ES2273482T3 - Composiciones de vacunas combinadas. - Google Patents

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Abstract

Una composición de vacuna que comprende: (a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV); y (b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV) rgD2t en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1, en la que la composición de vacuna está hecha mezclando el antígeno viral de hepatitis B y el antígeno viral de herpes y en la que el estimulador preferencial de respuesta celular TH1 se selecciona del grupo de adyuvantes constituido por: 3D-MPL, 3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido CpG.

Description

Composiciones de vacunas combinadas.
Esta invención se refiere a formulaciones de vacunas nuevas, procedimientos para prepararlas y su uso en tratamientos. En particular la presente invención se refiere a vacunas de combinación para administrar a la población adolescente.
HSV-2 es el agente etiológico primario del herpes genital. HSV-2 y HSV-1 (el agente causal del herpes labial) se caracterizan por su capacidad para inducir enfermedades agudas y establecer una infección latente, de manera primaria en células de ganglios nerviosos.
Se estima que se produce herpes genital en aproximadamente 5 millones de personas en EEUU con 500.000 casos clínicos informados cada año (infección primaria y recurrente). La infección primaria se produce típicamente tras la pubertad y se caracteriza por la aparición localizada de lesiones dolorosas en la piel, que persisten durante un período de entre 2 y 3 semanas. Dentro de los seis meses posteriores a la infección primaria el 50% de los pacientes experimentarán una recurrencia de la enfermedad. Aproximadamente el 25% de los pacientes pueden experimentar entre 10 y 15 episodios recurrentes de la enfermedad cada año. En pacientes inmunocomprometidos la incidencia de recurrencia con frecuencia alta es estadísticamente mayor que en la población de pacientes normales.
Tanto el virus HSV-1 como el HSV-2 tienen una cantidad de componentes glicoproteicos ubicados en la superficie del virus. Estos se conocen como gB, gC, gD y gE, etc.
Son bien conocidas las vacunas para la profilaxis de infecciones de Hepatitis B, que comprenden uno o más antígenos de Hepatitis B. Por ejemplo la vacuna Engerix-B (Marca Registrada) de SimthKline Beecham Biologicals se usa para prevenir la Hepatitis B. Esta vacuna comprende antígeno de superficie de Hepatitis B (específicamente los 226 aminoácidos del antígeno S descritos por Hardford y col. en Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (supl. 2), págs. 65-70) y está formulada usando hidróxido de aluminio como adyuvante.
Existe una necesidad de vacunas de combinación eficaces para prevenir enfermedades para las que los adolescentes son particularmente propensos.
El documento WO-A-4211291 describe un polipéptido híbrido inmunogénico que comprende un primer componente polipeptídico que es un antígeno de superficie de Hepatitis B unido de manera covalente por medio de un átomo de azufre nativo en el primer componente polipeptídico al segundo componente polipeptídico tal como gD de HSV.
La presente invención provee una composición de vacuna que comprende:
(a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV); y
(b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV) rgD2t
en combinación con un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1, en la que la composición de vacuna está hecha mezclando el antígeno viral de hepatitis B y el antígeno viral de herpes y en la que el estimulador preferencial de respuesta celular TH1 se selecciona del grupo constituido por 3D-MPL, 3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido CpG.
La composición de vacunas de la invención es de gran beneficio para la administración a adolescentes que pueden estar particularmente en riesgo de sufrir infección con HBV y/o HSV.
Opcionalmente la composición de vacunas de la invención comprende además uno o más de una cantidad de otros antígenos como se describe a continuación.
Se ha encontrado que las composiciones de vacunas de acuerdo con la invención sorprendentemente no muestran interferencia, es decir que la respuesta inmune a cada antígeno en la composición de la invención es esencialmente la misma que la obtenida por cada antígeno administrado individualmente en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1.
La vacuna Havrix (Marca Registrada), también de SimthKline Beecham Biologicals es un ejemplo de una vacuna que puede usarse para prevenir infecciones de Hepatitis A. Está formulada con hidróxido de aluminio como adyuvante. Esta vacuna comprende una cepa atenuada del virus de Hepatitis A HM-175 inactivado con formol (formaldehído); ver Andre y col. (Prog. Med. Virol. Vol. 37, págs. 1-24).
Como se usa en este documento el término antígeno viral de hepatitis A (HAV) se usa para referirse a una proteína derivada del virus de hepatitis A o una cepa atenuada de HAV, opcionalmente inactivada, por ej. con formaldehído. Si el antígeno HAV es una proteína derivada del virus de hepatitis A puede ser opcionalmente una proteína recombinante.
La vacuna Twinrix (Marca Registrada) es una combinación de un antígeno de hepatitis B recombinante con el anteriormente mencionado virus atenuado de hepatitis A inactivado. La vacuna puede usarse para proteger simultáneamente contra hepatitis A y hepatitis B.
La Patente Europea EP-B-0339667 (Chemo Sero) describe el concepto general de combinar un antígeno de hepatitis A y un antígeno de hepatitis B para realizar una vacuna de combinación. En esa memoria se establece que el adyuvante que se usa no es crítico: sólo debe ser capaz de potenciar la actividad inmune hasta un punto deseado y no causar ningún efecto colateral. Se establece que puede usarse gel de aluminio, en particular gel de hidróxido de aluminio y gel de fosfato de aluminio.
En otro aspecto, la invención provee una composición de vacuna:
(a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV);
(b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV) r9D2t;
(c) un antígeno viral de hepatitis A (HAV)
en combinación con un adyuvante seleccionado del grupo constituido por 3D-MPL, 3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D-MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido CpG.
Tal vacuna es muy beneficiosa para la administración a adolescentes que pueden estar particularmente en riesgo de infección con HBV y/o HSV y/o HAV.
Una respuesta inmune puede diferenciarse ampliamente en dos categorías extremas, una respuesta inmune humoral o una respuesta mediada por células (tradicionalmente caracterizada por mecanismos de protección por medio de anticuerpos o por medio de células respectivamente). Estas categorías de respuesta han sido denominadas respuestas inmunes de tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunes de tipo TH2 (respuesta humoral).
Las respuestas inmunes extremas de tipo TH1 pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, con haplotipo restringido y respuestas celulares natural killer. En ratones, las respuestas TH1 frecuentemente se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en los seres humanos estos corresponden a anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH2 se caracterizan por la generación de una amplia variedad de isotipos de inmunoglobulinas incluyendo IgG1, IgA e IgM en ratones.
Puede considerarse que lo que genera el desarrollo de estos dos tipos de respuesta inmune son las citoquinas. Niveles altos de citoquinas TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células para el antígeno dado, mientras que niveles altos de citoquinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales para el antígeno dado.
La distinción entre respuestas humorales de tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En realidad un individuo soportará una respuesta inmune descrita predominantemente como TH1 o predominantemente como TH2. Sin embargo, frecuentemente es conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos descritos en clones de células T CD4+ve murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, págs. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 están asociadas con la producción de INF-\gamma y citoquinas IL-2 por los linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no son producidas por células T, tal como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y factor de necrosis tumoral-\beta (TNF-\beta).
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas de tipo TH1 o de tipo TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores de equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune tras una vacunación o infección incluye la medición directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por los linfocitos T in vitro tras reestimulación con antígeno y/o la medición de la proporción IgG1:IgG2a de las respuestas de anticuerpos específicas de antígeno.
Por ello, un adyuvante de tipo TH1 es uno que estimula poblaciones aisladas de células T para producir niveles elevados de citoquinas de tipo TH1 cuando se reestimula con el antígeno in vitro e induce respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígeno asociadas con el isotipo de tipo TH1.
Los adyuvantes capaces de producir estimulación preferencial de la respuesta celular TH1 se describen en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/00153 y en WO 95/17209.
Uno de tales adyuvantes es monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL). Se lo conoce del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-de-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. En la Patente Europea EP-B-0689454 (SmithKline Beecham Biologicals SA) se describe una forma de preferencia del monofosforil lípido A 3-de-O-acilado.
De preferencia, las partículas de 3D-MPL son lo suficientemente pequeñas como para filtrarlas de manera estéril a través de una membrana de 0,22 micrómetros (como se describe en la Patente Europea Nº 0689454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo desde 10 \mug hasta 100 \mug. De preferencia de 25 a 50 \mug por dosis en la que el antígeno estará típicamente presente en un intervalo de 2 a 50 \mug por dosis.
Otro adyuvante de preferencia comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente ésta puede mezclarse con monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento de producción de QS21 se describe en la Patente de EEUU Nº 5.057.540.
Anteriormente se describieron formulaciones de adyuvantes no reactogénicas conteniendo QS21 (WO 96/33739). Tales formulaciones comprendiendo QS21 y colesterol demostraron ser adyuvantes estimuladores de TH1 exitosos cuando se formulan junto con un antígeno. Por lo tanto las composiciones de vacunas que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de QS21 y colesterol.
Otros adyuvantes que son estimuladores preferenciales de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias de CpG no metiladas como se describe en el documento WO 96/02555.
También se contempla que combinaciones de diferentes adyuvantes que estimulan TH1, tales como los mencionados anteriormente, provean un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, puede formularse QS21 junto con 3D-MPL. La proporción QS21:3D-MPL será típicamente del orden de 1:10 a 10:1; de preferencia 1:5 a 5:1 y frecuentemente 1:1. El intervalo de preferencia para el sinergismo óptimo es 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.
De preferencia también está presente un vehículo en la composición de vacunas de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Una emulsión de aceite de agua de preferencia comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80 (Marca Registrada). Adicionalmente la emulsión de aceite de agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
En un aspecto particularmente de preferencia los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención están combinados con 3D-MPL y alum.
Para administración en seres humanos, QS21 y 3D-MPL típicamente estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug a 200 \mug, tal como 10 a 100 \mug, de preferencia 10 \mug a 50 \mug por dosis. Típicamente la emulsión de aceite en agua comprenderá desde 2 hasta 10% de escualeno, desde 2 hasta 10% de alfa tocoferol y desde 0,3 hasta 3% de Tween 80. De preferencia la proporción escualeno:alfa tocoferol es igual o menor que 1, puede también estar presente Span 85 en un nivel de 1% debido a que provee una emulsión más estable. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizante.
Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua de preferencia contienen un aceite no tóxico, por ejemplo escualano o escualeno, un emulsionante, por ej. Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser por ejemplo, solución salina tamponada con fosfatos.
En el Documento WO 95/17210 se describe una formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua.
El antígeno HSV en la composición de la invención de HSV-2, es una glicoproteína D truncada (rgD2t). La glicoproteína D nativa está localizada en la membrana viral y también se encuentra en el citoplasma de las células infectadas (Eisenberg R. J. y col; J of Virol 1980, 35, 428-435). Comprende 393 aminoácidos que incluyen un péptido señal y tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kD. De todas las glicoproteínas de envoltura de HSV ésta es probablemente la mejor caracterizada (Cohen y col.; J. of Virology, 60, 157-166). Se sabe que in vivo juega un papel central en la unión viral a las membranas celulares. Más aún, la glicoproteína D ha demostrado ser capaz de promover la formación de anticuerpos neutralizantes in vivo (Eing y col. J. Med. Virology 127: 59-65). Sin embargo, el virus HSV-2 latente puede todavía aún reactivarse e inducir recurrencia de la enfermedad a pesar de la presencia de un título alto de anticuerpos neutralizantes en el suero de los pacientes.
En la invención se emplea una glicoproteína D truncada de HSV-2 de 308 aminoácidos que comprende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 306 presentes en la glicoproteína naturalmente con el agregado de Asparagina y Glutamina en el extremo C terminal de la proteína truncada desprovista de su región de anclaje a la membrana. Esta forma de la proteína incluye el péptido señal que está clivado para dar una proteína madura de 283 aminoácidos. En la Patente Europea de Genetech EP-B-139417 
\hbox{se
describe la producción de tal proteína en células de ovario  de
Hámster Chino.}
La glicoproteína D de HSV-2 madura truncada recombinante se usa en las formulaciones de vacuna de la presente invención y se la nombra rgD2t.
En el Documento WO 92/16231 se describe una combinación de este antígeno en combinación con el adyuvante 3D-MPL.
El antígeno viral de hepatitis B (HBV) en la composición de la invención es típicamente antígeno de superficie de hepatitis B.
La preparación de antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) está bien documentada. Ver por ejemplo, Harford y col. en Develop. Biol. Standard 54, página 125 (1983), Gregg y col. en Biotechnology, 5, página 479 (1987), los Documentos EP-A-0 226 846 y EP-A-0 299 108 y sus referencias.
Como se usa en este documento la expresión "antígeno de superficie de Hepatitis B", abreviado aquí como "HBsAg" o "HBS" incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento del mismo que despliega la antigenicidad del antígeno de superficie de HBV. Debe entenderse que en el agregado de antígeno S de HBsAg a la secuencia de 226 aminoácidos (ver Tiollais y col. Nature, 317, 489 (1985) y sus referencias), HBsAg como se describe en este documento puede, si se desea contener toda o parte de la secuencia pre-S como se describe en las referencias a continuación y en el documento EP-A-0278940. HBsAg como se usa en este documento puede también referirse a variantes, por ejemplo el "mutante de escape" descrito en el documento WO 91/14703. En otro aspecto el HBsAg puede comprender una proteína descrita como L* en la Solicitud de Patente Europea Nº 0414374, esto es, la secuencia de aminoácidos constituida por partes de la secuencia de aminoácidos de la proteína grande (L) del virus de hepatitis B (subtipo ad o ay), caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de la proteína está constituida por:
(a) los residuos 12-53, seguidos por los residuos 133-145, seguidos por los residuos 175-400 de dicha proteína L; o
(b) el residuo 12, seguido por los residuos 14-52, seguidos por los residuos 133-145, seguidos por los residuos 175-400 de dicha proteína L.
HBsAg puede también referirse a los polipéptidos descritos en los documentos EP 0198474 ó EP 0304578.
Normalmente el HBsAg estará en forma de partícula. Puede comprender sólo proteína S o puede ser como partículas compuestas, por ejemplo (L*,S) en la que L* es como se definió anteriormente y S significa proteína S del antígeno de superficie de hepatitis B.
El HBsAg puede estar adsorbido en fosfato de aluminio como se describe en el documento WO 93/24148.
De preferencia el antígeno de hepatitis B (HBV) usado en la formulación de la invención es antígeno S de HBsAg como se usa en el producto comercial Engerix-B (Marc antígeno de superficie de hepatitis B a Registrada; SmithKline Beecham Biologicals).
En la Solicitud de Patente Europea 0633784 se describió una vacuna comprendiendo antígeno de superficie de Hepatitis B en conjunción con 3D-MPL.
El Virus de Epstein Barr (EBV), un miembro del grupo herpesvirus, causa la mononucleosis infecciosa como enfermedad primaria en seres humanas. Afecta predominantemente a niños y adultos jóvenes. Más del 90% de la población adulta promedio está infectada por EBV que persiste durante toda la vida en los linfocitos B periféricos. El virus es producido de por vida en la glándula parótida y se esparce primariamente por medio de intercambio de saliva por parte de los individuos que acogen este virus. Los niños infectados con EBV son muy sintomáticos o tienen síntomas muy leves, mientras que los adolescentes y adultos que se infectan desarrollan la mononucleosis infecciosa típica, caracterizada por fiebre, faringitis y adenopatía. Las personas que fueron infectadas mantienen anticuerpos anti EBV durante el resto de sus vidas y son por ello inmunes a otra infección.
Además de sus cualidades infecciosas, EBV ha demostrado que transforma linfocitos en células en rápida división y ha sido implicado por consiguiente en varios linfomas diferentes, incluyendo el linfoma Africano de Burkitt (BL). EBV puede también estar involucrado como causante del carcinoma nasofaríngeo (NPC). Se estima que mundialmente se producen 80.000 casos de carcinoma nasofaríngeo y es más prevalente en las poblaciones chinas. La mononucleosis infecciosa es consecuencia de la infección primaria por EBV. No es una enfermedad que ponga en riesgo la vida si están ausentes otros factores de riesgo.
Se describieron cuatro proteínas de la envoltura viral de EBV constituyendo el llamado complejo antígeno de membrana. Usualmente se las nombra como gp 220/350 o gp 250/350 o simplemente como gp 250 o 350 (ver documento EP-A-151079). Existe evidencia convincente de que gp 350 y gp 250 inducen la producción de anticuerpos neutralizantes y que los anticuerpos contra gp 350 y gp 250 tienen capacidad neutralizante. Estas proteínas son por lo tanto candidatas para una posible vacuna para EBV. Para más información acerca de la aplicación de gp 250/350 para tratamientos de profilaxis de enfermedades relacionadas con EBV ver el documento EP 0173254.
La principal glicoproteína de superficie de EBV, gp 350/220 infecta células blanco humanas a través de la interacción con la proteína de membrana celular, CD21. El principal blanco para los anticuerpos neutralizantes de EBV es gp350/220 en seres humanos y algunas formas de gp 350/220 demostraron que protegen contra la enfermedad relacionada con EBV. De preferencia, una composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende gp 350 de EBV aunque pueden usarse otros antígenos protectores.
Los papilomavirus son pequeños virus tumorales de ADN, que son altamente específicos de especie. Hasta ahora, se han descrito más de 70 genotipos individuales de papilomavirus humano (HPV). Los HPVs son generalmente específicos de la piel (por ej. HPV-1 y -2) o de superficies mucosas (por ej. HPV-6 y -11) y usualmente causan tumores benignos (verrugas) que persisten durante varios meses o años. Tales tumores benignos pueden ser angustiosos para quienes los sufren pero no implican riesgo para la vida, con unas pocas excepciones.
Algunos HPVs están también asociados con cáncer. La más fuerte asociación positiva entre un HPV y el cáncer humano es la que existe entre HPV-16 y HPV-18 y carcinoma cervical. El carcinoma cervical es la neoplasia más común en los países en desarrollo, con aproximadamente 500.000 nuevos casos en el mundo cada año. Ahora es técnicamente factible combatir activamente las infecciones primarias con HPV-16 y aún cánceres establecidos conteniendo HPV-16. Para una revisión de las perspectivas para la vacunación profiláctica y terapéutica contra HPV-16 ver Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306 y Hagenesee M. E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556,559-564. De preferencia, una composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende la proteína principal de la cápside, la proteína L1.
Actualmente, se han aislado y caracterizado los diferentes tipos de HPVs con la ayuda de los sistemas de clonación en bacterias y más recientemente mediante amplificación con PCR. Se ha definido la organización molecular de los genomas de HPV en base a comparación con la bien caracterizada del papilomavirus bovino tipo 1
(BPV1).
Aunque pueden ocurrir variaciones menores, todos los genomas de HPVs descritos tienen al menos siete genes tempranos, E1 a E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región reguladora secuencia arriba contiene la secuencia reguladora que parece controlar la mayoría de los acontecimientos transcripcionales del genoma de
HPV.
Los genes E1 y E2 están involucrados en el control de la replicación y transcripción viral, respectivamente y tienden a ser interrumpidos por la integración viral. E6 y E7, y también evidencias recientes implican a E5, están involucrados en el carcinoma cervical tal como HPV 16 y 18, el proceso oncogénico comienza tras la integración del ADN viral. La integración da como resultado la inactivación de los genes que codifican las proteínas de cápside L1 y L2 y la instalación continua sobre la expresión de dos proteínas tempranas E6 y E7 que llevarán a una pérdida gradual de la diferenciación celular normal y al desarrollo del carcinoma.
El carcinoma de cérvix es común en mujeres y se desarrolla a través de un estado intermedio precanceroso hasta el carcinoma invasivo que frecuentemente lleva a la muerte. Los estados intermedios de la enfermedad se conocen como neoplasia intraepitelial y se divide en grados I a III en términos de gravedad incrementada.
Clínicamente, la infección por HPV del tracto anogenital femenino se manifiesta como condilomas cervicales planos, cuya característica distintiva es la coilocitosis que afecta predominantemente a las células superficiales e intermedias del epitelio escamoso cervical.
Los coilocitos, que son la consecuencia de un efecto citopático del virus, aparecen como células multinucleadas con un halo perinuclear claro. El epitelio está espesado con queratinización anormal responsable de la apariencia verrugosa de la lesión.
Cuando tales condilomas planos son positivos para serotipos de HPV 16 o 18, son factores de alto riesgo para la evolución hacia neoplasia cervical intraepitelial (CIN) y carcinoma in situ (CIS) que son considerados como lesiones precursoras del carcinoma invasivo de cérvix.
La Solicitud de Patente Internacional Nº WO 96/19496 describe variantes de proteínas de virus de papiloma humano E6 y E7, particularmente proteínas de fusión de E6/E7 con una deleción en ambas proteínas, E6 y E7. Se dice que estas proteínas de fusión con deleciones son inmunogénicas.
En los Documentos WO94/00152, WO94/20137, WO93/02184 y WO94/05792 se describen vacunas basadas en HPLV L1. Tales vacunas pueden comprender el antígeno L1 como un monómero, un capsómero o una partícula similar a un virus. Tales partículas pueden además comprender proteínas L2. Otras vacunas de HPV se basan en las proteínas Tempranas, tal como E7 o proteínas de fusión tal como L2-E7.
En la vacuna de la invención resulta de preferencia usar composiciones que comprenden una proteína E6 o E7 unida a un acompañante inmunológico de fusión con epitopes de células T.
En una forma de preferencia de la invención, el acompañante inmunológico de fusión deriva de la proteína D de Haemophilus influenza B. De preferencia, el derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer 1/3 de la proteína, en particular aproximadamente los primeros 100-110 aminoácidos del extremo N terminal.
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Por consiguiente, en una forma de realización la presente invención comprende antígeno(s) derivados de HPV como se describió anteriormente. De preferencia la invención comprende proteínas de fusión que comprenden Proteína D-E6 de HPV 16, Proteína D-E7 de HPV 16, Proteína D-E7 de HPV 18 y Proteína D-E6 de HPV 18. La parte de proteína D de preferencia comprende el primer 1/3 de la proteína D.
Las proteínas de la presente invención se expresan de preferencia en E. coli. En una forma de realización de preferencia se expresan con una cola de Histidina comprendiendo de 5 a 9 y de preferencia seis residuos Histidina. Éstos son ventajosos para ayudar en la purificación. La descripción de la fabricación de tales proteínas de describe en su totalidad en la solicitud de patente en trámite de UK número GB 9717953.5.
En un aspecto de preferencia la composición de vacunas de la invención además comprende un antígeno viral de Varicella Zoster (antígeno VZV). Los antígenos adecuados de VZV para inclusión en la formulación de vacuna incluyen gpI-V descrito por Longnecker y col., Proc Natl Acad Sci USA 84, 4303-4307 (1987).
En una forma de realización de preferencia se usa gpI (ver Ellis y col., Patente de EEUU Nº 4.769.239). Ver también la Patente Europea Nº EP-B-0 405 867.
En otro aspecto de preferencia la composición de vacunas de la invención además comprende un antígeno de citomegalovirus humano (HCMV). HCMV es un virus humano de ADN que pertenece a la familia de los herpesvirus. HCMV es endémico en la mayor parte del mundo. Entre dos poblaciones, HCMV es responsable de afecciones médicas serias. HCMV es una causa principal de defectos congénitos en recién nacidos. La segunda población en riesgo son los pacientes inmunocomprometidos tales como aquellos que sufren de infección con HIV y aquellos pacientes sometidos a transplantes. La enfermedad clínica causa una diversidad de síntomas incluyendo fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis. Un antígeno de preferencia para uso en una vacuna contra HCMV es gB685** como está descrito en el documento WO 95/31555. También se proveen inmunógenos para uso en vacunas de HCMV de pp65, una Proteína de Matriz de HCMV como se describe en el documento WO 94/00150 (Ciudad de
Hope).
En un aspecto de preferencia la composición de vacunas de la invención además comprende un antígeno de VZV y un antígeno de HCMV, en particular aquellos antígenos descritos anteriormente.
En otro aspecto de preferencia la composición de vacunas de la invención además comprende un antígeno de Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular obligado responsable de la toxoplasmosis en animales de sangre caliente, incluyendo al hombre. Aunque generalmente es clínicamente asintomático en los individuos sanos, la toxoplasmosis puede causar complicaciones graves en mujeres embarazadas y pacientes inmunocomprometidos. Un antígeno de preferencia para uso en una vacuna contra el toxoplasma gondii es SAG1 (también conocido como P30) como se describe en el documento WO96/02654 o Tg34 como se describe en el documento WO92/11366.
En un aspecto de preferencia la composición de vacunas de la invención además comprende un antígeno VZV o un antígeno HCMV combinado con un antígeno de Toxoplasma gondii, en particular aquellos antígenos descritos anteriormente.
En un aspecto de preferencia la composición de vacunas de la invención es una vacuna multivalente, por ejemplo una vacuna tetra o pentavalente.
Las formulaciones de la presente invención son muy eficaces induciendo inmunidad protectora, aún con dosis muy bajas de antígeno (por ej. tan bajas como 5 \mug de rgD2t).
Estas vacunas proveen una protección excelente contra la infección primaria y estimulan, de manera ventajosa respuesta inmune humoral específica (anticuerpos neutralizantes) y también respuesta inmune mediada por células efectoras (DTH).
En otro aspecto la presente invención provee una formulación de vacuna como se describe en este documento para uso en tratamiento médico, particularmente para uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones por Herpes Simplex y Hepatitis B viral.
La vacuna de la presente invención contendrá una cantidad inmunoprotectora de antígenos y puede prepararse por medio de técnicas convencionales.
La preparación de vacuna está descrita en general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col., University Park Press, Baltimore, Md., U.S.A. 1978. El encapsulado dentro de liposomas está descrito por ejemplo por Fullerton, en la Patente de EEUU Nº 4.235.877. La conjugación de proteínas con macromoléculas está descrita, por ejemplo, por Likhite, Patente de EEUU Nº 4.372.945 y por Armor y col., Patente de EEUU Nº 4.474.757.
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La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos colaterales adversos significativos de las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo del inmunógeno específico usado. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá de 1 a 1000 \mug de proteína, de preferencia de 2 a 100 \mug, de más preferencia de 4 a 40 \mug. Para una vacuna en particular puede determinarse una cantidad óptima por medio de estudios estándar que incluyen la observación de títulos de anticuerpos y otras respuestas en los sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un estímulo es aproximadamente 4
semanas.
Además de la vacunación de personas susceptibles de infecciones virales por HSV o HBV, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para tratar, inmunoterapéuticamente, a pacientes que sufren de dichas infecciones virales.
En otro aspecto de la presente invención se provee un procedimiento de fabricación como en el descrito en este documento, en el que el procedimiento comprende mezclar un antígeno viral de herpes y un antígeno viral de hepatitis B con un adyuvante que induce TH-1, por ejemplo 3D-MPL y, de preferencia, un vehículo, por ejemplo alum.
Si se desea, pueden agregarse otros antígenos, de cualquier manera conveniente, para proveer composiciones de vacunas multivalentes como se describe en este documento.
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Ejemplo 1
Estudio de inmunogenicidad con combinación gD + HBs
El objetivo del estudio fue demostrar la factibilidad de la combinación HSV gD/HBV HBs en una formulación con Al(OH)_{3}/3D-MPL. Se compararon las respuestas inmunes inducidas en cobayas por inmunización con estos antígenos usados solos o en combinación. HBs es una abreviatura para antígeno de superficie de Hepatitis B, específicamente la proteína S como se describió anteriormente. gD es una abreviatura para rgD2t como se describió anteriormente.
Protocolo Experimental
El protocolo experimental fue el siguiente. Se inyectaron cobayas Hartley por vía intramuscular en el día 0 y el día 28 con las siguientes formulaciones:
- grupo 1: HBs 5 \mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL 12,5 \mug
- grupo 2: gD 5 \mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL 12,5 \mug
- grupo 3: HBs 5 \mug + gD 5 \mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL 12,5 \mug
- grupo 4: HBs 5 \mug + gD 5 \mug/Al(OH)_{3} 125 \mug/3D-MPL de un lote diferente de 3D-MPL 12,5 \mug
Se extrajo sangre de los animales en los días 14 y 31 tras la segunda inmunización. Se evaluó la respuesta inmune humoral contra HSV gD y HBV HBs en ambos momentos con ELISA.
También se evaluó las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) para HBs. Consistió en la inyección intradérmica de 10 \mug de HBs por duplicado. Se controló el desarrollo de reacciones DTH midiendo el espesor de la piel a las 0, 24 y 48 horas tras la inyección.
Resultados 1. Respuestas de anticuerpos
En la Fig. 1 se muestran los títulos de Anti-gD obtenidos por ELISA. Los títulos de anti-gD en el grupo inmunizado con gD fueron comparables con aquellos inducidos en animales inmunizados con la combinación gD + HBs. La presencia de HBs en la formulación no afectó la inducción de respuestas de anticuerpos anti-gD.
De manera similar, se compararon los títulos de anticuerpos anti HBs en animales inmunizados con HBs solo o combinado con gD. La Fig. 2 muestra que se observaron títulos comparables de anti HBs en animales inmunizados con HBs solo o con HBs + gD.
Los resultados se muestran en las Figuras 1-4 de las que puede concluirse que en la formulación probada, la combinación gD/HBs induce respuestas de anticuerpos comparables con aquellas inducidas por los mismos antígenos usados solo y respuestas DTH a HBs comparables a aquellas inducidas por HBs solo. Por ello no se observaron diferencias significativas en las respuestas DTH para HBs en animales vacunados con HBs o HBs + gD. La presencia de gD no afectó la respuesta DTH para HBs.
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Ejemplo 2
Experimento PRO30 combinación HBV/HSV
El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia protectora de una combinación de HSV gD + HBV HBs en una formulación con 3D-MPL/alum en el modelo de HSV en cobaya comparada con gD solo en una formulación con 3D-MPL/alum. La formulación con 3D-MPL/alum comprende alum (10 partes en peso) con eD-MPK (1 parte en peso).
Protocolo Experimental
Se inmunizaron grupos de doce cobayas hembra Hartley con las siguientes formulaciones o se dejaron sin tratamiento:
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1
2 
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Se inmunizaron los animales por vía intramuscular dos veces en los días 0 y 28. Se realizó un desafío intravaginal en el día 57 (1 mes tras la segunda inmunización) con 10^{5} unidades formadoras de placa (pfu) de cepa MS de HSV2 (100 \mul) y posteriormente se controlaron diariamente buscando signos clínicos de enfermedad primaria (días 4 a 12 postinfección) y recurrente (días 13 a 39 postinfección). Se midió la protección inducida de acuerdo con varios criterios descritos en la Tabla 1, así como por medio de curvas de puntuación acumulada.
También se realizaron pruebas en los sueros recogidos en los días 14 y 28 tras la inmunización II para determinar los títulos de anticuerpos anti gD por ELISA (expresados como EU/ml); también se realizaron pruebas en los sueros recogidos en el día 28 tras la inmunización II para determinar la actividad neutralizante de HSV ("NEUTRA"; los títulos corresponden a la inversa de la dilución del suero que brinda 100% de protección contra el efecto citopático de HSV2).
Resultados Resultados de la serología
Los datos de inmunogenicidad se presentan en la Tabla siguiente y en la Figura 5:
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3 
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Se indujeron títulos ELISA y neutralizantes similares mediante la combinación gD (5 \mug) + HBs (5 \mug) en la formulación 3D-MPL/alum y gD/formulación 3D-MPL/alum.
Protección contra la enfermedad primaria
Como se muestra en la Figura 6 (curva de puntuación acumulada) y en la Tabla 1 a continuación, la combinación gD + HBs/formulación 3D-MPL/alum confirió una protección contra la enfermedad primaria tan buena como gD solo en formulación 3D-MPL/alum.
Protección contra la enfermedad recurrente
En la Figura 7 (curvas de puntuación acumulada) y en la Tabla 2 a continuación se muestra la protección contra las recurrencias del herpes La combinación de gD + formulación HBs/3D-MPL/alum confirió una protección contra la enfermedad recurrente tan buena como gD solo en la formulación 3D-MPL/alum.
Una cantidad similar de animales tuvieron recurrencias en los grupos gD + HBs y gD solo. Exactamente la misma cantidad de animales en estos grupos tuvieron más de 1 recurrencia durante el período de observación (días 13 a 39 post desafío). En aquellos animales con recurrencia, se informaron lesiones de gravedad comparable.
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TABLA 1 Enfermedad Primaria 
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4 
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Tanto las cobayas inmunizadas con la combinación gD + HBs como las inmunizadas con gD solo estuvieron muy bien protegidas contra el desafío con HSV. Mientras que la mayoría de los animales control tuvieron lesiones, éstas se observaron sólo en 2/12 y 3/12 animales en los grupos gD + HBs y gD solo, respectivamente.
5
Ejemplo 3
El objetivo del estudio es evaluar las respuestas inmunes serológicas inducidas en ratones por una vacuna de combinación que comprende HAV, HBs y gD formulada con sales de Aluminio y 3D-MPL. El componente de hepatitis A usado en este ejemplo (y abreviado en este documento como "HAV") fue la cepa HM175 inactivada encontrada en Havrix.
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Materiales y Procedimientos Antígeno/lotes de 3D-MPL
HBs: Al: 4550 \mug/ml, HBs preadsorbido: 227,62 \mug/ml
HAV: Al: 1380 \mug/ml, HAV: 25230 EU/ml
gD: 493 \mug/ml
3D-MPL: 957 \mug/ml
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Procedimiento de formulación
\bullet
Grupo 1: HBs AlPO_{4}/3D-MPL
HBs/H_{2}O/NaCl/fenoxi/AlPO_{4} durante 15 minutos + 3D-MPL durante 1 hora
\bullet
Grupo 2: gD AlOH_{3}/3D-MPL
H_{2}O/AlOH_{3} durante 5 minutos + gD durante 15 minutos + 3D-MPL durante 30 minutos + PBS durante 15 minutos + Fenoxi
\bullet
Grupo 3: HAV AlOH_{3}/3D-MPL
H_{2}O/NaCl/Fenoxi durante 5 minutos + AlOH_{3}/HAV durante 30 minutos/3D-MPL
\bullet
Grupo 4:
1.
H_{2}O/NaCl/Fenoxi durante 5 minutos + AlPO_{4}/HBs durante 5 minutos + 3D-MPL durante 30 minutos
2.
gD/AlOH_{3} durante 15 minutos + 3D-MPL durante 30 minutos
Mezclar 1 y 2 durante 20 minutos +HAV durante 1 hora.
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Lecturas serológicas
\bullet
La cuantificación de anticuerpos anti HBs y anti gD se realizó por Elisa usando HBs o gD como antígeno de recubrimiento. Se usaron las soluciones de antígeno y anticuerpo a razón de 5 \mul por pocillo. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark). Posteriormente se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC con PBS conteniendo 1% de seroalbúmina de ternera y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se agregaron diluciones al doble de suero en tampón de saturación a las placas recubiertas con antígeno y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS 0,1% Tween 20 y se agregó Ig anti ratón conjugada con biotina (Amersham, UK) diluida 1/1000 en tampón de saturación a cada pocillo y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Tras una etapa de lavado, se agregó complejo estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham, UK) diluido 1/5000 ó 1/1000 en tampón de saturación (para ELISA de HBs y anti gD respectivamente) durante otros 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas como anteriormente y se incubaron durante 20 minutos con una solución de o-fenilendiamina (Sigma) 0,04%, H_{2}O_{2} 0,03% en tampón citrato 0,05 M pH 4,50 con 1% Tween 20. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 492/620 nm. Se calcularon los títulos de ELISA a partir de una referencia por medio de SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en EU/ml.
\bullet
La cuantificación de anticuerpo anti HAV se realizó por medio de Enzymun ELISA (Boehringer) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Protocolo Experimental
Se inmunizaron grupos de 7 ratones Balb/C por vía intramuscular con las siguientes formulaciones (correspondientes a 1/10 de la dosis para seres humanos)
1.
HBs (2 \mug)/AlPO_{4} (50 \mug)/3D-MPL (5 \mug)
2.
gD (2 \mug)/Al(OH)_{3} (50 \mug)/3D-MPL (5 \mug)
3.
HAV (72 EU)/Al(OH)_{3} (50 \mug)/3D-MPL (5 \mug)
4.
HAV (72 EU)/Al(OH)_{3} (5 \mug) + HBs (2 \mug)/AlPO_{4} (40 \mug)/3D-MPL (2,5 \mug) +gD (2 \mug)/Al(OH)_{3} (5 \mug)/3D-MPL (2,5 \mug)
Se inmunizaron los animales dos veces en los días 0 y 21 con 50 \mul de vacuna. Se recogió suero en varios momentos post inmunización (21 post I y 14 post II) y se analizaron para determinar sus títulos de anticuerpos anti HAV, HBs y gD.
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Resultados
Los datos individuales de 21 post I y 14 post II se muestran en la Tabla 3 y se resumen a continuación:
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TABLA 3 
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6
7 
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\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Serología para HBs 
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8 
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\bullet Serología para gD
9 
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\bullet Serología para HAV
10
Conclusiones
\bullet
Se observaron títulos comparables de anticuerpos anti HBs en la vacuna de combinación y en la vacuna de HBs conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.
\bullet
Se observaron títulos comparables de anticuerpos anti gD en la vacuna de combinación y en la vacuna de gD conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.
\bullet
Se observaron títulos comparables de anticuerpos anti HAV en la vacuna de combinación y en la vacuna de HAV conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.
Por consiguiente parece no haber interferencias cuando se combinan HBs, gD y HAV en una vacuna conteniendo sales de Aluminio y 3D-MPL.

Claims (18)

1. Una composición de vacuna que comprende:
(a) un antígeno viral de hepatitis B (HBV); y
(b) el antígeno viral de herpes simplex (HSV) rgD2t
en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1, en la que la composición de vacuna está hecha mezclando el antígeno viral de hepatitis B y el antígeno viral de herpes y en la que el estimulador preferencial de respuesta celular TH1 se selecciona del grupo de adyuvantes constituido por: 3D-MPL, 3D-MPL en el que el tamaño de las partículas de 3D MPL es de preferencia menor que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido CpG.
2. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 que además comprende un vehículo.
3. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en la que el estimulador preferencial de respuesta celular TH1 es 3D-MPL.
4. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que el antígeno de Hepatitis B es antígeno de superficie de hepatitis B.
5. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además está presente un antígeno de EBV.
6. Una composición de vacuna como se definió en la reivindicación 5 en la que en antígeno de EBV es gp 350.
7. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además está presente un antígeno de Hepatitis A.
8. Una composición de vacuna como se definió en la reivindicación 7 en la que en antígeno de HAV deriva de la cepa HM-175
9. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además está presente un antígeno de papilomavirus humano (HPV).
10. Una composición de vacuna como se definió en la reivindicación 9 en la que el antígeno de HPV se selecciona de uno o más de los siguientes: L1, L2, E6, E7, proteína D-E6, proteína D-E7 o L2-E7.
11. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 en la que el vehículo se selecciona del grupo que comprende hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y tocoferol y una emulsión de aceite en agua.
12. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que además comprende un antígeno de VZV.
13. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 en la que el antígeno de VZV es gpI.
14. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que además comprende un antígeno de HCMV.
15. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 14 en la que el antígeno de HCMV es gB685** o pp65.
16. Una composición de vacuna de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que además comprende un antígeno de Toxoplasma gondii.
17. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 16 en la que el antígeno de Toxoplasma gondii es SAG1 o TG34.
18. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende HBsAg antígeno S y HSV2gDt y opcionalmente además uno o más de EBVgp 350; VZVgpI; HAV de cepa HM-175 inactivada; L1, L2, E6, E7, proteína D-E6, proteína D-E7 o L2-E7 de HPV; gB685** o pp65 de HCMV y antígenos SAG1 o TG34 de Toxoplasma gondii.
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