ES2261243T3

ES2261243T3 - Composiciones de vacuna combinada.

Info

Publication number: ES2261243T3
Application number: ES00967654T
Authority: ES
Inventors: Martine SmithKline Beecham Bio. s.a. Wettendorff
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2020-09-07
Also published as: GC0000201A; DK1410805T3; DE60024893T2; IL158107A; IL158107A0; NO20033715L; ES2253636T3; TW200408405A; CY1106090T1; KR100557665B1; ATE321569T1; CZ2002843A3; DE60027029T2; DK1210113T3; US7101560B2; HU229099B1; NO2012016I2; KR20030087081A; HK1048435A1; CN1618465A

Abstract

Una composición vacunal adecuada para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones por el virus del papiloma humano e infecciones por el virus del herpes simple que comprenden: a) un antígeno gD del virus del herpes simple (VHS) 2; y b) un antígeno L1 del virus del papiloma humano (VPH), en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1, de modo que la composición no contenga un antígeno de la hepatitis B.

Description

Composiciones de vacuna combinada.

Esta invención se refiere a nuevas formulaciones de vacunas, procedimientos para su preparación y su uso en terapéutica. En particular, la presente invención se refiere a vacunas combinadas para su administración a adolescentes.

Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN asociados a tumores que son altamente específicos de especie. Hasta ahora, se han descrito más de 70 genotipos individuales del virus del papiloma humano (VPH). Los VPHs son generalmente específicos bien de la piel (por ejemplo, VPH-1 y -2) o bien de las superficies mucosas (por ejemplo VPH-6 y -11) y normalmente causan tumores benignos (verrugas) que persisten durante varios meses o años. Tales tumores benignos pueden ser preocupantes para los individuos en cuestión pero no tienden a suponer una amenaza para la vida, con pocas excepciones.

Algunos VPHs están también asociados a cánceres. La asociación positiva más fuerte entre un VPH y un cáncer humano es aquella que existe entre el VPH-16 y VPH-18 y el carcinoma cervical. El cáncer cervical es tumor maligno más común en los países en vías de desarrollo con cerca de 500.000 nuevos casos en el mundo cada año. En nuestros días, es técnicamente posible combatir activamente las infecciones primarias por VPH-16 e incluso cánceres ya establecidos que comprenden un VPH-16 mediante la utilización de vacunas. Para una revisión sobre las perspectivas para la vacunación profiláctica y terapéutica frente al VPH-16, véase Cason J. Clin. Immunother., 1994; 1(4) 293-306 y Hagenesee M. E., Infections in Medicine, 1997, 14(7), 555-556, 559-564.

Otros VPH de particular interés son los serotipos 31, 33 y 45.

Hoy día, se han aislado y caracterizado los diferentes tipos de VPHs con la ayuda de sistemas de clonación en bacterias y más recientemente mediante amplificación por PCR. Se ha definido la organización molecular de los genomas de los VPH de modo comparativo con la del bien caracterizado virus del papiloma bovino tipo 1 (VPB1).

Aunque existen variaciones poco importantes, todos los genomas de VPHs descritos tienen por lo menos siete genes tempranos, del E1 al E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región reguladora en dirección 5' alberga las secuencias regulatorias que parecen controlar la mayoría de los eventos transcripcionales en el genoma del
VPH.

Los genes E1 y E2 están involucrados en la replicación viral y el control transcripcional respectivamente y tienden a ser interrumpidos durante la integración viral. E6 y E7 están involucrados en la transformación inducida por el virus, lo que implica también al E5 según evidencias recientes.

En los VPHs involucrados en el carcinoma cervical tales como el VPH 16 y 18, el proceso oncogénico comienza tras de la integración de ADN viral. La integración resulta en la inactivación de los genes que codifican las proteínas de la cápsida L1 y L2 y en la instauración de una sobreexpresión mantenida de las dos proteínas tempranas E6 y E7 que llevará a la pérdida gradual de la diferenciación celular normal y al desarrollo del carcinoma.

El carcinoma del cuello del útero es común en mujeres y se desarrolla a través de un periodo precanceroso intermedio hacia el carcinoma invasivo que frecuentemente lleva a la muerte. Los periodos intermedios de la enfermedad se conocen como neoplasia cervical intraepitelial y están graduados del I al III en términos de gravedad creciente.

Clínicamente, la infección por VPH del tracto anogenital femenino se manifiesta como condiloma plano cervical, cuyo signo característico es la coilocitosis que afecta predominantemente a las células superficiales e intermedias del epitelio cervical escamoso.

Los coilocitos, que son la consecuencia de un efecto citopático del virus, aparecen como células multinucleadas con un claro halo perinuclear. El epitelio se engrosa con queratinización anormal responsable de la apariencia verrugosa de la lesión.

Tales condilomas planos, cuando son positivos para los serotipos del VPH 16 o 18, son factores de alto riesgo para la evolución hacia neoplasia cervical intraepitelial (NCI) y carcinoma in situ (CIS) que se consideran en sí mismos lesiones precursoras del carcinoma cervical invasivo.

WO 96/19496 revela variantes de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano, en particular proteínas de fusión de E6/E7 con una deleción en ambas proteínas E6 y E7. Se dice que estas proteínas de fusión delecionadas son inmunogénicas.

Las vacunas basadas en la proteína L1 del VPH se revelan en WO94/00152, WO94/20137, WO93/02184 y WO94/05792. Tal vacuna puede comprender el antígeno L1 como un monómero, un capsómero o una partícula similar al virus. Tales partículas pueden comprender adicionalmente proteínas L2. Las vacunas basadas en L2 se describen, por ejemplo, en WO93/00436. Otras vacunas para el VPH se basan en las proteínas tempranas, tales como la E7 o proteínas de fusión tales como L2-E7.

El VHS-2 es el agente etiológico primario del herpes genital. VHS-2 y VHS-1 (el agente causal del herpes labial) se caracterizan por su capacidad tanto de inducir enfermedades agudas como de establecer una infección latente, sobre todo en células neuronales de los ganglios.

Se estima que el herpes genital es padecido por alrededor de 5 millones de personas solamente en los Estados Unidos con 500.000 casos clínicos registrados cada año (infección primaria y recurrente). La infección primaria típicamente ocurre después de la pubertad y se caracteriza por la aparición localizada de lesiones cutáneas dolorosas que persisten durante un periodo de entre 2 y 3 semanas. Durante los siguientes seis meses después de la infección primaria, el 50% de los pacientes experimentará una recurrencia de la enfermedad. Alrededor de un 25% de los pacientes puede experimentar entre 10-15 episodios recurrentes de la enfermedad cada año. En pacientes inmunocomprometidos, la incidencia de recurrencia de alta frecuencia es estadísticamente más alta que en la población de pacientes normales.

Ambos virus VHS-1 y VHS-2 tienen un elenco de componentes glicoproteicos localizados en la superficie del virus. Estos se conocen como gB, gC, gD y gE, etc.

La patente US 5855891 revela una partícula similar al virus del papiloma que comprende un producto de fusión de la proteína L1 del virus del papiloma. WO9517209 revela composiciones vacunales que comprenden emulsiones oleosas en agua con 3D MPL y QS21.

WO9945957 revela composiciones vacunales combinadas para su administración preferente a adolescentes, que comprenden un antígeno viral de la hepatitis B y un antígeno viral del herpes simple y opcionalmente otros antígenos formulados con un adyuvante.

Es necesario obtener una combinación de vacunas eficaz para prevenir enfermedades a las cuales los adolescentes son particularmente propensos.

La presente invención proporciona una composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 1.

La composición vacunal de la invención resulta muy beneficiosa para su administración a adolescentes que se pueden encontrar particularmente en riesgo de infección por VHS y/o VPH.

Opcionalmente, la composición vacunal de la invención comprende adicionalmente uno o más de entre otros varios antígenos como se describe a continuación.

Se ha enfrente encontrado que las composiciones vacunales, de acuerdo con la invención, sorprendentemente no muestran interferencia, lo que quiere decir que la respuesta inmune a cada antígeno en la composición de la invención es esencialmente la misma que la que se obtiene por cada antígeno dado individualmente en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1.

La vacuna Havrix (marca registrada) también de SmithKline Beecham Biologicals es un ejemplo de una vacuna que se puede utilizar para prevenir las infecciones de hepatitis A. Está formulada con hidróxido de aluminio como adyuvante. Esta vacuna comprende una cepa atenuada del virus de la hepatitis A HM-175 inactivado con formol (formaldehído): véase Andre et al., (Prog. Med. Virol., vol. 37, pág. 1-24).

Como se utiliza aquí, el término antígeno viral de la hepatitis A (VHA) se utiliza para referirse tanto a proteína derivada del virus de la hepatitis A como a una cepa atenuada de VHA, opcionalmente inactivada, por ejemplo, con formaldehído. Si el antígeno del VHA es una proteína derivada del virus de la hepatitis A, puede ser opcionalmente una proteína recombinante.

La composición vacunal de acuerdo con la invención puede comprender, aparte de los antígenos del VPH y del VHS, un antígeno del VHA.

Tal vacuna resulta muy beneficiosa para su administración a los adolescentes que pueden estar particularmente en riesgo de infección por VHS y/o VPH y/o de infección por VHA.

Una respuesta inmune se puede dividir a grandes rasgos en dos categorías extremas que son una respuesta humoral o una respuesta inmune mediada por células (tradicionalmente caracterizada por mecanismos de protección basados en anticuerpos y efectores celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta han sido denominadas como respuestas inmunes de tipo TH-1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunes de tipo TH-2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes de tipo TH-1 extremas se pueden caracterizar por la generación de linfocitos T citotóxicos restringidos a haplotipo y específicos de antígeno y respuestas de células natural killer. En ratones, las respuestas de tipo TH-1 se caracterizan frecuentemente por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a mientras que en el ser humano éstas se corresponden con los anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo TH-2 se caracterizan por la generación de un rango de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen la IgG1 en ratones.

Se puede considerar que la causa última que está detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citoquinas. Niveles altos de citoquinas de tipo TH-1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células frente a un antígeno determinado, mientras que niveles altos de citoquinas de tipo TH-2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales frente al antígeno.

La distinción entre las respuestas inmunes de tipo TH-1 y TH-2 no es absoluta. En realidad, un individuo desarrollará una respuesta inmune que se describe como predominantemente TH-1 o como predominantemente TH-2. Sin embargo, frecuentemente es conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos descritos en clones de células T CD4+ murinas por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989), TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág. 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 se asocian con la producción de citoquinas de tipo INF-\gamma por los linfocitos T. Otras citoquinas frecuentemente asociadas de manera directa con la inducción de respuestas inmunes de tipo TH1 no se producen mediante las células T, como es el caso de la IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y del factor de necrosis tumoral \beta (TNF-\beta).

Se sabe que ciertos adyuvantes de las vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas tanto de tipo TH1 como de TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o una infección incluyen medidas directas de la producción de citoquinas de TH1 o TH2 por los linfocitos T in vitro tras re-estimulación con antígeno y/o (por lo menos, en ratones) la medida de la relación IgG1:IgG2a en respuestas de anticuerpos específicos de antígeno.

Por lo tanto, un adyuvante de tipo TH1 es aquel que estimula poblaciones aisladas de células T para producir altos niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se re-estimulan con antígeno in vitro e induce respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con un isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de estimular preferentemente la respuesta celular TH1 se describen en la Solicitud de Patente Internacional nº WO 94/00153 y WO 95/17209.

Uno de estos adyuvantes es monofosforil lípido A 3 de-O-acilado (3D-MPL). Se describe en GB 2220211 (Ribi). Químicamente, es una mezcla de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferente de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado se revela en la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals, S.A.).

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son lo suficientemente pequeñas como para ser esterilizadas por filtración a través de una membrana de 0,22 micras (como se describe en la Patente Europea nº 0 689 454). El 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug-100 \mug, preferiblemente de 25-50 \mug por dosis, en la cual el antígeno estará presente típicamente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferente comprende QS21, una fracción purificada por HPLC no tóxica derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina. Opcionalmente, ésta se puede mezclar con monofosforil lípido A 3 de-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de la producción del QS21 se revela en la patente US nº 5.057.540.

Las formulaciones de adyuvante no reactogénico que comprenden QS21 se han descrito anteriormente (WO 96/33739). Se ha mostrado que tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol son eficaces adyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno. Estas composiciones vacunales que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de QS21 y colesterol.

Otros adyuvantes que son estimuladores preferenciales de respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se revela en WO 96/02555.

Las combinaciones de diferentes adyuvantes que estimulan TH1, tales como los aquí arriba mencionados, son también contempladas como suministradoras de un adyuvante que es un estimulador preferencial de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 se puede formular junto con 3D-MPL. La razón QS21:3D-MPL estará típicamente en el orden de 1:10 a 10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo esencialmente 1:1. El intervalo preferente para la sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferiblemente, también está presente un vehículo en la composición vacunal de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser un aceite en emulsión acuosa o una sal de aluminio, tales como el fosfato de aluminio o el hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferente comprende un aceite metabolizable, tales como el escualeno, el alfa tocoferol y el Tween 80. Adicionalmente, el aceite en emulsión acuosa puede comprender Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

En un aspecto particularmente preferente, los antígenos en la composición vacunal de acuerdo con la invención se combinan con 3D-MPL y alumbre.

Típicamente, para la administración a humanos, el QS21 y el 3D-MPL se estarán presentes en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como de 10-100 \mug, preferentemente de 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente, el aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10% de alfa tocoferol y del 0,3 al 3% de Tween 80. Preferiblemente, la razón escualeno:alfa tocoferol es igual o menor que 1, puesto que esto proporciona una emulsión más estable. El Span 85 también puede estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos, puede ser ventajoso que la vacuna de la presente invención además contenga un estabilizador.

El aceite no tóxico en las emulsiones acuosas comprende preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo, un escualano o un escualeno, un emulsificador, por ejemplo Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

Una formulación de adyuvante particularmente potente que comprende QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210.

El antígeno del VPH en la composición de la invención se deriva preferiblemente del VPH 16 y/o 18, o del VPH 6 y/o 11, o VPH 31, 33 o 45.

En una realización preferente, el antígeno de VPH en la composición vacunal de acuerdo con la invención, comprende la principal proteína de la cápsida del VPH, la proteína L1 y, opcionalmente, la proteína L2, particularmente del VPH 16 y/o VPH 18. En esta realización, la forma preferente de la proteína L1 es una proteína L1 truncada. Preferiblemente, la proteína L1, opcionalmente en una fusión L1-L2, está en la forma de una partícula similar al virus (VLP; virus-like particle). La proteína L1 se puede fusionar con otra proteína del VPH, en particular la E7 para formar una fusión de L1-E7. Las VLP quiméricas que comprenden L1-E o L1-L2-E son particularmente preferentes.

Las proteínas de la presente invención se expresan preferiblemente en E. coli. En una realización preferente, las proteínas se expresan con una cola de histidina que comprende de 5 a 9 y, preferiblemente, seis residuos de histidina. Tienen la ventaja de facilitar la purificación. La descripción de la fabricación de tales proteínas se describe completamente en la solicitud de patente del Reino Unido en tramitación junto con la presente nº GB 9717953.5.

El antígeno del VPH en la composición vacunal se puede adsorber sobre AI(OH)_{3}.

El antígeno del VHS en la composición de la invención se deriva preferiblemente de la glicoproteína D del VHS-2. La glicoproteína D está localizada en la membrana viral y se encuentra asimismo en el citoplasma de las células infectadas (Eisenberg R. J. et al.; J. Virol. 1980, 35, 428-435). Comprende 393 aminoácidos que incluyen un péptido señal y tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kDa. De todas las glicoproteínas de la envuelta del VHS, ésta es probablemente la mejor caracterizada (Cohen et al.; J. of Virology, 60, 157-166). In vivo, se sabe que desempeña un papel importante para el acoplamiento viral a las membranas de la célula. Además, se ha mostrado que la glicoproteína D es capaz de generar anticuerpos neutralizantes in vivo (Eing et al.; J. Med. Virology, 127: 59-65). Sin embargo, el virus VHS-2 latente aún puede reactivarse e inducir recurrencia de la enfermedad a pesar de la presencia de un título alto de anticuerpos neutralizantes en los sueros de los pacientes.

En una realización preferente de la invención, el antígeno del VHS es una glicoproteína D del VHS-2 truncada de 308 aminoácidos que comprende los aminoácidos del 1 al 306 que existen de manera natural en la glicoproteína con la adición de una asparagina y una glutamina, en el extremo C-terminal de la proteína truncada desprovista de su región de anclaje a membrana. Esta forma de la proteína incluye el péptido señal que es eliminado para producir una proteína madura de 283 aminoácidos. La producción de dicha proteína en células de ovario de hámster chino se ha descrito en la patente europea de Genentech EP-B-139 417.

La glicoproteína D del VHS-2 madura truncada recombinante se utiliza preferentemente en las formulaciones de la vacuna de la presente invención y se designa como rgD2t.

Una combinación de este antígeno del VHS-2 en combinación con el adyuvante 3D-MPL se ha descrito en WO 92/16231.

El Virus de Epstein Barr (VEB), un miembro del grupo de los herpesvirus causa mononucleosis infecciosa como enfermedad primaria en los seres humanos. Predominantemente, afecta a los niños o a los adultos jóvenes. Más de un 90% de la población media adulta está infectada por el VEB, el cual persiste durante toda la vida en los linfocitos B periféricos. El virus se produce durante toda la vida en las glándulas parótidas y se transmite sobre todo mediante intercambio de la saliva a partir de individuos que producen el virus. Los niños infectados con VEB son en gran parte asintomáticos o tienen síntomas muy suaves, mientras que los adolescentes y adultos que se infectan desarrollan una mononucleosis infecciosa típica caracterizada por fiebre, faringitis y adenopatía. Las personas que han sido infectadas mantienen anticuerpos anti-VEB durante el resto de sus vidas y son, por lo tanto, inmunes ante una posible
infección.

Además de su capacidad infecciosa, se ha mostrado que el VEB transforma a los linfocitos en células que se dividen rápidamente y por esta razón se le ha implicado en varios linfomas diferentes, incluyendo el linfoma de Burkitt africano (LB). Asimismo, el VEB puede estar involucrado en la causa del carcinoma nasofaríngeo (CNF). Se estima que en todo el mundo ocurren 80.000 casos de carcinoma nasofaríngeo y es más prevalente en poblaciones étnicas chinas. La mononucleosis infecciosa es la consecuencia de una infección primaria por VEB. No es una enfermedad que amenace la vida en ausencia de factores de riesgo adicionales.

Se han descrito cuatro proteínas de la envuelta viral del VEB que constituyen el así llamado complejo de antígeno de membrana. Generalmente se les denomina gp 220/350 o gp 250/350 o simplemente como gp 250 o 350 (véase EP-A-151079). Existen evidencias convincentes de que la gp 350 y la gp 250 inducen la producción de anticuerpos neutralizantes y que los anticuerpos frente a la gp 350 y la gp 250 tienen capacidad neutralizante. Estas proteínas son, por lo tanto, candidatos para una posible vacuna frente a el VEB. Para más información sobre la aplicación de la gp 250/350 para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el VEB, véase EP 0 173 254.

La principal glicoproteína de superficie del VEB gp350/220 infecta a células diana humanas a través de la interacción con la proteína de la membrana celular CD21. La glicoproteína gp350/220 es la diana principal para los anticuerpos neutralizantes del VEB en seres humanos y se ha mostrado que algunas formas de gp350/220 protegen frente a la enfermedad relacionada con el VEB. Preferiblemente, la composición vacunal de acuerdo con la invención comprende la gp 350 del VEB aunque se pueden utilizar otros antígenos protectores.

En un aspecto preferente, la composición vacunal de la invención comprende adicionalmente un antígeno viral de Varicela Zoster (antígeno VVZ). Antígenos adecuados del VVZ para su inclusión en la formulación de la vacuna incluyen gpI-V, descritos por Longnecker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307 (1987).

En una realización preferente, se utiliza el gpI (véase Ellis et al., patente US 4.769.239). Véase también la Patente Europea nº. 0 405 867 B1.

En otro aspecto preferente, la composición vacunal de la invención comprende adicionalmente un antígeno del citomegalovirus humano (CMVH). El CMVH es un virus de ADN humano que pertenece a la familia de los herpesvirus. El CMVH es endémico en la mayoría del planeta. En dos tipos de poblaciones, el CMVH es responsable de condiciones médicas graves. El CMVH es una causa importante de defectos congénitos en recién nacidos. La segunda población de riesgo son pacientes inmunocomprometidos, tales como los que sufren de infección por HIV y aquellos pacientes sometidos a transplantes. La enfermedad clínica causa una variedad de síntomas que incluyen fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis infecciosa. Un antígeno preferente para su uso en una vacuna frente a el CMVH es gB685**, como se describe en la patente WO 95/31555. Otros inmunógenos para su uso en vacunas frente al CMVH son proporcionados por la pp65, una proteína de matriz del CMVH, como se describe en la patente WO 94/00150 (City of Hope).

En un aspecto preferente, la composición vacunal de la invención comprende adicionalmente tanto un antígeno del VVZ como un antígeno del CMVH, en particular los antígenos arriba descritos.

En otro aspecto preferente, la composición vacunal de la invención comprende adicionalmente un antígeno de Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii es un protozoo parásito intracelular obligado responsable de la toxoplasmosis en animales de sangre caliente incluyendo al hombre. Aunque en general es clínicamente asintomática en los individuos sanos, la toxoplasmosis puede causar complicaciones graves en mujeres embarazadas y en pacientes inmunocomprometidos. Un antígeno preferente para su uso en una vacuna frente a Toxoplasma gondii es SAG1 (también conocido como P30), como se describe en la patente WO 96/02654 o Tg34, como se describe en la patente WO 92/11366.

En un aspecto preferente, la composición vacunal de la invención comprende adicionalmente bien un antígeno del VVZ o bien un antígeno del CMVH combinados con un antígeno de Toxoplasma gondii, en particular los antígenos anteriormente descritos.

En un aspecto preferente, la composición vacunal de la invención es una vacuna multivalente, por ejemplo, una vacuna tetra- o pentavalente.

Las formulaciones de la presente invención son muy eficaces en la inducción de inmunidad protectora, incluso con unas dosis muy bajas de antígeno (por ejemplo, tan bajas como 5 \mug de rgD2t).

Éstas proporcionan una protección excelente frente a la infección primaria y estimulan, de manera ventajosa, tanto la respuesta humoral específica (anticuerpos neutralizantes) como la respuesta inmune mediada células efectoras (DTH).

La presente invención en otro aspecto proporciona una formulación de vacuna como se describe aquí para su uso en terapia médica, particularmente para su uso en el tratamiento o en la profilaxis de infecciones por el virus del papiloma humano y de infecciones por el virus del herpes simple.

La vacuna de la presente invención contendrá una cantidad inmunoprotectora de los antígenos y puede prepararse mediante técnicas convencionales.

La preparación de la vacuna se describe de modo general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61, Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, editado por Powel y Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. La encapsulación en liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, patente US 4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas se revela, por ejemplo, por Likhite, patente US 4.372.945 y por Armor et al., patente US 4.474.757.

En las vacunas típicas, la cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos. Tal cantidad variará dependiendo del inmunógeno específico empleado. Generalmente, cabe esperar que cada dosis comprenderá 1-1000 \mug de proteína, preferiblemente 2-100 \mug y, óptimamente, de 4-40 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna particular se puede establecer mediante estudios estándar que involucran la observación de títulos de anticuerpos y otras respuestas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una dosis de recuerdo en alrededor de 4 semanas.

Además de la vacunación de personas susceptibles a infecciones por VPH o VHS, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar para tratar, inmunoterapéuticamente, a los pacientes que sufran de dichas infecciones virales.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de fabricación como se describe aquí, de modo que el procedimiento comprende la mezcla de un antígeno del virus del papiloma humano y un antígeno del virus del herpes simple con un adyuvante inductor de TH-1, por ejemplo, 3D-MPL y, preferiblemente, un vehículo, por ejemplo alumbre.

Si se desea, se pueden añadir otros antígenos, en cualquier orden conveniente, para proporcionar composiciones de vacuna multivalentes como se describe aquí.

Los siguientes ejemplos ilustran pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Inmunogenicidad comparativa de VPH Ags/HBs/gD en vacunas monovalentes o combinadas formuladas con AS04 Introducción

Se realizó un estudio de inmunogenicidad en ratones Balb/C utilizando cuatro antígenos diferentes:

1.: Partícula similar al virus compuesta por la proteína L1 del VPH16 (VLP-16)

2.: Partícula similar al virus compuesta por la proteína L1 del VPH18 (VLP-18)

3.: Antígeno gD del VHS-2

4.: HBsAg

formulados con Alum/3D-MPL (AS04) utilizando monomasas preadsorbidas de antígeno o 3D-MPL sobre Al(OH)_{3} o AIPO_{4}.

Las formulaciones de 3D-MPL/Al(OH)_{3} se denominan al AS04D mientras que las formulaciones basadas en 3D-MPL/AIPO_{4} se denominan al AS04C.

Se valoraron las siguientes vacunas:

1.: VLP16 + VLP18 AS04D;

2.: gD AS04D;

3.: HBs AS04C.

y se evaluó el potencial de combinar estas vacunas.

La meta de este experimento fue comparar la inmunogenicidad de dos diferentes combinaciones de AS04 compuestas de:

1.: VLP16 + VLP18 y gD; o bien

2.: VLP16 + VLP18 y gD y HBs Ag.

El protocolo experimental se describe detalladamente en la sección de Materiales y Procedimientos.

En resumen, se inmunizó intramuscularmente dos veces a un grupo de 10 ratones en intervalos de 3 semanas con varias formulaciones basadas en Ag. Se monitorizaron la respuesta de anticuerpos a las Ag VLPs, gD y HBs, así como el perfil isotípico inducido por la vacunación, mediante ELISA en el día 14 post II. En ese mismo punto temporal, se analizó la producción de citoquinas (IFN\gamma/IL5) tras re-estimulación in vitro de células esplénicas con antígenos de VLPs, gD o HBs.

Materiales y procedimientos Formulación Composiciones de la formulación

VLP16, VLP18, gD y HBs fueron formulados con 3D-MPL sobre sal de aluminio.

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Componentes utilizados

Componente	Concentración	Tampón
VPH 16 VLP	560 \mug/ml	Tris 20 mM/NaCl 500 mM
VPH 18 VLP	550 \mug/ml	NaCl 500 mM/NaPO_{4} 20 mM
Al(OH)_{3}	10380 \mug/ml	H_{2}O
HBs	1219 \mug/ml	PO_{4} 10 mM/NaCl 150 mM
gD	443 \mug/ml	PBS pH 7,4
3D-MPL	1170 \mug/ml	Agua para inyección
AlPO_{4}	5 mg/ml	NaCl 150 mM

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Adsorción a) Adsorción de VLPs

Los productos crudos de VLP16 y VLP18 purificados se añaden a Al(OH)_{3} para obtener una razón de 2 \mug de VLP/10 \mug Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la formulación final.

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b) Adsorción de gD

Se mezclan 2 \mug de gD con 10 \mug de Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la formulación final.

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c) Adsorción de HBs

Se mezclan 2 \mug de HBs con 10 \mug de AIPO_{4}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la formulación final.

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d) Adsorción de 3D-MPL

Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL con 10 \mug de Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la formulación final.

Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL con 10 \mug de AIPO_{4}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la formulación final.

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Formulación

Se mezclan H_{2}O y NaCl (concentrada 10x) y tras 10 minutos de agitación a temperatura ambiente, se añaden los diferentes componentes: antígeno adsorbido, 3D-MPL adsorbido y Al(OH)_{3} (véase la tabla a continuación). Se agitan a temperatura ambiente durante 10 minutos y se almacenan a 4ºC hasta la inyección.

\newpage

	Antígeno(s)	Inmunoestimulantes	Vehículo
Grupo	Tipo	\mug	Tipo	\mug	Tipo	\mug
A	gD	2			Al(OH)_{3}	10
	VLP16	2			Al(OH)_{3}	10
	VLP18	2			Al(OH)_{3}	10
			3D-MPL	5	Al(OH)_{3}	10
					Al(OH)_{3}	10
B	gD	2			Al(OH)_{3}	10
	VLP16	2			Al(OH)_{3}	10
	VLP18	2			Al(OH)_{3}	10
	HBs	2			AlPO_{4}	10
			3D-MPL	5	Al(OH)_{3}	10
C	gD	2			Al(OH)_{3}	10
			3D-MPL	5	Al(OH)_{3}	10
					Al(OH)_{3}	30
D	VLP16	2			Al(OH)_{3}	10
	VLP18	2			Al(OH)_{3}	10
			3D-MPL	5	Al(OH)_{3}	10
					Al(OH)_{3}	20
E	HBs	2			AlPO_{4}	10
			3D-MPL	5	Al(OH)_{3}	10
					Al(OH)_{3}	30

Serología de ratones Serología de anti-VLP-16 y anti-VLP-18

Se realizó la cuantificación de anticuerpos de anti-VLP16 y anti-VLP18 mediante ELISA utilizando VLP16 503/1 (20/12/99) y VLP18 504/2 (25/10/99F) como antígenos de revestimiento. Las soluciones de antígeno y anticuerpo se utilizaron a 50 \mul por pocillo. El antígeno fue diluido a una concentración final de 0,5 \mug/ml en PBS y fue adsorbido durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino. Diluciones seriadas 2x de suero (empezando por una dilución a 1/400) en el tampón de saturación se añadieron a las placas revestidas de VLP y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS con un 0,1% de Tween 20 y se añadió a cada pocillo Ig anti-ratón conjugada a biotina (Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/1500 y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Tras el paso de lavado, se añadió el complejo de biotina-streptavidina conjugado con peroxidasa (Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/1000 durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha mencionado arriba y se incubaron durante 20 minutos con una solución de o-fenilenodiamina (Sigma) al 0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03%, 0,1% de Tween 20, en tampón citrato pH 4,5 0,05M. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 490/630 nm. Los títulos de ELISA se calcularon a partir de una referencia por SoftmaxPro (utilizando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en
UE/ml.

Respuesta anti-gD

Se realizó una cuantificación de anticuerpo anti-gD mediante ELISA utilizando gD (gD 43B318) como antígeno de revestimiento. Se utilizaron las soluciones de antígeno y anticuerpo a 50 \mul por pocillo. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación; 100 \mul/pocillo). Se añadieron diluciones seriadas 2x de suero (empezando por una dilución al 1/100) en el tampón de saturación a las placas revestidas de gD y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS con 0,1% de Tween 20 y se añadieron a cada pocillo IgG1, IgG2a, IgG2b o Ig anti-ratón conjugadas a biotina (Amersham, UK) diluidas en el tampón de saturación al 1/1000 y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Tras un paso de lavado, se añadió el complejo de biotina-streptavidina conjugado con peroxidasa (Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/1000 durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha descrito arriba y se incubaron durante 20 minutos con una solución de o-fenilenodiamina (Sigma) al 0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03%, 0,1% de Tween 20, en tampón citrato 0,05M pH 4,5. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 490/630 nm. Los títulos de ELISA se calcularon a partir de una referencia por SoftmaxPro (utilizando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en UE/ml.

Serología de anti-HBs

Se realizó una cuantificación de anticuerpo anti-HBs mediante ELISA utilizando HBs (Hep 286) como antígeno de revestimiento. Se utilizaron las soluciones de antígeno y anticuerpo a 50 \mul por pocillo. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Se añadieron diluciones seriadas 2x de suero (empezando por una dilución al 1/100) en el tampón de saturación a las placas revestidas de HBs y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS con 0,1% de Tween 20 y se añadieron a cada pocillo Ig anti-ratón conjugadas a biotina (Amersham, UK) diluidas a 1/1500, o IgG1, IgG2a, IgG2b anti-ratón conjugadas a biotina (IMTECH, USA) diluidas respectivamente a 1/4000, 1/8000, 1/4000 en tampón de saturación y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Tras un paso de lavado, se añadió el complejo de biotina-streptavidina conjugado con peroxidasa (Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/1000 durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha descrito arriba y se incubaron durante 20 minutos con una solución de o-fenilenodiamina (Sigma) al 0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03%, 0,1% de Tween 20, en tampón citrato 0,05M pH 4,5. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 490/630 nm. Los títulos de ELISA se calcularon a partir de una referencia por SoftmaxPro (utilizando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en UE/ml.

Producción de citoquinas

Dos semanas después de la segunda inmunización, se sacrificó a los ratones, se extrajeron los bazos asépticamente y se mezclaron. Se prepararon suspensiones celulares en un medio de RPMI 1640 (GIBCO) que contenían 2 mM de L-glutamina, antibióticos, 5x10^{-5} M 2-mercaptoetanol y 5% de suero fetal de ternera. Se cultivaron las células en una concentración final de 5x10^{6} células/ml, en 1 ml por cada placa de 24 pocillos de fondo plano con diferentes concentraciones (10-1 \mug/ml) de cada uno de los Ags (antígenos de VLPs, gD o HBs). Se recolectaron los sobrenadantes 96 horas más tarde y se congelaron hasta que se les analizó para detectar la presencia de IFN\gamma e IL5 mediante
ELISA.

IFN\gamma (Genzyme)

Se realizó la cuantificación de IFN\gamma mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Se utilizaron las soluciones de las muestras y los anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) fueron revestidas durante la noche a 4ºC con 50 \mul de anticuerpos de hámster frente a IFN\gamma de ratón, diluidos a 1,5 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5. Después se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Diluciones seriadas 2x de sobrenadante obtenido de una estimulación in vitro (empezando a ½) en tampón de saturación se añadieron a las placas revestidas de anti-IFN\gamma y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS con Tween al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió anti-IFN\gamma de ratón generado en cabra conjugado a biotina diluido en tampón de saturación a una concentración final de 0,5 \mug/ml a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Tras un paso de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido a 1/10000 en tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas como se ha descrito arriba y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 10 minutos. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se calcularon utilizando una curva patrón (IFN\gamma de ratón estándar) por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en pg/ml.

IL5 (Pharmingen)

Se realizó la cuantificación de IL5 mediante ELISA utilizando reactivos de Pharmingen. Se utilizaron las soluciones de la muestra y los anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) fueron revestidas durante la noche a 4ºC con 50 \mul de anticuerpos de rata frente a IL5 de ratón diluidos a 1 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5. Después se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Diluciones seriadas 2x de sobrenadante procedente de una estimulación in vitro (empezando a ½) en tampón de saturación se añadieron a las placas revestidas de anti-IL5 y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS con Tween 0,1% (tampón de lavado) y se añadió anticuerpo anti-IL5 de ratón generado en rata conjugado a biotina diluido en tampón de saturación en una concentración final de 1 \mug/ml a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Tras un paso de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido a 1/10000 en tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas como se ha descrito arriba y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 15 minutos. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se calcularon utilizando una curva patrón (IL5 de ratón recombinante) por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en pg/ml.

Grupos

Se inmunizó intramuscularmente a grupos de 10 ratones de Balb/C con las formulaciones siguientes:

TABLA 1 Grupos y formulaciones

Grupo	Formulación
A	VLP16 2 \mug / VLP18 2 \mug / gD 2 \mug / 3D-MPL 5 \mug / Al(OH)_{3} 50 \mug
B	VLP16 2 \mug / VLP18 2 \mug / HBs 2 \mug / gD 2 \mug / 3D-MPL 5 \mug / Al(OH)_{3} 40 \mug / AlPO_{4} 10 \mug
C	gD 2 \mug / 3D-MPL 5 \mug / Al(OH)_{3} 50 \mug
D	VLP16 2 \mug / VLP18 2 \mug / 3D-MPL 5 \mug / Al(OH)_{3} 50 \mug
E	HBs 2 \mug / 3D-MPL 5 \mug / AlPO_{4} 10 \mug / Al(OH)_{3} 40 \mug

Los detalles de las formulaciones se han descrito anteriormente en Materiales y Procedimientos.

Resultados 1. Serología a) Respuesta de Anti-VLP16

Se midieron las respuestas humorales (Ig) por ELISA utilizando VLP16 503-1 (20/12/99) como antígeno de revestimiento. Se analizó suero del día 14 post II.

La Figura 1 muestra las respuestas de anticuerpos Ig anti-VLP16 medidas en sueros individuales en el día 14 post II.

Los títulos de anti-VLP16 obtenidos después de inmunización con la combinación de Ag VLPs, gD y HBs (grupo B) fueron ligeramente más bajos que los obtenidos con la combinación de VLPs y gD (grupo A) o la formulación monovalente de VLPs (grupo D) (GMT de 27578 frente a 48105 UE/ml frente a 44448 UE/ml, respectivamente). Antes del análisis estadístico, se aplicó el test de T-Grubbs a cada población para exclusión de datos. Se eliminaron del análisis dos ratones de grupos A y D que no respondieron.

Las diferencias observadas entre los grupos se mostraron como estadísticamente no significativas utilizando la prueba de Student Newman Keuls.

b) Respuesta de anti-VLP18

Se midieron las respuestas humorales (Ig) mediante ELISA utilizando VLP18 504-2 (25/10/99) como antígeno de revestimiento. Se analizó suero del día 14 post II.

La Figura 2 muestra respuesta de anticuerpos Ig anti-VLP18 medida en sueros individuales en el día 14 post II.

Los títulos de anti-VLP18 obtenidos después de inmunización con la combinación de Ag VLPs, gD y HBs (grupo B) estaban en el mismo rango que los títulos obtenidos con la combinación de VLPs y gD (grupo A) o con la formulación monovalente de VLPs (grupo D) (GMT de 56078 frente a 88786 UE/ml frente a 76991 UE/ml, respectivamente).

Antes del análisis estadístico, se aplicó el test de T-Grubbs a cada población para exclusión de datos. Se eliminaron del análisis dos ratones de grupos A y D que no respondieron.

Las diferencias observadas se mostraron como estadísticamente no significativas utilizando análisis unidireccional de varianza.

c) Respuesta de anti-gD

Se midieron las respuestas humorales (Ig e isotipos) mediante ELISA utilizando gD como antígeno de revestimiento. Se analizó suero del día 14 post II.

La Figura 3 muestra respuestas de anticuerpos anti-gD medidas en sueros individuales en el día 14 post II.

Con respecto a la respuesta de anti-gD, se observó una ligera disminución en el GMT obtenido con la combinación de VLPs/gD/HBs (grupo B) en comparación con gD solo (grupo C) o con la combinación de VLPs/gD (grupo A) (GMT de 18631 frente a 32675 frente a 27058 UE/ml, respectivamente).

Antes del análisis estadístico, se aplicó el test de T-Grubbs a cada población para exclusión de datos. Se eliminaron del análisis dos ratones del grupo A que no respondieron.

Se realizó un análisis unidireccional de varianza sobre títulos de anti-gD después de una transformación logarítmica decimal de los datos post II. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las tres formulaciones.

La distribución isotípica analizada sobre los sueros combinados fue la siguiente:

	Distribución isotípica (%)
	IgG1	IgG2a	IgG2b
Grupo A	96	3	2
Grupo B	96	3	2
Grupo C	97	1	1

No se observó ninguna diferencia en el perfil isotípico inducido por las tres formulaciones: se indujo principalmente la respuesta de IgG1 (96-97% de IgG1) en los tres grupos como se describe en la tabla anterior.

d) Respuesta de anti-HBs

Se midieron las respuestas humorales (Ig e isotipos) mediante ELISA utilizando Ag HBs (Hep286) como antígeno de revestimiento. Se analizó suero del día 14 post II.

La Figura 4 muestra las respuestas de anticuerpos anti-HBs medidas en sueros individuales en el día 14 post II.

Se observa una respuesta ligeramente más baja de anticuerpo anti-HBs en la combinación de grupo B que comprende los antígenos VLPs, gD y HBs en comparación con el HBs solo (grupo E) (GMT de 28996 UE/ml frente a 20536 UE/ml).

Se realizó análisis unidireccional de variancia sobre títulos de anti-HBs después de una transformación logarítmica decimal de los datos post II. No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre el grupo B (VLPs/HBs/gD) frente a el grupo E (HBs AS04) utilizando el test de Student Newman Keuls.

La distribución isotípica analizada sobre sueros combinados fue como se muestra a continuación y no mostró ninguna diferencia entre los dos grupos con una proporción de IgG2a que se mantiene en la vacuna combinada.

	Distribución isotípica (%)
	IgG1	IgG2a	IgG2b
Grupo B	54	24	21
Grupo E	56	23	21

2. Respuesta inmune mediada por células

Las respuestas inmunes mediadas por células (producción de IFN\gamma/IL5) se evaluaron en el día 14 post II después de la re-estimulación in vitro de células esplénicas tanto con antígenos VLPs como gD o HBs. Para cada grupo de ratones, se recogieron combinaciones de 5 órganos. El proceso experimental se describe detalladamente en Materiales y Procedimientos.

3. Producción de citoquinas a) Re-estimulación in vitro con VLP16 y VLP18

La Figura 5 muestra la producción de citoquinas monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de re-estimulación in vitro con VLP16.

La Figura 6 muestra la producción de citoquinas monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de re-estimulación in vitro con VLP18.

No se ha observado ningún efecto claro de rango de dosis utilizando dosis de 10 \mug y 1 \mug de Ag para la re-estimulación con ninguno de los antígenos VLP sobre la producción de citoquinas.

Se observó un perfil TH1 claro con todas las formulaciones.

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TABLA 2 Razón de IFN-\gamma/IL-5 tras una re-estimulación in vitro con VLP16 y VLP18

Razón IFN/IL-5	Grupo A	Grupo B	Grupo D
VLP16	10 \mug/ml	5,2	8,9	11,8
VLP16	1 \mug/ml	15,1	14,3	16,5

Razón de IFN/IL-5	Grupo A	Grupo B	Grupo D
VLP18	10 \mug/ml	19,6	11,1	16,1
VLP18	1 \mug/ml	23,2	14,3	18,2

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b) Re-estimulación in vitro con gD

La Figura 7 muestra la producción de citoquinas monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de re-estimulación in vitro con antígeno gD.

No se ha observado ningún efecto claro de rango de dosis cuando se compararon las dosis de 10 \mug y 1 \mug de Ag para la re-estimulación.

El IFN-\gamma se produce en una concentración mucho más alta en comparación con la IL-5 (Tabla 3) indicando un perfil TH1 claro de la respuesta inmune en todos los grupos evaluados (monovalente frente a combinación).

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TABLA 3 Razón de IFN-\gamma/IL-5 tras una re-estimulación in vitro con gD

Razón de IFN/IL-5	Grupo A	Grupo B	Grupo C
gD	10 \mug/ml	6,2	7,2	3,1
gD	1 \mug/ml	6,2	11,2	2,3

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c) Re-estimulación in vitro con HBs

La Figura 8 muestra la producción de citoquinas monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de re-estimulación in vitro con HBs.

Se observó un nivel significativo de producción de IFN-\gamma pero no de producción de IL5 para el grupo B. Como se muestra en la Tabla 2, se observó una producción más alta de IFN-\gamma en el grupo E en comparación con el grupo B. Sin embargo, se observó un alto valor de fondo de IFN-\gamma en el grupo E (monovalente de HBs) para el control sin ningún antígeno para la re-estimulación. Se observó una razón muy alta de IFN-\gamma/IL-5 con la vacuna monovalente, indicando que se induce una fuerte respuesta TH1. De manera similar, se midió una alta razón IFN-\gamma/IL-5 con la vacuna combinada, confirmando la capacidad de esta formulación para inducir también una respuesta
TH1.

TABLA 4 Razón de IFN-\gamma/IL-5 tras una re-estimulación in vitro con HBs

Razón de IFN/IL-5	Grupo B	Grupo E
HBs	10 \mug/ml	15,8	65,3
HBs	1 \mug/ml	7,6	67,6

Conclusiones

Se evaluó en ratones de Balb/C el efecto de la combinación de Ag VLPs/gD o VLPs/gD/HBs formulada en AS04 sobre la inmunogenicidad:

En lo que se refiere al análisis serológico, no se observó ninguna interferencia de la combinación de Ag sobre la serología de anti-VLPs, anti-gD y anti-HBs.

La combinación de antígenos VLPs y gD o VLPs, gD y HBs no interfirió con el perfil isotípico de la respuesta de anticuerpos mostrada por las vacunas monovalentes de gD y HBs.

En la evaluación de citoquinas, el perfil TH-1 (razón IFN-\gamma/IL-5) observado con cada vacuna monovalente se confirmó con los grupos de vacunas combinadas.

Claims

1. Una composición vacunal adecuada para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones por el virus del papiloma humano e infecciones por el virus del herpes simple que comprenden:

a) un antígeno gD del virus del herpes simple (VHS) 2; y

b) un antígeno L1 del virus del papiloma humano (VPH),

en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de la respuesta celular TH1, de modo que la composición no contenga un antígeno de la hepatitis B.

2. Una composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 1 que adicionalmente comprende un vehículo.

3. Una composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2 en la cual el estimulador preferencial de la respuesta celular TH1 se selecciona del grupo de adyuvantes que consisten en: monofosforil lípido A 3 de-O-acilado, monofosforil lípido A 3 de-O-acilado en el cual el tamaño de las partículas de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado es preferiblemente aproximadamente o menos que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido de CpG.

4. Una composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 3 en la cual el estimulador preferencial de la respuesta celular TH1 es monofosforil lípido A 3 de-O-acilado.

5. Una composición vacunal de acuerdo con la reivindicación 4 que adicionalmente comprende alumbre.

6. Una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 en la cual el antígeno VHS es una proteína gD truncada del VHS-2.

7. Una composición vacunal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la cual el antígeno del virus del papiloma humano se deriva del VPH 6.

8. Una composición vacunal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la cual el antígeno del virus del papiloma humano se deriva del VPH 11.

9. Una composición vacunal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la cual el antígeno del virus del papiloma humano se deriva del VPH 16.

10. Una composición vacunal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la cual el antígeno del virus del papiloma humano se deriva del VPH 18.

11. Una composición vacunal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de la 2 a la 10 en la cual el vehículo se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y tocoferol y un aceite en emulsión acuosa.