ES2261237T3 - Vacuna contra vhb y vph. - Google Patents
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Abstract
Una composición vacunal que comprende un antígeno de superficie de la hepatitis B y un antígeno del virus del papiloma humano (VPH), en conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferente de la respuesta celular TH1, de modo que la composición vacunal no comprenda un antígeno del virus del herpes simple, de modo que la composición sea adecuada para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones por el virus del papiloma humano e infecciones de hepatitis B y de modo que el antígeno de VPH comprenda la proteína principal de la cápsida L1 del VPH a partir del VPH16 y/o VPH18 o una fusión de la proteína D de Haemophilus influenza B con la proteína E7 del VPH16.
Description
Vacuna contra VHB y VPH.
Esta invención se refiere a nuevas formulaciones
de vacunas, procedimientos para su preparación y su uso en
terapéutica. En particular, la presente invención se refiere a
vacunas combinadas para su administración a adoles-
centes.
centes.
Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN
asociados a tumores que son altamente específicos de especie. Hasta
ahora, se han descrito más de 70 genotipos individuales del virus
del papiloma humano (VPH). Los VPHs son generalmente específicos
bien de la piel (por ejemplo, VPH-1 y -2) o bien de
las superficies mucosas (por ejemplo VPH-6 y -11) y
normalmente causan tumores benignos (verrugas) que persisten durante
varios meses o años. Tales tumores benignos pueden ser preocupantes
para los individuos en cuestión pero no tienden a suponer una
amenaza para la vida, con pocas excepciones.
Algunos VPHs están también asociados a cánceres.
La asociación positiva más fuerte entre un VPH y un cáncer humano es
aquella que existe entre el VPH-16 y
VPH-18 y el carcinoma cervical. El cáncer cervical
es tumor maligno más común en los países en vías de desarrollo con
cerca de 500.000 nuevos casos en el mundo cada año. En nuestros
días, es técnicamente posible combatir activamente las infecciones
primarias por VPH-16 e incluso cánceres ya
establecidos que contienen un VPH-16 mediante la
utilización de vacunas. Para una revisión sobre las perspectivas
para la vacunación profiláctica y terapéutica contra el
VPH-16, véase Cason J. Clin. Immunother.,
1994; 1(4) 293-306 y Hagenesee M. E.,
Infections in Medicine, 1997, 14(7),
555-556, 559-564.
Hoy día, se han aislado y caracterizado los
diferentes tipos de VPHs con la ayuda de sistemas de clonación en
bacterias y más recientemente mediante amplificación por PCR. Se ha
definido la organización molecular de los genomas de los VPH de
modo comparativo con la del bien caracterizado virus del papiloma
bovino tipo 1 (VPB1).
Otros VPH de particular interés son los
serotipos 31, 33 y 45.
Aunque existen variaciones poco importantes,
todos los genomas de VPHs descritos tienen por lo menos siete genes
tempranos, del E1 al E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una
región reguladora en dirección 5' alberga las secuencias
regulatorias que parecen controlar la mayoría de los eventos
transcripcionales en el genoma del VPH.
Los genes E1 y E2 están involucrados en la
replicación viral y el control transcripcional respectivamente y
tienden a ser interrumpidos durante la integración viral. E6 y E7
están involucrados en la transformación inducida por el virus, lo
que implica también al E5 según evidencias recientes.
En los VPHs involucrados en el carcinoma
cervical tales como el VPH 16 y 18, el proceso oncogénico comienza
tras de la integración de ADN viral. La integración resulta en la
inactivación de los genes que codifican las proteínas de la cápsida
L1 y L2 y en la instauración de una sobreexpresión mantenida de las
dos proteínas tempranas E6 y E7 que llevará a la pérdida gradual de
la diferenciación celular normal y al desarrollo del carcinoma.
El carcinoma del cuello del útero es común en
mujeres y se desarrolla a través de un periodo precanceroso
intermedio hacia el carcinoma invasivo que frecuentemente lleva a la
muerte. Los periodos intermedios de la enfermedad se conocen como
neoplasia cervical intraepitelial y están graduados del I al III en
términos de gravedad creciente.
Clínicamente, la infección por VPH del tracto
anogenital femenino se manifiesta como condiloma plano cervical,
cuyo signo característico es la coilocitosis que afecta
predominantemente a las células superficiales e intermedias del
epitelio cervical escamoso.
Los coilocitos, que son la consecuencia de un
efecto citopático del virus, aparecen como células multinucleadas
con un claro halo perinuclear. El epitelio se engrosa con
queratinización anormal responsable de la apariencia verrugosa de
la lesión.
Tales condilomas planos, cuando son positivos
para los serotipos del VPH 16 ó 18, son factores de alto riesgo para
la evolución hacia neoplasia cervical intraepitelial (NCI) y
carcinoma in situ (CIS) que se consideran en sí mismos
lesiones precursoras del carcinoma cervical invasivo.
WO 96/19496 revela variantes de las proteínas E6
y E7 del virus del papiloma humano, en particular proteínas de
fusión de E6/E7 con una deleción en ambas proteínas E6 y E7. Se dice
que estas proteínas de fusión delecionadas son inmunogénicas.
Las vacunas basadas en la proteína L1 del VPH se
revelan en WO94/00152, WO94/20137, WO93/02184 y WO94/05792. Tal
vacuna puede comprender el antígeno L1 como un monómero, un
capsómero o una partícula similar al virus. Tales partículas pueden
comprender adicionalmente proteínas L2. Las vacunas basadas en L2 se
describen, por ejemplo, en WO93/00436. Otras vacunas para el VPH se
basan en las proteínas tempranas, tales como la E7 o proteínas de
fusión tales como L2-E7.
Son bien conocidas las vacunas para la
profilaxis de las infecciones de la hepatitis B que comprenden uno o
más antígenos de la hepatitis B. Por ejemplo, la vacuna
Engerix-B (marca registrada) de SmithKline Beecham
Biologicals se utiliza para prevenir la hepatitis B. Esta vacuna
comprende un antígeno de superficie de hepatitis B (específicamente,
el antígeno S de 226 aminoácidos descrito en Harford et al.,
en Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (Supl. 2), p.
65-70) y se formula utilizando hidróxido de aluminio
como adyuvante.
Es necesario obtener una combinación de vacunas
eficaz para prevenir enfermedades a las cuales los adolescentes son
particularmente propensos.
La presente invención proporciona una
composición vacunal que incluye un antígeno de superficie de la
hepatitis B y un antígeno del virus de papiloma humano (VPH) en
conjunción con un adyuvante que es un estimulador preferencial de
la respuesta celular TH1 de modo que la composición vacunal no
comprenda un antígeno del virus del herpes simple, tal que la
composición es adecuada para el tratamiento o profilaxis de
infecciones por el virus de papiloma humano y de infecciones por
hepatitis B y en la cual el antígeno de VPH comprende la principal
proteína de la cápsida L1 del VPH a partir del VPH 16 y/o VPH 18 o
una fusión de la proteína D de Haemophilus influenzae B con
la proteína E7 del VPH 16.
Tindle et al., Virology, vol. 200,
1994, p. 547-557 revela la inserción de secuencias
de ADN que codifican epítopos B lineares inmunodominantes y un
epítopo T cooperador "universal" de la proteína transformante
E7 del virus del papiloma humano (VPH) tipo 16 en la secuencia
completa del gen HBcAg clonada en un plásmido de expresión
bacteriano inducible (pPN1.0).
WO9517209 revela una composición vacunal que
comprende una emulsión oleosa en agua opcionalmente con monofosforil
lípido A 3 de-O-acilado y QS21.
La composición vacunal de la invención resulta
muy beneficiosa para su administración a adolescentes que se pueden
encontrar particularmente en riesgo de infección por VHB y/o
VPH.
Opcionalmente, la composición vacunal de la
invención comprende adicionalmente uno o más de entre otros varios
antígenos como se describe a continuación.
Se ha encontrado que las composiciones
vacunales, de acuerdo con la invención, sorprendentemente no
muestran interferencia, lo que quiere decir que la respuesta inmune
a cada antígeno en la composición de la invención es esencialmente
la misma que la que se obtiene por cada antígeno dado
individualmente en conjunción con un adyuvante que es un
estimulador preferencial de la respuesta celular TH1.
La vacuna Havrix (marca registrada) también de
SmithKline Beecham Biologicals es un ejemplo de una vacuna que se
puede utilizar para prevenir las infecciones de hepatitis A. Está
formulada con hidróxido de aluminio como adyuvante. Esta vacuna
comprende una cepa atenuada del virus de la hepatitis A
HM-175 inactivado con formol (formaldehído): véase
Andre et al., (Prog. Med. Virol., vol. 37, pág.
1-24).
Como se utiliza aquí, el término antígeno viral
de la hepatitis A (VHA) se utiliza para referirse tanto a proteína
derivada del virus de la hepatitis A como a una cepa atenuada de
VHA, opcionalmente inactivada, por ejemplo, con formaldehído. Si el
antígeno del VHA es una proteína derivada del virus de la hepatitis
A, puede ser opcionalmente una proteína recombinante.
La vacuna Twinrix (marca registrada) es una
combinación de un antígeno de la hepatitis B recombinante con el
virus de la hepatitis A atenuado e inactivado, mencionado arriba. La
vacuna se puede utilizar para proteger contra la hepatitis A y la
hepatitis B simultáneamente.
La patente europea 0 339 667 (Chemo Sero)
describe el concepto general de la combinación de un antígeno de la
hepatitis A y un antígeno de la hepatitis B para crear una vacuna
combinada. En esa memoria descriptiva, se afirma que el adyuvante
que se utiliza no es crítico: sólo tiene que ser capaz de aumentar
la actividad inmune hasta un límite deseado y no causar ningunos
efectos secundarios. Se afirma que se puede utilizar un gel de
aluminio, particularmente, un gel de hidróxido de aluminio y un gel
de fosfato de aluminio.
En un siguiente aspecto, la invención
proporciona una composición vacunal que comprende un antígeno de
superficie de la hepatitis B y un antígeno del virus de papiloma
humano (VPH) en conjunción con un adyuvante que es un estimulador
preferencial de la respuesta celular TH1 de modo que la composición
vacunal no comprenda un antígeno del virus del herpes simple, tal
que la composición es adecuada para el tratamiento o profilaxis de
infecciones por el virus del papiloma humano y de infecciones por
hepatitis B y en la cual el antígeno de VPH comprende la principal
proteína de la cápsida L1 del VPH a partir del VPH 16 y/o VPH 18 o
una fusión de la proteína D de Haemophilus influenzae B con
la proteína E7 del VPH 16, de modo que la vacuna adicionalmente
comprende un antígeno viral de la hepatitis A (VHA).
Tal vacuna resulta muy beneficiosa para su
administración a los adolescentes que pueden estar particularmente
en riesgo de infección por VHB y/o VPH y/o de infección por VHA.
Una respuesta inmune se puede dividir a grandes
rasgos en dos categorías extremas que son una respuesta humoral o
una respuesta inmune mediada por células (tradicionalmente
caracterizada por mecanismos de protección basados en anticuerpos y
efectores celulares, respectivamente). Estas categorías de respuesta
han sido denominadas como respuestas inmunes de tipo
TH-1 (respuesta mediada por células) y respuestas
inmunes de tipo TH-2 (respuesta humoral).
Las respuestas inmunes de tipo
TH-1 extremas se pueden caracterizar por la
generación de linfocitos T citotóxicos restringidos a haplotipo y
específicos de antígeno y respuestas de células natural
killer. En ratones, las respuestas de tipo TH-1
se caracterizan frecuentemente por la generación de anticuerpos del
subtipo IgG2a mientras que en el ser humano éstas se corresponden
con los anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas inmunes de tipo
TH-2 se caracterizan por la generación de un rango
de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen la IgG1 en ratones.
Se puede considerar que la causa última que está
detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son
las citoquinas. Niveles altos de citoquinas de tipo
TH-1 tienden a favorecer la inducción de respuestas
inmunes mediadas por células frente a un antígeno determinado,
mientras que niveles altos de citoquinas de tipo
TH-2 tienden a favorecer la inducción de respuestas
inmunes humorales frente al antígeno.
La distinción entre las respuestas inmunes de
tipo TH-1 y TH-2 no es absoluta. En
realidad, un individuo desarrollará una respuesta inmune que se
describe como predominantemente TH-1 o como
predominantemente TH-2. Sin embargo, frecuentemente
es conveniente considerar las familias de citoquinas en los términos
descritos en clones de células T CD4+ murinas por Mosmann y Coffman
(Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989), TH1 and TH2 cells:
different patterns of lymphokine secretion lead to different
functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág.
145-173). Tradicionalmente, las respuestas de
tipo TH1 se asocian con la producción de citoquinas de tipo
INF-\gamma por los linfocitos T. Otras citoquinas
frecuentemente asociadas de manera directa con la inducción de
respuestas inmunes de tipo TH1 no se producen mediante las células
T, como es el caso de la IL-12. En contraste, las
respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10 y del factor de necrosis tumoral
\beta
(TNF-\beta).
(TNF-\beta).
Se sabe que ciertos adyuvantes de las vacunas
son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de
citoquinas tanto de tipo TH1 como de TH2. Tradicionalmente, los
mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune
después de una vacunación o una infección incluyen medidas directas
de la producción de citoquinas de TH1 o TH2 por los linfocitos T
in vitro tras re-estimulación con antígeno
y/o (por lo menos, en ratones) la medida de la relación IgG1:IgG2a
en respuestas de anticuerpos específicos de antígeno.
Por lo tanto, un adyuvante de tipo TH1 es aquel
que estimula poblaciones aisladas de células T para producir altos
niveles de citoquinas de tipo TH1 cuando se
re-estimulan con antígeno in vitro e induce
respuestas de inmunoglobulina específicas de antígeno asociadas con
un isotipo de tipo TH1.
Los adyuvantes que son capaces de estimular
preferentemente la respuesta celular TH1 se describen en la
Solicitud de Patente Internacional nº WO 94/00153 y WO
95/17209.
Uno de estos adyuvantes es monofosforil lípido A
3 de-O-acilado
(3D-MPL). Se describe en GB 2220211 (Ribi).
Químicamente, es una mezcla de monofosforil lípido A 3
de-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas
aciladas y se fabrica por Ribi Immunochem, Montana. Una forma
preferente de monofosforil lípido A 3
de-O-acilado se revela en la Patente
Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals, S.A.).
Preferiblemente, las partículas de
3D-MPL son lo suficientemente pequeñas como para ser
esterilizadas por filtración a través de una membrana de 0,22
micras (como se describe en la Patente Europea nº 0 689 454). El
3D-MPL estará presente en el intervalo de 10
\mug-100 \mug, preferiblemente de
25-50 \mug por dosis, en la cual el antígeno
estará presente típicamente en un intervalo de 2-50
\mug por dosis.
Otro adyuvante preferente comprende QS21, una
fracción purificada por Hplc no tóxica derivada de la corteza de
Quillaja saponaria Molina. Opcionalmente, ésta se puede
mezclar con monofosforil lípido A 3
de-O-acilado
(3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento de la producción del QS21 se
revela en la patente US nº 5.057.540.
Las formulaciones de adyuvante no reactogénico
que contienen QS21 se han descrito anteriormente (WO 96/
33739). Se ha mostrado que tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol son eficaces adyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno. Estas composiciones vacunales que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de QS21 y colesterol.
33739). Se ha mostrado que tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol son eficaces adyuvantes estimulantes de TH1 cuando se formulan junto con un antígeno. Estas composiciones vacunales que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de QS21 y colesterol.
Otros adyuvantes que son estimuladores
preferenciales de respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos
inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas como se
revela en WO 96/02555.
Las combinaciones de diferentes adyuvantes que
estimulan TH1, tales como los aquí arriba mencionados, son también
contempladas como suministradoras de un adyuvante que es un
estimulador preferencial de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21
se puede formular junto con 3D-MPL. La razón
QS21:3D-MPL estará típicamente en el orden de 1:10 a
10:1; preferentemente de 1:5 a 5:1 y a menudo esencialmente 1:1. El
intervalo preferente para la sinergia óptima es de 2,5:1 a 1:1 de
3D-MPL:QS21.
Preferiblemente, también está presente un
vehículo en la composición vacunal de acuerdo con la invención. El
vehículo puede ser un aceite en emulsión acuosa o una sal de
aluminio, tales como el fosfato de aluminio o el hidróxido de
aluminio.
Una emulsión de aceite en agua preferente
comprende un aceite metabolizable, tales como el escualeno, el alfa
tocoferol y el Tween 80. Adicionalmente, el aceite en emulsión
acuosa puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
En un aspecto particularmente preferente, los
antígenos en la composición vacunal de acuerdo con la invención se
combinan con 3D-MPL y alumbre.
Típicamente, para la administración a humanos,
el QS21 y el 3D-MPL se encontrarán en una vacuna en
el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como de
10-100 \mug, preferentemente de 10
\mug-50 \mug por dosis. Típicamente, el aceite
en agua compenderá del 2 al 10% de escualeno, del 2 al 10% de alfa
tocoferol y del 0,3 al 3% de Tween 80. Preferiblemente, la razón
escualeno: alfa tocoferol es igual o menor que 1, puesto que esto
proporciona una emulsión más estable. El Span 85 también puede
estar presente a un nivel del 1%. En algunos casos, puede ser
ventajoso que la vacuna de la presente invención además contenga un
estabilizador.
El aceite no tóxico en las emulsiones acuosas
contiene preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo, un
escualano o un escualeno, un emulsificador, por ejemplo Tween 80, en
un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo,
solución salina tamponada con fosfato.
Una formulación de adyuvante particularmente
potente que contiene QS21, 3D-MPL y tocoferol en una
emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210.
El antígeno del VPH en la composición de la
invención se deriva preferiblemente del VPH 16 y/o 18.
El antígeno de VPH en la composición vacunal de
acuerdo con la invención, comprende la principal proteína de la
cápsida del VPH, la proteína L1 y, opcionalmente, la proteína L2 del
VPH 16 y/o VPH 18. En esta realización, la forma preferente de la
proteína L1 es una proteína L1 truncada. Preferiblemente, la
proteína L1 está en la forma de una partícula similar al virus (VLP;
virus-like particle). La proteína L1 se puede
fusionar con otra proteína del VPH, en particular la E7 para formar
una fusión de L1-E7. Las VLP quiméricas que
comprenden L1-E o
L1-L2-E son particularmente
preferentes.
En otra realización preferente, el antígeno de
VPH en la composición de la invención se deriva de una proteína E7,
en particular de E7 unida a una proteína inmunológica de fusión
asociada que tiene epítopos de células T.
En una forma preferente de esta realización de
la invención, la proteína inmunológica de fusión asociada se deriva
de la proteína D de Haemophilus influenzae B.
Preferiblemente, el derivado de proteína D comprende aproximadamente
el primer 1/3 de la proteína, en particular aproximadamente los
primeros 100-110 aminoácidos
N-terminales.
Las proteínas de fusión en esta realización de
la invención comprenden la proteína D-E7 del VPH 16.
La parte de la proteína D preferiblemente comprende el primer 1/3
de la proteína D.
Las proteínas de la presente invención se
expresan preferiblemente en E. coli. En una realización
preferente, las proteínas se expresan con una cola de histidina que
comprende de 5 a 9 y, preferiblemente, seis residuos de histidina.
Tienen la ventaja de facilitar la purificación. La descripción de la
fabricación de tales proteínas se describe completamente en la
solicitud en tramitación junto con la presente patente del Reino
Unido nº GB 9717953.5.
El antígeno del VPH en la composición vacunal se
puede adsorber sobre Al(OH)_{3}. Preferiblemente, la
VLP L1 se adsorbe sobre Al(OH)_{3}.
El antígeno viral de la hepatitis B (VHB) en la
composición de la invención es típicamente un antígeno de superficie
de la hepatitis B.
La preparación del antígeno de superficie de la
hepatitis B (HBs Ag) está bien documentada. Véase por ejemplo
Hartford et al., en Develop. Biol. Standard 54, p. 125
(1983), Gregg et al., en Biotechnology, 5, p. 479 (1987),
EP-A-0 226 846,
EP-A-0 299 108 y referencias ahí
incluidas.
Como se utiliza aquí, la expresión "antígeno
de superficie de la hepatitis B", aquí abreviada como
"HBsAg" o "HBS" incluye cualquier antígeno HBsAg o sus
fragmentos que muestre la antigenicidad del antígeno de superficie
del VHB. Se entenderá que además de la secuencia de 226 aminoácidos
del antígeno HBsAg (véase Tiollais et al., Nature, 317, 489
(1985) y referencias ahí incluidas) HBsAg como se describe aquí,
pueden contener, si se desea, toda o parte de una secuencia
pre-S como se describe en las referencias arriba
citadas y en EP-A-0 278 940. HBsAg
como se describe aquí, pueden también referirse a variantes, por
ejemplo, el "mutante de escape" descrito en WO 91/14703. En un
aspecto siguiente, el HBsAg puede comprender una proteína descrita
como L* en la Solicitud de Patente Europea nº. 0 414 374, es decir,
una proteína, cuya secuencia de aminoácidos se compone de partes de
la secuencia de aminoácidos de la proteína grande (L) del virus de
la hepatitis B (subtipo ad o ay), caracterizada de modo que la
secuencia de aminoácidos de la proteína consista bien de:
(a) los residuos 12-52, seguidos
por los residuos 133-145, seguidos por los residuos
175-400 de dicha proteína L; o bien
(b) el residuo 12, seguido por los residuos
14-52, seguidos por los residuos
133-145, seguidos por los residuos
175-400 de dicha proteína L.
Los HBsAg también se pueden referir a los
polipéptidos descritos en EP 0 198 474 o EP 0 304 578.
Normalmente, los HBsAg estarán en forma de
partícula. Pueden comprender proteína S sola o pueden presentarse
como partículas compuestas, por ejemplo (L*, S) tal que L* será como
se ha definido anteriormente y S indica la proteína S del antígeno
de superficie de la hepatitis B.
Los HBsAg se pueden adsorber sobre fosfato de
aluminio como se ha descrito en WO93/24148.
Preferiblemente, el antígeno de la hepatitis B
(VHB) utilizado en la formulación de la invención, es el antígeno S
de HBsAg como se utiliza en el producto comercial
Engerix-B (marca registrada; SmithKline Beecham
Biologicals).
Una vacuna que comprende el antígeno de
superficie de la hepatitis B en conjunción con
3D-MPL fue descrita en la Solicitud de la Patente
Europea 0 633 784.
A continuación se describen ejemplos de
antígenos de patógenos adicionales que pueden ser incluidos en las
composiciones de acuerdo con la invención.
El Virus de Epstein Barr (VEB), un miembro del
grupo de los herpesvirus causa mononucleosis infecciosa como
enfermedad primaria en los seres humanos. Predominantemente, afecta
a los niños o a los adultos jóvenes. Más de un 90% de la población
media adulta está infectada por el VEB, el cual persiste durante
toda la vida en los linfocitos B periféricos. El virus se produce
durante toda la vida en las glándulas parótidas y se transmite
sobre todo mediante intercambio de la saliva a partir de individuos
que producen el virus. Los niños infectados con VEB son en gran
parte asintomáticos o tienen síntomas muy suaves, mientras que los
adolescentes y adultos que se infectan desarrollan una
mononucleosis infecciosa típica caracterizada por fiebre, faringitis
y adenopatía. Las personas que han sido infectadas mantienen
anticuerpos anti-VEB durante el resto de sus vidas y
son, por lo tanto, inmunes ante una posible infección.
Además de su capacidad infecciosa, se ha
mostrado que el VEB transforma a los linfocitos en células que se
dividen rápidamente y por esta razón se le ha implicado en varios
linfomas diferentes, incluyendo el linfoma de Burkitt africano (LB).
Asimismo, el VEB puede estar involucrado en la causa del carcinoma
nasofaríngeo (CNF). Se estima que en todo el mundo ocurren 80.000
casos de carcinoma nasofaríngeo y es más prevalente en poblaciones
étnicas chinas. La mononucleosis infecciosa es la consecuencia de
una infección primaria por VEB. No es una enfermedad que amenace la
vida en ausencia de factores de riesgo adicionales.
Se han descrito cuatro proteínas de la envuelta
viral del VEB que constituyen el así llamado complejo de antígeno
de membrana. Generalmente se les denomina gp 220/350 o gp 250/350 o
simplemente como gp 250 o 350 (véase
EP-A-151079). Existen evidencias
convincentes de que la gp 350 y la gp 250 inducen la producción de
anticuerpos neutralizantes y que los anticuerpos contra la gp 350 y
la gp 250 tienen capacidad neutralizante. Estas proteínas son, por
lo tanto, candidatos para una posible vacuna contra el VEB. Para más
información sobre la aplicación de la gp 250/350 para la profilaxis
y el tratamiento de enfermedades relacionadas con el VEB, véase EP 0
173 254.
La principal glicoproteína de superficie del VEB
gp350/220 infecta a células diana humanas a través de la interacción
con la proteína de la membrana celular CD21. La glicoproteína
gp350/220 es la diana principal para los anticuerpos
neutralizantes del VEB en seres humanos y se ha mostrado que algunas
formas de gp350/220 protegen contra la enfermedad relacionada con el
VEB. Preferiblemente, la composición vacunal de acuerdo con la
invención comprende la gp 350 del VEB aunque se pueden utilizar
otros antígenos protectores.
El VHS-2 es el agente etiológico
primario del herpes genital. VHS-2 y
VHS-1 (el agente causal del herpes labial) se
caracterizan por su capacidad tanto de inducir enfermedades agudas
como de establecer una infección latente, sobre todo en células
neuronales de los ganglios.
Se estima que el herpes genital es padecido por
alrededor de 5 millones de personas solamente en los Estados Unidos
con 500.000 casos clínicos registrados cada año (infección primaria
y recurrente). La infección primaria típicamente ocurre después de
la pubertad y se caracteriza por la aparición localizada de lesiones
cutáneas dolorosas que persisten durante un periodo de entre 2 y 3
semanas. Durante los siguientes seis meses después de la infección
primaria, el 50% de los pacientes experimentará una recurrencia de
la enfermedad. Alrededor de un 25% de los pacientes puede
experimentar entre 10-15 episodios recurrentes de la
enfermedad cada año. En pacientes inmunocomprometidos,
la incidencia de recurrencia de alta frecuencia es estadísticamente más alta que en la población de pacientes normales.
la incidencia de recurrencia de alta frecuencia es estadísticamente más alta que en la población de pacientes normales.
Ambos virus VHS-1 y
VHS-2 tienen un elenco de componentes glicoproteicos
localizados en la superficie del virus. Estos se conocen como gB,
gC, gD y gE, etc.
Cuando se incluye un antígeno del VHS en la
composición de la invención se deriva preferiblemente del
VHS-2, típicamente de la glicoproteína D. La
glicoproteína D está localizada en la membrana viral y se encuentra
asimismo en el citoplasma de las células infectadas (Eisenberg R. J.
et al.; J. Virol. 1980, 35, 428-435).
Comprende 393 aminoácidos que incluyen un péptido señal y tiene un
peso molecular de aproximadamente 60 kDa. De todas las
glicoproteínas de la envuelta del VHS, ésta es probablemente la
mejor caracterizada (Cohen et al.; J. of Virology, 60,
157-166). In vivo, se sabe que desempeña un
papel importante para el acoplamiento viral a las membranas de la
célula. Además, se ha mostrado que la glicoproteína D es capaz de
generar anticuerpos neutralizantes in vivo (Eing et al.;
J. Med. Virology, 127: 59-65). Sin embargo, el
virus VHS-2 latente aún puede reactivarse e inducir
recurrencia de la enfermedad a pesar de la presencia de un título
alto de anticuerpos neutralizantes en los sueros de los
pacientes.
En una realización preferente de la invención,
está presente una glicoproteína D truncada del
VHS-2 de 308 aminoácidos que comprende los
aminoácidos del 1 al 306 que existen de manera natural en la
glicoproteína con la adición de una asparagina y una glutamina, en
el extremo C-terminal de la proteína truncada
desprovista de su región de anclaje a membrana. Esta forma de la
proteína incluye el péptido señal que es eliminado para producir
una proteína madura de 283 aminoácidos. La producción de dicha
proteína en células de ovario de hámster chino se ha descrito en la
patente europea de Genentech
EP-B-139 417.
La glicoproteína D del VHS-2
madura truncada recombinante se utiliza preferentemente en las
formulaciones de la vacuna de la presente invención y se designa
como rgD2t.
Una combinación de este antígeno del
VHS-2 en combinación con el adyuvante
3D-MPL se ha descrito en WO 92/16231.
En un aspecto preferente, la composición vacunal
de la invención comprende adicionalmente un antígeno viral de
Varicela Zoster (antígeno VVZ). Antígenos adecuados del VVZ para su
inclusión en la formulación de la vacuna incluyen
gpI-V, descritos por Longnecker et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307 (1987).
En una realización preferente, se utiliza el gpI
(véase Ellis et al., patente US 4.769.239). Véase también la
Patente Europea nº. 0 405 867 B1.
En otro aspecto preferente, la composición
vacunal de la invención comprende adicionalmente un antígeno del
citomegalovirus humano (CMVH). El CMVH es un virus de ADN humano que
pertenece a la familia de los herpesvirus. El CMVH es endémico en
la mayoría del planeta. En dos tipos de poblaciones, el CMVH es
responsable de condiciones médicas graves. El CMVH es una causa
importante de defectos congénitos en recién nacidos. La segunda
población de riesgo son pacientes inmunocomprometidos, tales como
los que sufren de infección por HIV y aquellos pacientes sometidos
a transplantes. La enfermedad clínica causa una variedad de síntomas
que incluyen fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis
infecciosa. Un antígeno preferente para su uso en una vacuna contra
el CMVH es gB685**, como se describe en la patente WO 95/31555.
Otros inmunógenos para su uso en vacunas contra el CMVH son
proporcionados por la pp65, una proteína de matriz del CMVH, como se
describe en la patente WO 94/00150 (City of Hope).
En un aspecto preferente, la composición vacunal
de la invención comprende adicionalmente tanto un antígeno del VVZ
como un antígeno del CMVH, en particular los antígenos arriba
descritos.
En otro aspecto preferente, la composición
vacunal de la invención comprende adicionalmente un antígeno de
Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii es un protozoo
parásito intracelular obligado responsable de la toxoplasmosis en
animales de sangre caliente incluyendo al hombre. Aunque en general
es clínicamente asintomática en los individuos sanos, la
toxoplasmosis puede causar complicaciones graves en mujeres
embarazadas y en pacientes inmunocomprometidos. Un antígeno
preferente para su uso en una vacuna contra Toxoplasma gondii
es SAG1 (también conocido como P30), como se describe en la patente
WO 96/02654 o Tg34, como se describe en la patente WO 92/11366.
En un aspecto preferente, la composición vacunal
de la invención comprende adicionalmente bien un antígeno del VVZ o
bien un antígeno del CMVH combinados con un antígeno de
Toxoplasma gondii, en particular los antígenos anteriormente
descritos.
En un aspecto preferente, la composición vacunal
de la invención es una vacuna multivalente, por ejemplo, una vacuna
tetra- o pentavalente.
Las formulaciones de la presente invención son
muy eficaces en la inducción de inmunidad protectora, incluso con
unas dosis muy bajas de antígeno (por ejemplo, tan bajas como 5
\mug de rgD2t).
Éstas proporcionan una protección excelente
contra la infección primaria y estimulan, de manera ventajosa, tanto
la respuesta humoral específica (anticuerpos neutralizantes) como la
respuesta inmune mediada células efectoras (DTH).
La presente invención en otro aspecto
proporciona una formulación de vacuna como se describe aquí para su
uso en terapia médica, particularmente para su uso en el tratamiento
o en la profilaxis de infecciones por el virus del papiloma humano
y de infecciones por el virus de la hepatitis B.
La vacuna de la presente invención contendrá una
cantidad inmunoprotectora de los antígenos y puede prepararse
mediante técnicas convencionales.
La preparación de la vacuna se describe de modo
general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61, Vaccine
Design - the subunit and adjuvant approach, editado por Powel y
Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in
Vaccines, editado por Voller et al., University Park
Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. La encapsulación en
liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, patente US
4.235.877. La conjugación de proteínas a macromoléculas se revela,
por ejemplo, por Likhite, patente US 4.372.945 y por Armor et
al., patente US 4.474.757.
En las vacunas típicas, la cantidad de proteína
en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce
una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos
significativos. Tal cantidad variará dependiendo del inmunógeno
específico empleado. Generalmente, cabe esperar que cada dosis
comprenderá 1-1000 \mug de proteína,
preferiblemente 2-100 \mug y, óptimamente, de
4-40 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna
particular se puede establecer mediante estudios estándar que
involucran la observación de títulos de anticuerpos y otras
respuestas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos
pueden recibir una dosis de recuerdo en alrededor de 4 semanas.
Además de la vacunación de personas susceptibles
a infecciones por VPH o VHB, las composiciones farmacéuticas de la
presente invención se pueden utilizar para tratar,
inmunoterapéuticamente, a los pacientes que sufran de dichas
infecciones virales.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un procedimiento de fabricación como se describe aquí,
de modo que el procedimiento comprende la mezcla de un antígeno del
virus del papiloma humano y un antígeno del virus de la hepatitis B
con un adyuvante inductor de TH-1, por ejemplo,
3D-MPL y, preferiblemente, un vehículo, por ejemplo
alumbre.
Si se desea, se pueden añadir otros antígenos,
en cualquier orden conveniente, para proporcionar composiciones de
vacuna multivalentes como se describe aquí. Los siguientes ejemplos
ilustran pero no limitan la invención.
Se realizó un estudio de inmunogenicidad en
ratones Balb/C utilizando cuatro antígenos diferentes:
- 1.
- Partícula similar al virus compuesta por la proteína L1 del VPH16 (VLP-16)
- 2.
- Partícula similar al virus compuesta por la proteína L1 del VPH18 (VLP-18)
- 3.
- PD 1/3 16E7 2M del VPH-16 (E7)
- 4.
- HBs Ag.
formulados con
Alum/3D-MPL (AS04) utilizando monomasas
preadsorbidas de antígeno o 3D-MPL sobre
Al(OH)_{3} o
AlPO_{4}.
Las formulaciones de
3D-MPL/Al(OH)_{3} se denominan AS04D
mientras que las formulaciones basadas en
3D-MPL/AlPO_{4} se denominan AS04C.
Se valoraron las siguientes vacunas:
- 1.
- VLP16 + VLP18 AS04D;
- 2.
- Formulaciones basadas en E7
- 3.
- HBs AS04C.
y se evaluó el potencial de
combinar estas
vacunas.
Los objetivos de este experimento fueron los
siguientes:
1) Comparar la inmunogenicidad de varias
combinaciones de AS04 con VLP16 + VLP18 o bien E7 y HBs Ag.
2) Como las vacunas monovalentes son formuladas
bien sobre AS04C o bien sobre en AS04D:
para comparar la inmunogenicidad de varias
formulaciones de HBs AS04 hechas de AlPO_{4} o una mezcla de
AlO_{4}/Al(OH)_{3} con proporciones diferentes de
formas de Alum; y
para evaluar el efecto de la adsorción de
3D-MPL sobre una fracción de
Al(OH)_{3} y AlPO_{4}, frente a
3D-MPL/Al(OH)_{3} en combinación,
conteniendo antígenos de VLPs o de E7.
El protocolo experimental se describe
detalladamente en la sección de Materiales y Procedimientos.
En resumen, se inmunizó intramuscularmente dos
veces a un grupo de 10 ratones en intervalos de 3 semanas con varias
formulaciones basadas en Ag (1/10HD). Se monitorizaron la respuesta
de anticuerpos a los AgHBs, E7 y VLPs así como el perfil isotípico
inducido por la vacunación, mediante ELISA en el día 14 post II. En
ese mismo punto temporal, se analizó la CMI (respuesta
linfoproliferativa o la producción de citoquinas (IFN\gamma/IL5))
tras re-estimulación in vitro de células
esplénicas con antígenos de HBs, VLPs o E7.
VLP16, VLP18, PD
1/3-VPH16E7-His y HBs sobre AS04C o
AS04D.
| Componente | Concentración | Tampón |
| VPH 16 VLP | 560 \mug/ml | Tris 20 mM/NaCl 500 mM |
| VPH 18 VLP | 550 \mug/ml | NaCl 500 mM/NaPO_{4} 20 mM |
| AL(OH)_{3} | 10380 \mug/ml | H_{2}O |
| PD 1/3-VPH 16 E7-His | 1170 \mug/ml | PO_{4} 20 mM |
| HBs | 1219 \mug/ml | PO_{4} 10 mM/NaCl 150 mM |
| 3D-MPL | 1170 \mug/ml | Agua para inyección |
| AlPO_{4} | 5 mg/ml | NaCl 150 mM |
Los productos crudos de VLP16 y VLP18
purificados se añaden a Al(OH)_{3} a 2 \mug de
VLP/10 \mug Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a
2-8ºC hasta la formulación final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 2 \mug de HBs con 40 \mug de
AlPO_{4}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la
formulación final.
Se mezclan 2 \mug de HBs con 10 \mug de
AlPO_{4}. La mezcla se almacena a 2-8ºC hasta la
formulación final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 2 \mug de E7 con 10 \mug de
Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a
2-8ºC hasta la formulación final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL
con 10 \mug de Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a
2-8ºC hasta la formulación final.
Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL
con 10 \mug de AlPO_{4}. La mezcla se almacena a
2-8ºC hasta la formulación final.
Se mezclan 2,5 \mug de 3D-MPL
con 5 \mug de Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena a
2-8ºC hasta la formulación final.
Se mezclan 2,5 \mug de 3D-MPL
con 5 \mug de AlPO_{4}. La mezcla se almacena a
2-8ºC hasta la formulación final.
Se mezclan H_{2}O y NaCl (concentrada 10x) y
tras 10 minutos de agitación a temperatura ambiente, se añadan los
diferentes componentes: antígeno adsorbido, 3D-MPL
adsorbido y Al(OH)_{3} (véase la tabla a
continuación). Se agitan a temperatura ambiente durante 10 minutos y
se almacenan a 4ºC hasta la inyección. La caracterización in
vitro de la formulación se puede realizar a continuación.
Tabla de grupos y detalles de
las
formulaciones
| Antígeno(s) | Inmunoestimulantes | Vehículo | ||||
| Grupo | Tipo | \mug | Tipo | \mug | Tipo | \mug |
| A | VLP16 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | ||
| VLP18 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| 3D-MPL | 5 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| 20 | ||||||
| B | VPH16E7 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | ||
| 3D-MPL | 5 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| 30 | ||||||
| C | HBs | 2 | AlPO_{4} | 40 | ||
| 3D-MPL | 5 | AlPO_{4} | 10 | |||
| D | HBs | 2 | AlPO_{4} | 10 | ||
| 3D-MPL | 5 | AlPO_{4} | 10 | |||
| Al(OH)_{3} | 30 | |||||
| E | HBs | 2 | AlPO_{4} | 10 | ||
| 3D-MPL | 5 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| Al(OH)_{3} | 30 | |||||
| F | E7 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | ||
| HBs | 2 | AlPO_{4} | 10 | |||
| 3D-MPL | 5 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| Al(OH)_{3} | 20 | |||||
| G | VLP16 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | ||
| VLP18 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| HBs | 2 | AlPO_{4} | 10 | |||
| 3D-MPL | 5 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| Al(OH)_{3} | 10 | |||||
| H | VLP16 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | ||
| VLP18 | 2 | Al(OH)_{3} | 10 | |||
| HBs | 2 | AlPO_{4} | 10 | |||
| 3D-MPL | 2,5 | Al(OH)_{3} | 5 | |||
| 3D-MPL | 2,5 | AlPO_{4} | 5 | |||
| Al(OH)_{3} | 10 |
Se realizó una cuantificación de anticuerpo
anti-HBs mediante ELISA utilizando HBs (Hep 286)
como antígeno de revestimiento. Se utilizaron las soluciones de
antígeno y anticuerpo a 50 \mul por pocillo. El antígeno se
diluyó a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió
durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas microensayo de 96
pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca).
Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que
contenía un 1% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de Tween 20
(tampón de saturación). Se añadieron diluciones seriadas a 2x de
suero (empezando por una dilución al 1/100) en el tampón de
saturación a las placas revestidas de HBs y se incubaron durante 1
hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro veces con
PBS con 0,1% de Tween 20 y se añadieron a cada pocillo Ig
anti-ratón conjugadas a biotina (Amersham, UK)
diluidas a 1/1500, o IgG1, IgG2a, IgG2b anti-ratón
conjugadas a biotina (IMTECH, USA) diluidas respectivamente a
1/4000, 1/8000, 1/4000 en tampón de saturación y se incubaron
durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Tras un paso de lavado, se
añadió el complejo de biotina-streptavidina
conjugado con peroxidasa (Amersham, UK) diluido en tampón de
saturación a 1/1000 durante 30 minutos más a 37ºC. Las placas se
lavaron como se ha descrito arriba y se incubaron durante 20 minutos
con una solución de o-fenilenodiamina (Sigma) al
0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03%, 0,1% de Tween 20, en tampón citrato
0,05 M pH 4,5. La reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2 N y se
leyó a 490/630 nm. Los títulos de ELISA se calcularon a partir de
una referencia por SoftmaxPro (utilizando una ecuación de cuatro
parámetros) y se expresaron en UE/ml.
Se realizó una cuantificación de anticuerpo
anti-E7 mediante ELISA utilizando PD1/3 16E7 2 M
como antígeno de revestimiento. Se utilizaron las soluciones de
antígeno y anticuerpo a 100 \mul por pocillo. El antígeno se
diluyó a una concentración final de 0,5 \mug/ml en PBS y se
adsorbió durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas microensayo
de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc,
Dinamarca). Después, las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC
con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino y un 0,1% de
Tween 20 (tampón de saturación). Se añadieron diluciones seriadas 2x
de suero (empezando por una dilución al 1/100 o al 1/400) en el
tampón de saturación a las placas revestidas de E7 y se incubaron
durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas cuatro
veces con PBS con 0,1% de Tween 20 y se añadieron a cada pocillo Ig,
IgG1, IgG2a, IgG2b anti-ratón conjugadas a biotina
(Amersham, UK) diluidas en el tampón de saturación al 1/1500 y se
incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Tras un paso de
lavado, se añadió el complejo de
biotina-streptavidina conjugado con peroxidasa
(Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/5000 durante 30
minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha descrito
arriba y se incubaron durante 20 minutos con una solución diluida 2x
de tetrametil benzidina (TMB) (Biorad, USA) diluida 2x en tampón
citrato (0,1 M pH=5,8). La reacción se paró con H_{2}SO_{4}
0,5 N y se leyó a 450/630 nm. Los títulos de ELISA se calcularon a
partir de una referencia por SoftmaxPro (utilizando una ecuación de
cuatro parámetros) y se expresaron en UE/ml.
Se realizó la cuantificación de anticuerpos de
anti-VLP16 y anti-VLP18 mediante
ELISA utilizando VLP16 503/1 (20/12/99) y VLP18 504/2 (25/10/99F)
como antígenos de revestimiento. Las soluciones de antígeno y
anticuerpo se utilizaron a 50 \mul por pocillo. El antígeno fue
diluido a una concentración final de 0,5 \mug/ml en PBS y fue
adsorbido durante la noche a 4ºC a los pocillos de placas
microensayo de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate,
Nunc, Dinamarca). Después, las placas se incubaron durante 1 hora a
37ºC con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero bovino.
Diluciones seriadas 2x de suero (empezando por una dilución a 1/400)
en el tampón de saturación se añadieron a las placas revestidas de
VLP y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Se lavaron
las placas cuatro veces con PBS con un 0,1% de Tween 20 y se añadió
a cada pocillo Ig anti-ratón conjugada a biotina
(Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/1500 y se
incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Tras el paso de
lavado, se añadió el complejo de
biotina-streptavidina conjugado con peroxidasa
(Amersham, UK) diluido en tampón de saturación a 1/1000 durante 30
minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha mencionado
arriba y se incubaron durante 20 minutos con una solución de
o-fenilenodiamina (Sigma) al 0,04%, H_{2}O_{2}
al 0,03%, 0,1% de Tween 20, en tampón citrato pH 4,5 0,05 M. La
reacción se paró con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 490/630 nm. Los
títulos de ELISA se calcularon a partir de una referencia por
SoftmaxPro (utilizando una ecuación de cuatro parámetros) y se
expresaron en UE/ml.
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificó a los ratones, se extrajeron los bazos asépticamente y
se mezclaron (un muestreo de 5 órganos por grupo). Se prepararon
suspensiones celulares en un medio de RPMI 1640 (GIBCO) que
contenían 2 mM de L-glutamina, antibióticos,
5x10^{-5} M 2-mercaptoetanol y 1% de suero de
ratón singénico normal. Se cultivaron las células esplénicas en una
concentración final de 2x10^{6} células/ml, en 200 \mul por
cada placa de 96 pocillos de fondo redondo con diferentes
concentraciones (10-0,03 \mug/ml) de cada uno de
los Ags (antígenos de VLPs, E7 o HBs). Cada prueba se realizó por
cuadruplicado. Tras 96 horas de cultivo a 37ºC bajo 5% de CO_{2},
las células fueron pulsadas durante 18 horas con
^{3}H-timidina (Amersham, UK, 5Ci/mmol) a 0,5
\muCi/pocillo y después se recolectaron sobre placas Unifilter
(Packard) con un recolector de células. Se midió la radiactividad
incorporada en un contador de centelleo (Topcount, Packard). Los
resultados fueron expresados en cpm (cpm promedio en pocillos
cuadruplicados) o como índices de estimulación (cpm promedio en
cultivos de células con antígeno/cpm promedio en cultivos de células
sin antígeno).
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificó a los ratones, se extrajeron los bazos asépticamente y
se mezclaron. Se prepararon suspensiones celulares en un medio de
RPMI 1640 (GIBCO) que contenían 2 mM de
L-glutamina, antibióticos, 5x10^{-5} M
2-mercaptoetanol y 5% de suero fetal de ternera. Se
cultivaron las células en una concentración final de 5x10^{6}
células/ml, en 1 ml por cada placa de 24 pocillos de fondo plano con
diferentes concentraciones (10-1 \mug/ml) de cada
uno de los Ags (antígenos de VLPs, E7 o HBs). Se recolectaron los
sobrenadantes 96 horas más tarde y se congelaron hasta que se les
analizó para detectar la presencia de IFN\gamma e IL5 mediante
ELISA.
Se realizó la cuantificación de IFN\gamma
mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Se utilizaron las
soluciones de las muestras y los anticuerpos a 50 \mul por
pocillo. Placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) fueron revestidas
durante la noche a 4ºC con 50 \mul de anticuerpos de hámster
frente a IFN\gamma de ratón, diluidos a 1,5 \mug/ml en tampón
carbonato pH 9,5. Después se incubaron las placas durante 1 hora a
37ºC con 100 \mul de PBS que contenía un 1% de albúmina de suero
bovino y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación). Diluciones
seriadas 2x de sobrenadante obtenido de una estimulación in
vitro (empezando a ½) en tampón de saturación se añadieron a las
placas revestidas de anti-IFN\gamma y se
incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron
cuatro veces con PBS con Tween al 0,1% (tampón de lavado) y se
añadió anti-IFN\gamma de ratón generado en cabra
conjugado a biotina diluido en tampón de saturación a una
concentración final de 0,5 \mug/ml a cada pocillo y se incubó
durante 1 hora a 37ºC. Tras un paso de lavado, se añadió conjugado
AMDEX (Amersham) diluido a 1/10000 en tampón de saturación durante
30 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas como se ha descrito arriba
y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 10 minutos. La
reacción se paró con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450/630 nm.
Las concentraciones se calcularon utilizando
una curva patrón (IFN\gamma de ratón estándar) por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en pg/ml.
una curva patrón (IFN\gamma de ratón estándar) por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en pg/ml.
Se realizó la cuantificación de IL5 mediante
ELISA utilizando reactivos de Pharmingen. Se utilizaron las
soluciones de la muestra y los anticuerpos a 50 \mul por pocillo.
Placas microensayo de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) fueron revestidas
durante la noche a 4ºC con 50 \mul de anticuerpos de rata frente a
IL5 de ratón diluidos a 1 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5.
Después se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC con 100
\mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino y 0,1% de
Tween 20 (tampón de saturación). Diluciones seriadas 2x de
sobrenadante procedente de una estimulación in vitro
(empezando a ½) en tampón de saturación se añadieron a las placas
revestidas de anti-IL5 y se incubaron durante 1 hora
y 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS con
Tween 0,1% (tampón de lavado) y se añadió anticuerpo
anti-IL5 de ratón generado en rata conjugado a
biotina diluido en tampón de saturación en una concentración final
de 1 \mug/ml a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37ºC.
Tras un paso de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido
a 1/10000 en tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Se
lavaron las placas como se ha descrito arriba y se incubaron con 50
\mul de TMB (Biorad) durante 15 minutos. La reacción se paró con
H_{2}SO_{4} 0,4N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se
calcularon utilizando una curva patrón (IL5 de ratón recombinante)
por SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en
pg/ml.
Se inmunizó intramuscularmente a grupos de 10
ratones de Balb/C con las formulaciones siguientes:
| Grupo | Formulación |
| A | VLP16 2 \mug/VLP18 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 50 \mug |
| B | 16E7 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 50 \mug |
| C | HBs 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/AlPO_{4} 50 \mug |
| D | HBs 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/AlPO_{4} 20 \mug/Al(OH)_{3} 30 \mug |
| E | HBs 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/AlPO_{4} 10 \mug/Al(OH)_{3} 40 \mug |
| F | 16E7 2 \mug/HBS 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 40 \mug/AlPO_{4} 10 \mug |
| G | VLP16 2 \mug/VLP18 2 \mug/HBs 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 40 \mug/AlPO_{4} 10 \mug |
| H | VLP16 2 \mug/VLP18 2 \mug/HBs 2 \mug/3D-MPL 5 \mug/Al(OH)_{3} 35 \mug/AlPO_{4} 15 \mug |
Los detalles de las formulaciones se han
descrito anteriormente en Materiales y Procedimientos.
Se midieron las respuestas humorales (Ig e
isotipos) mediante ELISA utilizando Ag HBs (Hep286) como antígeno
de revestimiento. Se analizó suero del día 14 post II.
La Figura 1 muestra las respuestas de
anticuerpos anti-HBs medidas en sueros individuales
en el día 14 post II.
No se observó ninguna diferencia en la respuesta
de anticuerpo anti-HBs entre los protocolos
aplicados para adsorber el 3D-MPL: sobre
Al(OH)_{3} sólo, o sobre AlPO_{4} sólo (grupos C,
D, E) con varias proporciones de Al(OH)_{3} y
AlPO_{4} en la vacuna (GMT de 27905 UE/ml frente a 30832 o 26670
UE/ml).
Se observa una respuesta ligeramente más baja de
anticuerpo anti-HBs en los grupos de combinación G y
H que contienen los antígenos de VLPs y HBs en comparación con HBs
sólo (grupo C) (GMT de 10635 UE/ml o 15589 UE/ml frente a 27905
UE/ml, respectivamente). Los GMT de Anti-HBs
obtenidos en la combinación E7/HBs alcanzaron 19235 UE/ml.
Antes del análisis estadístico, se aplicó el
test de T-Grubbs a cada población para exclusión de
datos. Se eliminó del análisis un ratón de grupo C.
Se realizó un análisis unidireccional de
varianza sobre títulos de anti-HBs después de una
transformación logarítmica de los datos post II. Se observaron
diferencias significativas entre formulaciones (p = 0,0108) y
después se aplicó el test de Student Newman Keuls para comparaciones
múltiples. No se observó una diferencia estadísticamente
significativa entre la combinación del grupo H (VLP/HBs) o el grupo
F (HBs/E7) frente al grupo C (HBs AS04C). Una diferencia
estadísticamente significativa se observó entre el grupo G (VLP/HBs)
y el grupo C (HBs AS04C) (p = 0,0291), sin embargo los intervalos
de confianza del 95% de los dos grupos se solapan y la diferencia
que alcanza una razón de 2,5 podría no ser biológicamente
relevante.
La distribución isotípica analizada sobre sueros
combinados fue como se muestra a continuación y no mostró
diferencias importantes entre los seis grupos.
| Distribución isotípica (%) | |||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | |
| Grupo C | 59 | 31 | 10 |
| Grupo D | 69 | 19 | 12 |
| Grupo E | 66 | 19 | 15 |
| Grupo F | 61 | 22 | 17 |
| Grupo G | 61 | 30 | 9 |
| Grupo H | 46 | 29 | 25 |
Se midieron las respuestas humorales (Ig e
isotipos) mediante ELISA utilizando PD 1/3 16E7 2M como antígeno de
revestimiento. Se analizó suero del día 14 post II de los grupos B y
F.
La Figura 2 muestra las respuestas de
anticuerpos anti-E7 medidas en sueros individuales
en el día 14 post II.
Se observó una ligera disminución en la
respuesta anti-E7, con una disminución a la mitad en
GMT para las combinaciones de HBs/E7 en comparación con E7 sólo
(9626 frente a 22447 UE/ml). Esto se determinó como estadísticamente
no significativo utilizando el test de Student Newman Keuls.
No se observó ninguna diferencia en el perfil
isotípico inducido por las dos formulaciones: principalmente la
respuesta de IgG1 (97-98% de IgG1) como se describe
en la siguiente tabla:
La distribución isotípica analizada sobre sueros
combinados fue la siguiente:
| Distribución isotípica (%) | |||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | |
| Grupo B | 98 | 0 | 1 |
| Grupo F | 97 | 1 | 2 |
Se midieron las respuestas humorales (Ig)
mediante ELISA utilizando VLP16 503-1 (20/12/99)
como antígeno de revestimiento. Se analizó suero del día 14 post
II.
La Figura 3 muestra las respuestas de
anticuerpos de anti-VLP16 Ig medidas en sueros
individuales en el día 14 post II.
Se obtuvieron títulos similares de
anti-VLP16 después de la inmunización tanto con la
combinación de HBs y VLPs (grupo G y H) como con la formulación
monovalente de VLPs (grupo A) (GMT de 19570 o 23448 UE/ml frente a
30311 UE/ml).
Se observaron títulos equivalentes entre las dos
combinaciones preparadas utilizando cualquiera de las maneras para
adsorber el 3D-MPL: Al(OH)_{3} sólo
(grupo G) en comparación con la adsorción mixta sobre
Al(OH)_{3} y AlPO_{4} (grupo H) (GMT de 19570
UE/ml frente a 23448 UE/ml).
Estas diferencias se determinaron como
estadísticamente no significativas utilizando análisis
unidireccional del test de varianza.
Se midieron las respuestas humorales (Ig)
mediante ELISA utilizando VLP18 504-2 (25/10/99)
como antígeno de revestimiento. Se analizó suero del día 14post
II.
Figura 4 muestra la respuesta de anticuerpos
anti-VLP18 Ig medida en sueros individuales en el
día 14 post II.
Se obtuvieron títulos similares de
anti-VLP18 después de la inmunización con la
combinación de HBs y VLPs (grupo G y H) o con las formulaciones
monovalentes del VLP (grupo A) (GMT de 37285 ó 51202 UE/ml frente a
56504 UE/ml).
Se observaron títulos equivalentes (grupos G y
H) entre la combinación preparada utilizando cualquiera de las
maneras para adsorber el 3D-MPL:
Al(OH)_{3} sólo (grupo G) en comparación con la
adsorción mixta sobre Al(OH)_{3} y AlPO_{4}
(grupo H).
Las diferencias observadas se determinaron como
estadísticamente no significativas utilizando análisis
unidireccional de test de varianza.
Las respuestas inmunes mediadas por células
(linfoproliferación, producción de IFN\gamma/IL5) se evaluaron en
el día 14 post II después de la re-estimulación
in vitro de células esplénicas con antígenos HBs, E7 o de
VLPs. Para cada grupo de ratones, se recogieron combinaciones de 5
órganos. El proceso experimental se describe detalladamente en
Materiales y Procedimientos.
La Figura 5 muestra la producción de citoquinas
monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de
re-estimulación in vitro con HBs.
Se observó una producción baja de
IFN-\gamma y de IL5 para todos los grupos pero,
como se muestra en la Tabla 2, se observó una producción más alta
de IFN-\gamma en comparación con la producción de
IL5, con la razón IFN-\gamma/IL-5
indicando que una respuesta comparable TH1 se induce con las vacunas
monovalentes y combinadas. Los resultados del grupo C no se
deberían tomar en consideración puesto que los datos por debajo del
umbral pueden indicar una ausencia de antígeno para la
re-estimulación.
| Razón de IFN/IL-5 | Grupo C | Grupo D | Grupo E | Grupo F | Grupo G | Grupo H | |
| HBs | 10 \mug/ml | 0,3 | 4,0 | 9,4 | 7,9 | 7,9 | 6,6 |
| HBs | 1 \mug/ml | 0,4 | 3,7 | 1,5 | 4,0 | 4,0 | 5,0 |
La Figura 6 muestra la producción de citoquinas
monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de
re-estimulación in vitro con antígeno E7.
Se observó un efecto de rango de dosis cuando se
comparó la dosis del 10 \mug y 1 \mug de Ag para la
re-estimulación.
Se observó una respuesta inespecífica para los
grupos inmunizados con VLPs de proteína L1 de VPH16/18 utilizando
10 \mug de Ag para la re-estimulación.
El IFN-\gamma se produce en
una concentración mucho más alta en comparación con la
IL-5 (Tabla 3) indicando un perfil TH1 claro de la
respuesta inmune en todos los grupos evaluados (monovalente frente a
combinación).
| Razón de IFN/IL-5 | Grupo B | Grupo F | |
| E7 | 10 \mug/ml | 17,7 | 12,9 |
| E7 | 1 \mug/ml | 8,9 | 1,2 |
Las Figuras 7 y 8 muestran la linfoproliferación
después de la re-estimulación in vitro con
VLP16 o VLP18 en el día 14 post II.
Se observaron perfiles comparables para todas
las formulaciones que contenían VLPs (Índices Estimulados Integrados
entre 12-29) con cpm alrededor de 30000 para una
dosis de re-estimulación de 10 \mug de Ag
indicando la ausencia de interferencia entre las varias
formulaciones en este registro.
La Figura 9 muestra la producción de citoquinas
monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de
re-estimulación in vitro con VLP16.
La Figura 10 muestra la producción de citoquinas
monitorizada en células esplénicas después de 96 horas de
re-estimulación in vitro con VLP18.
No se ha observado ningún efecto de rango de
dosis utilizando una dosis de 10 \mug y 1 \mug de Ag para la
re-estimulación con ninguno de los dos antígenos VLP
sobre la producción de ambas citoquinas.
Se observó un perfil claro TH1 en todas las
formulaciones.
| Razón de IFN/IL-5 | Grupo A | Grupo G | Grupo H | |
| VLP16 | 10 \mug/ml | 12,0 | 19,9 | 16,5 |
| VLP16 | 1 \mug/ml | 22,1 | 37,9 | 23,2 |
| Razón de IFN/IL-5 | Grupo A | Grupo G | Grupo H | |
| VLP18 | 10 \mug/ml | 20,5 | 17,9 | 13,4 |
| VLP18 | 1 \mug/ml | 21,8 | 23,7 | 21,0 |
Se evaluó en ratones de Balb/C el efecto de la
combinación de Ag VLPs/HBs o E7/HBs formulada en AS04 sobre la
inmunogenicidad:
En lo que se refiere al análisis serológico, no
se observó ninguna interferencia de la combinación de Ag sobre la
serología de anti-HBs, anti-E7 y
anti-VLPs.
La combinación de antígenos VLPs y HBs o E7 y
HBs no interfirió con el perfil isotípico de la respuesta de
anticuerpos mostrada por las vacunas monovalentes.
El procedimiento de adsorción de
3D-MPL (Al(OH)_{3}, AlPO_{4} o
mezclas de Al(OH)_{3} y AlPO_{4}) no interfirió
con los resultados serológicos.
En los ensayos de linfoproliferación, los
resultados estuvieron disponibles después de la
re-estimulación con los VLPs. En estos grupos, no se
observó ningún efecto negativo de la combinación de Ags en la
respuesta proliferativa.
En la evaluación de citoquinas, se obtuvo una
producción de citoquinas baja (IL-5 e
IFN-\gamma) después de la
re-estimulación con Ag HBs, pero las respuestas
fueron comparables en las vacunas monovalentes y combinadas. Tras
la re-estimulación con E7 o con VLPs, se produjeron
niveles comparables de citoquinas respectivamente en las
combinaciones del E7/HBs o del VLP/HBs en comparación con grupos
monovalentes. El perfil TH-1 observado con cada
vacuna monovalente se mantuvo en los grupos con vacunas
combinadas.
Claims (16)
1. Una composición vacunal que comprende un
antígeno de superficie de la hepatitis B y un antígeno del virus del
papiloma humano (VPH), en conjunción con un adyuvante que es un
estimulador preferente de la respuesta celular TH1, de modo que la
composición vacunal no comprenda un antígeno del virus del herpes
simple, de modo que la composición sea adecuada para su uso en el
tratamiento o profilaxis de infecciones por el virus del papiloma
humano e infecciones de hepatitis B y de modo que el antígeno de VPH
comprenda la proteína principal de la cápsida L1 del VPH a partir
del VPH16 y/o VPH18 o una fusión de la proteína D de Haemophilus
influenzae B con la proteína E7 del VPH16.
2. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 1 que adicionalmente comprende un vehículo.
3. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 1 o con la reivindicación 2 en la cual el estimulador
preferencial de la respuesta celular TH1 se selecciona del grupo de
adyuvantes que comprende: 3D-MPL,
3D-MPL en el cual el tamaño de las partículas de
3D-MPL es preferiblemente aproximadamente o menos
que 100 nm, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un
oligonucleótido de CpG.
4. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 3 en la cual el estimulador preferencial de la
respuesta celular TH1 es 3D-MPL.
5. Una composición vacunal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 en la cual se
encuentra adicionalmente un antígeno del virus de Epstein Barr
(VEB).
6. Una composición vacunal como se define en la
reivindicación 5, en la cual el antígeno de VEB es gp 350.
7. Una composición vacunal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en la cual está
presente adicionalmente un antígeno de la hepatitis A.
8. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 7, en la cual el antígeno del virus de la hepatitis A
(VHA) se deriva de la cepa HM-175.
9. Una composición vacunal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en la cual el
vehículo se selecciona del grupo que comprende hidróxido de
aluminio, fosfato de aluminio y tocoferol y una emulsión de aceite
en agua.
10. Una composición vacunal de acuerdo con las
reivindicaciones de la 1 a la 9 que comprende adicionalmente un
antígeno del virus de la Varicela Zoster (VVZ).
11. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 10 en la cual el antígeno de VVZ es gpl.
12. Una composición vacunal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 que comprende
adicionalmente un antígeno del citomegalovirus humano (CMVH).
13. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 12 en la cual el antígeno de CMVH es gB685* o
pp65.
14. Una composición vacunal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13 que
adicionalmente comprende un antígeno de Toxoplasma
gondii.
15. Una composición vacunal de acuerdo con la
reivindicación 14 en la cual el antígeno de Toxoplasma gondii
es SAG1 o TG34.
16. Una composición vacunal de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 que comprende las
proteínas L2, E6, E7, D-E6, D-E7 o
L2-E7 del VPH y, opcionalmente, además, uno o más de
entre los siguientes: gDt de VHS-2; gp 350 de VEB;
gpl de VVZ; una cepa inactivada HM-175 de VHA;
gB685** o pp65 de CMVH y los antígenos SAG1 o TG34 de Toxoplasma
gondii.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GBGB9921147.6A GB9921147D0 (en) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | Novel composition |
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