BRPI0017420B1 - Composição de vacina, hpv 16 l1 e hpv 18 l1 vpl - Google Patents

Abstract

composição de vacina. novas composições de vacina combinada são fornecidas, compreendendo um antígeno de vírus simplex de herpes (hsv) e um antígeno hpv e opcionalmente em adição um ou mais dos seguintes: um antígeno ebv, um antígeno de hepatite a ou vírus atenuado desativado, um antígeno viral de hepatite b, um antígeno vzv , um antígeno hcmv, um antígeno de toxoplasma gondii. as composições de vacina são formuladas com um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célula th1 tal como 3d-mpl e qs21.

Description

[0001] O presente pedido de patente é um pedido de patente de DIVISÃO do PI 0014171-2 depositado em 07.09.2000.

[0002] Esta invenção refere-se a novas formulações de vacina, métodos para prepará-las e seu uso em terapia. Em particular a presente invenção refere-se a vacinas de combinação para administração para adolescentes.

[0003] Papilomavírus são pequenos vírus de DNA de tumor, que são altamente espécie-específicos. Até o momento, mais de 70 genótipos individuais de papilomavírus humano (HPV) foram descritos. Os HPVs são normalmente específicos ou para superfícies da pele (por exemplo, HPV-1 e -2) ou da mucosa (por exemplo, HPV-6 e -11) e frequentemente causam tumores benignos (verrugas) que persistem por vários meses ou anos. Tais tumores benignos podem ser penosos para os indivíduos afetados porém tendem não ser ameaçadores à vida, com umas poucas exceções.

[0004] Alguns HPVs estão também associados com cânceres. A associação positiva mais forte entre HPV e câncer humano é essa que existe entre HPV-16 e HPV-18 e carcinoma cervical. O câncer cervical é a malignidade mais comum em países desenvolvidos, com cerca de 500.000 novos casos ocorrendo no mundo a cada ano. Atualmente é tecnicamente viável combater ativamente infecções por HPV-16 primárias, e ainda cânceres estabelecidos contendo HPV-16, empregando vacinas. Para uma revisão nas expectativas para vacinação terapêutica e profilática contra HPV-16 observe Cason J., Clin. Immunother 1994; 1(4) 293 - 306 e Hangenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556, 559-564.

[0005] Outros HPVs de interesse particular são os sorotipos 31, 33 e 45.

[0006] Hoje, os diferentes tipos de HPVs têm sido isolados e caracterizados com a ajuda de sistemas de clonagem em bactérias e mais recentemente por amplificação de PCR. A organização molecular dos genomas de HPV tem sido definida em uma base comparativa do tipo 1 de papilomavírus bovino bem caracterizado (BPV 1).

[0007] Embora variações menores ocorram, todos os genomas de HPVs descritos têm pelo menos sete genes iniciais, E1 a E7 e dois genes tardios L1 e L2. Além disso, uma região reguladora a jusante acolhe as sequências reguladoras que aparecem para controlar a maioria dos eventos transcricionais do genoma de HPV.

[0008] Os genes E1 e E2 estão envolvidos no controle trans- cricional e replicação virai, respectivamente, e tendem ser rompidos por integração virai. E6 e E7, assim como evidência recente em relação à E5, demonstram que os mesmos estão envolvidos na transformação virai.

[0009] Nos HPVs envolvidos em carcinoma cervical tal como HPV 16 e 18, o processo oncogênico inicia após a integração de DNA virai. A integração resulta na desativação de genes codificando para proteínas de capsídeos L1 e L2 e na instalação contínua sobre expressão das duas proteínas precoces E6 e E7 que induzirá à perda gradual da diferenciação celular normal e o desenvolvimento do carcinoma.

[00010] O carcinoma do colo do útero é comum em mulheres e desenvolve por meio de um estágio intermediário pré-canceroso ao carcinoma invasivo que frequentemente induz à morte. O estágio intermediário da doença é conhecido como neoplasia intra-epitelial cervical e é de grau I ou III em termos de aumentos de gravidade.

[00011] Clinicamente, a infecção por HPV do trato anogenital feminino manifesta-se como condilomas planos cervicais, a marca para indicar boa qualidade da qual é a cilocitose afetando predomi- nantemente as células intermediárias e superficiais do epitélio escamoso cervical.

[00012] Os cilócitos que são a consequência de um efeito citopático do vírus, aparecem como células multinucleadas com um halo claro perinuclear. O epitélio é engrossado com queratinização anormal responsável pela aparência verrucosa da lesão.

[00013] Tais condilomas planos quando positivos para o sorotipo de HPV 16 ou 18, são fatores de alto risco para a evolução direcionada à neoplasia intra-epitelial cervical (CIN) e carcinoma in situ (CIS) que são por si próprios considerados como lesões precursoras de carcinoma do colo de útero invasivo.

[00014] WO 96/19496 divulga variantes de proteínas E6 e E7 de vírus de papiloma humano, particularmente proteínas de fusão de E6/E7 com uma deleção em ambas as proteínas E6 e E7. Essas proteínas de fusão de deleção são ditas serem imunogênicas.

[00015] As vacinas com base em HPV L1 são divulgadas em WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 e WO 94/05792. Uma tal vacina pode compreender o antígeno L1 como um monômero, um capsômero ou uma partícula tipo vírus. Tais partículas podem adicionalmente compreender proteínas L2. As vacinas com base em L2 são descritas por exemplo em WO 93/00436. Outras vacinas HPV são com base em proteínas iniciais, tal como E7 ou proteínas de fusão tal como L2-E7.

[00016] HSV-2 é o agente etiológico primário de herpes genital. HSV-2 e HSV-1 (o agente causador de herpes labial) são caracterizados pela sua capacidade de induzir ambas doenças agudas e de estabelecer uma infecção latente, primeiramente em células do gânglio neuronais.

[00017] A herpes genital é estimada ocorrer em cerca de 5 milhões de pessoas nos U.S.A, apenas com 500.000 casos clínicos registrados cada ano (infecção recorrente e primária). A infecção primária tipicamente ocorre após a puberdade e é caracterizada pela aparência localizada de lesões da pele dolorida, que persiste durante um período dentre 2 a 3 semanas. Dentro dos seguintes seis meses após a primeira infecção 50% dos pacientes experimentarão uma re-ocorrên- cia da doença. Cerca de 25% dos pacientes podem experimentar entre 10-15 episódios de re-ocorrência da doença a cada ano. Em pacientes imunocomprometidos a incidência de re-ocorrência de frequência elevada é estatisticamente mais elevada do que na população de paciente normal.

[00018] Ambos vírus HSV-1 e HSV-2 têm vários componentes de glicoproteína localizados na superfície do vírus. Esses são conhecidos como gB, gC, gD e gE, etc.

[00019] Há uma necessidade para vacinas de combinação eficaz para prevenir doenças às quais adolescentes são particularmente propensos.

[00020] A presente invenção fornece uma composição de vacina compreendendo: (a) um antígeno de vírus simplex de herpes (HSV); e (b) um antígeno de papilomavírus humano (HPV) em combinação com um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célula TH1.

[00021] A composição de vacina da invenção é de grande benefício para administração a adolescentes os quais podem estar particularmente em risco de infecção de HSV, e/ou HPV.

[00022] Opcionalmente a composição de vacina da invenção adicionalmente compreende um ou mais vários outros antígenos como descrito abaixo.

[00023] Tem sido constatado que as composições de vacina de acordo com a invenção surpreendentemente não mostraram nenhuma interferência, isto é, para dizer que a resposta imune a cada antígeno na composição da invenção é essencialmente a mesma como aquela que é obtida por cada antígeno determinado individualmente em conjunção com um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célula TH1.

[00024] As vacinas para a profilaxia de infecções de hepatite B, compreendendo um ou mais antígenos de hepatite B, são bem- conhecidas. Por exemplo a vacina Engerix-B (nome comercial) de SmithKline Beecham Biologicals é empregada para prevenir hepatite B. Esta vacina compreende antígeno de superfície de hepatite B (especificamente o antígeno-S de aminoácido 226 descrito em Harford e outros, em Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (Suppl. 2), p 65 - 70) e é formulada empregando hidróxido de alumínio como adjuvante.

[00025] A vacina Havrix (nome comercial), também de SmithKline Beecham Biologicals é um exemplo de uma vacina que pode ser empregada para prevenir infecções de hepatite A. É formulada com hidróxido de alumínio como adjuvante. Esta vacina compreende uma cepa atenuada do vírus de hepatite A HM-175 desativado com formol (formaldeído); observe André e outros (Prog. Med. Virol., volume 37, páginas 1 - 24).

[00026] Como empregado aqui, o termo antígeno de hepatite A virai (HAV) é empregado para referir-se à ou a uma proteína derivada do vírus de hepatite A ou uma cepa atenuada de HAV, opcionalmente desativada, por exemplo, com formaldeído. Se o antígeno de HAV é uma proteína derivada do vírus de hepatite A pode opcionalmente ser uma proteína recombinante.

[00027] A vacina tulinnix (nome comercial) é uma combinação de um antígeno de hepatite B com o vírus de hepatite A atenuado desativado acima mencionado. A vacina pode ser empregada para proteger contra hepatite A e hepatite B simultaneamente.

[00028] A patente Europeia 0 339 667 (Chermo Sero) descreve o conceito geral de combinação de um antígeno de hepatite A e um antígeno de hepatite B para fazer uma vacina de combinação. Neste relatório descritivo é declarado que o adjuvante que é empregado não é crítico: ele deve ser capaz somente de realçar a atividade imune a uma extensão desejada e não causa quaisquer efeitos colaterais. É declarado que o gel de alumínio pode ser empregado, em particular gel de hidróxido de alumínio e gel de fosfato de alumínio.

[00029] A composição da vacina de acordo com a invenção pode compreender, além dos antígenos de HPV e HSV, um antígeno de HAV ou um antígeno de HBV ou mais preferivelmente uma combinação de ambos antígenos HAV e HBV.

[00030] Uma tal vacina é de grande benefício para administração a adolescentes os quais podem estar particularmente em risco de infecção por HSV, e/ou HPV, e/ou infecção por HAV, e/ou infecção por HBV.

[00031] Uma resposta imune pode ser amplamente dividida em duas categorias extremas, sendo uma resposta imune mediada por célula ou humoral (tradicionalmente caracterizada por anticorpos ou mecanismos efetores celulares de proteção, respectivamente). Essas categorias de resposta têm sido denominadas respostas do tipo TH1 (resposta mediada por célula), e respostas imunes do tipo TH2 (resposta humoral).

[00032] As respostas imunes tipo TH1 extremas podem ser caracterizadas pela geração de antígenos específicos, linfócitos T citotóxicos restritos a halotipo, e respostas de células de morte natural. Em respostas tipo TH1 em camundongos são muitas vezes caracterizadas pela geração de anticorpos do subtipo lgG2a, ao mesmo tempo que no ser humano esse corresponde a anticorpos tipo lgG1. As respostas imunes tipo TH2 são caracterizadas pela geração de uma faixa de isótipos de imunoglobulina incluindo em lgG1 de camundongos.

[00033] Pode ser considerado que a força de impulso atrás do desenvolvimento desses dois tipos de respostas imunes são citocinas. Os níveis elevados de citocinas tipo TH1 tendem favorecer a indução de respostas imunes mediadas por células ao determinado antígeno, ao mesmo tempo que níveis elevados de citocinas do tipo TH2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.

[00034] A distinção de respostas imunes do tipo TH2 e TH1 não é absoluta. Na realidade um indivíduo suportará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente TH1 ou predominantemente TH2. Entretanto, é muitas vezes conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquelas descritas em clones de células T CD4 + ve de camundongos por Mosmann e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different funcional properties. Annual Review of Immunology, 7, páginas 145 - 173). Tradicionalmente, as respostas do tipo TH1 são associadas com a produção das citocinas INF-y por T-linfócitos. Outras citocinas muitas vezes diretamente associadas com a indução de respostas imunes tipo TH1 não são produzidas por T-células, tal como IL-12. Ao contrário, respostas do tipo TH2 são associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e fator de necrose de tumoral-β (TNF-β).

[00035] É conhecido que certas vacinas adjuvantes são particularmente adequadas para a estimulação de qualquer das duas respostas de citocina tipo TH1 ou TH2. Tradicionalmente os melhores indicadores do equilíbrio TH1:TH2 da resposta imune após uma vacinação ou infecção inclui medição direta da produção de citocinas TH1 ou TH2 por linfócitos T in vitroapós re-estimulação com antígeno, e/ou (pelo menos em camundongos) a medição da relação de lgG1: lgG2a de respostas de anticorpo específica de antígeno.

[00036] Desse modo, um adjuvante do tipo TH1 é um que estimula populações de célula T isolada para produzir níveis elevados de citocinas tipo TH1 quando reestimulado com antígeno in vitro,e induz respostas de imunoglobulina específicas de antígeno associadas com isótipo tipo TH1.

[00037] Os adjuvantes que são capazes de estimulação preferencial da resposta de célula TH1 estão descritos no Pedido de Patente Internacional n° WO 94/00153 e WO 95/17209.

[00038] O monofosforil lipídeo A 3 De-0 acilado (3D-MPL) é um tal adjuvante. Isto é conhecido por GB 2220211 (Ribi). Quimicamente é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3 De-0 acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Uma forma preferida de monofosforil lipídeo A 3 De-0 acilado está divulgada na Patente Europeia 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

[00039] Preferivelmente, as partículas de 3D-MPL são pequenas o suficiente para serem estéreis filtradas através de uma membrana de 0,22 micron (como descrito na Patente Europeia número 0 689 454). 3D-MPL estará presente na faixa de 10 ^g -100 pg preferivelmente 25 - 50 pg por dose onde o antígeno tipicamente estará presente em uma faixa de 2 - 50 iig por dose.

[00040] Outro adjuvante preferido compreende QS21, uma fração não-tóxica purificada por HPLC derivada da casca de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente isto pode ser misturado com monofosforil lipídeo A 3 De-0 acilado (3D-MPL), opcionalmente junto com um veículo.

[00041] O método de produção de QS21 é divulgado na patente U.S. n° 5.057.540.

[00042] As formulações adjuvantes não-reatogênicas contend QS21 têm sido descritas previamente (WO 96/33739). Tais formulações compreendendo QS21 e colesterol têm sido mostradas ser adjuvantes de estimulação de TH1 bem-sucedidos quando formuladas junto com um antígeno. Desse modo as composições de vacina que formam parte da presente invenção podem incluir uma combinação de QS21 e colesterol.

[00043] Outros adjuvantes que são estimuladores preferenciais de resposta de célula TH1 incluem oligonucleotídeo imunomodulador, por exemplo, sequências CpG não-metiladas como divulgada na WO 96/02555.

[00044] As combinações de adjuvantes de estimulação de TH1 diferentes, tal como aqueles mencionados acima, são também com- templadas como fornecimento de um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta celular TH1. Por exemplo, QS21 pode ser formulado junto com 3D-MPL. A relação de QS21:3D-MPL tipicamente será na ordem de 1:10 para 10:1; preferivelmente 1:5 para 5:1 e muitas vezes substancialmente 1:1. A faixa preferida para sinergia ótima é 2,5:1 para 1:1 3D-MPL:QS21.

[00045] Preferivelmente um veículo está também presente na composição de vacina de acordo com a invenção. O veículo pode ser uma emulsão de óleo-em-água, ou um sal de alumínio, tal como fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.

[00046] Uma emulsão de óleo-em-água preferida compreende um óleo metabolizável, tal como esqualeno, alfa tocoferol e Tween 80. Adicionalmente a emulsão de óleo-em-água pode conter span 85 e/ou lecitina e/ou tricaprilina.

[00047] Em um aspecto particularmente preferido os antígenos na composição de vacina de acordo com a invenção são combinados com 3D-MPL e alumínio.

[00048] Tipicamente para administração humana QS21 e 3D-MPL estarão presentes em uma vacina na faixa de 1 pg - 200 pxg, tal como 10 - 100 pg, preferivelmente 10 pg - 50 pg por dose. Tipicamente o óleo-em-água compreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80. Preferivelmente a relação de esqualeno: alfa tocoferol é igual ou menor do que 1 quando este fornece uma emulsão mais estável. Span 85 pode também está presente em um nível de 1%. Em alguns casos pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção ainda contenham um estabilizador.

[00049] As emulsões de óleo-em-água não-tóxicas contêm um óleo não-tóxico, por exemplo, esqualano ou esqualeno, um emulsificador, por exemplo Tween 80, em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser, por exemplo, salina tamponada por fosfato.

[00050] Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo-em- água está descrita em WO 95/17210.

[00051] O antígeno HPV na composição da invenção é preferivelmente derivado de HPV 16 e/ou 18, ou de HPV 6 e/ou 11, ou HPV 31, 33 ou 45.

[00052] Em uma modalidade preferida o antígeno HPV na composição de vacina de acordo com a invenção compreende a proteína de capsídeo L1 principal de HPV e opcionalmente a proteína L2, particularmente de HPV 16 e/ou HPV 18. Nesta modalidade, a forma preferida da proteína L1 é uma proteína L1 truncada. Preferivelmente o L1, opcionalmente em uma fusão L1-L2, está na forma de uma partícula tipo vírus (VLP). A proteína L1 pode ser fundida à outra proteína HPV, em particular E7 para formar uma fusão L1-E7. VLPs quiméricos compreendendo L1-E ou L1-L2-E são particularmente preferidos.

[00053] Em outra modalidade preferida, o antígeno HPV na composição da invenção é derivado de uma proteína E6 ou E7, em particular E6 ou E7 ligadas a um par de fusão imunológica tendo epítopos de célula T.

[00054] Em uma forma preferida desta modalidade da invenção, o par de fusão imunológica é derivado de proteína D de Heamophilus influenzaB. Preferivelmente o derivativo de proteína D compreende aproximadamente o primeiro 1/3 da proteína, em particular aproximadamente os primeiros 100 -110 aminoácidos de terminação N.

[00055] As proteínas de fusão preferidas nesta modalidade da invenção compreendem proteína D-E6 de HPV 16, Proteína D-E7 de HPV 16, Proteína D-E7 de HPV 18 e Proteína D-E6 de HPV 18. A parte da proteína D preferivelmente compreende o primeiro 1/3 de proteína D.

[00056] Em ainda outra modalidade da invenção, o antígeno HPV está na forma de uma fusão L2-E7, particularmente de HPV 6 e/ou HPV 11.

[00057] As proteínas da presente invenção preferivelmente são expressadas em E. coli. Em uma modalidade preferida as proteínas são expressadas com uma cauda de Histidina compreendendo entre 5 a 9 e preferivelmente seis resíduos de Histidina. Essas são vantajosas n auxílio da purificação. A descrição da fabricação de tais proteínas é totalmente descrita no pedido de patente UK copendente n° GB 9717953.5.

[00058] O antígeno HPV na composição de vacina pode ser absorvido em AI(OH)s.

[00059] O antígeno HSV na composição da invenção é preferivelmente derivado de HSV-2, tipicamente glicoproteína D. A glicoproteína D está localizada na membrana virai, e é também encontrada no citoplasma de células infectadas (Eisenberg R.J., e outros; J de Virol 1980, 35, 428 - 435). Ela compreende 393 aminoácidos incluindo um peptídeo de sinal e tem um peso molecular de aproximadamente 60 kD. De todas as glicoproteínas de envoltório de HSV esta é provavelmente a melhor caracterizada (Cohen e outros; J. de Virology, 60, 157 - 166). In vivo é conhecido por representar um papel importante na ligação viral a membranas da célula. Entretanto, a glicoproteína D tem sido mostrada ser capaz de extrair anticorpos de neutralização in vivo (Eing e outros, J. Med. Virology 127:59 - 65). Entretanto, vírus HSV-2 latente pode ainda ser reativado e induz re- ocorrência da doença a despeito da presença de títulos de anticorpos de neutralização elevados no soro dos pacientes.

[00060] Em uma modalidade preferida da invenção o antígeno de HSV é uma glicoproteína D de HSV-2 truncada de 308 aminoácidos que compreende aminoácidos de 1 até 306 glicoproteínas de ocorrência natural com a adição de Asparagina e Glutamina na extremidade C-terminal da proteína truncada desprovida de sua região de âncora de membrana. Esta forma da proteína inclui o peptídeo de sinal que é clivado para produzir uma proteína de 283 aminoácidos maduros. A produção de uma tal proteína em células de ovário de Hamster Chinês tem sido descrita na Patente Europeia de Genentech EP-B-139 417.

[00061] O truncado de glicoproteína D HSV-2 maduro recombinante é preferivelmente empregado nas formulações de vacina da presente invenção e é designada rgD2t.

[00062] Uma combinação deste antígeno HSV-2 em combinação com o adjuvante 3D-MPL tem sido descrita em WO 92/16231.

[00063] Quando um antígeno viral de hepatite B (HBV) é incluído na composição da invenção este é tipicamente antígeno de superfície de hepatite B.

[00064] A preparação de antígeno de superfície de hepatite B (HBsAg) é bem documentada. Observe por exemplo, Harford e outros, em Develop. Biol Standard 54, página 125 (1983), Gregg e outros em Biotechnology, 5, página 479 (1987), EP-A- 0 226 846, EP-A- 0 299 108 e referências nesta.

[00065] Como empregado aqui a expressão 'antígeno de superfície B de Hepatite', abreviado aqui como 'HBsAg' ou 'HBS' inclui qualquer antígeno HBsAg ou fragmento deste exibindo a antigenicidade de antígeno de superfície HBV. Será entendido que em adição sequências de 226 aminoácidos do antígeno HBsAg S (observe Tiollais e outros, Nature, 317, 489 (1985) e referências desta) HBsAg como aqui descrito pode, se desejado, conter toda ou parte de uma sequência pré-S como descrito nas referências acima e em EP-A- 0 278 940. HBsAg como aqui descrito pode também referir-se a variantes, por exemplo o 'mutante de escape' descrito em WO 91/14703. Em um outro aspecto o HBsAg pode compreender uma proteína descrita como L* no Pedido de Patente Europeia n° 0 414 374, que é referido como uma proteína, a sequência de aminoácido da qual consiste de partes da sequência de aminoácido da proteína de grandes vírus de hepatite B (L) (subtipo ad ou ay), caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido da proteína consiste de qualquer dos dois: (a) resíduos 12 - 52, seguidos por resíduos 133 - 145, seguidos por resíduos 175 - 400 da referida proteína L; ou (b) resíduo 12, seguido por resíduos 14-52, seguido por resíduos 133 - 145, seguido por resíduos 175 - 400 da referida proteína L.

[00066] HBsAg pode também referir-se a polipeptídeos descritos em EP 0 198 474 ou EP 0 304 578.

[00067] Normalmente o HBsAg estará na forma de partícula. Ele pode compreender somente proteína S ou pode ser como partículas de compósito, por exemplo (L*, S) onde L* é como definido acima e S denota a proteína S de antígeno de superfície de hepatite B.

[00068] O HBsAg pode ser absorvido em fosfato de alumínio como descrito em WO 93/24148.

[00069] Preferivelmente um antígeno de hepatite B (HBV) empregado na formulação da invenção é antígeno S HBsAg como empregado no produto comercial Engerix-B (nome comercial; SmithKline Beecham Biologicals).

[00070] Uma vacina compreendendo antígeno de superfície de hepatite B em conjunto com 3D-MPL foi descrita no pedido de Patente Europeia 0 633 784.

[00071] Os exemplos de antígenos de patógenos adicionais que podem ser incluídos nas composições de acordo com a invenção são descritos agora.

[00072] Vírus Barr Epstein (EBV), um membro do grupo herpesvirus, causa mononucleoses infecciosas como uma doença primária em seres humanos. Predominantemente afeta crianças ou adultos jovens. Mais do que 90 % da população adulta média são infectados por EBV que persisti para vida toda em linfócitos B periféricos. O vírus é produzido permanentemente na glândula parótida e espalhado primeiramente por permuta de saliva de indivíduos os quais abrigam o vírus. As crianças infectadas com EBV são amplamente assintomáticas ou têm sintomas muito suaves, ao mesmo tempo que adolescentes e adultos que tornaram-se infectados desenvolveram mononucleose infecciosa típica, caracterizada por febre, faringite, e adenopatia. Pessoa que tenham sido infectadas mantêm anticorpos anti-EBV para subsistência de suas vidas, e são desse modo imunes a outra infecção.

[00073] Em adição às suas qualidades infecciosas, EBV tem sido mostrado transformar linfócitos em células rapidamente divididas e tem por esse motivo implicado em vários linfomas diferentes, incluindo linfoma African Burkitt’s (BL). EBV pode também estar envolvido na causa de carcinoma nasofaríngeo (NPC). Em todo mundo é estimado que 80.000 casos de carcinoma nasofaríngeo ocorram e é mais predominante em populações de Chineses étnicos. A mononucleose infecciosa é uma consequência de infecção primária por EBV. Não é uma doença ameaçadora à vida se fatores de risco adicionais estiverem ausentes.

[00074] Quatro proteínas de envoltório virai EBV constituindo o então chamado complexo de antígeno de membrana têm sido descritas. Elas são frequentemente referidas como gp 220/350 ou gp 250/350 ou simplesmente como gp 250 ou 350 (observe EP-A- 151079). Existe uma evidência convincente que gp 350 e gp 250 induzem a produção de anticorpos de neutralização e que anticorpos contra gp 350 e gp 250 têm capacidade de neutralização. Essas proteínas são desse modo candidatas para uma possível vacina EBV. Para outra informação cerca da aplicação de gp 250/350 para profilaxia e tratamento de doenças relacionadas com EBV observe EP 0 173 254.

[00075] A maior glicoproteína de superfície EBV gp 350/220 infecciona célula alvo humana através da interação com a proteína de membrana celular, CD21. Gp 350/220 é o alvo primário para anticorpos de neutralização de EBV em seres humanos e algumas formas de gp 350/220 têm sidos mostrada para proteger contra doença relacionada com EBV. Preferivelmente uma composição de vacina de acordo com a invenção compreende gp 350 de EBV embora outros antígenos de proteção possam ser usados.

[00076] Em um aspecto preferido a composição de vacina da invenção compreende adicionalmente um antígeno viral de Varicella Zoster (antígeno VZV). Os antígenos adequados de VZV para inclusão na formulação de vacina incluem gpl-V descrito por Longnecker e outros, Proc Natl Acad Sei USA 84, 4303-4307 (1987).

[00077] Em uma modalidade preferida gpl (observe Ellis e outros, patente U.S 4.769.239) é empregado. Observe também Patente Europeia N°0 405 867 B1.

[00078] Em outro aspecto preferido a composição de vacina da invenção compreende adicionalmente um antígeno de citomemega- lovírus humano (HCMV). HCMV é um vírus de DNA humano pertencente à família de vírus de herpes. HCMV é endêmico na maior parte do mundo. Em meio de duas populações, HCMV é responsável pelas condições médicas importantes. O HCMV é uma causa principal de defeitos congênitos em recém-nascidos. A segunda população de risco são pacientes imunocomprometidos tal como aqueles sofrendo infecção de HIV e aqueles pacientes sofrendo transplantes. A doença clínica causa uma variedade de sintomas incluindo febre, hepatites, pneumonia e mononucleose infecciosa. Um antígeno preferido para o uso em uma vacina contra HCMV é gB685** como descrito em WO 95/31555. Os imunógenos para uso em vacinas HCMV são também fornecidos por pp65, uma Proteína Matriz HCMV como descrita em WO 94/00150 (City of Hope).

[00079] Em um aspecto preferido a composição de vacina da invenção compreende adicionalmente ambos antígenos HCMV e VZV, em particular aqueles antígenos descritos acima.

[00080] Em outro aspecto preferido a composição de vacina da invenção compreende adicionalmente um antígeno Toxoplasma gondii.O Toxoplasma gondii é um parasita protozoário intracelular obrigatório responsável pela toxoplasmose em animais de sangue quente, incluindo mamífero. Embora seja geralmente clinicamente assintomático em pacientes saudáveis, toxoplasmose pode causar várias complicações em mulheres grávidas e pacientes imunocomprometidos. Um antígeno preferido para uso em uma vacina contra Toxoplasma gondiié SAGI (também conhecido como P30) como descrito em WO 96/02654 ou Tg34 como descrito em WO 92/11366.

[00081] Em um aspecto preferido a composição de vacina da invenção compreende adicionalmente ou um antígeno VZV ou um antígeno HCMV combinado com antígeno Toxoplasma gondii,em particular aqueles antígenos descritos acima.

[00082] Em um aspecto preferido a composição de vacina da invenção é uma vacina multivalente, por exemplo uma vacina tetra- ou pentavalente.

[00083] As formulações da presente invenção são muito eficazes na indução de imunidade protetora, mesmo com doses muito baixas de antígeno (por exemplo, tão baixas quanto 5 pig de rgD2t).

[00084] Eles fornecem excelente proteção contra infecção primária e estimula vantajosamente ambos humoral específico (neutralizando anticorpos) e também respostas imunes mediadas por células efetoras (DTH).

[00085] A presente invenção em um outro aspecto fornece uma formulação de vacina como aqui descrito para uso em terapia médica, particularmente para uso no tratamento ou profilaxia de infecções de papilomavírus humano e infecções de vírus herpes simplex.

[00086] A vacina da presente invenção conterá uma quantidade imunoprotetora dos antígenos e pode ser preparada por técnicas convencionais.

[00087] A preparação de vacinas é geralmente descrita em Pharmaceutical Biotechnology, Volume 61 Vaccine Design- a subunidade e método adjuvante, editado por Powell e Newman, Plenum Press, 1995. New Trends e Developments in Vaccines, editado por Voller e outros, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Encapsulação com lipossomos é descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente U.S. 4.235.877. A conjugação de proteínas para macromoléculas é divulgada, por exemplo, por Likhite, Patente U.S. 4.372.945 e por Armor e outros, Patente U.S. 4.474.757.

[00088] A quantidade de proteína em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos colaterais adversos, significantes em vacinas típicas. Tais quantidades variarão dependendo de qual imunógeno específica seja empregado. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 1 - 1000 pg de proteína, preferivelmente 2 - 100 pg, ainda mais preferivelmente 4-40 pg. Uma quantidade opcional para uma vacina particular pode ser verificada por estudos padrão envolvendo observação de títulos de anticorpos e outras respostas em indivíduos. Seguindo uma vacina inicial, indivíduos podem receber um reforço em cerca de 4 semanas.

[00089] Além da vacinação de pessoas suscetíveis a infecções HSV ou HPV, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser empregadas para tratar, imunoterapeuticamente, pacientes sofrendo das referidas infecções virais.

[00090] Em um outro aspecto da presente invenção é fornecido um método de fabricação como descrito aqui, onde o método compreende misturar um antígeno de vírus papiloma humano e um antígeno de vírus simplex de herpes com um adjuvante de indução TH-1, por exemplo 3D-MPL e, preferivelmente, um veículo, por exemplo alúmen.

[00091] Se desejado, outros antígenos podem ser adicionados, em qualquer ordem conveniente, para fornecer composições de vacina multivalente como descrito aqui.

[00092] Os exemplos seguintes ilustram, porém não limitam a invenção.

Exemplo 1: Imunoqenicidade Comparativa de HPV AQS/HBS/QD em vacinas de combinação ou monovalentes formuladas com AS04. INTRODUÇÃO

[00093] Um estudo de imunogenicidade foi realizado em camundon- gos Balb/C empregando quatro diferentes antígenos: 1. Partícula tipo Vírus HPV16L1 (VLP-16) 2. Partícula tipo Vírus HPV18L1 (VLP-18) 3. antígeno gD de HSV-2 4. HBsAg formulado com Alúmem/3D-MPL (AS04) empregando monocargas pré-absorvidas de antígeno ou 3D-MPL sob AI(OH)s ou AIPO4.

[00094] As formulações 3D-MPL/AI(OH)3 estão referidas ao AS04D ao passo que formulações com base em 3D-MPL/AIPO4 são referidas como AS04C.

[00095] As seguintes vacinas foram estimadas: 1. VLP16 + VLP18 AS04D; 2. gD AS04D; 3. HBs AS04C 4. 0 potencial para combinar essas vacinas foi avaliado.

[00096] O objetivo deste experimento foi comparar a imunogene- cidade de duas diferentes combinações de AS04 feita de qualquer dos dois: 1. VLP16 + VLP18 e gD. 2. VLP16 + VLP18 e gD e HBs Ag.

[00097] O protocolo experimental está inteiramente descrito na seção de Materiais e Métodos.

[00098] Em resumo, grupos de 10 camundongos foram imunizados intramuscularmente duas vezes em intervalos de 3 semanas com várias formulações com base em Ag. Resposta do anticorpo para VLPs, gD e HBs Ag e 0 perfil isotípico induzido por vacinação foram monitorados por ELISA no dia 14 pós II. Ao mesmo tempo, a produção de citocina (IFNy/IL5) foi analisada após reestimulação in vitro de células esplénicas com antígenos VLPs, gD ou HBs. Materiais e Métodos Formulação Composições das formulações VLP16, VLP18, gD e HBs formulados com 3D-MPL sob sal de alumínio. Componentes usados.

Absorção a) Absorção de VLP

[00099] Carga purificada VLP18 e VLP16 é adicionada ao AI(OH)s para obter uma relação de 2 pg de VLP/10 pg de AI(OH)3. A mistura é estocada entre 2 - 8°C até formulação final.

b) Absorção de gD

[000100] 2 pg de gD foram misturados com 10 pg de AI(OH)3. A mistura é estocada entre 2 a 8°C até formulação final.

c) Absorção de HBs

[000101] 2 pig de HBs foram misturados com 10 pg de AIPO4. A mistura é estocada entre 2 - 8°C até formulação final.

d) Absorção de 3D-MPL

[000102] 5 pig de 3D-MPL foram misturados com 10 pg de AI(OH)3. A mistura é estocada entre 2 - 8°C até formulação final.

[000103] 5 pg de 3D-MPL foram misturados com 10 pg de AIPO4. A mistura é estocada entre 2 - 8°C até formulação final.

Formulação

[000104] H2O e NaCI foram misturados (10 x concentrado) e após 10 minutos de agitação em temperatura ambiente, os diferentes componentes são adicionados: antígeno absorvido, 3D-MPL absorvido e AI(OH)3 (observe tabela abaixo). Eles foram sacudidos em temperatura ambiente durante 10 minutos e estocados em 4°C até injeção.

Soroloqia de Camundongos Sorologia anti-VLP-18 e anti-VLP-16.

[000105] A quantificação de anticorpos anti-VLP18 e anti-VLP16 foi realizada por ELISA empregando VLP16 503/1 (20/12/99) e VLP18 504/2 (25/10/99F) como antígenos de revestimento. As soluções de anticorpos e antígenos foram empregadas em 50 pL por cavidade. O antígeno foi diluído em uma concentração final de 0,5 pg/mL no PBS e foi absorvido durante A noite em 4°C para as cavidades de placas de microtítulos de 96 cavidades (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark). As placas foram então incubadas durante 1 hora em 37°C com PBS contendo 1% de albumina de soro bovino. As diluições de duas vezes do soros (início em diluição 1/400) no tampão de saturação foram adicionadas às placas revestidas por VLP e incubadas durante 1 hora e 30 minutos em 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS, 0,1 % de Tween 20 e lg anti-camundongo conjugado com biotina (Amersham, UK) diluído 1/1500 em tampão de saturação, foram adicionadas a cada cavidade e incubadas durante 1 hora e 30 minutos em 37°C. Após a etapa de lavagem, complexo de peroxidase de biotinilado com estreptavidina (Amersham, UK) diluído 1/1000 em tampão de saturação foi adicionado durante um adicional de 30 minutos em 37°C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 20 minutos com uma solução de o-fenilenodiamina (Sigma) 0,04 % de H2O2 0,03 % em 0,1 % de tween 20, 0,05 M de tampão de citrato pH 4,5. A reação foi suspensa com H2SO4 2 Ne lida em 490/630 nm. Os títulos ELISA foram calculados a partir de uma referência por SoftmaxPro (empregando uma equação de quatro parâmetros) e expressada em EU/mL.

Resposta a Anti-qD:

[000106] A quantificação de anticorpo anti-gD foi realizada por ELISA empregando gD (gD 43B318) como 0 antígeno de revestimento. As soluções de anticorpos e antígenos foram empregadas a 50 pL por cavidade. O antígeno foi diluído em uma concentração final de 1 pg/mL em PBS e foi absorvido durante a noite a 4°C para as cavidades de placas de microtítulos de 96 cavidades (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmarck). As placas foram então incubadas durante 1 hora em 37°C com PBS contendo 1 % de albumina de soro bovino e 0,1 % de Tween 20 (tampão de saturação; 100 pL/cavidade). As diluições de duas vezes do soros (início em diluição 1/100) no tampão de saturação foram adicionadas às placas revestidas de gD e incubadas durante 1 hora e 30 minutos em 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS, 0,1 % de Tween 20 e lgG1, lgG2a, lgG2b, ou lg anti-camundongo conjugado com biotina (Amersham, UK) diluído 1/1000 em tampão de saturação, foram adicionados para cada cavidade e incubados durante 1 hora e 30 minutos em 37°C. Após a etapa de lavagem, o complexo de peroxidase streptavidina biotinilada (Amersham, UK) diluído 1/1000 em tampão de saturação foi adicionado durante um adicional de 30 minutos em 37°C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 20 minutos com uma solução de o-fenilenodiamina (Sigma) 0,04 % de H2O2, 0,03 % em 0,1 % de tween 20, 0,05 M de tampão de citrato pH 4,5. A reação foi suspensa com H2SO4 2N e lida em 490/630 nm. Os títulos ELISA foram calculados a partir de uma referência por SoftmaxPro (empregando uma equação de quatro parâmetros) e expressada em EU/ml.

Soroloqia de Anti-HBs

[000107] A quantificação de anticorpo de anti-HBs foi realizada por ELISA empregando HBs (Hep 286) como 0 antígeno de revestimento. As soluções de anticorpos e antígenos foram empregadas a 50 pl por cavidade. O antígeno foi diluído em uma concentração final de 1 pg/ml em PBS e foi absorvido durante a noite a 4°C para as cavidades de placas de microtítulos de 96 cavidades (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark). As placas foram então incubadas durante 1 hora em 37°C com PBS contendo 1 % de albumina de soro bovino e 0,1 % de Tween 20 (tampão de saturação). As diluições de duas vezes do soros (início em diluição 1/100) no tampão de saturação foram adicionadas às placas revestidas de HBs e incubadas durante 1 hora e 30 minutos em 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS, 0,1 % de Tween 20 e lg anti-camundongo conjugado com biotina (Amersham, UK) diluído 1/1500 ou lgG1, lgG2a, lgG2b (IMTECH, USA) diluídos respectivamente em 1/4000, 1/8000, 1/4000 em tampão de saturação foram adicionados para cada cavidade e incubados durante 1 hora e 30 minutos em 37 °C. Após a etapa de lavagem, complexo de peroxidase estreptavidina biotinilada (Amersham, UK) diluído 1/1000 em tampão de saturação foi adicionado durante um adicional de 30 minutos em 37°C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 20 minutos com uma solução de o-fenilenodiamina (Sigma) 0,04 % de H2O2, 0,03 % em 0,1 % de tween 20, 0,05 M de tampão de citrato pH 4,5. A reação foi suspensa com H2SO4 2N e lida em 490/630 nm. Os títulos de ELISA foram calculados a partir de uma referência por SoftmaxPro (empregando uma equação de quatro parâmetros) e expressada em EU/mL.

Produção de Citocina

[000108] Duas semanas depois da imunização, camundongos foram mortos, baços foram removidos assepticamente e agrupados. As suspensões de célula foram preparadas no veículo RPMI 1640 (GIBCO) contendo 2 mM de L-glutamina, antibióticos, 5 x 10’5 M de 2- mercaptoetanol, e 5 % de soro de bezerro fetal. As células foram cultivadas em uma concentração final de 5 x 106 células/mL, em 1 mL por placas de 24 cavidades de base plana com concentrações diferentes (10 -1 pig/mL) de cada do Ag (VLPs, gD ou antígeno HBs). Os sobrenadantes foram coletados 96 horas após e congelados até que testados quanto à presença de IFNy e IL5 por ELISA.

IFNY (Genzyme)

[000109] Quantificação de IFNy foi realizada por ELISA empregando reagentes de Genzyme. As soluções de anticorpos e amostras foram empregados a 50 piL por cavidade. As placas de microtítulos de 96 cavidades (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) foram revestidas durante a noite a 4°C com 50 pL de IFNy de hamster anti-camundongo diluído em 1,5pg/mL no tampão de carbonato de pH 9,5. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 37°C com 100 pL de PBS contendo 1 % de albumina de soro bovino e 0,1 % de Tween 20 (tampão de saturação). As diluições de duas vezes do sobrenadante de estimulação in vitro(início em 1/2) em tampão de saturação foram adicionadas às placas revestidas com anti-IFNy e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS, 0,1 % de Tween 20 (tampão lavado) e IFNy de bode anti- camundongo conjugado com biotina diluído em tampão de saturação em uma concentração final de 0,5 pg/mL foi adicionado para cada cavidade e incubado durante 1 hora a 37°C. Após a etapa de lavagem, conjugado AMDEX (Amersham) diluído 1/10000 em tampão de saturação foi adicionado durante 30 minutos a 37°C. As placas foram lavadas como acima e incubadas com 50 pL de TMB (Biorad) durante 10 minutos. A reação foi suspensa com H2SO4 0,4 N e lida em 450/630 nm. As concentrações foram calculadas empregando uma curva padrão (padrão de IFNy de camundongo) por SoftmaxPro (equação de quatro parâmetros) e expressada em pg/mL.

IL5 (Pharminqen)

[000110] A quantificação de IL5 foi realizada por ELISA empregando reagentes de Pharmingen. As soluções de anticorpos e amostras foram empregadas a 50 pJ por cavidade. As placas de microtítulos de 96 cavidades (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) foram revestidas durante a noite a 4°C com 50 pL de IL5 de rato anti- camundongo diluído em 1 ng/mL no tampão de carbonato de pH 9,5. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 37°C com 100 pl de PBS contendo 1 % de albumina de soro bovino e 0,1 % de Tween 20 (tampão de saturação). As diluições de duas vezes do sobrenadante de estimulação in vitro(início em 1/2) em tampão de saturação foram adicionadas às placas revestidas de anti-IL-5 e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS, 0,1% de Tween 20 (tampão lavado) e IL5 de rato anti- camundongo conjugado com biotina diluído em tampão de saturação em uma concentração final de 1 Mg/mL foi adicionado para cada cavidade e incubado durante 1 hora a 37°C. Após a etapa de lavagem, conjugado AMDEX (Amersham) diluído 1/10000 em tampão de saturação foi adicionado durante 30 minutos a 37°C. As placas foram lavadas como acima e incubadas com 50 pL de TMB (Biorad) durante 15 minutos. A reação foi suspensa com H2SO4 0,4 N e lida em 450/630 nm. As concentrações foram calculadas empregando uma curva padrão (camundongo recombinante de IL-5) por SoftmaxPro (equação de quatro parâmetros) e expressada em pg/mL

Grupos

[000111] Os grupos de camundongos 10 Balb/C foram imunizados intramuscularmente com as seguintes formulações: Tabela 1: Grupos e formulações.

[000112] Detalhes das formulações são descritos acima em Materiais e Métodos. Resultados: 1. Sorologia: a) Resposta Anti-VLP16:

[000113] Respostas humorais (lg) foram medidas por ELISA empregando VLP16 503-1 (20/12/99) como o antígeno de revestimento. Dia 14 pós II soros foram analisados.

[000114] Figura 1 mostra respostas de anticorpos lg anti-VLP16 medidas em soros individuais no dia 14 pós II.

[000115] Os títulos anti-VLP16 obtidos após imunização com a combinação de VLPs, gD e HBs Ag (grupo B), foram insignificantemente menores do que um obtido com ou a combinação de VLPs e gD (grupo A) ou a formulação VLPs monovalente (grupo D) (GMT respectivamente de 27578 versus 48105 EU/mL versus 44448 EU/mL). Antes da análise estatística um teste T-Grubbs foi aplicado sob cada população para exclusão de dados. Dois camundongos não- responsivos nos grupos A e D foram eliminados para análises.

[000116] As diferenças observadas entre os grupos foram mostradas como não significantes estatisticamente empregando o Teste Keuls Newman Student.

b) Resposta Anti-VLP18:

[000117] Respostas humorais (lg) foram medidas por ELISA empregando VLP18 504-2 (25/10/99) como o antígeno de revestimento. Dia 14 pós II soros foram analisados.

[000118] Figura 2 mostra respostas de anticorpos lg anti-VLP18 medidas em soros individuais no dia 14 pós II.

[000119] Os títulos anti-VLP18 obtidos após imunização com a combinação de VLPs, gD e HBs Ag (grupo B), foram na mesma magnitude como os títulos obtidos com ou a combinação de VLPs e gD (grupo A) ou a formulação VLPs monovalente (grupo D) (GMT respectivamente de 56078 versus 88786EU/mL versus 76991 EU/mL).

[000120] Antes da análise estatística um teste T-Grubbs foi aplicado sob cada população para exclusão de dados. Dois camundongos não- responsivos nos grupos A e D foram eliminados para análises.

[000121] As diferenças observadas foram mostradas como não significantes estatisticamente empregando análises de um modo de teste de variância.

c) Resposta Anti-qD:

[000122] Respostas humorais (lg e isótipos) foram medidas por ELISA empregando gD como o antígeno de revestimento. Dia 14 pós II soros foram analisados.

[000123] Figura 3 mostra respostas de anticorpos anti-gD medidas em soros individuais no dia 14 pós II:

[000124] Com respeito à resposta ao anti-gD, uma diminuição significante foi observada no GMT obtida com a combinação de VLPs/gD/HBs (grupo B) comparada à gD sozinho (grupo C) ou combinação de VLPs/gD (grupo A) (GMT respectivamente de 18631 versus 32675 versus 27058 EU/ml).

[000125] Antes da análise estatística um teste T-Grubbs foi aplicado em cada população para exclusão de dados. Dois camundongos não- responsivos no grupo A foram eliminados para análises.

[000126] As análises de um modo de teste de variância foram realizadas em títulos anti-gD após transformação de log de dados pós II. Nenhuma diferença significante estatisticamente foi observada entre as três formulações.

[000127] As repartições isotípicas analisadas em soros agrupados foram como segue:

[000128] Nenhuma diferença foi observada no perfil isotípico induzido pelas três formulações:

[000129] Principalmente respostas lgG1 (96 - 97 % de lgG1) foram induzidas nos 3 grupos como reportados na tabela abaixo.

d) Resposta Anti-HBs:

[000130] Respostas humorais (lg e isótipos) foram medidas por ELISA empregando HBsAg (Hep286) como o antígeno de revestimento. Dia 14 pós II soros foram analisados.

[000131] Figura 4 mostra respostas de anticorpos anti-HBs medidas em soros individuais no dia 14 pós II:

[000132] Uma resposta de anticorpo anti-HBs significantemente inferior é observada na combinação do grupo B contendo os antígenos VLPs, gD e Hbs comparados ao HBs sozinho (grupo E) (GMT de 28996 EU/ml versus 20536 EU/ml).

[000133] As análises de um modo de teste de variância foram realizadas sob títulos anti-HBs após transformação de log de dados pós II. Nenhuma diferença significante estatisticamente foi observada entre o grupo B (VLP/HBs/gD) versus o grupo E (HBs AS04) empregando o teste Keuls Newman Student.

[000134] As repartições isotípicas analisadas em soros agrupados foram como segue e não mostram nenhuma diferença entre os 2 grupos com uma proporção de lgG2a preservados na vacina de combinação.

2. Resposta Imune Mediada por Célula

[000135] As respostas imunes mediadas por células (produção de IL- 5/IFNy) foram avaliadas no dia 14 pós II após reestimulação in vitro de células esplénicas com ou VLPs, gD ou antígenos HBs. Para cada grupo de camundongos, agrupados de 5 órgãos foram constituídos. O procedimento experimental é totalmente descrito em Material e Métodos.

3. Produção de Citocina. a) Reestimulação in vitro com VLP16 e VLP18

[000136] A figura 5 mostra a produção de citocina monitorada em células esplénicas após 96 horas de reestimulação in vitro com VLP16.

[000137] A figura 6 mostra a produção de citocina monitorada em células esplénicas após 96 horas de reestimulação in vitro com VLP18.

[000138] Nenhum efeito de variação de dose claro tem sido observado empregando 10 pg e 1pg de dose Ag para reestimulação com ou antígenos VLP sob ambas produções de citocina.

[000139] Um perfil de TH1 claro foi observado com todas as formulações. Tabela 2: Relação de IFN-y/11-5 após reestimulação in vitro com VLP16e VLP18.

b) Reestimulação in vitrocom o D

[000140] A figura 7 mostra a produção de citocina monitorada nas células esplénicas após 96 horas de reestimulação in vitro com antígeno gD.

[000141] Nenhum efeito de variação de dose claro tem sido observado quando comparado a 10 e 1pg de dose Ag para reestimulação.

[000142] O IFN-y é produzido em concentração muito maior quando comparado com IL-5 (Tabela 3) indicando um perfil TH-1 claro da resposta imune em todos os grupos avaliados (monovalente versus combinação). Tabela 3: Relação de IFN-y/IL-5 após reestimulação in vitro com gD.

c) Reestimulação in vitro com HBs

[000143] A figura 8 mostra a produção de citocina monitorada em células esplénicas após 96 horas de reestimulação in vitro com HBs.

[000144] Um nível significante de IFN-y porém nenhuma produção de IL-5 foi observada para grupo B. Como mostra na Tabela 2 a produção maior de IFN-y foi observada no grupo E como comparada para grupo B. Entretanto o valor de fundamento elevado de IFN-y foi observado no grupo E (HBs monovalente) para o controle com nenhum antígeno para reestimulação. Uma relação extremamente elevada de IFN-y/IL-5 foi observada com a vacina monovalente indicando que uma forte resposta TH1 é induzida. Similarmente, uma relação de IFN-y/IL-5 elevada foi medida com a vacina combinada confirmando a capacidade desta formulação para também induzir uma resposta TH-1. Tabela 4: Relação de IFN-y/IL-5 após reestimulação in vitro com HBs.

Conclusões:

[000145] O efeito da combinação de VLPs/gD ou VLPs/gD/HBs Ag formulados na AS04 sob a imunogenicidade foi avaliado em camundongos Balb/C:

[000146] Com respeito à análise sorológica, nenhuma interferência da combinação de Ag foi observada sob anti-VLPs, anti-gD e sorologia anti- HBs.

[000147] A combinação de VLPs e gD ou VLPs, gD e antígenos HBs não interfere com o perfil isotípico da resposta do anticorpo exibido pelo gD e vacinas monovalentes de HBs.

[000148] Na avaliação das citocinas, o perfil TH-1 (relação de IFN- y/IL-5 ) observado com cada vacina monovalente foi confirmado com a combinação de grupos de vacina.

Claims (6)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula tipo vírus de um papilomavírus humano 16 L1 (HPV 16 L1 VLP), uma partícula tipo vírus de um papilomavírus humano 18 L1 (HPV 18 L1 VLP), hidróxido de alumínio e monofosforil lipídeo A 3 De-0 acilado (3D-MPL).

2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as VLPs são formuladas usando monocargas pré-absorvidas de antígeno e 3D-MPL em hidróxido de alumínio.

3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as cargas purificadas de HPV 16 L1 VLP e HPV 18 L1 VLP são adicionadas ao hidróxido de alumínio para se obter uma razão de 2 pg de VLP/10 pg de AI(OH)3.

4. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que consiste em HPV 16 L1 VLP, HPV 18 L1 VLP, hidróxido de alumínio e 3D-MPL.

5. HPV 16 L1 VLP, caracterizada pelo fato de que é formulada com alum e 3D-MPL usando monocargas pré-absorvidas de antígeno e 3D-MPL em hidróxido de alumínio ou AlPO4.

6. HPV 18 L1 VLP, caracterizada pelo fato de que é formulada com alum e 3D-MPL usando monocargas pré-absorvidas de antígeno e 3D-MPL em hidróxido de alumínio ou AlPO4.

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