CZ2002842A3

CZ2002842A3 - Vakcinační prostředek

Info

Publication number: CZ2002842A3
Application number: CZ2002842A
Authority: CZ
Inventors: Martine Anne Cecile Wettendorff
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2000-09-06
Publication date: 2002-08-14
Also published as: DE60040879D1; MXPA02002483A; HK1048436A1; WO2001017550A3; JP4694745B2; ES2261237T3; DK1210112T3; GC0000202A; DE60027440T2; ZA200201834B; PL353923A1; ATE414533T1; JP2003508494A; ES2314816T3; WO2001017550A2; EP1731167B1; IL148455A0; US20080118527A1; TR200200608T2; US7371390B2

Description

Vakcinační prostředek

SvcV-fífU

Oblast techniky

Vynález se týká nových vakcinačníchích prostředků. Zvláště se předkládaný vynález týká kombinovaných vakcín pro podávání dospívajícím.

Dosavadní stav techniky

Papilomaviry jsou malé tumorové DNA viry, které jsou vysoce druhově specifické. Do současnosti bylo popsáno více než 70 genotypů jednotlivých lidských papilomavirů (HPV, human papillomavirus). HPV jsou obecně specifické buď pro kůži (například HPV 1 a HPV 2) nebo slizniční povrchy (například HPV 6 a HPV 11) a obvykle působí benigní tumory (bradavice) a přetrvávají po několik měsíců nebo let. Takové benigní tumory mohou být pro dotyčné jedince obtížné, většinou však neohrožují život, až na některé výjimky.

Některé HPV jsou spojeny rovněž s rakovinným bujením. Nejsilnější pozitivní vazbou mezi HPV a rakovinou lidí je ta, která existuje mezi HPV 16 a HPV 18 a rakovinou děložního krčku. Rakovina děložního krčku je nejobvyklejší malignitou v rozvojových zemích, jedná se přibližně o 500 000 nových případů v průběhu jednoho roku na celém světě. Nyní je aktivní boj s primárními infekcemi HPV 16 a dokonce s již probíhajícími rakovinami, týkajícími se HPV 16, technicky proveditelný použitím vakcín. Přehled vyhlídek profylaktické a léčebné vakcinace vůči HPV 16 viz J. Cason, Clin. Immunother. ý (4), 293-306, 1994 a M.

E. Hagenesee, Infections in Medicine 14 (7), 555-556, 559-564, 1997.

V současnosti byly izolovány a charakterizovány různé typy HPV za pomoci systému klonování u bakterií a později i PCR amplifikací

• · (polymerase chain reaction, reakce polymerázového řetězce).

Molekulární organizace genomů HPV byla definována na bázi srovnání s molekulární organizací genomů dobře charakterizovaného hovězího papilomaviru typu 1 (BPV 1).

Jiné serotypy HPV, které jsou zvláště zajímavé, jsou 31, 33 a 45.

Ačkoliv jsou možné i menší změny, veškeré popsané genomy HPV mají alespoň 7 časných genů, E1 až E7 a dva pozdní geny L1 a L2. Nad to, protisměrná regulační oblast obsahuje regulační sekvence, které pravděpodobně řídí nejtranskribovanější (nejpřepisovanější) případy genomu HPV.

E1 a E2 geny se účastní virové replikace, respektive transkripční kontroly a mají sklon k rozrušení virovou integrací. E6 a E7, a podle nejnovějších důkazů lze zahrnout i E5, se účastní virové transformace.

V HPV, účastnících se rakoviny děložního krčku, jako jsou HPV 16 a HPV 18, začíná onkogenní proces po integraci virové DNA. Výsledkem integrace je inaktivace genů, kódujících bílkoviny L1 a L2 kapsidu a dosažení spojitého nadbytku exprese dvou časných bílkovin E6 a E7, které povede k rostoucímu úbytku normální buněčné diferenciace a k vývoji rakovinného bujení.

Rakovina děložního krčku je běžná u žen a vyvíjí se přes prerakovinné střední stadium k invazivní rakovině, která často končí smrtí. Střední stadium onemocnění je známo jako cervikální intraepiteliální neoplasie a je hodnoceno od I do III podle vzrůstající závažnosti.

Klinicky se HPV infekce ženského anogenitálního traktu projevují jako cervikální ploché kondyloma, jehož charakteristickým znakem je • · • ·

- 3 AA A A AAA koilocytóza, záporně ovlivňující především povrchové a střední buňky cervikálního šupinatého epitelu.

Koilocyty, které jsou důsledkem cytopatického účinku viru, vypadají jako vícejaderné buňky s čirým perinukleárním kruhem (halo). Epitel se ztlušťuje s abnormální keratinizací, zodpovědnou za bradavičnatý vzhled leze.

Takové ploché kondylomy, pokud jsou pozitivní vzhledem k serotypům HPV 16 nebo HPV 18, jsou vysoce rizikovými faktory pro vývoj směrem k cervikální intraepiteliálηí neoplasii (CIN) a místního karcinomu (CIS, carcinoma in situj, na které se pohlíží jako na prekursory leží invazivního karcinomu děložního krčku.

WO 96/19496 předkládá varianty bílkovin lidského papilomaviru E6 a E7, zvláště spojených bílkovin E6/E7 s delecí u obou bílkovin E6 a E7. Tyto deleční spojené bílkoviny jsou uváděny jako imunogenní.

Vakcíny na základě HPV L1 jsou předkládány ve WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 a WO 94/05792. Taková vakcína může obsahovat L1 antigen jako monomer, jako kapsomer, nebo jako částici podobnou viru. Takové částice mohou nádavkem obsahovat bílkoviny L2. Vakcíny na základě L2 jsou popsány například ve WO 93/00436. Jiné HPV vakcíny jsou založeny na časných bílkovinách, jako jsou E7 nebo spojené bílkoviny jako L2-E7.

Vakcíny k profylaxi infekcí hepatitidy B, obsahující jeden nebo více antigenů hepatitidy B, jsou dobře známé. Například vakcína Engerix-B (™), od firmy SmithKline Beecham Biologicals, se používá k prevenci hepatitidy B. Tato vakcína obsahuje povrchový antigen hepatitidy B (zvláště S-antigen o 226 aminokyselinách, popsaný

- 4 ·· · ·· · · ····

Harfordem a spoluautory v Postgraduate Medical Journal 63 (doplněk 2), 65-70, 1987 a je vyráběna za použití hydroxidu hlinitého jako adjuvans.

Stále přetrvává potřeba účinných kombinovaných vakcín k prevenci onemocnění, k nimž jsou zvláště náchylní dospívající lidé.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje vakcinační prostředek, obsahující:

a) antigen virové hepatitidy B (HBV); a

b) antigen lidského papilomaviru (HPV) v kombinaci s adjuvantní látkou, která je přednostním stimulátorem odpovědi TH1 buněk.

Vakcinační prostředek podle vynálezu je velmi přínosný pro podávání dospívajícím, u nichž je zvláštní riziko infekce HBV a/nebo HPV.

Vakcinační prostředek podle vynálezu volitelně navíc zahrnuje jeden nebo více z množství jiných antigenů, jak je popsáno níže.

Bylo zjištěno, že vakcinační prostředky podle vynálezu překvapivě nevykazují žádnou interferenci, to znamená, že imunitní odpověď vůči každému z antigenů v prostředku podle vynálezu je v podstatě stejná jako imunitní odpověď, která se získá vůči každému z antigenů podávanému jednotlivě ve spojení s adjuvantní látkou, kterou je přednostní stimulátor odpovědi TH1 buněk.

Vakcína Havrix (™), rovněž výroby firmy SmithKline Beecham Biologicals, je příkladem vakcíny, kterou lze použít k prevenci infekcí hepatitidy A. Vyrábí se s hydroxidem hlinitým jako adjuvantní látkou.

• ·

- 5 Tato vakcína obsahuje oslabený kmen HM-175 viru hepatitidy A, inaktivovaný formaldehydem; viz André se spoluautory (Prog. med. Virol. 37, 1 až 24.

Tak jak je zde používán, výraz antigen viru hepatitidy A (HAV) se užívá k označení buď bílkoviny, odvozené od viru hepatitidy A, nebo oslabeného kmene HAV, volitelně inaktivovaného, například formaldehydem. Pokud je HAV antigen bílkovinou odvozenou od viru hepatitidy A, může být volitelně rekombinantní bílkovinou.

Vakcína Twinrix (™) je rekombinantním antigenem hepatitidy B s výše zmíněným, inaktivovaným oslabeným virem hepatitidy A. Vakcínu lze použít k současné ochraně vůči hepatitidě A i hepatitidě B.

Evropský patent 0 339 667 (Chemo Šero) popisuje obecný koncept spojení antigenu hepatitidy A a antigenu hepatitidy B k vytvoření kombinované vakcíny. V popisu se uvádí, že použitá adjuvantní látka není kritickou otázkou: musí být pouze schopna zvyšovat imunitní aktivitu v požadovaném rozsahu a nevyvolávat žádné vedlejší účinky. Je zde uvedeno, že lze použít hliníkový gel, zvláště gel hydroxidu hlinitého a gel fosforečnanu hlinitého.

V dalším aspektu vynález poskytuje vakcinační prostředek, zahrnující:

a) antigen viru hepatitidy B (HBV);

b) antigen lidského papilomavíru (HPV); a

c) antigen viru hepatitidy A (HAV) v kombinaci s adjuvantní látkou, kterou je přednostní stimulátor odpovědi TH1 buněk.

Taková vakcína je velmi přínosná pro podávání dospívajícím, u nichž je zvláštní riziko infekcí HBV a/nebo HPV a/nebo HAV.

- 6 • · · · · · ΒΒΒΒ ·· 9· • · Β · ··♦«

ΒΒΒ Β ΒΒΒΒ Β * *

Β · · Β ΒΒΒ Β Β

Β · · ΒΒΒΒ • ΒΒ ΒΒ ΒΒΒ Β · ΒΒΒΒ

Imunitní odpověď může být široce rozdělena do dvou extrémních kategorií, kterými jsou humorální nebo buněčně zprostředkovaná imunitní odpověď (tradičně charakterizované protilátkovými, respektive buněčnými efektorovými mechanismy ochrany). Tyto kategorie imunitní odpovědi byly nazvány odpovědí typu TH1 (buněčně zprostředkovaná odpověď) a imunitní odpovědí typu TH2 (humorální odpověď).

Imunitní odpověď extrémního typu TH1 může být charakterizována vytvářením (generováním) antigenně specifických, haplotypově omezených cytotoxických lymfocytů T a buněčnou odpovědí přirozených zabíječských buněk (natural killers). U myší je odpověď typu TH1 často charakterizována vytvářením protilátek subtypu lgG2a, zatímco u lidí odpovídá protilátkám typu lgG1. Imunitní odpověď typu TH2 je charakterizována vytvářením škály ímunoglobulinových izotypů, které u myší zahrnují IgG 1.

Je možné usoudit, že hnací silou vývoje těchto dvou typů imunitní odpovědi jsou cytokiny. Vysoké hladiny cytokinů typu TH1 mají sklon favorizovat indukci buněčně zprostředkované imunitní odpovědi vůči danému antigenu, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu TH2 mají sklon favorizovat indukci humorální imunitní odpovědi vůči antigenu.

Rozlišení imunitních odpovědí typu TH1 a TH2 není absolutní. Ve skutečnosti bude jedinec podporovat imunitní odpověď, která je popsána jako převažující TH1 nebo převažující TH2. Často je ovšem vhodné označovat skupiny cytokinů v termínech, popsaných Mosmannem a Coffmanem v myších T- buněčných klonech CD4 + ve (T. R. Mosmann a R. L.Coffman, 1989: TH1 and TH2 celíš: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology 7, 145-173). Tradičně jsou odpovědi typu TH1 spojeny s produkcí cytokinů INF-γ lymfocyty T. Jiné cytokiny, často

- 7 ΦΦΦΦ ·· φφφ· ·· ·· • ··· φφφφ • φ φ · φφφ· · · · • ΦΦΦ φφφφ φ • · · φ φ · · φφφ φφ φφφ · · φφφφ přímo spojené s indukcí imunitní odpovědi typu TH1, nejsou produkovány buňkami T, jako IL-12. Proti tomu, odpovědi typu TH2 jsou spojeny se sekrecí IL-4, IL-5, lL-6, IL-10 a faktoru nekrózy tumoru-β (TNF-β, tumour necrosis factor).

Je známo, že určité adjuvantní látky ve vakcínách jsou zvláště vhodné pro stimulaci odpovědí cytokinů buď typu TH1, nebo typu TH2. Tradičně nejlepší indikátory rovnováhy TH1:TH2 v imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infikaci zahrnují přímé měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 lymfocyty T v podmínkách in vitro po restimulaci antigenem, a/nebo měření (alespoň u myší) v poměru lgG1:lgG2a antigenně specifické protilátkové odpovědi.

Adjuvantní látka typu TH1 je tedy taková, která stimuluje izolované populace T-buněk k produkci vysokých hladin cytokinů typu TH1 po restimulaci antigenem in vitro a indukuje antigenně specifickou imunoglobulinovou odpověď, spojenou s isotypem typu TH1.

Adjuvantní látky, které jsou schopné přednostní stimulace odpovědi buněk TH1, jsou popsány v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/00 153 a ve WO 95/172 09.

Jednou z takových adjuvantních látek je 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Tato látka je známa z GB 2 220 211 (Ribi). Chemicky je to směs 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci a je vyráběna firmou Ribi Immunochem v Montaně. Upřednostňovaná forma 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A je uvedena v evropském patentu 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

- 8 ΦΦΦΦ ·« ···· φφ φφ φ φφφ φφφφ

Φ·· φφφφφ φ φ · φ · φ φ · · φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φφ φφφ φφ φφφφ

Částice 3D-MPL jsou s výhodou dostatečně malé pro sterilní filtraci přes membránu o velikosti 0,22 mikrometru (jak je popsáno v evropském patentu 0 689 454). 3D-MPL bude přítomen v množství od 10 mikrogramů do 100 mikrogramů, s výhodou 25 až 50 mikrogramů na dávku, zatímco antigen bude typicky přítomen v množství od 2 do 50 mikrogramů na dávku.

Jiná upřednostňovaná adjuvantní dávka obsahuje QS21, netoxický podíl, získaný z kůry Quillaja Saponaria Molina, vyčištěný pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC). Volitelně může být smísen s 3-De-O-acylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL), podle volby společně s nosičem.

Způsob výroby QS21 je popsán v patentu US 5 057 540.

Již dříve byly popsány nereaktogenní adjuvantní prostředky, obsahující QS21 (WO 96/33 739). Takové prostředky, obsahující QS21 a cholesterol, byly v případě formování spolu s antigenem prokázány jako úspěšné TH1 stimulující adjuvantní látky. Vakcinační prostředky, které tvoří část předkládaného vynálezu, mohou tedy zahrnovat kombinaci QS21 a cholesterolu.

Další adjuvantní látky, které jsou přednostními stimulátory buněčné odpovědi TH1, zahrnují imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované sekvence CpG, jak je uvedeno ve WO 96/02 555.

Kombinace odlišných adjuvantních látek, stimulujících TH1, jako jsou ty, zmíněné výše, jsou rovněž považovány za poskytující adjuvantní látku, která je přednostním stimulátorem buněčné odpovědi TH1. Například lze společně formovat QS21 a 3D-MPL. Poměr QS21:3D-MPL bude typicky v řádu od 1:10 do 10:1; s výhodou od 1:5 do 5:1 a často v

- 9 4444 99 444 4 44 <44 444«

444 4 4 444 4 · ·

444 4 444 4 4

4 4 4 4 4 4

444 44 444 44 4444 podstatě 1:1. Upřednostňované rozmezí pro optimální synergii je 2,5:1 až 1:1 (3D-MPL:QS21).

S výhodou je ve vakcinačním prostředku podle tohoto vynálezu přítomen také nosič. Nosičem může být emulze typu oleje ve vodě, nebo hlinitá sůl, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Upřednostňovaná emulze typu oleje ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, tokoferol alfa a Tween 80. Nadto může emulze typu oleje ve vodě obsahovat Spán 85 a/nebo lecitin a/nebo tricaprylin.

Ve zvláště upřednostňovaném aspektu jsou antigeny ve vakcinačním prostředku podle vynálezu kombinovány s 3D-MPL a hlinitou solí.

Pro humánní podávání budou QS21 a 3D-MPL ve vakcině typicky přítomny v rozmezí od 1 do 200 mikrogramů, jako od 10 do 100 mikrogramů a s výhodou od 10 do 50 mikrogramů na dávku. Olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % tokoferolu alfa a od 0,3 do 3 % Tween 80. Poměr skvalenu a tokoferolu alfa je s výhodou rovnající se nebo menší než 1 a tento poměr poskytuje stálejší emulzi. Látka Spán 85 může být přítomna také v množství 1 %. V některých případech může být výhodné, pokud vakcíny podle předkládaného vynálezu budou dále obsahovat stabilizátor.

Emulze netoxického oleje ve vodě s výhodou obsahují ve vodném nosiči netoxický olej, například skvalen nebo skvalan a emulgátor, například Tween 80. Vodným nosičem může být například fosforečnanem pufrovaný solný roztok, PBS.

φ φ φ · φ

• φ

- 10 Zvláště účinný adjuvantní prostředek, zahrnující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu oleje ve vodě, je popsán ve WO 95/17 210.

Antigen HPV je v prostředku podle vynálezu s výhodou odvozen od HPV 16 a/nebo HPV 18, nebo od HPV 6 a/nebo HPV 11, nebo HPV 31, 33 nebo 45. V jednom upřednostněném ztělesnění zahrnuje HPV antigen ve vakcinačním prostředku podle vynálezu hlavní kapsidovou bílkovinu L1 z HPV a volitelně bílkovinu L2, zvláště z HPV 16 a/nebo z HPV 18. V tomto ztělesnění je upřednostňovanou formou bílkoviny L1 zkrácená bílkovina L1. L1 je s výhodou ve formě částice podobné viru (VLP). Bílkovina L1 může být spojená s jinou bílkovinou HPV, zejména E7 k vytvoření L1-E7 fúze. Zvláště se upřednostňují chimérické VLP, obsahující L1-E nebo L1-L2-E.

V jiném upřednostňovaném ztělesnění je antigen HPV v prostředku podle vynálezu odvozen z bílkoviny E6 nebo E7, zejména E6 nebo E7, spojené s partnerem imunologické fúze, který má epitopy buněk T.

V upřednostňované formě tohoto ztělesnění vynálezu je partner imunologické fúze odvozen od bílkoviny D z Haemophilus influenza B. Derivát bílkoviny D s výhodou obsahuje přibližně první třetinu bílkoviny, zejména přibližně 100 až 110 aminokyselin prvního N-konce.

Upřednostňované spojené (fúzované) bílkoviny v tomto ztělesnění vynálezu obsahují bílkovinu D-E6 z HPV 16, bílkovinu D-E7 z HPV 16, bílkovinu D-E7 z HPV 18 a bílkovinu D-E6 z HPV 18. Část bílkoviny D s výhodou zahrnuje první třetinu bílkoviny D.

V ještě jiném ztělesnění vynálezu je antigen HPV ve formě fúze L2-L7, zvláště z HPV 6 a /nebo HPV 11.

- 11 • 0

0000

0 0

Bílkoviny podle předkládaného vynálezu jsou s výhodou exprimovány v E.coli. V upřednostňovaném ztělesnění jsou bílkoviny exprimovány s histidinovým ocasem, obsahujícím 5 až 9 a s výhodou 6 histidinových zbytků. Ty jsou výhodné, neboť usnadňují čistění. Popis výroby takových bílkovin je plně popsán v britské patentové přihlášce GB 971 7953.5.

Antigen HPV může být ve vakcinačním prostředku adsorbován na hydroxid hlinitý; s výhodou je pak na hydroxid hlinitý adsorbován L1 VPL.

Antigenem viru hepatitidy B (HBV) je v prostředku podle vynálezu typicky povrchový antigen hepatitidy B.

Příprava povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg) je dobře dokumentována. Viz například Harford se spoluautory v Develop. Biol. Standard 54, 125, 1983; Gregg se spoluautory v Biotechnology 5, 479, 1987; EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108 a tam uvedené odkazy.

Jak je zde používán, výraz povrchový antigen hepatitidy B, zkracovaný dále jako HBsAg nebo HBS zahrnuje jakýkoliv antigen HBsAg nebo jeho fragment, vykazující antigennost povrchového antigenu HBV. Bude zřejmé, že kromě sekvence 226 aminokyselin antigenu HBsAg S (viz Tiollais se spoluautory, Nátuře 317, 489, 1985 a tam uvedené odkazy) může HBsAg, jak je zde popsán, pokud je to žádoucí, obsahovat celou sekvenci pre-S nebo její část, jak je popsáno ve výše zmíněných odkazech a v EP-A-0 278 940. Jak je zde popsán, může HBsAg odpovídat také variantám, například únikovému mutantu (escape mutant), popsanému ve WO 91/14 703. V dalším aspektu může HBsAg obsahovat bílkovinu popsanou jako L* v evropské patentové přihlášce 0 414 374, to znamená bílkovinu, jejíž aminokyselinová sekvence sestává z částí aminokyselinové sekvence široké (L) bílkoviny

- 12 • 9 A » · · · 9 9 A • 999 A « AAA »9 ♦ « AAA* 9 9 A 9 ·

9*9 A A A 9

99» 999 9» 999 99 9999 viru hepatitidy B (subtypu ad nebo ay), charakterizované tím, že aminokyselinová sekvence bílkoviny sestává buď:

a) ze zbytků 12 až 52, následovaných zbytky 133 až 145, následovaných zbytky 175 až 400 uvedené bílkoviny L; nebo

b) ze zbytku 12, následovaného zbytky 14 až 52, následovaných zbytky 133 až 145, následovaných zbytky 175 až 400 uvedené bílkoviny L.

HBsAg může také odpovídat polypeptidům, popsaným v EP 0 198

474 nebo EP 0 304 578.

HBsAg bude obvykle v částicové formě. Může obsahovat bílkovinu S samotnou, nebo může být ve formě složených částic, například (L*, S), kde L* odpovídá výše uvedené definici a S označuje bílkovinu S povrchového antigenů hepatitidy B.

HBsAg může být adsorbován na fosforečnan hlinitý, jak je popsáno ve WO 93/24 148.

Ahtigenem (HBV) hepatitidy B, použitým v prostředku podle vynálezu, je s výhodou S-antigen HBsAg, jak je použitý v komerčním produktu Engerix-B (™, SmithKline Beecham Biologicals).

Vakcína, obsahující povrchový antigen hepatitidy B ve spojení s 3D-MPL, byla popsána v evropské patentové přihlášce 0 633 784.

Nyní budou popsány příklady antigenů z přídavných patogenů, které lze zahrnout do prostředků podle vynálezu.

Virus Epsteina a Barrové (EBV), patřící do skupiny herpes virů, vyvolává infekční mononukleózu jako primární onemocnění u lidí. Napadá především děti nebo mladé dospělé lidi. Více než 90 % • »

- 13 «·»* φ» φφ» * ·· * · * ♦ · φφφ φ φφφφ » · * • ΦΦ φ φφφ · φ φφφ φφφφ «φφ φφ φφφ φφ φφφφ průměrné dospělé populace je infikováno EBV, který přetrvává po dobu života v periferních lymfocytech B. Virus je celoživotně produkován v parotické žláze a primárně rozšiřován výměnou slin od jedinců, kteří šíří virus. Děti, infikované EBV, jsou zcela bez příznaků, nebo mají jen velmi mírné příznaky, zatímco dospívající a dospělí po infikaci vytvářejí typickou infekční mononukleózu, charakterizovanou horečkou, faryngitidou a adenopatií. Lidé, kteří byli infikováni, si uchovávají protilátky vůči EBV po zbytek života a jsou tedy vůči další infekci imunní.

Bylo prokázáno, že kromě svého infekčního působení, EBV transformuje lymfocyty na rychle se dělící buňky a účastní se tedy v několika různých lymfomech, včetně afrického Burkittova lymfomu (Afričan Burkitťs lymphoma, BL). EBV se může také účastnit vyvolání nazopharingálního karcinomu (NPC). Celosvětově se odhaduje, 80 000 případů nazopharingálního karcinomu, který je převažující u populace etnických Číňanů. Infekční mononukleóza je důsledkem primární infekce EBV. Není život ohrožujícím onemocněním, pokud nejsou přítomny další rizikové faktory.

Popsány byly čtyři bílkoviny virové obálky EBV, vytvářející tak zvaný membránový komplex. Obvykle jsou označovány jako gp 220/350 nebo gp 250/350 nebo jednoduše jako gp 250 nebo 350 (viz EP-A-151 079). Zde je důkaz, že gp 350 a gp 250 indukují produkci neutralizujících protilátek a takové protilátky vůči gp 350 a gp 250 mají neutralizační kapacitu. Tyto bílkoviny jsou tedy kandidáty možné vakcíny vůči EBV. Další informace o použití gp 250/350 k profylaxi a léčbě onemocnění souvisejících s EBV jsou uvedeny v EP 0 173 254.

Hlavní povrchový glykoprotein EBV, gp 350/220, infikuje lidské cílové buňky prostřednictvím interakce s bílkovinou buněčné membrány, CD21. Gp 350/220 je primárním cílem protilátek neutralizujících EBV u

- 14 • ·0*0 ·· ♦ • · 0 0 0 · · ·

• 0 0»» · • « · • » 9 99 λ * • · * · » · · ·9

9 ♦

0 • 0 0 0 0 ·0«0 lidí a některé formy gp 350/220 byly prokázány jako ochranné vůči onemocnění, spojených s EBV. Vakcinační prostředek podle vynálezu s výhodou obsahuje gp 350 z EBV, i když mohou být použity i jiné ochranné antigeny.

HSV-2 je primární etiologické agens herpes genitalis. HSV-2 a HSV-1 (agens vyvolávající herpes labialis) jsou charakterizovány svou schopností indukovat jak akutní onemocnění, tak působit latentní infekci, primárně v buňkách neuronových ganglií.

Výskyt herpes genitalis se odhaduje přibližně na 5 milionu lidí v samotných USA s 500 000 klinických případů, zaznamenaných každý rok (primární nebo opakované infekce). Primární infekce typicky nastává po pubertě a je charakterizována místním výskytem bolestivých kožních leží, které přetrvávají po dobu mezi 2 a 3 týdny. V průběhu následujících 6 měsíců po primární infekci bude 50 % pacientů vykazovat opakování onemocnění. Přibližně 25 % pacientů může vykazovat 10 až 15 opakujících se epizod tohoto onemocnění každý rok. U imunologicky ohrožených pacientů je výskyt rychle se opakující infekce statisticky vyšší než v normální populaci pacientů.

Oba viry, HSV-1 a HSV-2, mají množství glykoproteínových složek, umístěných na povrchu viru. Ty jsou známé jako gB, gC, gD a gE a podobně.

Pokud je v prostředku podle vynálezu zahrnut HSV antigen, je s výhodou odvozen od HSV-2, typicky glykoproteinu D. Giykoprotein D je umístěn na virové membráně a nachází se také v cytoplasmě infikovaných buněk ( R. J. Eisenberg se spoluautory, J. of Virol.35, 428 až 435, 1980). Obsahuje 393 aminokyselin, včetně signálního peptidu a má molekulovou hmotnost přibližně 60 000. Ze všech glykoproteinu obálky HSV je tento pravděpodobně nejlépe charakterizován ( Cohen se

- 15 9 ···· ·· *

Φ 9·* f> 1' • 9 • · · · · · · • · ··· * · * • •9 9 <9 * · 9 • 9 · · · 9 «9« »· 9999 in vivo hraje Nadto bylo spoluautory, J. of Virol. 60, 157 až 166). Je známo, že ústřední roli v zachycení viru na buněčné membrány, prokázáno, že in vivo je glykoprotein D schopný vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek (Eing se spoluautory, J. Med. Virol. 127, 59 až 65). Ovšem latentní viry HSV-2 mohou být stále reaktivovány a indukovat návrat onemocnění i přes přítomnost vysokého titru neutralizačních protilátek v séru pacientů.

V jednom ztělesnění vynálezu je přítomen zkrácený glykoprotein D z HSV-2 o 308 aminokyselinách, který zahrnuje aminokyseliny 1 až 306 přírodně se vyskytujícího glykoproteinu s přídavkem asparaginu a glutaminu na G-konci zkrácené bílkoviny, postrádající svoji kotvící membránovou oblast. Tato forma bílkoviny zahrnuje signální peptid, který je odštěpen k poskytnutí zralé bílkoviny o 283 aminokyselinách. Produkce takové bílkoviny v buňkách vaječníků čínského křečka byla popsána v evropském patentu EP-B-139 417 (Genentech).

Zkrácený rekombinantní zralý glykoprotein D z HSV-2 se s výhodou používá ve vakcinačních prostředcích podle předkládaného vynálezu a je označován jako rgD2t.

Kombinace tohoto antigenu HSV-2 s adjuvantní látkou 3D-MPL byla popsána ve WO 92/16231.

V upřednostňovaném aspektu vakcinační prostředek podle vynálezu navíc zahrnuje virový antigen Varicella Zoster (antigen VZV). Vhodné antigeny VZV pro začlenění do vakcinačního prostředku zahrnují gpl-V, popsaný Longneckerem a spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 4303-4307, 1987.

V upřednostňovaném ztělesnění je použit gpl (viz Ellis a spol., patent US 4 769 239.) Viz také evropský patent č. 0 405 867 B1.

• ·

- 16 • · • · · · · ·

V jiném upřednostňovaném aspektu vakcinační prostředek podle vynálezu navíc zahrnuje antigen lidského cytomegaloviru (HCMV). HCMV je lidský DNA virus, patřící do skupiny herpes virů. HCMV se endemicky vyskytuje ve většině částí světa. U dvou populací je HCMV odpovědný za vážné zdravotní stavy. HCMV je hlavní příčinou vrozených defektů novorozenců. Druhou ohroženou populací jsou imunitně oslabení pacienti, jako jsou ti, trpící infekcí HIV a pacienti, kteří podstoupili transplantace. Klinické onemocnění vyvolává množství příznaků, včetně horečky, hepatitidy, zánětu plic a infekční mononukleózy. Upřednostňovaným antigenem pro použití ve vakcině vůči HCMV je gB685**, jak je popsán ve WO 95/31555. Imunogeny pro použití ve vakcinách vůči HCMV poskytuje také pp65, bílkovina matrixu HCMV, jak je popsána ve WO 94/00150 (City of Hope).

V upřednostňovaném aspektu vakcinační prostředek podle vynálezu navíc obsahuje jak antigen VZV, tak i antigenHCMV a zejména takové antigeny, které byly popsány výše.

V jiném upřednostňovaném aspektu vakcinační prostředek podle vynálezu navíc obsahuje antigen Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii je obvyklým nitrobuněčným protozoárním parazitem, odpovědným za toxoplasmózu u teplokrevných živočichů, včetně člověka. Ačkoli je u zdravých jedinců obecně bez klinických příznaků, toxoplazmóza může působit závažné komplikace u těhotných žen a imunitně oslabených pacientů. Upřednostňovaným antigenem pro použití ve vakcině vůči Toxoplasma gondii je SAG1 (známý také jako P30), jak je popsán ve WO 96/02654, nebo Tg34, jak je popsán ve WO 92/11366.

V jednom z upřednostňovaných aspektů vakcinační prostředek podle vynálezu navíc obsahuje buď antigen VZV nebo HCMV, kombinovaný s antigenem Toxoplasma gondii a zejména takové antigeny, které byly popsány výše.

- 17 V upřednostňovaném aspektu je vakcinační prostředek podle vynálezu multivalentní vakcínou, například tetra- nebo pentavalentní vakcínou.

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou velmi účinné při indukci ochranné imunity, dokonce i při velmi malých dávkách antigenu (například 5 mikrogramů rgD2t).

Poskytují vynikající ochranu vůči primární infekci a stimulují s výhodou jak specifickou humorální imunitní odpověď (neutralizujících protilátek), tak i efektorovými buňkami zprostředkovanou (DTH) imunitní odpověď.

Předkládaný vynález v dalším aspektu poskytuje vakcinační prostředek, jak je zde popsán, pro použití k léčebné terapii, zvláště pro použití k léčbě nebo profylaxi lidských papilomavirových infekcí a infekcí viru hepatitidy B.

Vakcina podle předkládaného vynálezu bude obsahovat imunoprotektivní množství antigenu (vyvolávající imunitní ochranu) a může být připravena běžnými technikami.

Příprava vakcíny je obecně popsána v Pharmaceutical Biotechnology, díl 61, Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, editoři Powell a Newman, Plenurn Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, vydáno Vollerem a spol., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Opouzdření do lipozomů je popsáno například Fullertonem v patentu US 4 235 877. Spojení bílkovin do makromolekul je popsáno například Likhitem v patentu US 4 372 945 a Armorem se spoluautory v patentu US 4 474 757.

• · · · • ·

- 18 Množství bílkoviny je v každé dávce vakcíny zvoleno jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď bez významných záporných vedlejších účinků typických vakcín. Takové množství bude proměnlivé v závislosti na použitém specifickém imunogenu. Obecně se předpokládá, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1 000 mikrogramů bílkoviny, s výhodou 2 až 100 mikrogramů a nejlépe 4 až 40 mikrogramů. Optimální množství pro určitou vakcínu může být stanoveno standartními studiemi, které zahrnují sledování titrů protilátek a jiných odpovědí subjektů. Po úvodní vakcinaci mohou subjekty obdržet zesilující (upomínací) dávku přibližně pod 4 týdnech.

Kromě vakcinace osob, citlivých vůči infekcím HPV nebo HBV, mohou být farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu použity k imunoterapeutické léčbě pacientů, trpících uvedenými virovými infekcemi.

V dalším aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytnut způsob výroby jak byl popsán, přičemž tento způsob zahrnuje smísení antigenu lidského papilomaviru a antigenu viru hepatitidy B s adjuvantní látkou indukující TH-1, například látkou 3D-MPL a s výhodou nosičem, například hlinitou solí (aíum).

Pokud je to žádoucí k poskytnutí multivalentního vakcinačního prostředku, jak je zde popsá, mohou být přidány i jiné antigeny v jakémkoliv vhodném pořadín.

Následující příklady dokreslují předkládaný vynález, aniž by se na ně omezoval.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

- 19 • ···· ·· ···· ·· ·· • · · ··· ···» ···· · ···· 9 9 · • · · · · · · · 9 · • · ··· ·· · · 9 ·

Srovnávací imunogenita HPV Ags/HBs kombinací, formulovaných s Alum/3D-MPL.

Úvod

Studie imunogenity byla provedena u myší Balb/C za použití čtyř rozdílných antigenů:

1. částic podobných viru HPV16 L1 (VLP 16)

2. částic podobných viru HPV18 L1 (VLP18)

3. PD 1/3 16E7 2M z HPV 16 (E7)

4. HBsAg formovaných s Alum/3D-MPL (AS04) za použití předem adsorbovaných monomnožství antigenů nebo 3D-MPL na AI(OH)₃ nebo AIPO₄ .

Prostředky 3D-MPL/AI(OH)₃ jsou označovány jako AS04D, zatímco prostředky na bázi 3D-MPL/ AIPO₄ jsou označovány jako AS04C.

Hodnoceny byly následující vakcíny:

1. VLP 16 + VLP 18 AS04V;

2. prostředky na bázi E7,

3. HBs AS04C a byla zjišťována možnost kombinace těchto vakcín.

Cíle tohoto pokusu byly následující:

1. Srovnání imunogenity kombinací různých AS04 s VLP 16 + VLP 18, nebo s E7 a HBs Ag.

2. Vzhledem k tomu, že monovalentní vakcíny jsou formovány buď v AS04C nebo v AS04D:

• ···· · · ···· • · · · * · • · · · · ···· • · · · « ·

- 20 ·· ·· • · · · • · ·

- srovnání imunogenity různých prostředků s HBs AS04, vyráběných s AIPO₄, nebo se směsí AÍPO₄ / AI(OH)₃ o různých poměrech jednotlivých forem hliníku; a

- stanovení účinku adsorbce 3D-MPL na podíl AI(OH)₃ a AIPO₄vůči 3D-MPL/AI(OH)₃ v kombinaci, obsahující VLP nebo E7 antigeny.

Postup experimentu je plně popsán v oddílu Materiál a metody.

Souhrnně byly skupiny 10 myší dvakrát nitrosvalově imunizovány v intervalech tří týdnů různými prostředky na bázi antigenu (1/10HD). Protílátková odpověď vůči HBs, E7 a VLP antigenům a izotypový profil, indukovaný vakcinací, byly sledovány za pomoci testu ELISA v den 14 po druhé vakcinací. Ve stejném časovém okamžiku byla CMI (lymfoproliferativní odpověď nebo produkce cytokinů (IFN-y/IL5)) analyzována po opětovné stimulaci slezinných buněk za podmínek in vitro buď antigeny HBs, VLP nebo E7.

Materiály a metody

Prostředek

Složení prostředku

VLP 16, VLP 18, PD1 /3-HPV16E7-His a HBs na AS04C nebo AS04D.

Použité složky

Složka	Koncentrace (pg/ml)	Pufr
HPV 16 VLP	560	20 mM Tris/ 500mM NaCl
HPV 18 VLP	550	500 mM NaCI/20 mM NaPO₄

• · · · • · · ·

AI(OH)₃	10380	H₂O
PD1/3-HPV-16E7-HÍS	1170	20 mM PO₄
HBs	1219	10 mM PO₄/150 mM NaCl
3D-MPL	1170	Voda pro injekce
aipo₄	5000	150 mM NaCl

mM = mmol χ I'¹

Adsorpce

a) adsorpce VLP

Vyčištěné množství VLP 16 a VLP 18 se přidá k AI(OH)₃ v poměru 2 pg VLP/10 pg AI(OH)₃. Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

b) adsorpce HBs pg HBs se smísí se 40 pg AIPO₄ .Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

pg HBs se smísí se 10 pg AIPO₄ .Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

c) adsorpce PD1 /3-HPV16E7-His.

pg E7 se smísí s 10 pg AI(OH)₃ . Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

d) adsorpce 3D-MPL pg 3D-MPL se smísí s 10 pg AI(OH)₃. Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

- 22 5 μρ 3D-MPL se smísí s 10 μρ AIPO₄. Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

2,5 μρ 3D-MPL se smísí s 5 μρ AI(OH)₃. Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

2,5 μρ 3D-MPL se smísí s 5 μρ AIPO₄ Směs se uchovává při teplotě mezi 2 až 8 °C až do dokončení prostředku.

Prostředek

H₂O a NaCl se smísí (10 x koncentrované) a po 10 minutách protřepávání při teplotě místnosti se přidají různé složky: adsorbovaný antigen, adsorbovaný 3D-MPL a AI(0H)₃ (viz tabulka níže). Míchají se při teplotě místnosti po dobu 10 minut a skladují se při teplotě 4 °C až do doby injikace. Potom může být stanovena charakterizace prostředku v podmínkách in vitro.

Tabulka skupin a podrobnosti prostředků

Skupina	Antigen (antigeny)	Imunostimulátory	Prostředí	(vehikulum)
typ	PO	typ	pg	typ	pg
A	VLP-16 VLP-18	2 2	3D-MPL	5	AI(OH)₃ AI(OH)₃ AI(OH)₃	10 10 10 20
B	HPV16E7	2	3D-MPL	5	AI(OH)₃ AI(0H)₃	10 10 30
C	HBs	2	3D-MPL	5	aipo₄ A!PO₄	40 10

- 23 • ··#· ·· ··*· ·« ·· ♦ ♦ · · · · rf « · · • 9 ·· · 9 · * 9 « 9 · • · · · 9 · · « · ·

D	HBs	2	3D-MPL	5	aipo₄ aipo₄ AI(OH)₃	10 10 30
E	HBs	2			aipo₄	10
			3D-MPL	5	AI(OH)₃	10
					AI(OH)₃	30
F	E7	2			AI(OH)₃	10
	HBs	2			aipo₄	10
			3D-MPL	5	AI(OH)₃	10
					AI(OH)₃	20
G	VLP-16	2			AI(OH)₃	10
	VLP-18	2			AI(OH)₃	10
	HBs	2			aipo₄	10
			3D-MPL	5	AI(OH)₃	10
					AI(OH)₃	10
H	VLP-16	2			ai(0H)₃	10
	VLP-18	2			AI(OH)₃	10
	HBs	2			aipo₄	10
			3D-MPL	2,5	AI(OH)₃	5
			3D-MPL	2,5	aipo₄	5
					AI(OH)₃	10

Sérologie myší

Anti-HBs sérologie

Množství protilátek anti-HBs bylo stanoveno testem ELISA za použití HBs (Hep 286) jako potahovacího antigenů. Roztoky antigenů a protilátek byly použity v množství 50 μΙ/jamku. Antigen byl zředěn na konečnou koncentraci 1 pg/ml a přes noc byl při teplotě 4 °C adsorbován na jamky mikrotitrační destičky o 96 jamkách (Maxisorb

- 24 • » · · · ·

Immuno-plate, Nunc, Dánsko). Destičky byly poté inkubovány jednu hodinu při 37 °C s roztokem PBS, obsahujícím 1% hovězí sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojitě naředěná séra (počínaje zředěním 1:100) v saturačním pufru byla přidávána na destičky pokryté HBs a ty byly inkubovány 1,5 hodiny při 37 °C. Poté byly destičky čtyřnásobně promyty PBS s 0,1% Tween 20 a do každé jamky byly přidány s biotinem konjugovaný anti-myší imunoglobulin (Amersham, Velká Británie), naředěný 1:1 500, nebo lgG1, lgG2a či lgG2b (Imtech, USA) ve zředění 1:4 000, 1:8 000, 1:4 000 v saturačním pufru a destičky byly inkubovány 1,5 hodiny při 37 °C. Po kroku promytí byl přidán komplex streptavidinu a biotinylované peroxydázy (Amersham, Velká Británie), naředěný 1:1 000 v saturačním pufru, na dobu dalších 30 minut při 37 °C. Destičky byly promyty jak bylo popsáno předtím a byly inkubovány 20 minut s 0,04% roztokem o-fenylendiaminu (Sigma) a 0,03% H₂O₂ v 0,05 mol χ I'¹ v citrátovém pufru s 0,1% Tween 20. Reakce byla ukončena přidáním 2N roztoku kyseliny sírové a odečítána při vlnové délce 490/630 nm. Titry ELISA byly vypočítány srovnáním za použití SoftmaxPro (použita rovnice o čtyřech parametrech) a vyjádřeny v EU/ml.

Anti-E7 sérologie

Kvantifikace protilátek anti-E7 byla provedena testem ELISA za použití PD1/3 16 E7 2M jako potahovacího antigenu. Roztoky antigenu a protilátky byly použity v množství 100 mikrolitrů/jamku. Antigen byl zředěn na konečnou koncentraci 0,5 pg/m v PBS a byl adsorbován přes noc při teplotě 4 °C na jamky mikrotitrační destičky o 96 jamkách (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko). Destičky byly poté inkubovány jednu hodinu při 37 °C s roztokem PBS, obsahujícím 1% hovězí sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojitě zředěná séra (počínaje zředěním 1:100 nebo 1:400) v saturačním pufru byla přidávána

- 25 • φ · · · · ♦»»· φφ φφ • φφφ φφφφ φφφ φ φφφφ · · φ φ · · φ φφφφ φ φφφ φφφφ na destičky pokryté Ε7 a ty byly inkubovány 1,5 hodiny při 37 °C. Poté byly destičky čtyřnásobně promyty PBS s 0,1% Tween 20 a do každé jamky byly přidány s biotinem konjugovaný anti-myší imunoglobulin, nebo lgG1, lgG2a či lgG2b (Amersham, Velká Británie), naředěné 1:1 500 v saturačním pufru. Destičky byly inkubovány 1,5 hodiny při 37°C. Po kroku promytí byl přidán komplex streptavidinu a biotinylované peroxydázy (Amersham, Velká Británie), naředěny 1:5 000 v saturačním pufru na dobu dalších 30 minut při 37 °C. Destičky byly promyty jak bylo popsáno dříve a byly inkubovány po dobu 20 minut s roztokem tetramethylbenzidinu (TMB) (Biorad, USA), dvojnásobně naředěným v citrátovém pufru (0,1 mmol χ I'¹, pH = 5,8). Reakce byla ukončena přidáním 0,5 N roztoku kyseliny sírové a odečtena při vlnové délce 450/630 nm. Titry ELISA byly vypočítány srovnáním za použití SoftmaxPro (použita rovnice o čtyřech parametrech) a vyjádřeny v EU/ml.

Sérologie anti-VLP 16 a anti-VLP 18

Kvantifikace protilátek anti-VLP 16 a anti-VLP 18 byla provedena testem ELISA za použití VLP 16 503/1 (20/12/99) a VLP 18 504/2 (25/10/99F) jako potahovacích antigenů. Roztoky antigenu a protilátek byly použity v množství 50 mikrolitrů/jamku. Antigen byl naředěn na konečnou koncentraci 0,5 mikrogramů/ml v PBS a přes noc byl adsorbován při teplotě 4 °C na jamky mikrotitrační destičky o 96 jamkách (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko). Destičky byly poté inkubovány 1 hodinu při teplotě 37 °C s roztokem PBS, obsahujícím 1% hovězí sérový albumin. Dvojitá zředění sér (počínaje 1:400) v saturačním pufru byla přidávána k destičkám potahovaným VLP a ty byly poté inkubovány po dobu 1,5 hodiny při 37 °C. Destičky byly čtyřnásobně promyty PBS s 0,1% Tween 20 a následně byl do každé jamky přidán biotin, konjugovaný s anti-myším imunoglobulinem (Amersham, Velká Británie), naředěny 1:1 500 v saturačním pufru.

- 26 • tototo· ·· toto·· ·· toto ··* tototo · · · · to··· to to ·to· * to to • · · · to to · · to · • ··♦ ·*·· • toto to·· toto to·· ·· tototo·

Inkubace probíhala 1,5 hodiny při 37 °C. Po kroku promývání byl přidán komplex streptavidinu a biotinylované peroxydázy (Amersham, Velká Británie), naředěny 1 :1 000 v saturačním pufru na dobu dalších 30 minut při 37 °C. Destičky byly promyty jak bylo popsáno dříve a byly inkubovány 20 minut s roztokem 0,04% roztokem o-fenylendiaminu (Sigma) a 0,03% H₂O₂ v 0,05 mol χ I¹ v citrátovém pufru s 0,1% Tween 20. Reakce byla ukončena přidáním 2N roztoku kyseliny sírové a odečítána při vlnové délce 490/630 nm. Titry ELISA byly vypočteny srovnáním za použití SoftmaxPro (použita rovnice o čtyřech parametrech) a vyjádřeny v EU/ml.

Proliferace buněk T

Dva týdny po druhé imunizaci byly myši zabity, byly jim asepticky odebrány sleziny a spojeny (pool pěti orgánům na skupinu). Suspenze buněk byly připraveny v mediu RPMI 1 640 (Gibco), obsahujícím 2 mmol χ I'¹ L-glutamin, antibiotika, 5 x 10⁵mol χ I’¹ 2-merkaptoethanol a 1% syngenní normální myší sérum. Slezinné buňky byly v konečné koncentraci 2 χ 10⁶ buněk/ml kultivovány v objemu 200 mikrolitrů v destičkách o 96 jamkách s kulatým dnem, společně s různými koncentracemi (10 až 0,03 mikrogramů/ml) každého z antigenů (VLP, E7 nebo antigenů HBs). Každý test byl prováděn ve čtyřech souběžných stanoveních. Po 96 hodinách kultivace při 37 °C a v přítomnosti 5% CO₂byly buňky v průběhu 18 hodin radioaktivně označeny ³H-thymidinem (Amersham, Velká Británie, 5 Ci/mmol) množstvím 0,5 p.Ci/jamku a poté byly pomocí sběrače shromážděny na destičky Unifilter (Packard). Získaná radioaktivita byla měřena na scintilačním počítači (Topcount, Packard). Výsledky jsou vyjádřeny v cpm (počet rozpadů za minutu) (jedná se o průměr cpm ze 4 souběžných stanovení), nebo jako stimulované hodnoty (průměr cpm v buněčných kulturách s antigenem/průměr cpm v buněčných kulturách bez antigenů).

- 27 ··»· 0 0 0 00 0 ·· 00 • · 0 · · · » 0 • ·· 0 0000 0 0 ·

0 0 00 0000

Produkce cytokinů

Dva týdny po druhé imunizaci byly myši zabity, byly jim asepticky odebrány sleziny a spojeny jako pool pěti orgánům na skupinu. Suspenze buněk byly připraveny v mediu RPMI 1 640 (Gibco), obsahujícím 2 mmol x I'¹ L-glutamin, antibiotika, 5 x 10'⁵ mol x l·¹2-merkaptoethanol a 5% fetální telecí sérum. Buňky byly kultivovány v konečné koncentraci 2 x 10⁶ buněk/ml v objemu 1 ml v destičkách o 24 jamkách s plochým dnem společně s různými koncentracemi (10 až 1 mikrogram/ml) každého z antigenů (VLP, E7 nebo antigenu HBs). Supernatanty byly shromážděny po 96 hodinách a zamraženy až do doby testování přítomnosti IFN-γ a IL5 pomocí ELISA.

IFN-γ (Genzyme)

Kvantifikace IFN-γ byla prováděna testem ELISA za použití reakčních činidel od firmy Genzyme. Vzorky a roztoky protilátek byly použity v množství 50 μΙ/jamku. Mikrotitrační destičky o 96 jamkách (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko) byly přes noc potahovány při teplotě 4 °C 50 μΙ křeččího anti-myšího IFN-γ, zředěného v množství 1,5 μς/ιτιΙ v uhličitanovém pufru o pH 9,5. Poté byly destičky inkubovány 1 hodinu při 37 °C se 100 μΙ roztoku PBS, obsahujícího 1% hovězí sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojitá zředění supernatantu ze stimulace za podmínek in vitro (počínaje 1/2) v saturačním pufru byly přidávány k destičkám potahovaným anti-IFN-γ a inkubovány 1,5 hodiny při 37 °C. Destičky byly čtyřnásobně promyty PBS s 0,1% Tween (promývací pufr) a poté byl do každé jamky přidán biotin, konjugovaný s kozím anti-myším IFN-γ, naředěným v saturačním pufru na konečnou koncentraci 0,5 μg/ml. Destičky byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C. Po kroku promytí byl na dobu 30 minut při teplotě 37 °C přidán konjugát AMDEX (Amersham), naředěný 1:10 000 v saturačním pufru. Destičky

- 28 ·· ·»«· φ 9 9 999 >9 » 9 9 9

9 9

9 9 • 99

9999 byly promyty jak bylo popsáno výše a poté byly inkubovány s 50 μΙ TMB (tetramethylbenzidin, Biorad) po dobu 10 minut. Reakce byla ukončena 0,4 N roztokem kyseliny sírové a odečtena při vlnové délce 450/630 nm. Koncentrace byly vypočteny za použití standardní křivky (standardní myší IFN-γ) pomocí Softmax Pro (rovnice o čtyřech parametrech) a vyjádřeny v pg/ml.

1L5(Pharmingen)

Kvantifikace IL5 byla provedena testem ELISA za použití reakčních činidel od firmy Pharmingen. Vzorky a roztoky protilátek byly použity v množství 50 μΙ/jamku. Mikrotitrační destičky o 96 jamkách (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko) byly přes noc při 4 °C potahovány 50 μΙ krysího anti-myšího IL5, zředěného na 1 pg/ml v uhličitanovém pufru o pH 9,5. Poté byly destičky inkubovány 1 hodinu při 37 °C se 100 μΙ roztoku PBS, obsahujícího 1% hovězí sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojitá naředění supernatantu ze stimulace za podmínek in vitro (počínaje 1:2) v saturačním pufru byly přidávány k destičkám potahovaným anti-IL5 a inkubovány po dobu 1,5 hodiny při 37 °C. Destičky byly čtyřnásobně promyty roztokem PBS s 0,1% Tween (promývací pufr). Do každé jamky byl přidán biotin konjugovaný s krysím anti-myším IL5, zředěným v saturačním pufru na konečnou koncentraci 1 pg/ml a destičky byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C. Po kroku promývání byl přidán konjugát AMDEX (Amersham), zředěný 1:10 000 v saturačním pufru na dobu 30 minut při 37 °C. Destičky byly promyty jak bylo popsáno výše a inkubovány s 50 μΙ TMB (Biorad) po dobu 15 minut. Reakce byla zastavena přidáním 0,4 N roztoku kyseliny sírové a odečtena při vlnové délce 450/630 nm. Koncentrace byly vypočítány za použití standardní křivky (rekombinantní myší IL5) pomocí Softmax Pro (rovnice o čtyřech parametrech) a vyjádřeny v pg/ml.

- 29 * 4 4· 4 »ι · ··· ···· • 4 4* 4 » 444 ·· 4 • · · · · · · · · · · 4 9 4 · · 9

444 «44 44 444 44 «444

Skupiny

Skupiny 10 myší (Balb/C) byly nitrosvalově imunizovány podáním následujících prostředků:

Tabulka 1: skupiny a prostředky

skupina	prostředek
A	VLP 16 2 gg / VLP 18 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AI(OH)₃ 50 gg
B	16E7 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AI(OH)₃ 50 gg
C	HBs 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AIPO₄ 50 gg
D	HBs 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AIPO₄ 20 gg / AI(OH)₃ 30 gg
E	HBs 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AIPO₄ 1 0 gg / AI(OH)₃ 40 gg
F	16E7 2 gg / HBs 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AI(OH)₃ 40 gg / AIPO₄ 10 gg
G	VLP 16 2 gg / VLP 18 2 gg / HBs 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AI(OH)₃ 40 gg / AIPO₄ 10 gg
H	VLP 16 2 gg / VLP 18 2 gg / HBs 2 gg / 3D-MPL 5 gg / AI(OH)₃ 35 gg / AIPO₄ 15 gg

Podrobnosti o prostředku jsou popsány výše, v tabulce Materiály a metody.

Výsledky .Sérologie

a) anti-HBs odpověď:

Humorální odpovědi (imunoglobuliny a izotypy) byly měřeny pomocí ELISA, přičemž jako potahovací antigen byl použit HBsAg (Hep

- 30 φ »»·» ·φ «φφφ φφ φφ • · < φφφ φφφφ •Φφφ φ φφφφ φ · φ φ φφφφ φφφφ φ • φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφφ φφ φφφφ

286). Analyzována byla séra ze dne 14 po druhé imunizaci (day 14 post II sera).

Obrázek 1 znázorňuje anti-HBs protilátkové odpovědi, změřené v jednotlivých sérech v den 14 po druhé imunizaci.

V anti-HBs protilátkové odpovědi nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi protokoly, uplatňovanými k adsorbování 3D-MPL na: AI(OH)₃samotný nebo AIPO₄ samotný (skupiny C,D, E) za různých poměrů AI(OH)₃ a AIPO₄ ve vakcíně (GMT o 27 904 EU/ml vůči 30 832 nebo 26 670 EU/ml).

Poněkud nižší anti-HBs protilátková odpověď byla pozorována v kombinovaných skupinách G a H, obsahujících antigeny VLP a HBs, ve srovnání s samotným HBs (skupina C) (GMT 10 635 nebo 15 589 EU/ml vůči 27 905 EU/ml). Anti-HBs GMT, získaný v kombinaci E7/HBs, představoval 19 235 EU/ml.

Před statistickou analýzou byi u každé populace použit T-Grubbsův test k vyloučení dat. Jedna myš ve skupině C byla z analýzy vyloučena.

Jednocestná disperzní analýza byla provedena u titrů anti-HBs po logaritmické transformaci údajů po druhé imunizaci. Mezi prostředky byly pozorovány významné rozdíly (hodnota p = 0,0108) a byl tedy použit Studentův-Newmanův-Keulsův test pro vícečetná srovnání. Žádné statisticky významné rozdíly nebyly pozorovány mezi kombinacemi skupiny H (VLP/HBs) nebo skupiny F (HBs/E7) vůči skupině C (HBs AS04C). Statisticky významný rozdíl byl pozorován mezi skupinou G (VLP/HBs) a skupinou C (HBs AS04C) (hodnota p = 0,0291), ovšem 95% intervaly spolehlivosti dvou skupin jsou přesahující a rozdíl, který dosahuje poměru 2,5, nemusí být biologicky relevantní.

» ·» A

A

AAA •

A

- 31 AA AAAA A A A

A A A · A

A A A A

A A ·

AA AAA

AA

A

A ··

AAA • A

A A a a AAAA

Izotypové rozdělení, analyzované ve spojeném séru, bylo následující a nevykazuje žádné podstatné rozdíly mezi šesti skupinami.

	Izotypické rozdělení (%>
lgG1	lgG2a	lgG2b
skupina C	59	31	10
skupina D	69	19	12
skupina E	66	19	15
skupina F	61	22	17
skupina G	61	30	9
skupina H	46	29	25

b) anti-E7 odpověď:

Humoráiní odpovědi (imunoglobuliny a izotypy) byly měřeny testem ELISA za použití PD1/3 16E7 2M jako potahovacího antigenů. Analyzována byla séra ze dne 14 po druhé imunizaci skupin B a F.

Obrázek 2 znázorňuje anti-E7 protilátkové odpovědi, měřené v jednotlivých sérech v den 14 po druhé imunizaci:

Slabé snížení bylo pozorováno u anti-E7 odpovědi s dvojnásobným snížením u GMT pro kombinace HBs/E7 ve srovnání s E7 samotným (9 626 vůči 22 447 EU/ml). To bylo za použití

Studentova-Newmanova-Keulsova testu prokázáno jako statisticky nevýznamné.

Žádný rozdíl nebyl pozorován v izotypovém profilu, indukovaném dvěma prostředky: zejména pokud se týká odpovědi lgG1 (97 až 98 % lgG1), jak je uvedeno v tabulce viz níže.

- 32 * «999 9« ·**· «9 99 «9 9 999 999«

9 99 9 9 999 9 9 9 »99· 9 9 9 9 9 «99 «999

999 999 «· 9*9 99 ··<·

Izotypové rozdělení, analyzované ve spojených sérech, bylo následující:

	Izotypové rozdělení (%)
lgG1	lgG2a	lgG2b
Skupina B	98	0	1
Skupina F	97	1	2

c) anti-VLP 16 odpověď:

Humorální odpovědi (imunoglobuliny) byly měřeny testem ELISA za použití VLP 16 503-1 (20/12/99) jako potahovacího antigenu.

Analyzována byla séra ze dne 14 po druhé imunizaci.

Obr. 3 znázorňuje anti-VLP 16 Ig protilátkové odpovědi, měřené v jednotlivých sérech v den 14 po druhé imunizaci.

Po imunizaci kombinací HBs a VLP (skupina G a H) a po imunizaci imunovalentním VLP prostředkem (skupina A) byly získány podobné anti-VLP 16 titry (GMT 19 570 nebo 23 448 EU/ml vůči 30 311 EU/ml). Rovnocenné titry byly pozorovány u dvou kombinací, připravených za použití jedné či druhé cesty k adsorbování 3D-MPL: AI(OH)₃ samotného (skupina G) ve srovnání se směsnou adsorbcí na AI(OH)₃ a AIPO₄(skupina H) (GMT 19 570 EU/ml vůči 23 448 EU/ml).

Tyto rozdíly byly prokázány jako statisticky nevýznamné za použití jednocestné analýzy variačního testu.

d) anti-VLP 18 odpověď:

Humorální odpovědi (imunoglobuliny) byly měřeny testem ELISA

- 33 000* • »·

IP

00*0 • 0 · • · 000 • 9 9 ·

0 0 • 0 ·0· <

«0

0-0

0 ·

0 t 0 0

0000 za použití VLP 18 504-2 (25/10/99) jako potahovacího antigenu. Séra byla analyzována v den 14 po druhé imunizaci.

Obr.4 znázorňuje anti-VLP 18 Ig protilátkovou odpověď, měřenou v jednotlivých sérech v den 14 po druhé imunizaci.

Podobné anti-VLP 18 titry byly získány po imunizaci kombinací HBs a VLP (skupina G a H), nebo monovalentními VLP prostředky (skupina A) (GMT 37 285 nebo 51 202 EU/ml vůči 56 504 EU/ml). Rovnocenné titry (skupina G a H) byly. pozorovány u kombinace, připravené za použití jedné i druhé cesty k adsorbování 3D-MPL: AI(OH)₃ samotného (skupina G) ve srovnání se směsnou adsorbcí na AI(OH)₃ a AIPO₄ (skupina H).

2. Buněčně zprostředkovaná imunitní odpověď

Buněčně zprostředkované imunitní odpovědi (lymfoproliferace, produkce IFN-y/IL5) byly stanovovány v den 14 po druhé imunizaci, následně po restimulaci slezinných buněk in vitro buď antigeny HBs, E7 nebo VLP. Pro každou skupinu myší byly vytvářeny pooly pěti orgánů. Postup experimentu je plně popsán v dříve uvedeném odstavci Materiál a metody.

3. Produkce cytokinů

a) Restimulace in vitro pomocí HBs

Obr. 5 znázorňuje produkci cytokinů, sledovanou v slezinných buňkách po 96 hodinách restimulace in vitro účinkem HBs.

- 34 U všech skupin byla pozorována nízká produkce IFN-γ a IL5, ovšem jak je znázorněno v Tabulce 2, ve srovnání s produkcí IL5 byla pozorována vyšší produkce IFN-γ, přičemž poměr IFN-y/IL5 ukazoval, že srovnatelná odpověď TH1 je indukována monovalentními a kombinovanými vakcínami. Výsledky skupiny C by neměly být brány v potaz, neboť podprahová data mohou naznačovat nepřítomnost antigenu pro restimulaci.

Tabulka 2: poměr IFN-y/IL-5 po restimulaci in vitro účinkem HBs.

Poměr	Skupina	Skupina	Skupina	Skupina	Skupina	Skupina
IFN/IL-5	C	D	E	F	G	H
HBs 10pg/ml	0,3	4,0	9,4	7,9	7,9	6,6
HBs 1 pg/ml	0,4	3,7	1,5	4,0	4,0	5,0

b) restimulace in vitro účinkem E7

Obr. 6 znázorňuje produkci cytokinů, sledovanou ve slezinných buňkách po 96 hodinách restimulace in vitro antigenem E7.

Účinek dávkového rozmezí byl pozorován při srovnání dávky 10 pg a 1 pg antigenu pro restimulaci.

Nespecifická odpověď byla pozorována u HPV 16/18 L1 VLP imunizovaných skupin za použití 10 pg antigenu k restimulaci.

Ve srovnání s IL-5 je IFN-γ produkován v mnohem vyšší koncentraci (Tabulka 3), což ukazuje čistý TH-1 profil imunitní odpovědi u všech testovaných skupin (monovalentních vůči kombinacím).

• · · · • 9

- 35 Tabulka 3: Poměr IFN-y/IL-5 po restimulaci in vitro účinkem E7.

Poměr IFN/IL-5	Skupina B	Skupina F
E7 10 pg/ml	17,7	12,9
E7 1 pg/ml	8,9	1,2

c) restimulace in vitro účinkem VLP16 a 18

Obr. 7 a 8 znázorňují lymfoproliferaci po restimulaci in vitro účinkem VLP 16 nebo VLP 18 v den 14 po druhé imunizaci.

Srovnatelné profily byly pozorovány u všech prostředků, obsahujících VLP (integrované stimulované indexy mezi 12 až 29), přičemž počet rozpadů za minutu, cpm, se pro restimulační dávku 10 pg antigenů pohyboval kolem 30 000, což ukazuje na nepřítomnost interference mezi různými prostředky v tomto odčítání.

Obr. 9 znázorňuje produkci cytokinů, sledovanou ve slezinných buňkách po 96 hodinách restimulace in vitro účinkem VLP 16.

Obr. 10 znázorňuje produkci cytokinů, sledovanou ve slezinných buňkách po 96 hodinách restimulace in vitro účinkem VLP 18.

Při použití dávek 10 pg a 1 pg antigenů pro restimulaci kterýmkoliv z antigenů VLP nebyl pozorován žádný účinek rozmezí dávek na produkci cytokinů U všech prostředků, byl pozorován čistý TH1 profil.

Tabulka 5: poměr IFN-y/IL-5 po restimulaci in vitro účinkem

VLP 16 a VLP 18 • ·

Poměr IFN/IL-5	Skupina A	Skupina G	Skupina H
VLP 16 10 pg/ml	12,0	19,9	16,5
VLP 16 1 pg/ml	22,1	37,9	23,2

Poměr IFN/IL-5	Skupina A	Skupina G	Skupina H
VLP 18 10 pig/ml	20,5	17,9	13,4
VLP 18 1 pig/ml	21,8	23,7	21,0

Závěry:

Účinek kombinací VLP/HBs nebo E7/HBs Ag, formulovaných v AS04, na imunogenitu byl určován u myší Balb/C:

Vzhledem k serologické analýze nebyla pozorována žádná interference (vzájemné působení) antigenní kombinace u anti-HBs, anti E7 a anti-VLP sérologie.

Kombinace antigenů VLP a HBs nebo E7 a HBs neinterferovala s izotypovým profilem protilátkové odpovědi, vykazované monovalentní vakcínou.

Způsob adsorbce 3D-MPL (AI(OH)₃, AIPO₄, nebo směsí AI(OH)₃ a AIPO₄) neinterferoval se serologickými výsledky.

V lymfoproliferativním stanovení byly výsledky dostupné po restimulaci účinkem VLP. V těchto skupinách nebyl pozorován žádný záporný účinek kombinace antigenů na proliferativní odpověď.

U stanovení cytokinů byla po restimulaci účinkem HBs Ag získána nízká produkce cytokinů (IL-5 a lFN-γ), ale odpovědi byly srovnatelné u

- 37 monovalentních i kombinovaných vakcín. Po restimulaci účinkem E7 nebo VLP byly u kombinace E7/HBs nebo kombinace VLP/HBs ve srovnání s monovalentními skupinami produkovány srovnatelné hladiny cytokinů. Profil TH-1, pozorovaný u každé z monovalentních vakcín, byl zachován i u skupin kombinovaných vakcín.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje :

a) antigen virové hepatitidy B (HBV); a

b) antigen lidského papilomaviru, HPV ve spojení s adjuvantní látkou, kterou je přednostní stimulátor bunčné odpovědi TH1, přičemž vakcinační prostředek neobsahuje antigen viru herpes simplex.
2. Vakcinační prostředek podle nároku 1, vyznačující se t i m , že navíc obsahuje nosič.
3. Vakcinační prostředek podle nároku 1 nebo nároku 2, v y znáčů j i c i s e t i m , že přednostní stimulátor bunčné odpovědi TH1 je zvolen ze skupiny adjuvantních látek, zahrnující: 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A, 3D-MPL; 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A, kde velikost částic 3-De-O-acylovaného monofosforyllipidu A je s výhodou menší nebo přibližně rovná 100 nm; netoxický podíl, získaný z kůry Quillaja Saponaria Molina, QS21; směs netoxického podílu, získaného z kůry Quillaja Saponaria Molina a cholesterolu; a oligonulkeotid CpG.
4. Vakcinační prostředek podle nároku 3, vyznačující se t i m , že přednostním stimulátorem bunčné odpovědi TH1 je 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A.
5. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že antigenem hepatitidy B je povrchový antigen hepatitidy B.

- 39 9 9 · • * • · • · • · · ·
6. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antigen lidského papilomaviru, HPV, zvolený ze skupiny, sestávající z L1, L2, E6 a E7, volitelně ve formě spojené bílkoviny nebo zkrácené bílkoviny.
7. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že je v něm navíc přítomen antigen viru Epsteina a Barrové, EBV.
8. Vakcinační prostředek podle nároku 7, vyznačující se t í m , že antigenem viru Epsteina a Barrové je gp 350.
9. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že je v něm navíc přítomen antigen viru hepatitidy A.
10. Vakcinační prostředek podle nároku 9, vyznačující se t í m , že antigen viru hepatitidy A, HAV, je odvozen od kmene HM-175.
11. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že nosič je zvolen ze skupiny, zahrnující hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a tokoferol a emulzi oleje ve vodě.
12. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen viru varicella zoster, VZV.
13. Vakcinační prostředek podle nároku 12, vyznačující se t í m , že antigenem viru varicella zoster je gpl.

- 40 φφφφ ·· ΦΦ·Φ ·· φφ • · · · φφφφ φφφ φ φφφφ φ φ · φφφφ φφφφ φ φφ φφφ φφ φφφφ
14. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 13, vyznačující se t í m , že navíc obsahuje antigen lidského cytomegaloviru, HCMV.
15. Vakcinační prostředek podle nároku 14, vyznačující se t í m , že antigenem lidského cytomegaloviru je gB685** nebo pp65.
16. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen Toxoplasma gondii.
17. Vakcinační prostředek podle nároku 16, v y z n a č u j í c í se t í m , že antigenem Toxoplasma gondii je SAG1 nebo TG34.
18. Vakcinační prostředek podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že obsahuje povrchový antigen hepatitidy B, HBsAg S, a L1, L2, E6, E7, bílkovinu D-E6, bílkovinu D-E7 nebo L2-E7 lidského papilomaviru, HPV, a volitelně navíc jeden či více z následujících antigenů: viru Epsteina a Barrové gp 350; viru varicella zoster gpl; inaktivovaného kmene viru hepatitidy A, HAV, HM-175; gB685** nebo pp65 lidského cytomegaloviru a SAG1 či TG34 antigenů Toxoplasma gondii.