JPH06503821A

JPH06503821A - Ｂ型肝炎表面抗原に基づくワクチン

Info

Publication number: JPH06503821A
Application number: JP4501000A
Authority: JP
Inventors: バン・ウィナンダール，フラン; ベジョ，ミッシェル; プリエール，ジャン−ポール
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1991-12-16
Publication date: 1994-04-28
Also published as: AU9052091A; EP0563091A1; WO1992011291A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ型肝炎表面抗原に基づくワクチン本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に化学的に結合した抗原ポリペプチドよりなる改良された免疫原に関する。さらに、本発明は、新規ワクチンおよびそれらの用途に関する。

！在エウイルスのエピトープよりなる蛋白または合成ペプチドは、各々のウィルスにより起こる感染性疾患に対するワクチンに使用するための潜在的な免疫原に相当する。しかし、かかるポリペプチドは、ワクチンとして考えて十分に免疫原性となるために、しばしば、担体およびアジュバントの組合せを要する。

正しい抗原提示が有効なサブユニットワクチンのための鍵要件のようであり、バレンズアラ（Ｖａｌｅｎｚｕａｌａ）らは、良好な免疫原は、適切に露出したそのエピトープの最大数を有しているはずであると結論している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１９ｇ５．３．。

３２３−３２６）。これらの著者によると、この要件は、手当たり次第に抗原を担体分子に化学結合させることによっては達成し難いものである。したがって、担体および第一抗原としてＨＢｓＡｇを使用し、第二抗原をコードする遺伝子をＨＢｓＡｇについての遺伝子で組換えて、第二抗原がＨＢｓＡｇ粒子の表面に組み込まれてその上で提示されるという、新しいアプローチを試みた。ＨＢ　ｓ　、Ａ　ｇ中（ｍｉｄｄｌｅ）蛋白の切頭形とのＮ末端融合を用いて、バレンズラら（上記引用文中）は、単純ヘルペス糖蛋白Ｄ−ＨＢａＡｇハイブリッドポリペプチドの粒子集合を観察した。糖蛋白Ｄ　（ｇＤ）エピトープは、該粒子の表面で繰り返して提示され、それにより、ｇＤ酸成分免疫原性を大きく増大させることが判明した。

より最近になって、ピー・ファルシパルム（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）サーカムスホロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）　（ＣＳ　）蛋白の主要反復エピトープがＨＢｓＡｇに融合され得ることが示された。ハイブリッド粒子の免疫原性は、等価な単量体Ｃ８抗原のものより優れていることが判明した［ルトガーズ（Ｒｕｔｇｅｒｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｃｙｇｙ、　１９８８．６２．１０６５］　ｏまた、ＨＢｓＡｇよりなるハイブリッド免疫原性粒子から製造されたワクチンは、欧州特許出願公開束０２７８９４０号に記載されている。すべての場合において、化学結合技術でなく遺伝子融合により該ハイブリッド粒子を得た。

多価ワクチンを設計する手段として遺伝子融合を強調するにもかかわらず、驚くべきことに、今や、表面に少なくとも１個の遊離スルフィドリル基を有するＨＢｓＡｇ蛋白（またはその適当な断片）のもう一つの抗原との化学的架橋により、有効な免疫原性分子を製造することができることが判明している。

したがって、本発明は、ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すＨＢｓＡｇまたはその断片であって、第一のポリペプチド成分中の天然の硫黄原子を介して第二のポリペプチド成分に共有結合している第一のポリペプチド成分よりなる免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供する。

本発明の有利な点は、上記で定義のとおりのＨＢｓＡｇまたはその断片の免疫原性を損なうことなく、抗原が架橋剤でＨＢｓＡｇ粒子に結合していてもよいことである。さらに、本発明によれば、第二のポリペプチド抗原を、そのプロセッノングを非エンドソーミアル（ｎ□ｎ−６１ｄｎ−６１ｄｏｓｏ経路を経由して指令し得るベクター（ＨＢｓＡｇ粒子）と複合（ｃａｎ　ｊｕｇａｔｅ）させることが可能である。このようにして、第二の抗原は、ＭＨＣＩ抗原に結合し、細胞傷害性リンパ球によりそれとして認識されるのである。結局、化学的結合は、ＨＢｓＡｇ粒子上の抗原（エピトープ）密度に関して、より大きな自由度を可能とし、また、非免疫原性スペーサーの使用を可能とし、それにより、付着部位から粒子までの距離を自由自在に変化させることができるのである。

一つの態様においては、本発明のハイブリッドポリペプチドは、式（Ｉ）二ＰＩ −３−Ｘ−Ｐ２　（１）［式中、基Ｐ＝Ｓ−は、天然の硫黄原子を介して結合したＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すＨＢｓＡｇまたはその断片である。

Ｐ２は、第二の抗原性ポリペプチドである：Ｘは、ａ）基−Ａ−ＮＨ−（式中、Ａはスペーサー基であり、Ｎ、Ｈ−はＰ２におけるアミノ酸の側鎖に存在するアミノ基の残基である）。

または所望により、Ｐ２がシスティン残基および疎水性アンカー基よりなる場合、ｂ）ｐｉ中に存在する上記システィン残基の硫黄原子のいずれかであるコで表されてもよい。

好ましくは、Ｐ２は、Ｈ３ＶからのｇＤ、ｔから選ばれるか、または、ＨＩＶ中和抗体に結合する能力を有するペプチドであり、ｇｐ１２’ｏからのＶ３ループの中和ドメインに相当する。

また、本発明で使用するＶ、ループペプチドは、好ましくは、長さが１０〜２１個のアミノ酸であり、βターン配列の両側に、少なくとも１個の、好ましくは少なくとも２個のアミノ酸により隣接されるβターンよりなる。

好ましくは、該配列は、ｇｐ１６０蛋白の配列３１０〜３２８に相当する。

以下のペプチドが好ましい。

ＴＹＲＴｌ’ｌｌ’ｌ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＳＥＲＩＬＥ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＰＲＯＧＬＹ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　Ｐ）hＥ　ＶＡＬＴＨＲＩＬＥ　ＧＬＹＣ末端チロシンが望ましい。その主要な機能が、放射活性ヨウ素による標識を可能にすることであるからである。

本発明によるハイブリッド粒子の重要な利点は、それらの、Ｔリンパ球により媒介される細胞性免疫を誘導する能力、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導する能力である。

第二抗原ポリペプチド抗原は、通常、単に一個の硫黄原子を介してはＰｌに結合しないため、式（Ｔ）は、簡略化された表現であると理解される。さらに、Ｐｌは、好ましくは、下記のとおり個々の粒子からなる形態である。

第一のポリペプチド成分として使用されるＨＢｓＡｇまたはその断片が、その表面に少なくとも一個の遊離チオールを有する（例、ＰＩ−５Ｈとして表されてもよい）ことが本発明に必須である。この目的のため、ＨＢｓＡｇまたはその断片を正しい方法で得ることが重要である。

商業的に入手可能なＨＢＶに対するワクチンは、天然または組換え形態のＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）よりなる。信用できるＢ型肝炎ウィルス表面抗原は、Ｐ２４およびそのグリフシル化誘導体ＧＰ２８　［これらは共に、Ｓ蛋白コープインク配列またはＨＢＶ　Ｓ遺伝子として公知のＨＢＶゲノム上の２２６個のアミノ酸コーディング配列によりコードされている：チオライス（Ｔｉｏｌ　１ａｉｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１７　（１９８５）４８９頁およびその中の参考文献参照］として公知の２個の蛋白よりなる約２２ｎｍの粒子として、感染した個体の血漿から回収することができる。ＨＢｓＡｇの完全なアミノ酸配列およびＨＢｓＡｇをコードするヌクレオチド配列が、バレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）ら、へａｔｕｒｅ、２８０　（１９７９）、８１５頁に与えられている。ヌクレオチドおよびアミノ酸の位置を定義するための、チオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）ら（上記引用文中）が使用している番号づけを、本明細書中で使用する。

ワクチン製造のためにニス・セレビンアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のＨＢｓＡｇを発現させることを可能とするための、発現ベクター上の酵母プロモーターの制御下でのＨＢＶＳ遺伝子コーディング配列の挿入は、例えば、ハーフオードる。また、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現も、ブレツブ（Ｇｒｅｇｇ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５　（１９８７）　、４７９頁に記載されており（また、欧州特許出願公開束０２２６　８４６を参照せよ）、ハンセヌラ・ポリモルファ　（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）における発現も同様である（ＥＰ−Ａ−０２９９１０８を参照せよ）。

上記方法のすべてが、本発明における使用に適したＨＢｓＡｇを与えるわけてはない。なぜなら、バレンズアラ（Ｖａｌｅｎｚｕａｌａ）および他者の方法により哺乳動物細胞または酵母において生産された組換えＨＢｓＡｇは、使用可能な遊離ＳＨ基を有さないからである。ＨＢｓＡｇのシスティン残基が、すべて、ジスルフィド結合の形成に関与していると考えられている［ワンブラー（Ｗａｍｐｌｅｒ）ら、酬ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ａｉｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、１９８５．　８２６８３０　６８３４およびその中の参照文献］。

ＥＰ−Ａ−０１３５４３５［メルク・アンド−：］　（Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏ、　）　］には、非ジスルフィド結合ＨＢｓＡｇ抗原を完全分子間ジスルフィド結合粒子に効率的に変換する方法が記載されている。これは、このように処理されていない抗原の１０倍免疫原性であると主張されている。

しかし、ワクチンエンゲリックス（Ｅｎｇｅｒｉｘ）　−Ｂ　［ｘンゲリックス（Ｅｎｇｅｒｉｘ）−Ｂは商標である］［ハーフオード（Ｂａｒｆｏｒｄ）ら、上記引用文中コの製造のためにスミスクライン・ビーチャーム・ハイオロジカルズ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　ＢｅｅｃｈａｍＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）によりニス・セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）で生産される組換えＨＢｓＡｇは、Ｓ単量体当たり平均４個の遊離システィンを有し、粒子を形成し、これは、少なくとも完全分子間ジスルフィド結合粒子と同じ（らい免疫原性であることが判明している。ＨＢｓＡｇがこの形態である場合、遊離システィンが、第二ポリペプチドとの結合に利用され得る１以上の天然硫黄原子を与えることは明らかである。また、好ましくは、ＨＢｓＡｇは粒子、典型的にはリポ蛋白粒子を形成すると理解される。

本発明によるハイブリッド中の第一のポリペプチド成分は、本明細書中でプレ（ｐｒｅ）　−Ｓコーディング配列と称するＨＢＶゲノム上のＨＢＶ−３遺伝子に直接に先行するコーディング配列によりコードされるＨＢｓＡｇ前駆体蛋白の全部または一部よりなるものであってもよい。

プレーＳコーディング配列は、通常、１６３個のアミノ酸をコードしくａｙ　ＨＢＶサブタイプ）、プレ−８１コーデイング配列およびプレ−８２コーデイング配列よりなる。後者は、５５個のアミノ酸をコードし、Ｓ−蛋白コーディング配列に直接に先行する（詳細はＥＰ−Ａ−０２７８９４０参照）。　一つの好ましい態様においては、第一のポリペプチド成分Ｐ１は、１個以上、好ましくは４個までのスルフヒドリル基を表面上に有するＨＢｓＡｇ　Ｓ−蛋白である。

上記から、第一のポリペプチド成分は、好ましくは、例えば、ハーフオード（Ｈａｒｆｏｒｄ）ら（上記引用文中）により記載されている、ニス・セレビンアエ（Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｊａｅ）における発現による組換えＤＮＡ技術により調製される、すなわち、市販のワクチンエンゲリソクス（Ｅｎｇｅｒｉｘ）　−Ｂ　［エンゲリックス（Ｅｎｇｅｒｉｘ）−Ｂは商標である］中に存在するＨＢＳＡｇ抗原に相当する、またはそれよりなると理解される。

別の態様において、第一のポリペプチド成分は、ＨＢｓＡｇ　Ｓ−蛋白の断片または切頭体からなっていてもよい、ただし該断片は少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を基Ｘに結合させるのに利用できるその表面上に有し、粒子アセンブリーは有害な作用を及ぼさない。

さらに別の態様において、第一のポリペプチド成分はＢ型肝炎表面抗原の１つの生物学的活性を有する蛋白の一部またはすべてに対応する少なくとも２つのポリペプチドからなる混成粒子の一部であってもよく、ここで継続中の欧州特許出願第０４１４３７４号に記載されているように、該粒子はＳ−蛋白、プレー８２− 蛋白またはプレーＳ］−蛋白によって付勢される少なくとも２つの抗原決定因子を提供し、所望により宿主特異的脂質を含有していてもよい。

このような混成粒子の例は（Ｌ、、Ｓ）により表すことができ、ここで■、はＨＢｓＡｇのラーン蛋白（前記のようなプレー８１、プレー８２およびＳコーディング配列を包含する）てあり、ＳはＨＢｓＡｇ　Ｓ−蛋白である。

さらなる態様において、第一のポリペプチド成分は、継続中の欧州特許出願第０４１４３７４号に記載されているようにＨＢｓＡｇの修飾り蛋白てあってもよく、ここで該修飾し蛋白は以下の配列の少なくとも１つにおける修飾により特徴付けられるし蛋白をコートするアミノ酸配列からなる修飾Ｂ型肝炎ウィルスのラーン表面蛋白を包含する　プロテアーゼ消化に感受的な配列、ミリスチル化に必須の配列、Ｎ−結合グリコシル化に必須の配列、〇−結合グリコシル化に必須の配列、およびヒト血清アルブミンの結合に必須の配列。

好ましい態様において、修飾し蛋白はＬ利こよって表すことができ、ここでＬ本はＬ蛋白の残基１２−５２と、残基１３３−１４５と、つづいて残基１７５−４００とからなるアミノ酸配列を有する。

別の好ましい態様において、本発明の化合物の第一のポリペプチドは、混成粒子（Ｌ＊、Ｓ）の一部であってもよく、ここでＬ本およびＳは前記の定義と同じである。このような混成粒子は、継続中の欧州特許出願第０４１４３７４号に記載されているように製造することができる。

第二のポリペプチドＰ２は多価ワクチンの製造に有用な抗原であり、いずれの適当な構造であってもよい。

Ｐ２についての特異的抗原は単純ヘルペスウィルス（Ｈ８Ｖ）の組換えＤＮＡエンベロープ蛋白ｇＤ、特にＨ８Ｖ２からのｇＤ２ｔとして知られているｇＤの不完全な形態を包含する。言及しうる他の抗原はマラリア抗原、特にサーカムスポロゾイト蛋白に由来する抗原、またはＨＩＶエンベロープ蛋白に由来の抗原である。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因となる病原体であるとして同定された。レトロウィルス科の他のウィルスと同様、ウィルスの主構造蛋白をコードする遺伝子・は、ｅｎｖ　（ウィルス性エンベロープ糖蛋白）およびｇａｇ（コア蛋白）遺伝子でゲノムの範囲内に限定される。

エンベロープ糖蛋白！ｔ　ｇ　ｐ　１．２０として知られている。ＡＩＤＳウィルスに感染すると、ヒトはこの糖蛋白に対する抗体を発展させる。多数の患者において、中和抗体が産生されているが、異なるＨＩＶ単離体が、特にエンベロープ遺伝子にて多様な配列の配列変異を示すことも知られている。

Ｖ３ループとして公知の領域内にあるエンベロープ蛋白ｇ　＋）　］、　２０に位置する主中和ドメインからの蛋白が、ｉｎ　ｖｉｖｏにて産生される中和抗体に結合することがわかっている。中和抗体を産生ずるこれらのペプチドのオーダーにもかかわらず、該ペプチドの正確な表示がめられている。本発明は、ここに記載の方法にてＨＢｓＡｇの表面にかかるペプチドを付与することによりこのことを達成している。

ある種の環境で、第二のポリペプチドは、自然にまたは合成的にそのアミノ末端に結合しうる疎水性アンカー基（疎水性゛フッド）を有していてもよい。

適当な疎水性アンカー基は、ミリストイル、バルミトイルおよびラウリルのような脂肪酸残基を包含する。

該第二のポリペプチド成分にお（ブるそのような疎水性アンカー基を有することの利点は、疎水的相互作用を介して、それが第一のポリペプチド成分に付随する脂質膜にしっかりと付着するようになることである。

さらに第二のポリペプチド成分が利用しやすいンステイン残基を有する場合、その場合、ノステインのチオール基は、自発的酸化により第一のポリペプチド成分中の天然チオール基と分子間のジスルフィド結合を形成し、それにより形成された複合体の安定性に寄与することとなる。このような場合において、本発明にしたがってハイブリッドを形成させるのに架橋剤を用いる必要はない（すなわち、前記した基Ｘは、前記のＰ２についての天然硫黄原子を意味するものであってもよい）。

前記のリンカ−基Ａは、−の末端で第一のポリペプチドの天然硫黄原子に結合し、他の末端でＰ２中のアミノ酸含有側鎖を介して第二のポリペプチドＰ２に結合する母ニアースペーサー基を意味する。

基Ａの例は、置換Ｃ２ＣＩＯアルカンまたはりニア−ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールである。

およびＳ　ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−を包含する。

本発明はさらに、ａ）Ｘが基−ＡＮＨ−である場合ｌ）第二のポリペプチドＰ２を式（ｎ）’１’−Ａ−Ｂ　（ＩＩ）［式中、Ｙは第一のポリペプチドの天然チオール基との反応能を有する基で、Ｂは第二のポリペプチドＰ２の１またはそれ以上のアミノ酸側鎖に対して特異的な基であり、Ａは前記と同意義であるコで示される化合物と反応させ；その後、１１）その生成物を第一のポリペプチドＰ’−３Ｈと反応させるか、またはｂ）ＸがＳであって、Ｐ２が疎水性アンカー基およびシスティン残基を有する場合・ｉ）第一のポリペプチドと第二のポリペプチドを水溶液中で混合し、ｉｉ）　Ｐ ’とＰ２の間で、自発酸化により分子間ジスルフィド結合を形成させる工程よりなる、式（Ｉ）Ｐ’−３−Ｘ−Ｐ２　（１）［式中、ｐｉ、ｐ２およびＸは前記と同じコて示されるハイブリットポリペプチドの製法を提供する。

式（ＩＩ）の異形二官能基試薬は当該分野において公知であり、スクシンイミノル３−（２−ビリシルチオ）プロピオナート［５ＰＤＰ　；　（ＩＩＩ）　］　、スクシンイミンル６−マレイミノルへキサノアート［ＥＭＣ３（ｒＶ）　］　、および］Ｎ−スクシンイミノル４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ　（Ｖ）］を包含する。

その分野において公知の標準的条件で実施してもよく、最終生成物（ま、例え（ぼ、分取用高圧液体クロマトグラフィーにより精製してもよＬ）。

本発明の対象である特定のハイブリ・ノドは：試薬（Ｖ）を用い、単純ヘルペスウィルス２のｇＤ２ｔｌこ架橋しｔこＨＢＳＡ４Ｓ蛋白。

分子間ンスルフイド結合を介して前記のＬＣＦ６１こ結合したＨＢｓＡｇ　Ｓ蛋白、およびＨＩＶ　ｇｐ１２０から＼′３ペプチドに結合したＨＢｓＡｇ　Ｓ− 蛋白を包含する。

典型的には、第一のポリペプチドに対する第二のポリペプチドの８１１合（ま、単量体あたり０１〜１０分子の範囲にある。しかし、〜１３ペプチドの場合、単量体あたり１０〜４分子の範囲にある。

本発明のさらなる具体例において、ポリペプチドｐ＋を■３ペプチドの混合物と混合してもよい。その場合、得られた融合体は、Ｐｌの表面↓こ付着した種々のＸｒ３ペプチドを有する。

この場合、その反応の有効性は、約４０個のペプチドが各粒子（こ結合するものであり、本発明に係る〕１イブリツドは好ましくは粒子形であること力（理解される。

さらなる態様において、本発明は、免疫学的保護量の本発明の）＼イブＩＪ・ノドポリペプチドを、慣用の担体またはアジュバントと一緒にしてなるワクチン組成物を提供する。

本発明によれば、好ましいアジュバントは、適当な担体中のデー３−０−アシル化モノリン酸化脂質Ａ　（３Ｄ−ＭＰＬ）である。このアジュバント系は高中和抗体価を付与する。

３Ｄ−ＭＰＬは英国特許第２．２１１５０２号（ＲＩＢＩ）に記載の方法によって得られる。

ＨＩＶペプチドを利用する場合において、本発明者らは、まず本発明のＨＢｓＡｇ−Ｖ、ペプチド複合体をアラムに吸着させ、ついて３Ｄ−ＭＰＬと混合することにより例外的な結果が得られることを見いだした。

加えて、３Ｄ−ＭＰＬ含有の水中油型エマルジョンもまた優れた結果を付与する。本発明によって得られる最も好ましい水中油型エマルジョン処方は、３Ｄ−ＭＰＬ、スクアラン、プルロニンクＬ−１２１およびリン酸塩緩衝生理食塩水からなる。

該エマルジョンはミクロ流動装置を通してミクロン以下の粒子からなるエマルジョンを得ることが好ましい。これは該処方の活性を強化する。

別法として、本発明のハイブリッドポリペプチドを含有するワクチンを、慣用手段により製造し、免疫学的保護量の該ハイブリッドを好ましくは緩衝された生理的食塩水中に含め、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムを包含する種々の公知アジュバントのいずれかと混合しまたは吸着させる。「免疫学的保護」とは、十分な量のハイブリッドを投与して、重大な副作用をもたらすことなく、感染因子に対する保護を付与する免疫応答介在の十分な保護抗体または細胞が誘発されることを意味する。投与すべきハイブリッドの量はそのワクチンが補助的なものであるかどうかに依存し、一般に、１〜１００１００Ｏの総蛋白、例えば１〜２０Ｑｍｃｇの総蛋白、より好ましくは５〜４Ｑｍｃｇの総蛋白からなる。

投与すべき量および回数は、対象の抗体価および他の応答の観察を包含する標準用量範囲の実験にて決定てきる。

本発明のハイブリッドポリペプチドはまた、ワクチン処方用のブレＳ１またはブレＳ２ポリペプチドの全部または一部あるいは部分を含有する混成ＨＢｓＡｇ粒子のような他の抗原と混合してもよい。また、他の微生物からの蛋白由来のエピトープを有する融合または他の化学合成ハイブリノドＨＢｓＡｇ粒子と、他の免疫原と一緒に混合し、多価ワクチンを形成させてもよい。ワクチン調製は、一般に、１９７８年、アメリカ合衆国、メリーランド州、ポルティモア、ユニバーンティー・パーク・プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ）　、ホラ−（Ｖｏｌｌｅｒ）らにより編集された「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅｓ）　Ｊに記載されている。

したがって、さらなる態様にて、本発明は、有効量の本発明に係るワクチン組成物を免疫処置を必要とする対象に投与することからなる、ウィルス感染に対して対象を免疫処置する方法を提供する。

以下の実施例は本発明を説明するものである。

蛋白中のンステイン含有ヘプチドの同定法を、容易に検出できるプローブを導入するために、２−ブロモアセトアミド−４−二トロフェノール（ＢＮＰ）を用いて適用した。蛋白のスルフヒドリル基およびＢＮＰのアセトアミド残基の間の共有結合の形成は、４１０ｎｍに吸収極大を有する発色基を導入する。ついで、修飾蛋白を、適当なプロテアーゼて切断し、得られたペプチドをクロマトグラフィー的方法で分離した。４０５ｎｍの単一波長をモニターすることは、ンステイン残基を有するそれらのペプチドのみを迅速かつ簡単に検出かつ単離する方法を提ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇはスミスクライン・バイオロジカルズ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社から得た。Ｎ）１４ＨＣＯ３，２−ブロモアセトアミド−４−二トロフェノール（ＢＮＰ）およびキモトリプシンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から得た。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトニトリルは、ペイカー（Ｂａｋｅｒ）社から得た（ＨＰＬＣグレード）。Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はジャンセン・フ７一マソーチカ（Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ）社から得た。

蛋白の標識標識用緩衝液（０，ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ＥＤＴＡ　２ｍＭ、尿素　８Ｍ。

ｐＨ８，６）に対し、蛋白（±１ｍｇ）を透析した。蛋白ｍｇあたり２．５ｍｇのＢＮＰ　（ＤＭＦ中に溶解）を変性蛋白に添加した。室温で９０分のインキユベーシヨンの後、未反応のＢＮＰを、ｐＨ８，５，１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３に対して、さらに透析することにより除去した。

修飾蛋白の消化２度のキモトリプシン添加（ｔｏおよびｔ０＋４時間）（２％Ｗ／Ｗ）を行った。

ついで、３７℃て一晩インキュベーションした。消化された蛋白を４℃で保存した。

ペプチドのＨＰＬＣによる分離を、２５０ｍｍＸ４．６ｍｍバイダック（ＶｙｄａＣ）Ｃ４逆相カラムを装備したウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）　６００　ＨＰ　Ｌ　Ｃシステムにより行った。カラムをＨＰＬＣ緩衝液（ＮＨ４ＨＣＯ３１００ｍＭ、ｐＨ８，５）にて、試料（±１ｍｇ）注入前に、平衡化した。０〜５０％のアセトニトリルの直線的クランエンド溶出法により、ペプチドを溶出した。

溶出を、ウォーターズ４９０マル千ウェーブ検出器て４０５ｎｍおよび２２４ｎｍにおいてモニター観察した。

ＢＮＰペプチドの配列分析乾燥試料を６０μｍのＴＦＡ　６％に再溶解し、配列決定装置のガラス繊維膜に塗布した。好ましくは膜をバイオブレン（Ｂｉｏｂｒｅｎｅ）て処理する。ニドマン自動配列決定分解を、アミノ酸分析装置（アプライド・）＼イオシステム（＾ｐｐｌｉ＝ｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）　１２　ＯＡ）と連結した液相配列決定装置（アプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）　４７７　Ａ）により行った。

用いたプログラムは、ヘライック（Ｈｅｖｉｃｋ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、１９８１年、２５６．７９９０−７９９７のプログラムに類似のものである。開裂アミノ酸のフェニルチオヒアントイン誘導体を、フンカピラーおよびフード（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｏｄ）　、メソッズ・イ’７−　工：／ザイモロシー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　、１９８３、旦１．４８６−４９３記載のグラ／エントンステムに従ったＲＰＬＣにて同定した。

ピリジンによる蛋白チオールの反応（チオールンスルフイド交換反応）により、２−チオピリジンが遊離し、３４３ｎｍ　（ε３４３−＝８．０８Ｘ１０３Ｍ）においＨＢ　ｓ　Ａ　ｇはスミスクライン・バイオロジカルズ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）社から得た。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２．２′−ジチオジピリジン（ＰＤＳ）は、セルバ（Ｓｅｒｖａ）社から得た。ＰＤＩＯゲル濾過カラムはファルマ／ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社から得た。

測定手順蛋白（＝７５０μｇ／ｍｌ）を、緩衝液（尿素　８Ｍ、ＥＤＴＡ　２ｍＭ、ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，５）に対して透析した。ＰＤＳ（ｆｆ−タノール中に過剰量溶解、２５Ｍ）を変性蛋白に添加した。室温で１時間インキュベーションした後、過剰のＰＤＳをゲル濾過（ＰＤＩＯカラム）にて除去した。修飾蛋白の吸光度を２８０ｎｍにて測定した。ＤＴＴ　（最終濃度１０ｍＭ）を添加し、３４３ｎｍにて遊離子オンの吸光度を測定した。

ヨードアセトアミドはメルク（Ｍｅｒｃｋ）社から得た。ＨＢｓＡｇはスミスクライン・バイオロジカルズ社からのものを用いた。

カルボキノメチル化蛋白（１ｍｇ／ｍｌ）を、尿素８Ｍを含むあるいは含まない緩衝液（ＴｒｉｓｌｏｏｍＭ、ＥＤＴ、Ａ　２ｍＭ、ｐＨ８，０）に対して透析した。チオール基のＳ−カルボキノメチル化を、遮光下、室温で２０分間、ヨードアセトアミド（スルフヒドリル基１モルあたり１００モル）を添加することにより行った。

アミノ酸分析加水分解：蛋白（±１００μｇ）の部分試料を、スピード・バック・コンセントレータ−にて円錐形加水分解チューブ中で乾燥した。加水分解を、０．５％フェノールを含む６Ｎ　ＨＣＩ　（５００μｍ）を添加することにより、１１０℃で２４時間行った。試料を３系統用意した。

冷却後、加水分解物を蒸発乾固させ、５００μｍの水で洗浄し、再び乾燥させた。２００μＩの０．２Ｎ　ｐＨ２，２のクエン酸緩衝液中に溶解し、４５μｍの膜で濾過し、各５０μｍの試料を分析器カラムに注入した。

アミノ酸分析・ポリスチレンスルホン化カラムを用いて自動アミノ酸分析装置（アルファ・プラス・エルケイビー（＾１ｐｈａ　Ｐｌｕｓ−ＬＫＢ）　４１５１　）にて行った。３種の緩衝液溶出システムを用い、異なるアミノ酸を分離した。

１　クエン酸緩衝液　０．２Ｎ　ｐＨ３，２５４℃２　クエン酸緩衝液　０．２Ｎ　ｐＨ４，２５５６°Ｃ３ホウ酸緩衝液　０．２Ｎ　ｐＨ１０，０９０℃アミノ酸検出を、ニンヒドリンによるポスト・カラム反応ならびに４４０ｎｍおよび５７０ｎｍにおける比色法にて行った。定量には、４４０および５７０ｎｍの光学密度を一緒に加え、クロマトグラフィーのデータ積分をノマグ（Ｓｉｍａｄｚｕ）　ＣＲ−Ａ　３種分計にて行った。

ＢＮＰによる遊離チオール基の修飾およびキモトリプ／ン分解の後、ＢＮＰＰｉ識を有するペプチドをＲＰＬＣにて分離し、カードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、１９８７．６７７．１４〇−１４４の操作に従った配列決定により同定した。

５種の異なるＨＢｓＡｇのキモトリプシン分解物のＨＰＬＣ分析は、すべてのバッチにおいて再生産可能な酸化状態を示す５個の充分に分離した主たるピークを示した。ＢＮＰ標識ペプチドの配列は、４つのチオール基（ｃｙｓ４８．６５．１２１および１２４）を示した。

同定分析を、哺乳動物細胞中て生産されたＨＢｓＡｇにより行った。ＢＮＰ非標識ピークが検出され、利用可能な遊離システィン残基がないことを示した。

ｂ）　ＰＤＳ法スミスクライン・バイオロジカルズ社からのＨＢｓＡｇ粒子の３つの異なるバッチ（以下の表１に示すバッチ１〜３）に対してＰＤＳ法を適用した後、ＨＢｓＡｇ単量体あたり４つのチオール基を検出した。チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現したＨＢｓＡｇのハツチにおいては、単量体あたり遊離のＳＨ基は１つも検出されなかった（ハツチ４）。

ＰＤＳ法　遊離チオール基の測定 □　ハツチ番号　１　単量体あたりの１　■　遊離ＳＨ基 □ １４（ＣＨ○細胞）１０　ＩＨＢｓＡｇ粒子中の７ステインを、変性剤（尿素　８Ｍ）添加あるいは無添加系にてカルボキシメチル化した。

その後のアミノ酸分析は、双方とも、ＨＢｓＡｇ単量体あたり３個のカルポキンメチルノステインの存在を示した。

ＣＨＯ細胞中で発現されたＨ５Ｖ２の糖蛋白Ｄ　（ｇＤｚｔ）（ラスキーおよびドウベンコ（ＬａｓｋｙおよびＤｏｗｂｅｎｋｏ）、ディーエヌエ−（ＤＮＡ）　、１９８４、旦（１）、２３−２９）は、遊離ＳＨ基含有の組換えＨＢｓＡｇ粒子に共有結合している。

５、５”−’チオビス２−ニトロ安息香酸（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬またはＤＴＮＢ）およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノ安息香酸エステル（ＳＩＡＢ）は、ピアース（ＰＩＥｌ？ＣＥ）社から購入した。

２、４．６−ドリニトロペンセンスルホン酸（ＴＮＢＳ）は、セルバ（ＳＥＲＶ＾）社から入手した。

組換えｇＤ２ｔをＣＨＯ細胞中て発現させ、スミスクライン・バイオロジカルズ社により精製した。

ピアース社の酵素ビーズ法にてｇＤ２ｔをヨウ素化した。

スミスクライン・バイオロジカルズ社によりＨＢｓＡｇ粒子を生産した。

ｂ、１１　スルフヒドリル基の定量分析］、５０μｌのｇＤ２ｔ　（ｐＨ７の０．０２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ，中に２３μＭＮ＝、１ｍｌのＤＴＮＢ　（ｐＨ８の０．０４　Ｍ　Ｎａ２ＨＰ　０４中に３．２８ｍＭ）を加える。

５分後、蛋白不含ブランクに対する４１２ｎｍにおける光学密度を測定する。

モル吸光係数１．３Ｘ１０’Ｍ−’ａｍ司を用いて反応性のスルフヒドリル基の濃度を計算する（エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）　、アーチ・六イオケム・バイオフィズ（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　）　、１９５９．８２，７０）。

ｂ、１２　リジン残基の定量分析２４．５ｍＭのＴＮＢ　Ｓ／　Ｒ２０５０ｕ　］をｇＤ、ｔ　（ｐＨ７の００２ＭＮａ２８Ｐ０４中に５８μＭ）５０μｌを添加し、２００μｌのホウ酸緩衝液（００５ＭＮａＯＨでｐＨを９５に調節した０、０５Ｍ　Ｎａ２Ｂ４０ｙ）で希釈する。

３時間後、暗所室温にて、蛋白不含ブランクに対する３６７ｎｍにおける吸光度変化を追跡する。

トリニトロフェニル化の程度を、ε３６□、、＝１．、ｌＸ１０’Ｍ−’ｃｍ− ’を基準として計算する（ブラッグ（Ｐｌａｐｐ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ１００μｌのｇＤｚｔ　（ｐＨ７の０．０２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ＜中に２３μＭ）＋１００μｍのｇ　ｌ）　２ｔｌ　ｌ　２５を、スクシンイミド／リジン比２に対応するモル比の２μｌのＳ　ＩＡＢ　（ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）と共に３７℃で３０分間インキュベーションする。透析（ｐＨ８の０．０２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４に対して２時間）により過剰の架橋剤を除去し、’ｌ’Ｍ１０セントリコンを用いた限外濾過により、反応混合物を１００１１１にまで濃縮する。

ｂ　３　比圧ｌＡｇ粒子の喧登濃縮（１ｍｇ／ｍｌ）および５ＩＡＢ−活性化したｇＤｚｔ　（１００μｌ）を、５３ｕｌのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子（ｐＨ７，２１，ＯｍＭのＩ’Ｊａ、ＨＰＯ，および１５０ｍＭＮａＣ］中、１ｍｇ／ｍｌ）と共に、３７°Ｃて種々の時間インキュベーションする。

ｇ　Ｄ　２／　Ｓ単量体の最初のモル比は１／１である。粒子のｇＤ、ｔを、１．５ＭＣｓＣ１勾配（７０，１Ｔｉｏ−ターて４５時間、６５０００ｒｐｍ）により精製する。

ｂ、４．　粒子あたり結合したｇＤｚｔの定量分析５０μｍの水を酵素ビーズのバイアルに加える。１時間後、５０μｍのｐＨ７゜２０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，２５μｍのｇＤｔｔ　（ｌｒｎｇ／ｍｌ）　、０．５ｍＣ１のＮａ１１２５（アマージャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）および２５μｌのβ−Ｄ−グルコースを添加する。

２０分後室温において、反応を完了させ、１％ＢＳＡで飽和したダウエックス（ＤＯＷＥＸ）Ａｇ　１ｘ８樹脂を用いたクロマトグラフィーにより、ヨウ素化蛋白を遊離ヨウ素から分離する。

結合に含まれるｇＤｚｔの比活性を、標識および非標識ｇＤ、を混合物中の放射活性を測定することにより決定してもよい。粒子に結合したｇＤｚｔの量を、この比活性により決定してもよい。

ＤＴＮＢによっては、ｇＤｚｔにて遊離のチオール基は検出されない。この結果は、蛋白のアミノ酸配列に合致する。使用した一部を切断したｇＤ２を分子（２８３アミノ酸）は、６個のシスティン残基を有しており、それぞれのシスティン残基は不連続なエピトープを構成するスルフヒドリル架橋結合に含まれる。それゆえ、ｇＤｚｔはホモポリマー化する危険性のない異形二官能基架橋剤による活性化段階のための理想的な分子である。

ａ２．　リジン残基の定量分析遊離アミノ基の数を、無処理あるいは５ＴＡＢ活性化ｇＤ２ｔのいずれかのＴＮＢＳにより測定する。過剰の５ＩＡＢの作用にともなって遊離リジンの数が減少する。

５ＩＡＢ／リジンのモル比が２の場合、４つの残基が活性化される。

無処理の蛋白において検出されたり／ンの数（１０）は、アミノ酸配列に巧いて見い出されるリジンの数（１１）に近い。

ｂ、　５ＩＡＢによるｇＤｚｔの活性化５ＩＡＢ／リジンのモル比を２として３７°Ｃで３０分間活性化した後、ｇＤｚｔのホモポリマーの不存在をゲル濾過でチェックする。

ＴＳＫ３０００カラムにて、ホモポリマーは排除体積（８分）に溶出し、ｇ　Ｄ　２　ｔ　単量体は、１５分の保持時間を有する。

蛋白中ソスティン残基の不存在にもかかわらず、ｇＤ、ｔを２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性化した場合、ホモポリマーの形成が観察される。５ＩＡＢ中のハロゲンの、リジン、メチオニンまたはヒスチジン残基に対する非特異的反応性によりこの現象が説明される（ミーンズおよびフィーニー（ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ）　、ケミカル・モディフィケーンヨンズ・オブ・プロテインズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　；ホールデン・ディ（Ｈｏｌｄｅｎ　Ｄａｙ）出版、１９７１．１０７ベーノ参昭）。

最初の蛋白濃度が、ホモポリマー化事象における決定的な要素である。ｇＤｚｔを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で活性化した場合、ホモポリマーの形成は５０から１０％に減少する。

ｃ、　ＨＢｓＡｇ粒子への結合３０分、２時間または一晩３７℃でインキュベーションした後に得られるＨＢｓ、Ａｇ−ｇＤ２を複合体を、ＣｓＣ１勾配により精製する。ｇＤ、ｔホモポリマーは、担体に対して異なった密度を有しており、複合体には混入しない。表２に示すように、結合量が時間とともに増加する。粒子の密度面積において検出した放射活性により計算すると、Ｓ単量体あたり０２＠のｇＤ２を分子（粒子あたり２０個）が結合する。

圭ｌ：結合量へのインキュベーションの影響１０μｌのＬＣＦ６溶液（ｐＨ７の１０ｍＭリン酸および１５０ｍＭ　ＮａＣ１中１ｍｇ／ｍ＋）を、ＨＢｓＡｇ粒子を発現しているｐＨ７の１０ｍＭリン酸および１５０ｍＭ　ＮａＣ１中の酵母溶液（スミスクライン・バイオロジカルズ）（１ｍｇ／ｍ１）１０μｍとともに、３７℃で一晩インキュベーションする。

Ｂ　２．２　分析ＨＢｓＡｇに対する抗体のポリクローナルＩｇＧを５μｍ／ｍ１の濃度でコートし、ＬＣＦ６の繰り返し配列に向けられた抗体のビオチン化モノクローナルＩｇＭを検出するサンドウィッチＥＬＩＳＡ試験により、ＨＢｓＡｇ−ＬＣＦ６ハイブリノドの定量を行う。

既知濃度のＲ１６ＨＢｓＡｇ抗原溶液（組換え型繰り返しマラリア−ＨＢｓＡｇ粒子（ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｒｅｐｅａｔ　Ｍａｌａｒｉａ−ＨＢｓＡｇ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）　）を標準として用いる。このＥＬＩ　ＳＡは、遊離ペプチドをあらかじめ分離することなくハイブリットをモニターできる利点がある。結果をＲ１６ＨＢｓＡｇに等価なμｇ／ｍ！ジスルフィド架橋結合および疎水性基部の相対的な重要性を評価するために、システィンを有しないペプチドおよびラウロイル基を有しないペプチドの取り込みを比較した。ＥＬＩＳＡは、ンスティンを有しないリポペプチド（ＬＦ６）が、ＨＢｓＡｇ粒子中へ取り込まれないことを示す。ラウロイル基を有しないペプチド（ＣＦ６）は、殆ど効果がない。それゆえ、−水的および共有的相互作用の間の相乗作用は、ＨＢｓＡｇ粒子へのペプチドの取り込みに関して重要である。

種々の酸化状態の、異なるＨＢｓＡｇ粒子へのＬＣＦ６の取り込みから得られる結果を比較した。

リポペプチドを、古典的なＨＢｓＡｇ粒子（Ｓ単量体あたり±４個の遊離ＳＨ基）、より酸化された粒子（Ｓ単量体あたり１個の遊離ＳＨ基）、あるいはすべて酸化された粒子（遊離ＳＨ基なし、ＣＨＯ細胞で合成された粒子）と共に、インキュベーションする。

これらの結果は、ＬＣＦ６およびＳ単量体間のジスルフィド架橋結合が、ペプチドの取り込みを安定化することを示した。抗−ＨＢｓＡｇ−ＬＣＦ６に関するＥＬＩ　ＳＡは、ＨＢｓＡｇ粒子の酸化状態の増加の作用としての結合の減少を示す。

ＬＣＦ６およびＨＢｓＡｇ間の共有結合の存在もまた、５ＤＳ−ＰＡＧＥでの分析にて示された。バンドが、非還元状態での２６および５０Ｋｄに現れる。これらのバンドはＳ単量体および２量体に結合したＬＣＦ６ＣＦ６ペプチドする。

対照的に、還元状態では、これらのバンドは現れなかった。

用いたペプチドは、外部蛋白ｇｐ１２０の第３の可変領域中のジスルフィド架橋結合ループに含まれるアミノ酸３１０〜３２８の配列（ジー・ラロサ（Ｇ、Ｌａｒｏｓａ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１９９０．　２４９−９３２）に相当する。

その保存は中央部の１４の位置のうち９にて８０％以上であり、その予想される構造モチーフはβ型ストラッド−■型βターンーβストランドーαヘリックスである。

ペプチドの主構造は、次のように表すことができるＴＹＩ！−ＴＨＲＡＲＧ　ＬＹＳ　ＳＥＲＩＬＥ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＰＲＯＧＬＹ　ＡＲＧＡＬＡ　ＰＩＩＥ　ＶＡＬ　ＴＨＲＩＬＥ　ＧＬＹ３．２．　合成ペプチドをメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相法に従って合成し、逆相ｈｐｌｃにより精製した後に９７％純度のペプチドを得る。該ペプチドは５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＴＳＫ２０００カラムでのゲル濾過により同質である。その分子量は２８００である。

３．３．　結合手順ＥＭＣＳ、（スクシンイミジル６−マレイミシルヘキサノアート、第一級アミノ反応基のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびチオール基（マレイミド）含有の異形官能基架橋剤を選択した。

３、　３．　１．　活性化Ｖ３ペプチドは、３７℃、ｐＨ７にて３０分間、１：１〜４：１の割合にてＥＭＣＳで活性化した１個のリジン基を有する。

３、　３．　２．　ＨＢｓへの結合ＧＩＯカラム上で過剰の架橋剤を排除した後、ＨＢｓＡｇ粒子をｖ３ペプチドと一緒に１・１の割合にて加えた。反応を３７℃、ｐＨ６，５〜７．５にて一夜案施した。

得られた複合体をＨＲ２００カラム上のゲル濾過により非複合ペプチドよｌり精うンオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡ法により分析した場合、結合効率はＨＢｓ単量体あたり０４ペプチド結合であり、それはＨＢ　ｓ粒子あたり４０個のＶ、ペプチドまたはＨＢＳＡｇ２５ｍｇあたりＶ　ｓ　１　ｍ　ｇに相当する。

１　水中油型エマルジョン中のＶ、ＨＢｓＡｇ粒子ビヒクルを以下のように調製する。Ｔｖｅｅｎ８００．４％（Ｖ／Ｖ）含有のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、５　（ｖ／ｖ）プルロニック（ＰｌｕｒｏｎｉＣ）　Ｌ１２１および１０％スクアランを加える。ついで、この混合物をミクロ流動化する。ミクロ流動化の場合、エマルジョンをミクロ流動化装置（Ｍｏｄｅｌ　ＭＩＩＯＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓＣａｒｐ、　、　Ｎｅｗｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、　）を通して１０回循環させる。該ミクロ流動化装置を５回通すと、得られるエマルジョンはミクロ以下の粒子のみからなる。ついで、３Ｄ−ＭＰＬ　５０μｇをこのエマルジョンに加える。３Ｄ−ＭＰＬ含有のこのエマルジョン１容量を等容量の２倍濃度のＶ３ＨＢｓＡｇと一緒に混合し、簡単に撹拌してその成分を完全に混合させる。

この最終調製物は、２５０μｍの注射用量中に、０２％Ｔｗｅｅｎ８０．２．５％プルロニックＬ１２１．５％スクアラン、３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇおよび１μｇ等量のＶ３ペプチド（ＨＢｓＡｇ２５μｇに相当）を含１μｇ等量のＶ３を、４ ℃にて一夜、１５０ｍＭ　ＮａＣ１０，２５ｍ１，１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）中の０．５ｍｇ等量のＡＩ”に対応するアラム上に吸着すせる。−夜インキユヘーンヨンした後、このアジュバント調製物を遠心分離に付し、その上澄を除去する。ついで、３Ｄ−ＭＰＬ５０μｇ含有の１容量の吸着緩衝液を該アラム結合ＨＢｓＡｇ−Ｖ３ペプチドに加える。

、、、＋−ＰＣＴ／ＥＰ９１１０２４２２国際調査報告フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＫＲ，ＵＳ（７２）発明者　プリエール、ジャンーポールベルギー国べ一−１２００ブルッセル、アブニュ・ドウ・フエブリエール７番

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すＨＢｓＡｇまたはその断片であって、第一のポリペプチド成分（Ｐ１）の天然の硫黄原子を介して第二のポリペプチド成分（Ｐ２）に共有結合した、第一のポリペプチド成分からなることを特徴とする免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
２．式：ｐ１−Ｓ−Ｘ−Ｐ２［式中、Ｐ１−Ｓ−は、無処理の硫黄原子を介して結合したＨＢＶ表面抗原の抗原性を示すＨＢｓＡｇまたはその断片であり；Ｐ２は第二の抗原性ポリペプチドであり；およびＸは、ａ）基−Ａ−ＮＨ（式中、Ａはスペーサ−基であり、ＮＨ−はＰ２中のアミノ酸の側鎖に存在するアミノ基の残基である）であるか；または所望により、ｐ２がシステイン残基および疎水性アンカー基よりなる場合、ｂ）Ｐ２中にシステイン残基の硫黄原子のいずれかを意味する］で示されるハイブリッドポリペプチド。
３．Ｐ２が単純ヘルペスウイルスのｇＤまたはその誘導体、ＨＩＶからのｇｐ１２０またはその誘導体、サーカムスポロゾイト抗原またはその誘導体から選択される請求項１または２記載のハイブリッドポリペプチド。
４．Ｐ２がｇＤ２ｔである請求項３記載のハイブリッドポリペプチド。
５．Ｐ２がＨＩＶｇｐ１２０のＶ３ループに相当するペプチドである請求項３記載のハイブリッドポリペプチド。
６．Ｐ１がＨＢｓＡｇ先駆体蛋白の全部または一部あるいは部分からなる請求項１〜５記載のいずれか１つのハイブリッドポリペプチド。
７．Ｐ１が粒子の単量体である請求項１〜６記載のいずれか１つのハイブリッドポリペプチド。
８．融合前、Ｐ１がその表面に１またはそれ以上のスルフヒドリル基を有するＨＢｓＡｇ−Ｓ−蛋白であるハイブリッド蛋白。
９．Ｐ１がＢ型肝炎表面抗原の生物学的活性を有する蛋白の一部または全部に相当する少なくとも２つのポリペプチドからなる混成粒子の一部であるハイブリッド蛋白であって、該粒子がＳ−蛋白、プレＳ２−蛋白またはプレＳ１−蛋白によって付与される少なくとも２つの抗原決定因子を提供し、該粒子が所望により宿主特異的脂質を含有していてもよいハイブリッド蛋白。
１０．混成蛋白をＬ、Ｓで表すことができ、ここでＬはプレＳ１、プレＳ２およびＳを包含するＨＢｓＡｇのラージ蛋白であり、ＳはＨＢｓＡｇＳ−蛋白である請求項９記載のハイブリッド蛋白。
１１．Ｌ蛋白が配列中にて１またはそれ以上の以下の修飾：プロテアーゼ消化に対して感受的な配列、ミリスチル化に必須の配列、Ｎ−結合グリコシル化に必須の配列、Ｏ−結合グリコシル化に必須の配列、およびヒト血清アルブミンの結合に必須の配列からなることを特徴とする請求項１０記載のハイブリッド蛋白。
１２．Ｌが修飾され、Ｌ蛋白の残基１２〜５２、つづいて１３３〜１４５、つづいて残基１７５〜４００からなるアミノ酸配列を有する請求項１０または１１記載のハイブリッド蛋白。
１３．Ａが置換Ｃ２−Ｃ１０アルカンであるか、またはリニアーポリマー、例えばポリエチレングリコールまたは以下の化合物：▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ およびＳ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ− である請求項２〜１２記載のいずれか１つのハイブリッド蛋白。
１４．請求項１〜１３に記載のいずれかのハイブリッド蛋白と医薬上許容される賦形剤を一緒にしてなるワクチン処方。
１５．さらに、適当な担体中にデ−３−Ｏ−アシル化モノリン酸化脂質Ａ（３Ｄ −ＭＰＬ）を含有することからなる請求項１４記載のワクチン処方。
１６．３Ｄ−ＭＰＬおよびアラムからなる前記のワクチン処方。
１７．担体が水中油型エマルジョンである前記のワクチン処方。
１８．水中油型エマルジョンが３Ｄ−ＭＰＬ、スタアラン、プルロニックＬ−１２１およびリン酸緩衝生理食塩水からなる請求項１８記載のワクチン処方。
１９．ａ）Ｘが基−ＡＮＨ−である場合：ｉ）第二のポリペプチドＰ２を式（ＩＩ）：Ｙ−Ａ−Ｂ（ＩＩ）［式中、Ｙは第一のポリペプチドの天然チオール基との反応能を有する基で、Ｂは第二のポリペプチドＰ２の１またはそれ以上のアミノ酸側鎖に対して特異的な基であり、Ａは前記と同意義である〕で示される化合物と反応させ；その後、ｉｉ）その生成物を第一のポリペプチドＰ１−ＳＨと反応させるか；またはｂ）ＸがＳであって、Ｐ２が疎水性アンカー基およびシステイン残基を有する場合：ｉ）第一のポリペプチドと第二のポリペプチドを水溶液中で混合し、ｉｉ）Ｐ１とＰ２の間で、自発酸化により分子間ジスルフィド結合を形成させる工程よりなる、式（Ｉ）：Ｐ１−Ｓ−Ｘ−Ｐ２（Ｉ）［式中、Ｐ１、Ｐ２およびＸは請求項２の記載と同じ］で示されるハイブリッドポリペプチドの製法。