JP2858848B2 - Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原粒子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原性デターミナントを含有し且つキャリ
アーに結合したポリペプチドからなるコンジュゲート
体、その製造及び抗体誘導に用いるその用途に関する。

目標とすべき望ましいワクチンとは、持続時間が長い
免疫化であって、且つその免疫記憶が十分に長く次のワ
クチン接種まであるいは感染性物質の浸入時まで継続す
る免疫化を素早く生ぜしめるワクチンである。またワク
チン製剤は、容易に投与することができて、安定であっ
て、その副作用も少なく、接種した者が感染性物質から
広範囲な保護を得られるようなワクチン製剤でなければ
ならない。

従来用いられているワクチンの多くはこのような要求
をおおよそ満たしている。しかしながら、感染性物質の
ものを不活性化することによって得られている従来のワ
クチンは多くの問題点を有している。例えば、免疫抗原
の特質が不確定であること、不活性化ワクチンが真に無
害であるかどうかという問題点があり、また感染性物質
を大量に取扱う際の危険性、あるいは安定性、安定性の
問題から生じる投与方法の制限などの問題点がある。

より安定で明確なワクチンを開発する試みの１つとし
て、多くの感染性物質に対する免疫応答を詳細に研究し
て、保護免疫を提供するのに関与しているエピトープを
同定するこが行なわれている。このような試みによって
得られた知識に基づき、より短いペプチドを作成してエ
ピトープの類似体を得、これらをワクチンとして用いる
ことが現在では可能となっている。このようなペプチド
を用いたワクチンは多くの利点を有している。即ち、こ
れらは化学的に明確なものであって、安定であり、その
製造工程で感染性物質が混入することもない。更には、
免疫応答が適度に促進されるようにデザインすることが
可能であり、また新たなデリバリーシステムを用いて抗
原を目的部位に投与できるようにすることも可能であ
る。製造の点から見れば、大量生産するためのプラント
を作成する必要性もなくまた複雑な加工工程も必要とし
ない。

このような多くの利点があるにもかかわらず、ペプチ
ドワクチンに対しても多くの問題点が指摘されている。
即ち、ペプチドワクチンの場合には化学的に不明確なキ
ャリアー蛋白を必要とし、またペプチド抗原の免疫原性
は天然の生物抗原の免疫原性と同様になることはないと
考えられている。また、多くの合成ペプチドはその分子
量が比較的小さいためにハプテンのように機能し、従っ
てその免疫原性を高めるためには大きな外来蛋白キャリ
アーを結合することが必要であると一般的に考えられて
いる。このようにキャリアーと結合して得られるコンジ
ュゲード体で免疫した場合には、そのペプチドとキャリ
アーとの結合方法によっては感染性物質のあるいは天然
蛋白を確認できない抗ペプチド抗体が産生されることが
しばしばある。またワクチン接種に関連した他の問題と
しては、キャリアーに用いた外来蛋白に対する高感受性
の問題、あるいはコンジュゲート体を製造する際の各バ
ッチ間の再現性の問題がある。

最近、キャリアー蛋白としてＢ型肝炎ウイルスコア抗
原（HBcAg）を用いることが検討されている。Clarke et
al., Nature, 330,381−384,1987には、口蹄疫ウイル
ス（FMDV）のVP1カプシド蛋白の主要抗原部位をHBcAgの
アミノ末端に融合した融合蛋白が記載されている。この
融合蛋白は自己集合してレギュラー27nmコア様粒子にな
り、天然ウイルス自体と同様にFMDVに関して免疫原性と
なる。

EP−Ａ−0271302号明細書には、HBcAgがアミノ酸残基
の側鎖を介してポリペプチド免疫原に結合したポリペプ
チドコンジュゲート体が開示されている。また、HBcAg
蛋白がペプチド結合により病原性免疫原に結合した免疫
原性融合蛋白も記載さてれいる。Ｔ細胞特異的促進ポリ
ペプチドも記載されている。

本発明者らは、HBcAg粒子にポリペプチドを化学的に
結合することについて研究した。しかしながら満足すべ
き結果は得られなかった。

即ち、 1.本発明者らは、HBcAg粒子をスクシンイミジル−４−
（Ｎ−マレイミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（SMCC）で誘導体化してHBcAg上の側鎖
アミノ基を介してＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）
をHBcAgに結合することを試みた。しかしながら、HBcAg
粒子の誘導体化はほとんど起こらなかった。

2.上記１の試みを、SMCCを用いる代わりにｍ−マイレイ
ミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（MBS）を用いて実施したが、やはりHBcAg粒子の誘
導体化はほとんど起こらなかった。

3.グルタルアルデヒドを用いてHBcAg粒子にHBsAgを結合
させることを試みた。高濃度のグルタルアルデヒドを用
いた場合には結合させることができた。しかしながら、
高濃度のグルタルアルデヒドを用いた場合にはHBsAgが
ダメージを受け、得られるコンプレックスをマウスに投
与した場合にHBsAgに対する免疫応答が著しく減少し
た。

4.本発明者らは、ピス（マレイミド）メチルエステル
（BMME）を用いて、HBcAgの側鎖アミノ基にCys含有FMDV
VP1 141−160ペプチドを結合させることを試みた。HBc
Ag粒子の量は減少したがBMMFによって誘導体化されたペ
プチドと反応した。結合はしたが、得られるコンプレッ
クスを投与してもFMDVに対する免疫応答は極めて低かっ
た。

本発明者らは上記した困難性を克服するために、HBcA
gのアミノ末端にLys含有短鎖配列を融合した融合蛋白を
用いた。この修正HBcAg蛋白に、そのLys残基の側鎖アミ
ノ基を介してペプチドを結合させた所、結合がうまく行
なわれ、得られるコンジュゲート体は抗ペプチド抗体及
び中和抗体を有効に誘導した。この方法は簡便であって
効果的であり、明確な方法によってペプチドを結合させ
ることができる。

従って本発明によれば、Lys残基を含有するＮ末端延
長鎖であって最初の14個のＮ末端側のアミノ酸残基内に
Lys残基を含有するＮ末端延長鎖を有するHBcAgからなる
粒子であって、該Lys残基の側鎖アミノ基を介して抗原
性エピトープを有するポリペプチドが結合された粒子が
提供される。

上記の修正HBcAg粒子にはいずれのポリペプチドも結
合することができる。しかしながら、HBcAgのＮ末端延
長鎖中のLys残基の側鎖アミノ基に結合することのでき
る−NH₂、−SHなどの官能基がポリペプチド上に存在す
ることが必要である。典型的には、ポリペプチドは、外
来エピトープ、即ち、HBcAgのエピトープでないエピト
ープを有することができる。

ポリペプチドは、ウイルス、バクテリア、プロトゾア
などの感染性物質のエピトープなどの、中和抗体を誘導
することのできる抗原性エピトープを含有している。あ
るいは、成長ホルモン断片などの非感染性物質のエピト
ープを含有していてもよい。またポリペプチドは、例え
ばエピトープの８あるいは４個のコピーまでのエピトー
プの複数コピーを含有していてもよい。エピトープの２
個のコピーが存在していてもよい。２つあるいはそれ以
上の異なるエピトープ、例えば３あるいは４種類のエピ
トープが存在していてもよい。

エピトープの有するウイルスの例としては、例えば、
Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザ
ウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫
不全ウイルスタイプ１（HIV−１）、HIV−２、シミアン
免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトライノウイルス（HR
V）、デングウイルス、黄熱病ウイルスなどが挙げられ
る。修正HBcAgに結合するポリペプチドはHBsAgあるいは
FMDV VP1主要抗原部位を含むポリペプチドであってもよ
い。エピトープを有するプロトゾアとしてはマラリアパ
ラサイトPlasmodiom faliparomが挙げられる。

FMDV VP1主要抗原部位を含有するペプチドとしては、
FMDVのVP1、例えばいずれかのFMDVセロタイプの137−14
2番目のアミノ酸残基からスタートして160−162番目の
アミノ酸残基で終る配列からなるペプチドを用いること
ができる。典型的な配列は、VP1アミノ酸残基140−16
2、140−160、137−162、137−160あるいは141−160の
配列である。このような配列のタンデムリピートを含有
するポリペプチドあるいはこのような配列の混合セロタ
イプのタンデムリピートを含有するポリペプチドを、修
正HBcAg粒子に結合することができる。

FMDV VP1主要抗原部位のタンデムリピートを含有する
適当なペプチドとしては、それぞれが30個以下のアミノ
酸残基からなる配列が連続していてそれぞれ同じ免疫性
を有している配列から構成されるペプチドが挙げられ
る。この免疫原性配列とは、 ÅFMDVサブタイプO₁のVP1のアミノ酸残基137−145か
らスタートしてアミノ酸残基150−162で終る配列；ある
いは ｌセロタイプでＯの他のサブタイプあるいは異なるFM
DVセロタイプのサブタイプの対応するアミノ酸残基から
なる配列である。

従って、ペプチドは免疫原生配列のタンデムリピート
であってもよい。あるいは、連続した配列から構成され
るペプチドであって、そのうちの１つあるいはそれ以上
の配列が免疫原生配列の活性部分でない部分を更に付加
的に含んだペプチドであってもよい。このような付加的
なアミノ酸残基はそれぞれの免疫原性配列を連結するの
に用いることができる。このような連結に用いられる配
列としては、６個までのアミノ酸残基、例えば１−３個
のアミノ酸残基からなる配列が挙げられる。このような
連結用配列がなくても、それぞれの免疫原性配列を直接
結合することもできる。

ペプチドは免疫原性配列の任意のリピート数を含有し
ていてもよい。例えば、２−８、より好ましくは２−４
のリピート数が挙げられる。ペプチドは、非天然性のシ
ステイン残基を有するＣ末端及び／又はＮ末端で終って
も終らなくともよい。

免疫原性FMDV配列を含有する配列は、30個以下のアミ
ノ酸残基からなる。配列の長さは、付加的な連結用アミ
ノ酸残基及びＮ末端及び／又はＮ末端非天然性システイ
ンが存在していても、免疫原性配列の長に依存する。し
かしながら、連続した配列のそれぞれの配列は26個以下
のアミノ酸残基からなるのが好ましい。

ペプチドはFMDV VP1主要免疫原性部位のリピートを有
している。FMDV主要エピトープは、VP1キャプシド蛋白
の少なくともアミノ酸残基142−160によって定義され
る。これは特にセロタイプO₁に適用される。従って、く
り返し存在していてもよい免疫原性配列としては、FMDV
セロタイプO₁のVP1アミノ酸残基142−160であって任意
にＮ末端側のアミノ酸残基137及び／又はＣ末端側のア
ミノ酸残基162まで延びていてもよいアミノ酸配列によ
って定義される配列、あるいは他のセロタイプの対応す
るアミノ酸配列によって定義される配列が挙げられる。
典型的な配列としては、例えばサブタイプO₁及びA₁₂な
どのセロタイプＯまたはＡのVP1アミノ酸残基140−16
2、140−160、137−162または137−160が挙げられる。
このような典型的配列は例えば２回くり返し存在してい
てもよい。１文字コードを用いて有用なペプチドを挙げ
れば以下の通りである。

FMDVエピトープのより少さな免疫原性配列であっても
よい。例えば、セロタイプO₁のVP1アミノ酸残基145−15
0によって定義される配列でもよい。従って、くり返し
存在していてもよいFMDV配列は、セロタイプO₁のVP1ア
ミノ酸残基145−150からなるアミノ酸配列であって任意
にＮ末端側のアミノ酸残基137及び／又はＣ末端側のア
ミノ酸残基162まで延びていてもよいアミノ酸配列、あ
るいは他のセロタイプの対応するアミノ酸配列によって
広く定義することができる。有用な少さな配列は以下の
通りである。

FMDV VP1主要抗原性部位の混合セロタイプタンデムリ
ピートからなる適当なペプチドは下記式（Ｉ）で表わさ
れる。

Ｃ′−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｃ″ （Ｉ） ここでＸは、ÅFMDVセロタイプO₁のVP1のアミノ酸残
基137−142からスタートしてアミノ酸残基160−162で終
るアミノ酸配列、あるいはｌセロタイプＯの他のサブタ
イプまたは異なるFMDVセロタイプのサブタイプの対応す
るアミノ酸配列を表わし、 Ｙは直接結合、あるいはアミノ酸残基６個までからな
る連結用配列を表わし、 Ｚは、Ｘで表わされる配列のセロタイプとは異なるセ
ロタイプの配列であってＸと同様にして定義される配列
を表わし、 Ｃ′及びＣ″はそれぞれ独立に任意のシステイン残基
を表わす。

Ｘ及びＺで表わされるそれぞれの免疫原性配列は、FM
DVセロタイプO₁のVP1アミノ酸残基142−160のアミノ酸
配列であって任意にそのＮ末端側のアミノ酸残基137及
び／又はそのＣ末端側のアミノ酸残基162まど延びてい
てもよいアミノ酸配列、あるいはセロタイプＯの他のサ
ブタイプまたは異なるFMDVセロタイプのサブタイプの対
応するアミノ酸配列によって定義される。典型的な配列
は、VP1アミノ酸残基140−162、140−160、137−162又
は137−160である。

Ｘ及びＺで表わされる免疫原性配列は、それぞれ異な
るセロタイプのアミノ酸配列である。７種類のFMDVセロ
タイプ、即ち、Ｏ、Ａ、Ｃ、Asia 1、SAT1、SAT2及びSA
T3がある。有用なペプチドは、セロタイプO₁のアミノ酸
配列及びセロタイプA₁₂のアミノ酸配列をいずれかの順
序で含むペプチドである。免疫原性配列は、６個まで例
えば１〜３個のアミノ酸残基を介して連結することがで
きる。Ｃ末端の非天然性のシステイン残基が存在してい
るのが好ましい。１文字コードで好ましいペプチドを表
わせば以下の通りである。

修正HBcAg粒子に結合するのに用いる好ましいポリペ
プチドは、EP−Ａ−0287395号明細書に記載されたHRV N
Im−IIエピトープからなるポリペプチドである。このエ
ピトープは、HRV2のVP2のアミノ酸残基156−164のアミ
ノ酸配列あるいは他のHPVのそれと等価のアミノ酸残基
からなるアミノ酸配列によって定義される。これらの配
列におけるアミノ酸残基は、当該配列の抗原性に影響を
与えない他のアミノ酸残基によって置換してもよい。HR
V2のNIm−II配列は以下の通りである。

他のHRVのこれと等価のアミノ酸残基は、HRV2のVP2ア
ミノ酸残基156−164に対応するVP2アミノ酸残基であ
る。換言すれば、それらは他のHRVセロタイプの対応す
るVP2アミノ酸残基である。これらは、HRV2のVP2配列と
他のHRVのVP2の配列とを並べることによって容易に決定
することができる。このことは、HRVの異なるタイプのV
P2配列間においては相同性があるため、容易に行なうこ
とができる。

ポリペプチドは、50個まで、例えば40又は30個までの
アミノ酸残基からなる比較的短かいペプチドであってよ
い。あるいは、例えば100又は200個のアミノ酸残基の長
さの長いものであってもよい。それらは蛋白であっても
よい。それらは化学合成あるいは組換えDNA技術によっ
て得ることができる。

ポリペプチドが結合する粒子は、Lys残基を含有する
Ｎ末端延長鎖を持ったHBcAgから本質的になるものであ
る。HBcAgは自己集中することによって直径27nmの粒子
となる。本発明で用いる修正HBcAgも自己集中すること
によってコア状の粒子を形成する。Ｎ末端延長鎖上には
１個より多くのLys残基が存在していてもよい。６個ま
で、例えば４個までのLys残基が存在していてもよい。

Ｎ末端延長鎖は、このＮ末端延長鎖をそなえたHBcAg
が自己集中してコア状の粒子を形成し該延長鎖上のLys
残基が結合用に用いられるようにさらされていれば、ど
のような長さであってもよい。Ｎ末端延長鎖は、250個
まで、例えば200個又は100個までのアミノ酸残基からな
る長さのものでもよい。あるいは、60個まで、例えは4
0、20、10又は５個までのアミノ酸残基からなるような
短いものでもよい。

好ましいＮ末端延長鎖は、SabinまたはMahoney株など
のポリオウイルスタイプ１（PV1）株のVP1キャプシド蛋
白のアミノ酸残基95−102、例えば95−104からなるアミ
ノ酸配列である。これらを示すと以下の通りである。

これらは１文字コード（Eur.J.Biochem.138,9−37,19
84）により示したものであってＫはLysを表わす。これ
らの配列は、PV1 VP1の主要抗原性部位上に広がる配列
である。他の適当な延長鎖としては、HRV2のVP2キャプ
シド蛋白のアミノ酸残基156−164、例えば156−170のア
ミノ酸配列、あるいは他のHRVのそれと等価のアミノ酸
残基からなるアミノ酸配列が挙げられる。HRV2について
のこれらのアミノ酸配列は以下の通りである。

PV1あるいはHRV由来の配列のいずれかの末端あるいは
両末端に、例えば５もしくは３個までのアミノ酸残基か
らなるリンカー配列を設けてもよい。HBcAgのいずれの
Ｎ末端延長鎖の場合にも、最初の14個のＮ末端側のアミ
ノ酸残基内に少なくとも１つのLys残基が存在している
必要がある、即ち、例えば、最初の５個もしくは12個の
Ｎ末端側のアミノ酸残基内に１個のLys残基、あるいは
最初の14個のＮ末端側のアミノ酸残基内に２個のLys残
基が存在していることが必要である。結合に用いるポリ
ペプチドとしては、Ｎ末端延長鎖自体のＮ末端の近にLy
s残基を有するＮ末端延長鎖を備えたHBcAgを用いるのが
望ましい。またＮ末端延長鎖は親水性であるのが望まし
い。

これらの配列のうちの１つあるいは他の配列からなり
Lys残基を含有するＮ末端延長鎖を持った修正HBcAgは、
遺伝子工学技術、例えばJP−Ａ−196299/88号明細書に
記載された方法によって得ることができる。より具体的
には、このような修正HBcAgは、この修正HBcAgをコード
する遺伝子を適当な発現ベクター中に導入し、該ベクタ
ーで形質転換した宿主中で該修正HBcAgを発現すること
によって得ることができる。

修正HBcAgをコードする遺伝子は、目的とするＮ末端
延長鎖をコードするDNA配列を合成し、必要に応じて適
当なリンカーを用いてこのDNA配列をHBcAgをコードする
DNA配列の５′末端に連結することによって調製するこ
とができる。かくして得られるDNA配列を、適当な転写
及び翻訳調節配列のコントロール下で発現ベクター中に
導入する。修正HBcAgは、E.coli,Salmonellaまたは酵母
などの適当な真核または原核宿主中で発現せしめて、粒
子として回収することができる。

HBcAgをコードするDNA配列の５′末端部位に制限酵素
部位が存在する場合には、HBcAgを発現することのでき
るプラスミドなどの発現ベクターを用いることができ
る、所望のＮ末端延長鎖をコードするDNA配列を、この
制限酵素部位に挿入する。Ｎ末端延長鎖を有しHBcAgの
アミノ末端に連結した融合蛋白が発現される。

適当な発現ベクターはプラスミドpBc404である。この
プラスミドを有するE.coli（JM101）は、National Coll
ection of Industrial and Marine Bacteria,Aberdeen,
GBに1989年２月９日に寄託されており、受託番号NCIB40
111が付与されている。このプラスミドは選択マーカー
としてアンピシリナーゼ遺伝子をコードとしており、HB
cAg遺伝子の上流に強力バクテリアプロモーターtacを持
っている。また、制限酵素部位EcoRI及びBamHIを有して
いるため、所望のＮ末端延長鎖をコードする合成オリゴ
ヌクレオチドを挿入することが可能である。

本発明のコンジュゲード体は、抗原性デターミナント
を有するポリペプチドを、修正HBcAgの最終的な14個の
Ｎ末端アミノ酸残基内のLys残基の側鎖アミノ基を介し
て、該修正HBcAgに結合することによって調製すること
ができる。これは、アミノ酸及びスルフヒドリル基に結
合することのできる２官能性試薬と修正HBcAgとを反応
させることによって達成することができる。かくして得
られる誘導体化された修正HBcAgを、ポリペプチドであ
ってフリーのスルフヒドリル基を持っていない場合には
スルフヒドリル基が導入されたポリペプチドと反応させ
る。

適当な二官能性試薬としては、例えば、SMCC、MBS、
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオネート（SPDP）などが挙げられる。二官能性試薬
は、一般に、ペプチド結合を形成する官能基とジスルフ
ィドもしくはチオエステル結合を形成する官能基とを有
している。スルフヒドリル基はポリペプチド上に存在し
ていてもよい。この場合には、Ｎ末端呼び／又はＣ末端
のCys残基を介して、あるいはそのアミノ基と２−イミ
ノチオランまたは３−（３−ジチオピリジル）プロピオ
ネートもしくはＳ−アセチルチオグリコール酸のＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルと反応することによ
り、ポリペプチドが修正HBcAgに結合される。Ｓ−アセ
チルグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル（SATA）との反応後、例えばヒドロキシアミンでSATA
をデアセチル化をすることにより−SH基が得られる。

実際には、修正HBcAg粒子は、pH約７のリン酸バッフ
ァーなどの緩衝液中にて得られる。過剰モルの二官能性
試薬をジメチルホルムアミノなどの非プロトン性溶媒等
の不活性溶媒に溶解し、この溶液を加える。これにより
HBcAg粒子の誘導体化が起こる。次いで過剰のポリペプ
チドを加えて修正HBcAg粒子に結合させる。カップリン
グが起こり、修正HBcAg粒子にポリペプチドが結合した
コンジュゲード体が得られ、これを濾過などによって回
収する。

修正HBcAgコア粒子は使用する前にカルボキシメチル
化することができる。これは、コア粒子上に存在するス
ルフヒドリル基を誘導体化する前にブロックして、二官
能性試薬を用いてコア粒子上のＮ末端側鎖アミノ基とポ
リペプチド上の−SH基とを結合せしめる債にコア粒子蛋
白が架橋するのを防ぐためである。カルボキシメチル化
は、コア粒子とヨードアセタミドとを反応することによ
って達成される。過剰の試薬はゲル濾過あるいは透析に
より分離することができる。

かくして得られるコンジュゲート体は、 HBcAg粒子に結合したポリペプチド上に存在する抗原性
デターミナントに対する抗体を誘導するのに極めて有用
である。従って、このコンジュゲート体はヒトまたは動
物のワクチンとして用いることができる。このコンジュ
ゲート体の有効量をヒトあるいは動物に投与することに
よってワクチン接種を行なうことができる。経口投与、
あるいは皮下、静脈、筋肉などの非経口投与により投与
することができる。典型的には、経口あるいは非経口投
与により、１回当り１−1,000μｇ、好ましく10−100μ
ｇの投与量で投与される。

コンジュゲート体は、投与用には薬学的に許容し得る
担体もしくは希釈剤とともに製剤化される。慣用的に用
いられている剤形、担体、希釈剤を用いることができ
る。これらはもちろん投与ルートによって決定すること
ができる。適当な担体及び希釈剤としては、例えば、フ
ロイントの不完全アジュバンド（IFA）、水酸化アルミ
ニウム、サポニン、DEAE−デキストラン、ムラミルジペ
プチド、ミネラルオイル、ミグリオールなどの中性オイ
ル、ピーナッツオイルなどのベジタブルオイル、イスコ
ム（Iscoms）、リポゾーム、プルロニック（トレードマ
ーク）ポリオール、Ribiアジュバント系（GB−Ａ−2189
141）などが挙げられる。

以下の実施例により本発明を説明する。添付した図面
にはプラスミドpBc404が示されている。図面において、
Ｂ、Ｅ及びＰはそれぞれBamH I、EcoR I及びPst I部位
を示し、tacはtacプロモータを示し、oriは複製オリジ
ンを示し、blaはβ−ラクタマーゼを示し、SDはシャイ
ンダルガーノ配列を示す。

例１ Ｎ末端に、PV1 Mahoney VP1アミノ酸残基95−104を含有
する短い延長鎖を持つHBcAg（PVコア）の調製 図面に示した親プラスミドpBc404に基づいて、PVコア
用の発現プラスミドを作成した。

PV1 MahoneyのVP1のアミノ酸残基95−104をコードす
る合成オリゴヌクレオチドを、T4リガーゼを用いてスタ
ンダード法によりpBc404に連結した。合成オリゴヌクレ
オチド、それらのアニール化の仕方、及びＮ末端延長鎖
のコード配列は以下の通りである。

組換えプラスミドを保持したバクテリア（E.coli JM1
01）を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（IPTG）60μg/mlを用いて６時間発現誘導させた。細
胞を遠心分離により採取し、リゾチーム及び非イオン性
洗浄剤処理により溶解した。10000rpmで５分間遠心して
バクテリア破片を除去した。

上清サンプルを、20℃で50000rpmで１時間15分間、15
−45％リニア−シュクロースグラジエントで分画した。
260nmでの光学密度により粒子を検出した。粒子を40000
rpmで１時間遠心して濃縮した。あるいは、シュクロー
スの透析後、そのまま誘導体化に直接用いた。

例２ FMDV VP1アミノ酸残基141−160のアミノ酸配列からなる
ペプチドであってＣ末端Cys残基を有するペプチド（FMD
V141−160Cys）のPVコアへの結合 ２回の連続したシュクロースを用いた分画により精製
したPVコアを、pH7.2の10mMリン酸バッファー溶液に溶
解して5mg/mlの濃度で、セファデックス（トレードマー
ク）G100カラムに通した。次いで10mMリン酸バッファー
中にPVコアーが2mg/mlの濃度で溶解した溶液を用いて、
これに、ドライジメチルホルムアミドに溶解した1/20容
量のSMCCを加えてPVコアサンプル中でのSMCCの終濃度が
PVコア蛋白に対して50倍モル過剰となるようにして、誘
導体化を実施した。

室温で30分後、pH7.2の10mMリン酸バッファー中のセ
ファデックスG100に通して濾過してSMCCを除去した。新
たに溶解したFMDV141−160Cysを1/10容量で加えて、誘
導体化したPVコアに対して10倍モル過剰となるようにし
た。室温で２時間撹拌後、未結合のペプチドを、セファ
デックスG200を用いた濾過により誘導体化したPVコアか
ら分離した。ペプチドが結合したPVコアを回収した。

例３ HRV2ペプチドへのPVコアの結合 例２に記載された方法に従って、Nin−IIエピトープ
を含有し以下のアミノ酸配列を有するHRV2ペプチドをRV
コアに結合した。

VKAETRLNPDLQPTC HRV2ペプチドが結合したPVコアを回収した。

例４ PVコアのカルボキシメチル化 シュクロースを透析し、遠心により濃縮後、PVコアを
200μg/mlの量で、暗所中で室温で１時間、pH8.0の0.5M
Trisに溶解した10mMヨードアセトアミドと反応させ
た。ゲル濾過により過剰の試薬をカルボキシメチル化PV
コアから除去した。

例５ Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（HbsAc）のカルボキシメチ
ル化PVコアへの結合 例４で得られたカルボキシメチル化PVコアを、等モル
量のSMCCを溶解したジメチルホルムアミド（DMF）溶液
で誘導体化した。SMCCの量はDMFの1/20の量であった。
酵母中で発現したHbsAg粒子を200μg/ml濃度で、Ｓ−ア
セチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（SATA）を用いてDMF中で等モル比で誘導体化
した。SATAの量はDMFの量の1/20であった。ヒドロキシ
アミンでSATAをデアセチル化してフリーの−SH基を得た
後、２つの誘導体化粒子の等量（それぞれ200μg/ml）
を混合した。HBsAgが結合したPVコアを回収した。

例６ FMDVペプチド及びHRV2ペプチドのカルボキシメチル化PV
コアへの結合 例５に記載された方法に従って、FMDV141−160Cysペ
プチドをカルボキシメチル化PVコアに結合した。別の実
験では、例３で記載したHRV2ペプチドを同様にしてカル
ボキシメチル化PVコアに結合した。しかしながら、両者
の場合には、誘導体化は、pH7.8の50mMリン酸バッファ
ー中で行ない。誘導体化後できるだけ早くマレイミド基
を安定化させるためにpH6.8の50mMリン酸バッファー中
に移した。

例７ FMDVペプチド及びHRV2ペプチドのPVコアへの結合につい
ての分析テスト結果 例２及び６で得られた、FMDVペプチドが結合したPVコ
ア、及び例３及び６で得られた、HRV2ペプチドが結合し
たPVコアの分析テストを次のようにして実施した。

（ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動 これによって、すべてのコア蛋白は、ペプチドの付加
により、高分子量側へシフトしたことが示された。

（ｂ）ウエスタンブロッティング ゲル電気泳動後、蛋白をニトロセルロースへ移動し、
抗コア抗血清あるいは抗ペプチド抗血清と反応させた。
得られた結果により、結合後に得られたより高分子量の
蛋白が期待通りに両者の抗血清と反応したことが示され
た。

（ｃ）ELISA ÅELISAプレートに結合した抗コア血清を用いて誘導
体化コア粒子をトラップするサンドイッチ法によりアッ
セイを実施した。テスト後抗ペプチド抗血清と反応させ
た。これにより、誘導体化粒子はコア抗原性とペプチド
抗原性を両者を有していた。

lHRV2ペプチド配列がコア蛋白のＮ末端に融合した融
合コア粒子に対する抗HRV2ペプチド抗血清、及びHRV2ペ
プチドが結合したPVコアに対する抗HRV2ペプチド抗血清
の力価をELISAにより測定した所、同じ結果が得られ
た。このアッセイでは、上記の２つの粒子については同
じ量を用いたため、Ｎ末端融合粒子と化学結合した粒子
の抗原性活性は実質的に同じであった。抗HRV2ペプチド
抗血清は、例３及び６のHRV2ペプチドに対して誘導され
た抗血清である。

（ｄ）シュクロース密度グラジエント この分析により、FMDVペプチドがコアに結合して粒子
凝集が起こったことが示された。これらはチューブの底
にペレット化した。HRVペプチドが結合したPVコアは、
未処理コアと同様の位置に沈降し、ELISAによる分析結
果から、コア免疫原性及びペプチド免疫原性の両者を有
していた。

（ｅ）電子顕微鏡 HRV2ペプチドが結合したPVコアを調べた所、規制正し
い粒子が観察された。HRV2ペプチドに結合したPVコアと
抗HRV2ペプチド抗血清との間で形成された免疫複合体を
電子顕微鏡で調べた所、コア粒子は抗体によって結合し
ていることが判った。

（ｆ）免疫原性 Åコアに結合したFMDV粒子は20μｇ以下で（ペプチド
の２μｇ以下）中和活性を有していた。

lHRV2ペプチドＮ末端融合コア粒子及び化学的結合粒
子の免疫原性活性を、それぞれ20μｇをギニアピッグに
投与して比較した、インジェクション後の各種時間で、
HRV2ペプチドに対する抗血清をELISAによりテストし
た。結果は以下の通りである、日数 化学的結合コア 融合コア 0 ＜1 ＜1 14 2.9 2.3 28 3.9 3.3 56 3.9 4.0 63 4.1 3.9 70 4.1 3.9 84 4.2 3.9 不完全フロイントアジュバンドに溶解して筋注投与し
た。

例８ FMDVタンデムリピートペプチドの調製 以下に示すペプチドを固相法により合成した。

より具体的には、Hovghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82,5131−5135,1985に記載されたMerrifield法（Merrif
ield,JACS 85,2149−2154,1963）の応用法を用いて合成
を行なった。それぞれのペプチドは、ペプチド199を除
いてそのＣ末端に非天然性システイン残基を付加的に有
している。ペプチド199はＣ末端に非天然性のグリシン
残基を有している。

それぞれのペプチドはＰ−メチルベンズヒドリルアミ
ンジビニルベンゼン樹脂上で合成した。それぞれのアミ
ノ酸のアルファアミノ保護基はｔ−ブトキシカルボニル
（Boc）を用いた、それぞれのカップリング反応サイク
ルは次の通りである。

1.ジクロロメタンにより樹脂の洗浄−10分間 2.5％ジイソプロピルエチルアミンのジクロロメタン溶
液による洗浄−２分間×３ 3.ジクロロメタン洗浄−１分間×２ 4.t−ブトキシカルボニルアミノ酸のジクロロメタン溶
液と0.3Mジイソプロピルカルボジイミドを用いたカップ
リング−60分間 5.上記３と同じ 6.50％トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液を用いた
脱保護−20分間 7.ジクロロメタン洗浄−１分間×６ 8.上記２へ戻る。

カップリングサイクルが完了した時に、アニソールス
カベンジャ−10％とともに水素化フルオライドを用いて
１時間処理してペプチドを樹脂から解離させた。かくし
て。カルボキシ末端にアミド基を有するペプチドが得ら
れた。次いでエーテルで洗浄して乾燥し、15％酢酸中に
溶解して凍結乾燥した。

例９ FMDV混合セロタイプタンデムリピートペプチドの調製 例８に記載した固相法により以下のペプチドを合成し
た。

例10 HRV2 VP2アミノ酸残基156−170のアミノ酸配列を含む延
長鎖をＮ末端に有するHBcAg（HRV2コア）の調製 VP2アミノ酸残基156−170を含む特異的Ｎ末端HRV2 VP
2エピトープをコードするキメラ融合粒子を構築するた
めに、５′末端にEcoR I及び３′末端にBamH I用の粘着
末端を有する合成オリゴヌクレオチドをApplied Biosys
tems 381A DNAシンセサイザーにより調製した。これら
のオリゴヌクレオチドを、EcoR I−BamH Iで消化して１
％低融点アガロースでスタンダード法Francis and Clar
ke,Meth.Enzymology 178,659−676,1989）により精製し
たpBc404に連結した。次いでこのDNAをE.coli JM101株
に導入し、小スケールDNA調製品から制限酵素マップを
作成した。合成オリゴヌクレオチド、これらのアニール
化の仕方、及びＮ末端延長鎖のコード配列は以下に示し
た通りである。

組換えプラスミドを有するバクテリアをＬ−Amp培地
中で一晩高細胞密度になるまで成育せしめて、次の日に
新鮮なＬ−ブロース（1:10）で希釈した。IPTG（終濃度
60μg/ml）を添加して発現を誘導し、更に37℃で６−８
時間複製させた。次いでバクテリアを採取し、Ｎ末端ペ
プチドエピトープを有するキメラコア粒子を精製し、公
知の方法（Clarke et al,Nature330,381−383,1987;Fra
ncis and Clarke,1989）でその特性を調べた。

例11 HBsAgのHRV2コアへの結合 例10のHRV2コアを等モル量のSMCCを含むDMF溶液で誘
導体化した。SMCCの量はDMF量の1/20であった。酵母中
で発現されたHBsAgを200μg/mlの濃度で、等モル比のDM
F中に溶解したSATAで誘導体化した。SATAの量はDMF量の
1/20であった。ヒドロキシアミンでSATAをデアセチル化
してフリーの−SH基を得た後、等量の２つの誘導体化粒
子（それぞれ200μg/ml）を混合した。

HBsAgが結合したHRV2コアを回収した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpBc404の構成を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 バーウィン エワート クラーケ イギリス国ビーアール３ ３ビーエス ケント，ベッケンハム，ラングリイ コ ート（番地なし）ザ ウエルカム ファ ウンデーション リミテッド 気付 (72)発明者 マイクル ジェームス フランシス イギリス国ビーアール３ ３ビーエス ケント，ベッケンハム，ラングリイ コ ート（番地なし）ザ ウエルカム ファ ウンデーション リミテッド 気付 (56)参考文献 特開 昭63−196299（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−25800（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 19/00 C07K 14/02 A61K 39/29 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原性エピトープを有するポリペプチドを
   保持したＢ型肝炎ウイルスコア抗原（HBcAg）粒子であ
   って、該HBcAg粒子は、Lys残基を有するＮ末端延長鎖で
   あって最初の14個のＮ末端側のアミノ酸残基内にLys残
   基を有するＮ末端延長鎖を備えたHBcAgから構成されて
   おり、該ポリペプチドは該Lys残基の側鎖アミノ基を介
   して該粒子に結合している上記HBcAg粒子。
2. 【請求項２】該ポリペプチドが、中和抗体を誘導できる
   抗原性エピトープを持つポリペプチドである請求項１の
   粒子。
3. 【請求項３】該エピトープが、ウイルス、バクテリアま
   たはプロトゾアのエピトープである請求項２の粒子。
4. 【請求項４】該ポリペプチドが、50個までのアミノ酸残
   基からなる長さのポリペプチドである請求項１から３の
   いずれかの粒子。
5. 【請求項５】該Ｎ末端延長鎖が、60個までのアミノ酸残
   基からなる長さのものである請求項１から４のいずれか
   の粒子。
6. 【請求項６】該Ｎ末端延長鎖が、タイプ１のポリオウイ
   ルスのVP1キャプシド蛋白のアミノ酸残基95−102のアミ
   ノ酸配列、あるいはヒトライノウイルス（HRV）タイプ
   ２のVP2キャプシド蛋白のアミノ酸残基156−164のアミ
   ノ酸配列もしくは他のHRVのそれと等価のアミノ酸残基
   からなるアミノ酸配列を含む請求項１から５のいずれか
   の粒子。
7. 【請求項７】Ｎ末端延長鎖を備えたHBcAgがカルボキシ
   メチル化されている請求項１から６のいずれかの粒子。
8. 【請求項８】抗原性エピトープを有するポリペプチドを
   保持したHBcAg粒子の調製法であって、さらされたLys残
   基を有するＮ末端延長鎖であって最初の14個のＮ末端側
   のアミノ酸残基内にさらされたLys残基を有するＮ末端
   延長鎖を備えたHBcAgから構成されるHBcAg粒子に、該Ly
   s残基の側鎖アミノ基を介して該ポリペプチドを結合さ
   せることを特徴とする上記調製法。
9. 【請求項９】Ｎ末端延長鎖を備えたHBcAgを、該ポリペ
   プチドに結合する前に、カルボキシメチル化する請求項
   ８の調製法。
10. 【請求項１０】抗原性エピトープを有するポリペプチド
    を保持したＢ型肝炎ウイルスコア抗原（HBcAg）粒子で
    あって、該HBcAg粒子は、Lys残基を有するＮ末端延長鎖
    であって最初の14個のＮ末端側のアミノ酸残基内にLys
    残基を有するＮ末端延長鎖を備えたHBcAgから構成され
    ており、該ポリペプチドは該Lys残基の側鎖アミノ基を
    介して該粒子に結合している上記HBcAg粒子を活性成分
    として含有する、ワクチンに用いるための薬学的組成
    物。