FI110613B - Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini - Google Patents
Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini Download PDFInfo
- Publication number
- FI110613B FI110613B FI935877A FI935877A FI110613B FI 110613 B FI110613 B FI 110613B FI 935877 A FI935877 A FI 935877A FI 935877 A FI935877 A FI 935877A FI 110613 B FI110613 B FI 110613B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- protein
- att
- modified
- modifierat
- enligt
- Prior art date
Links
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 title description 35
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 title description 35
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 29
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 19
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 15
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 13
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 8
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- -1 4-iodacetyl Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- 229940064734 aminobenzoate Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims 9
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims 9
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 claims 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 abstract description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 abstract description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 abstract description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 abstract description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 32
- 101100386050 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-14 gene Proteins 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RBNSZWOCWHGHMR-UHFFFAOYSA-N (2-iodoacetyl) 2-iodoacetate Chemical compound ICC(=O)OC(=O)CI RBNSZWOCWHGHMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBWHYNPDTSNGQD-NSHCULHESA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s,3r)-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]hexanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino] Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 LBWHYNPDTSNGQD-NSHCULHESA-N 0.000 description 1
- DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 DIYPCWKHSODVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 5-[(3-carboxylato-4-nitrophenyl)disulfanyl]-2-nitrobenzoate Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C([O-])=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000007963 capsule composition Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000003670 easy-to-clean Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002106 nanomesh Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000010809 targeting technique Methods 0.000 description 1
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Hydrogenated Pyridines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
110613
Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini -Kapsidbildande och cysteinmodifierat chimärt MS2-täckprotein
Keksintö koskee kimeeristä proteiinia ja on erityisesti kohdistettu virusproteiineihin, 5 joissa on vieraita inserttejä, sellaisten proteiinien valmistusta ja niiden käyttöä, esimerkiksi kantajina molekyylilajeille, kuten kohdistusosille.
Samanaikaisesti haussa oleva FI-patenttihakemus 933328 kuvaa havaintoa, että epi-tooppi-insertio tunnistettuun virusproteiinikantajien luokkaan voidaan spesifisesti ohjata siten, että vieraat epitoopit ovat luotettavasti edustettuna proteiinikapsidikokoon-10 panon pinnalla sen jälkeen, kun kimeerinen proteiini on ekspressoitunut bakteeri-isännässä.
Mitenkään ei voitu ennustaa, että sellainen tulos saavutettaisiin. Kaikilla viruksilla ei ole vaippaproteiineja, jotka kokoavat itsensä: lisäksi ei ole mahdollista ennustaa sellaista itsekokoamista. Vielä lisäksi, toisin kuten eläinvirukset, bakteeriviruksilla ei 15 odoteta luonnostaan olevan immunodominoivia alueita ja täten ei ole ohjeita, mitä kohtaa bakteeriviruksen vaippaproteiinin alueesta (jos sellainen on) voitaisiin modifioida niin, että kohtuudella voitaisiin odottaa immuunivasteen indusoitumista.
Sen mukaisesti samanaikaisesti haussa oleva hakemus 920 1372.1 koskee kimeeristä \ . proteiinia, joka kykenee muodostamaan osan kapsidikokoonpanoa ja sisältää faagin 20 MS-2 vaippaproteiinin aminohapposekvenssin tai sen säilyneen modifioidun muun- ; noksen, tai riittävästi mainittua sekvenssiä tai muunnosta ylläpitämään kapsidin muo- • » ♦ : dostamiskykyä, mikä aminohapposekvenssi on modifioitu insertoimalla vieras epi- : · * tooppi proteiinin alueelle, joka vastaa N-terminaalista β-hiusneulaa, kuten on määritet- • »* •. · · ty koko faagipartikkelin röntgensädekristallografialla.
, ·, : 25 Yllättäen on havaittu, että sellaista kimeeristä proteiinia voidaan ekspressoida sopivas- • · * sa bakteeri-isännässä tuottamaan kapsideja, joissa ei ole faagi-RNA:ta ja suuressa : ‘ määrin ilman muita nukleiinihappokontaminantteja.
. Koska on tutkittu, että vieraan epitoopin, joka on lineaarinen polypeptidi, verrattain lyhyt pituudeltaan, esimerkiksi noin 30 aminohappojäännökseen asti, insertio voidaan : " 30 saada aikaan, on ymmärrettävää että ei-lineaaristen epitooppien esittäminen yksinker- ’ ”· täisellä insertiolla β-hiusneulaan ei ole mahdollinen toteuttaa. Täten useissa epitoo- peissa ei ole polypeptidin yksinkertaisia lineaarisia fragmentteja: sen sijaan ne on tehty useasta sellaisesta fragmentista, jotka avaruudellisesti ovat läheisesti yhteenkuuluvia 2 110613 natiivin proteiiniantigeenin kokonais- kolmiulotteisen laskostumisen takia, so. ei-jatkuvat epitoopit. On selvästi toivottavaa, että kyetään esittämään sellaisia epitooppe-ja faagikapsidin pinnalla.
Nyt on havaittu, että MS-2:n vaippaproteiinia voidaan käyttää siinä tarkoituksessa, että 5 esitetään epitooppien tai muiden molekyylilajien sarja, kuten kohdennetut osat kapsi-din pinnalla, poistamalla kysteiinijäännökset, joita esiintyy kohdissa, jotka eivät kuulu N-terminaaliseen β-hiusneulaan ja viedään kysteiinijäännös β-hiusneula-alueeseen, mikä kysteiinijäännös on sitten saatavilla yhdistämään toivottujen antigeenien tai muiden molekyylilajien kanssa, sopivasti tarkoituksenmukaisen välissä olevan kappaleen 10 kautta.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Siksi tämän keksinnön mukaisesti tarjotaan kimeeristä proteiinia, joka kykenee muodostamaan osan kapsidikokoonpanoa ja koostuu MS-2:n vaippaproteiinin aminohapposekvenssistä tai sen varovaisesti modifioidusta muunnoksesta tai riittävästi mainit-15 tua sekvenssiä tai muunnosta ylläpitämään kykyä muodostaa kapsidikokoonpano, mikä aminohapposekvenssi on modifioitu poistamalla kysteiinijäännökset, joita on ulkoisesti vaippaproteiinin N-terminaalisen ulkonevassa β-hiusneulassa, ja kysteiinijään-nöksen insertio alueelle, joka vastaa N-terminaalista ulkonevaa β-hiusneulaa.
Kysteiinijäännökset, jotka ovat ulkoisia β-hiusneulaan nähden, poistetaan sopivasti 20 mutatoimalla vaippaproteiinin cDNA sopivin kohdin.
i · _ Insertoitu kysteiini voidaan liittää suoraan haluttuun molekyylilajiin, kuten epitoop- ; Y piin, etenkin ei-lineaariseen antigeeniproteiiniin tai muuhun molekyylilajiin, kuten » · ;' kohdistusosaan. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää välikappaleosaa kysteiinin ja mole- •' ’ kyylilajin välissä, täten laajentaen liitettävien lajien aluetta.
.'. : 25 Sopivia välikappaleosia valitaan tunnetuista kaupallisesti saatavilla olevista heterobi- j · , · ·. toiminnallisista ristiimeagoivista reagensseista, jotka liittyvät yhteen esillä olevan kys- • ‘ teiini-tioliryhmän kanssa. Esimerkkejä sellaisista ristiinliittäjistä ovat m-maleimido- i bentsoyyh-N-hydroksisulfosukkiini-imidiesteri, N-sukkiini-imidyyli-(4-jodiasetyyli)- » % * :: aminobentsoaatti ja N-sukkiini-imidyyli-3-(2-pyridyyhditio)-propionaatti. Ristiinliittä- : . 30 jän valinta riippuu liitettävästä molekyylilajista ja sen koosta. Täten suuremmat mole- ,.,.: kyylilajit saattavat vaatia pidempiä ristiinliittäviä osia minimoimaan steerisen esteen.
» »
Ristiinliittäjä voidaan liittää ensin kysteiinijäännökseen tai ensin molekyylilajiin.
3 110613
Kimeerinen vaippaproteiini on edullisesti johdettu faagi MS-2:sta, mutta se voidaan johtaa myös läheistä sukua olevista RNA-faageista, jotka kykenevät replikoimaan E colissa. kuten faagit Rl7, fr, GA, QB ja SP. Sellaisissa RNA-faageissa, jotka ovat fysikaaliselta rakenteeltaan samanlaisia kuin MS-2, sisältävät jonkin verran kemiallista 5 muunnosta vaippaproteiinin aminohappojäännöksissä ja ovat täten MS-2 vaippaprote-iinin varovaisesti modifioituja muunnoksia. Koska tällä hetkellä uskotaan, että olennaisesti koko vaippaproteiini saatetaan vaatia kapsidin kokoamiseen, saattavat myös suhteellisen pieniä luonteeltaan olevat deleetiot ja/tai insertiot olla mahdollisia samalla kun ylläpidetään kapsidia muodostava kyty Proteiinit, joilla on sellaisia muokattuja 10 sekvenssejä, kuuluvat keksinnön piiriin.
Kuten edellä esitettiin, vieras osa insertoidaan proteiinin alueelle, joka vastaa kokoonpannussa kapsidissa N-terminaalista β-hiusneulaa. Valegard et ai., (Nature, 1990, 345, 36-41) ovat julkaisseet MS-2-faagipartikkelin kolmiulotteisen rakenteen. Julkaistut tiedot osoittavat, että ensimmäiseksi vaippaproteiinin rakenne ei ole sukua kahdeksan-15 säikeiselle β-koteloaiheelle, jota on kaikissa pyöreissä RNA-virus alayksiköissä, joiden rakenne tällä hetkellä tunnetaan. Toiseksi vaikka vaippaproteiini osoittaa kvasi-vastaavia alayksikön välisiä kontakteja, ei ole muita välineitä, kuten pidentyneitä po-lypeptidivälikkeitä, auttamaan varmistamaan jokainen proteiinimukauttaja. Vaippa-proteiinirakennetta voidaan tarkastella kolmen erillisen alueen muodossa. Nämä eivät 20 ole domeeneja tavallisessa merkityksessä, mutta voisivat edustaa itsenäisiä laskostu-, · · misyksiköitä. Nämä alueet ovat jäännökset 1-20, joka muodostaa β-hiusneularaken- I ‘ * · teen, mikä työntyy ulos faagin, joka muodostaa etäisimmän säteittäisen piirteen, pin- . : nasta. Tätä aluetta seuraavat jäännökset 21-94, jotka muodostavat 5 β-säiettä "FG-sil- • mukka" mukaanluettuna, mikä on vain pääasiallisen konformationaalisen vaihdon ': 25 kohta kvasi-ekvivalenttien muuntajien välillä. Näitä β-säikeitä seuraa sitten kaksi a- heliksiä, jäännökset 95-125, jotka ovat lomisormitettuja suojaamaan vaippaproteiinin alayksiköiden dimeerejä. Valegard et ai. puuttuvat pelkästään MS-2-viruksen fysikaa-. , liseen rakenteeseen eivätkä yritä selventää viruksen toiminnan mallia.
'.,. · Kuten edellä selitettiin, tämä keksintö sisältää vaippaproteiinin aminohapposekvenssin : .·. 30 modifikaation tuomalla tysteiinijäännöksen alueella, joka vastaa ulkonevaa hius- neulaa. Keksinnön kimeerinen proteiini on siksi modifioitu aminohappojäännösten 1-20 alueelta, sellaisen numeroinnin ollessa viite koko MS-2:n vaippaproteiinisekvens-i *· siin, kuten Fiers, Nature, 1976, 260 500-507, ovat julkaisseet. Modifikaatio tysteiini- ‘” jäännöksen tuomiseksi on edullisesti kohti hiusneula-aluetta tai sen keskellä. On edul- 35 lista tuoda tysteiini vaippaproteiinin glysiini 13:n ja 14 alueelle. Kysteiinijäännökset, jotka ovat ulospäin β-hiusneulasta, jotka on tarkoitus poistaa, löytyvät asemissa 46 ja 4 110613 101. Ne voidaan poistaa millä tahansa tavanomaisella geneettisellä manipulointitek-niikalla, sopivasti kohdistetulla mutageneesillä.
Edullisessa menetelmässä poistaa ei-toivottuja kysteiinijäännöksiä voidaan saada kaksi MS-2 vaippaproteiinin mutanttia, yksi ainoastaan cys 46:een mutatoitu ja yksi ai-5 noastaan cys 101:een mutatoitu, standardeilla, kaupallisesti saatavilla olevilla kohdistetuilla mutageneesi-tekniikoilla ja vastaavat cDNA-sekvenssit viedään standardi eks-pressiovektoreihin, mille vektoreille tehdään restriktioentsyymipilkkominen, jotta saadaan erikseen DNA-fragmentit, joissa on mutatoitu cys 46 kohta ja vastaava fragmentti, jossa on mutatoitu cys 101 kohta, sen jälkeen fragmentit ligoidaan antamaan 10 kahdesti mutatoitu vaippaproteiini cDNA. Kahdesti mutatoidulle cDNA:lle voidaan sitten tehdä kohdennettu mutageneesi käyttämällä standardimenetelmiä viemään kys-teiinijäännös β-hiusneula-alueelle.
Sisääntuotuun kysteiinijäännökseen, joka on välikappaleosan välityksellä tai ilman, voi olla lisäksi liittynyt toivottu molekyylilaji, joka on tarkoitus liittää. Esimerkkejä 15 sellaisista lajeista ovat epitoopit, joita on kuvattu samanaikaisesti haetussa hakemuksessa nro. 920 1372.1, so. 9-meeri-peptidisekvenssi, joka on johdettu ihmisen patogeenisen influenssaviruksen hemagglutiniinista (tai hemagglutiniiniosasta, jossa on epitooppi) tai IgE dekapeptidi, joka on siinä kuvattu (joka on myös kuvattu ja josta on patenttivaatimukset kansainvälisessä patenttihakemusjulkaisussa nro. WO90/15878). 20 Muihin vaihtoehtoisiin lajeihin, jotka voivat olla liittyneet kysteiinijäännökseen, kuu-. luu suu- ja sorkkatautivirus (FMDV) VP 1, luteinisoivan hormonin vapautumista sääte levä hormoni (LHRH) ja HIV gpl60- ja 120-proteiinit ja entsyymit, kuten piparjuuri- '/·. peroksidaasi.
· · .: Keksintö ulottuu myös sen vuoksi kimeerisiin proteiineihin, jotka koostuvat sellaisesta : : 25 vieraasta molekyylilajista ja mahdollisesti välikkeestä, joka on liittynyt kysteiini jäännökseen vaippaproteiinin β-hiusneula-alueella. On ymmärrettävää, että vieraat ',· molekyylilajit ja mahdollisesti välikkeet saattavat olla liittyneet kysteiinijäännökseen •. ennen kapsidin kokoamista tai sen jälkeen. Keksintö ulottuu lisäksi keksinnön kimee- risten proteiinien kapsidien kokoonpanoihin. On havaittu, että sellaisia kapsideja voi-• : 30 daan ekspressoida K colissa "faagi tyhjinä" ilman elävän viruksen RNA:ta. Sekoitettu- ... · jen kapsidikokoonpanojen luomista tarkastellaan, esimerkiksi ennen in vivo -koottujen . näytteiden purkamista, minkä jälkeen seos kootaan uudestaan.
Keksinnön mukaisia kimeerisiä proteiineja voidaan käyttää kohdentamaan, esimerkiksi lisäämällä galaktoosijäännöstä, joka ohjaisi kapsidin olemaan vuorovaikutuksessa 35 spesifisten solupinnan reseptorien kanssa. Sellainen kohdennustekniikka saattaa olla 5 110613 hyödyllinen kuljetettaessa vieraita osia spesifisiin soluihin ja pois. Vieraita osia voidaan pitää aluksi kapseloituneena vaippaproteiinikapsideihin, kuten on kuvattu GB-hakemuksessamme 2 268 492, joka on jätetty samanaikaisesti tämän kanssa. Sellaisiin vieraisiin molekyyleihin saattaa kuulua geenit, ribotsyymit tai anti-sense-lähetit.
5 On ymmärrettävää, että on lukuisia etuja käyttää MS-2:ta ja sen kaltaisia faageja kan-tajasysteeminä. Täten tyhjiä vaippaproteiinikapsideja voidaan helposti ekspressoida suhteellisen suurella saannolla E. colissa. tuote on helppo puhdistaa ja on havaittu, että kootut kapsidit osoittavat melkoista stabiiliutta suhteessa lämpötila-alueisiin, pH:hon ja ionivahvuuteen. Samalla kun toivotaan, ettei ole sitouduttu mihinkään erityiseen 10 teoriaan, pidetään selviönä, että keksintö sallii myös esittää molekyylilajeja, kuten epi-toopit säännöllisessä järjestyksessä kantajakapsidien pinnalla, edeltä määrätyissä kohdissa, jotka maksimoivat immuunitunnistamisen, mikä nojaa vasta-ainemolekyylien monihampaiseen luonteeseen. Syntyy myös mahdollisuus ylläpitää epitoopin tai muun lajin, joka on tuotu sisään, kolmiulotteinen rakenne.
15 Uskotaan, että MS-2-systeemillä on merkittävä potentiaalinen hyöty esittämään vieraita molekyylilajeja pyöreän bakteerifaagin pinnalla. Systeemillä on lukuisia etuja verrattuna filamenttisiin bakteriofaagivaihtoehtoihin. MS-2 vaippaproteiini kykenee sujuvaan itsekokoamiseen nukleiinihapon puuttuessa toisin kuin filamenttiset faagit, joissa kokoaminen on samanaikaista nukleiinihapon kapseloinnin kanssa. Lisäksi filamentti-20 sen vaippaproteiinin täytyy läpikäydä translaation jälkeinen prosessointi ja membraa-: \ nin insertio ennenkuin kokoaminen tapahtuu, kun taas MS-2-proteiinia ei prosessoida.
MS-2-systeemillä on myös etuna yksityiskohtainen molekyylimalh vaippaproteiinille . ’ ! sallien vieraan peptidi-insertion vaikutukset mallitettavan.
• · • · · • ’.: Seuraava spesifinen kuvaus valaisee keksintöä esimerkin vuoksi.
25 A) Yksittäisen mutantti MS-2:n vaippaproteiinigeenien eristys » · :‘ : Käytettiin kohdennettua mutageneesiä ja standarditeknfikoita tuottamaan aminohap- ‘ ’ * ]: pomutantteja vaippaproteiinin asemiin 46 ja 101.
·*.: · Mutantit valittiin siten, että niillä oli joko kysteiini asemassa 46 substituoitu seriinillä :: tai kysteiini asemassa 101 substituoitu seriinillä.
: ’* 30 Jokaista yksittäistä mutantti-DNA:ta ekspressoitiin R cohssa osoittamaan itseko- koamiskyky.
6 110613 B) Kahdesti mutatoidun cDNA:n valmistus
Ser 46 yksittäinen mutantti vaiheesta A) vietiin standardiin vaippaproteiinin ekspres-siovektoriin pTAC-CP ja pilkottiin Sad- ia Xbal-restriktioentsvvmeillä ia siten saatua pidempää tukifragmenttia käsiteltiin vasikan suolen fosfataasilla ja sitten puhdistettiin 5 agaroosi- tai polyakryyliamidigeeleissä ennen elektroeluaatiota ja saostamista.
Ser 101 mutanttia vaiheesta A) käsiteltiin samoin jättämällä pois fosfataasikäsittely. Pienempi fragmentti, jossa oli C-terminaalinen osa vaippaproteiinigeeniä, puhdistettiin geelielektroforeesilla.
Suuri fragmentti, jossa oli mutatoitu cys 46-kohta ja pieni fragmentti, jossa oli muta-10 toitu 101-kohta, ligoitiin standardimenetelmin. Täten saadut rekombinanttimolekyylit käytettiin transformoimaan R coli TG1 ampisilhiniresistenssiksi ja positiivisista pesäkkeistä tarkistettiin kaksoismutaatio DNA-sekvenssoinnilla.
C) Kysteiini-jäännöksen tuominen
Kaksoismutatoitu ser 46/101 vaippaproteiini cDNA vaiheesta B vietiin M 13 sekvens-15 sointivektoriin standardeilla subkloonausmenetelmillä, luotiin yksijuosteinen mallisäie kohdennettua mutageneesiä varten ja kysteiinijäännös vietiin gly 14:ta käyttämällä kaupalhsesti saatavilla olevaa kohdennetun mutageneesin protokollaa, joka perustui nukleotidifosfotioaatteihin. Tällöin saatiin mutatoitu cys 14 ser 46/101 vaippaproteii-ni-cDNA.
20 D) Proteiinin tuotto ja puhdistus *: Eristetty, mutatoitu cDNA ekspressoitiin E, colissa. jotta varmistettiin rekombinantti- proteiinin kapsidin muodostamiskyky. Edellä olleen C):n cys 114 ser 46/101 vaippa-proteiini-cDNA vietiin ekspressiovektoriin pTAC-CP ja siitä seurannutta plasmidia . käytettiin transformoimaan E, coli-kanta TG1 ampisilhiniresistenssiksi. Kimeerisiä ;., * 25 proteiineja ekspressoitiin seuraavan menetelmän mukaisesti.
: , ·, 5 x 5 ml (2TY-alustat, jossa oli 100 pg/ml ampisilliinia) viljelmiä yksittäispesäkkeistä, -·* jotka oli poimittu transformaatiomaljoilta, kasvatettiin noin 4 h 37 °C:ssa ja käytettiin sitten ymppäämään 5 x 500 ml 2TY-pullot + ampisilliini ja viljelmiä kasvatettiin I ’·· 30 °C:ssa. Kun viljelmät saavuttivat OD6oo noin 0,45, indusoitui proteiinituotanto li- 30 säämällä 1 mM i sopropyyli- β -D-tiogal ak tosi di a (IPTG). Solut, jotka olivat kasvaneet yön yli, sentrifugoitiin 3 k rpm, 30 min, 4 °C Beckman JA14-roottorissa.
7 110613
Saadut pelletit suspendoitiin uudestaan 50 mM Hepesiiin, 100 mM NaCl:iin, 10 mM ditiotreitoliin (DTT), 5 mM EDTA:han ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridiin (PMSF) ja solut lyysattiin sonikoimalla. Solulysaattia sentrifugoitiin sitten 15k, 20 min, 4 °C Beckman JA20 -roottorissa ja supematantti ajettiin NAP-25-pylvään läpi 5 (Pharmacia) vaihtamaan puskurit 20 mM NaPi:hen (natriumfosfaattiperusteinen puskuri) pH 7,0. Kerättiin 1 ml fraktiot NAP-pylväästä, lisättiin MS-2 vaippaproteiinia sisältävät fraktiot (nro 2-5 mukaan luettuina) anti-MS-2 vaippaproteiini immunoaffini-teettipylvääseen ja näytteen annettiin sitoutua 1 h huoneenlämpötilassa kevyesti ravistellen.
10 Pylväs pestiin 20 mM:lla NaPi:llä, pH 7, sitten 10 mM NaPi/100 mM NaCl, pH 7. Näyte eluoitiin 20 ml:lla 20 mM etikkahappo/200 mM NaCl, noin pH 2,7 ja 4 ensimmäistä ml:aa kerättiin.
pH säädettiin välittömästi titraamalla 1 M Tris.HCkllä, pH 9, pH:hon 7-7,4 ja seos sentrifugoitiin 30 k rpm, 4 °C yön yli (noin 15 h) käyttämällä Beckman SW.55Ti-15 roottoria. Supematantti heitettiin pois ja MS-2-proteiinipelletti suspendoitiin uudestaan pieneen tilavuuteen vaadittua puskuria.
Saatiin homogeenisiä cys-14-modifiotuja kapsideja, joista testattiin niiden kyky reagoida aktivoidun galaktoosireagenssin kanssa, kuten jäljempänä E):ssä kuvattiin.
SDS-PAGE saaduista immunoaffiniteettipuhdistetuista cys-14-modifioiduista kapsi-20 deista osoitti olennaisesti yksittäisen komponentin, jolla oli odotettu molekyylipaino. ,' Tulos nähdään kuviossa 1, jossa linja a) osoittaa cys-14-modifioidut kapsidit, linjat b) ja c) osoittavat villityypin kapsidit, jotka on puhdistettu vastaavasti inununoaffinitee-': tiliä ja sakkaroositiheyspuhdistetut ja linja d) antaa molekyylipainostandardit.
Kuvio 2 osoittaa elektromikrokuvan immunoaffmiteettipuhdistetuista cys-14-25 modifioiduista kapsideista osoittaen koottujen partikkeleiden läsnäolon, jotka ovat sa- . ·: manlaisia kuin ne, joita villityypin vaippaproteiinit tuottavat.
« E) Cys-14-modifioidun proteiinin reaktio aktivoidun galaktoosin kanssa * « » ·
Jotta testataan cys-14-modifioitujen MS-2-kapsidien reaktiivisuus, valmistettiin halo-geeniaktivoitu galaktoosireagenssi seuraavasti: ‘: 30 Sekoitettuun p-aminofenyyli-p-D-galaktopyranosidin (0,54 g; 2 mmol) vedessä (4 ml) ja etanolin (6 ml) liuokseen lisättiin jodiasetanhydridiä (0,9 g; 2,5 mmol) huoneenlämpötilassa. 2 h kuluttua reaktio konsentroitiin kuiviin ja jäännös pestiin eetterillä (2 x 8 110613 10 ml). Etanolista kiteyttäminen antoi tuotteen neulasina (0,7 g; 80 %), sp. 158-160 °C.
Cys-14-modifioitujen kapsidien reaktio aktivoidun galaktoosin kanssa määritettiin käyttämällä Ellmanin reagenssia (ditionitrobentsoaatti, DTNB), joka antaa luonteen-5 omaisen absorption OD4i2:ssa reaktiossa vapaiden -SH-ryhmien kanssa. Kuvio 3 osoittaa kontrollikäyrän vapaan kysteiinin reaktiolle DTNB:n kanssa. Kontrollikäyrä saatiin käyttämällä: 100 μΐ näyte.
100 μΐ DTNB 4 mg/ml 100 mM:ssaNa2HP04 pH 8 ("puskuri 1").
10 5 ml "puskuri 1".
Seos jätettiin huoneenlämpötilaan 15 minuutiksi sen jälkeen, kun oli lisätty DTNB.tä ja sitten OD412 tallennettiin.
Kuvio 4 osoittaa käyrän, joka saatiin kun kysteiini (4 mM) sekoitettiin 1-10 mM kanssa aktivoitua galaktoosia ja jätettiin seisomaan huoneenlämpötilaan 1 tunniksi, minkä 15 jälkeen määritettiin 100 μΐ erät, kuten edellä kuvattiin käyttämällä DTNB:tä.
Cys-14-modifioidun kapsidiproteiinin annettiin reagoida DTNB:n kanssa seuraavasti:
Puhdistetut cys-14-modifioidut kapsidit suspendoitiin uudestaan puskuriin 1, jossa oli 1 mM EDTA siten, että lopullinen konsentraatio oli 400 μg/ml. Tehtiin seuraavat yksittäiset kokeet.
: /: 20 1) 100 μΐ proteiininäyte, 100 μΐ 5 mM aktivoitu galaktoosi.
: ‘: 2) 100 μΐ proteiininäyte, 90 μΐ puskuri 1, 10 μΐ 5 mM aktivoitu galaktoosi.
; ‘: 3) 100 μΐ proteiininäyte, 100 μΐ puskuri 1.
Jokainen jätettiin sekoittumaan huoneenlämpötilaan 1 h ennen kuin lisättiin 200 μΐ DTNB:tä 4 mg/ml etanolissa sekoittuvaan liuokseen. OD4i2 tallennettiin 15 min kulut-..25 tua ja tulokset nähdään taulukossa 1. Vapaiden tiolien määrä väheni lisääntyneen ga-: laktoosireagenssille altistumisen mukana, varmistaen että cys-14-kapsidit on deriva- , · >, tisoitu galaktoosilla.
9 110613
Taulukko 1 Näyte OD^nm
Puskuri sokea koe 0,0 1) 100 μΐ MS2-cys; 100 μΐ gal 0,031 5 2) 100 μΐ MS2-cys; 90 μΐ puskuri; 10 μΐ gal 0,080 3) 100 μΐ MS2-cys; 100 μΐ puskuri 0,118 F) Cys-14-modifioidun vaippaproteiinin liittäminen immunogeeniseen proteiiniin
Puhdistettu cys-14-modifioidut kapsidit liitettiin, kuten jäljempänä on kuvattu, HA10:een, 10-meeri peptidisekvenssi käsittää nonapeptidiepitoopin, joka on johdettu 10 ihmisen patogeenistä influenssaviruksen hemagglutiniinista ja jossa on N-terminaa-linen kysteiinijäännösjatkos, mikä 9-meerisekvenssi YPYDVPDYA, jonka Wilson et al.„ Molecular and Cell Biology, May 1988, 2159-2165 ja Cell, 37, 1984, 767-778, ovat tunnistaneet sisältävän yhden antigeenisen determinantin. Menetelmään sisältyi ensimmäinen ristiinliittämisvaihe muodostamaan disulfidiliitos, joka sitten hapetettiin.
15 Seuraavia reagensseja käytettiin tekemään neljä testireaktioseosta.
2 μg cys-14-modifioidut kapsidit (noin 3 μ!) ("cys-silta") 1 μΐ 1 M Tris.HCl pH 8, 10 mM EDTA ("puskuri 2") 17 μg HA9 peptidi (noin 2 μΐ) ("peptidi") 1 μΐ 2-merkaptoetanoli ("βΜΕ") ’ ;' 20 Valmistettiin seuraavat 4 testiseosta, jokaisessa tapauksessa täytettiin 10 pl:ksi vedel- : lä: t * t • . : ’; 1) cys-silta + puskuri 2 + βΜΕ 2) cys-silta + puskuri 2 •, ; 3) cys-silta + puskuri 2 + βΜΕ + peptidi > ♦ » !.. ‘ 25 4) cys-silta + puskuri 2 + peptidi : Seoksia inkuboitiin 1 h huoneenlämpötilassa. Sitten siihen lisättiin 1 μΐ 0,37 M natri- . · · *, umtetrationaatin ja 1,6 M natriumsulfiitin seosta (joka oli juuri valmistettu Morehead et ai., menetelmän mukaisesti, Biochem., 23, 1984, 2500). Seokset jätettiin yön yli : · · huoneenlämpötilaan. 1
Seokset analysoitiin käyttämällä PAGE Schägger -systeemiä (Schägger et ai., 1987, Anal. Biochem., 166, 368-379), blotattiin nitroselluloosapaperille käyttämälä Bio-Rad 10 110613
Western -blottauslaitetta, siirtopuskurina 39 tnM glysiiniä, 48 mM Trisiä, 0,1 % (w/v) natriumdodekyylisulfaattia (SDS) ja 20 % metanolia 1 h siirtoajalle 450 mA:ssa.
Blotit pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) pH 7,6, jossa oli Tween 20:tä (polyoksietyleenisorbitaanimonolauraattia - 3 ml/1 PBS:ää) tasapainottamaan.
5 Sitten niitä inkuboitiin 1 h 37 °C:ssa 35 ml:n kanssa PBS-Tween + 0,5 % (w/v) naudan seerumialbumiinia (BSA), pestiin 6x5 min 200 ml:lla PBS-Tweeniä ja sen jälkeen inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa 35 ml:n kanssa PBS-Tween + 0,5 % (w/v) BSA yhdessä 100 μ1:η kanssa hiiren anti-HA9-monoklonaalista vasta-ainetta (saatu Balcore Co., Berkley, USA). Sitten seurasi pesu PBS-Tween (6x5 min - 200 ml) ja 0,5 h in-10 kubaatio 35 ml:n kanssa PBS-Tween + 0,5 % (w/v) BSA yhdessä 50 μ1:η kanssa vuohen anti-hiiri-IgG-piparjuuriperoksidaasi (HRP) -konjugaattia. Lisäpesun jälkeen (6 x 6 min - 200 ml PBS-Tween), geeli viritettiin luminol Western blotting -reagensseilla (Amersham) ja tehtiin näkyväksi.
Tulokset osoittivat, että vain yksittäinen juova linjassa vastaten näytenumeroa 4 reagoi 15 ristiin anti-HA9-vasta-aineen kanssa. Tämä on odotettu tulos, näytteiden 1-3 ollessa negatiivisia kontrolleja. Täten on mahdollista kytkeä lineaariset peptidifragmentit cys-14-kapsideihin käyttämällä näitä menetelmiä.
G) Cys-14-modifioidun vaippaproteiinin kovalenttinen ristiinsitoutuminen entsyymiin •, 20 Puhdistetut cys- 14-modifioidut kapsidit, jotka on kuvattu edellä E):ssä, liitettiin kova- ;' ·, lenttisesti maleimidiryhmän kautta piparjuuriperoksidaasi-entsyymiin (HPR) seuraa- « 1 j! V vasti: i · » » v ’ Käytettiin HPR-maleimidikonjugaattia (Pierce Europa BV, Hollanti), cys-14- modifioituja kapsideja ja PME:tä tekemään seuraavat seokset, joista jokainen täytettiin : , 25 100 piiksi 100 mM:lla NaPidlä, pH 7,2: 1) 20 pg HPR-maleimidi + 1 μΐ βΜΕ 2) 20 pg cys- 14-modifioidut kapsidit + 1 pl βΜΕ ·; ‘: 3) 20 pg cys- 14-modifioidut kapsidit + 20 pg HRP-maleimidi Näyte 3) jätettiin 1 h:ksi huoneenlämpötilaan ja sitten lisättiin βΜΕ^ sammuttamaan ‘: 30 kaikki jäljellä olevat tiolit. Näytteet 1-3 fraktioitiin sitten HPLC-geelisuodatus- kromatografialla PW 3000:ssa, 2 x 30 cm pylväät, 100 mM.ssa NaPi.ssä, pH 7,2, 0,5 ml/min virtausnopeudella. Eluaatin fraktioista (1 min - 0,5 ml) määritettiin sitten 11 110613 HRP-aktiivisuus käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa testipakkausta (ABTS-reagenssi, Pierce), entsyymiaktiivisuuden ollessa arvioitu havaitsemalla liuosten kohonnut absorbanssi 410 nm:ssä. Tiedot osoittivat merkittävää lisääntymistä verrattuna taustatasoihin fraktioissa, jotka vastasivat näytteen 3 cys-14 kootun materiaalin OD28o 5 piikkiä.
i > i « » i » I » > » I » I » f ! I 4 4 » » t i * » ί · * 4 » *
» · I
Claims (13)
1. Modifierad variant av membranproteinet hos en bakteriofag vald ur gruppen in-nefattande MS-2 och besläktade fager inklusive Rl7, fr, GA, QB och SP, vilken modifierats genom att cysteinrestema avlägsnats frän ställen i membranproteinet • · som befinner sig extemt tili N-ändens utskjutande β-hämäl av sammansatt kapsid ·, ” 20 och insertion av en cysteinrest i en regionmotsvarande N-ändens utskjutande β- hämäl. • t at·
1. Bakteriofagin kalvoproteiinin modifioitu muoto, joka bakteriofagi on valittu ryhmästä käsittäen MS-2:n ja sen sukulais-faagit mukaan luettuina Rl 7, fr, GA, QB ja SP, jota on modifioitu poistamalla kysteiinitähteet kalvoproteiinin paikoista, jotka si- 5 järisevät koostuneen kapsidin N-terminaalisen ulkonevan β-hiusneulan ulkopuolella, ja insertoimalla kysteiinitähde alueelle, joka vastaa N-terminaalista ulkonevaa β-hiusneulaa.
2. Modifierat protein enligt patentkrav 1, kännetecknat av att en inserterad cys- • a . ·: *. teinrest ersätter restema 13 och 14 av membranproteinet.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, että insertoi-tu kysteiinitähde korvaa kalvoproteiinin 13-ja 14-tähteet.
3. Modifierat protein enligt patentkrav 2, kännetecknat av att en inserterad cys- :. ’1: 25 teinrest ersätter glycin 14. • · · • a
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, että insertoi- tu kysteiinitähde korvaa glysiini 14:n.
4. Modifierat protein enligt patentkrav 1, kännetecknat av att de utatriktade cys- f * a ';I;* teinema i β-hämälen ersatts med serin. .' 5. Modifierat protein enligt patentkrav 1, 2, 3 eller 4, kännetecknat av att en in- . . serterad cysteinrest är direkt eller indirekt fogad tili en ffämmande molekylart. • · • »
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, että β-hiusneulassa ulospäin olevat kysteiinit on korvattu seriinillä.
5. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3 tai 4 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, et-15 tä insertoitu kysteiinitähde on liitetty suoraan tai epäsuoraan vieraaseen molekyylila- jiin.
6. Modifierat protein enligt patentkrav 5, kännetecknat av att en inserterad cys teinrest fogats tili den främmande molekylarten med hjälp av en mellanrest. 14 110613
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, että insertoi- * * tu kysteiinitähde on riitetty vieraaseen molekyylilajiin väliketähteen avulla. .·. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, että välike- 20 tähde on johdettu bifunktionaalisesta ristiinsidontareagenssistä, joka on valittu m-ma- I t V leimidobentsoyyh-N-hydroksisulfosukkiini-imidiesteristä, N-sukkiini-imidyyli-(4- ..! jodiasetyylij-aminobentsoaatista ja N-sukkiini-imidyyli-3-(2-pyridyylitio)-propionaa- • ’ tista.
7. Modifierat protein enligt patentkrav 6, kännetecknat av att mellanresten här-letts ur en bifunktionell korsbindningsreagens vald bland m-maleimidobensoyl-N-hydrosulfosuccinimidester, N-succinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobensoat och N-suc-cinimidyl-3-(2-pyridyltio)-propionat.
8. Modifierat protein enligt vilket som heist av patentkrav 1-7, kännetecknat av att en inserterad cysteinrest är direkt eller indirekt fogad till antigenprotein.
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu 25 siitä, että insertoitu kysteiinitähde on liitetty suoraan tai epäsuoraan antigeeniproteii- . ‘. niin.
9. Modifierat protein enligt vilket som heist av patentkrav 1-7, kännetecknat av att en inserterad cysteinrest är direkt eller inderekt fogad till en malrest.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu .. siitä, että insertoitu kysteiinitähde on liitetty suoraan tai epäsuoraan kohdetähteeseen.
10. Modifierat protein enligt patentkrav 9, kännetecknat av att mälresten innehäl-10 lergalaktos.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen modifioitu proteiini, tunnettu siitä, että kohde- 30 tähde sisältää galaktoosia. i3 110613
11. Kapsidema, som innehäller modifierat protein enligt vilket som heist av föregä-ende patentkrav eller en blandning av dylika proteiner.
11. Kapsidit, jotka sisältävät minkä tahansa edellä olleen patenttivaatimuksen mukaista modifioitua proteiinia tai sellaisten proteiinien seosta.
12. Förfarande för framställning av modifierat protein enligt vilket som heist av de föregäende patentkraven och som innefattar framställning av tvä enskilda mutanter 15 av fagmembranproteinet, en mutant för att avlägsna cysteinrest 46, och en mutant för att avlägsna cysteinrest 101, de ekvivalenta cDNA spjälks och ligeras pä nytt för att ge dubbelmutaterat membranprotein DNA och genom att underkasta dubbelmu-taterad cDNA för riktad mutagenes genom att föra cysteinresten tili ett omräde som motsvarar N-ändens utskjutande β-hämäl och genom att uttrycka ätervunnet cDNA, , 20 för att erhälla ett modifierat protein.
12. Menetelmä, jolla valmistetaan minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukaista modifioitua proteiinia ja johon sisältyy, että valmistetaan faagikalvoproteiinin 5 kaksi yksittäistä mutanttia, yksi mutatoitu poistamaan kysteiini 46 -jäännös ja yksi mutatoitu poistamaan kysteiini 101 -jäännös, pilkotaan ja ligoidaan uudestaan vastaavat cDNA:t antamaan kaksoismutatoitua kalvoproteiini cDNA:ta ja alistamalla kaksoismutatoitu cDNA kohdistetulle mutageneesille viemään kysteiinijäännös alueelle, joka vastaa N-terminaalista ulkonevaa β-hiusneulaa ja ekspressoimalla saatua 10 cDNA:ta, jotta saadaan modifioitu proteiini.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ekspressio suoritetaan E colissa.
14. Ekspressiovektori, joka koostuu DNArsta, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaista modifoitua proteiinia.
15 Patentkrav
13. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att expressionen genomförs i ‘: E.coli. 1 Expressionsvektor, som bestar av DNA, som kodar modifierat protein enligt vilket som heist av patentkraven 1-4.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB919114003A GB9114003D0 (en) | 1991-06-28 | 1991-06-28 | Chimaeric protein |
| GB9114003 | 1991-06-28 | ||
| PCT/GB1992/001159 WO1993000434A1 (en) | 1991-06-28 | 1992-06-26 | Capsid forming and cystein modified chimaeric ms2-coat protein |
| GB9201159 | 1992-06-26 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI935877A0 FI935877A0 (fi) | 1993-12-27 |
| FI935877L FI935877L (fi) | 1993-12-27 |
| FI110613B true FI110613B (fi) | 2003-02-28 |
Family
ID=10697502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI935877A FI110613B (fi) | 1991-06-28 | 1993-12-27 | Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5698424A (fi) |
| EP (1) | EP0591369B1 (fi) |
| JP (1) | JP3514755B2 (fi) |
| KR (1) | KR100222163B1 (fi) |
| AT (1) | ATE205880T1 (fi) |
| AU (1) | AU657560B2 (fi) |
| CA (1) | CA2111683A1 (fi) |
| DE (1) | DE69232069T2 (fi) |
| FI (1) | FI110613B (fi) |
| GB (2) | GB9114003D0 (fi) |
| IE (1) | IE922085A1 (fi) |
| NO (1) | NO315050B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ243330A (fi) |
| WO (1) | WO1993000434A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA924774B (fi) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9213601D0 (en) * | 1992-06-26 | 1992-08-12 | Mastico Robert A | Protein based delivery system |
| DE19618797C2 (de) * | 1996-05-10 | 2000-03-23 | Bertling Wolf | Vehikel zum Transport molekularer Substanz |
| AU770802B2 (en) * | 1998-10-21 | 2004-03-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Virus-like particles for the induction of autoantibodies |
| CN1193791C (zh) * | 1998-11-30 | 2005-03-23 | 希托斯生物技术股份公司 | 抗原的有序分子呈递,制备及使用的方法 |
| DE19916224C1 (de) | 1999-04-10 | 2000-06-21 | November Ag Molekulare Medizin | Synthetisches biologisch aktives Molekül |
| AU781396B2 (en) * | 1999-07-20 | 2005-05-19 | Morphosys Ag | Novel methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds |
| WO2001085208A2 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays and vaccines |
| US7094409B2 (en) * | 2001-01-19 | 2006-08-22 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases |
| AU2007202761B2 (en) * | 2001-01-19 | 2010-01-21 | Kuros Biosciences Ag | Molecular antigen array |
| RU2294211C2 (ru) * | 2001-01-19 | 2007-02-27 | Цитос Байотекнолоджи Аг | Композиция и способ для иммунизации, способ продуцирования неприродного, упорядоченного и повторяющегося массива антигенов |
| US7320793B2 (en) * | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| US7128911B2 (en) * | 2001-01-19 | 2006-10-31 | Cytos Biotechnology Ag | Antigen arrays for treatment of bone disease |
| AU2002347404A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-04-01 | Cytos Biotechnology Ag | In vivo activation of antigen presenting cells for enhancement of immune responses induced by virus like particles |
| DE60234375D1 (de) | 2001-09-14 | 2009-12-24 | Cytos Biotechnology Ag | VERPACKUNG VON IMMUNSTIMULIERENDEM CpG IN VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN: HERSTELLUNGSVERFAHREN UND VERWENDUNG |
| MXPA04002644A (es) | 2001-10-05 | 2004-07-08 | Cytos Biotechnology Ag | Conjugados que portan un peptido de angiotensina y usos de los mismos. |
| US7115266B2 (en) * | 2001-10-05 | 2006-10-03 | Cytos Biotechnology Ag | Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof |
| JP4658475B2 (ja) * | 2001-11-07 | 2011-03-23 | サイトス バイオテクノロジー アーゲー | 骨疾患治療用の抗原アレイ |
| US20030219459A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-11-27 | Cytos Biotechnology Ag | Prion protein carrier-conjugates |
| PL375306A1 (en) * | 2002-06-20 | 2005-11-28 | Cytos Biotechnology Ag | Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use |
| AU2003246690B2 (en) | 2002-07-17 | 2010-03-11 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein |
| NZ537003A (en) | 2002-07-18 | 2008-03-28 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
| EP1524994B1 (en) * | 2002-07-19 | 2011-04-27 | Cytos Biotechnology AG | Vaccine compositions containing amyloid beta1-6 antigen arrays |
| JP5022028B2 (ja) * | 2003-03-26 | 2012-09-12 | サイトス・バイオテクノロジー・アクチェンゲゼルシャフト | メラン−ａペプチドアナログ−ウイルス様粒子コンジュゲート |
| US20060210588A1 (en) * | 2003-03-26 | 2006-09-21 | Cytos Biotechnology Ag | Hiv-peptide-carrier-conjugates |
| US7537767B2 (en) * | 2003-03-26 | 2009-05-26 | Cytis Biotechnology Ag | Melan-A- carrier conjugates |
| KR20060128924A (ko) * | 2004-01-20 | 2006-12-14 | 사이토스 바이오테크놀로지 아게 | 그레린-담체 접합체 |
| US20070248617A1 (en) * | 2004-06-02 | 2007-10-25 | Bachmann Martin F | Medical Uses of Carrier Conjugates of Non-Human Tnf -Peptides |
| WO2006037787A2 (en) * | 2004-10-05 | 2006-04-13 | Cytos Biotechnology Ag | Vlp-antigen conjugates and their uses as vaccines |
| WO2006045796A2 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-04 | Cytos Biotechnology Ag | Gastric inhibitory polypeptide (gip) antigen arrays and uses thereof |
| GB0424563D0 (en) | 2004-11-05 | 2004-12-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
| WO2006095345A2 (en) * | 2005-03-08 | 2006-09-14 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Targeted drug-carrying bacteriophages |
| US7767212B2 (en) * | 2005-03-18 | 2010-08-03 | Cytos Biotechnology Ag | CAT allergen conjugates and uses thereof |
| AU2006298767B2 (en) | 2005-09-28 | 2013-01-10 | Cytos Biotechnology Ag | Interleukin-1 conjugates and uses thereof |
| US20070184068A1 (en) | 2005-12-14 | 2007-08-09 | Cytos Biotechnology Ag | Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity |
| CN101466720B (zh) | 2006-06-12 | 2013-01-02 | 赛托斯生物技术公司 | 向rna噬菌体的病毒样颗粒内包装寡核苷酸的方法 |
| EP2190987B1 (en) * | 2007-08-21 | 2012-11-14 | MorphoSys AG | Methods for the formation of disulphide bonds |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9101550D0 (en) * | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
-
1991
- 1991-06-28 GB GB919114003A patent/GB9114003D0/en active Pending
-
1992
- 1992-06-26 ZA ZA924774A patent/ZA924774B/xx unknown
- 1992-06-26 GB GB9213644A patent/GB2257431B/en not_active Revoked
- 1992-06-26 WO PCT/GB1992/001159 patent/WO1993000434A1/en not_active Ceased
- 1992-06-26 US US08/167,982 patent/US5698424A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-26 JP JP50123093A patent/JP3514755B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-26 DE DE69232069T patent/DE69232069T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-26 CA CA002111683A patent/CA2111683A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-26 KR KR1019930703986A patent/KR100222163B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1992-06-26 NZ NZ243330A patent/NZ243330A/en unknown
- 1992-06-26 AU AU21955/92A patent/AU657560B2/en not_active Ceased
- 1992-06-26 AT AT92913894T patent/ATE205880T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-06-26 EP EP92913894A patent/EP0591369B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-01 IE IE208592A patent/IE922085A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-12-27 NO NO19934842A patent/NO315050B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-12-27 FI FI935877A patent/FI110613B/fi active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100222163B1 (ko) | 1999-10-01 |
| CA2111683A1 (en) | 1993-01-07 |
| JP3514755B2 (ja) | 2004-03-31 |
| GB2257431A (en) | 1993-01-13 |
| DE69232069T2 (de) | 2002-01-31 |
| US5698424A (en) | 1997-12-16 |
| ZA924774B (en) | 1993-04-22 |
| FI935877A0 (fi) | 1993-12-27 |
| GB9114003D0 (en) | 1991-08-14 |
| KR940701447A (ko) | 1994-05-28 |
| ATE205880T1 (de) | 2001-10-15 |
| NO934842D0 (no) | 1993-12-27 |
| DE69232069D1 (de) | 2001-10-25 |
| NZ243330A (en) | 1994-06-27 |
| EP0591369B1 (en) | 2001-09-19 |
| AU2195592A (en) | 1993-01-25 |
| AU657560B2 (en) | 1995-03-16 |
| GB2257431B (en) | 1995-04-19 |
| WO1993000434A1 (en) | 1993-01-07 |
| NO934842L (no) | 1994-02-28 |
| GB9213644D0 (en) | 1992-08-12 |
| IE922085A1 (en) | 1992-12-30 |
| JPH06509223A (ja) | 1994-10-20 |
| FI935877L (fi) | 1993-12-27 |
| NO315050B1 (no) | 2003-06-30 |
| EP0591369A1 (en) | 1994-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI110613B (fi) | Kapsidia muodostava ja kysteiini-modifioitu kimeerinen MS2-vaippaproteiini | |
| JP3634358B2 (ja) | タンパク質に基づく輸送系 | |
| JP2974028B2 (ja) | アドヒシン抗原類 | |
| CN100435846C (zh) | 用于口蹄疫的合成肽疫苗 | |
| JP2858848B2 (ja) | Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原粒子 | |
| JPH06504907A (ja) | 抗原発現キメラタンパク質 | |
| WO1999067294A1 (en) | Antigenic complex comprising immunostimulatory peptide, cd4, and chemokine receptor domain for hiv treatment and immune disorders | |
| EA006207B1 (ru) | ИММУНОГЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ ЧАСТИЦЫ НВс, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ | |
| JP2002509700A (ja) | 戦略的修飾されたｂ型肝炎コアタンパク質及びそれらの誘導体 | |
| Lee et al. | Nanoglue: an alternative way to display cell-internalizing peptide at the spikes of hepatitis B virus core nanoparticles for cell-targeting delivery | |
| JP3764476B2 (ja) | 組合せポリペプチド抗原 | |
| JP3135060B2 (ja) | ヘモフィルスインフルエンザｂ型菌の外皮膜タンパク質Ｐ２の部分断片を用いた接合体 | |
| US5916562A (en) | Membrane proteins and peptides of haemophilus influenzae type B | |
| JPS59173084A (ja) | ポリオウイルスの免疫原性部位よりなるペプチド類及びこれらのペプチド類を暗合化するヌクレオチド配列を含有するｄｎａ類 | |
| HK1036751A (en) | Synthetic peptide vaccines for foot-and-mouth disease | |
| HK1036751B (en) | Synthetic peptide vaccines for foot-and-mouth disease | |
| JPH03503359A (ja) | 外来シグナルペプチド及び任意のトランスメンブレンアンカー配列を包含する遺伝子発現系（特にロタウイルスｖｐ７タンパク質） | |
| JPH03501684A (ja) | Ｈｉｖ抗原の製法およびその系 |