NO315050B1 - Kapsiddannende og cysteinmodifisert kim¶rt MS2-kappeprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et modifisert kappeprotein som er i stand til å danne en del av en kapsidsanvmensetning og som er særpreget ved at det omfatter kappeproteinet for fag MS-2, eller en konservativt modifisert variant derav, eller tilstrekkelig til å beholde evnen til å danne en kapsidsammensetning, hvilket kappeprotein har blitt modifisert ved fjerning av cysteinresiduene som er tilstede utvendig på den N-terminalt utstikkende p-hårnål av kappeproteinet og innsetning av et cysteinresiduum i området tilsvarende den N-terminalt utstikkende p-hårnål. Det er også beskrevet en fremgangsmåte ved fremstilling av slike proteiner, som angitt i krav 12, samt vaksinepreparat som omfatter et slikt protein eller kapsider omfattende et slikt protein.

Samtidig GB patentsøknad nr. 9201372.1 beskriver funnet av at epitopinnsetning i en identifisert klasse av viruspro-teinbærere kan bli spesifikt rettet, slik at fremmede epitoper blir pålitelig presentert på overflaten av protein-kapsidsammensetningen etter ekspresjonen av det kimære protein i en bakteriell vertsorganisme.

Det kunne på ingen måte forutsies at et slikt resultat kunne oppnås. Ikke alle virus har kappeproteiner som vil sette seg sammen av seg selv: videre er det ikke mulig å forutsi slik egensammensetning. Videre, ulikt dyrevirus kan bakterielle virus ikke naturlig ventes å ha immunodominante områder, og det er således ingen retningslinjer for hvilke områder hos et bakterielt viruskappeprotein (om noen) som kunne bli modifisert med rimelig forventning om å indusere en immunrespons .

Følgelig angår samtidig GB søknad nr. 9201372.1 et kimært protein som er i stand til å danne en del av en kapsidsammensetning og som omfatter aminosyresekvensen av kappeproteinet av fag MS-2, eller en konservativt modifisert variant derav, eller tilstrekkelig av nevnte sekvens eller variant til å opprettholde kapsiddannende egenskaper, hvilken aminosyresekvens har blitt modifisert ved innsetning av en fremmed epitop i området av proteinet som tilsvarer en N-terminal p-hårnål, som bestemt ved røntgenstrålekrystallo-grafi av hele fagpartikkelen.

Overraskende ble det funnet at et slikt kimært protein kan uttrykkes i en passende bakteriell vertsorganisme for å gi kapsider som er tomme for fag-RNA og for en stor del fri for andre nukleinsyreforurensninger.

Berzin V.M. et al. (Bioorg. Khim., vol.7, nr.6, 1981. s-482-486) har undersøkt funksjonen til kappeproteinets cystein-residier med den hensikt å finne hvilken rolle sulfhydryl gruppene har i dannelsen av et repressorkompleks mellom kappeproteinet og MS-2 fagens RNA. Kun en SH gruppe i cysteinresidie nr. 46 i kappeproteinet til fag MS-2, reagerer med disulfidreagenser slik at proteinet fullstendig mister evnen til å binde til MS-2 RNA. Både Cys-46 og Cys-101 kan modifiseres av disulfidreagenser med SH gruppen til Cys-46 reagerer først med det resultat at proteinet inakti-veres .

Selv om det er påtenkt at innsetningen av en fremmed epitop som er et lineært polypeptid med relativt kort lengde, f.eks. opptil omkring 30 aminosyreresiiduer, kan utføres, vil det bli forstått at presentasjonen av ikke-lineære epitoper ved enkel innsetning i p-hårnålen ikke kan være mulig. Således består mange epitoper ikke av enkle lineære poly-peptidfragmenter, men er dannet av flere slike fragmenter som er rommessig relatert ved den totale tredimensjonale folding av det native proteinantigen, dvs. diskontinuerlige epitoper. Det er klart ønskelig å være i stand til å presentere slike epitoper på overflaten av fagkapsidet.

Det er nå blitt funnet at kappeproteinet av MS-2 kan anvendes når det gjelder å presentere et antall epitoper eller andre molekyltyper, så som målrettende enheter, ved kapsid-overflaten ved å fjerne cysteinresiduene som forekommer ved områder inkludert i den N-terminale p-hårnål og å innføre et cysteinresiduum innenfor p-hårnål-området, hvilket cysteinresiduum da er tilgjengelig for binding med forsterkede an-tigener eller andre molekyltyper, passende via en egnet av-standgivende enhet,

Det er derfor ifølge foreliggende oppfinnelse fremskaffet et modifisert kappeprotein som er i stand til å danne en del av en kapsidsammensetning og omfattende aminosyresekvensen for kappeproteinet av fag-MS-2, eller en konservativt modifisert variant derav eller tilstrekkelig av nevnte sekvens eller variant til å opprettholde evnen til å danne en kapsidsammensetning, hvilken aminosyresekvens har blitt modifisert ved fjerning av cysteinresiduene som er tilstede eksternt på kappeproteinets N-terminalt utstikkende Q-hårnål innsetning av et cysteinresiduum inne i området som tilsvarer den N-terminalt utstikkende p-hårnål.

Cysteinresiduene som er utvendige i forhold til p-hårnålen, blir passende fjernet ved mutering ved de passende områder av kappeproteinets cDNA.

Den innsatte cystein kan bli bundet direkte til en ønsket molekyltype som skal presenteres, så som en epitop, spesielt et ikke-lineært antigent protein, eller til en annen mole-kyl type som skal presenteres, så som en målrettende enhet. Alternativt kan en avstandsgivende enhet anvendes mellom cysteinet og molekyltypen som skal presenteres, for således å utvide området av typer som kan presenteres.

Egnede avstandsgivende enheter velges fra kjente kommersielt tilgjengelige hetero-bifunksjonelle fornetningsreagenser som kobler med den eksponerte cysteintiolgruppe. Eksempler på slike kryssbindere er m-maleimidobenzoyl-N-hydroksy-sulfo-succinimidester, N-succinimidyl-{4-jodacetyl)aminobenzoat og N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)- propionat. Valget av kryssbinder vil avhenge av molekyltypen som skal presenteres samt dets størrelse. Således kan større molekyltyper kreve lengre kryssbindende enheter for å minimalisere sterisk hin-dring. Kryssbinderen kan først bli bundet til cysteinresiduet eller først til molekyltypen som skal presenteres.

Det modifiserte kappeprotein er fortrinnsvis det som er avledet fra fag MS-2, men det kan også være avledet fra be-slektede RNA-fager som er i stand til replikasjon i E.coli, så som fag R17, fr, GA, QP og SP. Slike RNA-fager med en fysisk struktur lik den for MS-2, vil inneholde en viss kjemisk variasjon i kappeproteinets aminosyreresiduer og er således konservativt modifiserte varianter av MS-2 kappeprotein. Selv om det for tiden er antatt at i hovedsak hele kappeproteinet kan være nødvendig for kapsidsammensetning, kan delesjoner og/eller innsetninger av relativt liten natur også være mulig mens den kapsiddannende evne fremdeles opp-rettholdes. Proteiner med slike modifiserte sekvenser er inkludert i oppfinnelsens omfang.

Som angitt ovenfor blir den fremmede enhet satt inn ved området hos proteinet som i det sammensatte capsid tilsvarer den N-terminale p-hårnål. Den tredimensjonale struktur av MS-2 fagpartikkelen har blitt publisert av Valegard et al., (Nature 1990, 345, 36-41). De publiserte data viser for det første at kappeproteinets struktur ikke er relatert til den-åttekjedede B-sylinder-struktur funnet i alle andre sfæriske RNA-virussubenheter hvis strukturer for tiden er kjent. For det andre, selv om kappeproteinet oppviser kvasiekvivalente inter-subenhetkontakter, er det ingen andre strukturer, så som utvidede polypeptidarmer, som hjelper til med å sikre hver proteinkonformer. Kappeproteinstrukturen kan betraktes ut fra tre atskilte områder. Disse er ikke domener i den vanlige forstand, men kan representere uavhengige foldings-enheter. Disse regioner er residuene 1-20, som danner p-hår-nålstrukturen som stikker ut fra overflaten av fagen og danner det mest fjerntliggende trekk. Dette område er fulgt av residuene 21-94, som danner fem p-kjeder innbefattende "FG-løkken", som er området for det eneste konformasjonelle hovedendring mellom kvasiekvivalente konformere. Disse p-kjeder blir så fulgt av to a-spiraler, residuene 95-125, som griper inn i hverandre for å sikre dimerer av kappeprotein-subenhetene. Valegard et al. behandler kun den fysiske struktur av MS-2-viruset og forsøker ikke å belyse virusets virkningsmåte.

Som forklart ovenfor, omfatter foreliggende oppfinnelse mo-difisering av kappeproteinets aminosyresekvens ved å innføre et cysteinresiduum i området som tilsvarer den utstikkende p-hårnål. Proteinet ifølge oppfinnelsen har følgelig blitt modifisert på en slik måte i området for aminosyreresiduene 1-20, idet en slik nummerering er under henvisning til den fullstendige kappeproteinsekvens av MS-2, som publisert av Fiers, Nature 1976, 260, 500-507. Foretrukket er modifiser-ingen for å innføre cysteinresiduet mot eller ved midten av håmålområdet. Det er foretrukket å innføre cysteinet i området for glysin 13 og 14 av kappeproteinet. Cysteinresiduene som skal fjernes, og som er utvendige i p-hårnålen, blir funnet ved posisjonene 46 og 101 De kan fjernes ved enhver passende konvensjonell genetisk manipuleringsteknikk, passende ved seterettet mutagenese.

I en foretrukket fremgangsmåte for å fjerne de uønskede cys-teinresiduer, kan to mutanter av MS-2 kappeproteinet, en enkeltmutert ved cys 46 og en enkeltmutert ved cys 101, dannes ved standard kommersielt tilgjengelige teknikker for setespesifikk mutagenese, og de tilsvarende cDNA-sekvenser kan innføres i standard ekspresjonsvektorer, hvilke vektorer blir underkastet spaltning med restriksjonsenzymer for å oppnå separat DNA-fragmentet inneholdende det muterte cys-46 -sete og det tilsvarende fragment inneholdende det muterte cys-101-sete, idet fragmentene deretter blir ligert for å gi et dobbeltmutert kappeprotein cDNA. Det dobbeltmuterte cDNA kan så bli utsatt for seterettet mutagenese ved å bruke standard metoder for å innføre et cysteinresiduum i p-hår-nålområdet.

Ytterligere kan det til det introduserte cysteinresiduum, med eller uten interplassering av en avstandsgivende enhet. bindes en ønsket molekyltype som skal presenteres. Eksempler på slike typer er epitopene beskrevet i svevende GB søknad nr. 9201372.1, dvs. en 9-mer peptidsekvens avledet fra hemagglutininet av det humane patogene influensavirus (eller en hemagglutininenhet inneholdende epitopen), eller IgE decapeptidet beskrevet deri (som også er beskrevet og krevd i WO90/15878). Ytterligere alternative typer som kan bindes til cysteinresiduet, innbefatter munn-og-klovsyke-virus (PMDV) VPi, luteiniserende hormonfrigjørende hormon (LHRH) og HIV gpl60- og 120-proteinene, samt enzymer så som pepperrot-peroksydase.

Oppfinnelsen strekker seg følgelig til modifiserte proteiner omfattende en slik fremmed molekyltype, og eventuelt en avstandsgivende gruppe bundet til et cysteinresiduum i kappeproteinets p-hårnålsområde. Det skal forstås at den fremmede molekyltype og eventuelle avstandsgivende grupper, kan bindes til cysteinresiduet før eller etter kapsid-sammensetning. Oppfinnelsen strekker seg videre til kapsidsammensetninger av de modifiserte proteiner ifølge oppfinnelsen.

Det har blitt funnet at slike kapsider kan uttrykkes i E. coli som "tomme fager" uten RNA av det levende virus. Dannelsen av blandede kapsidsammensetninger er vurdert, f.eks. ved forutgående demontering av in vivo sammensatte prøver, fulgt av ny sammensetning av en blanding. Det er meningen at slike kapsidsammensetninger f.eks. skal være i stand til å fremskaffe en blandet immunrespons og således kunne finne anvendelse som vaksiner for immunisering mot et naturlig spektrum av virale epitoper i en befolkning. Oppfinnelsen strekker seg følgelig til vaksiner omfattende ett eller flere modifiserte proteiner som definert ovenfor.

De modifiserte proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse blir vurdert for anvendelse f.eks. som vaksiner som beskrevet i samtidig GB søknad nr. 9201372.1.

I tillegg blir de påtenkt for anvendelse for målretting, f.eks. ved tilsetning av et galaktoseresiduum, hvilket ville dirigere kapsidet til å samvirke med spesifikke celloverfla-tereseptorer. Slike målrettende teknikker kan være anvende-lige ved bæring av fremmede enheter til og inn i spesifikke celler. Fremmede enheter kan i utgangspunktet holdes ved innkapsling i kappeproteinkaptidene. Slike fremmede enheter kan innbefatte gener, ribozymer, antisense meldinger eller cytotoksiske midler.

Det vil være tydelig at det er flere fordeler ved å bruke MS-2 og relaterte fager som et presentasjonssystem. Således kan de tomme kappeproteinkapsider lett bli uttrykt i relativt høyt utbytte i E. coli, idet produktet lett kan renses, og det har blitt funnet at de sammensatte kapsider viser be-traktelig stabilitet med hensyn til et område av temperatu-rer, pH og ionestyrker. Selv om det ikke ønskes å være bundet til noen spesiell teori, blir det postulert at oppfinnelsen også gjør det mulig å presentere molekyltyper, så som epitoper, i en jevn oppstilling på overflaten av bærerkap-sider ved på forhånd bestemte beliggenheter, noe som vil maksimere immungjenkjenneIse, som avhenger av antistoff-molekylenes flertannede natur. Muligheten forekommer også til å opprettholde den tredimensjonale struktur av epitopen eller andre typer som blir innført.

Det er antatt at MS-2-systemet har stor potensiell anvende-lighet for presentasjonen av fremmede molekyltyper på overflaten av en sfærisk bakteriofag. Systemet har et antall fordeler i forhold til de filamentøse bakteriofagalternati-ver. MS-2 kappeproteinet er i stand til å lette egensammensetning ved fravær av nukleinsyre, ulik de filamentøse fager hvor sammensetning er samtidig med innkapsling av nukleinsyre. Videre må det filamentøse kappeprotein undergå en posttranslasjonell behandling og membraninnsetning før sammensetning inntreffer, mens MS-2-proteinet er ubehandlet. MS-2-systemet har også fordelen av en detaljert molekylmo-dell for kappeproteinet, noe som muliggjør at effektene av fremmed peptidinnsetning kan bli modellert.

Den følgende spesielle beskrivelse illustrerer oppfinnelsen ved hjelp av eksempler.

Isolering av enkeltmutant MS-2 kappeproteingener.

Seterettet mutagenese og standard teknikker ble anvendt for å fremstille aminosyremutanter ved kappeproteinposisjoner 46 og 101.

Det ble valgt mutanter som hadde enten cystein ved posisjon 46 substituert med serin eller cystein ved posisjon 101 substituert med serin.

Hvert enkelt mutant-DNA ble uttrykt i E. coli for å vise evnen til å egensammensetning.

B) Fremstilling av dobbeltmutert cDNA.

Ser 46 enkeltmutanten fra trinn A) ble innført i standard kappeprotein ekspresjonsvektor pTAC-CP og spaltet med SacI og Xbal restriksjonsenzymer og fragmentet med den lengste stamme således fremstilt behandles med kalvetarm-fosfatase og renses deretter på agarose- eller polyakrylamidgeler før elektroeluering og utfelling.

Ser 101-mutanten fra trinn A) ble behandlet på samme måte, med utelatelse av f osf at asebehandl ingen. Det mindre fragment inneholdende den C-terminale del av kappeproteingenet, ble renset ved gelelektroforese.

Det store fragment inneholdende det muterte cys 46-sete og det lille fragment inneholdende et mutert 101-sete ble ligert ved standardmetoder. De rekombinante molekyler således fremstilt ble brukt for å transformere E. coli TG1 til ampicillin-resistens, og positive kolonier ble undersøkt for dobbelmutasjon ved DNA-sekvensering.

C) Innføring av cysteinresiduum.

Det dobbeltmuterte 46/101 kappeprotein cDNA fra trinn B) ble innført i en M 13 sekvenseringsvektor ved standard subklon-ingsmetoder, idet et enkeltkjedet templat for seterettet mutagenese dannes, og et cysteinresiduum innføres ved gly 14 ved å bruke den kommersielt tilgjengelige seterettede muta-genesefremgangsmåte basert på nukleotidfosfotioater. Det ble således dannet mutert cys 14 Ser 46/101 kappeprotein cDNA.

D) Proteinfremstilling og rensing.

Det isolerte muterte cDNA ble uttrykt i E. coli for å bekref-te den kapsid-dannende egenskap av det rekombinante protein. Cys 114 ser 46/101 kappeprotein cDNA fra C) ovenfor ble inn-ført i ekspresjonsvektoren pTAC-CP og det resulterende plas-mid ble brukt til å transformere E. coli stamme TG1 til ampi-cillinresistens. Kimære proteiner ble uttrykt i henhold til den følgende fremgangsmåte. 5 x 5 ml (2TY media med 100 ug/ml ampicillin) kulturer av enkle kolonier plukket fra transformasjonsplater ble dyrket i omkring 4 timer ved 37°C og deretter brukt til å inokulere 5 x 500 ml kolber av 2TY pluss ampicillin, og kulturene ble dyrket ved 30°C. Når kulturene nådde OD60o, ble ca. 0,45 pro-teinproduksjon indusert ved å tilsette 1 mM isopropyl-fi-D-tio-galaktosid (IPTG). Celler dyrket over natten ble så sentrifugert ved 3 komdr./min. i 30 min. ved 4°C i en Beckman JAI4-rotor.

De resulterende pelleter ble resuspendert i 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM ditiotreitol (DTT), 5 mM EDTA og 1 mM fenyl-metylsulfonylfluorid (PMSF), og cellene ble lysert med ul-tralydbehandling. Cellelysatet ble så sentrifugert ved 15k, 20 min, 4°C i en Beckman JA20-rotor, og supernatanten ble passert ned en NAP-25-kolonne (Pharmacia) for å endre buf-ferne til 20 mM NaPi (natriumfosfatbasert buffer), pH 7,0. Fraksjoner på 1 ml ble samlet opp fra NAP-kolonnen, de MS-2 kappeprotein-inneholdende fraksjoner (nr. 2 til og med 5) ble satt på en anti-MS-2 kappeprotein immunoaffinitets-kolonne og prøven fikk binde seg i 1 time ved romtemperatur med forsiktig omrøring.

Kolonnen ble vasket med 20 mM NaPi, pH 7,0, deretter med 10 mM NaPi/100 mM NaCl, pH 7,0. Prøven ble eluert med 20 ml 20 mM eddiksyre/200 mM NaCl omkring pH 2,7, og de første 4 ml ble samlet opp.

pH ble umiddelbart justert ved titrering med 1 M Tris-HCl pH 9 til pH 7-7,4, og blandingen ble sentrifugert ved 30 k omdr./min., 4°C over natten (omtrent 15 timer) ved å bruke en Beckman SW.55Ti-rotor. Supernatanten ble dekantert, og MS-2 proteinpelleten ble resuspendert i et lite volum av den nødvendige buffer.

Homogene cys 14-modifiserte kapsider ble dannet og ble un-dersøkt for sin evne til å reagere med et aktivert galaktosereagens som beskrevet i E) nedenfor.

SDS-PAGE av de resulterende immunoaffinitetsrensede cys-14-modifiserte kapsider viste i hovedsak en enkelt komponent med den ventede molekylvekt. Dette resultat er vist i figur 1, hvor spor a) viser de cys-14-modifiserte kapsider, spor

b) og c) viser villtype-kapsider som er henholdsvis immuno-af f initetsrensede og sukrosetetthetsrensede, og spor d) gir

molekylvektstandarder.

Figur 2 viser en elektromikrograf av de immunoaffinitetsrensede cys-14-modifiserte kapsider som viser tilstedeværel-se av sammensatte partikler lik dem som var dannet med villtype kappeproteiner. E) Reaksjon av cys-14-modifisert protein med aktivert galaktose.

For å undersøke reaktiviteten av de cys-14-modifiserte MS-2-kapsider ble et halogenaktivert galaktosereagens fremstilt som følger: Til en omrørt oppløsning av p-aminofenyl fi-D-galaktopyrano-sid (0,54 g, 2 mmol) i vann (4 ml) og etanol (6 ml) ble det tilsatt jodoeddiksyreanhydrid (0,9 g, 2,5 mmol) ved romtemperatur. Etter 2 timer ble reaksjonen konsentrert til tørr-het og residuet vasket med eter (2 x 10 ml). Krystallisering fra etanol ga produktet som nåler (0,7 g; 80%), smp. 158-160°C.

Reaksjonen av de cys 14-modifiserte kapsider med den aktive-rte galaktose ble undersøkt ved å bruke Ellman's reagens (ditionitrobenzoat, DTNB), som gir en karakteristisk absorp-sjon ved OD412 ved reaksjon med frie - SH-grupper. Figur 3 viser en kontrollkurve for reaksjon av fritt cystein med DTN. Kontrollkurven ble oppnådd ved å bruke:

100 1 prøve,

100 pl DTNB 4mg/ml i 100 mM Na2HP04 pH8 ("buffer 1"),

5 ml "buffer 1".

Blandingen ble holdt ved romtemperatur i 15 min etter tilsetning av DTNBV og deretter ble OD412 nedtegnet.

Figur 4 viser den oppnådde kurve når cystein (4 mM) ble blandet med fra 1 til 10 mM aktivert galaktose og oppbevart ved romtemperatur i 1 time, fulgt av undersøkelse av 100 ml porsjoner som beskrevet ovenfor ved å bruke DTNB.

Det cys-14-modifiserte kappeprotein ble omsatt med DTNB som følger: Rensede cys-14-modifiserte kapsider ble resuspendert i buffer 1 inneholdende 1 mM EDTA til en endelig konsentrasjon på 400 ug/ml. De følgende enkeltstående forsøk ble satt opp.

l) 100 ul proteinprøve, 100 ul 5 mM aktivert galaktose,

2) 100 ul proteinprøve, 90 ul buffer 1, 10 ul 5 mM aktivert galaktose,

3) 100 ul proteinprøve, 100 ul buffer 1.

Hver prøve ble omrørt ved romtemperatur i 1 time før tilsetning av 200 ul DTNB 4 mg/ml i etanol til den omrørte oppløs-ning. OD4ia ble nedtegnet etter 15 minutter, og resultatene er vist i tabell 1 nedenfor. Antallet fri tioler minket med økende eksponering til galaktosereagenset, noe som bekrefter at cys-14-capsidene hadde blitt derivatisert med galaktose.

P) Binding av cys-14-modifisert kappeprotein til immunogent peptid.

De rensede cys-14-modifiserte kapsider ble bundet som beskrevet nedenfor til HalO, en 10-mer peptidsekvens som omfatter en nonapeptidepitop avledet fra hemagglutininet av det humane patogene influensavirus og med en N-terminal cysteinresiduum-utvidelse, hvilken 9-mer-sekvens YPYDVPDYA har blitt identifisert som inneholdende én av de antigene determinanter av Wilson et al., Molecular and Cell Biology, mai 1988, 2159-2165 og Cell, 37 1984, 767-778. Fremgangsmå-ten innbefattet et initielt kryssbindingstrinn for å danne en disulfidbinding som så ble oksidert.

De følgende reagenser ble anvendt for å danne fire forsøks-reaksj onsblandinger:

2 ug cys 14-modifiserte kapsider (ca. 3 ul) ("cys bro"),

1 ul IM Tris-HCl pH8, 10 mM EDTA ("buffer 2"),

17 ug HAp-peptid (ca. 2 ul) ("peptid"),

1 ul 2-merkaptoetanol ("BME").

De følgende fire forsøksblandinger ble fremstilt, i hvert tilfelle utvidet til 10 ul med vann:

1) cys-bro + buffer 2 + BME

2) cys-bro + buffer 2

3) cys-bro + buffer 2 + BME + peptid

4) cys-bro + buffer 1 + peptid.

Blandingene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Det ble så tilsatt 1 ul av en blanding av 0,37M natriumtetrationat og 1,6 M natriumsulfitt (som var blitt ferskt fremstilt i henhold til metoden til Morehead et al., Biochem., 23, 1984, 2500). Blandingene fikk stå over natten ved romtemperatur.

Blandingene ble analysert ved å bruke et PAGE Schågger System (Schågger et al., 1987, Anal. Biochem, 166, 368-379), blottet på nitrocellulosepapir ved å bruke en Bio-RAD Western blottingapparatur med en overføringsbuffer av 39 mM glycin, 48 mM Tris, 0,1% (w/v) natriumdodecylsulfat (SDS) og 20% metanol med en overføringstid på 1 time ved 450 mA.

Blottene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,6, inneholdende Tween 20 (polyoksyetylensorbitanmono-laurat - 3 ml pr. 1 PBS) for å ekvilibrere. De ble så inkubert i 1 time ved 3 7°C med 35 ml PBS-Tween pluss 0,5% (w/v) bovin serum albumin (BSA), vasket 6x5 min med 200 ml PBS-Tween og deretter inkubert over natten ved 4°C med 35 ml PBS-Tween + 0,5% (w/v) BSA, sammen med 100 ul muse anti-HA9 monoklonalt antistoff (erholdt fra Balcore Co., Berkley, USA). Deretter fulgte vask med PBS-Tween (6x5 min - 200 ml) og inkubering i en halv time med 35 ml PBS-Tween + 0,5% (w/v) BSA sammen med 50 ul geite-anti-mus IgG pepperrotperoksydase-(HRP)-konjugat. Etter ytterligere vask (6x6 min - 200 ml PBS-Tween) ble gelen tømt med luminol Western blotting reagenser

(Amersham) og gjort synlige.

Resultatene viste at kun et enkelt bånd i sporet som til-svarte prøve nr. 4, kryssreagerte med anti-HA9 antistoffet. Dette er det ventede resultat, idet prøve 1-3 var negative kontroller. Således er det mulig å koble lineære peptid-fragmenter til cys-14-kapsider ved å bruke disse metoder.

G) Kovalent kryssbinding av cys-14-modifisert kappeprotein til et enzym

De rensede cys-14-modifiserte kapsider beskrevet i E) ovenfor ble kovalent bundet via en maleimidgruppe til enzymet pepperot-peroksydase (HRP) som følger: HRP-malimid-konjugat (Pierce Europe BV, Nederland), cys-14-modifiserte kapsider og åME ble brukt for å danne de følg-ende blandinger, hvorav hver ble laget opptil 100 ul med 100 mM NaPi, pH 7,2.

1) 20 ug HRP-maleimid pluss 1 ul j3ME

2) 20 ug cys-14-modifiserte kapsider pluss 1 ul BME

3) 20 ug cys-14-modifiserte kapsider pluss 20 ug HRP-maleimid

Prøve 3) ble oppbevart i 1 time ved romtemperatur og deretter ble fJME tilsatt for å blokkere alle gjenværende tioler. Prøve 1-3 ble så fraksjonert med HPLC gelfiltrerings-kromatografi på PW 3000, 2 x 30 cm kolonner, i 100 mM NaPi, pH 7,2 ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Fraksjoner (1 min - 0,5 ml) av eluatet ble så undersøkt for HRP-akti-vitet ved å bruke det kommersielt tilgjengelige kit (ABTS reagens, Pierce), idet enzymaktivitet ble beregnet ved å observere den økede absorbans av oppløsninger ved 410 nm. Dataene viste en signifikant økning i forhold til bakgrunns-nivå i fraksjoner tilsvarende OD280-toppen av cys-14-sammen-satt materiale fra prøve 3.

Claims (15)

1. Kimaert protein, karakterisert ved at det omfatter kappeproteinet for fag MS-2 eller relatert fag av liknende struktur innbefattende R17, fr, GA Qp og SP, hvilket kappeprotein har blitt modifisert ved fjerning av cysteinresiduene som er tilstede utvendig på den N-terminalt utstikkende B-hårnål av kappeproteinet og innsetning av et cysteinresiduum i området tilsvarende den N-terminalt utstikkende p-hårnål.

2. Modifisert kappeprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at cysteinresiduet har blitt satt inn i området for glysin 13- og 14-residuene hos kappeproteinet.

3. Modifisert kappeprotein ifølge krav 2, karakterisert ved at cysteinresiduet har blitt satt inn for å erstatte glysin 14.

4. Modifisert kappeprotein ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at de utvendige cys-teiner av p-hårnålen har blitt erstattet med serin.

5. Modifisert kappeprotein ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at det innsatte cysteinresiduum har blitt bundet direkte eller indirekte til en fremmed molekyltype.

6. Modifisert kappeprotein ifølge krav 5, karakterisert ved at det innsatte cystein- residuum har blitt bundet til den fremmede molekyltype via en avstandsgivende enhet.

7. Modifisert kappeprotein ifølge krav 6, karakterisert ved at den avstandsgivende enhet er avledet fra et bifunksjonelt kryssbindende reagens valgt fra m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysulfosuccinimid-es-ter,N-succinimidyl-(4-jod-acetyl)aminobenzoat og N-succini-midyl-3-(2-pyridylditio)-propionat.

8. Modifisert kappeprotein ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at cysteinresiduet har blitt bundet direkte eller indirekte til et antigent protein.

9. Modifisert kappeprotein ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at cysteinresiduet har blitt bundet direkte eller indirekte til en målrettende enhet .

10. Modifisert kappeprotein ifølge krav 9, karakterisert ved at den målrettende enhet omfatter galaktose.

11. Kapsider karakterisert ved at de omfatter det modifiserte kappeprotein ifølge ethvert av de foregående krav eller en blanding av slike proteiner.

12. Fremgangsmåte ved fremstilling av et modifisert kappeprotein ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter å fremstille to enkle mutanter av fag-kappeproteinet, en mutert for å fjerne cystein 46-residuet og en mutert for å fjerne cystein 101-residuet, spalting og religering av de tilsvarende cDNA for å fremstille et dobbeltmutert kappeprotein cDNA og underkaste det dobbeltmuterte cDNA seterettet mutagenese for å innføre et cysteinresiduum i området tilsvarende den N-terminalt utstikkende å-hårnål og uttryk-kende det resulterende cDNA for å erholde det modifiserte protein.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at ekspresjonen utføres i E. coli.

14. Ekspresjonsvektor karakterisert ved at den omfatter DNA som koder for det modifiserte kappeprotein ifølge ethvert av kravene 1-4.

15. Vaksinepreparat karakterisert ved at det omfatter et protein ifølge krav 8 eller kapsider omfattende et slikt protein.