JPH03501684A - Ｈｉｖ抗原の製法およびその系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ抗原の製法およびその系 記載 関連出願に対する相互引照 本願は係続中の１９８８年５月６日出願の特許出願第１９１．２２９号、１９８ ８年６月１３日付出願の特許出願第２０６，４９９号および１９８８年１０月１ ４日付出願の特許出願第２５８，０１６号のＣＩＰ出願に係り、従ってこれら特 許出願の開示を本願の参考文献として加えてお（。

鼓五丘立 本発明は、組換えＨＩＶｐ２４タンパクおよび／またはＨＩＶｐ２４−ｇｐ４Ｌ 融合タンパクをコードするＤＮＡセグメント並びに該ＤＮＡセグメントを含む組 換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）に関するものである０本発明は、本発明のｒＤＮＡで 形質転換した細胞およびＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクの製法をも意図 する。

ｌ置皿１量 ヒト免疫不全ウィルス（Ｈ’ＩＶ）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の作因 であると考えられている。このＨＩＶプロウィルスゲノムの核酸配列が推断され 、かつ該ウィルスゲノム内の様々なタンパクコード化領域の位置が決定されてい る。

本発明で最も興味のあることは、咳ＨＩＶゲノムの従来からｇａｇｔｌ域として 知られている部分である。このｇａｇｔｒＭ域は、開裂しかつ処理して３種の成 熟タンパクｐ１７、ｐ２４およびｐｔｓに類別されるプリカーサタンパクをコー ドすると考えられている。

ＨＩＶｐ２４タンパクは約２４，０００の見掛けの相対的分子量を有し、かつ当 分野においてｆ（ＩＶココア原として知られている。というのは、これがウィル スカプシドを形成するからである。

ＨＩＶのｐ２４抗原は特に興味あるものである。というのは、研究により、感染 体中における抗−ＨＩＶ抗体形成（セロコンバージョン）の最初の証拠が、Ｐ２ ４抗原により誘発された抗体、即ち抗−ｐ２４抗体の出現であることが示された からである。更に、最近の研究は、Ｐ２４タンパクが抗−ｐ２４抗体の検出以前 においてさえ血液サンプル中に検知できることを報告している。

従って、Ｐ２４タンパクまたは抗−ｐ２４抗体いずれかの存在の検出は、最も初 期におけるＨＩＶ感染の検出に対する最良の方法であると考えられる。

更に、二〇Ｐ２４抗原は、完全に発現したＡＩＤＳへの移行を伴う患者の臨床状 態の悪化を示す、患者中の抗−ｐ２４抗体の減少に伴って感染個体の血液中に再 度出現する。かくして、ｐ’　２’　４抗原は治療中の患者の有効な診断マーカ ーとして使用できる。

抗−ｐ２４抗体検出用のイムノアツセイの開発は、免疫反応性の不純物を本質的 に含まないＨＩＶｐ２４タンパクを十分な量で製造することが困難であることに より制限されている。患者サンプル中に存在する抗体と免疫反応する不純物の存 在は低いアッセイ特異性および感度並びに誤った正の結果の増加をもたらす。

現在、血液サンプル中の抗−Ｐ２４抗体をアッセイする場合、当技術は、典型的 に、ＨＩＶｐ２４タンパク処方物中における不純物の存在を、該不純物を含有す る処方物で予め該サンプルを吸収させることにより克服している０例えば、Ｄｏ ｗｂｅｎｋｏ等（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　、１９８５．　８２． 　ｐｌ）、７７４８−７７５２）は、呈、延、中にＨＩＶＰ２４融合タンパクを 生成するのに組換えＤＮＡを用いる方法を報告している。しかし、免疫親和性に 基き精製したＰ２４融合タンパク処方物は、Ｅ、ｕタンパク抽出物でテストされ る血液サンプルを予め吸収させておくことが必要とされる程に多量の旦、ユニタ ンパク不純物を含んでいた。

同様に、Ｓｔｅｉｍｅｒ等（Ｖｉｒｏｌ、、１９８６　、　ｌｉｉ、　ＰＩ）、 ２８３−２９０）は不完全ＨＩ　Ｖ　ｐ　２４の旦、ユニ中での製造を報告して いる。この不完全ｐ２４は硫安沈殿およびゲル濾過による分別を利用して、不純 物含有Ｅ、ａタンパクから単離されて、Ｉ）２４抗原処方物とされ、その純度は ９９％以上であると託戦されている。しかし、ＥＬ　Ｔ　ＳＡ法でこのｐ２４抗 原処方物を用いて抗−ｐ２４抗体を検出するためには、依然として血液サンプル を旦。

１１タンパクで予め吸着させることを必要とした。１９８６年７月９日付公開の 欧州特許出願第８５３０９４５４．８　（公開第０１８７０４１号）もＥ、２ｉ 中でのＨＩｖｐ２４融合タンパクの表現を開示している。

遺伝子操作された１、ユニを用いて、不純物旦、二丈タンパクを本質的に含まな いＨＩＶｐ２４抗原処方物を生成するに係る２つの難点は、組換え法で生成され たタンパクが不溶性であること、およびその収率の低いことである。例えば、Ｄ ｏｗｂｅｎｋｏ等（上記文献）　、Ｇｈｖａｙｅｂ等（ＤＮＡ、１９８６．　ｉ 、　ｐｐ、９３−９９）およびＳｈｏｅｍａｎ等（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ ＊、　、　１９８７　＊　−Ｌ玉」−、ＰＩ）。

３７０−３７９）は、１．ユニ中で生成されたＨＩＶｐ２４融合タンパクが、こ の産生バクテリア内に不溶性凝集物じ封入体゛）として蓄積されることを報告し ている。この凝集体（これらはこのバクテリアの電子顕微鏡写真では顆粒として 見ることができる）は、細胞の溶Ｍ（崩壊）および遠心処理後のベレント画分中 に回収された０次いで、このペレットからのタンパクの可溶化は、強力な変性剤 での処理を必要とした。

形質転換されたバクテリアからの組換えタンパクの収量は、その翻訳速度に直接 関連している。組換えタンパクは全翻訳過程における最も遅い段階よりも迅速に 合成することはできない、翻訳開始、延長および終止はすべてＤＮＡ配列のみか らその効率を予想することのできない段階であることがわかっている。

例えば、Ｓｔｅｉｍｅｒ等（上記文献）は、アミノ末端をもつ不完全ＨＩＶｐ２ ４タンパクをコードするｒＤＮＡ中の開始コドンＡＵＧの３つのヌクレオチド５ ′を変化させることの、翻訳効率に及ぼす作用を調べた結果を報告している。１ ｉｒＤＮＡのこのｔＪｌ　ｂ’５が調べられたのは、これが翻訳開始（リポソー ム結合）サイトの決定の関与しているからである。　Ｓｔｅｉｍｅｒ等は、翻訳 開始の効率が数種のファクタの組合せに依存しており、該リポソーム結合領域の ＤＮＡ配列からは予測し得ないことを見出した。

１皿二以１ 本発明は第１のヌクレオチド塩基配列と第２のヌクレオチド塩基配列とを含み、 該第１のヌクレオチド塩基配列がその３′末端において該第２のヌクレオチド塩 基配列の５′末端に結合しているＤＮＡセグメントを目的とする。この第１の配 列は以下の式：％式％ で表されるヌクレオチド塩基配列をもつ。該第２の配列は組換えＨＩＶｐ２４タ ンパクをコードするヌクレオチド塩基配列をもつ。

本発明は、ＤＮＡセグメントに機能し得るように結合したベクタを含む組換えＤ ＮＡをも目的とする。該ＤＮＡセグメントは３′末端で機能し得るように第２の ヌクレオチド塩基配列の５′末端に結合した第１のヌクレオチド塩基配列を含む 。この第１の配列は以下の式： ％式％ で表されるヌクレオチド塩基配列をもつ、該第２の配列は組換えＨＩＶｐ２４タ ンパクをコードするヌクレオチド塩基配列をもつ。

本発明は、第１Ｂ図に示された残基ｌから約２５７までのアミノ酸残基配列をコ ードするＤＮＡセグメント、第１Ｃ図に示された残基１〜２５８のアミノ酸残基 配列をコードするＤＮＡセグメントまたは第１Ｅ図に示された残基１〜２８３の アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡセグメントをも目的とする。好ましくは、 このＤＮＡセグメントは第１Ｂ、ＩＣまたはＩ已に示された特定のヌクレオチド 塩基配列をもつ。

また、本発明は、本発明のＤＮＡセグメントに機能し得るように結合したベクタ 、好ましくは表現ベクタを含む組換えＤＮＡ分子をも目的とする。好ましい組換 えＤＮＡ分子はｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４ｉ、ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−２またはｐ ＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１−Ｌ２である。

第１Ｂ図に示された残基１または２乃至約２５７までの、第１Ｃ図に示された残 基１または２乃至約２５８までのあるいは第１Ｅ図に示された残基１または２乃 至約２８３までのアミノ酸残基配列をもつＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパク も本発明の目的の一つである。

更に、本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換された細胞の培養物および該培養物 を用いた本発明の該組換えＨ１Ｖｐ２４またはＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１Ｕ合タン パクの製法も本発明の目的である。

また、本発明は組換えＨＩＶｐ２４タンパクを含む組成物をも目的とする。この 組成物は更に（ａ）原核抗原および（ｂ）他のＨＩＶ関連タンパクを本質的に含 まないことにより特徴付けられる。

更に別の本発明の目的は、少なくとも一度のアッセイを実施するのに十分な量で 、本発明の組換えＨＩＶＥ）２４タンパク組成物を、別々の包装された試薬とし て含むキット型の診断系を提供することである。

もう一つの態様において、本発明は本発明のＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパ クを含むキット型の診断系をも目的とする。好ましくは、この診断系は固体マト リックスに固定化されたＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクを含む。

更に、本発明は少なくとも一つのＨＩＶ抗原ｐ２４およびｇｐ４１に対する抗体 の存在につき、体液サンプルを７フセイする方法を目的とする。この方法は、該 体液サンプルと本発明のＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクとを混合すること により、免疫反応混合物を形成することを含む。この免疫反応混合物を存在する あらゆる抗体が該融合タンパクと免疫反応して免疫反応生成物を形成するのに十 分な時間維持する。この免疫反応生成物が検出された際には、これは抗−ＨＩＶ ｐ２４および／または抗−ＨＩＶｇｐ４１抗体の存在を表す、好ましくは、この 融合タンパクは、この方法を実施する際に固体マトリックスに固定されている。

もう一つの態様において、本発明は製薬上許容される担体中に治療上有効量の組 換えＨＩＶｐ２４タンパクを含む接種物Ｑ　ｎｏｃｕＩｕｍ）を提供する。この 接種物は本質的に（ａ）原核抗原および（ｂ）他のＨＩＶ関連タンパクを含まな い。

更に、ＨＩＶ惑染の治療法にも係り、この方法は本発明の接種物を投与すること を含む。

図面の簡単な説明 パネルＬＡ、ＩＢ、ＩＣ，ＩＤおよびＩＥを含む第１図は、本発明の好ましいＤ ＮＡセグメントのヌクレオチド塩基配列を示す。

この塩基配列は便宜的に左から右に、かつ５′末端から３′末端方向に、単一文 字ヌクレオチド塩基コード（Ａ−アデニン；Ｔ−る。第１図のすべてのパネルに おいて、ヌクレオチド塩基１〜４はシャインダルガルノ　（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌ ｇａｒｎｏ）配列（Ｓｈｉｎｅ等、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ　、　１９７４．１上、ｐ１３ ４２）を表し、塩基１〜１５はリポソーム結合サイトを規定し、かつ塩基１６〜 ６９０は組換えＨＩＶｐ２４タンパクの構造遺伝子の大部分を規定している。

第１図のずぺてのパネルに図示された構造遺伝子の読取枠は、該遺伝子がコード するクンバクの推定されたアミノ酸残基配列を、各アミノ酸残基をコードする３ つの文字（対応表）が各残基をコードする３つの塩基（コドン）上に直接位置す るように該ヌクレオチド配列上方に配置することにより示されている。この残基 配列は便宜的に左から右に、即ちアミン末端からカルボキシ末端の方向に示され ている。最右端の残基および塩基の各アミノ酸残基およびヌクレオチド塩基配列 中の位置は図の右側の余白に数値で示されている。好ましいｍ換えＨＩＶ−関連 タンパクのＤＮＡでコードされたアミノ酸残基配列は各タンパクをコードする構 造遺伝子上方に示されている。

夫々パネルＩＡ〜１Ｂ（各パネルは連続の番号が付された一連の紙面に示されて いる）中の塩基１５〜７１８．１５〜７９３．１５〜７９６．１５〜１０２１お よび１５〜８２１により表わされるヌクレオチド塩基配列は好ましいＤＮＡセグ メントを表し、各々は制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ＋で開裂することにより生 成するヌクレオチド塩基配列に相補的な５′コード化ストランド末端、即ちＮｄ ｅｌ付着末端および制限エンドヌクレアーゼ１３ａ＋ｓＨＩで開裂して生成する ヌクレオチド塩基配列に相補的な３′コード化ストランド末端、即ちＢａｍＨＩ 付着末端をもつ。

パネルＩＡに図示された組換えＨＩＶｐ２４タンパクは残基１〜２３２に対応す るアミノ酸残基配列を含む。

パネルＩＢに示されたＨ　Ｉ　Ｖｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパク（ｐ２４−Ａ ５）は、アミノ末端ＨＴ　Ｖ　ｐ　２４ポリペプチド部分（残基１〜２２５に対 応）、中間ＨＩ　Ｖｇｐ４１ポリペプチド部分（残基２２６〜２４８に対応）、 Ｇｌｙ−Ｐｒｏジペプチドリンカ一部分（残基２４９〜２５０に対応）およびカ ルボキシ−末＠ＨＴＶｐ２４ポリペプチド部分（残基２５１〜２５７に対応）を 含んでいる。

パネルＩＣに示されたＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−２８合タンパクは、残基１〜２ ２５に対応するアミノ末端ＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分、残基２２６〜２４９ に対応する中間ＨＩＶｇｐ４１ポリペプチド部分、残基２５０〜２５１に対応す るＧｌｙ−Ｐｒｏジペプチドリンカ一部分および残基２５２〜２５Ｂに対応する カルボキシ末端ＨＩＶＩ）２４ポリペプチド部分を含んでいる。

バネ／ｌ／ＩＤに示されたＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．２，１．１融合クンバ ク（ｐ２４−Ａｓ−Ａ２−Ａ５−Ａ５）は、残基１〜２２５に対応するアミノ− 末端ＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分、残基２２６〜２４８．２５１〜２７４．２ ７７〜２９９および３０２〜３２４に対応する４種の中間ＨＩＶｇｐ４１ポリペ プチド部分、残基２４９−２５０．２７５〜２７６．３００〜３０１および３２ ５〜３２６に対応する４つのＧｌｙ−Ｐｒｏジペプチドリンカ一部分および残基 ３２７〜３３３に対応するカルボキシ−末端ＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分を含 む。

バネ／Ｌ’ｌＥで示されたＨＩＶｐ２４−ｇＰ４１−１．２融合クンバク（ｐ２ ４−Ａ５−Ａ２）は残基１〜２２５に対応するアミノ−末端ＨＩＶｐ２４ポリペ プチド部分、残基２２６〜２４８および２５１〜２７４に対応する２つの中間Ｈ ｒＶｇｐ４１ポリペプチド部分、残基２４９−２５０および２７５〜２７６に対 応する２つのＧｌｙ−Ｐｒｏジペプチド部分および残基２７７〜２８３に対応す るカルボキシ−末端ＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分を含む。

第２図、パネルＡ（シート２人−１および２Ａ−２＞は旦、２ユ中で組換えＨＩ Ｖｐ２４タンパクを表現するｐＧＥＸｐ２４−組換えＤＮＡの樹立工程を示す。

この樹立法により取扱われかつ作製された組換えＤＮＡは本図において円で示さ れている。この樹立は以下の実施例１で詳しく述べるように、本図の円を接続す る矢印で示されたような一連の工程に従って進められる。標識点即ち使用した制 限酵素認識サイトは該円と交叉する線分で円上に示されている０個々の遺伝子の 相対的位置およびその転写方向は咳円内の標識矢印で示されている。

第２図パネルＢは、一本の下線を施したアミノ酸残基配列（ペプチドＡ５）をコ ードするオリゴヌクレオチドを、ｐＧＥＸｐ２４のＨＩＶｐ２４構造遺伝子内に 位置するＰｐｕＭＩ制限サイトで結合することによる、組換えＤＮＡプラスミド ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１の樹立を示す、この結合は、第１Ｂ図に示された、機能 可能にｐＧＥＸ７ベククに結合され、かつ同様に第１Ｂ図に示されたＨＩＶｐ２ ４−ｇｐ４１融合タ７パ’）＜残基１〜２５７）をコートする構造遺伝子の形成 に導く。

第３図はｐＧＥＸｐ　２４プラスミドを含むバクテリア細胞溶解液の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥの結果を示す。細胞は４２℃にて０分（レーン１）、０．５時間（レーン ２）、１時間（レーン３）および２時間（レーン４）維持した。

第４図は、ＨＴＶ−１ｇａｇからの精製組換えｐ２４ポリペプチドのＳＤＳゲル 電気泳動の結果を示す、レーンＡは低分子量標準物質を含み、分子量は左側余白 にキログルトンで示されている（カタログｌｂ　１６１，０３０　；バイオラド 、リッチモンド、ＣＡ）、　レーンＢおよびＣは夫々１２および２４μｇの本発 明の木質的に純粋な組換えＨＩＶｐ２４タンパクを含む。

第５図は、実施例３Ｅに記載するように、ｐＧＥＸｐ２４プラスミドで形質転換 したＥ、２ＪＬの５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたウェスタンプロット法の結果を 示す、４２℃で誘発した後、細胞溶解液を０分（レーン１）、３０分（レーン２ ）、１時間（レーン３）および２時間（レーン４）において潤製した。

第６図は、本発明の組換えＨＩＶｐ２４タンパクおよびＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１ 融合タンパクのカルボキシ末端を示す、本図の上方では、ポリペプチドＡ５およ びＡ２のアミノ末端からカルボキシ末端までのアミノ酸残基配列を左から右の方 向に描写している。

その下方では、本発明の５種のＨＩＶ抗原、即ち組換えＨＩ　Ｖ　ｐ２４タンパ ク（ｐ２４）並びにＨＩＶ融合タンパクｐ２４ｇｐ４１、ｐ２４ｇｐ４１−２、 ｐ２４ｇｐ４１−１．２およびｐ２４ｇｐ４１−１．２，１．１のカルボキシ末 端のアミノ酸残基配列を描写した。

１里ｆｌ槻笠粁載 Ａ、ｆＪｉ ヱＬｌ：　本明細書で同定したすべてのアミノ酸残基は天然のＬ−配置にある。

標準ポリペプチド命名法（Ｊ、　ｌ１ｉｏ１．　ＣｈｅｇＡ、。

１９６９．２土１．ｐρ、３５５７−５９）に従って、アミノ酸残基の略称は以 下の対応表に示す通りである。

対応表 Ｙ　Ｔｙｒ　Ｌ−チロシン Ｇ　Ｇｌｙ　グリシン Ｆ　Ｐｈｅ　Ｌ−フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　Ｌ−メチオニン Ａ　Ａｌａ　Ｌ−アラニン Ｓ　Ｓｅｒ　Ｌ−セリン １　１１ｅ　Ｌ−イソロイシン Ｌ　Ｌｅｕ　Ｌ−ロイシン Ｔ’　Ｔｈｒ　Ｌ−スレオニン Ｖ　Ｖａｔ　Ｌ−バリン Ｐ　Ｐｒｏ　Ｌ−プロリン Ｋ　Ｌｙｓ　Ｌ−リジン ＨＨｉｓ　Ｌ−ヒスチジン Ｑ　Ｇ、１ｎ　Ｌ−グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸 Ｗ　Ｔｒｐ　Ｌ−）リブトファン ＲＡｒｇ　Ｌ−アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　Ｌ−アアバラギン ＣＣｙｓ　Ｌ−システィン すべてのアミノ酸残基配列、典型的に本明細書で“残基配列゛と呼ぶものは、本 明細書では左から右への配向が公知のアミノ末端からカルボキシ末端への方向に ある式で表されていることに注意すべきである。

ス久之土天ヱ：　糖部分（ペントース）、リン酸および含窒素複素環式塩基から なるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位である。

該塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して咳１唐部分に結合し ており、また塩素と糖との組合せはヌクレオシドである。このヌクレオシドがペ ントースの３′または５′位置に結合したリン酸根を含む場合、これはヌクレオ チドと呼ばれる。機能可能に結合したヌクレオチド配列は、本明細書において典 型的に、“塩基配列°と呼ばれ、ここでは左から右への配向が５′−末端から３ ′−末端への公知の方向にあるような式で表される。

Ｍ１対−Ω且と：　二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）あ るいはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との結合対を意味する。

Ｂ、ＤＮＡセ゛　ン 生体において、タンパクまたはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝子コー ドを通して直接該タンパクをコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）配列に関連している。従って、構造遺伝子はアミノ酸残基配列、即ち該遺伝子 のコードするタンパクまたはポリペプチドで定義できる。

遺伝子コードの重要なかつ周知の特徴はその重複性である。即ち、タンパクを作 るのに使われるアミノ酸の殆どに対し、１以上のコード化ヌクレオチドトリプレ ット（コドン）が特定の１つのアミノ酸残基をコード即ち指定できる。従って、 い（つかの異るヌク１／オチド配列は一つの特定のアミノ酸残基配列をコードし 得る。このようなヌクレオチド配列は機能上等価であると考えられる。というの はこれらはあらゆる生物において同一のアミノ酸残基配列の製造をもたらすから である。場合によっては、プリンまたはピリミジンのメチル化変性体を所定のヌ クレオチド配列中に組込むことができる。しかし、このようなメチル化はいずれ にしてもコード関係に何等影響しない。

−態様において、本発明のＤＮＡセグメントはリポソーム結合サイトを規定する 第１のヌクレオチド塩基配列を含み、しかも以下の式： ％式％ で示される配列をもつ、この第１の配列はその３′末端において機能可能に第２ のヌクレオチド塩基配列の５′末端に結合しており、該第２の塩基配列は組換え ＨＩＶｐ２４タンパクを表現することのできる構造遺伝子を規定する。好ましい ＤＮＡセグメントは第１Ａ図に示された塩基位置１〜７１１または７１８の塩基 配列によって表される塩基配列をもつ。更に、好ましいＤＮＡセグメントは該構 造遺伝子の３′−末端に機能可能に結合した塩基配列（２つの燃接する終止シグ ナルを表す塩基配列）ＴＡＡＴＡＡをも含む、好ましい態様において、結合した 際の第１および第２ヌクレオチド塩基配列の長さは約７１１塩基以上、より好ま しくは約１０，０００塩基以上である。更に、本発明のＤＮＡセグメントは、Ｈ ＩＶゲノムのｇａｇｔｉ域によってコードされる他のいかなるタンパク、あるい はその抗原的に同一と考えられる部分をもコードしない。

本明細書で使用する用語“担換えＨＩＶｐ２４タンパク′とは長さが約２３１ア ミノ酸残基に相当するタンパクであつて、天然産の成ｖＱＨＩＶｐ２４タンパク と相同のアミノ酸残基配列をもつタンパクを意味する。ヌクレオチド塩基の残基 １６〜１Ｂは第１図のすべてのパネルに示したように末端メチオニン残基をコー ドして、周知の如＜、Ａ　Ｔ　Ｃコドンにおけるタンパクの翻訳開示を容易にす る。しかし、表現タンパクの大部分において、このメチオニンはタンパク翻訳中 に切り取られ、プロセッシングされてアミノ酸残基２　（プロリン）で始まるク ンバクが生成する。組換えＨＩＶｐ２４タンパクは水溶性であり、かついかなる ＨＩＶｐ１７またはｐ１５抗原決定基をも表現しないものとして更に４！徴付け られる。好ましい組換えＨｒｖｐ２４タンパクのアミノ酸残基配列はその残基２ 〜２３２が第１Ａ図に示されている。

もう一つのＢｙにおいて、本発明のＤＮＡセグメントは、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４ １融合タンパクを表現し得る構造遺伝子を規定するヌクレオチド塩基配列を含む 、用語“ＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパク”とはカルボキシ末端において ペプチド結合を介してＨＩＶｇｐ４１ポリペプチド部分に機能し得るように結合 したアミノ末端ＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分をもつクンバクを意味する。

このＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分は第１Ｂ図に示した残基約２から約２２５ま での配列に対応するアミノ酸残基配列をもつ、その表現された型のＨＩＶｐ２４ −ｇρ４１融合タンパクは、残基２（プロリン）で始まるアミノ酸残基配列をも ち、咳残基配列のアミノ末端メチオニン残基は翻訳中に切り取られ、表現された ＨＩＶｐ２４タンパクについて上記したようにプロセッシングされる。

このＨＩＶｇｐ４１ポリペプチド部分は、抗−ＨＩＶｇｐ４１抗体と免疫反応し 得るポリペプチド、即ちＨＩＶｇｐ４１抗原性を表示するポリペプチド（ＨＩ　 Ｖｇｐ４１−抗原性ポリペプチド）に対応するアミノ酸残基配列をもつ、Ｈ■Ｖ ｇｐ４１抗原性を表すポリペプチドは当分野で周知である。例えば、Ｃｏ５ａｎ ｄの米国特許第４，６２９゜７８３号、Ｗａｎｇ等の米国特許第４，７３５，８ ９６号および　Ｋｅｎｎｅｄｙ等の５ｃｉｅｎｃｅ、１９８６．　ｉｉｌ、　ｐ ｐ、１５５６　１５５９を参照のこと。

Ｈ１ｖｐ２４−ｇｐ４１融合タ融合タンパクツーＨＩ　Ｖｇｐ４１ポリペプチド 部分は第１Ｂ図に示された残基２２６から２４８までの配列または第１Ｃ図に示 された残基２２６から２４９までの配列によって表されるアミノ酸残基配列をも つ。

−態様において、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクは１以上のＨＩＶｇｐ４ １ポリペプチド部分を、例えば第１Ｄ図に示された残基２２６から３２４までの 配列または第１Ｅ図の残基２２６から２７４までの配列によって表される２つの 異るＨＴＶｇｐ４１ポリペプチド部分の組合せとして含む。

好ましい１１において、本発明のＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合クンバクのＨＩＶ ｇｐ４１ポリペプチド部分は少なくとも１０個のアミノ酸残基、かつ約３５以下 のアミノ酸残基を含み、好ましくは約１５〜約３５残基に相当する長さをもつ。

好ましいＧＬＪにおいて、ＨＩＶｐ２４ポリペプチド部分をコードする、本発明 のＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合クンバクコードＤＮＡセグメントの該当部分は 、第１Ｂ図の約残基１から約２２５までのアミノ酸残基配列をコードする配列、 およびより好ましくは第１Ｂ図の塩基１６〜６９０の塩基配列に対応す、るヌク レオチド塩基配列をもつ。

好ましい態様において、ＨＩＶｇｐ４１ポリペプチド部分をコードする、本発明 のＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクコードＤＮＡセグメントの該当部分は、 第１Ｂ図の残基２２６〜２４８、第１Ｃ図の残基２２６〜２４９、第１Ｄ図の残 基２２６〜３２４、または第１Ｅ図の残基２２６〜２７４のアミノ酸残基配列を コードする配列に対応するヌクレオチド塩基配列をもつ、より好ましくは、塩基 配列の点で８３　ＨＩ　Ｖ　ｇｐ　４１ポリペプチド部分をコードする該ＤＮＡ の部分は第１Ｂ図の塩基６９１〜７５９、第１Ｃ図の塩基６９１〜７６２、第１ Ｄ図の塩基６９１〜９８７、または第１Ｅ図の塩基６９１〜８３７の配列に相当 するヌクレオチド塩基セグメントをもつ。

最も好ましくは、本発明のＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクをコードする ＤＮＡセグメントは、（１）第１Ｂ図の塩基１〜７８６、塩基１５〜７８６．１ ６〜７８６．１〜７９３．１５〜７９３、または１６〜７９３、（２）第１Ｃ図 の塩基１〜７８９．１５〜７８９．１６〜７８９．１〜７９６．１５〜７９６、 または１６〜７９６、（３）第１Ｄ図の塩基１〜１０１４．１５〜１０１４．１ ６〜１０１４．１〜１０２１．１５〜１０２１、または１６〜１６２１、あるい は（４）第１Ｅ図の塩基１〜８６４．１５〜８６４．１６〜８６４．１〜８７１ ．１５〜８７１、または１６〜８７１の配列に対応するヌクレオチド塩基配列を もつ。

好ましい態様において、本発明のＤＮＡセグメントは相補的ＤＮＡセグメントに 結合して、二本鎖ＤＮＡセグメントを形成している。好ましくは、本発明の二本 鎖Ｄ　Ｎ　Ａ’上セグメント約８００塩基対以上、好ましくは約５０００以上、 より好ましくは約１０，０００以上の塩基対を含む、更に、本発明の二本鎖ＤＮ Ａセグメントはその末端のいずれかまたは両方に一本鎖付着尾部をもつ。

本発明のＤＮＡセグメントはＨＩＶ−感染体から得た単離ウィルスから容易に調 製でき、あるいは化学的方法、例えばＭｅｔｔｃｕｃｃｉ等のホスホトリエステ ル法（Ｊ、　Ａｒ＋ｃ、　Ｃｈｍｅ、　Ｓｏｃ、＋　１９８１　。

上ＪＬＬ、Ｉ）　３１８５）　（この開示を本発明の参考文献とする）によって 容易に合成できる。勿論、該構造遺伝子部分の化学的合成によって、単に適当な 塩基を、天然のアミノ酸残基をコードする塩基と置換するだけで任意の所定の変 更を行うことが可能である。

しかし、第１Ａ、ＩＢ、ＩＣ，ＩＤまたは１８図に示したセグメントに等価な配 列を含むＤＮＡセグメントが好ましい。

Ｃ０皿且主且に人立王 本発明は、更に機能できるようにベクタに結合した本発明のＤＮＡセグメントを 含む組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）をも提供する。

本発明の好ましいｒＤＮＡは、適合性ホスト内で組換えＨＩＶｐ２４タンパクま たはＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクを直接表現することができるものとし て特徴付けられる。“直接表現”なる用語は、該タンパクの成熟ポリペプチド鎖 が、大きな翻訳されたプリカーサタンパクから２またはそれ以上の末端アミノ酸 残基をタンパク分解により切り取るのとは対照的に、翻訳のみによって形成され ることを意味する０本発明の好ましいｒＤＮＡは夫々・　第２Ａおよび２Ｂ図に 示されたｒ　ＤＮＡプラスミドｐＧＥＸｐ２４およびｐ　ＧＥＸ　ｐ　２４ｇｐ ４１並びに実施例ＩＢで記載するｒ　ＤＮＡプラスミドｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１ −２およびｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−１，２である。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、本発明のＤＮＡセグメントにベクタを機能可能に 結合することにより得ることができる。

本明細書で使用する用語“ベクタ”とは細胞内で自己複製し得るＤＮＡ分子を意 味し、これに他のＤＮＡセグメントを°機能可能に結合して、付着したセグメン トの複製が可能となる。ＨＩＶｐ２４タンパクまたはＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融 合タンパク構造遺伝子の表現を可能とするベクタはここでは°表現ベクタ”とい う。

かくして、組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、自然界では通常−諸に見出される ことのない少なくとも２種のヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡである 。

本発明のＤＮＡセグメントを機能可能に結合するベクタの選択は、当分野で周知 の如く、直接型まれる機能性、例えばクンバク表現および形質転換すべきホスト 細胞に依存する。これらは組換えＤＮＡ分子の樹立技術において固有の制限であ る。しかし、本発明の意図するベクタは少なくとも複製を行うことができ、かつ 好ましくはベクタに機能可能に結合しているＤＮＡセグメントに含まれルＸｓ　 ′１ｔＪｉ換えＨＩＶｐ２４タンパクまたはＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパ クの表現をも行うことができる。

好ましい態様において、本発明で意図するベクタは原核レプリコン（ｏｒｉ）、 即ち形質転換される原核ホスト細胞、例えばバクテリアホスト細胞中で直接自己 複製でき、かつ染色体外に該組換えＤＮＡ分子を維持できる能力をもつＤＮＡ配 列を含む。このようなレプリコンは当分野で周知である。更に、原核レプリコン を含むこれらの態様はまた、表現により典型的に形質転換すべきバクテリアホス トに薬剤耐性を与える遺伝子をも含む、典型的なバクテリア薬剤耐性遺伝子はア ンピシリンまたはテトラサイクリン耐性をこれに付与するものである。

原核レプリコンを含むこれらベクタは、また形質転換すべきバクテリアホスト細 胞、例えば旦、二見内で組換えＨＩＶｐ２４構造遺伝子またはＨＩＶｐ　２４− ｇｐ４１融合タンパクの表現（転写並びに翻訳）を行うことのできる原核プロモ ータをも含むことができる。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼの結合並びに転 写の発生を可能とするＤＮＡ配列により形成される表現制御要素である。バクテ リアホストと適合するプロモータ配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメン トの挿入に対して有利な制限サイトを含むプラスミドベクタ中に与えられている 。このようなベクタプラスミドの典型例はＢｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ　（リッチモンド、ＣＡ）から入手できるｐＵｃ８、ｐＵｃ９、ｐＢＲ３２ ２およびｐＢＲ３２９；並びにＰｈａｒｍａｃｉａ　（ピスカクウェイ、Ｎ、Ｊ 、’）から入手できるｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。

相補的付着性末端を介して機能可能にＤＮＡセグメントをベクタに結合するため の多数の方法が開発されている０例えば、相補的ホモポリマートラクト（ｔｒａ ｃｔｓ）を挿入すべきＤＮＡセグメントおよびベクタＤＮＡに加えることができ る。このベクタおよびＤＮＡセグメントを、次に咳相補的ホモポリマー尾部間で 水素結合により結合させて、＆１ｌｔＡえＤＮＡ分子を形成する。

１以上の制限サイトを含む合成リンカはＤＮＡとベクタとを接合するもう一つの 方法を与える。前に記載したようにエンドヌクレアーゼ制限消化により生成した ＤＮＡセグメントはバタテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは旦、ユ、 、ｌＤＮＡポリメラーゼＩで処理される。これら酵素はその３１　＋　５　／エ キソヌクレアーゼ分解活性により突出する３′一本鎖末端を除き、かつ凹状の３ ′末端を、その重合活性により満たす。従って、この活性の組合せは、平滑末端 をもつＤＮＡセグメントを生成する０次に、この平滑末端をもつセグメントは酵 素の存在下で大過剰のリンカ−分子と共にインキュベートされる。該酵素はバク テリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端をもつＤＮＡ分子の連結を 触媒することのできるものである。か（して、この反応の生成物はその端部にポ リマーリンカ配列を担持するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡ セグメントを適当な制限酵素で開裂し、かつｉｆｆ　Ｄ　Ｎ　Ａセグメントの末 端と相容性の末端を生成する酵素で開裂された表現ベクタに連結する。

様々な制限エンドヌクレアーゼサイトを含む合成リンカは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社にューヘブン、ＣＮ）を含むいく つかの供給元から市販品として入手できる。

本発明は、また上記の組換えＤＮＡ分子に等価なＲＮＡにも開本発明は、同様に 本発明の組換えＤＮＡ分子、好ましくは組換えＨＩ　ｖｐ　２４５’７ハクまた はＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンハクを表現し得るｒ　ＤＮＡおよびより好 ましくはｒ　ＤＮＡプラスミドｐＧＥＸｐ　２４、ｐＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１、 ｐ　ＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１−２またはｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−１．２で形質 転換された原核ホスト細胞にも係る。バクテリア細胞は、好ましくは原核ホスト 細胞であり、かつ典型的にはＥ、ｌの菌株、例えばＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｂｅｔ、ｈｅｓｄａ、　ＭＤ）から入手 できる旦。

２ｉ株ＤＪ（５などである。適当なホスト細胞の、本発明の組換えＤＮＡ分子に よる形質転換は、周知の方法で達成できるが、これは典型的に使用するベクタの 型に応して変化する。原核ホスト細胞の形質転換については、例えばＣｏｈｅｎ 等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、１９７２．　６９．　９．　２１１０およびｌ’１ａｎｉａ ｔｉｓ等のＭｏ１ｅｕｃｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａａ＋＋ｎａｌ、　１９８２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）Ｉａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｓｒｙ社（コール１′スプリング、ハーバ−ＮＹ）を参照のこと 。

首尾よく形質転換された細胞、即ち本発明の組換えＤＮＡ分子を含む細胞は周知 の技術で同定できる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入により得られる細胞はク ローン化して、モノクローナルコロニーを生成できる。これらコロニ・−からの 細胞を収穫し、溶菌し、そのＤＮＡ含有物を５ｏｕｔｈｅｒｎによって記載され たような方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ＋、、１９７５．　９８．　ｐ、５０３ ）またはＢｅｒｅｎｔ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈ、、１９８５．　３．　ｐ、２ ０８）を利用してｒＤＮＡの存在につき検査することができる。

ｒＤＮＡの存在の直接アンセイ以外にも、ＭＡ　ｒ　Ｄ　Ｎ　ＡがＨＩ　Ｖｐ２ ４を表現できる場合には、周知の免疫学的方法で確認することもできる。例えば 、表現ベクタで首尾良く形質転換された細胞はＨＩＶコア（ｐ　２４）抗原性を 表すタンパクを生成する。形質転換された可能性のある細胞のサンプルを収穫し 、該抗原に特異的な抗体を用いてＨＩＶ、Ｐ２４の存在につきアッセイする。こ のような抗体は当分野で周知である。

かくして、形質転換されたホスト細胞自体に加えて、本発明はまたこれら細胞の 培養物、好ましくはモノクローナル培養物（クローン的に均一）あるいは栄養培 地中でのモノクローナル培養により得られる培養物をも目的とする。好ましくは 、この培養物もＨＩＶｐ２４抗原性を示すタンパク、より好ましくは水溶性ＨＩ Ｖｐ２４を含む。

形質転換ホスト細胞を培養するのに有用な栄養培養は当分野で周知であり、数箇 所の製造元から得ることができる。

Ｅ０ＭＪｐＬＬ且土Ｎ」エー２虹二ＪＪＬＬＬ社育叉ツバ久皇製悲 本発明のもう一つの局面は本発明の組換えＨＩＶｐ２４およびＨＩ　Ｖｐ　２４ −ｇｐ４１融合タンパクの製法に係る。

本発明の方法は、必然的に、紐換えＨＩＶｐ２４タンパクまたはＨＩ”ｉ’ｐ２ ４−ｇρ４１融合タンパクを表現し得る本発明の紐換えＤＮＡで形質転換された ホスト細胞、好ましくは旦、ユニ細胞を含む栄養培地を含有する培養物の培養開 始を伴う、この培養は、該形質転換細胞がｍ換えＨＩ　Ｖ　ｐ　２４タンパクま たはＨ＃Ｖｐ２４−ｇｐ４１融合クンバクを表現するのに十分な時間続けられる 。次に、表現されたタンパクを該培養物から回収する。

しかし、当分野で周知の如く、回収した該表現タンパクは、細胞プロセンシング のために初期翻訳生成′！＃五に存在したアミノ−末端メチオニン残基を典型的 には含まない。

培養物からの表現タンパクの回収法は当分野で周知であり、周知の生化学的手法 を用いた該培養物のタンパク含有部分の分画を含む０例えば、ゲル濾過、ゲルク ロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、イオン交換、アフィニティクロマトグ ラフィーなどタンパクの分画のために公知の方法が該培養物中に見出される表現 タンパクの単離のために利用できる。更に、免疫化学的方法、例えばイムノアフ ィニティ法、免疫吸着法などは周知の方法で実施ンバクおよ　ＨＴＶ　−Ａ５’ ｉ血ｌ炭ともう一つの態様において、本発明は木質的に原核抗原（即ち、ホスト 細胞特異的抗原）および他のＨＩＶ−関連タンパク両者を含まないＨＩＶｐ２４ タンパクを含有する組成物を目的とする。

１本質的に含まない”なる用語は、ＨＩＶｐ２４タンパク対原核抗原または他の ＨＩＶ−関連タンパクの比が少なくとも１０００：１、好ましくは１０．０００ 　：　１であることを意味する。

組換えタンパク処方物中の汚染タンパクの存在およびその量は周知の方法で測定 できる。好ましくは、この組成物のサンプルをドテシル硫酸ナトリウム−ポリア クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で処理して、該組換えタンパク を存在するあらゆる不純物タンパクから分離する。このサンプル中に存在するタ ンパクの量の比を、次いで当分野で周知のデンシトメトリーソフトレーザ走査法 によりて決定する。これについては、Ｇｕｉｌｉａｕ等のＡｎａｌ、　Ｂｉｏｅ ｈｅｍ、＋　１９８３　＋上１主、　ｐｐ、　２７７−２８７を参照のこと。

好ましくは、この組成物中に存在するＨＩＶｐ２４タンパクは第１Ａ図の残基１ または２〜２３２で表されるアミノ酸残基配列を有する。

ＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクは、本発明においては、アミノ末端から カルボキシ末端までの、第１Ｂ図に示された残基１または２から約２４８まで、 第１Ｃ図に示された残基１または２から約２４９まで、第１Ｄ図に示された残基 １または２から約３２４まで、あるいは第１Ｅ図に示された残基１または２から 約２７４までに対応するアミノ酸残基配列をもつものとされる。好ましいＨＩＶ ｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクは第１Ｂ図の残基１または２から約２５７まで 、第１Ｃ図の残基１または２から約２５８まで、第１Ｄ図の残基１または２から 約３３３まで、あるいは第１Ｅ図の残基１または２から約２８３までの残基配列 に対応する、好ましくはこれと同一の配列をもつ。また、本発明はＨＩＶｐ２４ −ｇｐ４１融合タンパクを含有する組成物にも関する。

本発明の好ましいＨＩＶ抗原は、アミノ酸残基配列において、第１Ａ図の残基１ または２から２２４まで（即ち、ｐ２４由来の部分）の配列に対応する共通のア ミノ末端部分をもち、かつ異るカルボキシ末端をもち、好ましくはＨＩＶｇｐ４ １エピＩ・−プを免疫学的に模倣（ｍｉｌＩｌｉｃｋｉｎｇ）できるアミノ酸残 基配列を含む。例えば、好ましいＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクは意図 した数個のカルボキシ末端もつものとして、第６図に示されている。好ましいＦ ｌ［において、このＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクは、分子内Ｃｙｓ−Ｃ ｙｓ結合のために、非還元型にあり、即ち実質的にスルフヒドリル基を含まない 。

好ましい組成物において、以下に記載するようなＨＩＶｐ２４タンパク、ＨＩＶ ｐ２４−ｇｐ４１融合クンバクまたはＨＩＶｐ２４−Ａ５複合体は製薬上許容さ れる担体中に存在する。

ここで使用する“製薬上許容される°なる語は、哺乳動物に投与した場合に胃障 害、めまいなどのアレルギー反応または類似の面倒な反応を起こさない分子状物 質並びに組成物をいうものとする。製薬上許容される担体はこの処方の意図した 用途に応じて様々な形状をとることができる。いずれにしても、この組成物は少 なくとも約０．００１％〜約９９％の組換えＨ＋Ｖｐ２４タンパク、ＨＴＶｐ　 ２４−ｇｐ４１融合タンパクまたはＨＩＶｐ２４−Ａ５複合体を活性成分として 含み、典型的には約１０μｇ／−なる濃度で含む。

一例として、本発明の組換えＨＩＶｐ２４タンパクは減面懸濁液または溶液、あ るいは適当な保存剤を含む等張処方物などの液状組成物形状で使用できる。

本発明）Ｍｉ換えＨＩ　Ｖｐ　２４タフバク、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タン パクまたはＨＩＶｐ２４−Ａ５複合体はリポソームとして使用することもできる 。当分野で公知であるように、リポソームは、一般に燐脂質あるいは他の脂質物 質から誘導される。リポソームは水性媒体中に分散された単層または多一層永和 液晶により形成される。任意の非毒性の生理的に許容される、かつ代謝性のリポ ソーム形成性脂質が使用できる。リポソーム形の本発明の組成物は、本発明（７ ）ＨｆＶｐ２４タンパク、ＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクまたはＨＩＶ ｐ２４−Ａ５以外に、安定剤、保存剤、賦形側などを含むことができる。好まし い脂質はリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン類）（天然並びに合成 ）である。

リポソームの形成法は当分野で公知である０例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ。

Ｅｄ、　’Ｍｅｔｈｏｄｓ　＋ｎＣｅ１ｌ　Ｂ＋ｏｌｏｇｙ”　、　１９７６、 　ｖｏｌ　Ｘ■ｐ３３以後、アカデミツクブレス刊、ニューヨークＮＹを参照。

哺乳動物中に抗−ｐ２４抗体を誘導するのに存用な組成物は本発明（７）ＨＩ　 Ｖｐ　２４９７ハ’）、ＨＩ　Ｖｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクまたばＨＩＶ ｐ２４−Ａ５複合体を含み、これらは中和された製薬上許容される塩として該組 成物に処方されている。製薬上許容される塩は酸付加塩（ポリペプチドまたは抗 体分子の遊離アミノ基と共に形成される）を含み、これらは、例えば塩酸または リン酸などの無機酸、酢酸、修酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸によって形 成される。遊離カルボン酸基で形成される塩も、例えばナトリウム、カリウム、 アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄水酸化物などの無機塩基、トリメチルア ミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導でき る。

ＨＩＶｐ２４タンパク−１ＨＩＶｐ２４ｇｐ４１融合タンパク−またはＨＩＶｐ ２４−Ａ５複合体含有組成物は、例えば単位投与量を注射するなどの非経口経路 で投与される。本発明で用いる組成物に関連して使用される場合、用語“単位投 与量”とは、ヒトに対する単位投薬体として適した物理的に別々の単位を意味し 、各単位は必要な担体と共に、所定の治療効果を得るべく計算された有効物質の 所定量を含む。

この組成物は投薬処方に適した方法で、かつ治療上有効な量で投与される。投与 すべき量は治療すべき対象、該対象の免疫系の該有効成分の利用能および必要と される免疫応答の程度に応じて変化する。投与すべき活性成分の正確な量は医師 の判断に依存し、かつ患者毎に異る。しかし、適当な投与量の範囲は、投与経路 に応じて、体重１　ｋｇ当たり組換えＨＩＶＸ）２４タンパク、ＨＩＶｐ２４− ｇｐ４１融合タンパクまたはＨＩＶｐ２４−Ａ５複合体１〜１０μｇ程度である 。典型的に、ヒト成人の単位投与量は、腸管外注射で投与した場合には１００〜 ２００μｇである。

上記の担体成分に加えて、ここに記載の薬理処方物は必要に応じて、１つ以上の 追加の担体成分、例えばバインダ、界面活性剤、増量剤、滑剤、保存剤（酸化防 止剤を含む）などおよびレシピエンドの血液に対し等張性を該処方物に付与する ために含められる物質をも含存し得る。

Ｃ，ＨＩＶ　２４−Ａ５　” 本発明はアミノ酸残基側鎖を介してＡ５と記されるポリペプチドに機能可能に結 合したＨＩＶｐ２４タンパクを含む抗原性複合体にも関する。ポリペプチドＡ５ は以下の式で示されるアミノ酸残基配列をもつ。

Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ− Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ −Ａ　ｌａ−Ｖａ　１−　Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ。

ポリペプチドＡ５は、そのアミノ酸残基配列として、ＨＩＶｇｐ４１アミノ酸残 基配列の一部を含み、がっＨＩＶＰ２４−Ａ５複合体として使用する場合には、 目的のＨＩＶｐ２４タンパクへの機能的結合を容易にするために、カルボキシ末 端において、上記式に示されたシスティン（Ｃｙｓ）残基をも含む。

アミノ酸残基側鎖を介して機能的にポリペプチドを結合する方法は当分野におい て周知であり、様々な側鎖上での１以上の官能基を介しての結合を含み、各ポリ ペプチド主鎖を与えるが、これは共有結合で結合（カップリング）し、しがも少 なくとも１つの側鎖だけ離れている。

有用な側鎖官能基はε−アミノ基、βまたはγ−カルボキシル基、チオ基（−３ Ｈ）、および芳香族環（例えば、チロシンおよびヒスチジン）を含む。上記官能 基の各々を用いてポリペプチドを結合する方法はＥｒｌａｎｇｅｒ＋　Ｍｅｔｂ ｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋　１９８０　。

７０、　Ｐ、８５　；　Ａｕｒａｍｅｅｓ等＋　５ｃａｎｄ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎ ａｌ、＋　１９７８　。

主、別冊７．　ｐｐ、　７−２３　；およびＮｅ５ｌｏｖ等の米国特許第４゜４ ９３、７９５号に記載されている。これら文献を本発明の参考文献とする。更に 、サイト−特異的カップリング反応（Ｒｏｄ　ｗｅｌｌ等。

Ｂｆｏｔｅｃｈ、、１９８５，３．　ρＩ）、８８９−８９４）は、眩ポリペプ チドの生物学的活性が実質的に減衰しないように実施することができる。

更に、当分野で周知の如く、ＨＩＶｐ２４およびポリペプチドＡ５は両者ともそ の本来の形で使用することもでき、あるいはりジン残基のサクシニル化あるいは システィン−チオラクトンとの反応によってその官能基含有率を変えることがで きる。スルフヒドリル基を２−イミノチオランまたは３−（３−ジチオピリジル ）プロピオネートのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルとの反応またはアミ ノ官能基によりポリペプチドに組込むこともできる。

このポリペプチドもヘキサメチレンジアミンまたは他の同様なサイズの２官能性 分子などのスペーサアームを導入して変性して連結を容易にすることができる。

ＨＩＶｐ２４タンパクとポリペプチドＡ５とのカップリングのための連結を形成 する上で特に有用なものとしては多数の複素二官能性試薬があり、これらは一つ の官能基端部でジスルフィド結合を形成し、かつ他方の端部でペプチド結合を形 成する。その例はＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピ オネート（ＳＰＤＰ）を含む、この試薬はそれ自身と一つのタンパク中のシステ ィン残基との間にジスルフィド結合を形成し、かつリジン上のε−アミノ基また は他方のクンバクの他の遊離アミノ基を介してアミド結合を形成する。様々なこ の種のジスルフィド／アミド結合形成試薬が知られている。これについては、例 えばｆｌｌｕｎ、　Ｒｅｖ、、１９８２　、　ＪＪ＝＊　Ｐ。１８５を参照のこ と、他の二官能性カップリング試薬はジスルフィド結合よりもむしろチオエーテ ル結合を形成する。多くのこれらのチオエーテル結合形成試薬が市販されており 、その例は６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４− （Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸などの反応性エステ ルを包含する。これらをサクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−二トロー４ −スル、＋７ｉ１５ナトリウム塩と結合することによりそのカルボキシル基を活 性化できる。本発明の方法に特に好ましいカップリング剤はサクシンイミジルー ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ Ｃ）　（ＰｉＰｒｃｅ社、ロンクツオード、ＩＬから入手できる）である、この 例示はすべてを網羅するものではなく、かつ名を挙げた化合物の変性体も勿論使 用できる。

ポリペプチドＡ５は当ポリペプチド技術の当業者には公知の任意の技術によって 合成できる。化学的合成法、例えば固相マリフィールド−型合成法が、純度、抗 原特異性、望ましがらぬ副生成物を含まないこと、製造が容易であること等の理 由から、好ましい、また、Ｍａｒｒｉｆ　１ｅｌｃ１等のＪ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ ＋＊、　Ｓｏｃ、＋　１９６３．　８５＋ｐｐ、２１４９−２１５４に記載の方 法、およびＢｏｕｇｈ　ｔｏｎ等のＪｕｔ、　Ｊ、Ｐｅｐｔ、、　Ｐｒｏｔ、　 Ｒｅｓ、＋　１９８０　、工６．　ｐｐ、３１１−３２０に記載の方法に従って 実施できる。利用できる多くの技術の優れた概説は、固相ペプチド合成について はＪ、Ｍ、　Ｓｔｅｗａｒｄ　＆　Ｊ、Ｄ。

Ｙｏｕｎｇ、″５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｇｅ　Ｐｅｆｔ１ｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ”、　Ｍ、）１．　Ｆｒｅｅｍａｎ社刊、サンフランシスコ、１９６９　ＨＭ、 　Ｂｏｄａｕｓｚｋｙ等、’　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”、　Ｊｏｈ ｒ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ社、第２版、１９７６；およびＪ、Ｍｅｉｅｎｈ ｏｆｅｒ＋”）ｌｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　＆　Ｐｅｐｔ、１ｄｅｓ ”＋　１９８３　、　２　。

ｐ　４６　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　にューヨーク）に、また古典的 な溶液合成についてはＥ、　５ｃｈｒｏｄｅｒ　＆　Ｋ、　Ｘｕｂｋｅ、　”Ｔ ｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ″＋１９６５＋土、　Ａｃｏｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　 にューヨーク）にみることができる。これらを本発明の参考文献とする。

Ｈ−並逝至 本発明のキット形式にある診断系は、少なくとも１回のアッセイに対して十分な 量で、本発明のＨＩＶｐ２４タンパク、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクま たはＨＩＶｐ２４−Ａ５複合体を別々に包装された試薬として含む、この包装さ れた試薬の使用のための指針も典型的には包含される。

“使用の指針”は典型的には、試薬濃度あるいは少なくとも１回のアッセイ法に 必要なパラメータ、例えば混合すべき試薬とサンプルとの相対量、試薬／サンプ ル混合物の維持時間、温度、緩衝条件などを記述する明確な表示を含む。

好ましい態様において、本発明の診断系は更に標識、即ち組換えＨＩ　Ｖ　ｐ　 ２４タンパクを含む複合体の形成を信号で与えることのできる指示手段をも含む 。

ここで用いる１標ｉＪ　（ｌａｂｅｌ）”および１指示手段（ｉｎｄｉｃａｔｉ ｎｇｌｌｌｅａｎｓ）　”は、その様々な文法上の形式において、直接または間 接的に検知し得る複合体の存在を示す信号の発生に関与する原子団または分子団 を意味する。°インビボ”標識または指示手段はヒトの身体内で有用なものであ る。あらゆるＦｔｆｉまたは指示手段が、本発明の抗体またはモノクローナル抗 体組成物の一部である表現されたタンパク、ポリペプチドまたは抗体分子に結合 もしくはこれに組込まれ、あるいは別々に使用され、かつこれら原子団または分 子団は単独でもしくは付随的な試薬との組合せで使用できる。

このような標識はそれ自体臨床診断化学で周知であり、新規なタンパク法および ／または系と共に用いられる限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。

標識の結合、即ちポリペプチドおよびタンパクの標識は当分野で周知である０例 えば、ハイブリドーマから作られた抗体分子は、培地中の一成分として与えられ た放射性同位体含有アミノ酸の代謝による組込みを通して標識できる０例えば、 Ｇａ１ｆｒｅ等のＭｅｔｈ。

Ｅｖｚ）ｖ＋ｏ１．、　１９８１．　７３．　ｐｐ、３〜４６参照、活性化官能 基を介してクンバクを複合化もしくは結合する方法が特に有用である。

これについては、例えばＡｕｒａｍｅａｓ等の５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ａｌ、＋号を参照のこと。

この診断系は、また、好ましくは別々に包装されたものとして、特異的結合剤を も含むことができる。“特異的結合剤”は本発明の試薬種を選択的に結合し得る 分子状物であるが、それ自体は本発明のタンパク表現生成物、ポリペプチドまた は抗体分子ではない、特異的結合剤の例は抗体分子、補体タンパクまたはそのフ ラグメント、タンパクＡなどである。好ましくは、この特異的結合分子は、本発 明の組換えタンパクが複合体の一部として存在する場合にはこれと結合できる。

好ましい態様において、該特異的結合剤は標識されている。しかし、この診断系 が標識されていない特異的結合剤を含む場合、この試薬は典型的には増幅手段ま たは試薬として使用される。これらの態様において、該標識された特異的結合剤 は、この増幅手段が試薬種含有複合体に結合している場合、特異的に該増幅手段 を結合できる。

本発明の診断用キットは“ＥＬＩＳＡ”フォーマットで使用されて、血清、血漿 または唾液などの体液サンプル中の抗−Ｈ［Ｖｌ）２Ａ抗体の存在およびその量 を検知できる。“ＥＬＩＳＡ”とは酵素結合抗体法を意味し、ここでは固層に結 合した抗体または抗原と、酵素−抗原または酵素−抗体複合体とを使用してサン プル中に存在する抗原または抗体を検知しかつその量を定量する。

ＥＬＩＳＡ法についての記載はり、　Ｐ、　５ｉｔｅｓ等の′″Ｂａ５ｉｃ　ａ ｎｄＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　第４版の第２２章（Ｌａｎｇ ｅ　ＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈａｓ　Ａ１ｔｏｓ＋　 ＣＡ）、１９８２および米国特許第３．６５４，０９０号、同第３，８５０，７ ５２号および同第４，０１６，０４３号に見出せる。これらを本発明の参考文献 とする。

かくして、好ましいＢｍにおいて、本発明のＨＩＶｐ２４タンパク、）（ＩＶｐ ２４−ｇＰ４１融合クンバクまたはＨＩＶｐ２４−Ａ５複合体は固体マトリック スに固定して、固体担体とし、目的とする診断系において別途包装されたものと することができる。

試薬は典型的には該固体マトリックスに水性媒質からの吸着により固体されるが 、他の当業者にとって周知の固定法を用いることもできる。

有用な固体マトリックスは当分野で周知であり、その例としてはＰｈａｒｍａｃ ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（ビスカタウエイ、ＮＪ）から５ＥＰＨ ＡＤＥＸなる名称で入手できる架橋デキストラン、アガロース、Ａｂｂｏｔｔ　 １．ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ノースジカゴ、ＩＬ）から入手できる径約１μ 〜約５ｉｍのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリア クリルアミド、ニトロセルロース−あるいはナイロン主体のウェブ、例えばシー ト、ストリップまたはパドル（ｐａｃｌｄｌｅ）あるいはポリスチレン製または ポリ塩化ビニル製などのマイクロクイタブレートのウェル、チューブまたはプレ ートなどを挙げることができる。

ここに記載する任意の診断系のＨＩＶｐ２４タンパク、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１ 融合クンバク、ｐ２４−Ａ５複合体、標識特異的結合剤または増幅剤は溶液、液 状分散体または実質的に乾燥した粉末（例えば、凍結乾燥状態にあるもの）とし て提供できる。上記指示手段が酵素である場合、この酵素の基質も診断系の別の 包装に与えることができる。上記のマイクロクイタブレートなどの固体担体およ び１種以上のパンファーも本発明の診断系の別途包装要素として含むことができ る。

ここで、診断系に関連して述べる包装体は診断系で通常使用されているものであ る。このような包装はガラスまたはプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプ ロピレンおよびポリカーボネート）製のビン、バイアル、プラスチックおよびプ ラスチックホイルを積層したエンベロープなどである。

去旌斑 以下の実施例は例示の目的でのみ与えられるものであり、本発明の範囲を同等限 定するものではない。

Ｌ二■蓮入 ＨＴＬＶＩＩＩＢのｐＨＸＢ２ＣＧプラスミドクローンからのｇａｇ領域（Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（ベテスダ、ＭＤ）のＤｒ 。

Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇａ１ｌｏから入手）をプラスミドｐＨＸＢ　２ＣＧのＥｃｏＲ Ｖ制限酵素消化により単離し、得られた２、８６ｋｂのフラグメントを単離し、 連結により変性ｐＵＣ８ベクタ（ｐＵＣ８ＮＲ）のＥｃ。

ＲＶサイトに挿入してプラスミドｐＵＣＧＡＧを作製した（第２Ａ図の工程１参 照）。

このプラスミド（ｐＬＪＣＧＡＧ）は、以下の一連の手続きに従って変異誘発さ れて、ｇａｇのｐ２４構造遺伝子の開始点において、ＡＴＧ翻訳開始コドンとＮ ｄｅｌ制限酵素サイト（ＣＡＴＡＴＧ）とを生成した（第２Ａ図の工程２に概説 した）、旦、ＬＬのメチル化欠損ｄａｍ−株（ＮＥＢ）にｐＵＣＧＡＧを形質転 換した後、Ｃ１ａｌおよびＰｓｔｌ制限酵素で切断することによりｐ２４アミノ 末端ニおい”ＣＲＥ　Ｉ）　Ｕ　ＣＧ　Ａ　ＯＤ　Ｎ　Ａ中にギャップを形成し て、ｐ２４アミノ末端から小さなりＮＡ上セグメント失われたギャップをもつｐ ＵＣＧＡＧを形成した。制限酵素ＥｃｏＲ１で切断した１０μｇのｐＵＣＧＡＧ と１０μｇのギャップをもつｐＵＣＧＡＧＤＮＡを１％アガロースゲル上での電 気泳動に付し、これらのＤＮＡフラグメントを夫々別々にエレクトロエリューシ ョン（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）により　（ＩＳＣＯ（リンカン、ＮＥ） 社からのモデル１７５０サンプル濃縮器を使用）、分離し、併合し、フェノール −クロロホルム５０１５０混合物で２度抽出し、酢酸ナトリウム（最ｎ　ｔ７４ 度１００．ｍＭ）と３容のエタノールとを加えて沈殿させた。

沈殿したＤＮＡを遠心処理により集め、水に２５μｇ／−なる濃度に再懸濁させ た。同体積のアニール用バンフｙ−（８０％ホルムアミド、１００ｍＭ）リス、 ｐＨ８，０，２５ｍＭＥＤＴＡ）を加えた後、該再懸濁したＤＮＡを５分間沸騰 させて変性し、かつ３７℃にて３０分間アニールした。このアニール処理したＤ Ｎ、Ａを等量の水で希釈し、上記の如くエタノール中で沈殿させて、沈殿したア ニール処理されたＤＮＡを形成した。

このＮｄｅｌおよびＡＴＧ配列を、以下の合成オリゴヌクレオチドを用いて、ｐ ２４遺伝子のアミノ末端に機能可能に結合させた。

５’　ＣＣＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣ３’ このオリゴヌクレオチドの５′末端の１０個のヌクレオチドと３′末端の９個の ヌクレオチドはＨＴＬＶＩＩ［ＢＤＮＡ配列（ライスコンシン大学の遺伝子デー タベース）と相同である。介在するヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド内お よびｐ−，２ｉ内でのこれら配列の発現中にこの配列から作られると思われるＲ ＮＡ内における２次的構造の形成を最小化するように選ばれる。

上記オリゴヌクレオチド（ファルマシアジーヌアセンブラー（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓ５ｅｎｂｌｅｒ）上で合成された）４０ピコモルを（↑、　 Ｍａｎｉａｔ４ｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ によるＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　１９８２．　Ｉ）、１２５　（コ ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−）に記載の文献のように）ホスホリル化 し、上記の沈殿させアニール処理したＤ　Ｎ　Ａ、　２．５μｇと混合した０次 いで、この混合したＤＮＡを６５℃で５分間加熱してアニールし、リガーゼバッ フ１−中（ｏｐ、ｃｉｔ、、　ｐ　４７４）で１時間に亘り室温まで冷却した。

沈殿させアニールした上記のＤＮＡとアニールしたオリゴヌクレオチドをもつギ ャップのある鋳型とを含む、得られたＤＮＡ分子（即ちギャップをもつ鋳型）は 、リガーゼバッファー中で、２５、μｍｏ１の各デオキシヌクレオチドトリホス フェート、５０μｍｏ１のアデノシン三リン酸および旦、ユ、、１ＤＮＡポリメ ラーゼのクレノフラグメンｌ−１単位並びにＴ４ＤＮＡリガーゼ５単位の存在下 で１５℃にて３時間インキュベートすることによりインビトロで修復した。

大腸菌のＪＭ８３株のコンピテント細胞への形質転換の後に、バクテリアコロニ ーをニトロセルロース上に置いた後に放射性ラベルされたオリゴヌクレオチドへ のハイブリッド形成によりスクリーニングした（前出、２５０〜２５１，３１３ 〜３２９頁）。

ｐ２４遺伝子のアミノ末端配列のための下記のプラスミドＤＮＡ配列（ｐＵｃｐ ４０．第２Ａ図）を与える単一コロニーを、この手順により分離した。

Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　・・・５　’　ｔａｃｃａｔ　ＡＴＧ　ＣＣ Ａ　ＡＴＣＧＴＧ　・・・３　’ｐ４０と呼ばれるｐ２４−ｐ１５１５融ンパク をエンコードし、上記変異誘発により作られたＮｄｅ１制限酵素サイトとｇａｇ 遺伝子のカルボキシ末端側のＥｃｏＲＶサイトとの間に位置するｐＵｃｐ４０か らのＤＮＡフラグメントが、先ずプラスミドｐ　ＵＣｐ　４０をＮｄｅｌ及びＥ ｃｏＲＶで消化し、次にアガロースゲル上での分離、分離されたフラグメントの 抽出及び沈殿によって単離された。

プラスミドｐＧＥＸ７ＤＮＡは、Ｎｄｅｌ及びＥｃｏＲＶでの消化により線状化 された。プラスミドｐＧＥＸ７は、１９８８年６月９日にアメリカン　タイプ　 カルチュア　コレクシラン（ＡＴＣＣ）にプラスミドＰＨＡＧＥ３８として寄託 されてＡＴＣＣ寄託番号４０４６４を与えられたバクテリア表現ベクターである 。

このプラスミドは、ラムダバクテリオファージプロモーター（ＰＬ　）　、その 温度怒受性すブレンサーのための遺伝子（ＣＩ８５７＞、共通バクテリアリポソ ーム結合サイト及び複製の開始点（ｏｒｉ）を含む。

Ｎｄｅｌ及びＥｃｏＲＶでのｐＧＥＸ７の消化は、二つの線状フラグメントの製 造を結果し、その一つはａｍｐ’及びＣｌ８５７遺伝子及び複製の開始点を含み かつＮｄｅｌ及びＥｃｏＲＶ粘着末端を有する。ｐＵｃｐ４０の上記のｐ４０遺 伝子含有Ｎｄｅ　Ｉ　／　ＥｅｏＲＶ制限フラグメントは次に、ｐ　ＧＥＸ　７ 　Ｎｄｅｌ／ＥｃｏＲＶ　ａｍｐ’遺伝子含有フラグメントにそれらの夫々のＮ ｄｅｌ及びＥｃｏＲＶ末端を介してリゲートされて、プラスミドｐＧＥＸｐ　４ ０を形成した（ステップ３．第２Ａ図）。

ｐ１５をエンコードするｐＧＥＸｐ４０の配列は、酵素ＰｐｕＭＩ及びＢａｎＨ Ｉでの制限消化によりプラスミドｐＧＥＸｐ４０から除かれた。その後、ｐ２４ 遺伝子の３′末端が、ＰｐｕＭＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素サイト及び翻訳終止コ ドンを含む下記の二つの合成オリゴヌクレオチド（合成リンカ−）を組込むこと によって、第２Ａ図中のステップ４でまとめて示すように再構成された。

５’ＧＡＣＣＣＧＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＧ　 ３’３’　ＧＧＣＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＣＣ ＴＡＧ　５’得られるｒＤＮＡプラスミド（ｐＧＥχｐ２４）は、ｐ２４のカル ボキシ末端の下記の配列をエンコードする。

Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　）Ｉｉｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　＊　章 ５　’　ＧＡ　ＣＣＣＧＧＣＣＡＴ　ＡＡＧ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＴＧ 　ＴＡＡ　ＴＡＡ　Ｇ　３　’即ちｒＤＮＡプラスミドｐＧＥＸｐ２４は、両セ グメント上に存在するＮｄｅｌ及びＢａｍＨ１粘着末端を介して機能可能に結合 された第−及び第二の二本鎖ＤＮＡセグメントを含む、第一のセグメントは、組 換えＨＩＶｐ２４タンパク構造遺伝子を含み、そのＮｄｅｌ末端（５′コーデイ ング鎖末端）の塩基１５からそのＢａａＨＴ末端（３′コーデイング鎖末端）の 塩基７１８までの第１Ａ図により示されるヌクレオチド塩基配列を有する。第二 のセグメントは、表現ベクターであり、ｐＧＥＸ７のアンピシリン耐性（ａｍｐ ゝ）遺伝子含有Ｎｄｅ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。

Ｂ０ｗム　ンバ　ゴー゛する　゛告゛　−ｑ製造ｐＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１　： 実施例ＩＡで作ったプラスミドｐＧＥＸｐ２４を制限酵素ＰｐｕＭＩで消化して 、ＰｐｕＭＩ粘着末端を持つ線状化されたｐＧＥＸｐ　２４ＤＮＡセグメントを 形成した。

ＰｐｕＭＩ粘着末端を有し、ＨＩＶｇｌ）４１エピトープを免疫学的に模倣する ことができるアミノ酸残基配列（ポリペプチドＡ５）をコードするＤＮＡセグメ ントを、線状化されたｐＧＥＸｐ２４ＤＮＡにリゲートして、組換えＤＮＡプラ スミドｐＧＥＸｐ２４ｇり４１を形成した。リゲーションの結果として、プラス ミドｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１は、塩基１６から塩基７８６まで第１Ｂ図に示すよ うなヌクレオチド塩基配列により定義される）（ｌＶｐ２４−ｇｌ）４１融合タ ンパク（ｐ２４−Ａ５）構造遺伝子を含む、即ち、ｐＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１は 、両セグメンＩ・上に存在するＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩ粘着末端を介して機能可 能に結合された第−及び第二の二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａセグメン）・を含むプラスミド である。第一のセグメントは、ＨＩＶｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパクをエンコ ードする構造遺伝子を含み、そのＮ＋］ｅｌ末端（５′コーデイング鎖末＃Ａ） の塩基１５からそのＢａｎＨＩ末端（３′コーデイング鎖末端）の塩基７９３ま での第１Ｂ図で示すヌクレオチド塩基配列を有する。

第二のセグメントは、プラスミドｐＧＥＸ７のａ…ｐ１遺伝子含有Ｎｄｅ　Ｉ　 ／　ＢａｍＨＩ　ＩＩ限フラグメントである。　ＨＩ　Ｖｐ　２４−ｇｐ４１融 合クンバク構造遺伝子は、ｐＧＥＸ７表現コントロール要素たとえばラムダプロ モーターに機能可能に結合され、従って相容性バクテリアホストがｐ　ＧＥＸ　 ｐ　２４ｇｐ４１により形質転換された時に表現される。

ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−２：ＰｐｕＭＩ粘着末端を持つ線状化されたｐＧＥＸ ｐ２４ＤＮＡセグメントを、ｐＧＥＸｐ２４ｇρ４１について上述したように作 った。ＰｐｕＭＩ粘着末端を持ち、Ｈ１■タイプ２　（ＨＩＶ−２）エピトープ を免疫学的に模倣できるアミノ酸残基配列（ポリペプチドＡ２）をコードするＤ ＮＡセグメントが、線状化されたｐＧＥＸｐ　２４ＤＮＡにリゲートされて、組 換えプラスミドｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−２を形成した。リゲーションの結果と して、プラスミドｐＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１　２は、塩基１６から塩基７８９ま で第１Ｃ図に示すようなヌクレオチド塩基配列により定義されるＨＸＶｐ２４− ｇｐ４１−２融合タンパク（ｐ２４−Ａ２）構造遺伝子を含む、即ち、ｐＧＥＸ ｐ２４ｇ＋）４１−２は、両セグメント上に存在するＮｄｅｌ及びＢａｍＨ１粘 着末端を介して機能可能に結合された第−及び第二の二本鎖ＤＮＡセグメントを 含むプラスミドである。第一のセグメントは、Ｈ１Ｖｐ２４−ｇｐ４１−２融合 クンバクをエンコードする構造遺伝子を含み、そのＮｄｅＩ末端（５′コーデイ ング鎖末端）の塩基１５からそのＢａｗＨＩ末端（３′コーデイング鎖末端）の 塩基７９６までの第１Ｃ図で示すヌクレオチド塩基配列を存する。第二のセグメ ントは、プラスミドＰＧＥＸ７のａｍｐ’遺伝子含有Ｎｄｅｌ／ＢａｍＨＩ制限 フラグメントである。ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−２融合タンパク構造遺伝子は、 ＰＧＥＸ７表現コントロール要素たとえばラムダプロモーターに機能可能に結合 され、従って相容性バクテリアホストがｐｃＥＸＰ２４ｇＰ４１　２により形質 転換された時に表現される。

Ｃ，ボ１ペプチド鴇゛シ　・１ム　ンパク　コードする　′告這倣王立袈遣 ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−１．２，１，１　：実施例ＩＢにおいて作ったプラス ミドｐ　ＣＥＸ　Ｐ　２４ｇｐ４’ｌ及びｐ　ＧＥＸ　ｐ　２４ｇｐ４１−２を 夫々側々に、制限酵素ＡｖａＩ［で完全に消化して、夫々の場合にＡｖａＩＩ粘 着末端を有し、ＨＩＶｇｐ４１エピトープを免疫学的に模倣できるアミノ酸残基 配列（本明細書で夫々ポリペプチドＡ５及びＡ２と呼ぶ）を夫々コードする二本 鎖ＤＮＡセグメントを作った。ポリペプチドＡ５又はポリペプチドＡ２をコード するＤＮＡセグメントは夫々、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動に付され、各 ＤＮＡセグメントは実施例ＩＡ記載のようにエレクトロエリューションによりゲ ルから分離され、沈澱された。

ポリペプチドＡ５及びＡ２をコードする沈澱されたＤＮＡセグメントは、上で作 られたＰｐｕＭＩにより線状化されたｐｃＥｘｐ２４］ＮＡセグメントと混合さ れ、三つの混合されたＤＮＡセグメントはリゲートされて、同じ粘着末端を総て 持つ三つのＤＮＡセグメントのリゲーシッンにより可能なように、使用セグメン トの種々の組合せを持つプラスミドを形成した。形成されたプラスミドが大腸菌 中に形質転換され、夫々上述のように単離された。

単離したプラスミドを次に、制限酵素消化及び１％アガロース上での電気泳動に より特徴づけた。ＰｖｕＩＩで消化されたプラスミドは、ｐＧＥｐ２４ＤＮＡ部 分に一度開裂され、ポリペプチドＡ５をコードするＤＮＡセグメントに一度開裂 されたが、ポリペプチドＡ２をコードするＤＮＡセグメントに開裂されなかった 。ＨｐＡｔで消化されたプラスミドは、それらがポリペプチドＡ２をコードする ＤＮＡセグメントを含む場合には、開裂した。ポリペプチドＡ５、Ａ２又は両者 をコードするＤＮＡセグメントを含むプラスミドは、それらの開裂パターンに基 づいて選択され、前述のように単離され°た０次に、単離されたプラスミドの夫 々について核酸塩基配列を、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシシーケンシン グ法を用いて決定して、形成された塩プラスミドに存在する組み合されたＤＮＡ セグメントの構造を検証した。

一つの形成されたプラスミドｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１　１，２゜１．１は、塩基 １６から塩基１０１４までの第１Ｄ図に示すようなヌクレオチド塩基配列により 定義されるＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．２，１．１融合タンパク　ＣＰ　２４ −Ａ５−Ａ２−Ａ５−Ａ５）構造遺伝子を含む。即ち、ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１ −１．２゜１．１は、両セグメント上に存在するＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩ粘着末 端を介して機能可能に結合された第−及び第二の二本鎖ＤＮＡセグメントを含む プラスミドである。第一のセグメントは、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．２，１ ．１融合タンパクをエンコードする構造遺伝子を含み、そのＮｄｅｌ末端（５′ コーデイング鎖末端）の塩基１５からそのＢａｍＨＩ末端（３′コーデイング鎖 末端）の塩基１０２１までの第１Ｂ図で示すヌクレオチド塩基配列を有する。第 二のセグメントは、プラスミドｐＧＥＸ７のａｍｐ’遺伝子含有Ｎｄｅ　Ｉ　／ 　ＢａｎＨＩ制限フラグメントである。ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．２，１． １融合クンバク構造遺伝子は、ｐ　ＧＥＸ　７表現コントロール要素たとえばラ ムダプロモーターに機能可能に結合され、従って相容性バクテリアホストがｐＧ ＥＸ　ｐ２４ｇｐ４１−１．２，１．１により形質転換された時に表現される。

ｐＧＥＸｐ　２４ｇＰ４１−１，２　：実施例ＩＢにおいて作ったプラスミドｐ ＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１−２を制限酵素Ｈｐａｌ及びＢａａＨＩで完全に消化し て、Ｈｐａｌ及びＢａｗｌ粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡセグメントを作った。

二つのＤＮＡセグメントの小さい方は、消化混合物から実施例ＩＡ記載のように ゲル電気泳動、エレクトロエリューシッン及び沈澱により分離された。

実施例ＩＣにおいて作ったプラスミドｐ　ＧＥＸ　ｐ　２４ｇｐ４１−１．２， １．１は同様にＨｐａｌ及びＢａａＨＩで消化され、得られた二つのＤＮＡセグ メントの大きい方を同様に分離した。ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−２から分離した 小さなりＮＡ上セグメント、ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−１．２．１．１から分離 した大きなりＮＡ上セグメントを等モル比で混合し、リゲートして、作られたプ ラスミド中に各ＤＮＡセグメントの一つを持つプラスミドｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４ １−１．２を形成した。

リゲートされたプラスミドは大腸菌中に形質転換され、個々に分離され、上記の ように制限酵素消化及び電気泳動により特徴づけられた。プラスミドｐＧＥＸｐ ２４ｇｐ４１−１．２．１．１は塩基１６から塩基８６４まで第１Ｅ図に示すよ うなヌクレオチド塩基配列により定義されるＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．２融 合タンパク（ｐ　２４−Ａ５−Ａ２）構造遺伝子を含む、即ち、ｐｃＥＸｐ２４ ｇｐ４１−１．２は、両セグメント上に存在するＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩ粘着末 端を介して機能可能に結合された第−及び第二の二本鎖ＤＮＡセグメントを含む プラスミドである。第一のセグメントは、ＨＩ　Ｖｐ２４−ｇｐ４１−１．　２ 融合タンパクをエンコードする構造遺伝子を含み、そのＮｄｅｌ末端（５′コー デイング鎖末端）の塩基１５からそのＢａｍＨＴ末端（３′コーデイング鎖末端 ）の塩基７９３までの第１Ｂ図で示すヌクレオチド塩基配列を存する。第二のセ グメントは、プラスミドｐＧＥＸ７のａｍｐゝ遺伝子含有Ｎｄｅ　Ｉ　／　Ｂａ ｍＨＴ制限フラグメントである。ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．　２融合タンパ ク構造遺伝子は、ｐＧＥＸ７表現コントロール要素たとえばラムダプロモーター に機能可能に結合され、従って相客性バクテリアホストがｐＧＥＸｐ２４ｇρ４ １−１．　２により形質転換された時に表現される。

ポリペプチドＡ５の別の組合せを有する別のＨＩＶ関連ｐ２４−ｇＰ４１融合タ ンパク構造遺伝子が作られた。また更に、ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−１．２．１ ．１について上記した方法を用いてポリペプチドＡ５とポリペプチドＡ２の組合 せを作ることができる。たとえば、一般的表記ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−Ｘを１ 寺つ組換えＤＮＡプラスミドが作られた。ここでＸは、−１，１，−１゜１．１ 又は−１，１，１，１，１であり、夫々融合タンパクｐ２４−Ａ５−Ａ５、ｐ２ ４−Ａ５−Ａ５−Ａ５又はｐ２４−Ａ５−Ａ５−Ａ５に対応する。

ラムダプロモーター（ｐ　Ｌ）を含むプラスミドは通常、ＤＮＡの取扱いの間に 興味の遺伝子製品の表現を最小にするために、バクテリオファージラムダのリソ ゲンを含むバクテリアの株中に担持される。実施例１で記載したｐ、ＣＥＸ７に 基づくプラスミドは総て、大腸菌のＭＭ２９４株のリソゲン中に担持された。ｐ ＧＥＸ７のラムダプロモーターからの表現は、非怒染バクテリアホスト（たとえ ばＡＴＣＣ＃２７３２５としてＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州から入手 できる大腸菌株Ｗ３１１０）中にプラスミドを移すこと及び４２℃でのＣ！リプ レンサータンパクの失活によって実証することができる。Ｗ３１１０中のｐＧＥ Ｘｐ２４プラスミドは、５０μｇ／−アンピシリンを含むＬｕｒｊａブロス（Ｃ ；ＩＢＣＯラボラトリーズ、グランド　アイランド、ニューヨーク州）中で３０ ℃で一夜成長させ、翌朝に新鮮なブロスで１／１００希釈した。５５００ｎで０ ．５の光学密度に達した後、培養物を、連続的な激しい振とう下に４２℃の水浴 に移した。培養物の密度を種々の時点で測定し、不連続ｐＨドデシル硫酸すトリ ウム／ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によるバク テリアクンバクの表現の分析のために細胞サンプルを取り出した。ｐ２４０表現 の分析のこのタイプの例を第３図に示す、コーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブ リリアントブルーで着色されたタンパクの濃度から、４２℃で２時間の誘導の後 にｐ２４は全細胞タンパクの１０〜２０％を成すことが判る。

アボット（Ａｂｂｏｔｔ）　ラボラトリーズにより作られたＨＴＬＶｍ抗原テス トを用いての、これらバクテリア中で忰られたｐ２４の掘度の分析は、ｐ２４が バクテリアタンパク■当り４．３Ｘ１０”抗原単位で作られたことを示す（ロー リ−（Ｌｏｗｒｙ）アッセイにより測定して）。

Ｂ、（ＴＶ　−＝ム　ンバノ　ゴー゛告゛　−王５８１１ ｐＧＥＸｐ　２４ｇｐ４１７：形質転換された大腸菌株Ｗ３１１０を、実施例２ Ａ記載のように誘導及び培養した。組換え的に作ったｐ２４−ｇｐ４１融合クン バクは、下記のように形質転換細胞培養物から単離された。

３、　で　れた　えＨｌｖ　２４　ンバクの　１と立扼 組換えＨＩＶｐ２４の精製を４　”Ｃで行った。総てのバッファーは室温で作り 、使用前に４°Ｃに冷却した。Ｔｒｉｓバッファーは、Ｔｒｉｓ塩基（トリス〔 １ニトロキシメチ５ル〕アミノメタン）から作り、ＨＣｆで適当なＰｉ（に調節 した０組換えＨＩＶｐ２４タンパク組成物のタンパク濃度は、理論的アミノ酸組 成から計算される０、　１％溶液についての１．２９光学密度単位−〇−１の吸 光係数を用いて決定した（Ｄ、Ｂ、　ウェトラウファ−，アドバンスト　プロテ ィンケミストリー、１９６２，１７：３０３−３９０）、、’Ｐ２４組成物の純 度は、ラエムリ（ネイチア、１９７１，２２７８６８０−６８５）の手順に従い ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２，５％アクリルアミド）に付されたサンプルのコーマ シー　ブリリアント　ブルーＲ−２５０着色により評価した。

Ａ、　汐”び’Ｍ＼ 実施例ＩＡ記載のように作られたｐＧＥＸｐ２４で形質転換された大腸菌（Ｗ３ １１０）細胞（１７ｇ）を、０．１Ｍリン酸すトリウム（ＮａＨｚＰＯａから作 り、Ｎ　ａ　Ｏ）ＩでｐＨ７，ｏに調り　、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭベンズアミ ジン−）１ｃｊ２，０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、及びｌ Ｘｌ０−’ＭペプスタチンＡ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズリー州） を含むバッファー８５−中に懸濁した。Ｐ！濁物を、フレンチ圧力細胞プレス（ カタログ番号ＦＡＯ７３，ＳＬＭインスツルメンツ社、アーバン、イリノイ州） に１６．０００ｐｓｉで二度通し、得た均−物を遠心分離（１８，０ＯＯｘｇ、 ４０分間）に付した。遠心分離からの上澄（７Ｍ）を集め、タイプ７０．１　ｔ ｉミロ−ターベックマン　インスツルメンツ。

フレルトン、カリフォールニア州）を用いてＬ７−５５ｔＨ遠心分離器で１００ ，０ＯＯｘ　ｇで１時間再び遠心分離した。この段階で組換えＨＩＶＰ２４タン パクは可溶であり、上澄み中に留る。

Ｂ、硫　アンモニウム゛ 次に３０％飽和までの固体硫酸アンモニウムを、超遠心分離からの上澄み（７５ 威）に加え、塩を溶解させた後に溶液を３０分間撹拌した。？Ａ濁物を１２，０ ００　ｘ　ｇの遠心分離に２０分間付した。

得たペレットを、１００ｍＭτｒｉｓ−ＨＣＲを含むバッフｙ　−（ｐｉ（８， ５）の１５ｍ１中に溶解した。この溶液を、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！を 含むバッファー（ｐＨ８，０）　４１に対して５時間透析した。

Ｃ，アニオン六　クロマトクーフィー ２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　、　ｐＨ８，０で平衡化したＤＥＡＥセファロ ーズ（ファルマシア、ビスカタウェイ、ニューシャーシー州）のカラム（２，５ Ｘ１８ｃ＋ｓ）に透Ｆｉ″物を供給した（ｌＩｄＺ分）、サンプルの供給に続い て、カラムを５力ラム体積量の平衡バッファーで洗った（２戚／分）０組換えｐ ２４を、平衡バッファー（２ｄ／分）中の５０ｍＭ　ＮａＣｊ！でカラムから溶 出した。Ｐ２４（６７，４■〕を含んだアニオン変換カラムからの溶出物のｐＨ を固体Ｎａ）１．ＰＯ，で６゜８に調節し、姐換えｐ２４を３０％飽和までの固 体硫酸アンモニウムの添加により沈澱させた。塩の溶解に続いて、溶液を３０分 間撹拌し、組換えＰ２４を含む沈澱物を遠心分離（１２，０００ｘ　ｇ　。

３０分間）により集めた。

Ｄ、ヱ土４里 硫酸アンモニウム沈澱物を１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１（ｐＨ，５）　１０ｄ に溶解し、５０＋ｓＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｊ！！と２００ｍＭ　ＮａＣ１を含む バッファー（ｐＨ８，０）で予め平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマ シア）のカラム（２，５Ｘ　９０ｃｍ）でのクロマトグラフィ（０，５ｍ１／分 ）に付した０組換えＰ２４を含む百分（４ｄ）をプールしく４４ｍ１）　、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによる分析に付した（第４図）。

夫々１２及び２４μｇのタンパクを与えられたゲルレーンのコーマシー着色の後 に、汚染物質は見られなかった（第４図）、その後の、木質的に純粋な組換えＨ ＩＶｐ２４タンパクの貯蔵は、−２０°Ｃで行われた。

Ｅ、ウェス　−ンブロ・ト ｐＧＥＸｐ２４ｒＤＮＡで形質転換された大腸菌における組換えＨＩＶｐ２４タ ンパクの表現をｆＩｖ２するために、実施例２において１２．５％５ＤＳ−Ｐ、 ６Ｃ；Ｅにより分離された組換えＰ２４タンパクを含む細胞タンパクは、ウェス ターンプロット法を用いて分析に付された。トウビンら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ＋　７５：４３５０−４３５４　（１９７ ９）参照。

簡単に云えば、タンパクは５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースへ電気泳 動的に移された。得たプロット（面相−固定化抗原）は次に、エイズ患者からの ＨＩＶコア抗原陽性血清の１：１００希釈物と免疫反応させた。

第５図に示すこのウェスタンプロット分析の結果は、免疫反応性組換えＨＩＶＰ ２４タンパクが、ｃＴリプレッサータンパクの熱失活による表現の誘導の３０分 後に、形質転換された大腸菌において検出できるレベルで産生されたことを示す 。

４、九゛ノ　え）（ＩＶ　２４−　４１　ンハ／７（７）　”ＨＩＶｐ２４　ｇ ｐ４１融合タンパクＰ２４−Ａ５（７）精製は４°Ｃで行った。総てのバッファ ーは室温で作られ、使用前に４°Ｃに冷却された。このバフファーはＴｒｉｓ塩 基から作り、ＢＣ２で適当なｐ）Ｉに調節した。単離したｐ２４−Ａ５は、理論 的アミノ酸組成から計算される０、　１％溶液についての１．５６光学密度単位 −Ω゛ｌの吸光係数を用いて定量した（Ｄ、Ｂ、Ｗｅｔｌａｕｆｅｒ、　Ａｄｖ 、　ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ、、１９１１５２．１７　：３０３−３９０）−ｐ ２４−Ａ５の純度は、Ｌａｅｍ＋ｓｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ、１９７１．　２２７ 　：　６８０−６８５）の手順に従い５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２，５％アクリル アミド）に付されたサンプルのコーマシー　ブルー染色により評価した。

Ａ、　胞汐−び・當７・、一 実施例ＩＢ記載のように作られたｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１で形質転換された大腸 菌（Ｗ３１１０）細胞（１６ｇ）を、０．１　Ｍ　Ｔ）　ン酸ナトリウム（Ｎａ ＨｚＰＯ４から作り、ＮａＯＨでｐＨ７，、Ｏにｌｉｔり、５ＩＩＭＥＤＴＡ、 ５ｍＭベニ／ズアミジ７−ＨＣｊｌ！、０．５　ｍＭ７　Ｊ、　ニル）　’ｒ） Ｌｔスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、及びＩ　Ｘ　１０−’Ｍペプスタチ ンＡ（シグマ　ケミカル社）を含むバッファー８０ｍ１中に懸濁した。懸濁物を 、フレンチ圧力細胞プレス器（セルカタログ番号ＦＡ０７３．ＳＬＭインスッル メンツ社）　ニ１６，０００　ｐｓｉ　テ三度通し、得た均−物を遠心分離（１ Ｂ、０００ｘ　ｇ、４０分間）に付した。遠心分離からのペレット（２，４ｇ） を採り、０．１　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　、５ｍＭＥＤＴＡ及び５ ｍＭベンズアミジン−ＨＯ２を含むＦＥＢバッファー５Ｍに再懸濁した。懸濁物 を上記のように遠心分離した。得たペレット（１，７ｇ）を、５０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣＩ！、、３Ｍ尿素、０．５＋ｎＭＰＭＳＦ及びＩ　Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍヘプ スクチンＡを含むバッファー（ｐＨ８，５）８０ｍに再懸濁した。懸濁物を４℃ で１４時間撹拌し、次に上記のように遠心分離に付した。上澄みを集め、２５１ １Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣｆを含むバッフｙ　−（ｐＨ７，８）　２　ｆｔに対し て３時間透析し、次にベンクマンＬ７−５５超遠心分離器（タイプ７０．１Ｔｉ ローター）で１００．０００ｘ　ｇで１時間の遠心分離に付した。

Ｂ、左上左上ヌ　クロマトグーフィー 実施例４Ａの超遠心分離から作った上澄みを集め、２Ｍ酢酸でｐｎｓ、ｏに円節 した。この物質を２ｍ１１酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）２１に対して透析した （三度）、透析物を、０Ｍセファローズ（ファルマシア；２５１酢酸ナトリウム （ｐＨ５，０）で平衡化された）のカラム（２，５Ｘ１５ｃｍ）に供給した（１ −７分）、サンプルの供給に続いて、カラムを５力ラム体積量の平衡パンファー で洗った（２−７分）、平衡バッファー中のＮａＣＩＩの直線的勾配（１１゜Ｎ ａＣ１の０〜４００ｍＭ）でカラムからＨＩ　Ｖｐ　２４−ｇｐ４１融合タンパ クが溶出された。９５％より高い純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）で融合タ ンパクを含む百分をプールし、−８０℃で貯蔵した。

５、　’ＨＩＶ　２４　ンハクー″　ＨＩＶ４１ボＩペプチドコンシュ゛−トの ８．仲 実施例３Ｄで作った実質上純粋な組換えＨＩＶｐ２４タンパクの３−（約０．６ １６＋Ｉｖ）を、１ｍＭＭｇＣ１’を含む０．２　Ｍリン酸ナトリウムバッファ ー（ｐＨ８，５）の３１に対して４８時間透析した。

エタノール中の５ＰＤＰ　（ファルマシア）の１０＋ａＭ溶液を調製し、これは ２８０ｎｍで０．０４５の光学密度を存した。０．８　Ｍ　ＮａＣ０の２００μ ｉを５ＰＤＰ溶液に混合し、１０分後に吸光度を測定した。このように処理した ５ＰＤＰ溶液のエステル（活性化５ＰＤＰ）濃度は、９．６６ｍＭに対応すると 計算された。

組換えＨＩｖｐ　２４−ｓｐＤＰ誘導体を調製するために、２■の組換えＨＩ　 Ｖｐ　２４クンバク（０，００８３μモル）を活性化５ＰＤＰの０．４２μモル （上記の５ＰＤＰ溶液の４３μｍ）で室温で１５分間処理した。サンプルをｐｄ ｌｏカラムに供給し、２−の溶出物を集めることによって、セファデックスＧ− １０クロマトグラフイにより脱塩を行った。置換の程度は、組換えＨＩＶｐ２４ タンパクの１モル当り約３．４モルのチオールであると計算された。

チオール化された組換えＨＩＶｐ２４タンパク調製物にＡ５ポリペプチドを機能 可能に結合するために、０．１６２ｇモルのペプチドをチオール化タンパク（Ｐ ２４ポリペプチド１モル当り約３．５モルのペプチド）と混合し、混合物を４度 で一夜インキュベート（維持）した、インキュベーションを室温（約２０″Ｃ） で８時間続けた後に、３４３ｎｍでの溶液の吸光度を測定したところ、０．３５ であった。これは、３．８モルのチオール化Ｐ２４が加水分解されて、組換えＨ ＩＶｐ’２４−Ａ５ポリペプチドコンジュゲー）（ｐ２４−Ａ５コンジュゲート ）を作ったことを示す。

対照として、組換え）（ＩＶｐ２４タンパクの代りにウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）を用いてＢＳＡ−Ａ５コンジュゲートを上記の手順で調製した。

６、　Ａ　ア・セイ　ＥＬ　Ｔ　ＳＡ 抗原を、洗ったプラスチックマイクロタイターウェル（ヌンクマイクロウェル　 モジュール、カタログ番号４６８６６７）に吸着した。夫々実施例３，４．５及 び５で作った抗原ｐ２４．ｐ２４−Ａ５融合タンパク、ｐ２４−Ａ５コンジュゲ ート又はＢＳＡ−Ａ５コンジュゲートを、５０１炭酸ナトリウム、ｐＨ９，５及 び１５０ｍＭ　ＮａＣｊ！の１−当り１０μｇ含む？８液をウェルに加え、室温 で１時間維持した。このコーティング溶液を取去り、リン酸塩緩衝生理塩水（Ｐ ＢＳ：水溶液５１中に４０　ｇ　ＮａＣｊ２．　１　ｇ　ＫＨｚＰＯａ　。

５、７　ｇ　Ｎａ＊ＨＰＯａ、１　ｇ　ＫＣｆｌ、１　ｇ　ＮａＮ５）中の３％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、百分■、シグマ　ケミカルズ）の溶液で室温で一 夜インキュベートすることによって、ウェル上の非特異的結合サイトをブロック した。ブロックした後、プレートを水で三度すすぎ、放置乾燥し、もってブロッ クされた固相固定化抗原を形成した。

エイズ患者血清、正常なヒト血清、及び精製したＨ　Ｉ　Ｖ組換えｐ２４タンパ クに対して向けられたラビット抗血清の希釈物を固相固定化抗原と混合すること によってＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイを行った。血清は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ界面 活性剤及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　（ＰＴＢバッファー）で希釈した。免 疫反応混合物を３７℃で１時間維持して免疫反応生成物形成させた後に、ウェル をＰＢＳｌｏ、０５％↑−ｅｅｎ２０で三度洗った０次に各ウェルに、ラベルと してアルカリホスファターゼ（シグマｆｆ１Ａ−３１５０）にカップルされたヤ ギ抗ヒトＩｇＧ又はラベルとしてベータガラクトシダーゼ（ファルマシア）にカ ップルされたヒツジ抗ラビット免疫グロブリンの１：１０００希釈物（ＰＴＢパ ンファー中）を加えた。該第二の抗体と共に３７℃で３０分間インキュベーショ ン後に、アルカリホスファターゼがラベルとして用いられた場合には、０．０５ ％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳでウェルを三度洗い、１０％トリエタノールアミン（ ｐｆ＋９．８　）　、１　ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｔのバッファー中のパラニトロフ ェニルホスフェート（シグマ）を各ウェルに加工、ウェルを室温に３０分間維持 した。ベータガラクトシダーゼがラベルとして用いられた場合には、１００１リ ン酸塩バツフアー、ｐＨ７中のオルトニトロフェニルガラクトシド（シグマ）の ４μｇ／　ｒａｔを各ウェルに加え、ウェルを３７℃に２時間維持した。酵素反 応の程度は、バイオラド分光光度計を用いて４０５ｎ−におけるマイクロウェル 中溶液の光学密度を読み取ることによりモニターした。

これら研究の結果を表１に示す。

表１ 組換えＨｔｖｐ２４タンパク、ＨＩＶｐ２４　ｇｐ４１融合クンバク及びＨＩＶ ｐ　２４−ｇｐ４１コンジユゲートを用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡアンセイの結果 、２ 血清　ｐ２４−Ａ５　ｐ２４−Ａ５　ＢＳＡ−Ａ５サンプル 正常　ｘ：ｓｏ　１：１６０　１：３２０　１：４０１３６９０　１　８　８０ 　１　：　１０２４０　１　Ｈ　５１２０　１　：　５１２０Ｆ６６６−４　１ 　：　８０　１　：　１０２４０　１　：　１０２４０　１’：　１０２４０Ｆ ６６６−６　ａ：ｏｏ　１：８０　１　：ｓｏ　１：４０８０１５　１　：　８ ０　１　：　２０４８０　１　：　１０２４０　１　：　１０２４０８０３６　 １　：　８０　１　：　１０２４０　１　：　１０２４０　１　：　１０２４０ ８０５５　１　Ｈ　４０ ８０５７　１　：　８０　１　：　１０２４０　１　：　１０２４０　１　：　 １０２４０ラビツト 抗−ｐ２４　１　：　６４０００　１　：　６４０００１：血清サンプルは始め に１＝２０に希釈され、次に連続的に２倍に希釈された。抗血清の滴定の終点は 、光学密度の読みが０．　１より下に下ったときである．正常−健康な異性愛の ヒトからの血清．ラビント抗ーｐ２４ー組換えＨ　Ｉ　Ｖ　ｐ２　４タンパクで 免疫化されたラビットからの血清。

２：固相固定化抗原は以下の通り：組換えＨ　Ｘ　Ｖ　ｐ　２　４タンパク（９ ２４）、組換えＨ　Ｉ　ｖｐ　２　４−ホＩＪへ７’チｌ’Ａ５タンパク（ｐ２ ４−Ａ５融合）、組換えＨＩＶｐ２４タンパク−ポリペプチドＡ５コンジュゲー ト（ｐ　２　４　−Ａ５コンジュゲ−１・）、及びウシ血清アルブミン−Ａ５コ ンジュゲー）（ＢＳＡ．−Ａ５コンジュゲート）３：検出できる力価なし 表１の結果は、組換えＨＩＶｐ２４−Ａ５融合タンパク及び組換えＨＩＶｐ２４ −Ａ５コ７ジｓゲ　）が、組換えＨ　Ｉ　Ｖ　ｐ　２　４タンパク単独よりも抗 ＨＩＶ抗体の検出において敏感であったことを示している．加えて、五つのエイ ズ患者血清のうちの二つにおいて、組換えＨＩＶｐ２４−Ａ５融合タンパクが、 組換えＨＩＶｐ２４−Ａ５コンジュゲート又はＢＳＡ−Ａ５コンジュゲートより も抗ＨＩＶ抗体の検出において敏感であった．このことは、融合タンパクに比べ てコンジュゲート上には免疫反応に利用できるＨＩＶｇｐ４１エピトープ（Ａ５ ポリペプチド）が約４倍も多くあることを考えると、特に驚ろくべきことである 。

７、′　からの　えＨ■■　２４−　４１タンパクのＮ−１明記した事項を除い て実施例４と同様の手順によって、Ｉｉ　Ｉ　ＶＰ２４−ｇｐ４１融合タンパク ｐ２４−Ａ５も精製した。

実施例ＩＢ記載のようにして調製したｐ　ＧＥＸ　ｐ　２　４ｇｐ４　１で形質 転換された大腸菌（Ｗ３１１０）細胞（５０ｇ）を、０．１７％（Ｗ／Ｖ）リソ ゛チーム（シグマ、グレードＩ）を含む！Ｑ濁バッフｙ−（０．１Ｍリン酸ナト リウムｐＨ７．０．５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍ１つベンズアミジン−ＨＣｊ！，０． ５＋ｍＭＰＭＳＦ）の２５０ｄ中に組機ホモゲナイザ−（１５鴫のプローブを備 えられたポリトロン）を用いて懸濁した。懸濁物を撹拌下に２２“Ｃに４０分間 維持し、次に４℃に冷却した．冷却した懸濁物をフレンチプレスに通し、遠心分 離した（１８，０００ｘ　ｇｉ　４　０分間）。得たべ１／ツト（６．４ｇ）を １５０ｄのＰＥＢバンフプーに再懸濁し，、遠心分離した（１８，　０００ｘｇ ，３０分間）、得たベレフトを、１　０　０ｍｌ’ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、３ Ｍ尿素及び１０ｍＭジチオスレイトールを含むバッファー（ｐ）１８．５）１０ ０ｍｌに懸濁した。懸濁物を４℃で１時間攪拌し、次に４５Ｔｉローター（ベン クマン）中で３５．００Ｏ　ｒｐｍで４０分間遠心分離した．得た上澄みを集め 、０．１Ｍリン酸ナトリウム及び３０％飽和硫酸アンモニウムを含むパンファー （ｐＨ６．　５　）　４　１２に対して透析し、次に１８，０００　ｘ　ｇで２ ０分間遠心分離した．得たベレットを、０、１Ｍリン酸ナトリウム、５＋ｎＭＥ ＤＴＡ，６ＭグアニジンＨＣｌ及び１０ｍＭメルカプトエタノールを含むバッフ ァー（ｐＨ’７．　０　＞　３　５−に再懸濁して、グアニジン融合タンパク溶 液を形成した。

グアニジン？容液を、６Ｍグアニジンｌ（Ｃｊ！　％　５　０ｄ　Ｔｒｉｓ　、 ！ｍＭＥＤＴＡ及び１０＋ｃＭメルカプトエタノールを含むＳ−２００パンフア ー（ｐｌ＋７．０）で予め平衡化したセファクリルＳ−２００　（ファルマシア ）のカラム（５．ＯＸ９０ｃｍ）に供給した。次にカラムにＳ−２００バツフア ーを供給したとき、溶出した画分を集め、各両分を２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２ ８０）についてモニターして、タンパク含量を測定した。溶出したクンバクのピ ークを含む両分をプールし、Ｉ　Ｓ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ　Ｉｔ　、　ｐＨ　 ８．　５及び３Ｍ尿素を含むバッファーを用いて０．５のＡ２８０まで希釈した ，各々のプールしたピークを、実施例２人！！ｉｌ！載のようにＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅで分析して、精製したＨ　ＩＶｐ　２　４−ｇｐ４　１融合タンパクを含むプ ールされた両分を同定した。融合タンパクを含むプールを４時間透析し、次に３ Ｍ尿素を含む１　５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ　ｌ　、　ｐＨ　８．　５の４１ に対して１４時間透析して、尿素を含む透析された融合タンパク溶液を形成した ．透析された溶液を次に、１　５１ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＶ（ｐＨ８．５）に 対して４時間透析して、透析された融合クンバクを形成した。該タンパクは、ス ルフヒドリル基を実質上含まなかった．　１１１１ち、タンパクは非還元形であ った。

透析された融合タンパクを、１　５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｌｉｃｋ　（ｐＨ８．　５ 　）で予め平衡化されたＤＥＡＥ−セファローズ（ファルマシア）のカラム（２ ．６Ｘ２０の）に供給した（２−７分）。サンプルの供給に続いて、１　０ｍＭ 　ＮａＣ１を含む平衡バッファーの２力ラム体積量でカラムを洗つた（２ｄ／分 ）。平衡パンファー中のＮａＣ　Ａ’勾配（ｌｊ！．　ＮａＣ１の１０〜３０＋ ｅＭ）でカラムから）ｌｌＶｐ２４−ｇｌｌ＋４１融合タンパクが溶出された． ９５％より高い純度（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥで測定）で融合タンパクを含む百 分をプールして、ＤＥＡＥｊＫＩされた融合タンパクを形成した。

ＤＥＡＥ−セフ１０−ズカラムからのプールした百分のｐＨを、２０％酢酸を加 えることにより５．５に１９節し、次に２５ｍ１１酎酸ナトリウムを含むバッフ ブー（ｐＨ５．０）４Ｊに対して透析した。透析物を次に、ベンクマンＬ７ー５ ５遠心分離器中でタイプ４５−Ｔｉローターで４０．００Ｏ　ｒｐｍで１時間遠 心分離した．得た上澄みを、２５ｍＭ酢酸ナトリウムを含むパンファーｐＨｓ． ｏで予め平衡化したＣＭ−セファローズＣＬ−６Ｂ　（ファルマシア）のカラム （２．６ＸＩＱｉｘ）に供給した（２−７分）、サンプルの供給に続いて、３　 ０＋Ｍ　Ｎａ（Ｊを含む平衡バッファー２００−でカラムを洗った（２−７分） 。平衡パンファー中のＮａＣ　１の直線的勾配（１　１！。

ＮａＣ　１の３０〜２りＯＩＩＭ）でカラムからＨ　ＩＶｐ　２　４　−ｇｐ４ 　１融合タンパクが溶出された。９５％より高い純度（ＳＡＳ−ＰＡＧＥで測定 ）で融合タンパクを含む両分をプールし、−２０℃で貯蔵して、ＣＭ単離された 融合タンパクを形成した。

８、　か゛の　えＨＩＶ　２４−　４１−２　７バクノ製 下記の事項を除いて実施例７の手順に従って、ＨＴＶｐ２４−ｇｐ４１−２融合 タンパクｐ２４−Ａ２を精製した。

実施例ＩＢ記載のように調製したｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−２で大腸菌を形質転 換した。形質転換した細胞により表現されたｐ２４−ｇｐ４１−２融合タンパク を次に、実施例７記載のように単離して、ＤＥＡＥ単離されたタンパクを形成し た。

９、　か゛の　えＨＩＶ　２４−　４１−１　２　ンバタ立１製 下記の事項を除いて実施例７の手順に従って、ＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１−１．２ 融合タンパクｐ２４−Ａ５−Ａ２を精製した。

実施例ＩＢ記載のように調製したｐＣ；ＥＸｐ２４ｇｐ４１−１゜２で大腸菌を 形質転換し、次にグアニジン再懸濁工程を介して実施例７記載のように処理して 、単離されたＨ　ＩＶｐ　２４−ｇｐ４１−１．２融合タンパクを含むグアニジ ン融合タンパクを形成した。

１０８、±ム　酊、ア・セイ　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ抗原ｐ２４、又は実施例３．７． ８及び９で夫々調製された融合タンパクｐ２４−Ａ５．ｐ２４−Ａ２又はｐ２４ −Ａ５−Ａ２の一つを用いて、実施例６記載のようにＥＬ　Ｉ　ＳＡを行った。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ研究の結果を表２に示す。

表２ 組換えＨＩＶｐ２４タンパク及びＨＩＶ融合タンパクｐ２４−ｇｐ４１、ｐ　２ ４−ｇｐ４１−２又はｐ２４−ｇｐ４１−１．２を用いたＥＬＩＳＡアフセイの 結果 ？ 血清　ｐ２４−Ａ５　ｐ２４−Ａ２　ｐ２４−Ａ５−Ａ２１３６９０　１　：　 ９００　１　：　８１００　１　：　９００　１　：　８１００Ｆ６６６−４　 １　：　４００　１　：　１０８００　１　：　４００　１　：　１０８００Ｉ ＩＶ−２ ２Ａ　１８１００　ｉ：３ｏｏ　１：２７００　１：２７００２Ｂ　１：１００ 　１：３００　１：２７００　１：２７００ラビツト　ｌ：８１０００　１：８ １０００　１：８１０００　１：８１０００抗−ｐ２４ ラビット　コ　１　：　９０００　１　：　３０００抗−ｇｐ＋ｎ、旧ｖ１ ラビット　１　：　１０００　１　：　１００抗−ｇｐ４１．　ＨＩＶ−２ １：血清サンプルは初めに１　：　１００に希釈され、次に連続的に３倍に希釈 された０滴定の終点は、光学密度の読みが０．２より下に下ったときである。サ ンプル１３６９０及びＦ６６６−４は確認されたＨＩＶ−１感染を持つエイズ患 者から得た。サンプル２Ａ及び２Ｂは確認されたＨＩＶ−２惑染を持つエイズ患 者から得た。ラビ７）抗ｐ２４＝ｕ換えｐ２４で免疫化したラビットからの血清 。

ラビット抗ｇｐ４１、ＨＩ　Ｖ　−１−Ｂ　Ｓ　Ａ　ニ）　７　’；　ユデート されたＡ５ペプチドで免疫化されたラビ７）からの血清、ラビット抗ｇｐ４１． ＨＩＶ−２＝ＢＳＡに：ｔ：／シュゲートされたＡ２ペプチドで免疫化されたラ ビットからの血清。

２：固相固定化抗原は以下の通り：組換えＨＩＶｐ２４タンパク（ｐ　２４）　 、組換えＨＩＶｐ２４−ポリペプチドＡ５タンパク（ｐ２４−Ａ５融合）、組換 えＨＩＶｐ２４タンパク−ポリペプチドＡ２タンパク（ｐ２４−Ａ２融合）、組 換えＨＩＶｐ２４−ポリペプチドＡ５及びＡ２タンパク（ｐ２４−Ａ５−Ａ２融 合）。

３：検出できる力価なし 表２の結果は、組換えＨＩＶ融合タンパクｐ２４−Ａｓ、ｐ２４−Ａ２及びｐ２ ４−Ａ５−Ａ２が、組換えｐ２４タンパク単独よりも抗ＨＩＶ抗体の検出におい て敏感であったことを示している。

加えて、Ａ２ポリペプチドを含む融合タンパクに比べて、Ａ５ポリペプチドを含 む融合タンパクを用いる抗ＨＩＶ−１抗体のより敏感な検出によりタイプ特異性 が示される。同様に、Ａ５ポリペプチドを含む融合タンパクに比べて、Ａ２ポリ ペプチドを含む融合タンパクを用いて抗ＨＩＶ−２抗体を検出すると、増大され た感度が観察される。

以上の記載及び実施例は、例示を意図するものであって、限定と解されるべきで はない０本発明の精神及び範囲内で更に別の変化が可能であり、当業者には明白 であろう。

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Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．第１のヌクレオチド塩基配列と、第２のヌクレオチド塩基配列とを含み、該 第１のヌクレオチド塩基配列はその３′来端において該第２のヌクレオチド塩基 配列の５′末端に機能可能に結合しており、該第１の配列は以下の式： 【配列があります】 で表されるヌクレオチド塩基配列を有し、かつ該第２の配列は組換えＨＩＶｐ２ ４タンパクをコードするヌクレオチド塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ セグメント。
2. ２．該第２の配列が第１Ａ図に示された残基１〜２３２のアミノ酸残基配列をコ ードする請求の範囲第１項記載のＤＮＡセグメント。
3. ３．該配列が第１Ａ図に示された残基１〜７１１のヌクレオチド塩基配列をもつ 請求の範囲第２項記載のＤＮＡセグメント。
4. ４．第１Ｂ図の残基１〜２５７、第１Ｃ図の残基１〜２５８または第１Ｅ図の残 基１〜２８３で示した配列で表わされるアミノ酸残基配列をコードするヌクレオ チド塩基配列をもつＤＮＡセグメント。
5. ５．第１Ｂ図の塩基１６〜７８６、第１Ｃ図の塩基１６〜７８９または第１Ｅ図 の塩基１６〜８６４に示された配列で表わされるヌクレオチド塩基配列をもつＤ ＮＡセグメント。
6. ６．ＤＮＡセグメントに機能可能に結合されたベクタを含み、該セグメントが第 １のヌクレオチド塩基配列と第２のヌクレオチド塩基配列とを含み、該第１の配 列はその３′末端において該第２の配列の５′末端に機能可能に結合しており、 該第１の配列が以下の式： 【配列があります】 で示されるヌクレオチド塩基配列を有し、かつ該第２の配列が組換えＨＩＶｐ２ ４タンパクをコードするヌクレオチド塩基配列をもつことを特徴とする組換えＤ ＮＡ。
7. ７．該第２の配列が第１Ａ図の残基１〜２３２で表されるアミノ酸残基配列をコ ードする請求の範囲第６項記載の組換えＤＮＡ。
8. ８．該第２の配列が第１Ａ図の塩基１〜７１１または７１８で表されるヌクレオ チド塩基配列をもつ請求の範囲第７項記載の組換えＤＮＡ。
9. ９．ＤＮＡセグメントに機能可能に結合したベクタを含み、該ＤＮＡセグメント が、第１Ｂ図の残基１〜２５７、第１Ｃ図の残基１〜２５８または第１Ｅ図の残 基１〜２８３に示された配列で表されるアミノ酸残基配列をもつＨＩＶｐ２４− ｇｐ４１融合タンパクをコードする構造遺伝子を規定していることを特徴とする 組換えＤＮＡ分子。
10. １０．該ベクタが表現ベクタであり、かつ該分子が適合性ホスト内で核融合タン パクを表現し得る請求の範囲第９項記載の組換えＤＮＡ分子。
11. １１．ＤＮＡセグメントに機能可能に結合したベクタを含み、該ＤＮＡセグメン トが第１Ｂ図の塩基１〜７９３、第１Ｃ図の塩基１〜７９６または第１Ｅ図の塩 基１〜８７１に示された配列により表されるヌクレオチド塩基配列をもつことを 特徴とする組換えＤＮＡ分子。
12. １２．ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１、ｐＧＥＸｐ２４ｇｐ４１−２およびｐＧＥＸｐ ２４ｇｐ４１−１，２からなる群から選ばれることを特徴とする組換えＤＮＡ分 子。
13. １３．該ベクタが表現ベクタであり、かつ、該分子が適合性ホスト内で該融合タ ンパクを表現し得る請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子。
14. １４．請求の範囲第６、９または１１項のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子に より形質転換された原核ホスト細胞を含む栄養培地を包含する形質転換細胞培養 物。
15. １５．ａ）請求の範囲第６項記載の組換えＤＮＡで形質転換されたホスト細胞を 含有する栄養培地を含む栄養物の培養を開始し、ｂ）該培養物を、該ホスト細胞 が該組換えＨＩＶｐ２４タンパクを表現するのに十分な期間培養状態に保ち、お よびｃ）該培養物から該組換えＨＩＶｐ２４タンパクを回収する工程を含む、組 換えＨＩＶｐ２４タンパクの製法。
16. １６．該組換えＤＮＡが第１Ａ図の残基１〜２３２で示されるアミノ酸残基配列 をコードするヌクレオチド塩基配列をもつ請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．ａ）請求の範囲第９または１１項に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換し たホスト細胞を含む栄養培地を包含する栄養物の培養を開始し、 ｂ）該培養物を、該ホスト細胞がＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクを表現す るのに十分な時間培養状態に保ち、およびｃ）該培養物から該融合タンパクを回 収する工程を含むＨＩＶｐ２４−ｇｐ４１融合タンパクの製法。
18. １８．組換えＨＩＶｐ２４タンパクを含み、本質的に（ａ９原核抗原および（ｂ ）他のＨＩＶ−関連タンパクを実質的に含まない組成物。
19. １９．該組換えＨＩＶｐ２４タンパクが第１Ａ図の残基２〜２３２で表されるア ミノ酸残基配列をもつ請求の範囲第１８項記載の組成物。
20. ２０．少なくとも一回のアッセイを実施するのに十分な量で、請求の範囲第１８ 項記載の組成物を含む、キット形の診断系。
21. ２１．該組成物が固体マトリックスに固定化されており、かつ核組換えＨＩＶｐ ２４タンパクが第１Ａ図の残基２〜２３２で表されるアミノ酸残基配列をもつ請 求の範囲第２０項記載の診断系。
22. ２２．第１Ｂ図の残基２〜２５７、第１Ｃ図の残基２〜２５８または第１Ｅ図の 残基２〜２８３に示された配列で表されるアミノ酸残基配列をもつＨＩＶｐ２４ −ｇｐ４１融合タンパクを含む、キット形状の診断系。
23. ２３．該融合タンパクが固体マトリックスに固定化されている請求の範囲第２２ 項記載の診断系。
24. ２４．第１Ｂ図の残基２〜２５７、第１Ｃ図の残基２〜２５８または第１Ｅ図の 残基２〜２８３に示された配列で表されるアミノ酸残基配列を有するＨＩＶｐ２ ４−ｇｐ４１融合タンパク。
25. ２５．少なくとも１つのＨＩＶ抗原ｐ２４およびｇｐ４１に対する抗体の存在に つき体液サンプルをアッセイする方法において、ａ）該体液サンプルとＨＩＶｐ ２４−ｇｐ４１融合タンパクとを混合することにより免疫反応混合物を形成する 工程、ここで該融合タンパクは第１Ｂ図の残基２〜２５７、第１Ｃ図の残基２〜 ２５８または第１Ｅ図の残基２〜２８３に示された配列で表されるアミノ酸残基 配列をもつ； ｂ）該免疫反応混合物を、存在する該抗体すべてが該融合タンパクと免疫反応し て免疫反応生成物を形放するのに十分な期間維持する工程、および ｃ）形辰された該免疫反応生成物の存在およびその結果としての該抗体の存在を 検出する工程 を含むことを特徴とする上記方法。
26. ２６．該融合タンパクが固体マトリックスに固定化されている請求の範囲第２５ 項記載の方法。
27. ２７．製薬上許容されるキャリヤ中に治療上有効な量の組換えＨＩＶｐ２４タン パクを含み、本質的に（ａ）原核抗原および（ｂ）他のＨＩＶ−関連タンパクを 含まないことを特徴とする接種物。
28. ２８．該組換えｐ２４タンパクが第１Ａ図の残基２〜２３２で表されるアミノ酸 残基配列をもつ請求の範囲第２７項記載の接種物。
29. ２９．製薬上許容されるキャリヤ中に治療上有効な量の組換えＨＩＶｐ２４タン パクを含む接種物を投与することを含み、該接種物が本質的に（ａ）原核抗原お よび山地のＨＩＶ−関連タンパクを含まないことを特徴とするＨＩＶ感染の治療 法。