JPS59173084A - ポリオウイルスの免疫原性部位よりなるペプチド類及びこれらのペプチド類を暗合化するヌクレオチド配列を含有するｄｎａ類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はポリオウィルスの免疫原性部位よりなるペプチ
ド類及びこれらのペプチド類を暗号化するヌクレオチド
配列を含有するＤＮＡフラグメントに関する。本発明は
また、その様なペプチド類を実用化するワクチン化成分
にも関するものであり、これらの成分はヒト或いは動物
の宿主内にそれ自体に対してのみならず、また完全な感
染性ポリオウィルスに対しても活性である抗体の産生を
誘発されるように適応されたものである。

フランス特許出願第１０２０１８号（１９８２年２月８
日出願）において、ｉｎ　ｖｉｖｏで抗ポリオウィルス
抗体の合成を誘発することのできる免疫原性ペプチドを
暗号化するＤＮＡフラグメントが既に記載されている。

これらのＤＮＡ７ラグメントは１．２ｋｂ（キロ塩基対
）のオーダーよりなるＤＮＡフラグメントの長さを越え
ない長さを有するものである。これらのフラグメントは
、より詳細には免疫原性のレベルにおいて対応する感染
性ポリオウィルスの役割を果す本質的な抗原決定基を有
することが示された蛋白質ＶＰ−１を暗号化するヌクレ
オチド配列を含有することを特徴とするものである。事
実、このペプチドは、全ポリオウィルスが注射された動
物から得られたモノクローナル或いはポリクローナル中
和血清（特異性り抽清）と抗原−抗体コンプレックスを
形成する能力を有する。

上記タイプの免疫原性ペプチドを暗号化するＤＮＡ配列
は、それらの１つについて添付の図面第１図及び第２図
に提示され、上記配列を含有するもう１つのＤＮＡフラ
グメントについても、また第３図及び第４図に例示され
る。以下において言及される制限部位の成るものの位置
については、これらの図においてもまた示される。これ
らのＤＮＡの構成に参加する連続的ヌクレオチドの番号
は５′末端の側から付される。

上記ＤＮＡの由来するポリオウィルスのクローン可能な
りＮＡの構成に関してはシルビー・クアンΦゾール・ウ
エルフ等の「ポリオウィルスのゲノムの分子クローニン
グ」と題する文献を引用する（　５ｙｌｖｉｅ　ＶＡＮ
　ＤＥＲＷＥＲＦ　ａｎｄ　　ｏｔｈｅｒａｕｔｈｏｒ
ｓ、　ｅｎｔｉｔｌｅｄ”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇｏｆ　　ｔｈｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　Ｐｏ１
ｉｏｖｉｒｕｓ”１ｎＰｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ、　Ａｃａ
ｄ、Ｓｃ　ｉ。ＵＳＡ、　Ｖｏ　ｌ。７８．ＡＩＯ。

ｐｐ。５９−８８．５９−８７．Ｏｃｔ。１９８１）。

本発明は、先行配列に含有されるが、これよりもはるか
に小さいＤＮＡ配列に対応するペプチド類がそれにも拘
らず対応するポリオウィルス類に対して有効なワクチン
化成分の構成に利用可能な抗原決定基を有することを発
見したことに基づくものである。関連するペプチド類の
中から直接に化学合成が可能となるのに充分に小さな大
きさのものを単離することが可能である。

本発明は更にフランス特許出願第８２０２０１８号の主
題を形成する比較的大きなりＮＡ中において決定基或い
は抗原性部位を有するペプチドが対応するより小さなり
ＮＡ配列の同定を可能にし、それらを対応する全及び感
染性ポリオウィルス類に関するワクチン化成分の製造に
使用するのに適したようにする技術を提供するものであ
る。

これに関して、本発明によるＤＮＡ配列の最も長いもの
は第１図の位置２５４６及び２８６１によって規定され
る領域にあるＸｂａＩ部位によりその対抗末端が境界付
けられる７ラグメントにより構成される。

本発明はより詳細には更に先行配列に含有されるＤＮＡ
配列であって、同一ポリオウィルスから発生するＣ及び
０粒子並びに同一ポリオウィルスのカプシドの構造ポリ
ペプチドＶＰ−１の両者に対して活性であるモノクロー
ナル抗体により８識されることのできるペプチドを暗号
化するＤＮＡ配列に関する。以下の説明において、特に
断りのない限り全ての状況において関連するモノクロー
ナル抗体はこのタイプのものである。

その様な抗体は、Ｃ抗原を有するウィルス或いはピリオ
ン（特にＤ抗原性に対応する感染性ポリオウィルスを１
時間５６℃で加熱することにより得られたもの）で予め
免疫された動物の肺臓細胞と適当な骨髄肺細胞の融合に
よる製造によってそれ自体公知の技術、即ち得られた細
胞クローンのハイブリッドの培養及びＣ抗原性を有する
ピリオン類、Ｄ抗原性を有する類似のピリオン類並びに
対応する蛋白質ＶＰ−１の両者に対してモノクローナル
抗体を産生ずることが示されたクローンの選択により得
られたハイブリドーマから得られる。関連するポリオウ
ィルスのうちで特にタイプｌ　（Ｍａｈｏｎｅｙ　）が
有利である。その様なモノクローナル抗体〔これは以下
の記載において「’　ＣＤ　−Ｖ　Ｐ　−１抗体」〔或
いはｒＣＬＪ）として示す〕、それらを産生ずることの
できる細胞ハイブリッド及び後者を得るための方法はフ
ランス特許出願第８２１９３３８号（１９８２年１１月
１８日出願）に記載されている。形成された２つのハイ
ブリツドはパリのパスツール研究所のナショナル・カル
チャー・コレクション・オブ・ミクロオルガニズムス（
Ｃ，Ｎ、　Ｃ，Ｍ。）にそれぞれ番号■−２０８及びｌ
−２０９として寄託された。

本発明によるこのＤＮＡ配列は次の構造を有する： ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＡＣＧＣＴ　Ｃ’ｌ”ＣＣＣＡ　Ａ
ＡＣＡＣＴ　ＧＡＡＧＣＣＡ（１’Ｉ”（イ）Ａ　ＣＣ
Ａ　ＡＣＡ　ＣＡＣＴＣＣＡＡＧ　ＧＡＡ　Ａ、ＴＴＣ
α）　（）ＣＡ　ＣＴＣＡＣＣ（社）Ａ　ＧＴＧ　ＧＡ
Ａ、　ＡＣＴ　ＯＯＧα℃ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　Ｃ
ＴＡ　ＧＴＣＣＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡ’ｒ　Ａ、ＣＡ　Ｇ
ＴＧＣＡＡ　ＡＣＣＡＧＡ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　
ＣＡＡ　ＣＡ、Ｔ　ＡＧＧ　ＴＣＡＡＧＧ　ＴＣＡ　Ｇ
ＡＧ　ＴＣＴ　ＡＧＣＡＴＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　’ｌ”
Ｔｃ　ＴＴＣ（）ＣＯＣｌ　（］（Ｍ’　（）ＣＡ　Ｔ
ＧＣＧＴＧ　ＡＣＣＡ、ＴＴ　Ａ、ＴＧ　ＡＣＣＧ’ｌ
Ｄ　ＧＡＴ　ＡＡＣＣＣＡ　ＯＣＴ　ＴＣＣＡＣＣＡＣ
Ｇ　ＡＡＴ　ＡＡＧＣＡ、Ｔ　ＡＡＧ　ＣＴＡ　ＴＴＴ
　（）ＣＡ　ＧＴＧ　Ｔ（Ｘ）　ＡＡＧ　ＡＴＣＡＣＴ
ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＣＣＡＧ　ＴＴ
Ａα追ＡＧＧ　ＡＡＡＴＴＧ　ＧＡＧ　ＴＴＣＴＴＣＡ
ＣＣＴＡＴ　ＴＣＴ本発明は、勿論、また上記ヌクレオ
チド配列により暗号化されるペプチドと同様な免疫原性
特性を有するペプチドを暗号化する任意のＤＮＡ配列に
関するものである。特に、任意の配列のトリブレットを
同一のアミノ酸或いは別のアミノ酸を暗号化する別のト
リプレットにより置換することができ、その程度は関連
するＤＮＡにより暗号化されるペプチドによるその様な
置換が変性されたＤＮＡ配列により暗号化されるペプチ
ドの免疫特性を基本的に変更しないものであればよい。

特に、本発明は上記Ｃ３抗体により認識されることので
きるペプチドを暗号化するこのタイプの任意のＤＮＡ配
列に関するものである。

本発明は、また、それが０３　　抗体により認識される
ことのできるペプチドを暗号化するものである限りにお
いて、先行配列中に含有されるより小さい長さの任意の
ヌクレオチド配列に関するものである。

本発明の範囲に含まれるＤＮＡ配列の内、下・記に示す
ペプチド配列Ｈｉｓ　６５−Ｐｈｅ　１０５を暗号化す
るヌクレオチド配列を含有するものが挙げられ、より詳
細には第１図のポリオウィルスの構造ＶＰ−１のポリペ
プチドを暗号化する遺伝子のヌクレオチド配列２６７１
−２７９２が挙げられる。

本発明の範囲に含まれるその他の好ましいＤＮＡ配列は
下記のＨｉｓ　６５−Ｔｌｅ　　１１０．より詳細には
同一遺伝子からのヌクレオチド配列Ｐｒｏ　　９５−Ｉ
ｔｅ　　１１０を暗号化するものである。

本発明は勿論上記ＤＮＡ配列により暗号化されたペプチ
ド配列を含有するポリペプチドに関するものである。そ
れは特に次式で表わされる配列に関するものである： Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａ
ｓｎ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ
　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅＰ
ｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＡｌａＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　
Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　８ｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖ
ａｌＧｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ
　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＳｅｒＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈ
ｅ　ＰｈｅＡｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　
Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　ＴｈｒＶａｌ　Ａｓ
ｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　８ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ
　Ａｓｎ　ＬｙｓＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａ
ｌａ　Ｖａｌ　　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　ＴｈｒＴ
ｙｒ　Ｌ’ｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌ
ｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ
　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ−Ｔｙｒ　Ｓｅｒ本発明は、また、上
記ＤＮＡ配列により暗号化されるペプチドに関して既に
示された条件下において等価の免疫特性を有する任意の
ペプチドにも関する。この点において、本発明はより詳
細には以下において「Ｈｉ　ｓ　６５−Ｐｈｅ　１０５
配列」と呼ばれる配列に関するものである：Ｉ（ｉｓ　
　Ｖａｌ　　　Ｖａｌ　　　Ｇｌｎ　　ＨｉｓＡｒｇ　
Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉ
ｌｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ０ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ０ また、以下において「配列　Ｈｉｓ　６５−Ｉｔｅｌｌ
ｏ」と呼ばれる配列に関する： Ｈ４ｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　ＨｉｓＡｒｇ　Ｓｅ
ｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ８０ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　’Ｉ”ｈｒ０ 本発明はより詳細には、また以下においてＡｓｐ　９８
−Ｌｅｕ　１０４：Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　
５ｅｒＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙ
ｓ　Ｌｅｕと呼ばれるペプチド配列を含有するペプチド
類にも関する。

本発明は勿論また、上記のＤＮＡ配列の任意のものによ
り形成されたインサートを含有するベクター特にプラス
ミド型或いはファージ型のベクターに関する。これらの
変性ベクターは細胞生物或いは適当な微生物による感染
性ウィルスを認識するモノクローナル抗体ｃＤ−ｐｖｉ
或いはＣ３或いはその他の抗体により認識可能なペプチ
ド配列を含有するポリペプチド或いは場合によりハイブ
リッドの産生を誘発するために、これらの細胞生物或い
は適当な微生物の形質転換に使用することができる。こ
れらのポリペプチド類、場合によってはハイブリッドも
、また本発明の一部を構成するものである。

本発明は、また、成る種のポリオウィルスのＤＮＡの内
部に通常含有されるＤＮＡ配列内において免疫原性ペプ
チドを暗号化する能力を有する或いは対応する全ポリオ
ウィルスに対して活性である抗体の産生を可能にする免
疫原性成分の製造に使用することのできる、より小さな
配列の同定を可能にする方法を提供するものである。こ
の方法は本質的に、免疫原性ペプチドを暗号化すること
のできる或いは免疫原性成分の構成中に入ることのでき
るより小さな配列を含有するものと認識された初期の配
列により形成されたインサートを含有するプラスミドを
出発物質として用い、該プラスミドを該より小さな配列
に対して外部の制限部位の箇所において線形化し、その
線形化されたプラスミドを制御された手法により、例え
ば酵素Ｂａｔ３１などの核酸末端分解酵素（エキソヌク
レアーゼ）を用いてトリミングし、このプラスミドをＤ
ＮＡ−リガーゼにより再環化し、それ自体対応するベク
ターにより形質転換可能でありベクター中に含有される
インサートを発現することのできる適当な微生物を形質
転換させ、及びこの微生物の発現生成物をＣＤ−ＶＰＩ
モノクｐ−ナル抗体と接触させることにより関連するタ
イプの免疫原性部位を有することのできるペプチドの存
在の可能性を該微生物の発現生成物中から検出すること
よシなり、この操作のサイクルを最後の再環化されたプ
ラスミドにより形質転換された該微生物の発現生成物内
から該免疫原性ペプチドの検出が消失するまで繰返され
ることを特徴とする。

上記方法の各サイクルの終りにおいて、例えば上記トリ
ミング操作の前後のプラスミドの制限地図の比較により
２つの連続トリムの間に除去されたＤＮＡ配列を決定す
ることが可能であり、従って、上記条件下における免疫
原性ペプチドの検出の可能性が絶えた際に、この結果な
先行トリミング操作の際に除去された配列の１つと関連
付けることができ、この除去されたＤＮＡ配列が該免疫
原性ペプチドを暗号化するものである。除去された配列
（或いは複数の除去された配列）の構造決定は勿論トリ
ミングの前後に行われる末端ヌクレオチド配列の決定に
より行われるものである。

以下、本発明を具体例により詳細に説明する。

異ったプラスミド類に用いられる構成技術は通常のもの
である。これらのプラスミドＤＮＡ類は毎回それらの各
々の製造者によって得られる条件下に制限酵素により切
断された。このＤＮＡフラグメントはアガロース或いは
ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動により分析した。

突出末端３′の遊離末端への変換はＤＮＡフラグメント
（０，１πｇ／虎ｌ）を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の１
００　ｆｉ　／　ｍｌのポリメラーゼＤ　Ｎ　Ａ　　Ｉ
　（Ｋｌｅ−ｎＯＷ７ラグメント）を用いて１０　ｍ　
Ｍ　Ｍｇ　Ｃｔｚ、５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　　
ＤＴＴを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ２媒体（ｐＨ
’Ｚ５）中において０．２ｍＭの第１のヌクレオチド対
の存在下に３７℃で１時間インキュベートさせることに
より行われた。ヌクレアーゼＢ’ａ８１による消化は０
．１２ｕ　／　ｐ　ｔの酵素／ＤＮＡ比を用いて２０ｍ
ＭＣａＣｔ１．１２　ｍＭ　ＭｇＣｔ１媒体中で行われ
た。

３０℃で１５分間インキュベート後、ＥＤＴＡを５０ｍ
Ｍの濃度に達するまで添加し、ＤＮＡをフェノールで抽
出し、エタノールで沈澱させた。

結合反応は、１μの’ｒ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ／
μＶのＤＮＡを用いることにより２０μｔの６０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｔ媒体（ｐｌＨ’Ｚ　５　）、１０ｍＭＭ
ｇＣ１ｘ　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、ｌ　ｍＭ　　ＡＴＰ
中において１５℃において１８時間行われた。この線形
化されたプラスミドは必要に応じて適当なフラグメント
との結合前に細菌アルカリホスファターゼ（０，０２ｕ
／μＰ　　ＤＮＡ）を用いて６８℃において３０分間処
理した。

１、　制限酵素によるクローン化ＤＮＡ類の加水分解 １．１　　プラスミドｐＰＶＩ−８４６のＤＮＡはＥｃ
ｏＲＩにより完全に加水分解された。その様にして得ら
れたプラスミドの線形々状（第５Ｃ図）はＫｐｎＩを用
いた部分消化により加水分解される。

得られるフラグメント（第５ｄ図）を０．７％アガロー
スゲル上の電気泳動により分離する。

６．６ｋｂｐの大きさの７ラグメントを選択する。

それは事実、ヌクレオチド１からヌクレオチド３０６４
（２番目のＫｐｎＩ部位）まで延びるポリオウィルスの
配列に対応するＤＮＡの配列から延びるＥｃｏＲ，Ｉ部
位からＰｓｔＩ部位までのプラスミドｐＢＲ３２２の配
列を表わす。

１．２　　クローン　ｐＰＶＩ−１２０のＤＮＡをＡｖ
ａＩ及びＥｃｏＲＩで完全に消化して加水分解し、異っ
た大きさの２つのフラグメント（第５ｅ図）を形成する
。ＤＮＡを次いでＫｐｎＩにより部分的に加水分解する
。その様にして得られたフラグメン）　（第５　ｆ図）
を０．７％アガロースゲル上の電気泳動により分離する
。

３．５５　　ｋｂｐ　の大きさの７ラグメントを選択す
る。それは事実、プラスミドｐＢＲ８２２のセグメント
ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩの７５２紐のｆＩＸ基から延びる
ほぼヌクレオチド３０６４（２番目のＫｐｎＩ部位）乃
至ヌクレオチド５６５ｏの範囲のポリオウィルスのｃＤ
ＮＡの配列を表わす。

λ１フラグメントはエチジウムプロミドを用いて染色す
ることによりゲル中で可視化された。

所望の大きさのものをゲルから透析バッグ中の電気溶出
によりゲルから抽出する。

２．２その様に得られた物質を精製し濃縮する。

クローンｐＰＶＩ−８４６及びｐＰＶＩ−１２０から得
られた上記の２つの選択されたフラグメントを混合し、
ファージＴ４のＤＮＡリガーゼにより再結合する。Ｅｃ
ｏＲＩ及びＫ　ｐ　ｎ　Ｉによる切断点において形成さ
れ、２つの７ラグメントの各末端に持ってこられた粘着
末端は、それらの再結合を容易にし、再結合が所望の方
向（第５ｇ図及び第５ｈ図）においてのみ行われること
を確実にする。

プラスミドｐＢＲ，３２２のゲノムはこの様にして組換
えプラスミドにおける変性或いは削除をすることなく再
構成される。特に、その複写及びテトラサイクリン耐性
の発現に必要な領域は影響を及ぼされない。

４　Ｂ、ｃｏｌｉ　　１１０６株の形質転換それらのＫ
ｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ　　部位で結合されたプラスミド
ｐＰＶＩ−８４８及び−１２０の７ラグメントは形質転
換条件下において適当な細菌テするＥ、ｃｏｌｔ　　１
１０６と接触される。テトラサイクリンに耐性を有し、
アンピシリンに感受性を有する細菌のコロニーを選択す
る。

５．１テトラサイクリン耐性細菌のプラスミドＤＮＡを
精製する。その集合体をアガロースゲル上の電気泳動に
より決定する。それは、再組合わせにより形成されたウ
ィルスのｃＤＮＡの５６５０組の塩基が増大したプラス
ミドｐＢＲ３２２のそれに等しい。

５．２　その様にして得られたｃＤＮＡのり四−ンｐＰ
ＶＩ−８４６及びｐＰＶＩ−１２０から得られた特異的
クローンとのｉｎ　　ｖｉｔｒｏのハイブリッド化は２
つの族クローンに元々挿入されたポリオウィルスの遺伝
子物質の単一組換えクローンの存在の証明を可能にする
。

５．３　新クローンの詳細な分析は既に特性化付けられ
たクローンの研究に使用された方法により行われる（制
限酵素による物理的地図作成法、電子顕微鎖、ヌクレオ
チド配列など）。

５．４組換えプラスミド（ｐＰＶＩ−Ｘ）或いはｐＰＶ
ｌ−９５８を有するｃＤＮＡは蛋白質ＮＣＶＰ１ａ（或
いはＰＬ）カプシドＶＰ４の蛋白質の前駆体（ヌクレオ
チド７４３〜９５０）、ＶＦ６（ヌクレオチド９５１〜
１７６６）、ＶＦ６（１７６７〜２４７９）及びＶＰＩ
（２４８０〜３８８５）、更に引続いて蛋白質ＮＣＶＰ
８ｂ（或いはＰ２）（特に蛋白質ＮＣＶＰＸの前駆体）
及び対応するもの及び蛋白質ＮＣＶＰｌｂ（或いはＰ８
）の初めのものを合成するに必要な遺伝情報を有する。

全部でウィルスゲノムの７４４０塩基の約５６５０をカ
バーする。

プラスミドｐＰＶＩ−８４６は、番号ｌ−１５５として
及びプラスミド１２０は番号ｌ−１５６として１９８１
年５月１９日にＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託した。

得られたプラスミドｐＰＶ１−９５８はそのインサート
中に蛋白質ＶＰＯ（ヌクレオチド７４３〜１．７６６　
）、ＶＦ６　（ヌクレオチド１７６７〜２４７９）及び
ＶＰＩ（ヌクレオチド２４８０〜１３８５）を暗号化す
るヌクレオチド配列を含有し、それに引続いて蛋白質Ｎ
ＣＶＰ３　ｂ　（ヌクレオチド３３８６〜５１００及び
その他）及び蛋白質ＮＣＶＰ１ｂの開始の配列を含有す
る。

プラスミドｐＰＶＩ−９５８から出発して次いで下記の
操作によりＶＰＩを暗号化するｃ　ＤＮＡの７ラグメン
トを得ることが可能となる。

蛋白質ＶＰＩを暗号化するヌクレオチド配列はウィルス
ゲノム中において、及び従ってｐＰＶｌ−９５８の有す
るインサートにおいても、また、それぞれこの配列の最
初及び最後のヌクレオチドから２３７個のヌクレオチド
を上流（位置２２４８）及び３２個のヌクレオチドの下
流（位置８４１７）に位置する２つのＰｓｔＩ部位によ
り枠組みされている（上記刊行物及び第１図及び第２図
の制限地図参照）。

従って、ＰｓｔＩ制限酵素によるｐＰＶｌ−９５８（第
６ａ図）の切断はそれぞれ４．３６ｋｂ（プラスミドの
本体）及び１．８ｋｂ、α４８ｋｂ、１．１７ｋｂ及び
約２．２８ｋｂに対応する長さを有する一群の７ラグメ
ントを発生する。１．１７ｋｂ７ラグメントはＶＦ６の
末端及びＶＰＩの全部を暗号化するヌクレオチド配列を
有する。後者の７ラグメントはヌクレオチド配列５’Ｇ
ＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡｖｃより始まり、配列Ｇ’ｌ’Ａ
ＣＡＣ’ｒＧＣＡ　８’　Ｋより完結される。それは、
その他の７ラグメントＰｓｔＩからアガロースゲル上の
電気泳動により分離される。それを含有するゲル片を取
り出し、電気溶出に付してＤＮＡをそれから抽出する。

電気溶出後、ゲルをエチジウムプロミドで染色の後、紫
外線を照射する。その様に調製されたフラグメントはポ
リオウィルスのヌクレオチド２２４３〜３４１７に対応
する。それを同一の酵素により前に線形化されたベクタ
ープラスミドｐＢＲ−８２２のＰｓｔＩの部位にＤＮＡ
−リガーゼを用いて結合により挿入する。この様にして
形成された組換えプラスミドをＥ、　ｃｏｌｉの１１０
６株中においてクローニングを行う（プラスミドによる
形質転換後テトラサイタリンに対して耐性となるが、し
かし、アンピシリンに対しては感受性を有するコロニー
の選択）。

制限酵素を用いた地図作成法によるそれらのＤＮＡの分
析はポリオウィルスのｃＤＮＡのフラグメントをｐＢＲ
−８２２の地図に関して左廻りの方向即ちβ−ラクタマ
ーゼの遺伝子（アンピシリン耐性の遺伝子）と同一の転
写方向に挿入されて有する組換えプラスミドの同定及び
選択を可能にする。フラグメン）２２４３−３４１７の
ｐＢＲ，−８２２のＰｓｔＩ部位における挿入はヌクレ
オチド配列の連続性を妨害し、従ってベクターのβ−ラ
クタマーゼの遺伝子を不活性化するが、しかし、その結
果インサートの読み取りの相に変化が生ずるのでポリオ
ウィルス蛋白質の発現を確実にするものではないことを
注意しなければならない。

これらの特性を有するプラスミドをｐＳＷ−１１（第６
ｂ図）と命名する。

プラスミドｐ８Ｗ−１１は転写方向５→３′においてＶ
ＰＩの配列に先行してＶＢ２の配列に応じてポリオウィ
ルスのｃＤＮＡの２３７個のヌクレオチドを含有する。

これらの過剰のヌクレオチドは少なくとも次の２つの方
法により除去することができる： ａ）１．１７ｋｂの７ラグメントＰｓｔＩ（先にｐＳＷ
−１１から抽出：第６ｃ図）の制限酵素Ｈａ　ｅ　１７
による制御された処理（ヌクレオチド２４６７における
部分的消化）を行い、次いで０．９５ｋｂの７ラグメン
トＨａｅｌｌ−ＰｓｔＩの電気泳動による選択（第６ｄ
図）（ポリオウィルスのヌクレオチド２４６７〜８４１
７）及びこのフラグメントを適当なプラスミド中におい
て再クローニングする方法。それ自体公知の方法により
トリミングされたフラグメントの合成アダプター（「リ
ンカ−」）の末端に合成により得られた成る種の制限部
位を含有するヌクレオチドの短い配列を付着することに
より再クローニングを容易にすることが可能である。例
えば、Ｒ，Ｈ。シェラ−等により記載された技術を参照
（Ｒ，、Ｈ６５Ｃ）置ＬＥＲｅｔ　ａｔ、　、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ。

ｖｏｌｕｍｅ１９６　（１９７７）、ｐｐ、　１７７−
１８０）。

この選ばれた「リンカ−」のタイプは本質的にエフηす
怖／サターに使用された制限酵素の切断部位に応じて異
る。

ｂ）プラスミドｐｓＷ−１１を酵素ＰｖｕＩ＋７）完全
消化により線形化した後、酵素Ｂａ１８１を用いて核酸
末端分解的処理を行い更に、典型的合成アダプター（「
リンカ−Ｊ　）　（Ｂｊｏｌａｂｓ。

Ｃｏ１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　　の
可能性のある付加及びプラスミドのＤＮＡリガーゼによ
る再環化を行う方法。

従って、分子は開環された状態にある。アガロースゲル
中における電気泳動における移動によりそれらの大きさ
を分析して約７００対の塩基を失ったもの（第６ｅ図に
おいて斜線を付した円弧により示される損失）、即ちＰ
ｖｕＩ部位の各個における約３５０即ちｐＢＲ−８２２
のフラグメントＰｖｕＩ−ＰｓｔＩ＋ＶＰ８乃至ＶＰＩ
の配列が一方にあり、他方にＰｖｕＩ乃至ＢｃｏＲＩの
範囲の同様の長さのｐＢＲ，−３２２を失ったものを同
定する。

この様にして、その一方の末端がＶＰＩを暗号化するＤ
ＮＡ配列の末端と一致するフラグメントを単離すること
が可能である。或いは全ての場合においてそれは極めて
近似するものである。

事実、ＰｖｕＩ部位は１．１７ｋｂの断片ＰｓｔＩの配
列の近接部位ＰｓｔＩから１２６対の塩基の）に生じ、
プラスミドｐｓＷ−１１においてはＶＰＩを暗号化する
ｃＤＮＡ　　の７ラグメントの近接末端から３６３対の
塩基において生じている。

例えばＢｇｌ　■部位を含有する「リンカ−」の選択さ
れたフラグメントの末端にリガーゼを用いた可能性のあ
る固定後にその大きさが４８〜５ｋｂ（第６ｆ図）であ
るプラスミドが選択される。次いで、■Ｐ１配列の全部
を保存しなからＶＢ２の全て或いはほとんど全てを失っ
たプラスミドが決定される。これは、選択されたプラス
ミドのＢｇｌｌＪ−Ｐｓｔ　Ｉのヌクレオチド配列を決
定することによりリンカ−Ｂｇｌｌｌに挿入された場合
において立証される。若し、ザンガー（ＳＡＮＧＥＲ，
）の方法が使用される場合には、配列されるフラグメン
トはファージＭ１３の複製形態に挿入され、その様に構
成された組換えファージがりｏ　−＝ングされる。次い
で、それらのＤＮＡを用いて挿入フラグメントをザンガ
ーにより説明される技術により挿入フラグメントを配列
する。また、マクサム（ＭＡＸＡＭ）及びギルバート（
ＧＩＬＢＦＲＴ）により説明される方法により保存され
るヌクレオチド配列の決定を行うことも可能である。

プラスミドｐ８Ｗ−１１をトリミングすることにより、
特に上記方法の変法すより、しかしリンカ−Ｂｇｌｌの
導入を行うことなく得られたプラスミドをｐｓＷ−１１
９と命名した。

プラスミドｐｓＷ−１１及びｐｓＷ−１１９（或いはｐ
ＣＷ−１１９）の間に見られる相違は第７図の図表から
得られる。特にプラスミドｐｓＷ−１１９はプラスミド
ｐｓＷ−１１も、また含有し、ポリオウィルスの構造Ｖ
Ｐ８のポリペプチドを暗号化する配列部分の大部分を失
っている。

フランス特許出願筒８２０２０１３号に示される如くプ
ラスミドｐｓＷ−１１９はＥ、ｃｏｌｉ１１０６或いは
ＧＣ２６の菌株（その他の微生物中上記特許出願第８２
　０２０１８号に示されているような）中の融合蛋白質
■Ｐ１−β−ラクタマーゼを発現する能力がある。この
４９，０００ダルトンの分子量を有する融合蛋白質はモ
ノクローナル抗体ＣＤ−ＶＰＩ　（或いはＣ８）により
特異的に免疫沈降される。

ｐｓＷ−１１９の誘導体、ｐＦｓ１１９はｐ　Ｂ　Ｒ８
２２の部位ＢａｒｎＨＩ及びＰｓｔＩ間の配列（ヌクレ
オチド３７５−１［）８）をｐＢＲ３２７の対応する配
列で置換することにより構成された。プラスミドｐＦ’
５１１９により細菌ＧＣ２ｅ中に発現された蛋白質を（
Ｓ）　　メチオニンで標識し、免疫沈降及びポリアクリ
ルアミドゲル上での電気泳動後にＧＣ２６の発現生成物
中に再び４９、０００ダルトン（ｐ４９）のオーダーの
分子量を有するＣ３により特異的に免疫沈降される融合
蛋白質を認識することが可能であった。

また、第７図にはプラスミドｐＦＳ　−１０１９の構造
が図示されている。このプラスミドはｐ８Ｗ−１１９或
いはｐＦ’５−１１９の消化、−得られた７ラグメント
のアガロースゲル上の電気泳動による分離、 −ｐｓＷ−１１９或いはｐＣＷ−１１９から得られ後者
の大きさを有する、しかしながら約３１５対の塩基が減
少したフラグメントの（関連する７ラグメントの大きさ
により）選択により得られたものである。同様にして、
塩基Ｘｂａ　Ｉ　−ＸｂａＩの３１５対の小さな７ラグ
メントを同一条件下において消化媒体から集めて得た。

選ばれた第１の７ラグメントをリガーゼを用いて再環化
してプラスミドｐＦｓ　１０１９を形成した。この物質
をＥ、ｃｏｌｉ　１１０６中に導入後、後者を最早モノ
ク四−ナル抗体ＣＤ−ＶＰＩ或ｃ３により認識されない
３９　、０００ダルトンの不完全融合蛋白質の取得に導
いた。

反対に、３１５のヌクレオチドのＸｈａＩ末端を有する
小さな７ラグメントは適当なプラスミドの有する遺伝子
中に再び相導入すると、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１０６を形質
転換する能力を有する変性プラスミドに導き後者をモノ
クローナル抗体ｃ３により認識されるハイブリッド蛋白
質を発現する能力を有するものにする。例えば、この相
中の再導入はｐＢＲ−３２２のβ−ラクタマーゼの遺伝
子中において行うことができる。

適当な相中への配置は必要に応じてフランス特許出願筒
７８３２０４１　（１９７８年１１月１３日出願）に記
載される技術を用いて行うことができる。

フラグメントＸｂａＩ　−ＸｂａＩのプラスミドｐＦＳ
１０１９中への再挿入はその起源の如何を問わず再びそ
の発現生成物がＣ３により認識可能々蛋白質を含有する
プラスミドに導く。従って、特許出願第８１０９９６８
号にも記載されているｐＰＶｌ　−３６６から単離され
た同一の大きさ及びヌクレオチド構造のフラグメントＸ
ｂａＩ−ＸｂａＪのｐＦＳ１０１９のＸｂａ１部位中の
再挿入により得られたものはこの様に特にプラスミドｐ
ｃＷ１１９に関するものであった。

フラグメントＸｂａＩ−ＸｂａＩ　（３１５対のヌクレ
オチド）のヌクレオチド配列は既に上記に示した通りで
ある。同様にしてペプチド５ｅｒ２３−８ｅｒ１２８の
ペプチド構造を上記説明で示した。

第９図にはプラスミドｐｃＷ１　ｉ　９の図が示されて
おシ、その蛋白質ＶＰＩを暗号化する配列は２つの円弧
により境界付けられる斜線を入れた領域により表わされ
ている。本発明の範囲に関する主たる部位も、また第９
図に示される。

求められている免疫原性部位（即ち、Ｃ３により認識さ
れるエピトープ）を有することのできるより小さなペプ
チド配列の決定及び取得は次のようにして行われた。

プラスミドｐｃｗ　１１９を制限酵素ＫｐｎＩ　Ｋよる
消化に付したところ、この制限酵素はプラスミドを制限
部位３０６４　（従って、前記フラグメントＸｂａ■の
範囲外）のレベルにおいて開環した。

上記方法を使用し、酵素１３ａＱ　３１を用いて繰返し
てトリミングサイクルを行ったところ、上記配列「Ｈｉ
ｓ　６５−Ｐｈｅ　１０５　Ｊ及びｒＡｓｐ９３−Ｌｅ
ｕ　１０４Ｊを暗号化するものを含む連続的末端フラグ
メントの喪失に導いた。今、将に述べたペプチド配列を
暗号化する配列を含有するフラグメントの線形化プラス
ミドからの除去は引続いて再環化される（Ｔ４−ＤＮＡ
−リガーゼにより）プラスミドにおけるモノクローナル
抗体ＣＤ−ＰＶＩ或はＣ３により認識されることのでき
るペプチド配列をそれによって形質転換される細菌によ
り産生ずることを誘発する能力の喪失により証明される
。

更により大きな精度でＣ３によシ認識されるエピトープ
を局在化するために、この配列の多少広範々削除を含む
１）ＣＷ１１９から得られる一連のプラスミドが構成さ
れた。部位ＸｂａＨ２５４６）及び（２８６１’）に関
して削除されたフラグメントの相対的位置は第９図に円
弧により図示されている。

これらの削除の左側への限界は、プラスミドのＸｂａＩ
を用いた線形化（１μりのＤＮＡ比中）、及びフレノウ
（Ｋｌｅｎｏｗ　）の酵素で〔α”２Ｐ　）−ｄＡＴＰ
（１０μＣｉ）及びｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ
　（後者の構成成分の各々の０．２　ｍＭの割合）の存
在下において１５Ｃで１時間標識を付することにより決
定された。標識化ＤＮＡを次いで下記制限酵素を用いて
消化した（ＡｌｕＩを用いる場合には部分的消化条件）
。標識化制限フラグメントを次いで５チポリアクリルア
ミドゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより可
視化した。右側への削除の限界は削除されたフラグメン
トの大きさから演縛し、第１０図の上部において同定さ
れた酵素の制限部位の存在或いは不存在により確認され
た。後者において使用された記号は次の意味を有する：
　Ｘ＝ＸｂａＩ　、　Ｈ＝　ＨｈａＩ、Ａ＝Ａ１ｕＩ、
５＝Ｓａｕ３Ａｓ　Ｋ＝ＫｐｎＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ。　示
された番号は第８図に関するヌクレオチドの位置に対応
する。

プラスミドｐｃＷ２１７．２１３．２１５及び２０２に
より発現される不完全融合蛋白質は、また、Ｃ３を中和
するモノクローナル抗体とも反応する。他方、プラスミ
ドｐｃＷ２１６．２０３．２１８及び２２３により発現
される不完全融合蛋白質は最早抗体Ｃ３によっては認識
されない。制限酵素による微細地図作成法は不完全蛋白
質とＣ３（ｐＣＷ２１５　）との反応性に影響を及ぼさ
ない最大の削除はヌクレオチド２７９２　（ｆ　ｏ　２
　）マで延びており、また、不完全蛋白質の活性の損失
により示される最小の削除はヌクレオチドことを決定す
ることを可能にした。

従って、Ｃ３により認識される中和エビ）　−ブを構成
するアミノ酸配列のＣ−末端はアミノ酸９５、と１１０
の間に位置し、より詳細には蛋白質ＶＰＩのアミノ酸９
８と１０４の間に配置しているものと考えることができ
る。この領域は、また、蛋白質の親水性領域にも対応す
るものである。

これらのＤＮＡ配列のエクスプレッションベクター中へ
の導入配列Ｘｂ　ａ　Ｉ　−Ｘｂ　ａ　Ｉは開始コドン
、停止コドンのいずれも含まない。それは、また、その
転写のためのプロモーターもリポソームによる認識信号
も含まない〔ギラード（Ｇ　Ｉ　ＲＡＲＤ　）　及びヒ
ルス（ＨＩＲＴＨ）により説明されるシャイン（ＳＨＩ
ＮＦ）及びダルガーノ（ＤＡＬＧＡＲＮＯ）の配列、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｉｅＭｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ　、　Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ　Ｄｏｉｎ　１９８０＋　ｐｐ、　１５−４６
及び２６３−２６４　）。それを発現させるためには、
従って、ヌクレオチド配列の中間の相中（及びいずれの
場合にも開始ＡＵＧＯ後）にそのプロモーターをクロー
ン化させた（或いはそれに上流に連結させた外部プロモ
ーター）遺伝子を挿入する必要がある。上記の如きリン
カ−の使用は関連するプロモーターに従って数個の異っ
たタイプのエクスプレッションベクターを使用すること
を可能にする。これらの各種タイプのプロモーターを以
下に例示する。

ａ）細菌プロモーター これは特［Ｅ、ｃｏｌｉ　のラクトースオペロン（オペ
ロン１ａｃ）　　のプロモーター−オペレーター領域に
引続きβ−ガラクトシダーゼの遺伝子の５′部分を含有
するプラスミドの場合である。これらのタイプｐｐｃ　
（ＣＨＡＲＮＡＹ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｎｕｃ　ｌｅ　ｉ
　ｃＡｃｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９７８　、　ｔｏ
ｍｅ　Ｖ、　ｐｐ、４４７９−４４９４　）のベクター
はβ−ガラクトシダーゼの開始ＡＵＧの後の２１ヌクレ
オチドに位置するＥＣＯＲＩ部位における配列の挿入を
可能にする。従って、それらが発生する蛋白質はＮ末端
について細菌β−ガラクトシダーゼの７個（或いは８個
）の最初のアミノ酸及びそれに引続く該配列により暗号
化されるアミノ酸である。

これは特にファージλの左オペロン（ＰＬ）或いハ右オ
ペロン（ＰＲ）のプロモーター−オペレーター領域を含
有するプラスミドの場合である。それぞれタイプｐＫｃ
３０　（ＲＯ８ＥＮＢＵＲＧ　、　Ｎａｔｕｒｅ　１９
８１　。

ｖｏｌ、２９２．ｐ、　１２８）或いはｐＣＬ４７（Ｚ
ＡＢＥＡＵ　ｅｔＳＴＡＮＬＥＹ、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ
ｏｕｒｎａｌ、　１９８２．　ｖｏｌ、　Ｉ。

ｐｐ、　１２１７−１２２４　）のｐＬＫ５　（或いは
ｐＲＣ５）及びｐＬＧ４００　（後者はＣｅ１ｌ　、１
９８０．ｖｏｌ、２０．ｐｐ、５４３−５５３に記載さ
れている）から得られるベクターは、該配列の挿入をそ
れぞれＮ遺伝子の生成物のＮ末端或いはＣ，Ｎ、　Ｃ，
Ｍ、にｌ−１８４の番号で１９８２年２月８日に寄託さ
れたｃｒｏ遺伝子の生成物のそれを暗号化するヌクレオ
チド配列中に行うことを可能にする。これらのベクター
系はＩＣにおいてλファージにより溶原化された細菌中
において感熱性リプレッサー（ｃ１８５７）或いは感熱
性リプレッサーを暗号化する同一の遺伝子を有するプラ
スミドの存在下において増殖される。それらは培養液が
３０Ｃに保たれる限り、リプレッサーにより不活性であ
り続ける。培養液を４２ｔＺ’に移すとｃｌ　８５７遺
伝子のリプレッサーの不活性化により組換えプラスミド
の有するλプロモーター（ＰＬ或いはＰＲ）の活性化が
行われる。

これは、Ｓ■４０ウィルスをベクターとして使用する場
合である。この場合には、後期ウィルスプロモーターが
使用され、ポリオウィルスの配列がＳＶ４０の後期蛋白
質（ＶＰＩ或いはＶＦ６）を暗号化する領域の全部或い
は部分の代りに挿入される。この様にして、このウィル
スのカプシド蛋白質を暗号化する配列が免疫原性ペプチ
ドを暗号化する配列で置換されたＳＶ４０の置換ＤＮＡ
が構成される。この様に該配列の導入は必要に応じてＳ
Ｖ４０の後記フラグメントＨａｅｌＴ−ｐｓｔ　Ｉ　（
７６７〜１９２３のヌクレオチド）或いはこのフラグメ
ントの一部の代りに適当なリンカ−を介して行われ、そ
の結果ＳＶ４０の蛋白質ＶＰ２のＮ末端部分の直接下流
のポリオウィルスに関して活性な抗体をｉｎ　ｖｉｖｏ
で誘発する免疫原性ペプチドを暗号化する配列を有する
キメラ遺伝子を形成する。

同様にして、部位ＥｃｏＲＩ（１７１８）及び１３ａｍ
　Ｈｌ（２４６９）の間のＳＶ４０の配列の代りにポリ
オウィルスのＶＰＩ配列を置換することも可能である。

これはヘルペスウィルスのチミジン−キナーゼの遺伝子
（ｐＡＧＯ）、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢｓ抗原の遺伝子
（ｐＡＣ−２或いはｐＡＣ−１４）或いはアデノウィル
ス２の早期成いは後期遺伝子などのプロモーターを有す
るプラスミドの場合である。そのプロモーターを用いて
クローン化されたウィルス遺伝子のＡＵＧの後への本発
明の免疫原性配列の挿入は、それの動物細胞における発
現を（形質導入、マイクロインジェクション或いは細胞
−プロトプラスト融合の後において）確実に行わせるこ
とを可能にする。

ペプチド配列即ち「本発明による配列」は化学合成によ
り取得可能であり、例えば下記に示す条件を用いて通常
の方法の１つにより得ることができる。

均−溶液及び同相におけるペプチド類の合成はよく知ら
れている。

この点について、均一溶液における合成法としてホウベ
ンワイルによる「有機化学の方法」と題される著作に記
載の方法が挙げられる〔ＨＯＵＢＥＮＷＥＹＬ：　”Ｍ
ｅｔｈｏｄｅｍ　ｄｅｒ　ＯｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈ
ｅｍｉｅ　−（Ｅ、Ｗｕ’ｎ５ｃｈ編、　ｖｏｌ、　１
５−■ａｎｄ　■、ＴＨＩＥＭ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　
１９７４　））。

この合成方法は連続するアミノアシル基を２つずつ順次
所定の順序で縮合させるか或いはアミノアシル基と予め
形成され既に数個のアミノアシル基を含有する適当な順
序で縮合させるか或いはこの様に予め形成された数個の
フラグメントを縮合させることによりなるものであるが
、これらのアミノアシル基の有する全ての反応性官能基
は通常ペプチド結合の形成に参加しなければならない一
方のアミン官能基、及び他方のカルボキシル基或いはそ
の反対を除外しては特にカルボキシル官能基の活性化後
においてはペプチド合成で公知の方法に従って保護され
るように注意が払われるべきである。或いは、またカル
ボジイミドタイプ例えば１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミドなどの通常のカッ
プリング試薬を使用するカップリング反応を使用するこ
ともできる。

使用されるアミノアシル基が更にアミン官能基（例えば
リジンの場合）或いは別の酸官能基（例えばグルタミン
酸の場合）、これらの官能基は例えばアミン官能基につ
いてはカルボベンゾオキシ或いはｔ−ブチルオキシカル
ボニル基により保護され、カルボキシル官能基について
はｔ−ブチルエステル基で保護される。これらの操作は
他の任意の反応性官能基の保護と同様である。例えば、
使用されるアミノアシル基の１つがＳｆ（官能基（例え
ばシスティン）、アセトアミドメチル基或いはパラメト
キシベンジル基を使用することができる。

アミノ酸対アミノ酸による漸進的合成の場合には、合成
はＣ−末端アミノ酸と所望の配列における隣接のアミノ
アシル基に対応するアミノ酸などとの縮合により開始さ
れるのが好ましく、段階的にＮ末端アミノ酸に至るのが
好ましい。

本発明のもう１つの好ましい技術によればＲ，Ｄ。

メリフィールドにより「固相ペプチド合成」と題すれる
文献に記載される方法が用いらレル〔Ｒ，Ｄ、ＭＥＲＲ
ＩＦＩＥＬＤ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　　ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ
ｏｃ、、４５．２１４９−２１５４　））。

メリフィールド法によりペプチド鎖を調製するためには
、極めて多孔性の重合体樹脂が使用されなければならず
、それには鎖の最初のＣ−末端アミノ酸が固定される。

このアミノ酸は樹脂にそのカルボキシル基を介して固定
され、そのアミン官能基は例えばｔ−ブチルオキシカル
ボニル基などにより保護されている。

最初のＣ−末端アミノ酸が、この様に樹脂に固定される
とアミン官能基の保護基は酸で樹脂を洗浄することによ
り除去される。

アミン官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基
である場合には、樹脂をトリフルオロ酢酸で処理するこ
とにより除去することができる。

次いで、第２のアミノ酸がカップリングされ、これはＣ
−末端アミノアシル残基から鎖に固定された最初のＣ−
末端アミノ酸の脱保護されたアミン官能基に至る所望の
配列の第２のアミノアシル基を与える。好ましくはこの
第２のアミノ酸のカルボキシル基は、例えばジシクロへ
キシルカルボジイミドにより活性化され、アミン官能基
は、例えばｔ−ブチルオキシカルボニルにより保護され
ているのがよい。

このようにして、所望のペプチド鎖の第１の部分が得ら
れ、それは２つのアミノ酸よりなりその末端アミン官能
基は保護されている。前記と同様にアミン官能基を脱保
護し、次いで第２のＣ−末端アミノ酸の付加の条件と同
様な条件下で第３のアミノアシル基の固定化を行うこと
が可能となる。

この様にして、次々とアミノ酸を固定し、既に形成され
樹脂に付着しているペプチド鎖の部分に毎回予め脱保護
されるアミノ基に対してペプチド鎖を構成する。

全部の所望のペプチド鎖が形成されるとペプチド鎖を構
成する異ったアミノ酸の保護基を除去し、ペプチドを樹
脂から例えばフッ化水素酸６１） を用いて脱着する。

該免疫原性配列を有し、それらを発現する能力を有する
即ち免疫原性ペプチドの合成を行う能力を有する組換え
プラスミドの発現は、それ自体公知の免疫沈降技術によ
り、好ましくはＣ３モノクローナル抗体或いは抗−ＶＰ
Ｉウサギ血清（ＶＰＩ）を含有する腹水を使用すること
により検出される。

最も小さな大きさであり、エピトープ或いは免疫原性決
定基を有する配列に関し、より詳しくは化学合成により
比較的容易に取得可能であるものに関し、それらのｉｎ
　ｖｉｖｏの免疫原特性を強化するためには１それらを
生理学的に許容可能で且つ非毒性の担体分子に共有的に
カップリング即ち「複合化」させるのが望ましい。

本発明による複合体の構成中に入る担体分子或いは高分
子支持体の具体例としては、テタヌス毒素、オバルプミ
ン、血清アルブミン、ヘモシアニン等の天然蛋白質が挙
げられる。

（５２） 合成高分子支持体としては、例えばポＩＪ　ＩＪジン類
或いはポリ（Ｄ−Ｌ−アラニン）−ポリ（Ｌ−リジン）
類が挙げられる。

文献には、通常２０　、０００より大きい分子量を有す
る使用することの可能なその他の分子支持体が挙げられ
ている。

本発明に従って複合体を合成するためには、それ自体公
知の方法例えばフランツ及びロバートリクにより記載さ
れている方法［：　ＦＲＡＮＴＺａｎｄ　ＲＯＢＥＲＴ
ｓＯＮＸＩｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　ＩｍｍｕｎｉｔＬ　
３３゜１９３−１９８　（１９８１）　）或いはＰ、　
Ｅ、カウフマンによりペプチド及び適当な担体分子を用
いて行われている方法ＣＰ、　Ｅ、　ＫＡＵＦＦＭＡＮ
、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ
ｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　、　０ｃｔｏｂｅｒ　
１９８１　＋Ｖｏ１．４２．Ｎｏ、　４　、６１１−６
１４　）　ヲ使用スル：Ｃトカできる。

実施に際して、カップリング試薬としては、次の化合物
が有利に使用されるが、これらに限定されるものではな
い。即ち、グルタルアルデヒド、エチルクロロホルメー
ト、水溶性カルボジイミド類（Ｎ−エチル−Ｎ′（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＣＱ）、
ジイソシアネート類、ビス−ジアゾベンジジン、ジー及
びトリクロロ−ｓ−トリアジン類、シアノーゲンブロミ
ド類、ベンザキノン並びに５ｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１９７８．ｖｏｌ　、８．Ｂ　
７−２３　（ＡＶＲＡＭＥＡＳ　。

ＴＥＲＮＹＮＣＫ　、　ＧＵＥＳＤＯＮ　）に述べられ
ているカップリング剤などが挙げられる。

一方において、ペプチドの１個或いは数個の反応性官能
基及び、他方において、支持体分子の１個或いは数個の
反応性官能基を作用させる任意のカップリング方法を使
用することが可能である。蛋白質の合成において使用さ
れるタイプのカップリング試薬、例えば１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ
−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの存在下において
、カップリング反応を行わせることのできるカルボキシ
ル基及びアミノ基などの官能基が含まれるのが有利であ
る。また、特にペプチド及び支持体分子の有するアミン
基を共にカップリングさせる量である場合には、グルタ
ルアルデヒドを使用することも可能である。

以下に具体例としてポケット（ＢＯＱＵＥＴ、Ｐｉｅｔ
　Ｃｏ１１．（１９８２）Ｍｏｌｅｃ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、、　１９．１５４１−１５４９　）　　により説明
される方法によるグルタルアルデヒドを用いてペプチド
Ａ８Ｉ）　９３−Ｌｅｕ　１０４を英国ｒ笠貝　ヘモシ
アニン」のヘモシアニン（ＫＬＨ）により構成される支
持体へのカップリングについて述べる。このカップリン
グは、約２．２５雫のヘモシアニン当り２ｍ９のペプチ
ドの割合で行われる。

得られる複合体はＣ３モノクロ一ナル抗体により免疫沈
降可能である。この免疫沈降の後にクロラミンＴを用い
て１２５■で複合体を標識化する。ペプチドがチロシン
残基を含有し々いならば標識化は支持体蛋白質の所での
み行われるに過ぎず、その結果ペプチドの抗原特性は変
性されることがない。

コレラノペプチドの免疫原性は、また、それ（５５） らのオリゴマー化を例えば単量体ペプチドの各々の有す
る別々の反応性官能基をカップリングさせることのでき
る任意の試薬の存在下によって行わせることにより強化
することができる。

特に本発明は２〜１０の単量体単位よりなるこの様にし
て得られた水溶性免疫原性オリゴマーに関する。

一般的に、本発明はか個未満のアミノアシル残基、好ま
しくは１５個未満のアミノアシル残基を含有する全ての
小さい［免疫原性ペプチド類」に関する。これらの免疫
原性ペプチド類は、好ましくは上記配列ＡＳＩ）　９３
−Ｌｅｕ　１０４或いは同様の立体配信構造を有する配
列を含有するものである。

本発明は勿論これまでに挙げられた特別のペプチド類に
限定されるものではない。

当業者には公知の如く、本発明の配列中に含有される成
る種のアミノアシル残基はその他のアミノアシル残基に
よりそれらの残基が形成されるペプチドの発現立体配座
及び％に高分子支（５６） 特休とのカップリング後におけるポリオウィルスに対す
る抗体と反応する能力を実質的に変性しない程度におい
て置換することが可能である。

この点において、例えば可能性のある置換として、アラ
ニル基のグリシル基による置換或いはその逆、イソアス
パラギン酸残基のアスパラギン酸残基、グルタミン或い
はイソグルタミンによる置換、バリン基のアラニン、ロ
イシン或いはグリシン基による置換、リジン基のノルロ
イシン基或いはアルギニンによる置換、などが挙げられ
るが、但し、毎回変性されたペプチドの全ポリオウィル
スを中和する能力、即ちＣＤ−ＶＰＩモノクローナル抗
体により認識される能力を有する抗体を誘発する能力が
確認される。これらの全ての可能性のある等何物は本発
明の特許請求の範囲内に入るものと当然理解されるべき
である。

本発明によるペプチド類の性質 本発明のペプチド類、より特別には形成された複合体ペ
プチド類は、通常の技術によりｉｎ　ｖｉｖ。

で抗体の産生を誘発する能力を有する。それらを抗ポリ
オウィルス抗体と反応させることが可能である。それら
は動物に接種されると抗ポリオウィルス抗体の合成を誘
発する。

更に、それらを抗ポリオ抗体の診断及び滴定の試薬とし
て使用することが可能である。それらの診断試薬として
の用途においては、通常の技術、例えばＥＬＩＳＡ技術
を使用することが可能である。その様な方法の原理を以
下に想起する。それは、例えば次の工程よりなるもので
あるニ ー　Ｅ　Ｌ　ｒ　Ｓ　Ａ法を実施するために使用される
タイプのマイクロプレートのウェル中への所定量の本発
明によるペプチドの堆積、 □場合に応じて検出すべき或いは検定すべき抗体を含有
する増大する稀釈率の血清のこのマイクロプレートのウ
ェル内への導入、□インキュベーション及び例えば硫酸
溶液の添加による反応の中断、 □マイクロプレートの適当な緩衝液による充分な洗浄、 □最初のものに対する標識化抗体の導入（標識化は、加
水分解が所定の波長の放射線に対する吸収率の変化によ
り示される基質から選ばれた基質を加水分解することの
できる酵素を用いて行われる）、 □吸光度の変化の測定及び好ましくは対照例についてな
された測定法と同様々方法による研究対象の血清中の抗
体含量の測定。

本発明によるＤＮＡ配列はそれ自体ウィルスのＲＮＡ或
いは生物学的試料中の対応する（！ＤＮＡの存在を検出
することを可能にするハイブリッド化プローブとして使
用することができる。この方法は従って生物学的試料か
らのＲＮＡ或いはＤＮＡの予備抽出及びそれの）・イブ
リッド化を可能にすあ条件下における放射線トレーサー
或いは酵素特に上記タイプの基質を加水分解するに適し
たタイプの酵素により標識化された本発明によるＤＮＡ
配列と接触させることを含むものである。

６９） 本発明は勿論、等価の免疫学的性質を付与された発現生
成物に導くあらゆる等価のＤＮＡ配列に関するものであ
る。即ち、これらの等価の配列の発現生成物により誘発
される抗体は、より詳細に説明されたＤＮＡフラグメン
トの発現生成物と反応性を有するものであり、また、そ
の逆も真である。特に、発現生成物の免疫学的性質は同
等であるが、核酸の削除、添加或いは置換によりより詳
細に説明されたものとは相異するＤＮＡ配列にも及ぶも
のである。

本発明は、また、上記の如き免疫原性ペプチドを得る方
法に関するものであり、この方法は本発明に従ったＤＮ
Ａ配列の適当なベクター中への挿入、上記挿入配列を発
現することのできるその様に変性されたベクターにより
形質転換可能な微生物の形質転換、合成蛋白質の回収、
及び本発明によるペプチドを含有するペプチド画分の単
離からなり、ペプチドが、場合によっては分子量の差に
より、分別後に同一ポリオウィルスのＣ及び０粒子及び
このポリオウィルス（６０） のカプシドのＶＰ−１構造ポリペプチドの両者に対して
活性である抗体により検出可能である、工程からなるこ
とを特徴とするものである。

本発明は、また、本発明の挿入配列を含有し、このイン
サートの、このベクターにより形質転換可能な微生物中
での発現を可能にするプロモーターの制御下にある任意
のベクターに関するものである。

最後に本発明は、その様なベクターにより形質転換され
、同一ポリオウィルスの粒子Ｃ及びＤ及びこのポリオウ
ィルスのカプシドのＶＰ−１構造ポリペプチドの両者に
対して活性である抗体により認識される蛋白質を産生ず
るように適応された微生物に関するものである。

前記説明より自明の如く及び前記以外の結果として、本
発明は特別に述べた応用及び態様の種類には全く限定さ
れることなく、逆にタイプ１株或いはタイプ２或いはタ
イプ３株の如何を問わず、その他のポリオウィルス株か
う得うれた対応するペプチド配列よりなるあらゆる修正
を包含するものである。例えばＳａｂ　ｉ　ｎ株の蛋白
質ＶＰ−１を暗号化するＤＮＡの対応する配列（或いは
等価物）を挙げることができる。Ｍａ　ｈ　ｏ　ｎ　ｅ
ｙ株のＶＰ−１の配列Ｈｉｓ　６５−　Ａｌａ　１０６
に対応する５ａｂｉｎ株のペプチド配列は後者とは下記
番号で示される位置における異ったアミノアシル残基に
より区別される： ８８（Ａｌａ）、９０（Ｉｌｅ）、９５（Ｓｅｒ）、９
８（ＬｙＳ）、及び１０６　（Ａｌａの代りにＴｈｒ）
。

また、上記において説明された異ったアミノ酸置換基を
含んでなるペプチド類は特許請求の範囲においてより具
体的に規定したものの等価物を構成するものであること
は自明である。□従って、これらのペプチド類も、また
、その様なものとして特許請求の範囲により保護される
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は既に上記説明において規定した配列に
対応するものである。 第５ａ〜５ｈ図は上記５ｙｌｖｉｅ　ＶＡＮ　ＤＥＲＷ
ＥＲＦ等の文献において記載されたクローンｐＰＶ１−
８４６及びｐＰＶｌ　−１２０から得られた前駆体に対
する製造様式を図示するものである。 第６ａ〜６ｆ図は第１図及び第２図の結果のようなりＮ
Ａ配列の遺伝情報の本質部分を含有するプラスミドの生
産様式の工程を図示するものである。 第７図は前記プラスミド及び本発明の前記第１の工程に
入れられた追加の工程を図示するものである。 第８図はＶＦ６を暗号化する配列の部分に先行され、Ｎ
ＣＶＰ３ｂの暗号化する配列の部分が続いているＶＰＩ
を暗号化する配列の新たな再生である。この配列は、第
１図〜第４図に表われる配列の対応する部分とは本質的
にヌクレオチドの付番によってのみ異るに過ぎない。こ
の付番はＡ、Ｊ、トーナー等が「ポリオウィルスポリ蛋
白質合成の開始部位の同定」と題する文献においていう
ところの「コンセンサス」から生ずるものに一致するも
のである（　Ａ、　Ｊ、　ＤＯＲＮＥＲｅｔ　ａＬ（６
３） ”■ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｎ
ｉｔｉａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ｏｆＰｏｌｉｏｖｉｒｕ
ｓ　Ｐｏ１ｙｐｒｏｔｅｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ’　
（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｊｕｎｅ　
１９８２　、　Ｖｏｌ、　４２．　Ｎｏ、　　３．ｐｐ
ｌ、０１７〜１，０２８））。 この文献は、また、充分に公刊された配列の付番と第８
図に採用された付番の間に確立されるべき関係に関して
スタンフォード大学のＳＵＭＥＸ　ＡＩＭ系のＭＯＬＧ
ＥＮ　　プロジェクトを引用している。 第９図は、プラスミドｐｃＷ１１９の図示である。 それは、上記その他のプラスミド及びｐｃＷ１１９の誘
導体に導入された削除部分の相対的位置を図示するもの
である。 第１０図はプラスミドｐｃＷ１１９における成る種のあ
る制限部位に関するこれらの削除の位置をより具体的に
図示するものである。 （（ｉ４） Ｒ３Ａｌ　　　１（ＡＥＩＩＩ　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｒ２゜ ３２５０　　　　　３２１’１０　　　　　３２７０　
　　　　３２８０　　　　．３２！１１０　　　　　３
３００ＡＡＡＴＣＡＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＡＡＡＡＣＣ
ＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧ
ＣＧＴＣＣＡＣＣＣＥＲ ３ＡＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ＡＵ３
Ａ　　　　　Ｖ　Ｐ　１Ｒ９ＡＩ ＡＬＵＩ ５ＡＩ Ｒ３ＡＩ　　ＰＳＴＩ ＣＥＲ ３ＡＵ３Ａ　　　　　Ｖ　Ｐ　ｌ ｚａｂ；ｔ ＡＳＮ　ＴＨＲＴＨＲＴＹＲＡＲＧ　ＧＬＮ　　ＴＨＲ
ＡＡＣＡＣＣＡＣＧ　ＴＡＴ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＡＣＣ
′ＩＡじ　［；ＡＡ　　ＡＴＴ　　ＡＴＯＴＡ［；　　
ＧＴＡ　　ＧＣＡ第１頁の続き 優先権主張　＠１９８３年６月２９日■フランス（ＰＲ
）［有］８３　１０７７８ ＠発　明　者　シルビー・ヴアン・ゾール・ウェルレフ フランス国７５０１５パリ・ヴイラ ・グリュニュール３ 手　　続　　補　　正　　書（方式） ２６ 昭和５８年合方合日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 ■、事件の表示 昭和５８年特許願第２２４５７８号 ２、発明の名称 するヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ類３、補正をす
る者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付　　印弁昭加５９坪２月２１１１８
６、補正により増加する発明の数　　なし７、補正の対
象　願書の特許出願人の欄、図面及び代理権を証明する
書面＝ ８、補正の内容　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　同一ポリオウィルスのＣ及び０粒子及びこのポリ
   オウィルスのカプシドのＶＰ−１構造ポリペプチドの両
   者に対して活性である抗体により認識されることのでき
   るペプチドを暗号化する最高３１５対のヌクレオチドを
   含有するＤＮＡフラグメント。 ２、　次の構造配列： ＴＣＴ　ＡＧＡ、　ＧＡＣＧＣＴ　ＣＴＣＣＣＡ、　Ａ
   ＡＣＡＣＴ　ＧＡＡＧＣＣＡＧ’［’　ＧＧＡ　ＣＣＡ
   　ＡＣＡ　ＣＡＣＴＣＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＴＣＣＧ
   　ＧＣＡ　Ｃ’ｒＣＡＣＣ（）ＣＡ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　
   ＡＣＴ　ＯＧＧ　（）ＣＣＡＣＡ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　Ｃ
   ＴＡ　ＧＴＣＣＣＴ　’１’ＣＴ　ＧＡ’ｌ’　ＡＣＡ
   （ト）℃ＣＡＡ　Ａ、ＣＣＡＧＡ、　ＣＡＴ　Ｇ’ｌ’
   Ｔ釘Ａ　ＣＡＡ　ＣＡ’ｌ”　ＡＧＧ　ＴＣＡＡＧＧ　
   ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＡＧＣＡＴＡ　ＧＡＧ　’ｌ
   ”ｃＴ　ＴＴＣＴＴＣＧＣＧ　ＣＧＧ　ＯＧ’ｌ’　Ｇ
   ＣＡ　ＴＧＣＧＴＧ　ＡＣＣＡ’ｌ”Ｔ　Ａ’ｌ”Ｇ　
   ＡＣＣＧＴＯＧＡＴ　ＡＡＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＣＣＡ
   ＣＣＡＣＧ　ＡＡＴ　ＡＡＧＣＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴＡ　
   ＴＴＴ　ＧＣＡ、Ｇ’ｌＸ）　ＴＧＧＡＡＧ　ＡＴＣＡ
   ＣＴＴＡ’Ｉ’　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＧＴＣＣＡ
   Ｇ　ＴＴＡ　ＣＧＧ　ＡＧＧ　ＡＡＡＴＴＧ　ＧＡＧ　
   ＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＴ　ＴＣＴを有するＤＮＡフラ
   グメント。 ：ｌ（８１５対未満の塩基よりなり、且つ特許請求の範
   囲第２項記載の配列中に含有される特許請求の範囲第１
   項記載のＤＮＡフラグメント。 ４、　次のペプチド配列Ｈｉｓ　６５−　Ｐｈｅ　１０
   ５　：）Ｔｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ＨｉｓＭｅ
   ｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　８ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ０ を暗号化するヌクレオチド配列を含有する特許請求の範
   囲第１項又は第３項記載のＤＮＡフラグメント。 ５、　次のペプチド配列： Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ　　ＨｉｓＡｒ
   ｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　８ｅｒ　　Ｓｅ
   ｒ　　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃ
   ｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ０ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　
   Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ０ を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第３項記載の７
   ラグメント。 ６、　次のペプチド：　Ａｓｐ　９３−Ｌｅｕ　１０４
   ：ＡｓｐＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔ
   ｈｒ　Ａｓｎ　ＬｙｓＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ を暗号化するヌクレオチド配列を含有する特許請求の範
   ｖＪ４第１項〜第３項のいずれかに記載の７ラグメント
   。 ７　通常所定のポリオウィルスのＤＮＡ内部に含有され
   るＤＮＡ配列内において、全ポリオウィルスに対して活
   性である抗体の産生を可能にする決定基或いは抗原性部
   位を有するペプチドを暗号化し得るより小さな配列の同
   定を可能にする方法において、該方法は免疫原性ペプチ
   ドを暗号化することのできる或いは免疫原性成分の構成
   中に入ることのできるより小さな配列を含有するものと
   認識された初期の配列により形成されたインサートを含
   有するプラスミドを出発物質として用い、該プラスミド
   を該より小さな配列に対して外部の制限部位の箇所にお
   いて線形化し、その線形化されたプラスミドを制御され
   た手法により例えば酵素Ｂａｔ３１などの核酸末端分解
   酵素（エキソヌクレアーゼ）を用いてトリミングし、こ
   のプラスミドをＤＮＡ−リガーゼにより再環化し、それ
   自体対応するベクターにより形質転換可能であり、ベク
   ター中に含有されるインサートを発現することのできる
   適当な微生物を形質転換させ、及びこの微生物の発現生
   成物をＣＤ　−Ｖ　Ｐ　］、モノクローナル抗体と接触
   させることにより関連するタイプの免疫原性部位を有す
   ることのできるペプチドの存在の可能性を該微生物の発
   現生成物中から検出することよりなり、この操作のサイ
   クルを最後の再環化されたプラスミドにより形質転換さ
   れた該微生物の発現生成物内から該免疫原性ペプチドの
   検出が消失するまで締返されることを特徴とする方法。 ＆　特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の
   ＤＮＡ配列により暗号化されるペプチド配列を含有し、
   月つ同一ポリオウィルスから発生する粒子Ｃ及びＤ並び
   に同一ポリオウィルスのカプシドの構造ポリペプチドＶ
   Ｐ−１の両者に対して活性であるモノクローナル抗体に
   より認識することのできるポリペプチド。 ９、　次の配列： Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔ−＋ｅｕ　Ｐｒｏ
   　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＡｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐ
   ｒｏ　Ｔｈｒ　ｌ−Ｔｉ５８ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｉ
   ｌ’ｅＰｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａ
   ｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＡｌａＴｈｒ　Ａｓｎ　
   Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　’
   ｌ”ｈｒ　ＶａｌＧＩｎ　’Ｉ’ｈｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ
   　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　８ｅｒＡ
   ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌ
   ｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ＰｈｅＡｌａ　Ａｒｇ　（）ｌｙ
   　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　
   ’Ｉ”ｈｒＶａｌ　　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　　Ｓｅｒ　’ｌ”、ｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　ＬｙｓＡ
   ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｒ
   ｐ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　
   ’Ｊ’、ｈｒ　Ｖａｔ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒ
   ｇ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　
   Ｔｙｒ　Ｓｅｒにより構成されるポリペプチド。 １０、次の配列： Ｈｉｓ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　ＨｉｓＡｒｇ　８ｅ
   ｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　８ｅｒ　８ｅｒ　Ｉｌｅ
   　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｃ
   ｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ０ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａ、ｓｎ　Ｐｒｏ　
   Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ０ を含有するポリペプチド。 ］１　次の配列： Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　ＨｉｓＡｒｇ　Ｓｅ
   ｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ
   　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ０ Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａ、ｌａ　Ａ−ｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
   　Ｃｙｓ　ｖａＩ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ０ Ｍｅｔ　　’ｌ’ｈｒ　Ｖａｌ　　Ａｓｐ　Ａｓｎ　　
   Ｐｒｏ　Ａｌａ　　８ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ０ Ａ、ｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　
   Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ００ ｃｅ １１０ を含有するポリペプチド。 １２、配列：　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａ、Ｉａ　Ｓ
   ｅｒ　ＴｈｒＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ
   　Ｌｅｕにより形成されるポリペプチド。 １３２０個未満のアミノアシル残基、好ましくは１５個
   未満のアミノアシル残基を含有し、特許請求の範囲第１
   ２項記載の配列を含有するポリペプチド。 １４　　特許請求の範囲第８項〜第１３項のいずれかに
   記載のポリペプチドのいずれかと好ましくは２０，００
   ０よりも大きい分子量を有する担体分子とを共有カップ
   リングさせて得られる免疫原性複合体。 １５、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載
   のＤＮＡ配列により構成されるインサートを含有するベ
   クターであって、このベクターにより形質転換可能な微
   生物中においてこのインサートの発現を可能にするプロ
   モーターの制御下に置かれていることを特徴とするベク
   ター。 １６、特許請求の範囲第１５項記載のベクターにより形
   質転換され、同一ポリオウィルスの粒子Ｃ及びＤ並びに
   このポリオウィルスのカプシドのＶＰ−１構造ポリペプ
   チドの両者に対して活性である抗体により認識される蛋
   白質を産生ずるように適応された微生物。 １７　　特に２個〜１０個のモノマ一単位を含有する水
   溶性オリゴマーであって、モノマ一単位が特許請求の範
   囲第８項〜第１３項のいずれかニ記載のポリペプチドよ
   りなることを特徴とするオリゴマー。 １＆　特許請求の範囲第８項〜第１３項のいずれかに記
   載のペプチドの製造方法において、本発明のＤＮＡ配列
   の適当なベクター中への挿入、上記挿入配列を発現する
   ことのできるその様に変性されたベクターにより形質転
   換可能な微生物の形質転換、合成蛋白質の回収、及び本
   発明ペプチドを含有するペプチド両分の単離からなり、
   ペプチドが、場合によっては分子量の差により、分別し
   た後に同一ポリオウィルスのＣ及び０粒子並びにこのポ
   リオウィルスのカプシドのＶＰ−１構造ポリペプチドの
   両者に対して活性である抗体により検出可能であること
   を特徴とする方法。 １９、血清のような生物学的試料内に抗ポリオ抗体の存
   在を診断するための試薬であって、該試薬がこれらの抗
   体と反応するように適応された抗原よりなり、或いは特
   許請求の範囲第８項〜第１２項のいずれかに記載のポリ
   ペプチドよりなり、或いは特許請求の範囲第１４項記載
   の免疫原性複合体よりなり、或いは特許請求の範囲第１
   ７項記載の免疫原性オリゴマーよりなることを特徴とす
   る試薬。 ２０、ポリオウィルスのＲＮＡ、或いは該ＲＮＡ又はｃ
   ＤＮＡとハイブリッド化することのできるヌクレオチド
   配列を含有する対応するｃＡＤＮの検出のためのプロー
   ブであって、該プローブは特許請求の範囲第１項〜第６
   項のいずれかに記載のＤＮＡフラグメントを含有するこ
   とを特徴とするプローブ。