BR112019021009A2

BR112019021009A2 - peptídeo ligase e uso do mesmo

Info

Publication number: BR112019021009A2
Application number: BR112019021009A
Authority: BR
Inventors: M Buldun Can; Howarth Mark
Original assignee: Univ Oxford Innovation Ltd
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2020-05-05
Also published as: CA3059132A1; GB201705750D0; AU2018251237B2; US10889622B2; ES2900612T3; JP7075678B2; WO2018189517A1; KR102669378B1; EP3610005B1; US20200115422A1; KR20190137820A; DK3610005T3; CN110582566A; EP3610005A1; CN110582566B; JP2020516314A; AU2018251237A1

Abstract

a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que tem capacidade de promover a conjugação covalente de duas etiquetas ou ligantes peptídicos e, em particular, a um polipeptídeo que compreende: a) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na seq id no: 1; ou b) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na seq id no: 1, em que a referida sequência de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 e um ou mais dentre os seguintes: 1) prolina na posição 66; 2) prolina na posição 95; 3) glicina na posição 96; e 4) valina na posição 97, em que os resíduos de aminoácidos especificados estão em posições equivalentes às posições na seq id no: 1, e em que o referido polipeptídeo tem capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre o resíduo de lisina na posição 9 da seq id no: 2 e o resíduo de asparagina na posição 17 da seq id no: 3.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: PEPTÍDEO LIGASE E USO DO MESMO [001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo que tem capacidade de promover a conjugação covalente de duas etiquetas peptídicas ou ligantes. Em particular, o polipeptídeo da invenção tem capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre duas etiquetas peptídicas ou ligantes específicos, isto é, o polipeptídeo da invenção pode ser visto como um peptídeo ligase. A invenção também fornece etiquetas peptídicas ou ligantes que podem ser conjugados (isto é, unidos de modo covalente, acoplados ou ligados através de uma ligação isopeptídica) eficientemente pelo peptídeo ligase da invenção. Também são fornecidas moléculas de ácido nucleico que codificam o dito polipeptídeo (peptídeo ligase) e etiquetas peptídicas, vetores que compreendem as ditas moléculas de ácido nucleico e células hospedeiras que compreendem os ditos vetores e moléculas de ácido nucleico. Também é fornecido um kit que compreende as ditas etiquetas peptídicas, polipeptídeos e/ou moléculas/vetores de ácido nucleico. Um método de produção do dito polipeptídeo (peptídeo ligase) e/ou etiquetas peptídicas e as utilizações dos polipeptídeos e etiquetas peptídicas da invenção também são fornecidos.

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2/114 [002] Eventos biológicos geralmente dependem da atividade cooperativa de múltiplas proteínas e o arranjo preciso de proteínas em complexos influencia e determina sua função. Desse modo, a capacidade de organizar proteínas individuais de um complexo de maneira controlada representa uma ferramenta útil na caracterização das funções das proteínas. Além disso, a conjugação de múltiplas proteínas para formar a chamada proteína de fusão pode resultar em moléculas com características úteis. Por exemplo, agrupar um único tipo de proteína geralmente aumenta amplamente os sinais biológicos, por exemplo, a repetição de estruturas antigênicas em vacinas. O agrupamento de proteínas com atividades diferentes também pode resultar em complexos com

atividades	aprimoradas,	por exemplo,	canalização de
substrato por enzimas.
[003]	Etiquetas	peptídicas	são ferramentas
convenientes	para análise	e modificação de	proteínas, devido

ao fato de que seu pequeno tamanho minimiza a perturbação da função da proteína. As etiquetas peptídicas são simples de codificar geneticamente e seu pequeno tamanho reduz a interferência com outras interações, o custo da biossíntese e a introdução da imunogenicidade. No entanto, as interações entre as etiquetas peptídicas raramente são de alta afinidade, o que limita sua utilidade na formação de complexos estáveis.

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3/114 [004] Proteínas que têm capacidade de formação espontânea de ligação isopeptídica têm sido vantajosamente usadas para desenvolver pares de etiquetas peptídicas/parceiros de ligação que se ligam de modo covalente entre si e fornecem interações irreversíveis (consultar, por exemplo, os documentos n° WO2011/098772 e n° WO2016/193746, ambos incorporados ao presente documento a título de referência). Em relação a isso, proteínas que têm capacidade de formação espontânea de ligação isopeptídica podem ser expressas como fragmentos separados, para gerar uma etiqueta peptídica e um parceiro de ligação para a etiqueta peptídica, em que os dois fragmentos têm capacidade de se reconstituírem de modo covalente pela formação de ligação isopeptídica. A ligação isopeptídica formada pelos pares de etiquetas peptídicas e parceiros de ligação é estável sob condições em que interações não covalentes se dissociam rapidamente, por exemplo, por longos períodos de tempo (por exemplo, semanas), em alta temperatura (pelo menos 95° C) , em alta força ou com tratamento químico rigoroso (por exemplo, pH 2-11, solvente orgânico, detergentes ou desnaturantes) .

[005] As ligações isopeptídicas são ligações amidas formadas entre os grupos carboxila/carboxamida e amino, em que pelo menos um dos grupos carboxila ou amino está fora da cadeia principal da proteína (a estrutura da proteína). Tais

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4/114 ligações são quimicamente irreversíveis sob condições biológicas típicas e são resistentes à maioria das proteases. Visto que as ligações isopeptídicas são de natureza covalente, as mesmas resultam nas interações proteicas mais fortes medidas.

[006] Em resumo, um par de etiqueta peptídica/parceiro de ligação pode ser derivado de uma proteína com capacidade de formar espontaneamente uma ligação isopeptídica (uma proteína isopeptídica), em que os domínios da proteína são expressos separadamente para produzir uma etiqueta peptídica que compreende um dos resíduos envolvidos na ligação isopeptídica (por exemplo, uma lisina) e um parceiro de ligação peptídica (ou Catcher) que compreende o outro resíduo envolvido na ligação isopeptídica (por exemplo, uma asparagina ou aspartato) e pelo menos um outro resíduo necessário para formar a ligação isopeptídica ( por exemplo, um glutamato) . A mistura da etiqueta peptídica e do parceiro de ligação resulta na formação espontânea de uma ligação isopeptídica entre a etiqueta e o parceiro de ligação. Desse modo, fundindo separadamente a etiqueta peptídica e o parceiro de ligação em moléculas diferentes, por exemplo, proteínas, é possível ligar de modo covalente as ditas moléculas através de uma ligação isopeptídica formada entre a etiqueta peptídica e o parceiro de ligação.

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5/114 [007] Embora os pares de etiquetas peptídicas/parceiro de ligação derivados de proteínas isopeptídicas (também conhecidos como sistemas Etiqueta/Catcher, por exemplo, Etiqueta Spy e SpyCatcher) tenham encontrado usos diversos em todo o mundo, sua utilidade foi limitada pelo tamanho dos parceiros de ligação (Catchers) como parceiros de fusão. Os parceiros de ligação a etiquetas peptídicas (Catchers) derivados de proteínas isopeptídicas normalmente compreendem mais de 80 aminoácidos, como pelo menos 90 ou 100 aminoácidos, o que resulta em vários problemas.

[008] Por exemplo, foi demonstrado que os sistemas Etiqueta/Catcher têm utilidade em decorar partículas semelhantes a vírus com antígenos (consultar, por exemplo, Brune et al. 2016, Scientific Reports, 6:19234), em que uma partícula semelhante a um vírus é fundida a um Catcher para produzir uma plataforma de sistema de vacina que pode ser usada para exibir qualquer antígeno fundido ao Etiqueta. No entanto, o grande tamanho de Catchers significa que os mesmos têm maior probabilidade de ter alta imunogenicidade, o que pode prejudicar o uso de sistemas Etiqueta/Catcher na produção de plataformas de sistemas de vacinas. As vacinas produzidas com uso dessas plataformas podem resultar na indução de anticorpos ou células T para o Catcher em vez do antígeno alvo. Essa imunogenicidade também pode proibir o

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6/114 uso da mesma plataforma de sistema de vacina para vacinação sequencial contra duas doenças separadas.

[009] O grande tamanho de Catchers nos sistemas Etiqueta/Catcher também confere uma limitação na sua localização em uma molécula de fusão, por exemplo, uma proteína de fusão. Os Catchers geralmente precisam ser fundidos nas extremidades das proteínas para evitar interferência na dobra de proteínas. Além disso, os Catchers parecem proteínas parcialmente dobradas e, portanto, podem reduzir o rendimento da expressão.

[0010] Uma outra limitação importante dos sistemas de Etiqueta/Catcher causada pelo tamanho do Catcher referese à indutibilidade da reação entre a Etiqueta e o Catcher. Tipicamente, as fusões das proteínas Etiqueta e Catcher reagem espontaneamente quando expressas nas células e, em algumas circunstâncias, seria vantajoso evitar ou controlar tais reações.

[0011] Consequentemente, existe um desejo de desenvolver sistemas de etiquetas peptídicas com as propriedades vantajosas associadas aos sistemas Etiqueta/Catcher derivados de proteínas isopeptídicas, ou seja, etiquetas peptídicas que formam uma ligação covalente estável e robusta conforme discutido acima, evitando os problemas associados ao grande tamanho dos parceiros de ligação peptídica (Catchers).

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7/114 [0012] Verificou-se que é possível expressar os domínios de uma proteína isopeptídica que compreende os resíduos envolvidos na formação da ligação isopeptídica separadamente, isto é, como três fragmentos separados, isto é, dois peptídeos e um polipeptídeo (consultar, por exemplo, Fierer et al. 2014, PNAS E1176-E1181) . Em resumo, uma etiqueta peptídica (Etiqueta K) compreende um dos resíduos envolvidos na ligação isopeptídica (por exemplo, uma lisina), uma segunda etiqueta peptídica (Etiqueta Spy) compreende o outro resíduo envolvido na ligação isopeptídica (por exemplo, um aspartato) e um polipeptídeo (SpyLigase) compreende o resíduo envolvido na mediação da formação da ligação isopeptídica (por exemplo, um glutamato). A mistura dos três fragmentos, isto é, os peptídeos e o polipeptídeo, resulta na formação de uma ligação isopeptídica entre os dois peptídeos, compreendendo os resíduos que reagem para formar a ligação isopeptídica, ou seja, Etiqueta Spy e Etiqueta K. Desse modo, o polipeptídeo (SpyLigase) medeia a conjugação dos etiquetas peptídicas, mas não faz parte da estrutura resultante, isto é, o polipeptídeo não está ligado de modo covalente às etiquetas peptídicas. Sendo assim, o polipeptídeo pode ser visto como uma proteína ligase ou peptídeo ligase.

[0013] O sistema SpyLigase descrito acima é, em teoria, particularmente útil, pois minimiza o tamanho dos

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8/114 etiquetas peptídicas que precisam ser fundidos à molécula, por exemplo, proteína de interesse, reduzindo assim a possibilidade de interações indesejadas causadas pela adição do parceiro de ligação de etiqueta peptídica parceiro (Catcher) discutido acima, por exemplo, desdobramento. No entanto, o sistema SpyLigase mostra um baixo rendimento de conjugação entre parceiros peptídicos (tipicamente, 50% ou menos) e tem baixa atividade acima de 4 °C. Além disso, a utilidade do SpyLigase é limitada por sua incapacidade de funcionar em uma ampla gama de condições, por exemplo, tampões e pela lenta taxa de reação, geralmente em torno de 24 horas (Fierer et al. 2014, supra).

[0014] Os presentes inventores desenvolveram um sistema de peptídeo ligase, isto é, um peptídeo ligase e um par de etiquetas peptídicas, a partir do domínio C-terminal da adesina Streptococcus pneumoniae, RrgA (SEQ ID NO: 4), que naturalmente contém uma ligação espontânea de isopeptídeo entre lisina e asparagina, promovida por um ácido glutâmico aposto. Conforme discutido abaixo, e em detalhes nos Exemplos, foram necessárias várias etapas para gerar o sistema de peptídeo ligase da invenção.

[0015] Em primeiro lugar, os inventores tiveram que selecionar uma proteína isopeptídica apropriada de uma ampla gama de candidatos para modificação e determinar subsequentemente os locais apropriados nos quais a proteína

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9/114 deveria ser dividida. Em relação a isso, o domínio C-terminal de RrgA contém 8 β-fitas e o isolamento do domínio compreendendo o resíduo de ácido glutâmico responsável por promover a formação da ligação isopeptídica a partir dos domínios que contêm os resíduos reativos resultou na remoção de 3 β-fitas (consultar a Figura IA). A remoção de 3 β-fitas de um pequeno domínio proteico é uma modificação importante e o polipeptídeo truncado (isto é, o peptídeo ligase putativo também conhecida como RrgALigase) foi considerado como tendo baixa estabilidade. Notavelmente, o polipeptídeo truncado mostrou baixa solubilidade (particularmente em soluções que compreendem NaCl, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato) e mostrou baixa atividade de ligase. De fato, o polipeptídeo truncado (RrgALigase) foi fundido à proteína de ligação à maltose (MBP) para melhorar a solubilidade da RrgALigase e facilitar a caracterização e modificação da proteína.

[0016] Desse modo, um segundo aspecto no desenvolvimento do sistema de peptídeo ligase da invenção exigiu o projeto e a introdução de várias modificações (isto é, mutações) nos componentes separados derivados da proteína isopeptídica, particularmente, a putase peptídica putativa. As modificações resultaram não apenas em um peptídeo ligase ativo com capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre duas etiquetas peptídicas, mas também foi

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10/114 surpreendentemente determinado que as mesmas também melhoraram a solubilidade e a atividade do domínio de peptídeo ligase, ou seja, quando o peptídeo ligase modificado não estava ligado à MBP, o peptídeo ligase modificado era solúvel e ativo em uma ampla gama de condições. Além disso, o sistema de peptídeo ligase da presente invenção mostra propriedades aprimoradas em relação ao sistema SpyLigase discutido acima, por exemplo, maior rendimento (ou seja, 95%), ampla faixa de condições de reação (temperatura, por exemplo, até 37 °C, uma variedade de tampões etc.), a taxa de reação mais rápida (ou seja, alto rendimento em cerca de 4 horas) e capacidade de funcionar na ausência de um acompanhante químico, como o TMAO (N-óxido de trimetilamina).

[0017] Notavelmente, o sistema de peptídeo ligase da invenção representa uma melhoria em relação aos sistemas de peptídeo ligase, por exemplo, sortase e transglutaminase, evoluídos em natureza por longos períodos de tempo. Por exemplo, as enzimas sortase estão presentes em diversas bactérias Gram-positivas que divergiram mais de 2 bilhões de anos atrás (Antos et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, vol. 131 (31), pp. 10800 a 10801). De fato, os inventores constataram inesperadamente que o sistema de peptídeo ligase da invenção tem um alto rendimento, mesmo em concentrações relativamente baixas de etiqueta peptídica. A título de comparação, o

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11/114 sistema de peptídeo ligase da presente invenção é eficiente em concentrações de peptídeos marcados que são dez vezes menores do que a concentração do parceiro reativo à oligoglicina que é normalmente usada com sortase (Chen et al. , Proc. Natl Acad. Sei. USA, 2011, vol. 108 (28), pp. 11399 a 11404).

[0018] Desta forma, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece, portanto, uma polipeptídeo que compreende:

[0019] a) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1; ou [0020] b) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 e um

ou mais dentre	os	seguintes:
[0021]	D	prolina na posição 66;
[0022]	2)	prolina na posição 95;
[0023]	3)	glicina na posição 96; e

[0024] 4) valina na posição 97, [0025] em que os resíduos de aminoácidos especificados estão em posições equivalentes às posições na SEQ ID NO: 1 e em que o dito polipeptídeo tem capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre o

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12/114 resíduo de lisina na posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição 17 da SEQ ID NO: 3.

[0026] À medida que o polipeptídeo da invenção medeia a conjugação covalente das etiquetas peptídicas da invenção (SEQ ID NOs: 2 e 3, conforme discutido abaixo), isso pode ser visto como um peptídeo ligase. Adicional ou alternativamente, o polipeptídeo da invenção pode ser visto como um catalisador que promove a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas da invenção. Em relação a isso, um catalisador pode ser definido como uma molécula que permite que uma reação ocorra sem alterar sua própria composição e acredita-se que a estrutura do polipeptídeo da invenção após sua interação com as etiquetas peptídicas da invenção e promoção subsequente da formação da ligação isopeptídica entre as ditas etiquetas peptídicas, seja exatamente a mesma que sua estrutura antes da interação. Desse modo, o polipeptídeo da invenção pode ser visto como um peptídeo ligase que catalisa a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas da invenção.

[0027] Conforme mostrado nos Exemplos, um grande número de modificações foi habilmente projetado e introduzido no polipeptídeo de domínio C-terminal RrgA truncado (ligase putativa ou RrgALigase) e testado para determinar seus efeitos na atividade de ligase do polipeptídeo. Os inventores determinaram que apenas as

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13/114 modificações selecionadas resultaram em uma melhoria na atividade da atividade da ligase (consultar Figura 2A). Além disso, verificou-se que cada modificação selecionada melhora independentemente a atividade da ligase.

[0028] Consequentemente, em algumas modalidades, o polipeptídeo da invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 e dois, três ou quatro dentre os

seguintes:
[0029]	D	prolina na	posição 66;
[0030]	2)	prolina na	posição 95;
[0031]	3)	glicina na	posição 96; e
[0032]	4)	valina na ;	posição 97.
[0033]	Desse modo,	por exemplo, as	variantes
polipeptídicas	da	invenção	podem compreender	pelo menos
resíduos de prol	ina nas posições 66 e 95.	Em algumas

modalidades, as variantes de polipeptídeo da invenção podem compreender pelo menos um resíduo de prolina na posição 66 e/ou 95 e um resíduo de glicina na posição 96. Em ainda outras modalidades, as variantes polipeptídicas da invenção podem compreender pelo menos um resíduo de prolina na posição 66 e/ou 95 e um resíduo de valina na posição 97. Em uma modalidade particularmente preferencial, o polipeptídeo da

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14/114 invenção compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e todos os seguintes:

[0034] 1) ácido glutâmico na posição 61;

[0035] 2) prolina na posição66;

[0036] 3) prolina na posição95;

[0037] 4) glicina na posição 96;e [0038] 5) valina na posição 97.

[0039] Em ainda outras modalidades, as variantes de polipeptídeo da invenção podem compreender um resíduo de treonina na posição 100.

[0040] Desse modo, o polipeptídeo (peptídeo ligase) da presente invenção, em particular, pode ser pelo menos 80% idêntico à sequência exemplificada, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e mais particularmente é pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% idêntico à SEQ ID NO: 1, em que a variante polipeptídica compreende um resíduo de ácido glutâmico na posição 61 (ou uma posição equivalente) e um ou mais de:

0041]	D	prolina	na	posição	66;
0042]	2)	prolina	na	posição	95;
0043]	3)	glicina	na	posição	96; e

[0044] 4) valina na posição 97, [0045] ou suas posições equivalentes, conforme definido abaixo.

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15/114 [0046] O polipeptídeo da invenção tem capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre o resíduo de lisina na posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição 17 da SEQ ID NO: 3 sob condições que são adequadas para a formação de uma ligação isopeptídica entre as ditas etiquetas peptídicas e/ou adequadas para a atividade de ligase do polipeptídeo da invenção. É evidente a partir dos Exemplos abaixo que o polipeptídeo da invenção é ativo sob uma variedade de condições. Por exemplo, no tampão de Tris borato (TB) em um pH de 6, 0 a 9,0, por exemplo, 7,0 a 9,0, 7,25 a 8,75, como cerca de 7,5 a 8,5, em uma ampla faixa de temperaturas, por exemplo, 0 a 40 °C, como 5 a 39, 10 a 38, 15 a 37 °C, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35 ou 37° C, preferencialmente, cerca de 15 °C. O polipeptídeo é funcional na presença de concentrações extracelulares de NaCl, por exemplo, cerca de 150 mM de NaCl ou menos. No entanto, em algumas modalidades, pode ser preferencial realizar reações de ligação na ausência de NaCl. O polipeptídeo da invenção também é ativo na presença dos detergentes comumente usados, como Tween 20 e Triton X-100 até uma concentração de cerca de 2%(v/v). Além disso, o polipeptídeo é ativo na presença de glicerol em concentrações de até pelo menos 40%(v/v). Desse modo, em algumas modalidades, pode ser preferencial realizar reações de ligação na presença de glicerol, por

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16/114 exemplo, cerca de 5 a 50%, 10 a 40%, preferencialmente, cerca de 15 a 30%(v/v). O elemento versado teria capacidade de determinar facilmente outras condições adequadas.

[0047] Desse modo, em algumas modalidades, as condições que são adequadas para a formação de uma ligação isopeptidica entre as ditas etiquetas peptídicas e/ou adequadas para a atividade de ligase do polipeptídeo da invenção incluem quaisquer condições nas quais o contato do polipeptídeo da invenção com as etiquetas peptídicas conforme definido no presente documento resulta na formação de uma ligação isopeptidica entre as ditas etiquetas peptídicas, particularmente entre o resíduo lisina na posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição 17 da SEQ ID NO: 3. Por exemplo, o contato do dito polipeptídeo e etiquetas peptídicas em condições tamponadas, por exemplo, em uma solução tamponada ou em uma fase sólida (por exemplo, coluna) que foi equilibrada com um tampão, como o tampão Tris borato. A etapa de contato pode estar em qualquer pH adequado, como pH 6,0 a 9,0, por exemplo, 6,5 a 9,0, como pH 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6 ou 8,8. Adicional ou alternativamente, a etapa de contato pode estar em qualquer temperatura adequada, como cerca de 0 a 40 °C, por exemplo, cerca de 1 a 39, 2 a 38, 3 a 37, 4 a 36, 5a 35, 6 a 34, 7 a 33, 8a 32, 9 a 31 ou 10 a 30 °C, por exemplo, cerca de 10, 12, 15, 18, 20, 22 ou 25 °C,

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17/114 preferencialmente cerca de 15 °C. Em algumas modalidades, a etapa de contato pode estar na ausência de NaCI. Em algumas modalidades, a etapa de contato pode estar na presença de glicerol, por exemplo, cerca de 5 a 50%, 10 a 40%, preferencialmente cerca de 15 a 30% (v/v).

[0048] Em algumas modalidades, o contato dos marcadores polipeptidicos e peptidicos conforme definido no presente documento sob condições adeguadas para a formação de uma ligação isopeptidica inclui o contato dos ditos marcadores polipeptidicos e peptidicos na presença de uma acompanhante química, por exemplo, uma molécula que aprimora ou melhora a reatividade do polipeptídeo e/ou etiquetas peptídicas. Em algumas modalidades, a acompanhante química é ΤΜΆΟ (N-óxido de trimetilamina). Em algumas modalidades, a chaperona química, por exemplo, ΤΜΆΟ, está presente na reação em uma concentração de pelo menos cerca de 0,2 M, por exemplo, pelo menos 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ou 2,5 M, por exemplo, cerca de 0,2 a 3,0 M, 0,5 a 2,0 M, 1,0 a 1,5 M.

[0049] O polipeptídeo da invenção abrange, assim, formas mutantes do polipeptídeo (isto é, aqui referidas como homólogos, variantes ou derivados) que são estruturalmente semelhantes ao polipeptídeo exemplificado estabelecido na SEQ ID NO: 1 e têm capacidade de funcionar como um peptídeo ligase, particularmente com capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptidica entre as etiquetas

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18/114 peptídicas da invenção (peptídeos que compreendem sequências de aminoácidos, conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 2 e 3) sob condições adequadas, conforme definido acima. Nos casos em que uma variante polipeptídica compreende mutações, por exemplo, deleções ou inserções, relativas à SEQ ID NO: 1, os resíduos especificados acima estão presentes em posições equivalentes de aminoácidos na sequência variante do polipeptídeo. Em uma modalidade preferencial, as deleções nas variantes polipeptídicas da invenção não são truncamentos no N-terminal e/ou no C-terminal.

[0050] Desse modo, em algumas modalidades, uma variante polipeptídica da presente invenção pode divergir da SEQ ID NO: 1 por exemplo 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, por exemplo, 1, 2 a 3 substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos, preferencialmente, substituições. Em algumas modalidades, quaisquer outras mutações que estão presentes no polipeptídeo (peptídeo ligase) da presente invenção podem ser substituições conservadoras de aminoácidos. Uma substituição conservadora de aminoácidos refere-se à substituição de um aminoácido por outro que preserva o caráter físico-químico do polipeptídeo (por exemplo, D pode ser substituído por E ou vice-versa, N por Q ou L ou I por V ou vice-versa). Desse modo, geralmente o aminoácido substituinte possui propriedades semelhantes, por exemplo, hidrofobicidade, hidrofilicidade,

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19/114 eletronegatividade, cadeias laterais volumosas etc. ao aminoácido que é substituído. Isômeros do L-aminoácido nativo, por exemplo, D-aminoácidos, podem ser incorporados.

[0051] A identidade de sequência pode ser determinada por qualquer meio adequado conhecido na técnica,

por exemplo, com uso	do banco	de	dados	de sequência	de
proteínas	SWISS-PROT	com uso	de	FASTA	pep-cmp	com	um
pamfactor	variável,	e penalidade	de cr	iação de	lacuna

definida em 12,0 e penalidade de extensão de lacuna definida em 4,0 e janela de 2 aminoácidos. Outros programas para determinar a identidade da sequência de aminoácidos incluem o programa BestFit do pacote de software Genetics Computer Group (GCG) versão 10 da Universidade de Wisconsin. O programa usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman com os valores padrão: Penalidade de criação de lacuna - 8, penalidade de extensão de lacuna = 2, Correspondência média = 2,912, Incompatibilidade média = 2,003.

[0052] Preferencialmente, a dita comparação é feita em todo o comprimento da sequência, mas pode ser feita em uma janela menor de comparação, por exemplo, menos de 100, 80 ou 50 aminoácidos contíguos.

[0053] Preferencialmente, essas proteínas relacionadas à identidade de sequência (variantes de polipeptídeos) são funcionalmente equivalentes aos

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20/114 polipeptídeos que são apresentados nas SEQ ID NOs citadas. Conforme referenciado neste documento, equivalência funcional refere-se a variantes do polipeptídeo (peptídeo ligase) da invenção discutido acima que podem mostrar alguma eficácia reduzida na reação de ligação (por exemplo, menor rendimento da reação, menor taxa de reação ou atividade em uma lacuna limitada das condições da reação (por exemplo, faixa de temperatura mais estreita, como 10 a 30 °C, etc.)) em relação à molécula percursora (isto é, a molécula com a qual ela mostra homologia de sequência), mas preferencialmente é tão eficiente ou mais eficiente.

[0054] Um polipeptídeo mutante ou variante da invenção com ligase ou atividade catalítica que é equivalente à ligase ou atividade catalítica de um polipeptídeo que compreende ou que consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 pode ter ligase ou atividade catalítica que é semelhante (isto é, comparável) à ligase ou atividade catalítica de um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, isto é, de modo que as aplicações práticas do peptídeo ligase não sejam significativamente afetadas, por exemplo, dentro de uma margem de erro experimental. Desse modo, uma ligase equivalente ou atividade catalítica significa que o polipeptídeo mutante ou variante da invenção tem capacidade

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21/114 de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptidicas da invenção com uma taxa de reação semelhante e/ou rendimento da reação a um polipeptídeo que

compreende	ou consiste em	uma	sequência	de	aminoácidos
conforme	estabelecido na	SEQ	ID NO: 1	sob	as mesmas
condições.
[0055	] A ligase	ou	atividade	catalítica de

diferentes polipeptídeos peptídicos da ligase (por exemplo, SEQ ID NO: 1 versus mutante) medidos sob as mesmas condições de reação, por exemplo, temperatura, substratos (por exemplo, sequências de etiquetas peptidicas) e sua concentração, tampão, sal etc., conforme exemplificado acima, podem ser facilmente comparados para determinar se a ligase ou a atividade catalítica de cada proteína é maior, menor ou equivalente.

[0056] Desse modo, a ligase ou atividade catalítica do polipeptídeo variante (por exemplo, mutante) pode ser de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70, 75, 80, 85 ou 90% da ligase ou atividade catalítica de um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, tais como pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% da atividade de ligase ou catalítica de um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1. Alternativamente, a atividade da ligase ou

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22/114 catalítica do polipeptídeo mutante pode ser não mais do que 40% menor que a atividade da ligase ou catalítica de um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, por exemplo, não mais que 35, 30, 25 ou 20% menor que a ligase ou atividade catalítica de um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, tal como não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% menor do que a ligase ou atividade catalítica de um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1.

[0057] Em algumas modalidades, a ligase ou atividade catalítica do polipeptídeo variante (por exemplo, mutante) pode ser avaliada medindo o rendimento da reação dos etiquetas peptídicas. O rendimento da reação é medido determinando a proporção de uma etiqueta (por exemplo, SEQ ID NO: 2) no complexo covalente com sua etiqueta peptídica parceira (por exemplo, SEQ ID NO: 3) em relação aos componentes que não reagiram após o contato dos etiquetas peptídicas com o polipeptídeo (peptídeo ligase) da invenção sob condições adequadas para a formação de uma ligação isopeptídica entre as ditas etiquetas peptídicas e/ou adequadas para a atividade de ligase do polipeptídeo da invenção. Desse modo, o rendimento da reação refere-se: à

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23/114 proporção de uma etiqueta (por exemplo, SEQ ID NO: 2) no complexo covalente com sua etiqueta peptidica parceira (por exemplo, SEQ ID NO: 3)/(a proporção da etiqueta (por exemplo, SEQ ID NO: 2) no complexo covalente com sua etiqueta peptidica parceira (por exemplo, SEQ ID NO: 3) + a proporção da etiqueta (por exemplo, SEQ ID NO: 2) não no complexo covalente com sua etiqueta peptidica parceira (por exemplo, SEQ ID NO: 3)) x 100.

[0058] Conforme mencionado acima, o peptídeo ligase que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 tem capacidade de catalisar a reação da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 com um rendimento de reação de cerca de 95%. Desse modo, em algumas modalidades um polipeptídeo variante da invenção que é funcionalmente equivalente a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 tem capacidade de catalisar a reação da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3 (isto é, a formação de uma ligação isopeptídica entre a SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3) com um rendimento de reação de pelo menos cerca de 57%, por exemplo, um rendimento de reação de pelo menos cerca de 67, 71, 76, 81 ou 86%, como pelo menos 86,5, 87,4, 88,4, 89,3, 90,3, 91,2, 92,2 93,1 ou 94% .

[0059] Portanto, qualquer modificação ou combinação de modificações pode ser realizada na SEQ ID NO: 1 para

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24/114 produzir um polipeptídeo variante (peptídeo ligase) da invenção, desde que o polipeptídeo variante compreenda um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente à posição 61 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos um (preferencialmente 2, 3 ou 4) outro resíduo (ou resíduos) de aminoácidos em posições equivalentes às posições 66, 95, 96 e 97 da SEQ ID NO: 1, conforme definido acima, e mantém as características funcionais definidas acima, isto é, resulta em um peptídeo ligase com capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas da invenção e, opcionalmente, possui um rendimento equivalente ou superior de reação, taxa de reação, temperatura e/ou faixa de tampão em relação a um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1.

[0060] Uma posição equivalente é determinada a título de referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. A posição homóloga ou correspondente pode ser facilmente deduzida alinhando a sequência do polipeptídeo homólogo (mutante, variante ou derivado) e a sequência da SEQ ID NO: 1 com base na homologia ou identidade entre as sequências, por exemplo, com uso de um algoritmo BLAST.

[0061] Conforme discutido acima, o domínio Cterminal da proteína de adesão ao Streptococcus pneumoniae, RrgA, foi dividido em três domínios, cada um dos quais foi então modificado para gerar o polipeptídeo (peptídeo ligase)

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25/114 da invenção e duas etiquetas peptídicas. Desse modo, as etiquetas peptídicas da invenção encontram utilidade particular em combinação com o peptídeo ligase da invenção. Consequentemente, as etiquetas peptídicas da invenção podem ser vistas como substratos do peptídeo ligase da invenção em uma reação de ligação ou conjugação peptídica. Notavelmente, o polipeptídeo ligase da invenção tem capacidade de direcionar uma transamidação específica entre o resíduo de lisina na posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição 17 da SEQ ID NO: 3. Desse modo, as etiquetas peptídicas da invenção podem ser vistas como substratos do peptídeo ligase da invenção em uma reação de transamidação.

[0062] Consequentemente, em um aspecto adicional, a invenção fornece uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[0063] O termo etiqueta peptídica ou ligador peptídico, conforme usado no presente documento, geralmente refere-se a um peptídeo ou oligopeptídeo. Não há definição padrão em relação aos limites de tamanho entre o que se entende por peptídeo ou oligopeptídeo, mas tipicamente um peptídeo pode ser visto como compreendendo entre 2 a 20 aminoácidos e oligopeptídeo entre 21 a 39 aminoácidos. Consequentemente, um polipeptídeo pode ser visto como compreendendo pelo menos 40 aminoácidos, preferencialmente

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26/114 pelo menos 50, 60, 70 ou 80 aminoácidos. Desse modo, uma etiqueta ou peptídeo peptídico conforme definido no presente documento pode ser visto como compreendendo pelo menos 12 aminoácidos, por exemplo, 12 a 39 aminoácidos, como por exemplo 13 a 35, 14 a 34, 15 a 33, 16 a 31, 17 a 30 aminoácidos de comprimento, por exemplo, podem compreender ou consistir em 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos.

[0064] Conforme discutido acima, as etiquetas peptídicas têm um grande número de utilidades e as etiquetas peptídicas e peptídeo ligase da invenção encontram utilidade particular na conjugação (isto é, união ou ligação) de duas moléculas ou componentes através de uma ligação isopeptídica. Por exemplo, as etiquetas peptídicas podem ser conjugadas separadamente ou fundidas a moléculas ou componentes de interesse e subsequentemente contatadas na presença do peptídeo ligase sob condições adequadas para permitir a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas, unindo-se (isto é, ligando-se ou conjugando-se) as moléculas ou componentes através de uma ligação isopeptídica.

[0065] Conforme mostrado nos Exemplos abaixo, os inventores determinaram que o peptídeo ligase da invenção se liga fortemente ao seu produto de reação, isto é, as duas etiquetas peptídicas da invenção unidas por uma ligação

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27/114 isopeptídica e quaisquer moléculas ou componentes fundidos ou conjugados às ditas etiquetas peptídicas. No entanto, a forte interação pode ser interrompida com uso de uma variedade de condições selecionadas, por exemplo, pH baixo, temperatura aumentada (por exemplo, 45 °C ou superior), adição de imidazol ou um concorrente peptídico ou uma combinação dos mesmos. Desse modo, em algumas modalidades, a forte interação entre o peptídeo ligase e seu produto de reação facilita vantajosamente a purificação eficiente do produto de reação.

[0066] A título de exemplo, o peptídeo ligase da invenção pode ser imobilizado em um suporte sólido ou fase sólida por qualquer meio conveniente, conforme discutido em mais detalhes abaixo, por exemplo, marcando o peptídeo ligase com uma etiqueta, por exemplo, biotina, e colocando a ligase colocada em etiqueta em contato com um suporte sólido ligado ao parceiro de ligação da etiqueta, por exemplo, estreptavidina agarose. O suporte sólido ou a fase sólida é então colocado em contato com moléculas ou componentes fundidos ou conjugados às etiquetas peptídicas sob condições que permitem a formação mediada por peptídeo ligase de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas, formando assim um complexo covalente entre as moléculas ou componentes. Devido à forte interação entre o peptídeo ligase imobilizado e o produto de reação, a fase sólida pode ser

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28/114 lavada sob condições rigorosas para facilitar a remoção de componentes não reagidos. A fase sólida é então sujeita a condições que interrompem a interação entre o peptídeo ligase imobilizado e o produto de reação, permitindo, assim, a separação do produto de reação.

[0067] Por exemplo, a fase sólida pode ser colocada em contato com uma solução de baixo pH, por exemplo, tampão de baixo pH, como um tampão com pH de 4,0 ou menos, para interromper a interação entre o peptídeo ligase imobilizado e o produto de reação, permitindo, assim, a separação do produto de reação. Por exemplo, a fase sólida pode ser uma coluna e o contato da coluna com uma solução de pH baixo resulta na eluição de um produto de reação substancialmente puro.

[0068] Conforme discutido abaixo, uma ou mais das moléculas ou componentes a serem conjugados através dos etiquetas peptídicas da invenção podem ser uma proteína. No entanto, nem todas as proteínas toleram tratamento com baixo pH. Consequentemente, os inventores procuraram identificar outras condições que permitem a separação do peptídeo ligase e do seu produto de reação a pH neutro (isto é, 6,5 a 7,5) .

[0069] Os inventores determinaram que elevar a temperatura da fase sólida para 55 °C era suficiente para eluir eficientemente o produto de reação sob condições que

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29/114 são toleradas pela maioria das proteínas, por exemplo, em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4.

[0070] Além disso, os inventores determinaram que a eluição eficiente pode ser alcançada a uma temperatura mais baixa adicionando produto de reação concorrente (por exemplo, proteína pré-ligada) para interromper (competir) a interação não covalente entre o produto de reação e o peptídeo ligase. Um produto de reação concorrente pode ser qualquer produto que compreende as etiquetas peptídicas da invenção que é facilmente separável do produto de reação pretendido (por exemplo, por diálise ou cromatografia de exclusão por tamanho).

[0071] Conforme mostrado nos Exemplos, a adição de μΜ de produto de reação concorrente (ou seja, uma proteína do concorrente que compreende uma etiqueta peptídica (SEQ ID NO: 9) acoplado a uma etiqueta peptídica AffiHER2 (SEQ ID NO: 7) a fusão utilizando SnoopLigase biotinilada, subsequentemente purificada por eluição a partir de uma fase sólida com uso de um tampão de glicina, pH 2) permitiu a eluição eficiente do produto de reação a 45 °C em vez de 55 °C. Em uma modalidade preferencial, o produto de reação concorrente compreende ou consiste em um peptídeo que possui uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ligado (por meio de uma ligação isopeptídica) a um peptídeo com uma sequência de aminoácidos conforme

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30/114 estabelecido na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o produto de reação concorrente é colocado em contato com a fase sólida em uma alta concentração, ou seja, pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 ou 200%, de a concentração dos reagentes (isto é, conjugados de etiqueta peptidica) utilizados na reação. Em modalidades particularmente preferenciais, o produto de reação concorrente é colocado em contato com a fase sólida a uma temperatura elevada, isto é, acima da temperatura ambiente, por exemplo, pelo menos 30, 35, 40 ou 45 °C.

[0072] Embora o uso de um produto de reação concorrente possa ser adequado para a eluição de alguns produtos de reação (por exemplo, conjugados de proteínas) do peptídeo ligase da invenção, é desejável ter capacidade de interromper a interação entre o peptídeo ligase da invenção e o produto de reação sob condições fisiologicamente relevantes, por exemplo, temperaturas fisiológicas e pH. Consequentemente, conforme discutido nos Exemplos, os inventores selecionaram habilmente uma gama de aditivos que podem ser eficazes para interromper a interação entre o peptídeo ligase da invenção e o produto de reação em condições fisiológicas, enquanto ainda são compatíveis com a maioria das proteínas ligadas por SnoopLigase mantendo sua estrutura dobrada.

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31/114 [0073] Dos doze aditivos testados, apenas um aditivo (imidazol 1 M) mostrou-se eficaz em condições fisiológicas (pH 6,5 a 7,0, 37 °C) e surpreendentemente, foi determinado que concentrações mais altas de imidazol (2 M) permitem eluição eficiente a temperaturas mais baixas (25 °C). O imidazol é bem tolerado pela maioria das proteínas, sendo usado em um dos métodos mais comuns de purificação de proteínas, para purificar proteínas marcadas com histidina da resina Ni-NTA.

[0074] Desse modo, em algumas modalidades, a fase sólida pode ser colocada em contato com uma solução que compreende imidazol, por exemplo, a uma concentração de pelo menos 1 M, preferencialmente cerca de 2 M, para interromper a interação entre o peptídeo ligase imobilizado e o produto de reação. Em modalidades particularmente preferenciais, a fase sólida é colocada em contato com uma solução que compreende imidazol cerca de 2 M a pH 6,5 a 7,5 (preferencialmente cerca de pH 7,0), a cerca de 20 a 30 °C (preferencialmente cerca de 25 °C).

[0075] Embora possa ser útil imobilizar o peptídeo ligase em um suporte sólido antes do contato com as etiquetas peptídicas da invenção, será evidente que isso não é essencial. Por exemplo, a reação de ligação pode ocorrer em solução, que é subsequentemente aplicada a um suporte sólido ou fase sólida, por exemplo, coluna, para separar o produto

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32/114 de reação e o peptídeo ligase. Em algumas modalidades, ο complexo de produto de reação com peptídeo ligase pode ser aplicado à fase sólida sob condições adequadas para imobilizar o complexo na fase sólida, seja por meio de produto de reação ou peptídeo ligase, lavado em condições adequadas e subsequentemente, submetido a uma ou mais das condições mencionadas acima, por exemplo, contatadas com uma solução ou solução de baixo pH compreendendo imidazol, para interromper o complexo, separando assim o produto de reação e o peptídeo ligase. Alternativamente, o complexo de produto de reação com peptídeo ligase pode ser submetido a uma ou mais das condições mencionadas acima na solução, por exemplo, entrar em contato com uma solução de baixo pH, uma solução que compreende imidazol ou um produto de reação concorrente e subsequentemente separada por qualquer meio adequado, por exemplo, por contato com uma fase sólida com afinidade com o produto de reação ou peptídeo ligase, cromatografia de exclusão por tamanho, diálise etc.

[0076] Embora o uso de um suporte sólido ou fase sólida seja vantajoso para gerar um produto de reação substancialmente puro, será evidente que isso não é essencial. Por exemplo, a reação de ligação pode ocorrer em solução e o complexo de produto de reação com peptídeo ligase pode ser separado por degradação do peptídeo ligase. Por exemplo, o peptídeo ligase da invenção pode ser modificado

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33/114 para inserir um domínio de clivagem, de modo que a clivagem do domínio de clivagem, por exemplo, com uso de uma protease, seja suficiente para interromper a interação entre o peptídeo ligase e o produto de reação. 0 peptídeo ligase degradado pode ser subsequentemente separado do produto de reação com uso de qualquer meio adequado conhecido na técnica.

[0077] Em outras modalidades, a forte interação entre o peptídeo ligase e seu produto de reação pode ser usada para produzir um complexo entre moléculas ou componentes fundidos ou conjugados com as etiquetas peptídicas e uma molécula ou componente fundido ou conjugado com o peptídeo ligase. Em relação a isso, as moléculas ou componentes fundidos ou conjugados com as etiquetas peptídicas são unidos por meio de uma ligação isopeptídica para produzir um produto de reação conforme descrito acima, que interage de maneira não-covalente com a molécula ou componente fundido ou conjugado com o peptídeo ligase, produzindo, assim, um complexo de três moléculas ou componentes, em que duas das moléculas ou componentes são ligadas através de uma ligação isopeptídica.

[0078] Desse modo, em algumas modalidades, a invenção pode ser vista como fornecendo o uso de um polipeptídeo (peptídeo ligase) conforme definido aqui para:

[0079] (1) conjugar duas moléculas ou componentes através de uma ligação isopeptídica; ou

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34/114 [0080] (2) produzir um complexo entre três moléculas ou componentes, em que duas das moléculas ou componentes no complexo são conjugadas por meio de uma ligação isopeptídica, [0081] em que as ditas moléculas ou componentes conjugados através de uma ligação isopeptídica compreendem:

[0082] a) uma primeira molécula ou componente que

compreende uma [0083]	etiqueta	peptídica sequência	que de	compreende:
(i)	uma	aminoácidos	conforme
estabelecido na	SEQ	ID I	IO: 2; ou
[0084]	(ü)	uma	sequência	de	aminoácidos	com pelo

menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2; e [0085] b) uma segunda molécula que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

[0086] (i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3; ou [0087] (ü) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, [0088] e

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35/114 [0089] em que a terceira molécula ou componente no complexo em (2) compreende um polipeptídeo (peptídeo ligase) da invenção conforme definido acima.

[0090] Tendo em vista os comentários acima, é evidente que a terceira molécula ou componente do complexo em (2) interage ou se liga de maneira não-covalente às moléculas ou componentes do complexo que são conjugados por meio de uma ligação isopeptidica. Em particular, a interação não-covalente entre a terceira molécula ou componente no complexo e as moléculas ou componentes no complexo que são conjugadas por meio de uma ligação isopeptidica é mediada pela (surge ou se dá por meio da) interação entre o peptídeo ligase e as etiquetas peptídicas conjugadas da invenção.

[0091] Alternativamente visto, a invenção fornece um processo para conjugar duas moléculas ou componentes por meio de uma ligação isopeptidica que compreende:

[0092] a) fornecer uma primeira molécula ou componente que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

[0093] (i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2; ou [0094] (ü) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, em que a dita

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36/114 sequência de aminoácidos compreende um resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2;

[0095] b) fornecer uma segunda molécula ou componente que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

[0096] (i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3; ou [0097] (ü) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3;

[0098] c) contato das ditas primeira e segunda moléculas ou componentes com um polipeptídeo (peptídeo ligase) da invenção, preferencialmente em que o dito polipeptídeo é imobilizado em um substrato sólido, sob condições que permitem a formação de uma ligação isopeptídica entre a lisina resíduo na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, conjugando assim a dita primeira molécula à dita segunda molécula através de um isopeptídeo para formar um complexo.

[0099] Em algumas modalidades, o polipeptídeo (peptídeo ligase) da invenção é conjugado ou fundido a uma molécula ou componente para fornecer uma terceira molécula

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37/114 ou componente e a etapa c) resulta na formação de um complexo compreendendo três moléculas ou componentes, em que a terceira molécula ou componente no complexo interage ou se liga de maneira não-covalente à primeira e segunda moléculas ou componentes no complexo que são conjugados por meio de uma ligação isopeptídica. Em particular, a interação nãocovalente entre a terceira molécula ou componente no complexo e a primeira e segunda moléculas ou componentes no complexo que são conjugadas por meio de uma ligação isopeptídica é mediada pela (surge ou se dá por meio da) interação entre o peptídeo ligase e as etiquetas peptidicas conjugadas da invenção.

[00100] Em algumas modalidades quando o polipeptídeo é imobilizado em um substrato sólido, o processo compreende uma etapa adicional de separação do complexo (compreendendo apenas a primeira e a segunda moléculas ou componentes conjugados por meio de uma ligação isopeptídica) do substrato sólido, em que o dito passo compreende sujeitar o complexo para condições adequadas para romper o complexo, isto é, romper a interação não-covalente entre o polipeptídeo e o produto de reação.

[00101] Em algumas modalidades, conforme mencionado acima, as condições adequadas para romper o complexo compreendem o contato do dito complexo com uma solução ou tampão de pH baixo. Em algumas modalidades, as condições

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38/114 adequadas para interromper o complexo compreendem submeter o dito complexo a temperaturas elevadas, por exemplo, pelo menos 30, 35, 40 ou 45 °C, como 30 a 65, 35 a 60, 40 a 55 °C e/ou entrar em contato com o dito complexo com uma solução que compreende imidazol (por exemplo, pelo menos 1 M, por exemplo, 1 a 4 Μ, 1 a 3 M ou 1,5 a 2,5 M, preferencialmente cerca de 2 M imidazol) ou uma solução que compreende um produto de reação concorrente (por exemplo, uma alta concentração de um produto de reação concorrente, conforme definido acima).

[00102] Em ainda outras modalidades, o processo compreende uma etapa de lavagem do substrato sólido com um tampão antes de separar o dito complexo do substrato sólido. Será evidente que qualquer tampão adequado pode ser selecionado com base nas moléculas ou componentes fundidos às etiquetas peptidicas. Além disso, a etapa de lavar o substrato sólido pode ser repetida múltiplas vezes, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais vezes. Visto alternativamente, em algumas modalidades, o processo compreende várias etapas de lavagem, em que as mesmas ou diferentes condições de lavagem podem ser usadas em cada etapa.

[00103] Conforme mencionado acima, em algumas modalidades, o substrato sólido é submetido a condições de lavagem rigorosas. A natureza das rigorosas condições de lavagem dependerá das moléculas ou componentes fundidos às

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39/114 etiquetas peptídicas e/ou da composição do substrato sólido. 0 especialista pode selecionar tais condições como uma questão de rotina. No entanto, a título de exemplo, condições rigorosas de lavagem podem compreender a lavagem com uma solução que compreende 50 mM de glicina e 300 mM de NaCl (pH 3,0) seguido por uma solução que compreende 50 mM de glicina (pH 3,0), em que cada lavagem pode ser repetida.

[00104] Uma solução ou tampão de pH baixo pode ser vista como qualquer solução ou tampão adequado para interromper a interação não-covalente entre o peptídeo ligase da invenção e seu produto de reação, ou seja, as etiquetas peptídicas da invenção conjugadas por meio de uma ligação isopeptídica. Em algumas modalidades, a solução ou tampão de baixo pH é um tampão de eluição de anticorpos. Em relação a isso, é evidente que o pH da solução necessária para interromper a interação entre o peptídeo ligase da invenção e seu produto de reação pode depender dos componentes da solução. A título de exemplo, os tampões de eluição de anticorpos podem compreender ou consistir em glicina 50 mM, pH 2,2 a 2,8 ou tampão de ácido cítrico 100 mM, pH 3,5 a 4,0. Desse modo, em algumas modalidades, a solução ou tampão de baixo pH tem um pH de 4,0 ou menos, por exemplo, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0 ou menos, por exemplo, cerca de 1,5 a 3,5, 1,6 a 3,4, 1,7 a

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3,3, 1,8 a 3,2, 1,9 a 3,1 ou 2,0 a 3,0, como cerca de 2,2 a 2,8 ou 2,5 a 2,7.

[00105] Os termos conjugação ou ligação no contexto da presente invenção com relação à conexão de duas ou mais moléculas ou componentes para formar um complexo se referem à união ou conjugação das ditas moléculas ou componentes, por exemplo, proteínas, por meio de uma ligação covalente, particularmente uma ligação isopeptídica que se forma entre as etiquetas peptídicas que são incorporadas ou fundidas com as ditas moléculas ou componentes, por exemplo, proteínas (por exemplo, etiquetas peptídicas que formam domínios das ditas proteínas).

[00106] Em algumas modalidades, a dita sequência de marcação de peptídeo acima é pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% idêntica à sequência (SEQ ID NOs: 2 ou 3) a que é comparada.

[00107] Preferencialmente, tais etiquetas peptídicas relacionadas à identidade de sequência são funcionalmente equivalentes às etiquetas peptídicas que são apresentadas nas SEQ ID NOs citadas. Conforme discutido acima, equivalência funcional refere-se a homólogos dos etiquetas peptídicas discutidos acima que podem mostrar alguma eficácia reduzida na formação de ligações isopeptídicas com seu respectivo parceiro, mediadas pelo peptídeo ligase da invenção, em relação à etiqueta peptídica exemplificada (ou

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41/114 seja, SEQ ID NO: 2 ou 3, a molécula com a qual a mesma mostra homologia de sequência), mas preferencialmente são tão eficientes quanto ou mais eficientes.

[00108] Desse modo, a capacidade de uma etiqueta peptídica mutante para formar uma ligação isopeptídica com seu respectivo parceiro, mediada pelo peptídeo ligase da invenção, pode ser de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70, 75, 80, 85 ou 90% do capacidade de uma etiqueta peptídica que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3, como pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% da capacidade de uma etiqueta peptídica que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3. Em alternativa, a capacidade de uma etiqueta peptídica mutante para formar uma ligação isopeptídica com seu respectivo parceiro, mediada pelo peptídeo ligase da invenção, pode ser não mais do que 40% menor que a capacidade de uma etiqueta peptídica que compreende ou consiste em um aminoácido sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3, por exemplo, não mais que 35, 30, 25 ou 20% menor que a capacidade de uma etiqueta peptídica que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3, tais como não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1% da capacidade de uma etiqueta

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42/114 peptídica que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 3.

[00109] Desse modo, por exemplo, uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2, deve ter capacidade de formar uma ligação isopeptídica com uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, preferencialmente com pelo menos 60% da eficácia da reação (por exemplo, rendimento, taxa de reação etc.) como uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2.

[00110] De modo similar, uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, deve ter capacidade de formar uma ligação isopeptídica com uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, preferencialmente com pelo menos 60% da eficácia da reação (por exemplo, rendimento,

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43/114 taxa de reação etc.) como uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3.

[00111] As definições das variantes polipeptídicas da invenção descritas acima, isto é, em relação às substituições, deleções e inserções, são igualmente aplicáveis às variantes da etiqueta peptídica descritas acima no contexto dos usos e processos da invenção.

[00112] Portanto, qualquer modificação ou combinação de modificações pode ser realizada na SEQ ID NO: 2 ou 3 para produzir uma etiqueta peptídica variante para uso na invenção, visto que a etiqueta peptídica variante compreende um resíduo de lisina em uma posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2 ou um resíduo de asparagina em uma posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3 e mantém as características funcionais definidas acima, isto é, resulta em uma etiqueta peptídica com capacidade de formar uma ligação isopeptídica com seu respectivo parceiro mediada pelo peptídeo ligase da invenção em condições adequadas.

[00113] Uma posição equivalente nas etiquetas peptídicas é determinada a título de referência à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou 3. A posição homóloga ou correspondente pode ser facilmente deduzida alinhando a sequência da etiqueta peptídica de polipeptídeo homólogo (mutante, variante ou derivado) a sequência da SEQ ID NO: 2

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44/114 ou 3 com base na homologia ou identidade entre as sequências, por exemplo, com uso de um algoritmo BLAST.

[00114] Conforme mencionado acima, em algumas modalidades, as etiquetas peptídicas da invenção são fundidas ou conjugadas com outras moléculas ou com outros componentes ou entidades. Tais moléculas ou componentes (ou seja, entidades) podem ser uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de pequenas moléculas, fluoróforo, complexo metal-ligante, polissacarídeo, nanopartícuias, nanotubos, polímeros, células, vírus, partículas semelhantes a vírus ou qualquer outra combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o componente ou entidade a qual a etiqueta peptídica é fundida ou conjugada é um suporte sólido, isto é, substrato ou fase sólida, conforme definido abaixo.

[00115] Desse modo, vista alternativamente, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo de metal-ligante, polissacarídeo, nanopartícuia, nanotubo, polímero, célula, vírus, partícula semelhante a vírus ou qualquer combinação dos mesmos ou suporte sólido fundido ou conjugado com uma etiqueta peptídica da invenção.

[00116] A célula pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana.

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45/114 [00117] Em algumas modalidades, a etiqueta peptidica pode ser conjugada ou fundida a um composto ou molécula que tem um efeito terapêutico ou profilático, por exemplo, um antibiótico, antiviral, vacina, agente antitumoral, por exemplo, um composto radioativo ou isótopo, citocinas, toxinas, oligonucleotideos e ácidos nucleicos que codificam genes ou vacinas de ácido nucleico.

[00118] Em algumas modalidades, a etiqueta peptidica pode ser conjugada ou fundida a uma marcação, por exemplo, uma radiomarcação, uma marcação fluorescente, uma marcação luminescente, uma marcação de cromóforo, bem como substâncias e enzimas que geram um substrato detectável, por exemplo, peroxidase de rabanete, luciferase ou fosfatase alcalina. Esta detecção pode ser aplicada em inúmeros ensaios em que os anticorpos são convencionalmente usados, incluindo Western blotting/immunoblotting, histoquimica, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou citometria de fluxo (FACS). Marcações para ressonância magnética, sondas de tomografia por emissão de positrons e boro 10 para terapia de captura de nêutrons também podem ser conjugadas com a etiqueta peptidica da invenção. Particularmente, a etiqueta peptidica pode ser fundida ou produzida com outro peptídeo, por exemplo, etiqueta His6, e/ou pode ser fundida ou produzida com outra proteína, por exemplo, com o objetivo de

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46/114 melhorar a expressão de proteína recombinante por fusão com a proteína de ligação à maltose.

[00119] Em uma modalidade particularmente útil, a etiqueta peptídica e/ou peptídeo ligase é fundida ou conjugada com outro peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo. Por exemplo, a etiqueta peptídica pode ser produzida como parte de outro peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo com uso de técnicas recombinantes conforme discutido abaixo, isto é, como uma proteína ou polipeptídeo recombinante ou sintético.

[00120] Será evidente que a etiqueta peptídica e/ou peptídeo ligase da invenção baseada é fundida com qualquer proteína ou polipeptídeo. A proteína pode ser derivada ou obtida de qualquer fonte adequada. Por exemplo, a proteína pode ser traduzida ou purificada in vitro a partir de amostras biológicas e clínicas, por exemplo, qualquer amostra de célula ou tecido de um organismo (eucariótico, procariótico) ou qualquer fluido ou preparação corporal derivado da mesma, bem como amostras como culturas de células, preparações celulares, lisados celulares, etc. As proteínas podem ser derivadas ou obtidas, por exemplo, purificadas de amostras ambientais, como amostras de solo e água ou amostras de alimentos. As amostras podem ser preparadas imediatamente ou podem ser tratadas previamente

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47/114 de qualquer maneira conveniente, por exemplo, para armazenamento.

[00121] Conforme observado acima, em uma modalidade preferencial, a proteína pode ser produzida de forma recombinante e, portanto, as moléculas de ácido nucleico que codificam as ditas proteínas podem ser derivadas ou obtidas de qualquer fonte adequada, por exemplo, qualquer material viral ou celular, incluindo todas as células procarióticas ou eucarióticas, vírus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos e organelas. Esse material biológico pode assim compreender todos os tipos de células animais de mamíferos e não mamíferos, células vegetais, algas, incluindo algas verde-azuladas, fungos, bactérias, protozoários, vírus etc. Em algumas modalidades, as proteínas podem ser proteínas sintéticas. Por exemplo, o peptídeo e polipeptídeo (proteínas) aqui divulgados podem ser produzidos por síntese química, como síntese de peptídeo em fase sólida.

[00122] A posição da etiqueta peptídica dentro de uma proteína recombinante não é particularmente importante. Desse modo, em algumas modalidades, a etiqueta peptídica pode estar localizada no N-terminal ou no C-terminal do polipeptídeo recombinante ou sintético. Em algumas modalidades, a etiqueta peptídica pode estar localizada internamente dentro do polipeptídeo recombinante ou sintético. Desse modo, em algumas modalidades, a etiqueta

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48/114 peptídica pode ser vista como um domínio N-terminal, C-

terminal ou

interno do polipeptídeo recombinante ou

sintético.

[00123]	0 peptídeo ligase está preferencialmente
localizado no	N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo

recombinante ou sintético. Em algumas modalidades, o peptídeo ligase pode estar localizado dentro do polipeptídeo recombinante ou sintético. Desse modo, em algumas modalidades, o peptídeo ligase pode ser visto como um domínio N-terminal, C-terminal ou interno do polipeptídeo recombinante ou sintético.

[00124]

Em algumas modalidades, pode ser útil incluir

um ou mais espaçadores, por exemplo, um espaçador peptídico, entre o peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo a ser unido ou conjugado com a etiqueta peptídica e/ou peptídeo ligase. Desse modo, o peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo e etiqueta peptídica e/ou peptídeo ligase podem ser ligados diretamente um ao outro ou podem ser ligados indiretamente por meio de uma ou mais sequências espaçadoras. Desse modo,

uma sequência

espaçadora pode espaçar ou separar duas ou

mais partes individuais do polipeptídeo recombinante ou sintético. Em algumas modalidades, um espaçador pode ser o N-terminal ou C-terminal para a etiqueta peptídica e/ou peptídeo ligase. Em algumas modalidades, os espaçadores

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49/114 podem estar em ambos os lados da etiqueta peptidica e/ou peptídeo ligase.

[00125] A natureza precisa da sequência espaçadora não é crucial e pode ser de comprimento e/ou sequência variável, por exemplo, pode ter 1 a 40, mais particularmente 2 a 20, 1 a 15, 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8 ou 1 a 6 resíduos, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos. A título de exemplo representativo, a sequência espaçadora, se presente, pode ter 1 a 15, 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8 ou 1 a 6 resíduos etc. A natureza dos resíduos não é crucial e, por exemplo, pode ser qualquer aminoácido, por exemplo, um aminoácido neutro ou um aminoácido alifático, ou alternativamente os mesmos podem ser hidrofóbicos ou polares ou carregados ou formadores de estrutura, por exemplo prolina. Em algumas modalidades preferenciais, o ligante é uma sequência rica em serina e/ou glicina, preferencialmente compreendendo pelo menos 6 resíduos de aminoácidos, por exemplo 6, 7 ou 8 resíduos.

[00126] Sequências espaçadoras exemplares incluem, assim, qualquer resíduo de aminoácido único, por exemplo, S, G, L, V, P, R, Η, M, A ou E ou um di-, tri-, tetra-, pentaou hexapeptídeo composto por um ou mais desses resíduos.

[00127] Desse modo, em algumas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo recombinante ou sintético que compreende uma etiqueta peptidica ou peptídeo ligase da invenção, conforme definido acima, isto é, um polipeptídeo

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50/114 recombinante ou sintético que compreende um peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo fundido a uma etiqueta peptídica ou peptídeo ligase da invenção. O polipeptídeo recombinante ou sintético opcionalmente compreende um espaçador conforme definido acima.

[00128] O polipeptídeo recombinante ou sintético da invenção também pode compreender porções químicas ou etiquetas de purificação para facilitar sua purificação (por exemplo, antes do uso nos métodos e usos da invenção discutidos abaixo). Qualquer porção química ou etiqueta de purificação adequada pode ser incorporada no polipeptídeo e essas porções são conhecidas na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo recombinante ou sintético pode compreender uma etiqueta ou porção de purificação de peptídeo, por exemplo, uma sequência de Hisetiqueta. Tais porções ou etiquetas de purificação podem ser incorporadas em qualquer posição dentro do polipeptídeo. Em algumas modalidades preferenciais, a porção química de purificação é localizada em ou em direção a (isto é, dentro de 5, 10, 15, 20 aminoácidos) do N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo.

[00129] Conforme observado acima, uma vantagem da presente invenção surge do fato de que as etiquetas peptídicas e/ou peptídeo ligase incorporadas no peptídeo, oligopeptídeos ou polipeptídeo (por exemplo, os

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51/114 polipeptídeos recombinantes ou sintéticos da invenção) podem ser completamente codificadas geneticamente. Desse modo, em um aspecto adicional, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que codifica uma etiqueta peptídica, peptídeo ligase ou polipeptídeo recombinante ou sintético, conforme definido acima.

[00130] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica uma etiqueta peptídica definida acima compreende uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 7 ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência, conforme estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 7.

[00131] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico que codifica um peptídeo ligase definida acima

compreende	uma	sequência de	nucleotídeos	conforme
estabelecido	na	SEQ ID NO: 5;	ou uma sequência de
nucleotídeos	com	pelo menos 80% de	identidade de	sequência
com uma sequência	conforme estabele	cido na SEQ ID	NO: 5.
[00132]	Preferencialmente,	a molécula	de ácido
nucleico acima é	pelo menos 85, 90	, 95, 96, 97,	98, 99 ou

100% idêntica à sequência com a qual a mesma é comparada.

[00133] A identidade da sequência de ácido nucleico pode ser determinada por, por exemplo, Pesquisa FASTA que usam pacotes GCG, com valores padrão e um pamfactor variável,

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52/114 e penalidade de criação de lacuna definida em 12,0 e penalidade de extensão de lacuna definida em 4,0 com uma janela de 6 nucleotídeos. Preferencialmente, a dita comparação é feita em todo o comprimento da sequência, mas pode ser feita em uma janela menor de comparação, por exemplo, menos de 600, 500, 400, 300, 200, 100 ou 50 nucleotídeos contíguos.

[00134] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser constituídas por ribonucleotídeos e/ou desoxirribonucleotídeos, bem como resíduos sintéticos, por exemplo, nucleotídeos sintéticos, capazes de participar de

interações	do tipo Watson-Crick ou	de	pares	de bases
análogas. Preferencialmente, a molécula	de	ácido	nucleico é
DNA ou RNA.
[00135]	\| As moléculas de ácido	nucleico	descritas

acima podem ser operacionalmente ligadas a uma sequência de controle de expressão ou a um veículo ou vetor de clonagem de DNA recombinante que contém tal molécula de DNA recombinante. Isto permite a expressão intracelular dos peptídeos e polipeptídeos da invenção como um produto genético, cuja expressão é direcionada pelo gene (ou genes) introduzido nas células de interesse. A expressão gênica é direcionada de um promotor ativo nas células de interesse e pode ser inserida em qualquer forma de vetor de ácido nucleico linear ou circular (por exemplo, DNA) para

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53/114 incorporação no genoma ou para replicação independente ou transíecção/expressão transitória. Técnicas de transformação ou transfecção adequadas são bem descritas na literatura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico nu (por exemplo, DNA ou RNA, que pode incluir um ou mais resíduos sintéticos, por exemplo, análogos de base) pode ser introduzida diretamente na célula para a produção de peptídeos e polipeptídeos da invenção. Alternativamente, o ácido nucleico pode ser convertido em mRNA por transcrição in vitro e as proteínas relevantes podem ser geradas por tradução in vitro.

[00136] Os vetores de expressão apropriados incluem sequências de controle apropriadas, como, por exemplo, códons de tradução (por exemplo, códons de início e parada, locais de ligação ribossômica) e elementos de controle transcricionais (por exemplo, regiões promotoras-operadoras, sequências de terminação) ligadas na estrutura de leitura correspondente com as moléculas de ácido nucleico da invenção. Os vetores apropriados podem incluir plasmídeos e vírus (incluindo vírus bacteriófagos e eucarióticos). Os vetores virais adequados incluem baculovírus e também adenovirus, vírus adeno-associado, vírus de herpes e vaccinia/varíola. Muitos outros vetores virais são descritos na técnica. Exemplos de vetores adequados incluem vetores de

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54/114 expressão bacteriana e de mamífero pGEX-KG, pEF-neo e pEFHA.

[00137] Conforme observado acima, o polipeptídeo recombinante ou sintético da invenção pode compreender sequências adicionais (por exemplo, etiquetas de peptídeo/polipeptídeos para facilitar a purificação do polipeptídeo) e, portanto, a molécula de ácido nucleico pode ser convenientemente fundida com o DNA que codifica um peptídeo ou polipeptídeo adicional, por exemplo, Hisetiqueta, proteína de ligação à maltose, para produzir uma proteína de fusão na expressão.

[00138] Desse modo, vista de um outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor, preferencialmente, um vetor de expressão, que compreende uma molécula de ácido nucleico conforme definido acima.

[00139] Outros aspectos da invenção incluem métodos para a preparação de moléculas de ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção, que compreende a inserção de uma molécula de ácido nucleico da invenção que codifica a etiqueta peptídica e/ou polipeptídeo da invenção em vetor de ácido nucleico.

[00140] As moléculas de ácido nucleico da invenção, preferencialmente contidas em um vetor, podem ser introduzidas na célula por qualquer meio apropriado. Técnicas de transformação ou transfecção adequadas são bem

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55/114 descritas na literatura. Inúmeras técnicas são conhecidas e podem ser usadas para introduzir esses vetores em células procarióticas ou eucarióticas para expressão. As células hospedeiras preferenciais para este fim incluem linhas celulares de insetos, leveduras, linhagens celulares de mamíferos ou E. coll, como a cepa BL21/DE3. A invenção também se estende a células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas transformadas ou transfectadas que contém uma molécula de ácido nucleico, particularmente um vetor conforme definido acima.

[00141] Desse modo, em outro aspecto, é fornecida uma célula hospedeira recombinante que contém uma molécula de ácido nucleico e/ou vetor conforme descrito acima.

[00142] Por recombinante entende-se que a molécula

de ácido	nucleico e/ou	vetor foi	introduzida	na	célula
hospedeira	A célula	hospedeira	pode ou não	conter
naturalmente uma cópia	endógena	da molécula	de	ácido
nucleico,	mas é recombinante pelo	fato de que	uma	cópia

exógena ou endógena adicional da molécula de ácido nucleico e/ou vetor foi introduzida.

[00143] Um aspecto adicional da invenção fornece um método de preparação de uma etiqueta peptídica e/ou polipeptídeo da invenção, conforme definido anteriormente no presente documento, que compreende a cultura de uma célula hospedeira que contém uma molécula de ácido nucleico conforme

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56/114 definido acima, sob condições pelas quais a dita molécula de ácido nucleico que codifica a dita etiqueta peptidica e/ou polipeptídeo é expresso e a recuperação da dita molécula (etiqueta peptidica e/ou polipeptídeo) assim produzida. A etiqueta peptidica e/ou polipeptídeo expressos formam um aspecto adicional da invenção.

[00144] Em algumas modalidades, as etiquetas peptidicas e/ou polipeptídeos da invenção, ou para uso no método e nas utilizações da invenção, podem ser gerados sinteticamente, por exemplo, pela ligação de aminoácidos ou peptídeos gerados sinteticamente menores, ou mais convenientemente pela expressão recombinante de uma molécula de ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo, conforme descrito anteriormente.

[00145] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser geradas sinteticamente por qualquer meio adequado conhecido na técnica.

[00146] Desse modo, a etiqueta peptidica e/ou polipeptídeo da invenção pode ser uma etiqueta ou polipeptídeo isolado, purificado, recombinante ou sintetizado.

[00147] O termo polipeptídeo é usado no presente documento de forma intercambiável com o termo proteína. Conforme observado acima, o termo polipeptídeo ou proteína inclui tipicamente qualquer sequência de aminoácidos

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57/114 compreendendo pelo menos 40 resíduos de aminoácidos consecutivos, por exemplo, pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 aminoácidos, como 40 a 1000, 50 a 900, 60 a 800, 70 a 700, 80 a 600, 90 a 500, 100 a 400 aminoácidos.

[00148] Similarmente, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser uma molécula de ácido nucleico isolada, purificada, recombinante ou sintetizada.

[00149] Desse modo, vistos alternativamente, as etiquetas peptídicas, polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico da invenção são preferencialmente moléculas não nativas, isto é, de ocorrência não-natural.

[00150] A nomenclatura de aminoácidos padrão é usada no presente documento. Desse modo, o nome completo de um resíduo de aminoácido pode ser usado de forma intercambiável com um código de letra ou três abreviações de letras. Por exemplo, a lisina pode ser substituída por K ou Lys, a isoleucina pode ser substituída por I ou lie, e assim por diante. Além disso, os termos aspartato e ácido aspártico, e glutamato e ácido glutâmico são usados no presente documento de forma intercambiável e podem ser substituídos por Asp ou D, ou Glu ou E, respectivamente.

[00151] Embora esteja previsto que as etiquetas peptídicas e polipeptídeos da invenção possam ser produzidos de forma recombinante, e esta seja uma modalidade preferencial da invenção, será evidente que as etiquetas

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58/114 peptídicas da invenção podem ser conjugadas com proteínas ou outras entidades, por exemplo, moléculas, conforme definido acima por outros meios. Em outras palavras, a etiqueta peptídica e outra molécula, componente ou entidade, por exemplo, proteína, podem ser produzidos separadamente por qualquer meio adequado, por exemplo, de modo recombinante, e subsequentemente conjugados (unidos) para formar um etiqueta peptídico-outro componente que podem ser usados nos métodos e usos da invenção. Por exemplo, as etiquetas peptídicas da invenção podem ser produzidas de modo sintético ou recombinante, conforme descrito acima, e conjugadas com outro componente, por exemplo, uma proteína por meio de um ligante ou espaçador não-peptídico, por exemplo, um ligante ou espaçador químico.

[00152] Desse modo, em algumas modalidades, a etiqueta peptídica e outro componente, por exemplo, proteína, podem ser unidas diretamente através de uma ligação ou indiretamente através de um grupo de ligação. Onde grupos de ligação forem empregados, esses grupos podem ser escolhidos para proporcionar a ligação covalente da etiqueta peptídica e de outra entidade, por exemplo, proteína, através do grupo de ligação. Os grupos de ligação de interesse podem variar amplamente, dependendo da natureza da outra entidade, por exemplo, proteína. O grupo de ligação, quando presente, está em muitas modalidades biologicamente inertes.

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59/114 [00153] Uma variedade de grupos de ligação é conhecida dos especialistas no assunto e encontra uso na invenção. Em modalidades representativas, o grupo de ligação é geralmente pelo menos cerca de 50 daltons, geralmente pelo menos cerca de 100 daltons e pode ser tão grande quanto 1.000 daltons ou maior, por exemplo, até 1.000.000 daltons se o grupo de ligação contiver um espaçador, mas geralmente não exceder cerca de 500 daltons e geralmente não excederá cerca de 300 daltons. Geralmente, esses ligantes compreenderão um grupo espaçador terminado em cada extremidade com uma funcionalidade reativa com capacidade de se ligar de modo covalente à etiqueta peptidica e à outra molécula ou componente, por exemplo, proteína.

[00154] Grupos espaçadores de interesse podem incluir cadeias de hidrocarbonetos alifáticos e insaturados, espaçadores contendo heteroátomos como oxigênio (éteres como polietileno glicol) ou nitrogênio (poliaminas) , peptídeos, carboidratos, sistemas cíclicos ou acíclicos que podem conter heteroátomos. Os grupos espaçadores também podem ser compostos de ligantes que se ligam a metais, de modo que a presença de um íon metálico coordene dois ou mais ligantes para formar um complexo. Os elementos espaçadores específicos incluem: 1,4-diamino-hexano, xililenodiamina, ácido tereftálico, ácido 3,6-dioxaoctanodioico, etilenodiamina-N, ácido N-diacético, 1,1'-etilenobis (ácido

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5-oxo-3-pirrolidinocarboxílico), 4,4'-etilenodipiperidina, oligoetileno glicol e polietileno glicol. As funcionalidades reativas potenciais incluem grupos funcionais nucleof1licos (aminas, álcoois, tióis, hidrazidas), grupos funcionais eletrof1licos (aldeidos, ésteres, vinil cetonas, epóxidos, isocianatos, maleimidas), grupos funcionais capazes de reações de cicloadição, formação de ligações dissulfeto ou ligação a metais. Exemplos específicos incluem aminas primárias e secundárias, ácidos hidroxâmicos, ésteres de Nhidroxissuccinimidila, carbonates de Nhidroxissuccinimidila, oxicarbonilimidazóis, ésteres de nitrofenila, ésteres de trifluoroetila, éteres glicidila, vinilsulfonas e maleimidas. Grupos ligantes específicos que podem ser utilizados no reagente de bloqueio do sujeito incluem compostos heterofuncionais, como azidobenzoilhidrazida, N-[4- (p-azidosalicilamino) butil]-3'-[2'piridilditio] propionamida), suberato de bissulfossuccinimidila, dimetiladipimidato, dissuccinimidiltartrato, éster de Nmaleimidobutiriloxissuccinimida, N-hidroxi sulfossuccinimidil-4-azidobenzoato, [4-azidofenil]-1,3 ' ditiopropionato de N-succinimidila, N-succinobutilidetil] , éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 3-(2piridilditio)propiônico (SPDP), éster de Nhidroxissuccinimida de ácido 4-(N-maleimidometil)ciclo

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61/114 hexano-l-carboxílico (SMCC), e similar. Por exemplo, um espaçador pode ser formado com uma azida reagindo com alcino ou uma tetrazina reagindo com transcicloocteno ou norborneno.

[00155] Em algumas modalidades, pode ser útil modificar um ou mais resíduos no etiqueta peptídica e/ou polipeptídeo para facilitar a conjugação dessas moléculas e/ou melhorar a estabilidade da etiqueta peptídica e/ou polipeptídeo. Desse modo, em algumas modalidades, a etiqueta peptídica ou polipeptídeo da invenção, ou para uso na invenção, pode compreender aminoácidos não-naturais ou nãopadrão.

[00156] Em algumas modalidades, a etiqueta peptídica ou polipeptídeo da invenção, ou para uso na mesma, pode compreender um ou mais, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 aminoácidos não-convencionais, como 10, 15, 20 ou mais não-convencionais, isto é, aminoácidos que possuem uma cadeia lateral que não é codificada pelo código genético padrão, denominada aqui aminoácidos não codificados (consultar, por exemplo, a Tabela 1) . Estes podem ser selecionados a partir de aminoácidos que são formados através de processos metabólicos, como ornitina ou taurina, e/ou aminoácidos modificados artificialmente, como 9H-fluoren-9ilmetoxicarbonila (Fmoc), (terc)-(B)utila (o)xi (c)arbonil (Boc), 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonila (Pmc)

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62/114 aminoácido protegidos, ou aminoácidos que tem o grupo benziloxi-carbonila (Z).

[00157] Exemplos de aminoácidos análogos não padronizados ou estruturais que podem ser utilizados nos ligantes peptídicos ou polipeptídeos de, e para uso na invenção, são aminoácidos D, isósteros de amida (como amida de N-metila, amida retroinversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinila, (E)vinila, metilenamino, metilenotio ou alcano), LN metilaminoácidos, D-α metilaminoácidos, D-Nmetilaminoácidos. Exemplos de aminoácidos não-convencionais, ou seja, não codificados, são listados na Tabela 1.

Tabela 1:

Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
Ácido α-aminobutírico	Abu	L-N-metilalanina	Nmala
a-amino-a-metilbutirato	Mgabu	L-N-metilarginina	Nmarg
aminociclopropano-	Cpro	L-N-metilasparagina	Nmasn
carboxilato		Ácido L-N- metilaspártico	Nmasp
Ácido aminoisobutírico	Aib	L-N-metilcisteína	Nmcys
aminonorbornil-	Norb	L-N-metiiglutamina	Nmgln

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
carboxilato		Ácido L-N- metilglutâmico	Nmglu
Ciclo-hexilalanina	Chexa	L-N-metil-histidina	Nmhis
ciclopentilalanina	Cpen	L-N-metilisoleucina	Nmile
D-alanina	Dal	L-N-metil-leucina	Nmleu
D-arginina	Darg	L-N-metilisina	Nmlys
Ácido D-aspártico	Dasp	L-N-metilmetionina	Nmmet
D-cisteina	Dcys	L-N-metilnorleucina	Nmnle
D-glutamina	Dgln	L-N-metilnorvalina	Nmnva
Ácido D-glutâmico	Dglu	L-N-metilornitina	Nmorn
D-histidina	Dhis	L-N- metilfenilalanina	Nmphe
D-isoleucina	Dile	L-N-metilprolina	Nmpro
D-leucina	Dleu	L-N-metilserina	Nmser
D-lisina	Dlys	L-N-metiltitonina	Nmthr
D-metionina	Dmet	L-N-metiltriptofano	Nmtrp
D-ornitina	Dorn	L-N-metiltirosina	Nmtyr
D-fenilalanina	Dphe	L-N-metilvalina	Nmval
D-prolina	Dpro	L-N- metiletilglicina	Nmetg

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
D-serina	Dser	L-N-metil-tbutilglicina	Nmtbug
D-treonina	Dthr	L-norleucina	Nle
D-triptofano	Dtrp	L-norvalina	Nva
D-tirosina	Dtyr	a-metil- aminoisobutirato	Maib
D-valina	Dval	a-metil-yaminobutirato	Mgabu
D-a-metilalanina	Dmala	a-metilciclo- hexilalanina	Mchexa
D-a-metilarginina	Dmarg	a- me tileiicopentilaia nina	Mcpen
D-a-metilasparagina	Dmasn	a-metil-a- naftilalanina	Manap
D-a-metilaspartato	Dmasp	α-metilpenicilamina	Mpen
D-a-metilcisteína	Dmcys	N- (4- aminobutil)glicina	Nglu
D-ot-me ti iglu t amina	Dmgln	N- (2- aminoetil)glicina	Naeg

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
D-a-metil-histidina	Dmhis	N- (3- aminopropil)glicina	Norn
D-a-metilisoleucina	Dmile	N-amino-ametilbutirato	Nmaabu
D-a-metil-leucina	Dmleu	α-naftilalanina	Anap
D-a-metilisina	Dmlys	N-benzilglicina	Nphe
D-a-metilmetionina	Dmmet	N- (2- carbamiletil)glicin a	Ngln
D-a-metilornitina	Dmorn	N- (carbamilmetil)glic ina	Nasn
D-a-metilfenilalanina	Dmphe	N- (2- carboxietil)glicina	Nglu
D-a-metilprolina	Dmpro	N- (carboximetil)glici na	Nasp
D-a-metilserina	Dmser	N-ciclobutilglicina	Ncbut
D-a-metiltritonina	Dmthr	N-ciclo- heptilglicina	Nchep

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
D-a-metiltriptofano	Dmtrp	N-ciclohexilglicina	Nchex
D-a-metiltirosina	Dmty	N-ciclodecilglicina	Ncdec
D-a-metilvalina	Dmval	N- cilododecilglicina	Ncdod
DN-metilalanina	Dnmala	N-ciclooctilglicina	Ncoct
DN-metilarginina	Dnmarg	N- ciclopropilglicina	Ncpro
DN-metilasparagina	Dnmasn	N- cicloundecilglicina	Ncund
DN-metilaspartato	Dnmasp	N- (2,2- difeniletil)glicina	Nbhm
DN-metilcisteina	Dnmcys	N- (3,3- difenilpropil)glici na	Nbhe
DN-metilglutamina	Dnmgln	N- (3- guanidinopropil)gli cina	Narg
DN-metilglutamato	Dnmglu	N- (1- hidroxietil)glicina	Nthr

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
DN-metil-histidina	Dnmhis	N- (hidroxietil))glici na	Nser
DN-metilisoleucina	Dnmile	N- (imidazoliletil) ) gl icina	Nhis
DN-metil-leucina	Dnmleu	N- (3- indolilietil)glicin a	Nhtrp
DN-metilisina	Dnmlys	N-metil-γaminobutirato	Nmgabu
N-metilciclohexilalanina	Nmchex a	DN-metilmetionina	Dnmmet
DN-metilornitina	Dnmorn	N- metilciclopentilala nina	Nmcpen
N-metilglicina	Nala	DN- metilfenilalanina	Dnmphe
N-metilaminoisobutirato	Nmaib	DN-metilprolina	Dnmpro
N- (1- metilpropil)glicina	Nilo	DN-metilserina	Dnmser

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
N- (2- metilpropil)glicina	Nleu	DN-metiltritonina	Dnmthr
DN-metiltriptofano	Dnmtrp	N- (1- metiletil)glicina	Nval
DN-metiltirosina	Dnmtyr	N-metila- naftilalanina	Nmanap
DN-metilvalina	Dnmval	metilpenicilamina	Nmpen
ácido γ-aminobutírico	Gabu	N- (p— hidroxifenil)glicin a	Nhtyr
L-t-butilglicina	Tbug	N-(tiometil)glicina	Ncys
L-etilglicina	Etg	penicilamina	Pen
L-homofenilalanina	Hphe	L-a-metilalanina	Mala
L-a-metilarginina	Marg	L-a-metilasparagina	Masn
L-a-metilaspartato	Masp	L-a-metil-tbutilglicina	Mtbug
L-a-metilcisteína	Mcys	L-metiletilglicina	Metg
L-a-metiIglutamina	Mgln	L-a-metilglutamato	Mglu
L-a-metil-histidina	Mhis	L-a-metil- homofenilalanina	Mhphe

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Não-convencional	Código	Não-convencional	Código
aminoácido		aminoácido
L-a-metilisoleucina	Mile	N- (2- metiltioetil)glicin a	Nmet
L-a-metil-leucina	Mleu	L-a-metilisina	Mlys
L-a-metilmetionina	Mmet	L-a-metilnorleucina	Mnle
L-a-metilnorvalina	Mnva	L-a-metilornitina	Morn
L-a-metilfenilalanina	Mphe	L-a-metilprolina	Mpro
L-a-metilserina	Mser	L-a-metiltritonina	Mthr
L-a-metiltriptofano	Mtrp	L-a-metiltirosina	Mtyr
L-a-metilvalina	Mval	L-N-metil- homofenilalanina	Nmhphe
N-(N-(2,2-difeniletil)	Nnbhm	N-(N-(3,3- difenilpropil)	Nnbhe
carbamilmetil)glicina		carbamilmetil)glici na
1-carboxi-l-(2,2— difenil-	Nmbc	L-O-metil serina	Omser
etilamino)ciclopropano		L-O-metil homosserina	Omhse

[00158] Conforme discutido acima, em algumas modalidades, pode ser útil fundir ou conjugar a etiqueta

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70/114 peptídica e/ou polipeptídeo (peptídeo ligase) da invenção a um substrato sólido (isto é, uma fase sólida ou suporte) e será evidente que isso pode ser alcançado de qualquer maneira conveniente. Desse modo, a maneira ou meios de imobilização e o suporte sólido podem ser selecionados, de acordo com a escolha, a partir de qualquer número de meios de imobilização e suportes sólidos, como são amplamente conhecidos na técnica e descritos na literatura. Desse modo, a etiqueta peptídica e/ou polipeptídeo podem ser diretamente ligados ao suporte, por exemplo, através de um domínio ou porção química da etiqueta peptídica ou polipeptídeo (por exemplo, reticulado quimicamente). Em algumas modalidades, a etiqueta peptídica ou polipeptídeo pode ser ligado indiretamente por meio de um grupo ligante ou por um grupo (ou grupos) de ligação intermediário (por exemplo, por meio de uma interação biotina-estreptavidina). Desse modo, a etiqueta peptídica ou polipeptídeo pode ser ligada covalente ou de modo nãocovalente ao suporte sólido. A ligação pode ser uma ligação reversível (por exemplo, clivável) ou irreversível. Desse modo, em algumas modalidades, a ligação pode ser clivada de modo enzimático, químico ou com luz, por exemplo, a ligação pode ser uma ligação sensível à luz.

[00159] Desse modo, em algumas modalidades, uma etiqueta peptídica ou polipeptídeo pode ser dotado de meios para imobilização (por exemplo, um parceiro de ligação por

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71/114 afinidade, por exemplo, biotina ou um hapteno, com capacidade de se ligar ao seu parceiro de ligação, ou seja, um parceiro de ligação cognato, por exemplo, estreptavidina ou um anticorpo) fornecido no suporte. Em algumas modalidades, a interação entre a etiqueta peptídica ou polipeptídeo e o suporte sólido deve ser robusta o suficiente para permitir as etapas de lavagem, ou seja, a interação entre a etiqueta peptídica ou polipeptídeo e o suporte sólido não é interrompida (significativamente interrompida) pelas etapas de lavagem descritas acima. Por exemplo, é preferencial que, em cada etapa de lavagem, menos de 5%, preferencialmente menos de 4, 3, 2, 1, 0,5 ou 0,1% da etiqueta peptídica ou polipeptídeo sejam removidos ou eluídos da fase sólida.

[00160] O suporte sólido (fase ou substrato) pode ser qualquer um dos suportes ou matrizes conhecidos, atualmente amplamente utilizados ou propostos para imobilização, separação etc. Os mesmos podem assumir a forma de partículas (por exemplo, esferas que podem ser magnéticas, paramagnéticas ou não magnéticos), folhas, géis, filtros, membranas, fibras, capilares, lâminas, matrizes ou tiras de microtitulação, tubos, placas ou poços etc.

[00161] O suporte pode ser feito de vidro, silica, látex ou um material polimérico. São adequados materiais que apresentam uma área de superfície alta para ligação da proteína de fusão. Esses suportes podem ter uma superfície

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72/114 irregular e podem ser, por exemplo, porosos ou particulados, por exemplo, partículas, fibras, teias, sinterizadores ou peneiras. Materiais particulados, por exemplo, pérolas, são úteis devido à sua maior capacidade de ligação, particularmente pérolas poliméricas.

[00162] Convenientemente, um suporte sólido particulado utilizado de acordo com a invenção compreenderá esferas esféricas. O tamanho das esferas não é crucial, mas as mesmas podem, por exemplo, ser da ordem de diâmetro de pelo menos 1 e preferencialmente de pelo menos 2 pm, e ter um diâmetro máximo preferencialmente não-superior a 10 e, por exemplo, não superior a 6 pm.

[00163] As partículas monodispersas, ou seja, aquelas que são substancialmente uniformes em tamanho (por exemplo, tamanho com um desvio padrão de diâmetro inferior a 5%) têm a vantagem de fornecer reprodutibilidade muito uniforme da reação. As partículas de polímero monodisperso representativas podem ser produzidas pela técnica descrita no documento n° US-A-4336173.

[00164] No entanto, para ajudar na manipulação e separação, as esferas magnéticas são vantajosas. O termo magnético, conforme usado no presente documento, significa que o suporte tem capacidade de ter um momento magnético conferido ao mesmo quando colocado em um campo magnético e, portanto, é deslocável sob a ação desse campo. Por outras

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73/114 palavras, um suporte que compreende partículas magnéticas pode ser facilmente removido por agregação magnética, o que fornece uma maneira rápida, simples e eficiente de separar as partículas seguindo as etapas de formação da ligação isopeptidica.

[00165] Em algumas modalidades, o suporte sólido é uma resina de agarose.

[00166] Conforme discutido nos Exemplos, os inventores determinaram surpreendentemente que o peptídeo ligase da invenção pode ser liofilizado sem perda significativa de atividade. Isso pode ser particularmente vantajoso para armazenamento a longo prazo e/ou transporte do polipeptídeo à temperatura ambiente, isto é, sem a necessidade de resfriamento. Desse modo, em algumas modalidades, o polipeptídeo (peptídeo ligase) e os peptídeos da invenção podem estar em um estado liofilizado. Em vista alternativa, a invenção fornece um polipeptídeo liofilizado (peptídeo ligase) conforme definido acima. A invenção também pode fornecer etiquetas peptidicas liofilizadas conforme definido acima. A liofilização pode ser alcançada com uso de qualquer meio adequado conhecido na técnica.

[00167] Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um kit, particularmente um kit para uso nos processos e usos da invenção, ou seja, para conjugar duas moléculas ou componentes por meio de uma ligação isopeptidica ou para

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74/114 produzir um complexo entre três moléculas ou componentes, em que duas das moléculas ou componentes no complexo são conjugadas por meio de uma ligação isopeptídica, em que o dito kit compreende:

[00168] (a) um peptídeo ligase conforme definido acima, opcionalmente conjugado ou fundido com uma molécula ou componente, por exemplo, uma proteína; e [00169] (b) uma etiqueta peptídica que compreende:

[00170]	(i)	uma sequência	de	aminoácidos	conforme
estabelecido	na SEQ	ID NO: 2;
[00171]	(ü)	uma sequência	de	aminoácidos	com pelo
menos 80% de identidade de sequênci	a com uma	sequência
conforme estabelecido na SEQ ID	NO:	2, em que a dita
sequência de	aminoácidos compreendí	s um	resíduo de	lisina na
posição equivalente	à posição 9 da	SEQ	ID NO: 2,
[00172]	(iü)	uma sequência	de	aminoácidos	conforme
estabelecido	na SEQ	ID NO: 3; ou
[00173]	(iv)	uma sequência	de	aminoácidos	com pelo

menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, [00174] em que a dita etiqueta peptídica é conjugada ou fundida a uma molécula ou componente, por exemplo, uma proteína como um polipeptídeo recombinante ou sintético que

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75/114 compreende uma etiqueta peptídica conforme definido acima;

e/ou

[00175]	(c)	uma	molécula de	ácido	nucleico,
particularmente	um	vetor,	que codifica	um peptídeo ligase
conforme definido em (a);	e
[00176]	(d)	uma	molécula de	ácido	nucleico,
particularmente	um	veto	r, que codifica uma	etiqueta

peptídica conforme definido em (b).

[00177] Em algumas modalidades, o kit pode ainda compreender uma segunda etiqueta peptídica conjugada ou fundida a uma molécula ou componente, por exemplo, uma proteína como um polipeptídeo recombinante ou sintético que compreende uma etiqueta peptídica conforme definido acima, em que o segundo etiqueta peptídica tem capacidade de formar um isopeptídeo ligação com a etiqueta peptídica em (b) quando em contato com um peptídeo ligase de (a) sob condições adequadas para a formação de uma ligação isopeptídica conforme definido acima. Desse modo, em algumas modalidades, o kit compreende uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 (ou variante do mesmo) conjugada ou fundida com uma molécula ou componente e uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3 (ou variante do mesmo) conjugada ou fundida com uma molécula ou componente.

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76/114 [00178] Será evidente que o peptídeo ligase e as etiquetas peptídicas da invenção têm uma vasta gama de utilidades. Em alternativa, o peptídeo ligase e as etiquetas peptídicas da invenção podem ser empregadas em uma variedade de indústrias.

[00179] Por exemplo, em algumas modalidades, o peptídeo ligase e as etiquetas peptídicas da invenção podem ter utilidade no direcionamento de sondas fluorescentes ou outras sondas ou marcações biofísicas a proteínas específicas. Em relação a isso, a proteína de interesse pode ser modificada para incorporar uma primeira etiqueta peptídica (por exemplo, SEQ ID NO: 2), conforme discutido acima, e a sonda ou marcação biofísica ou fluorescente pode ser fundida ou conjugada com a segunda etiqueta peptídica (por exemplo, SEQ ID NO: 3). A proteína modificada e a sonda ou marcação podem ser contatadas juntas na presença do peptídeo ligase sob condições adequadas para permitir a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas, marcando assim a proteína com a marcação ou sonda através de uma ligação isopeptídica.

[00180] Em algumas modalidades, o peptídeo ligase e as etiquetas peptídicas da invenção podem ter utilidade na imobilização de proteínas para proteômica. Em relação a isso, as proteínas de interesse podem ser modificadas para incorporar uma primeira etiqueta peptídica (por exemplo, SEQ

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ID NO: 2) e um substrato sólido pode ser fundido ou conjugado com a segunda etiqueta peptidica (por exemplo, SEQ ID NO: 3). As proteínas modificadas e o substrato sólido podem ser contatados juntos na presença do peptídeo ligase sob condições adequadas para permitir a formação de uma ligação isopeptídica entre as etiquetas peptidicas, imobilizando assim as proteínas no substrato sólido por meio de uma ligação isopeptídica. Será evidente que as etiquetas peptidicas e ligase da invenção podem ser utilizadas para imobilizar simultaneamente múltiplas proteínas em uma fase/substrato sólido.

[00181] Em ainda outras modalidades, o peptídeo ligase e as etiquetas peptidicas da invenção podem ter utilidade na conjugação de antígenos com partículas semelhantes a vírus, vírus, bactérias ou estruturas de multimerização para vacinação. Por exemplo, a produção de partículas, vírus ou bactérias semelhantes a vírus que exibem uma primeira etiqueta peptidica na superfície facilitaria a conjugação de antígenos que compreendem uma segunda etiqueta peptidica à sua superfície através de uma ligação isopeptídica, com uso de o peptídeo ligase da invenção para mediar a formação da ligação isopeptídica. Em relação a isso, a multimerização de antígenos dá origem a respostas imunes bastante aprimoradas. Desse modo, em algumas modalidades, a molécula ou componente fundido com o primeiro peptídeo da

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78/114 invenção é uma proteína do capsídeo viral e/ou a molécula ou componente fundido com a segunda etiqueta peptidica da invenção é um antígeno, por exemplo, um antígeno associado a uma determinada doença, por exemplo, infecção.

[00182] Em outras modalidades, as etiquetas peptídicas podem ser usadas para ciclizar ou uma proteína, por exemplo, fundindo etiquetas peptídicas em cada extremidade da proteína e subsequentemente entrando em contato com a proteína com o peptídeo ligase da invenção para mediar ou promover a formação da ligação isopeptídica entre as etiquetas peptídicas. Em relação a isso, foi demonstrado que a ciclização de proteínas aumenta a resiliência da proteína, por exemplo, ao calor, solvente orgânico, pH extremo ou degradação proteolítica.

[00183] Em particular, a ciclização de enzimas ou polímeros enzimáticos (proteínas de fusão) pode melhorar a termoestabilidade das unidades de proteína ou proteína no polímero enzimático. Nesse sentido, as enzimas são ferramentas valiosas em muitos processos, mas são instáveis e difíceis de recuperar. Polímeros enzimáticos têm maior estabilidade à temperatura, pH e solventes orgânicos e há um desejo crescente de usar polímeros enzimáticos em processos industriais. No entanto, a geração de polímeros enzimáticos geralmente usa uma reação inespecífica do glutaraldeído e isso danificará ou desnaturará (isto é, reduz a atividade

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79/114 de) muitas enzimas potencialmente úteis. Espera-se que a ligação específica de sítio de proteínas a cadeias (polímeros) através de ligações isopeptídicas com uso das etiquetas peptídicas e do peptídeo ligase da presente invenção melhore a resiliência enzimática, como em diagnósticos ou enzimas adicionadas à ração animal. Em modalidades particularmente preferenciais, as enzimas podem ser estabilizadas por ciclização, conforme discutido acima.

[00184] O peptídeo ligase e as etiquetas peptídicas da invenção também podem ser usadas para ligar várias enzimas a vias para promover a eficiência metabólica, conforme descrito no documento n° WO 2016/193746. Em relação a isso, as enzimas geralmente se unem para funcionar nas vias internas das células e, tradicionalmente, tem sido difícil conectar múltiplas enzimas em conjunto fora das células (in vitro) . Desse modo, as etiquetas peptídicas e o peptídeo ligase da invenção podem ser utilizados para acoplar ou conjugar enzimas para produzir proteínas de fusão e, portanto, aumentar a atividade de vias enzimáticas de várias etapas, o que pode ser útil em uma variedade de conversões industriais e para diagnóstico. Por exemplo, a proteína de fusão pode criar equipes de sinalização para induzir respostas celulares, por exemplo, em diferenciação ou terapia.

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80/114 [00185] As etiquetas peptídicas e o peptídeo ligase da invenção também terão utilidade na produção de polímeros de anticorpos. Em relação a isso, os anticorpos são uma das classes mais importantes de produtos farmacêuticos e são frequentemente utilizados ligados a superfícies. No entanto, a mistura de antígenos em uma amostra e, portanto, a captura do dito antígeno na dita amostra, são ineficientes perto de superfícies. Estendendo-se as cadeias de anticorpos, prevêse que a eficiência da captura seja aprimorada. Isso será especialmente valioso no isolamento de células tumorais circulantes, que atualmente é uma das maneiras mais promissoras de permitir o diagnóstico precoce do câncer. Também anticorpos de diferentes especificidades podem ser combinados em qualquer ordem desejada.

[00186] Ainda numa outra modalidade, as etiquetas peptídicas e o peptídeo ligase da invenção podem ter utilidade na produção de drogas para ativar a sinalização celular. Em relação a isso, muitas das maneiras mais eficazes de ativar a função celular são através de ligantes de proteínas. No entanto, na natureza, um ligante de proteína geralmente não operará por si só, mas com uma combinação específica de outras moléculas de sinalização. Desse modo, as etiquetas peptídicas e o peptídeo ligase da invenção permitem a geração de proteínas de fusão adaptadas (isto é, equipes de proteínas), o que podería proporcionar a ativação

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81/114 ideal da sinalização celular. Essas proteínas de fusão (equipes de proteínas) podem ser aplicadas para controlar a sobrevivência, divisão ou diferenciação celular.

[00187] Em ainda outras modalidades, as etiquetas peptidicas e o peptídeo ligase da invenção podem ter utilidade na geração de hidrogéis para crescimento de células-tronco, preparação de biomateriais, funcionalização de anticorpos com corantes ou enzimas e estabilizando enzimas por ciclização.

[00188] A invenção será agora descrita em mais detalhes nos seguintes Exemplos não-limitadores, em referência aos seguintes desenhos:

[00189] A Figura 1 (A) mostra um desenho animado de como o RrgA foi dividido e modificado para chegar às etiquetas peptidicas e peptídeo ligase da invenção. O domínio C-terminal do RrgA (Banco de Dados de Proteína 2WW8) foi dividido em três partes e manipulado, de modo que o Lys reativo seja localizado no Etiqueta SnoopJr, o Asn reativo no Etiqueta Dog e o Glu catalítico no SnoopLigase. (B) mostra a base molecular para a formação de ligações isopeptídicas em RrgA, em que Glu 803 catalisa a formação de ligações isopeptídicas entre Lys 742 e Asn 854, eliminando a amônia (números de resíduos como no arquivo PDB) . (C) mostra um desenho do uso de Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr para ligação peptídeo-peptídeo.

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82/114 [00190] A Figura 2 (A) é um gráfico que mostra a reatividade de diferentes mutantes de RrgALigase, em que: RrgALigase refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8; A808P refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8, em que o resíduo 66 é prolina; A808P Q837P refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8, em que os resíduos 66 e 95 são ambos prolina; A808P Q837P D838G refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 8, em que os resíduos 66 e 95 são prolina e o resíduo 96 é glicina; e SnoopLigase refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1. (B) uma fotografia de um gel de SDS-PAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a reatividade de SnoopLigase, Etiqueta SnoopJr e Etiqueta Dog juntamente com controles com mutação de alanina de Lys reativa de Etiqueta SnoopJr (KA) e Asn reativa de Etiqueta Dog (NA) e mutação de glutamina de Glu reativa de SnoopLigase (EQ), em que Etiqueta SnoopJr foi expresso como uma proteína de fusão com um anticorpo a HER2 de Etiqueta Dog foi expresso como uma proteína de fusão com SUMO.

[00191] A Figura 3 mostra uma fotografia de um gel de SDS-PAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise

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83/114 de produtos da reação de ligação em fase sólida descrita no Exemplo 4.

[00192] A Figura 4 mostra gráficos que demonstram o efeito do (A) pH e (B) da temperatura na atividade da SnoopLigase ligando Etiqueta SnoopJr-Aff1HER2 e SUMOEtiqueta Dog.

[00193] A Figura 5 mostra gráficos que demonstram o efeito da (A) concentração de NaCI, (B) detergentes e (C) glicerol na atividade da SnoopLigase ligando Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog.

[00194] A Figura 6 mostra um gráfico de barras que mostra a quantidade relativa de produto formado em reações repetidas de SnoopLigase imobilizadas em um substrato sólido após a eluição do produto de reação com uso de condições de pH baixo. O rendimento do produto foi normalizado em relação ao rendimento do ciclo de reação 1. n = 9, média +/- 1 DP.

[00195] A Figura 7 mostra (A) uma fotografia de uma SDS-PAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise de produtos da reação entre IMX-Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr-MBP descrita no Exemplo 6; e (B) um gráfico que mostra a quantificação da reação descrita em (A) (n = 3, média +/- 1 DP).

[00196] A Figura 8 mostra (A) uma fotografia de uma SDS-PAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise de produtos da reação entre Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO

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Etiqueta Dog descrita no Exemplo 6; e (B) um gráfico que mostra a quantificação da reação descrita em (A) (n = 3, média +/- 1 DP).

[00197] A Figura 9 mostra uma fotografia de uma SDSPAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise da eluição dependente da temperatura do produto da SnoopLigase descrita no Exemplo 7, em que Concorrente refere-se ao peptídeo Etiqueta Snoop ligado de modo covalente a AffiHER2Etiqueta Dog.

[00198] A Figura 10 mostra uma fotografia de uma SDSPAGE com coloração de Coomassie, que caracteriza a análise da eluição dependente de aditivos do produto da SnoopLigase descrita no Exemplo 8, em que Controle não possui aditivo no tampão de eluição e Reação é a mistura anterior captura de resina.

[00199] A Figura 11 mostra uma fotografia de uma SDSPAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise da titulação de imidazol para eluição do produto de SnoopLigase descrito no Exemplo 8. Deixado(a) em resina refere-se a amostras da fervura da resina após a eluição com tampão de carregamento de SDS, para visualizar o que permaneceu na resina. Esta ebulição liberou subunidades de estreptavidina da estreptavidina-agarose.

[00200] A Figura 12 mostra um gráfico que mostra a quantidade de produto de reação formada entre SUMO-Etiqueta

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Dog e Etiqueta Snoop-AffÍHER2 ou Etiqueta SnoopJr-AffiHER2, catalisado por SnoopLigase (n = 3, média +/- 1 DP) .

[00201] A Figura 13 mostra um gráfico que mostra a quantidade de produto de reação formada entre SUMO-Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr-AffiHER2, catalisado por SnoopLigase em várias concentrações de TMAO (n = 3, média + /- 1 DP).

[00202] A Figura 14 mostra uma fotografia de uma SDSPAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise da reatividade da proteína de fusão interna Etiqueta Dog-MBP com Etiqueta SnoopJr-AffiHER2, catalisada por SnoopLigase descrita no Exemplo 11.

[00203] A Figura 15 mostra uma fotografia de uma SDSPAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise de diferentes métodos de eluição para separar o produto de reação da proteína SUMO-Etiqueta Dog com Etiqueta SnoopJrAffiHER2 da SnoopLigase. A Eluição por peptídeo refere-se à eluição com uso do peptídeo concorrente Etiqueta SnoopJr: Etiqueta Dog descrito no Exemplo 12.

[00204] A Figura 16 mostra uma fotografia de uma SDSPAGE com coloração de Coomassie que caracteriza a análise de produtos da reação entre a proteína de fusão interna Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e Etiqueta HaloVSS-Etiqueta Dog, catalisada por SnoopLigase descrita no Exemplo 11.

[00205] A Figura 17 mostra (A) um gráfico de barras que mostra a atividade da SnoopLigase liofilizada após

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86/114 armazenamento a 37 °C durante o número especificado de dias em relação à atividade de uma amostra não liofilizada, conforme descrito no Exemplo 14, e (B) um gráfico de barras que mostra a atividade da SnoopLigase com agentes redutores em relação à SnoopLigase sem agentes redutores, conforme descrito no Exemplo 14.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Desenvolvimento do Peptídeo Ligase (SnoopLigase) e Etiquetas Peptidicas [00206] RrgA (SEQ ID NO: 4) é uma adesina de Streptococcus pneumoniae , uma bactéria Gram-positiva que pode causar septicemia, pneumonia e meningite em humanos. Uma ligação isopeptídica espontânea se forma no domínio do tipo imunoglobulina D4 de RrgA entre os resíduos Lys742 e Asn854 .

[00207] Os inventores dividiram o domínio D4 em três partes, um par de etiquetas peptidicas denominadas Etiqueta Snoop (resíduos 734 a 745 de RrgA, SEQ ID NO: 9) e Etiqueta RrgA2 (resíduos 838 a 860 de RrgA, SEQ ID NO: 10) e uma proteína denominada RrgALigase (resíduos 743 a 846, SEQ ID NO: 8) . Notavelmente, existe uma sobreposição de 9 aminoácidos entre o N-terminal da Etiqueta RrgA2 e o Cterminal da RrgALigase. Da mesma forma, há uma sobreposição de 3 aminoácidos entre o C-terminal do Etiqueta Snoop e o Nterminal da RrgALigase. Além disso, as sequências de

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RrgALigase e Etiqueta RrgA2 incorporam modificações relativas à sequência de RrgA nativa que são conhecidas por serem importantes por promover a taxa de reação da formação da ligação isopeptídica. Em particular, a glicina na posição 842 de RrgA foi substituída por treonina na posição correspondente (equivalente) na RrgALigase e Etiqueta RrgA2. Além disso, o ácido aspártico na posição 848 de RrgA foi substituído por glicina na posição correspondente em Etiqueta RrgA2.

[00208] A seleção dos locais nos quais a divisão do domínio RrgA D4 foi considerada importante para a atividade do peptídeo ligase e das etiquetas peptídicas. Em relação a isso, é um princípio geral na concepção de etiquetas peptídicas que as mesmas sejam tão curtas quanto possível, de modo a limitar quaisquer interações indesejadas quando incorporadas nas moléculas ou componentes, por exemplo, proteínas, a serem ligadas. Consequentemente, a inclusão de sequências em etiquetas peptídicas que se sobrepõem ao peptídeo ligase não é consistente com os princípios de concepção padrão. Contudo, determinou-se que as sequências sobrepostas são essenciais para a atividade das marcações ligase e peptídica, pois a remoção dessas sequências das marcações ou ligase perturbou significativamente a eficácia da reação de ligação. Embora não deseje se limitar pela teoria, acredita-se que a presença de sequências sobrepostas

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88/114 melhore a estabilidade da interação entre as etiquetas peptídicas e as porções de ligase do domínio D4 de RrgA.

[00209] Os locais N- e C-terminais selecionados para a proteína RrgALigase resultaram na remoção de 3 β-fitas, que é uma modificação importante, particularmente para uma proteína pequena, isto é, o domínio D4 de RrgA. Em relação a isso, a RrgALigase mostrou ter baixa solubilidade e atividade limitada da ligase (consultar Figura 2). De fato, a RrgALigase demonstrou ser insolúvel em soluções que compreendem NaCl, como solução salina tamponada com fosfato (PBS), o que limita severamente sua utilidade, particularmente em ambientes celulares de organismos vivos. Além disso, muitos ensaios biológicos in vitro requerem a presença de NaCl.

[00210] Visto que a RrgALigase era mais ativa a 4 °C, foi levantada a hipótese de que a estabilização dos domínios divididos seria importante para melhorar o desempenho da ligase. Para alcançar esta estabilização, os inventores procuraram modificar β-curvas do domínio da proteína substituindo-se os resíduos apropriados por prolina. As βcurvas são elementos proteicos flexíveis. A Prolina tem um

ângulo φ fixo	de	-60° e, portanto	, limita a flexibilidade
conformacional	da	proteína.
[00211]	A	sequência de	RrgALigase foi	tríada
manualmente para	locais adequados	para mutação em	prolina

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89/114 com base na estrutura cristalina. Vinte locais foram identificados e seis foram selecionados para modificação. No entanto, somente duas substituições de prolina (A66P e Q95P, com base na numeração na SEQ ID NO: 8) demonstraram melhorar a atividade, consultar a Figura 2.

[00212] Foi levantada a hipótese de que a taxa de reação de ligação podería ser melhorada estabilizando ainda mais a proteína. Consequentemente, os inventores analisaram o domínio C-terminal RrgA com uso do Protein Repair One Stop Shop (PROSS) . 0 PROSS analisa proteínas com base na homologia da sequência de proteínas e na modelagem atomistica de Rosetta. No entanto, o alinhamento de múltiplas sequências (MSA) usado pelo PROSS identificou apenas 35 sequências homólogas, o que é insuficiente para fornecer resultados significativos. Consequentemente, os inventores geraram manualmente um MSA separado para o RrgA para inserir no PROSS.

[00213] A análise de PROSS sugeriu quinze mutações que podem melhorar a estabilidade do domínio C-terminal RrgA e cinco foram selecionadas para análises adicionais (D737S, A820E, D830N, D838G e I839V com base na numeração em RrgA, SEQ ID NO: 4), com base na inspeção baseada em estrutura de contatos potenciais feitos pelas cadeias laterais de aminoácidos recém-introduzidas. Notavelmente, uma das mutações identificadas na análise de PROSS, D737S, estava na

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90/114 sequência de Etiqueta Snoop. As conversões de modificação do Etiqueta Snoop e RrgALigase que incorporam as mutações mencionadas foram nomeadas Etiqueta SnoopJr (SEQ ID NO: 2) e SnoopLigase (SEQ ID NO: 1), respectivamente. Com base nos estudos de truncamento de Etiqueta RrgA2, os inventores também levantaram a hipótese de que a mutação do resíduo de asparagina na posição 847 de RrgA (posição 10 de Etiqueta RrgA2, SEQ ID NO: 10) ao ácido aspártico também reduziría a heterogeneidade da proteína colocada em etiqueta com peptídeo. A versão modificada de Etiqueta RrgA2 foi denominada Etiqueta Dog.

[00214] Algumas das mutações de PROSS na RrgALigase melhoraram substancialmente o rendimento e a taxa de reação (Figura 2), mas A820E e D830N não melhoraram a atividade da ligase. De modo similar, a mutação D737S no Etiqueta Snoop (isto é, resultando em Etiqueta SnoopJr) também teve muito sucesso em melhorar a reação com o Etiqueta Dog.

[00215] Em vista da fraca solubilidade de RrgALigase, a proteína foi inicialmente expressa como uma proteína de fusão da proteína de ligação à maltose (MBP) para reduzir a agregação após a expressão e facilitar a análise. Contudo, verificou-se surpreendentemente que, quando a SnoopLigase foi produzida sem a fusão do MBP, a solubilidade da SnoopLigase foi melhorada em relação à RrgALigase. A SnoopLigase foi expressa eficientemente em E. coli (> 10 mg

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91/114 por litro de cultura) e era altamente solúvel (> 500 μΜ) . Conforme discutido abaixo no Exemplo 3, a SnoopLigase é ativa em uma variedade de condições, inclusive em concentrações extracelulares fisiológicas de NaCl. Desse modo, a mutação da RrgALigase (SEQ ID NO: 8) para gerar SnoopLigase (SEQ ID NO: 1) também melhorou a solubilidade da proteína.

[00216] Para validar o mecanismo de reação proposto e a especificidade da ligação de resíduos por SnoopLigase, a reação foi analisada por SDS-PAGE com cada um dos principais resíduos mutados. A SnoopLigase ligou eficientemente um afixado fundido com Etiqueta SnoopJr a um domínio SUMO fundido à Etiqueta Dog. No entanto, a mutação de Lys 9 em Etiqueta SnoopJr, Asn 17 em Etiqueta Dog ou Glu 61 em SnoopLigase aboliu a formação do produto (Figura 2B).

Exemplo 2 - Ligação de peptídeo-peptídeo mediado por SnoopLigase [00217] Para validar o mecanismo proposto de reação e a especificidade da ligação de resíduos por SnoopLigase, Etiqueta SnoopJr e Etiqueta Dog foram fundidos para modelar proteínas. A Etiqueta Dog foi fundida com o pequeno modificador semelhante a Ubiquitina (SUMO), enquanto a Etiqueta SnoopJr foi fundida a um affibody contra o HER2. A mistura de SUMO-Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 com SnoopLigase causou o aparecimento de uma nova banda de peso molecular mais alto, representando o produto de ligação

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92/114 ligado de modo covalente. A banda tinha o peso molecular esperado e era resistente à ebulição no tampão de carregamento de SDS. A mutação de qualquer um dos três resíduos da tríade reativa (lisina na posição 9 em Etiqueta SnoopJr, asparagina na posição 17 em Etiqueta Dog e ácido glutâmico na posição 61 em SnoopLigase) impediu a ocorrência da banda do produto de ligação (Figura 2B). A espectrometria de massa gerou a mudança de peso molecular esperada após a reação dos substratos peptidicos.

Exemplo 3 - Condições de reação de SnoopLigase [00218] A reação SnoopLigase funcionou satisfatoriamente em torno de pH neutro, com pouca diferença de 7,25 a 8,75 (Figura 4A). A ligação eficiente ocorreu em uma ampla faixa de temperaturas (4 a 37 °C), com ideal a 15 °C (Figura 4B). A SnoopLigase foi funcional na presença de concentrações extracelulares de NaCI, embora a reação prossiga com mais eficiência com o tampão Tris borato na ausência de NaCI (Figura 5A) . A SnoopLigase reagiu satisfatoriamente na presença dos detergentes comumente usados Tween 20 e Triton X-100 a 2%, mas o SDS inibiu a reação (Figura 5B). A adição do estabilizador de proteína glicerol a 15 a 30% (v/v) da taxa de reação intensificada (Figura 5C) .

[00219] A SnoopLigase teve uma temperatura de fusão de 45 °C do DSC e recuperou a atividade total seguindo

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93/114 tratamentos térmicos de até 70 °C. A atividade parcial foi restaurada após aquecimento a 99 °C.

Exemplo 4 - Purificação do produto de reação de

SnoopLigase [00220] Mediante a reação, a SnoopLigase se ligou fortemente ao produto de reação, o que permitiu a purificação eficiente do produto de reação de ligação (Figura 3A) . Após a reação do Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 com o SUMO-Etiqueta Dog com uso de SnoopLigase biotinilada, a ligase foi capturada por estreptavidina-agarose. A forte interação entre biotina-estreptavidina e produto de reação SnoopLigase permite uma lavagem rigorosa, de modo que as proteínas não reagidas sejam removidas. A incubação da resina com tampão de eluição do anticorpo não afetou a interação de biotinaestreptavidina, mas interrompeu a interação do produto de reação SnoopLigase e produziu um produto ligado de alta pureza (Figura 3A), removendo os produtos não reagidos e a SnoopLigase. Este procedimento elimina a necessidade de subsequente purificação que demanda tempo por cromatografia de exclusão por tamanho ou diálise. Além disso, ajustando o volume da eluição, o produto de ligação altamente concentrado pode ser eluído, independentemente das concentrações de reagente usadas durante a reação.

Exemplo 5 - Reação em fase sólida de SnoopLigase

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94/114 [00221] A imobilização de enzimas em fase sólida pode melhorar a eficiência da reação e facilitar a reutilização econômica de enzimas purificadas. Para testar se a SnoopLigase pode ser reciclada após o tratamento com tampão de eluição de anticorpos, os inventores imobilizaram a SnoopLigase biotinilado em estreptavidina agarose e realizaram uma reação de ligação por adição de Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog. Após lavagem e eluição do produto de reação, a resina de agarose acoplada a SnoopLigase foi usada para outra reação de ligação. A quantidade de produto formado permaneceu constante por pelo menos 8 ciclos de reação, indicando que a SnoopLigase pode realizar várias voltas e o tratamento da SnoopLigase com pH baixo não desregula irreversivelmente a enzima (Figura 6).

Exemplo 6 - Rendimento SnoopLigase de reação [00222] O rendimento da reação entre Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr catalisada por SnoopLigase foi determinado por incubação de IMX-Etiqueta Dog a 10 μΜ com 20 μΜ de cada SnoopLigase e Etiqueta SnoopJr-MBP em 50 mM TB pH 7,25 + 15% de glicerol (v/v) por uma variedade de períodos de tempo, de 15 minutos a 48 horas, a 4 °C. As amostras foram analisadas com uso de SDS-PAGE sob condições de redução com coloração de Coomassie e as Figuras 7A e B mostram que a SnoopLigase facilita o acoplamento de quase toda a proteína de fusão

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IMX-Etiqueta Dog. Notavelmente, um rendimento de reação de 96% para IMX-Etiqueta Dog foi alcançado após 48 h.

[00223] Da mesma forma, as Figuras 8A e B mostram que a incubação de Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 a 5 μΜ com 10 μΜ de cada SnoopLigase e SUMO-Etiqueta Dog em 50 mM TB pH 7,25 + 15% de glicerol (v/v) a 4 °C facilita o acoplamento de quase todos da proteína de fusão Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 após 24 horas, isto é, um rendimento de reação de 99% para Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 foi alcançado após 24 horas.

Exemplo 7 - Condições alternativas para Eluição do produto de reação de uma Fase Sólida [00224] O efeito da temperatura e da competição na eluição do produto de reação de uma fase sólida foi investigado com uso das proteínas de fusão Etiqueta SnoopJrAffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog e a SnoopLigase biotinilada descrita no Exemplo 5. As proteínas de fusão e SnoopLigase (50 μΜ cada) foram incubadas em TB 50 mM, pH 7,25 + glicerol a 15% (v/v), durante 5 horas a 4 °C. A biotina-SnoopLigase foi retirada com uso de estreptavidina agarose e a resina foi lavada 5 vezes com 5 volumes de resina de PBS. A eluição foi realizada duas vezes com 10 μΐ de PBS com ou sem 35 μΜ de uma proteína concorrente (peptídeo Etiqueta Snoop ligado de modo covalente ao AffiHER2-Etiqueta Dog), cada um por 5 minutos a temperaturas que variam de 25 a 55 °C. A Figura 9 mostra que a eluição eficiente foi alcançada a temperaturas

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96/114 de 55 °C e a adição de uma proteína concorrente permitiu a eluição eficiente a 45 °C.

Exemplo 8 - A Eluição do produto dependente de aditivos de SnoopLigase [00225] Doze aditivos (mostrados na Figura 10) foram selecionados para determinar se os mesmos tinham capacidade de interromper a interação não-covalente entre SnoopLigase e seu produto de reação.

[00226] A SnoopLigase biotinilada foi incubada com SUMO-Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 a 50 μΜ cada um durante 24 h a 4 °C. A biotina-SnoopLigase foi retirada com estreptavidina agarose e a resina foi lavada 5 vezes com 5 volumes de resina de tampão PT (Tris fosfato 10 mM, pH 6,5) a 25 °C. A eluição foi realizada duas vezes com 4 volumes de resina de tampão PT contendo 16 μΜ de concorrente de proteína AffiHER2-Etiqueta Dog: Etiqueta Snoop (descrito no Exemplo 7) e um dos doze aditivos selecionados indicados na Figura 10, pH 6,5 por 5 minutos a 37 °C. Uma reação de controle não usou aditivo no tampão de eluição.

[00227] A Figura 10 mostra que uma solução que compreende imidazol 1 M e o concorrente de proteína resultou na eluição eficiente do produto de reação (conjugado covalente) da fase sólida.

[00228] O efeito de diferentes concentrações de imidazol na ausência de um concorrente de proteínas foi

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97/114 investigado. Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog foram incubados com biotina-SnoopLigase a 50 μΜ cada em TB 50 mM, pH 7,25 + 15% de glicerol (v/v) por 24 h a 4 °C. A biotina-SnoopLigase foi rebaixada com resina de estreptavidina agarose e esta resina foi lavada 4 vezes com 5 volumes de resina de tampão PT (fosfato de Tris 25 mM, pH 7,0) a 25 °C. A eluição foi realizada com concentrações de imidazol variando de 0,5-4 M, pH 7,0 em tampão PT a 25 °C por 5 min.

[00229] A Figura 11 mostra que uma solução que compreende imidazol 2 M é suficiente para eluir eficientemente o produto de reação da fase sólida sob condições fisiologicamente relevantes, isto é, pH 7,0 e 25 °C. Concentrações notavelmente mais altas de imidazol resultaram na eluição de SnoopLigase e estreptavidina da fase sólida.

Exemplo 9 - Comparação de Etiqueta Snoop (SEQ ID NO: 9) e atividade de Etiqueta SnoopJr (SEQ ID NO: 2) [00230] Um ensaio comparativo foi realizado para medir a diferença de atividade produzida pela modificação da Etiqueta Snoop (SEQ ID NO: 9) sequência para gerar Etiqueta SnoopJr (SEQ ID NO: 2).

[00231] SnoopLigase e SUMO-Etiqueta Dog a 10 μΜ, cada uma, foram incubados com 10 μΜ de Etiqueta Snoop-AffÍHER2 ou Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 em TB 50 mM pH 7,25 + glicerol 15%

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98/114 (v/v) por intervalos de tempo entre 15 minutos a 24 horas a 4 °C.

[00232] A Figura 12 mostra que o Etiqueta SnoopJr reagiu com mais eficiência do que o Etiqueta Snoop em todos os pontos de tempo, conforme medido pela quantidade total de produto de reação formado.

Exemplo 10 - Efeito da chaperona química na atividade de SnoopLigase [00233] Conforme descrito acima, o SpyLigase tem capacidade de ligar seus substratos de etiquetas peptídicas (Etiqueta Spy e Etiqueta K) apenas na presença de um acompanhante químico TMAO (N-óxido de trimetilamina). Consequentemente, a atividade de SnoopLigase na presença de TMAO foi avaliada.

[00234] SnoopLigase, Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog a 10 μΜ cada foram incubados em TB 50 mM, pH 7,25 + glicerol a 15% + uma faixa de concentrações de TMAO (de 0-1,5 M) por 1,5 h a 4 °C. A atividade da SnoopLigase foi avaliada medindo a quantidade de produto de reação formado. A Figura 13 mostra que a adição de TMAO à reação não gerou aprimoramento na atividade da SnoopLigase, que tem capacidade de funcionar na ausência de TMAO.

Exemplo 11 - Avaliação de Etiqueta Dog (SEQ ID NO: 3) Reatividade em um Local Interno de uma proteína de fusão

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99/114 [00235] Para determinar se as etiquetas peptídicas têm capacidade de reagir quando pelo menos uma das etiquetas é localizada dentro de uma proteína (ou seja, em que a etiqueta forma um domínio interno de uma proteína) Etiqueta Dog (SEQ ID NO: 3) foi inserido na proteína de ligação à maltose (MBP) e Etiqueta Halo7. Em particular, a sequência de Etiqueta Dog foi flanqueada de ambos os lados por diferentes comprimentos de sequências de ligação (2 a 8 aminoácidos) e inserida no MBP após o resíduo 317 e antes do resíduo 319, excluindo o resíduo 318. As sequências de ligante que flanqueiam a etiqueta peptídica foram repetições de Gly-Ser. A sequência de Etiqueta Dog flanqueada com 3 repetições Gly-Ser de cada lado foi inserida no Etiqueta Halo7SS entre os resíduos D139 e E140. Etiqueta Halo7SS refere-se a Etiqueta Halo7 modificado para substituir os resíduos de cisteína nas posições 61 e 261 pelos resíduos de serina.

[00236] As proteínas de fusão Etiqueta Dog-MBP, Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SnoopLigase a 10 μΜ foram incubadas em TB 50 mM, pH 7,25 + glicerol a 15% por 4 h a 4 °C e analisadas com uso de SDS-PAGE com coloração de Coomassie. A Figura 14 mostra que todas as quatro construções de inserção de MBP-Etiqueta Dog foram reativas, com a maior reatividade mostrada pelos comprimentos dos ligantes de 6 ou 8 resíduos.

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100/114 [00237] A proteína de fusão Etiqueta Dog-Etiqueta Halo7SS (10 μΜ) foi incubada com Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SnoopLigase (ambos 20 μΜ) em TB 50 mM, pH 7,25 + glicerol a 15% por 0,5 a 48 h a 4 °C e analisada com uso de SDS-PAGE com coloração de Coomassie. A Figura 16 mostra que o construto de inserção Etiqueta Dog-Etiqueta Halo7SS foi reativo, com um rendimento de reação de cerca de 90% após 24 horas.

Exemplo 12 - Condições adicionais para Eluição do produto de reação de uma Fase Sólida [00238] Os exemplos 4, 7 e 8 demonstram que o produto de reação SnoopLigase pode ser eluído de uma fase sólida sob uma variedade de condições. No entanto, a incubação em imidazol a pH 2,0 ou 2 M ou a temperaturas relativamente altas pode não ser adequada para todas as proteínas. Os inventores confirmaram que um conjugado peptídico Etiqueta SnoopJr: Etiqueta Dog tem capacidade de superar o produto de reação SnoopLigase com eficiência equivalente a um tampão de eluição de anticorpos (glicina pH 2,0) e imidazol 2 M (Figura 15) .

[00239] O peptídeo concorrente Etiqueta SnoopJr: Etiqueta Dog foi gerado por meio de protease SUMO-Etiqueta Dog e SUMO. Os peptídeos SUMO-Etiqueta Dog e Etiqueta SnoopJr foram conjugados de modo covalente com uso de SnoopLigase imobilizado em uma fase sólida por meio de Etiqueta Halo7.

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O produto de reação (SUMO-Etiqueta Dog: Etiqueta SnoopJr) foi eluido com uso de imidazol conforme descrito acima. Ο produto de reação foi então incubado com SUMO-protease Ulpl, que cliva o peptídeo Etiqueta Dog: Etigueta SnoopJr de SUMO. A incubação do produto de reação com Ni-NTA esgotou as proteínas SUMO e Ulpl marcadas com etiqueta com His, produzindo um peptídeo Etiqueta Dog: Etiqueta SnoopJr purificado.

[00240] O peptídeo concorrente permitiu a eluição limpa do produto de reação SnoopLigase (SUMO-Etiqueta Dog: Etiqueta SnoopJrAffiHER2) de biotina-SnoopLigase imobilizada em uma coluna estreptavidina-agarose (Figura 15) sob condições fisiológicas, isto é, 37 °C. A purificação em fase sólida eliminou a necessidade de subsequente separação do produto de reação da SnoopLigase e dos materiais de partida não reagidos por cromatografia de exclusão por tamanho, que consome tempo e muitas vezes leva a perdas substanciais.

Exemplo 13 - Avaliação de Etiqueta Dog (SEQ ID NO: 3) e atividade de Etiqueta SnoopJr (SEQ ID NO: 2) Reatividade como fusões de N ou C-terminais em uma variedade de proteínas [00241] Para validar que as etiquetas peptídicas podem ser usadas como ligantes universais, as etiquetas foram fundidas com várias proteínas (AffiHER2, SUMO, mCloverS, MBP, mEGFP e Etiqueta Halo7SS) no N-terminal ou C e testadas em combinações. A proteína ligada a Etiqueta Dog (10 μΜ

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102/114 [Tabela 2] ou 20 μΜ [Tabela 3]) foi incubada com a proteína ligada a Etiqueta SnoopJr (20 μΜ [Tabela 2] ou 10 μΜ [Tabela 3]) e SnoopLigase (20 μΜ) em TB 50 mM, pH 7,25 + glicerol a 15%, durante 24 h a 4 °C e analisada com uso de SDS-PAGE com coloração de Coomassie. As tabelas 2 e 3 mostram a porcenetiquetaem de parceiro de Etiqueta Dog e parceiro de Etiqueta SnoopJr que reagiram, respectivamente. N/A referese a reações nas quais a sobreposição de bandas impediu a quantificação. A ordem dos componentes listados abaixo indicou se a etiqueta era N-terminal ou C-terminal, ou seja, AffiHER2-Etiqueta Dog refere-se a Etiqueta Dog vinculada ao C-terminal do AffiHER2, Etiqueta Dog-mClover3 refere-se a Etiqueta Dog vinculado ao N-terminal do mClover3.

[00242] Os resultados mostram que a maioria das combinações teve um rendimento de reação superior a 95%, demonstrando assim que as etiquetas peptídicas reagem eficientemente quando localizados nos N- ou C- terminais de diversas proteínas.

Tabela 2 - Porcenetiquetaem de parceiro de Etiqueta Dog reagido

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Parceiro Etiqueta Dog 10 μΜ
Parceiro Etiqueta SnoopJr 20 μΜ		AffiHER2- Etiqueta Dog	SUMO- Etiqueta Dog	Etiqueta Dog- mClover3	MBP- Etiqueta Dog
Etiqueta SnoopJr- AffiHER2	99,9±0,02	99,9±0,01	94,0±0,3	98,4±0 0,2
Etiqueta SnoopJr-mEGFP	99,9±0,04	99,1±1,3	82,3±2,1	87,8±0,1
Etiqueta HaloVSS- Etiqueta SnoopJr	99,95±0,03	99,7±0,5	96,l±0,5	97,0±l,0
MBP-Etiqueta SnoopJr	99,95±0,03	99,0±0,9	85,4±0,7	95,0±4,8

Tabela 3 - Porcenetiquetaem de parceiros Etiqueta

SnoopJr reagidos

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Parceiro Etiqueta Dog 20 μΜ
Parceiro Etiqueta SnoopJr 10 μΜ		Af fiHER2- Etiqueta Dog	SUMO- Etiqueta Dog	Etiqueta Dog- mClover3	MBP- Etiqueta Dog
Etiqueta SnoopJr- Af fiHER2	99,95±0,04	99,9±0,1	99,8±0,2	99,95±0,05
Etiqueta SnoopJr- mEGFP	99,9±0,05	99,95±0,03	89,4±3,4	99,7±0,3
Etiqueta Halo7SS- Etiqueta SnoopJr	99,3±0,03	99,0±0,1	98,0±0,2	N/A
MBP- Etiqueta SnoopJr	93,3±0,3	99,l±0,2	79,5±1,6	N/A

Exemplo 14 - A reatividade da SnoopLigase é tolerante aos agentes de liofilização e redução [00243] A SnoopLigase foi liofilizada e armazenada por 0 a 120 dias a 37 °C. Em vários momentos, amostras de SnoopLigase liofilizada foram reconstituídas em tampão de reação com Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog (10

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105/114 μΜ cada) por 2 horas a 4 °C em TB pH 7,25 com glicerol a 15% (v/v). A Figura 17A mostra a formação do produto em relação à amostra de controle não liofilizada e demonstra que quase toda a atividade foi mantida após a reconstituição.

[00244] Visto que não há cisterna na SnoopLigase ou nas etiquetas peptidicas, foi levantada a hipótese de que a reação não seria afetada pelos agentes redutores. Isso foi confirmado executando a reação descrita acima com ou com agente redutor: B-mercaptoetanol 100 mM (ME) ou ditiotreitol 20 mM (DTT) . A Figura 17B mostra a formação do produto em relação a uma reação de controle sem agente redutor e demonstra que os agentes redutores não afetam a atividade da SnoopLigase.

Métodos

Clonagem [00245] Os construtos de plasmideo para expressão de proteína foram clonados com uso de procedimentos padrão de PCR e monetiquetaem isotérmica de Gibson. As sequências nucleotídicas de inserções de gene foram validadas pelo sequenciamento de Sanger. Os construtos para expressão em E. coli continham um N-terminal de Hisg-etiqueta seguido de um ligante flexível rico em GS.

[00246] A sequência de RrgA é do código de identificação do código ID de banco de dados de proteínas 2WW8 .

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Expressão e Purificação de Proteína [00247] Os plasmideos de expressão foram transformados em E. coll BL21 (DE3) -RIPL (Agilent) e as células foram cultivadas em placas LB-Agar contendo 50 pg/ml de canamicina por 16 horas a 37 °C. As colônias individuais foram cultivadas em 2 χ YT com 0,8% (p/v) de glicose, 50 pg/ml de canamicina durante 16 horas a 37 °C, 200 rpm. As culturas iniciais foram diluídas 1:100 em 1 L2*YT com 0,8% (p/v) de glicose, 50 pg/ml de canamicina e crescidas a 37 °C, 200 rpm até atingir A goo de 0,5. As culturas foram induzidas com IPTG 0,42 mM e crescidas por 4 h a 30 °C, 200 rpm antes da coleta. As proteínas foram purificadas com uso de métodos de Ni-NTA (Qiagen) padrão e dialisadas três vezes 1:1.000. Os tampões para diálise foram TB (50 mM Tris*HCl, pH ajustado com ácido bórico) pH 8,0 para ΑΡ-SnoopLigase (em que AP é um substrato peptídico para biotinilação de BirA) e Etiqueta SnoopJr-MBP, 50 mM de ácido bórico pH 10,0 para RrgALigase (e mutantes de ponto), SnoopLigase, Etiqueta Snoop-AffÍHER2, Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog.

Reconstituição da SnoopLigase In Vitro [00248] Para avaliar a formação da ligação isopeptidica entre Etiqueta SnoopJr e Etiqueta Dog mediada por SnoopLigase, as proteínas foram incubadas a 10 μΜ cada uma em TB pH 7,25 + 15% (v/v) de glicerol a 4 °C por 2 h, a

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107/114 menos que indicado de outro modo. Para finalizar a reação, a tampão de carga SDS 6 χ (0,23 M Tris-HC1, pH 6.8, glicerol a 24% (v/v), azul de bromofenol 120 μΜ, SDS 0,23 M) foi adicionado a uma concentração final de 1χ. As amostras foram aquecidas por 3 minutos a 95 °C e deixadas esfriar até 25 °C por 10 minutos antes do carregamento.

Identificação de mutações no ponto SnoopLigase

[00249]	Para identificar resíduos	para	substituição
de prolina, a	análise de Ramachandran	dos	resíduos de
aminoácidos em	RrgA (código PDB 2WW8) foi	realizada com uso
de MolProbity.	Resíduos com ângulos φ de	-70	° a -50 ° e

localização nas regiões de ciclo foram considerados para substituição de prolina. Para usar o servidor PROSS, um alinhamento de múltiplas sequências (MSA) separado foi gerado. As sequências homólogas para os resíduos RrgA 734 a 860 foram coletadas com uso da Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico Iterative Específico de Posição (PSI-BLAST) . Um MSA foi gerado com uso de Comparação de Múltiplas Sequências por Expectativa de Log (MUSCLE). Ο Banco de Dados de Cluster em Alta Identidade com Tolerância (CD-HIT) foi usado para minimizar a redundância de sequência e ajustar o tamanho do conjunto de dados. O MSA modificado e os resíduos 734 a 860 da estrutura 2WW8 do RrgA PDB foram alimentados no servidor PROSS. As substituições de aminoácidos sugeridas foram revisadas manualmente.

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Biotinilação de SnoopLigase [00250] A Biotinilação de ΑΡ-SnoopLigase foi realizada por incubação de 220 μΜ de ΑΡ-SnoopLigase com 14,7 uM de GST-BirA, 0,5 mM de MgCl 2, D-biotina 3,3 e 1 mM de ATP em TB, pH 8,0 durante 1 h a 25 °C. A mesma quantidade de GST-BirA e D-biotina foi adicionada novamente e a mistura foi incubada por 1 h a 25 °C. Para esgotar o GST-BirA, a amostra foi incubada com 0,1 ml de resina glutationa-HiCap por 30 min a 25 °C em um rotor de amostra e centrifugada por 30 s a 17.000 g. O sobrenadante foi coletado e dializado três vezes 1: 1000 em TB pH 8,0.

Purificação do produto de reação de SnoopLigase [00251] SUMO-Etiqueta Dog, Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SnoopLigase biotinilada a 10 μΜ, cada um em TB pH 7,25 com 15% (v/v) de glicerol em um volume total de 200 μΐ foram incubados por 20 h a 4 °C. Para capturar a SnoopLigase, foram adicionados 25 μΐ de HiCap Streptavidin Agarose (Thermo Fisher, 20357) lavado e equilibrado e as amostras foram incubadas por 30 minutos a 25 °C em um rotor de tubo. A resina foi coletada em uma coluna de poli-prep de 1 ml (BioRad) e centrifugada por 1 min a 300 g. Após lavagem da resina duas vezes com 125 μΐ de glicina 50 mM pH 3,0 com NaCl 300 mM e três vezes com 125 μΐ de glicina 50 mM pH 3,0, uma rotação extra por 1 min a 500 g garantiu a remoção do excesso de líquido da resina. Para eluir o produto de reação

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SnoopLigase, a resina foi incubada com 25 μΐ de tampão de eluição de anticorpos (glicina 50 mM pH 2,0) por 1 min, antes de girar o eluato em um tubo contendo 2,5 μΐ de 1 M de Tris*HCl por 1 min a 300 g. A eluição foi repetida mais duas vezes.

Espectrometria de massa [00252] SUMO-Etiqueta Dog a 75 μΜ e peptídeo sintetizado em fase sólida Etiqueta Snoop (GKLGDIEFIKVNKGY, SEQ ID NO: 11 Insight Biotechnology com 95% de pureza) a 300 μΜ foram incubados com SnoopLigase biotinilada 75 μΜ em TB pH 7,25 e glicerol a 15% (v/ em um volume total de 200 μΐ por 36 h a 4 °C. O produto de reação foi purificado como acima, mas com 100 μΐ de HiCap Streptavidin Agarose e 500 μΐ de tampão de lavagem. A análise foi realizada com uso de um espectrômetro de massa de ionização por eletropulverização por tempo de voo Micromass LCT (Micromass). O perfil de massa molecular foi criado a partir do espectro m/z com uso do software V4.00.00 (Waters) com um algoritmo de entropia máxima. As massas moleculares de proteínas foram previstas pelo ExPASy ProtParam, com base na sequência de aminoácidos sem fMet N-terminal e perda de amônia (17,0 Da) durante a formação da ligação isopeptídica.

Ciclos de reação de ligação em fase sólida [00253] A SnoopLigase biotinilada a 50 μΜ em TB pH 8,0 foi acoplada a 10 μΐ de HiCap Streptavidin Agarose

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110/114 (Thermo Fisher) lavada e equilibrada em um volume total de 50 μΐ por 30 min a 25 °C em um rotor de tubo. A resina foi coletada em uma coluna de poli-prep de 1 ml (Bio-Rad) e centrifugada por 1 min a 300 g, seguida de cinco lavagens com 100 μΐ de TB pH 8,0. A reação foi iniciada pela adição de 50 μΐ de mistura de reação (100 μΜ de SUMO-Etiqueta Dog e 100 μΜ de Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 em TB pH 7,25 com 15% de glicerol (v/) e a amostra foi incubada por 3 h a 25 °C um Thermomixer a 800 rpm. A mistura de reação foi centrifugada por 1 min a 300 g e a resina foi lavada duas vezes com 50 μΐ de glicina 50 mM pH 3,0 com NaCl 300 mM e três vezes com 50 μΐ de glicina 50 mM pH 3,0. Uma rotação extra por 1 min a 500 g garantiu a remoção do excesso de líquido da resina. Para eluir o produto de reação SnoopLigase, a resina foi incubada com 10 μΐ de tampão de eluição de anticorpos por 1 min, antes de girar o eluato em um tubo contendo 1 μΐ de 1 M de Tris*HCl por 1 min a 300 g. A eluição foi repetida mais três vezes. A resina foi lavada duas vezes com 100 μΐ, 50 mM de glicina, pH 2,0 e duas vezes com 100 μΐ de TB, pH 7,25. O ciclo da reação foi repetido mais três vezes.

Teste de termoestabilidade da SnoopLigase [00254] A SnoopLigase a 12,5 μΜ em TB, pH 7,25 com glicerol a 15% (v/v) foi incubada à temperatura indicada por 15 minutos e resfriada a 4^o C por 5 minutos. A SnoopLigase

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111/114 tratada termicamente foi usada para ligação de Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog.

SDS-PAGE e quantificação de Reação [00255] Géis foram corados com a mancha InstantBlue Coomassie (Expedeon), descolorados com água MilliQ e imageados com uso de um gerador de imagens ChemiDoc XRS com o software ImageLab (Bio-Rad). O ImageLab também foi usado para quantificação de banda. A porcenetiquetaem de etiquetas reagidas foi calculada a partir das intensidades da banda como [banda do produto]/([banda do produto] + [faixas restantes do substrato]). A reatividade relativa foi calculada como porcenetiquetaem de etiquetas reagidas ([amostra]/[controle]).

Produção de Etiqueta Dog: Etiqueta SnoopJr Concorrente [00256] Uma quantidade de 4 ml de Etiqueta Halo7SnoopLigase a 20 μΜ em TB 50 mM, pH 7,25 com Tween 20 a 0,01% (v/v) foi incubada com 500 μΐ de resina HaloLink empacotada (Promega) por 2 h a 25 °C em um rotor de tubo. A amostra foi dividida em cinco colunas de poliprep de 1 ml em equilíbrio de tampão (Bio-Rad) e centrifugada por 1 minuto a 300 g a 25 °C. Cada amostra de resina foi lavada duas vezes com 500 μΐ de TB 50 mM, pH 7,25 com Tween 20 a 0,01% (v/. As colunas foram tapadas e 200 μΐ de tampão de reação [50 μΜ de SUMOEtiqueta Dog e 75 μΜ de peptídeo Etiqueta SnoopJr em TB pH 7,25 com 15% (v/ de glicerol] foram adicionadas a cada

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112/114 coluna. 0 peptídeo Etiqueta SnoopJr foi sintetizado em fase sólida por Activotec com >95% de pureza. Após incubação por 4 h a 25 °C a 300 rpm em um Thermomixer, as amostras foram centrifugadas por 1 min a 300 g a 25 °C e cada amostra de resina foi lavada cinco vezes com 640 μΐ de tris-fosfato pH 7,0 com imidazol 0,5 M e 0,01% (v/v) de Tween 20. Para eluir o produto de reação SnoopLigase, cada amostra de resina foi incubada com 100 μΐ de Tris-fosfato com imidazol 2,5 M, pH 7,0 e 0,01% (v/v) de Tween 20 por 2 min a 25 °C em um Thermomixer a 800 rpm, antes de girar o eluato em um tubo por 1 min a 300 g, a 25 °C. A eluição foi repetida mais duas vezes, e cada resina foi lavada duas vezes com 500 μΐ de TB pH 7,25 com 0,01% (v/v) de Tween 20. Para iniciar o próximo ciclo de reação, foi adicionada nova mistura de reação à resina e o procedimento de reação e purificação foi repetido. Seis ciclos de reação foram realizados no total. Todas as eluições foram reunidas e dialisadas em TB pH 7,5, e SUMOEtiqueta Dog:Etiqueta SnoopJr foi concentrado a 118 μΜ com uso de um filtro de rotação MWCO de 10 kDa (Sartorius) . A SUMO protease Ulpl foi adicionada na proporção molar de 1:50 a uma concentração final de 2,4 μΜ, seguida de uma incubação de 45 minutos a 25 °C. Após a reação, Tween 20 foi adicionado a uma concentração final de 0,01% (v/v). Para esgotar as proteínas marcadas com His (SUMO e Ulpl), 600 μΐ da amostra foram incubados com 150 μΐ de agarose Ni-NTA (Qiagen) por 1

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113/114 h a 25 °C em urn rotor de tubo, a amostra foi centrifugada por 1 min a 16.900 g a 25 °C, e o sobrenadante contendo o conjugado Etiqueta Dog: Etiqueta SnoopJr foi coletado. A concentração foi calculada com uso do coeficiente de extinção OD280 da ExPASy ProtParam.

Remoção de SnoopLigase por eluição de peptídeo [00257] SUMO-Etiqueta Dog, Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e biotina-SnoopLigase a 10 μΜ cada em TB pH 7,25 com 15% (v/ de glicerol em um volume total de 150 μΐ foram incubados por 16 h a 4 °C. Foi adicionado Tween 20 a uma concentração final de 0,01% (v/v). Para capturar biotina-SnoopLigase, foram adicionados 15 μΐ de HiCapstreptavidina-agarose lavada e equilibrada (Thermo Fisher), e a amostra foi incubada por 30 min a 25 °C em um rotor de tubo. A resina foi coletada em um tubo de PCR (StarLab) e centrifugada por 1 min a 300 g a 25 °C, seguida de cinco lavagens com 75 μΐ de Tris-fosfato pH 7,0 com Tween 20 a 0,01% (v/v). Foi adicionada uma quantidade de 30 μΐ de Etiqueta Dog: Etiqueta SnoopJr em TB pH 7,5 com Tween 20 a 0,01% (v/v), e a amostra foi incubada por 4 h a 37 °C a 800 rpm em um Thermomixer. A amostra foi centrifugada por 1 minuto a 16.900 g e o sobrenadante foi coletado.

Estabilidade de liofilização [00258] Alíquotas de 30 μΐ de SnoopLigase a 10 μΜ em TB, pH 7,25 foram preparadas em tubos de 100 μΐ de PCR de parede fina (StarLab). As amostras foram congeladas

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114/114 instantaneamente em banho de gelo etanol seco por 10 min e liofilizadas com uso de um liofilizador BenchTop 2K (VirTis) por 48 h a 0,000014 Mpa (0,14 mbar) e -72,5 °C. As amostras liofilizadas foram armazenadas a 37 °C pelo tempo indicado em um frasco de cintilação de vidro velado com Parafilm (Sigma-Aldrich) em um leito de Drierite (Sigma-Aldrich) para minimizar a hidratação de amostra. As amostras foram reconstituídas em tampão de reação e a ação de Etiqueta SnoopJr-AffiHER2 e SUMO-Etiqueta Dog foi realizada por 2 h a 4 °C, seguida por SDS-PAGE, coloração com Coomassie e densitometria.

Claims

REIVINDICAÇÕES

(1) conjugar duas moléculas ou componentes através de uma ligação isopeptídica; ou (2) produzir um complexo entre três moléculas ou componentes, em que duas das moléculas ou componentes no complexo são conjugadas por meio de uma ligação isopeptídica,

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1) prolina na posição 66;

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1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende:

a) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1; ou

b) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e em que a referida sequência de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 e um ou mais dentre os seguintes:

prolina na posição

66;

prolina na posição

95;

glicina na posição valina na posição 97, em que os resíduos de aminoácidos especificados estão em posições equivalentes às posições na SEQ ID NO: 1 e em que o referido polipeptídeo tem capacidade de promover a formação de uma ligação isopeptídica entre o resíduo de lisina na posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição 17 da SEQ ID NO: 3.
2) prolina na posição 95;

2/11 de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 e dois ou mais dentre os seguintes:

prolina na posição

66;

prolina na posição

95;

glicina na posição valina na posição 97.

Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende uma sequencia de aminoácidos com pelo de identidade de sequência com uma sequencia conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e em que a referida sequencia de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 ou mais dentre os seguintes:

prolina na posição

66;

prolina na posição

95;

glicina na posição valina na posição 97.

Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e em que a referida sequência de aminoácidos compreende um ácido glutâmico na posição 61 e todas as seguintes:

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 e em que a referida sequência

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3) glicina na posição 96; e

3/11
4/11 um polipeptídeo ou etiqueta peptídica como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8.

4) valina na posição 97.
5/11 em que as referidas moléculas ou componentes conjugados através de uma ligação isopeptídica compreendem:

a) uma primeira molécula ou componente que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

(i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2; ou (ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, em que a referida sequência de aminoácidos compreende um resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2; e

b) uma segunda molécula que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

(i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3; ou (ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a referida sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, e

em que a terceira molécula ou componente no complexo em (2) compreende um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 7 ou 8.

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma treonina na posição 100.
6/11 pelo fato de que a referida primeira molécula compreende uma etiqueta peptídica, conforme definido em a) conjugado a uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo de ligante de metal, polissacarídeo, nanopartícuia, nanotubo, polímero, célula, vírus, partícula semelhante a vírus ou uma combinação dos mesmos.

6. Etiqueta peptidica caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 3.
7/11 aminoácidos compreende um resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2;

b) fornecer uma segunda molécula ou componente que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

(i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3; ou (ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a referida sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3;

c) contato das referidas primeira e segunda moléculas ou componentes com um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7, de preferência em que o referido polipeptídeo é imobilizado em um substrato sólido, sob condições que permitem a formação de uma ligação isopeptidica entre o resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2 e o resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, conjugando assim a referida primeira molécula à referida segunda molécula através de um isopeptideo para formar um complexo.

7. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou etiqueta peptidica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo ou etiqueta peptidica é conjugado a uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo ligante metálico, polissacarídeo, nanopartícuias, nanotubos, polímeros, células, vírus, partículas semelhantes a vírus ou uma

combinação dos mesmos. 8. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou etiqueta peptidica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou etiqueta peptidica está imobilizado em um substrato sólido
8/11 sólido, em que a referida etapa compreende o contato do referido complexo com um tampão de pH baixo, preferencialmente com um pH de 4,0 ou menos.
9/11

9. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica

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10/11 (i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2;

(ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, em que a referida sequência de aminoácidos compreende um resíduo de lisina na posição equivalente à posição 9 da SEQ ID NO: 2, (iii) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3; ou (iv) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3, em que a referida sequência de aminoácidos compreende um resíduo de asparagina na posição equivalente à posição 17 da SEQ ID NO: 3, em que a referida etiqueta peptídica é conjugado ou fundido com uma molécula ou componente; e/ou (c) uma molécula de ácido nucleico, particularmente um vetor, que codifica uma peptase ligase conforme definido em (a) ; e (d) uma molécula de ácido nucleico, particularmente um vetor, que codifica uma etiqueta peptídica conforme definida em (b) .

10. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 9.
11/11 em que a segunda etiqueta peptídica tem capacidade de formar uma ligação isopeptídica com a etiqueta peptídica em (b) quando em contato com uma peptase ligase de (a) sob condições adequadas para a formação de uma ligação isopeptídica.

11. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 9 ou o vetor como definido na reivindicação 10.
12. Processo para produzir ou expressar o polipeptídeo e/ou etiqueta peptídica, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) transformar ou transfectar uma célula hospedeira com um vetor conforme definido na reivindicação 10;

b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo e/ou etiqueta peptídica; e opcionalmente

c) isolar o polipeptídeo e/ou a etiqueta peptídica.
13. Uso de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que é para:
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado

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15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a referida segunda molécula compreende uma etiqueta peptídica, conforme definido em b), conjugada com uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo de ligante de metal, polissacarídeo, nanopartícuia, nanotubo, polímero, célula, vírus, partícula semelhante a vírus ou uma combinação dos mesmos.
16. Processo para conjugar duas moléculas ou componentes por meio de uma ligação isopeptídica caracterizado pelo fato de que compreende:

a) fornecer uma primeira molécula ou componente que compreende uma etiqueta peptídica que compreende:

(i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2; ou (ii) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, em que a referida sequência de

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17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que quando o polipeptídeo é imobilizado em um substrato sólido, o processo compreende uma etapa adicional de separação do complexo do substrato

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18. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que quando o polipeptídeo é imobilizado em um substrato sólido, o processo compreende uma etapa adicional de separação do complexo do substrato sólido, em que a referida etapa compreende o contato do referido complexo com uma solução que compreende imidazol, preferencialmente a uma concentração de pelo menos 1 M.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que, quando o polipeptídeo é imobilizado em um substrato sólido, o processo compreende uma etapa adicional de separação do complexo do substrato sólido, em que a referida etapa compreende o contato do referido complexo que compreende um produto que compete pela reação compreendendo um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2 ligado a um peptídeo com uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3.
20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de lavagem do substrato sólido com um tampão antes de separar o referido complexo do substrato sólido.

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21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de que a referida primeira molécula compreende uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme definido em a) conjugada a uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo de ligante de metal, polissacarídeo, nanopartícuia, nanotubo, polímero, célula, vírus, partícula semelhante a vírus ou uma combinação dos mesmos.
22. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de que a referida segunda molécula compreende uma etiqueta peptídica que compreende uma sequência de aminoácidos conforme definido em b) conjugada com uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo de ligante de metal, polissacarídeo, nanopartícuia, nanotubo, polímero, célula, vírus, partícula semelhante a vírus ou uma combinação dos mesmos.
23. Kit, preferencialmente para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 15, ou no processo como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o referido kit compreende:

(a) uma peptase ligase como descrita em em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 7 ou 8; e (b) uma etiqueta peptídica que compreende:

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24. Kit, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma segunda etiqueta peptídica conjugada ou fundida a uma molécula ou componente,

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25. Kit, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a molécula ou componente é uma molécula de ácido nucleico, proteína, peptídeo, composto orgânico de molécula pequena, fluoróforo, complexo de ligante de metal, polissacarídeo, nanopartícuia, nanotubo, polímero, célula, vírus, partícula semelhante a vírus ou uma combinação dos mesmos.