ES2900612T3

ES2900612T3 - Péptido ligasa y su uso

Info

Publication number: ES2900612T3
Application number: ES18719246T
Authority: ES
Inventors: Mark Howarth; Can M Buldun
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2022-03-17
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: US10889622B2; BR112019021009A2; AU2018251237A1; WO2018189517A1; DK3610005T3; CN110582566B; EP3610005A1; EP3610005B1; JP2020516314A; CN110582566A; US20200115422A1; AU2018251237B2; JP7075678B2; CA3059132A1; GB201705750D0; KR20190137820A

Abstract

Un polipéptido que comprende: a) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1; o b) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un ácido glutámico en la posición 61 y uno o más de los siguientes: 1) prolina en la posición 66; 2) prolina en la posición 95; 3) glicina en la posición 96; y 4) valina en la posición 97, en el que los residuos de aminoácidos especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en la SEQ ID NO: 1 y en la que dicho polipéptido es capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre el residuo de lisina en la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición 17 de la SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido ligasa y su uso

La presente invención se refiere a un polipéptido que es capaz de promover la conjugación covalente de dos marcadores o enlazadores peptídicos. En particular, el polipéptido de la invención es capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre dos marcadores o enlazadores peptídicos específicos, es decir, el polipéptido de la invención puede verse como un péptido ligasa. La invención también proporciona etiquetas o enlazadores peptídicos que pueden conjugarse (es decir, unirse, acoplarse o enlazarse covalentemente mediante un enlace isopeptídico) de forma eficaz mediante el péptido ligasa de la invención. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican dicho polipéptido (péptido ligasa) y etiquetas peptídicas, vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico y células huésped que comprenden dichos vectores y moléculas de ácido nucleico. También se proporciona un kit que comprende dichas etiquetas peptídicas, polipéptidos y/o moléculas/vectores de ácido nucleico. También se proporcionan un método para producir dicho polipéptido (péptido ligasa) y/o etiquetas peptídicas y los usos de las etiquetas polipeptídicas y peptídicas de la invención.

Los eventos biológicos generalmente dependen de la actividad cooperativa de múltiples proteínas y la disposición precisa de las proteínas en complejos influye y determina su función. Por tanto, la capacidad de organizar proteínas individuales de forma compleja de manera controlada representa una herramienta útil para caracterizar las funciones de las proteínas. Además, la conjugación de múltiples proteínas para formar una denominada "proteína de fusión" puede dar como resultado moléculas con características útiles. Por ejemplo, agrupar un solo tipo de proteína a menudo mejora en gran medida las señales biológicas, por ejemplo, las estructuras de antígenos repetidos en las vacunas. La agrupación de proteínas con diferentes actividades también puede resultar en complejos con actividades mejoradas, por ejemplo, canalización del sustrato por enzimas.

Las etiquetas peptídicas son herramientas convenientes para el análisis y la modificación de proteínas porque su pequeño tamaño minimiza la perturbación de la función de las proteínas. Las etiquetas peptídicas son fáciles de codificar genéticamente y su pequeño tamaño reduce la interferencia con otras interacciones, el costo de la biosíntesis y la introducción de inmunogenicidad. Sin embargo, las interacciones entre las etiquetas peptídicas rara vez son de alta afinidad, lo que limita su utilidad en la formación de complejos estables.

Las proteínas que son capaces de formar enlaces isopeptídicos espontáneos se han usado ventajosamente para desarrollar pares de etiqueta peptídica/compañero de unión que se unen covalentemente entre sí y proporcionan interacciones irreversibles (véanse, por ejemplo, los documentos WO2011/098772 y WO2016/193746). A este respecto, las proteínas que son capaces de formar enlaces isopeptídicos espontáneos pueden expresarse como fragmentos separados, para obtener una etiqueta peptídica y un compañero de unión para la etiqueta peptídica, en los que los dos fragmentos son capaces de reconstituirse covalentemente por formación de enlaces isopeptídicos. El enlace isopeptídico formado por la etiqueta peptídica y los pares de compañeros de unión es estable en condiciones en las que las interacciones no covalentes se disociarían rápidamente, por ejemplo, durante largos períodos de tiempo (por ejemplo, semanas), a alta temperatura (hasta al menos 95 °C), con mucha fuerza o con un tratamiento químico severo (por ejemplo, pH 2-11, disolventes orgánicos, detergentes o desnaturalizantes).

Los enlaces isopeptídicos son enlaces amida formados entre grupos carboxilo/carboxamida y amino, en los que al menos uno de los grupos carboxilo o amino está fuera de la cadena principal de la proteína (la cadena principal de la proteína). Dichos enlaces son químicamente irreversibles en condiciones biológicas típicas y son resistentes a la mayoría de las proteasas. Como los enlaces isopeptídicos son de naturaleza covalente, dan como resultado las interacciones proteicas medidas más fuertes.

En resumen, un par de etiqueta peptídica/compañero de unión se puede derivar de una proteína capaz de formar espontáneamente un enlace isopeptídico (una proteína isopeptídica), en el que los dominios de la proteína se expresan por separado para producir una etiqueta peptídica que comprende uno de los residuos implicados en el enlace isopeptídico (por ejemplo, una lisina) y un compañero de unión peptídica (o "Catcher") que comprende el otro residuo implicado en el enlace isopeptídico (por ejemplo, una asparagina o aspartato) y al menos otro residuo necesario para formar el enlace isopeptídico (por ejemplo, un glutamato). La mezcla de la etiqueta peptídica y el compañero de unión dan como resultado la formación espontánea de un enlace isopeptídico entre la etiqueta y el compañero de unión. Por tanto, al fusionar por separado la etiqueta peptídica y el compañero de unión a diferentes moléculas, por ejemplo, proteínas, es posible unir covalentemente dichas moléculas a través de un enlace isopeptídico formado entre la etiqueta peptídica y el compañero de unión.

Mientras que los pares de etiqueta peptídica/compañero de unión derivados de proteínas isopeptídicas (también conocidos como sistemas Tag/Catcher, por ejemplo, SpyTag y SpyCatcher) han encontrado diversos usos en todo el mundo, su utilidad se ha visto limitada por el tamaño de los compañeros de unión ("Catchers") como compañeros de fusión. Los compañeros de unión de etiquetas peptídicas ("Catchers") derivados de proteínas isopeptídicas comprenden típicamente más de 80 aminoácidos, tal como al menos 90 o 100 aminoácidos, lo que da como resultado una serie de problemas.

Por ejemplo, se ha demostrado que los sistemas Tag/Catcher encuentran utilidad para decorar partículas similares a virus con antígenos (véase, por ejemplo, Brune et al. 2016, Scientific Reports, 6: 19234), en los que una partícula similar a virus se fusiona a un Catcher para producir una plataforma de sistema de vacuna que se puede utilizar para presentar cualquier antígeno fusionado a la etiqueta. Sin embargo, el gran tamaño de los "Catchers" significa que es más probable que tengan una alta inmunogenicidad, lo que puede perjudicar el uso de los sistemas Tag/Catcher en la producción de plataformas de sistemas de vacunas. Las vacunas producidas usando tales plataformas pueden resultar en la inducción de anticuerpos o células T contra el Catcher en lugar del antígeno diana. Tal inmunogenicidad también puede prohibir el uso de la misma plataforma de sistema de vacuna para la vacunación secuencial contra dos enfermedades separadas.

El gran tamaño de los receptores en los sistemas Tag/Catcher también imparte una limitación en su ubicación en una molécula de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión. Los Catchers generalmente necesitan fusionarse en los extremos de las proteínas para evitar interferencias con el plegamiento de las proteínas. Además, los Catchers parecen proteínas parcialmente plegadas y, por lo tanto, pueden reducir los rendimientos de expresión.

Otra limitación importante de los sistemas Tag/Catcher causada por el tamaño del Catcher se relaciona con la inducibilidad de la reacción entre la Tag y el Catcher. Normalmente, las fusiones de proteínas Tag y Catcher reaccionan espontáneamente cuando se expresan en células y, en algunas circunstancias, sería ventajoso evitar o controlar tales reacciones.

Por consiguiente, existe el deseo de desarrollar sistemas de etiquetas peptídicas con las propiedades ventajosas asociadas con los sistemas Tag/Catcher derivados de proteínas isopeptídicas, es decir, etiquetas peptídicas que formen un enlace covalente estable y robusto como se discutió anteriormente, mientras se evitan los problemas asociados con el gran tamaño de los compañeros de unión de péptidos (Catchers).

Se ha descubierto que es posible expresar los dominios de una proteína isopeptídica que comprende los residuos implicados en la formación de enlaces isopeptídicos por separado, es decir, como tres fragmentos separados, es decir, dos péptidos y un polipéptido (véase, por ejemplo, Fierer et al. 2014, PNAS E1176-E1181). En resumen, una etiqueta peptídica (KTag) comprende uno de los residuos involucrados en el enlace isopeptídico (por ejemplo, una lisina), una segunda etiqueta peptídica (SpyTag) comprende el otro residuo involucrado en el enlace isopeptídico (por ejemplo, un aspartato) y un polipéptido (SpyLigase) comprende el residuo involucrado en la mediación de la formación del enlace isopeptídico (por ejemplo, un glutamato). La mezcla de los tres fragmentos, es decir, tanto los péptidos como el polipéptido, da como resultado la formación de un enlace isopeptídico entre los dos péptidos que comprenden los residuos que reaccionan para formar el enlace isopeptídico, es decir, SpyTag y KTag. Por tanto, el polipéptido (SpyLigase) media la conjugación de las etiquetas peptídicas pero no forma parte de la estructura resultante, es decir, el polipéptido no está unido covalentemente a las etiquetas peptídicas. Como tal, el polipéptido puede verse como una proteína ligasa o péptido ligasa.

El sistema SpyLigase descrito anteriormente es, en teoría, particularmente útil ya que minimiza el tamaño de las etiquetas peptídicas que necesitan fusionarse con la molécula, por ejemplo, proteína de interés, reduciendo así la posibilidad de interacciones no deseadas causadas por la adición del compañero de unión de la etiqueta peptídica (Catcher) discutida anteriormente, por ejemplo, plegado incorrecto. Sin embargo, el sistema SpyLigase muestra un bajo rendimiento de conjugación entre péptidos asociados (típicamente 50% o menos) y tiene baja actividad por encima de 4 °C. Además, la utilidad de SpyLigase está limitada por su incapacidad para funcionar en una amplia gama de condiciones, por ejemplo, tampones, y la velocidad de reacción lenta, típicamente aproximadamente 24 horas (Fierer et al. 2014, citado anteriormente).

Los presentes inventores han desarrollado un sistema péptido ligasa, es decir, un péptido ligasa y un par de etiquetas peptídicas, a partir del dominio terminal C de la adhesina de Streptococcus pneumoniae, RrgA (SEQ ID NO: 4), que naturalmente contiene un enlace isopeptídico espontaneo entre lisina y asparagina, promovido por un ácido glutámico opuesto. Como se analiza a continuación, y en detalle en los Ejemplos, se requirieron varias etapas para generar el sistema péptido ligasa de la invención.

En primer lugar, los inventores tuvieron que seleccionar una proteína isopeptídica apropiada de una amplia gama de candidatos para modificación y posteriormente determinar las ubicaciones apropiadas en las que dividir la proteína. A este respecto, el dominio terminal C de RrgA contiene 8 cadenas p y el aislamiento del dominio que comprende el residuo de ácido glutámico responsable de promover la formación del enlace isopeptídico de los dominios que contienen los residuos reactivos resultó en la eliminación de 3 cadenas p (véase la Figura 1A). La eliminación de 3 cadenas p de un pequeño dominio de proteína es una modificación importante y se pensó que el polipéptido truncado (es decir, el péptido ligasa putativo también conocido como RrgALigase) tenía poca estabilidad. En particular, el polipéptido truncado mostró baja solubilidad (particularmente en soluciones que comprenden NaCl, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato) y mostró baja actividad ligasa. De hecho, el polipéptido truncado (RrgALigase) se fusionó con la proteína de unión a maltosa (MBP) para mejorar la solubilidad de RrgALigase y facilitar la caracterización y modificación de la proteína.

Por tanto, un segundo aspecto en el desarrollo del sistema péptido ligasa de la invención requirió el diseño e introducción de diversas modificaciones (es decir, mutaciones) en los componentes separados derivados de la proteína isopeptídica, particularmente el péptido ligasa putativo. Las modificaciones no solo dieron como resultado un péptido ligasa activo capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre dos etiquetas peptídicas, sino que se determinó sorprendentemente que también mejoraron la solubilidad y la actividad del dominio péptido ligasa, es decir, cuando el péptido ligasa modificado no estaba ligado a MBP, el péptido ligasa modificado era soluble y activo en una amplia gama de condiciones. Además, el sistema péptido ligasa de la presente invención muestra propiedades mejoradas en relación con el sistema SpyLigase discutido anteriormente, por ejemplo, mayor rendimiento (es decir, 95%), amplia gama de condiciones de reacción (temperatura, por ejemplo, hasta 37 °C, una gama de tampones, etc.), velocidad de reacción más rápida (es decir, alto rendimiento en aproximadamente 4 horas) y la capacidad de funcionar en la ausencia de una chaperona química, tal como TMAO (N-óxido de trimetilamina).

En particular, el sistema péptido ligasa de la invención representa una mejora con respecto a los sistemas de péptido ligasa, por ejemplo, sortasa y transglutaminasa, evolucionadas por naturaleza durante largos períodos de tiempo. Por ejemplo, las enzimas sortasa están presentes en diversas bacterias grampositivas que divergieron hace más de 2.000 millones de años (Antos et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, vol. 131 (31), págs. 10800-10801). De hecho, los inventores han descubierto inesperadamente que el sistema péptido ligasa de la invención tiene un alto rendimiento incluso a concentraciones relativamente bajas de etiqueta peptídica. A modo de comparación, el sistema péptido ligasa de la presente invención es eficaz a concentraciones de etiqueta peptídica que son diez veces más bajas que la concentración del compañero reactivo con oligoglicina que se usa típicamente con sortasa (Chen et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 2011, vol. 108 (28), págs. 11399-11404).

Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende:

a) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1; o

b) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un ácido glutámico en la posición 61 y uno o más de los siguientes:

1) prolina en la posición 66;

2) prolina en la posición 95;

3) glicina en la posición 96; y

4) valina en la posición 97,

en el que los residuos de aminoácidos especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en la SEQ ID NO: 1 y en el que dicho polipéptido es capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre el residuo de lisina en la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición 17 de la SEQ ID NO: 3.

Dado que el polipéptido de la invención media en la conjugación covalente de las etiquetas peptídicas de la invención (SEQ ID NO: 2 y 3, como se describe a continuación), puede verse como un péptido ligasa. Adicional o alternativamente, el polipéptido de la invención podría verse como un catalizador que promueve la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas de la invención. A este respecto, un catalizador puede definirse como una molécula que permite que se produzca una reacción sin cambiar su propia composición y se cree que la estructura del polipéptido de la invención después de su interacción con las etiquetas peptídicas de la invención y la promoción posterior de la formación del enlace isopeptídico entre dichas etiquetas peptídicas, es exactamente la misma que su estructura antes de la interacción. Por tanto, el polipéptido de la invención puede verse como un péptido ligasa que cataliza la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas de la invención.

Como se muestra en los Ejemplos, se diseñaron hábilmente un gran número de modificaciones y se introdujeron en el polipéptido del dominio terminal C truncado de RrgA (ligasa putativa o RrgALigase) y se ensayaron para determinar sus efectos sobre la actividad ligasa del polipéptido. Los inventores determinaron que solo modificaciones seleccionadas dieron como resultado una mejora en la actividad de la actividad ligasa (véase la Figura 2A). Además, se encontró que cada modificación seleccionada mejora de forma independiente la actividad de la ligasa.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un ácido glutámico en posición 61 y dos, tres o todos los siguientes:

1) prolina en la posición 66;

2) prolina en la posición 95;

3) glicina en la posición 96; y

4) valina en la posición 97.

Así, por ejemplo, las variantes polipeptídicas de la invención pueden comprender al menos residuos de prolina en las posiciones 66 y 95. En algunas realizaciones, las variantes polipeptídicas de la invención pueden comprender al menos un residuo de prolina en las posiciones 66 y/o 95 y un residuo de glicina en la posición 96. En otras realizaciones más, las variantes de polipéptido de la invención pueden comprender al menos un residuo de prolina en la posición 66 y/o 95 y un residuo de valina en la posición 97. En una realización particularmente preferida, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1 y todo lo siguiente:

1) ácido glutámico en la posición 61;

2) prolina en la posición 66;

3) prolina en la posición 95;

4) glicina en la posición 96; y

5) valina en la posición 97.

En otras realizaciones más, las variantes polipeptídicas de la invención pueden comprender un residuo de treonina en la posición 100.

Por tanto, el polipéptido (péptido ligasa) de la presente invención en particular puede ser al menos un 80% idéntico a la secuencia ejemplificada como se indica en la SEQ ID NO: 1 y más particularmente es al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntico a la SEQ ID NO: 1, en el que la variante de polipéptido comprende un residuo de ácido glutámico en la posición 61 (o una posición equivalente) y uno o más de:

1) prolina en la posición 66;

2) prolina en la posición 95;

3) glicina en la posición 96; y

4) valina en la posición 97,

o sus posiciones equivalentes, como se define a continuación.

El polipéptido de la invención es capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre el residuo de lisina en la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición 17 de la SEQ ID NO: 3 en condiciones que son adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico entre dichas etiquetas peptídicas y/o adecuado para la actividad ligasa del polipéptido de la invención. Es evidente a partir de los ejemplos siguientes que el polipéptido de la invención es activo en una variedad de condiciones. Por ejemplo, en tampón de tris borato (TB) a un pH de 6,0 a 9,0, por ejemplo, 7,0-9,0, 7,25-8,75, tal como aproximadamente 7,5-8,5, en un amplio intervalo de temperaturas, por ejemplo 0-40 °C, tal como 5-39, 10-38, 15-37 °C, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 35 o 37 °C, preferiblemente aproximadamente 15 °C. El polipéptido es funcional en presencia de concentraciones extracelulares de NaCl, por ejemplo, NaCl aproximadamente 150 mM o menos. Sin embargo, en algunas realizaciones, puede ser preferible realizar reacciones de ligación en ausencia de NaCl. El polipéptido de la invención también es activo en presencia de los detergentes comúnmente usados, tales como Tween 20 y Triton X-100 hasta una concentración de aproximadamente 2% (v/v). Además, el polipéptido es activo en presencia de glicerol a concentraciones de hasta aproximadamente al menos el 40% (v/v). Por tanto, en algunas realizaciones, puede ser preferible realizar reacciones de ligación en presencia de glicerol, por ejemplo, aproximadamente 5-50%, 10-40%, preferiblemente aproximadamente 15-30% (v/v). El experto en la materia podrá determinar fácilmente otras condiciones adecuadas.

Por tanto, en algunas realizaciones, las condiciones que son adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico entre dichas etiquetas peptídicas y/o adecuadas para la actividad ligasa del polipéptido de la invención incluyen cualquier condición en la que poner en contacto el polipéptido de la invención con las etiquetas peptídicas como se definen en el presente documento dan como resultado la formación de un enlace isopeptídico entre dichas etiquetas peptídicas, particularmente entre el residuo de lisina en la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición 17 de la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, poner en contacto dicho polipéptido y etiquetas polipeptídicas en condiciones tamponadas, por ejemplo, en una solución tamponada o en una fase sólida (por ejemplo, columna) que se ha equilibrado con un tampón, tal como el tampón de Tris borato. La etapa de poner en contacto puede ser a cualquier pH adecuado, tal como pH 6,0-9,0, por ejemplo 6,5-9,0, tal como pH 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6 u 8,8. Adicional o alternativamente, la etapa de poner en contacto puede ser a cualquier temperatura adecuada, tal como aproximadamente 0-40 °C, por ejemplo, aproximadamente 1-39, 2-38, 3-37, 4-36, 5-35, 6-34, 7-33, 8-32, 9 31 o 10-30 °C, por ejemplo, aproximadamente 10, 12, 15, 18, 20, 22 o 25 °C, preferiblemente aproximadamente 15 °C. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto puede ser en ausencia de NaCl. En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto puede ser en presencia de glicerol, por ejemplo, aproximadamente 5-50%, 10-40%, preferiblemente aproximadamente 15-30% (v/v).

En algunas realizaciones, poner en contacto las etiquetas polipeptídicas y peptídicas como se define en el presente documento "en condiciones que son adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico" incluye poner en contacto dichas etiquetas polipeptídicas y peptídicas en presencia de una chaperona química, por ejemplo, una molécula que potencia o mejora la reactividad de las etiquetas polipeptídicas y/o peptídicas. En algunas realizaciones, la chaperona química es t Ma O (N-óxido de trimetilamina). En algunas realizaciones, la chaperona química, por ejemplo, TMAO, está presente en la reacción a una concentración de al menos aproximadamente 0,2 M, por ejemplo, al menos 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 o 2,5 M, por ejemplo, aproximadamente 0,2-3,0 M, 0,5-2,0 M, 1,0-1,5 M.

Por tanto, el polipéptido de la invención abarca formas mutantes del polipéptido (es decir, denominadas en el presente documento homólogos, variantes o derivados) que son estructuralmente similares al polipéptido ejemplificado expuesto en la SEQ ID NO: 1 y pueden funcionar como un péptido ligasa, particularmente capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas de la invención (péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos como se indica en las SEQ ID NOs: 2 y 3) en condiciones adecuadas como se definen más arriba. En los casos en los que una variante polipeptídica comprende mutaciones, por ejemplo, eliminaciones o inserciones, con respecto a la SEQ ID NO: 1, los residuos especificados anteriormente están presentes en posiciones de aminoácidos equivalentes en la variante de secuencia polipeptídica. En una realización preferida, las eliminaciones en las variantes polipeptídicas de la invención no son truncamientos del terminal N y/o del terminal C.

Por tanto, en algunas realizaciones, una variante de polipéptido de la presente invención puede diferir de la SEQ ID NO: 1 en, por ejemplo, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, por ejemplo, 1,2 a 3 sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos, preferiblemente sustituciones. En algunas realizaciones, cualquier otra mutación que esté presente en el polipéptido (péptido ligasa) de la presente invención puede ser sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una sustitución conservadora de aminoácidos se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro que conserva el carácter fisicoquímico del polipéptido (por ejemplo, D puede sustituirse por E o viceversa, N por Q o L o I por V o viceversa). Por tanto, generalmente el aminoácido de sustitución tiene propiedades similares, por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas, etc. al aminoácido que se reemplaza. Se pueden incorporar isómeros del L-aminoácido nativo, por ejemplo, D-aminoácidos.

La identidad de secuencia puede determinarse mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, utilizando el banco de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT utilizando FASTA pep-cmp con un pamfactor variable, y la penalización por creación de huecos establecida en 12,0 y la penalización por extensión de huecos establecida en 4,0, y una ventana de 2 aminoácidos. Otros programas para determinar la identidad de la secuencia de aminoácidos incluyen el programa BestFit del paquete de software Genetics Computer Group (GCG) Versión 10 de la Universidad de Wisconsin. El programa utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman con los valores predeterminados: penalización por creación de espacios -8, penalización por extensión de espacios = 2, coincidencia promedio = 2,912, falta de coincidencia promedio = -2,003.

Preferiblemente, dicha comparación se realiza en toda la longitud de la secuencia, pero puede realizarse en una ventana de comparación más pequeña, por ejemplo, menos de 100, 80 o 50 aminoácidos contiguos.

Preferiblemente, dichas proteínas relacionadas con la identidad de secuencia (variantes de polipéptidos) son funcionalmente equivalentes a los polipéptidos que se indican en las SEQ ID NOs enumeradas. Como se menciona en el presente documento, "equivalencia funcional" se refiere a variantes del polipéptido (péptido ligasa) de la invención discutidas anteriormente que pueden mostrar cierta eficacia reducida en la reacción de ligación (por ejemplo, menor rendimiento de reacción, menor velocidad de reacción o actividad en un intervalo limitado de las condiciones de reacción (por ejemplo, un intervalo de temperatura más estrecho, tal como 10-30 °C, etc.)) con respecto a la molécula original (es decir, la molécula con la que muestra homología de secuencia), pero preferiblemente son igual de eficaces o más eficaces.

Un polipéptido mutante o variante de la invención con actividad ligasa o catalítica que es "equivalente" a la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1 puede tener actividad ligasa o catalítica que es similar (es decir, comparable) a la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1, es decir, tal que las aplicaciones prácticas del péptido ligasa no son significativamente afectadas, por ejemplo, dentro de un margen de error experimental. Por tanto, una actividad ligasa o catalítica equivalente significa que el polipéptido mutante o variante de la invención es capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas de la invención con una velocidad de reacción y/o rendimiento de reacción similar a un polipéptido que comprende o que consta de una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1 en las mismas condiciones.

La ligasa o la actividad catalítica de diferentes polipéptidos de péptido ligasa (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 frente a mutante) medida en las mismas condiciones de reacción, por ejemplo, la temperatura, los sustratos (es decir, secuencias de etiquetas peptídicas) y su concentración, tampón, sal, etc., como se ejemplificó anteriormente, se pueden comparar fácilmente para determinar si la actividad ligasa o catalítica para cada proteína es mayor, menor o equivalente.

Por tanto, la actividad ligasa o catalítica del polipéptido variante (por ejemplo, mutante) puede ser al menos del 60%, por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 85 o 90% de la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1, tal como al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1. Vista en forma alternativa, la actividad ligasa o catalítica del polipéptido mutante puede ser no más del 40% menor que la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, no más del 35, 30, 25 o 20% menor que la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1, tal como no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% menor que la actividad ligasa o catalítica de un polipéptido que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, la actividad ligasa o catalítica del polipéptido variante (por ejemplo, mutante) puede evaluarse midiendo el rendimiento de reacción de las etiquetas peptídicas. El rendimiento de la reacción se mide determinando la proporción de una etiqueta (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) en el complejo covalente con su etiqueta peptídica asociada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3) en relación con los componentes que no han reaccionado tras el contacto de las etiquetas peptídicas con el polipéptido (péptido ligasa) de la invención en condiciones adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico entre dichas etiquetas peptídicas y/o adecuadas para la actividad ligasa del polipéptido de la invención. Por lo tanto, el rendimiento de la reacción se refiere a: la proporción de una etiqueta (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) en el complejo covalente con su etiqueta peptídica asociada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3)/(la proporción de la etiqueta (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) en complejo covalente con su etiqueta peptídica asociada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3) la proporción de la etiqueta (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) no en complejo covalente con su etiqueta peptídica asociada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3)) x 100.

Como se mencionó anteriormente, el péptido ligasa que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1 es capaz de catalizar la reacción de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 con un rendimiento de reacción de aproximadamente 95 %. Por tanto, en algunas realizaciones, un polipéptido variante de la invención que es funcionalmente equivalente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1 es capaz de catalizar la reacción de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3 (es decir, la formación de un enlace isopeptídico entre la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3) con un rendimiento de reacción de al menos aproximadamente 57%, por ejemplo, un rendimiento de reacción de al menos aproximadamente 67, 71, 76, 81 u 86%, tal como al menos 86,5, 87,4, 88,4, 89,3, 90,3, 91,2, 92,2, 93,1 o 94%.

Por tanto, se puede realizar cualquier modificación o combinación de modificaciones en la SEQ ID NO: 1 para producir un polipéptido variante (péptido ligasa) de la invención, siempre que el polipéptido variante comprenda un residuo de ácido glutámico en una posición equivalente a la posición 61 de la SEQ ID NO: 1 y al menos uno (preferiblemente 2, 3 o 4) de otro(s) residuo(s) de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 66, 95, 96 y 97 de la SEQ ID NO: 1 como se definió anteriormente y retiene las características funcionales definidas anteriormente, es decir, da como resultado un péptido ligasa capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas de la invención y, opcionalmente, tiene un rendimiento de reacción, velocidad de reacción, temperatura y/o intervalo de tampón equivalente o superior con respecto a una polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1.

Se determina una posición equivalente por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La posición homóloga o correspondiente se puede deducir fácilmente alineando la secuencia del polipéptido homólogo (mutante, variante o derivado) y la secuencia de la SEQ ID NO: 1 basándose en la homología o identidad entre las secuencias, por ejemplo usando un algoritmo BLAST.

Como se discutió anteriormente, el dominio del terminal C de la proteína de adhesión de Streptococcus pneumoniae, RrgA, se dividió en tres dominios, cada uno de los cuales se modificó luego para generar el polipéptido (péptido ligasa) de la invención y dos etiquetas peptídicas. Por lo tanto, las etiquetas peptídicas de la invención encuentran una utilidad particular en combinación con el péptido ligasa de la invención. Por consiguiente, las etiquetas peptídicas de la invención pueden verse como sustratos del péptido ligasa de la invención en una reacción de unión o conjugación de péptidos. En particular, el polipéptido ligasa de la invención es capaz de dirigir una transamidación específica entre el residuo de lisina en la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición 17 de la SEQ ID NO: 3. Por lo tanto, las etiquetas peptídicas de la invención pueden verse como sustratos del péptido ligasa de la invención en una reacción de transamidación.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención proporciona una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

El término "etiqueta peptídica" o "enlazador peptídico", como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a un péptido u oligopéptido. No existe una definición estándar con respecto a los límites de tamaño entre lo que se entiende por péptido u oligopéptido, pero típicamente se puede considerar que un péptido comprende entre 2 y 20 aminoácidos y un oligopéptido entre 21 y 39 aminoácidos. Por consiguiente, se puede considerar que un polipéptido comprende al menos 40 aminoácidos, preferiblemente al menos 50, 60, 70 u 80 aminoácidos. Por tanto, una etiqueta o enlazador peptídico como se define en el presente documento puede verse como que comprende al menos 12 aminoácidos, por ejemplo, 12-39 aminoácidos, tal como por ejemplo, 13-35, 14-34, 15-33, 16-31, 17-30 aminoácidos de longitud, por ejemplo, puede comprender o consistir en 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 aminoácidos.

Como se discutió anteriormente, las etiquetas peptídicas tienen un gran número de utilidades y las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención encuentran una utilidad particular para conjugar (es decir, unir o enlazar) dos moléculas o componentes mediante un enlace isopeptídico. Por ejemplo, las etiquetas peptídicas se pueden conjugar o fusionar por separado a moléculas o componentes de interés y, posteriormente, ponerse en contacto en presencia del péptido ligasa en condiciones adecuadas para permitir la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas, uniendo así (es decir, uniendo o conjugando) las moléculas o componentes mediante un enlace isopeptídico.

Como se muestra en los ejemplos siguientes, los inventores han determinado que el péptido ligasa de la invención se une fuertemente a su producto de reacción, es decir, las dos etiquetas peptídicas de la invención unidas por un enlace isopeptídico y cualquier molécula o componente fusionado o conjugado a dichas etiquetas peptídicas. Sin embargo, la fuerte interacción se puede interrumpir usando una variedad de condiciones seleccionadas, por ejemplo, pH bajo, mayor temperatura (por ejemplo, 45 °C o más), adición de imidazol o un péptido competidor, o una combinación de los mismos. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la fuerte interacción entre el péptido ligasa y su producto de reacción facilita ventajosamente la purificación eficaz del producto de reacción.

A modo de ejemplo, el péptido ligasa de la invención puede inmovilizarse sobre un soporte sólido o fase sólida por cualquier medio conveniente, como se analiza con más detalle a continuación, por ejemplo, marcando el péptido ligasa con una etiqueta, por ejemplo, biotina, y poniendo en contacto la ligasa etiquetada con un soporte sólido unido al compañero de unión de la etiqueta, por ejemplo, estreptavidina agarosa. A continuación, el soporte sólido o la fase sólida se pone en contacto con moléculas o componentes fusionados o conjugados con las etiquetas peptídicas en condiciones que permiten la formación mediada por péptido ligasa de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas, formando así un complejo covalente entre las moléculas o componentes. Debido a la fuerte interacción entre el péptido ligasa inmovilizado y el producto de reacción, la fase sólida puede lavarse en condiciones rigurosas para facilitar la eliminación de los componentes que no han reaccionado. A continuación, la fase sólida se somete a condiciones que interrumpen la interacción entre el péptido ligasa inmovilizado y el producto de reacción, lo que permite la separación del producto de reacción.

Por ejemplo, la fase sólida puede ponerse en contacto con una solución de pH bajo, por ejemplo, tampón de pH bajo, tal como un tampón con un pH de 4,0 o menos, para interrumpir la interacción entre el péptido ligasa inmovilizado y el producto de reacción, permitiendo así la separación del producto de reacción. Por ejemplo, la fase sólida puede ser una columna y el contacto de la columna con una solución de pH bajo da como resultado la elución de un producto de reacción sustancialmente puro.

Como se analiza a continuación, una o más de las moléculas o componentes que se van a conjugar mediante las etiquetas peptídicas de la invención pueden ser una proteína. Sin embargo, no todas las proteínas toleran el tratamiento con pH bajo. Por consiguiente, los inventores buscaron identificar otras condiciones que permitan la separación del péptido ligasa y su producto de reacción a pH neutro (es decir, 6,5 - 7,5).

Los inventores determinaron que elevar la temperatura de la fase sólida a 55 °C era suficiente para eluir eficazmente el producto de reacción en condiciones que son toleradas por la mayoría de las proteínas, por ejemplo, en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4.

Además, los inventores determinaron que se puede lograr una elución eficaz a una temperatura más baja añadiendo un producto de reacción competidor (por ejemplo, proteína previamente ligada) para interrumpir (competir) la interacción no covalente entre el producto de reacción y el péptido ligasa. Un producto de reacción competidor puede ser cualquier producto que comprenda las etiquetas peptídicas de la invención que sea fácilmente separable del producto de reacción pretendido (por ejemplo, mediante diálisis o cromatografía de exclusión por tamaño).

Como se muestra en los Ejemplos, la adición de un producto de reacción competidor 35 pM (es decir, una proteína competidora que comprende una etiqueta peptídica (SEQ ID NO: 9) acoplada a una fusión de AffiHER2-etiqueta peptídica (SEQ ID NO: 7) usando SnoopLigase biotinilada, posteriormente purificada por elución de una fase sólida usando un tampón de glicina, pH 2) permitió la elución eficiente del producto de reacción a 45 °C en lugar de 55 °C. En una realización preferida, el producto de reacción competidor comprende o consiste en un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 ligada (a través de un enlace isopeptídico) a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID. NO: 3. En algunas realizaciones, el producto de reacción del competidor se pone en contacto con la fase sólida en una concentración alta, es decir, al menos el 60%, por ejemplo, al menos 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 o 200% de la concentración de los reactivos (es decir, conjugados de etiqueta peptídica) usados en la reacción. En realizaciones particularmente preferidas, el producto de reacción competidor se pone en contacto con la fase sólida a una temperatura elevada, es decir, por encima de la temperatura ambiente, por ejemplo, al menos 30, 35, 40 o 45 °C.

Aunque el uso de un producto de reacción competidor puede ser adecuado para la elución de algunos productos de reacción (por ejemplo, conjugados de proteínas) del péptido ligasa de la invención, es deseable poder interrumpir la interacción entre el péptido ligasa de la invención y el producto de reacción en condiciones fisiológicamente relevantes, por ejemplo, temperaturas fisiológicas y pH. En consecuencia, como se discutió en los Ejemplos, los inventores seleccionaron hábilmente una gama de aditivos que pueden ser efectivos para interrumpir la interacción entre el péptido ligasa de la invención y el producto de reacción en condiciones fisiológicas, mientras siguen siendo compatibles con la mayoría de las proteínas ligadas por SnoopLigase manteniendo su estructura plegada.

De los doce aditivos probados, solo un aditivo (imidazol 1 M) resultó ser eficaz en condiciones fisiológicas (pH 6,5-7,0, 37 °C) y se determinó sorprendentemente que concentraciones más altas de imidazol (2 M) permiten elución eficaz a temperaturas más bajas (25 °C). El imidazol es bien tolerado por la mayoría de las proteínas y se utiliza en uno de los métodos de purificación de proteínas más comunes para purificar proteínas marcadas con histidina a partir de resina Ni-NTA.

Por tanto, en algunas realizaciones, la fase sólida se puede poner en contacto con una solución que comprende imidazol, por ejemplo, a una concentración de al menos 1 M, preferiblemente aproximadamente 2 M, para interrumpir la interacción entre el péptido ligasa inmovilizado y el producto de reacción. En realizaciones particularmente preferidas, la fase sólida se pone en contacto con una solución que comprende imidazol aproximadamente 2 M a pH 6,5-7,5 (preferiblemente pH aproximadamente 7,0), a aproximadamente 20-30 °C (preferiblemente aproximadamente 25 °C).

Aunque puede ser útil inmovilizar el péptido ligasa sobre un soporte sólido antes de entrar en contacto con las etiquetas peptídicas de la invención, será evidente que esto no es esencial. Por ejemplo, la reacción de ligación puede tener lugar en solución, que posteriormente se aplica a un soporte sólido o fase sólida, por ejemplo, columna, para separar el producto de reacción y el péptido ligasa. En algunas realizaciones, el complejo de péptido ligasa-producto de reacción se puede aplicar a la fase sólida en condiciones adecuadas para inmovilizar el complejo en la fase sólida, ya sea mediante el producto de reacción o péptido ligasa, lavar en condiciones adecuadas y posteriormente someter a uno o más de las condiciones mencionadas anteriormente, por ejemplo se pone en contacto con una solución de pH bajo o una solución que comprende imidazol, para romper el complejo, separando así el producto de reacción y el péptido ligasa. Alternativamente, el complejo de péptido ligasa-producto de reacción puede someterse a una o más de las condiciones mencionadas anteriormente en solución, por ejemplo, se pone en contacto con una solución de pH bajo, una solución que comprende imidazol o un producto de reacción competidor, y posteriormente se separa por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por contacto con una fase sólida con afinidad por el producto de reacción o péptido ligasa, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis, etc.

Aunque el uso de un soporte sólido o una fase sólida es ventajoso para generar un producto de reacción sustancialmente puro, será evidente que esto no es esencial. Por ejemplo, la reacción de ligación puede tener lugar en solución y el complejo péptido ligasa-producto de reacción puede separarse por degradación del péptido ligasa. Por ejemplo, el péptido ligasa de la invención puede modificarse para insertar un dominio de escisión, de modo que la escisión del dominio de escisión, por ejemplo, usando una proteasa, es suficiente para interrumpir la interacción entre el péptido ligasa y el producto de reacción. El péptido ligasa degradado se puede separar posteriormente del producto de reacción usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica.

En otras realizaciones, la fuerte interacción entre el péptido ligasa y su producto de reacción puede usarse para producir un complejo entre moléculas o componentes fusionados o conjugados con las etiquetas peptídicas y una molécula o componente fusionado o conjugado con el péptido ligasa. A este respecto, las moléculas o componentes fusionados o conjugados a las etiquetas peptídicas se unen mediante un enlace isopeptídico para producir un producto de reacción como se describió anteriormente, que interactúa de forma no covalente con la molécula o componente fusionado o conjugado con el péptido ligasa, produciendo así un complejo de tres moléculas o componentes, en el que dos de las moléculas o componentes están unidos mediante un enlace isopeptídico.

Por tanto, en algunas realizaciones, se puede ver que la invención proporciona el uso de un polipéptido (péptido ligasa) como se define en el presente documento para:

(1) conjugar dos moléculas o componentes mediante un enlace isopeptídico; o

(2) producir un complejo entre tres moléculas o componentes, en el que dos de las moléculas o componentes del complejo se conjugan mediante un enlace isopeptídico,

en el que dichas moléculas o componentes conjugados mediante un enlace isopeptídico comprenden:

a) una primera molécula o componente que comprende una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2; o

(ii) una secuencia de aminoácidos con al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de lisina en la posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2; y

b) una segunda molécula que comprende una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3; o

(ii) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de asparagina en la posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3,

y

en la que la tercera molécula o componente del complejo en (2) comprende un polipéptido (péptido ligasa) de la invención como se definió anteriormente.

En vista de los comentarios anteriores, es evidente que la tercera molécula o componente del complejo en (2) interactúa o se une de forma no covalente a las moléculas o componentes del complejo que se conjugan mediante un enlace isopeptídico. En particular, la interacción no covalente entre la tercera molécula o componente en el complejo y las moléculas o componentes en el complejo que se conjugan a través de un enlace isopeptídico está mediada por (surge de o es a través de) la interacción entre el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas conjugadas de la invención.

Visto alternativamente, la invención proporciona un proceso para conjugar dos moléculas o componentes a través de un enlace isopeptídico que comprende:

a) proporcionar una primera molécula o componente que comprende una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2; o

(ii) una secuencia de aminoácidos con al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de lisina en la posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2;

b) proporcionar una segunda molécula o componente que comprende una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3; o

(ii) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de asparagina en la posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3;

c) poner en contacto dicha primera y segunda moléculas o componentes con un polipéptido (péptido ligasa) de la invención, preferiblemente en el que dicho polipéptido se inmoviliza sobre un sustrato sólido, en condiciones que permitan la formación de un enlace isopeptídico entre el residuo de lisina en la posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3, conjugando así dicha primera molécula con dicha segunda molécula mediante un isopéptido para formar un complejo.

En algunas realizaciones, el polipéptido (péptido ligasa) de la invención se conjuga o fusiona a una molécula o componente para proporcionar una tercera molécula o componente y la etapa c) da como resultado la formación de un complejo que comprende tres moléculas o componentes, en el que la tercera molécula o componente del complejo interactúa o se une de forma no covalente a la primera y segunda moléculas o componentes del complejo que se conjugan mediante un enlace isopeptídico. En particular, la interacción no covalente entre la tercera molécula o componente del complejo y la primera y segunda moléculas o componentes del complejo que se conjugan a través de un enlace isopeptídico está mediada por (surge de o es a través de) la interacción entre el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas conjugadas de la invención.

En algunas realizaciones, cuando el polipéptido se inmoviliza sobre un sustrato sólido, el proceso comprende una etapa adicional de separación del complejo (que comprende solo la primera y segunda moléculas o componentes conjugados mediante un enlace isopeptídico) del sustrato sólido, en el que dicha etapa comprende someter el complejo a condiciones adecuadas para romper el complejo, es decir, interrumpir la interacción no covalente entre el polipéptido y el producto de reacción.

En algunas realizaciones, como se mencionó anteriormente, las condiciones adecuadas para romper el complejo comprenden poner en contacto dicho complejo con una solución o tampón de pH bajo. En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas para romper el complejo comprenden someter dicho complejo a temperaturas elevadas, por ejemplo, al menos 30, 35, 40 o 45 °C, tal como 30-65, 35-60, 40-55 °C, y/o poner en contacto dicho complejo con una solución que comprende imidazol (por ejemplo, al menos 1 M, por ejemplo, 1-4 M, 1-3 M o 1,5-2,5 M, preferiblemente imidazol aproximadamente 2 M) o una solución que comprende un producto de reacción competidor (por ejemplo, una alta concentración de un producto de reacción competidor como se definió anteriormente).

En otras realizaciones más, el proceso comprende una etapa de lavar el sustrato sólido con un tampón antes de separar dicho complejo del sustrato sólido. Será evidente que se puede seleccionar cualquier tampón adecuado basándose en las moléculas o componentes fusionados a las etiquetas peptídicas. Además, la etapa de lavar el sustrato sólido puede repetirse varias veces, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más veces. Visto alternativamente, en algunas realizaciones el proceso comprende múltiples etapas de lavado, en las que se pueden usar las mismas o diferentes condiciones de lavado en cada etapa.

Como se mencionó anteriormente, en algunas realizaciones, el sustrato sólido se somete a condiciones de lavado rigurosas. La naturaleza de las condiciones de lavado rigurosas dependerá de las moléculas o componentes fusionados a las etiquetas peptídicas y/o la composición del sustrato sólido. El experto en la materia podría seleccionar tales condiciones de forma rutinaria. Sin embargo, a modo de ejemplo, las condiciones de lavado rigurosas pueden comprender lavar con una solución que comprende glicina 50 mM y NaCl 300 mM (pH 3,0) seguido de una solución que comprende glicina 50 mM (pH 3,0), en la que cada lavado puede repetirse.

Una "solución o tampón de pH bajo" puede verse como cualquier solución o tampón adecuado para interrumpir la interacción no covalente entre el péptido ligasa de la invención y su producto de reacción, es decir, las etiquetas peptídicas de la invención conjugadas mediante un enlace isopeptídico. En algunas realizaciones, la solución o tampón de pH bajo es un tampón de elución de anticuerpos. A este respecto, es evidente que el pH de la solución necesario para interrumpir la interacción entre el péptido ligasa de la invención y su producto de reacción puede depender de los componentes de la solución. A modo de ejemplo, los tampones de elución de anticuerpos pueden comprender o consistir en glicina 50 mM a pH 2,2-2,8 o tampón de ácido cítrico 100 mM a pH 3,5-4,0. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la solución o tampón de pH bajo tiene un pH de 4,0 o menos, por ejemplo, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0 o menos, por ejemplo, aproximadamente 1,5-3,5, 1,6-3,4, 1,7-3,3, 1,8-3,2, 1,9-3,1 o 2,0-3,0, tal como aproximadamente 2,2-2,8 o 2,5-2,7.

Los términos "conjugar" o "enlazar" en el contexto de la presente invención con respecto a conectar dos o más moléculas o componentes para formar un complejo se refieren a unir o conjugar dichas moléculas o componentes, por ejemplo, proteínas, a través de un enlace covalente, particularmente un enlace isopeptídico que se forma entre las etiquetas peptídicas que se incorporan o fusionan con dichas moléculas o componentes, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, etiquetas peptídicas que forman dominios de dichas proteínas).

En algunas realizaciones, dicha secuencia de etiqueta peptídica anterior es al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a la secuencia (SEQ ID NO: 2 o 3) con la que se compara.

Preferiblemente, dichas etiquetas peptídicas relacionadas con la identidad de secuencia son funcionalmente equivalentes a las etiquetas peptídicas que se indican en las SEQ ID NOs enumeradas. Como se discutió anteriormente, "equivalencia funcional" se refiere a homólogos de las etiquetas peptídicas discutidas anteriormente que pueden mostrar cierta eficacia reducida en la formación de enlaces isopeptídicos con su respectivo compañero, mediada por el péptido ligasa de la invención, en relación con la etiqueta peptídica ejemplificada (es decir, SEQ ID NO: 2 o 3, la molécula con la que muestra homología de secuencia), pero preferiblemente son tan eficientes o más eficientes.

Por tanto, la capacidad de una etiqueta peptídica mutante para formar un enlace isopeptídico con su respectivo compañero, mediada por el péptido ligasa de la invención, puede ser al menos del 60%, por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 85 o 90% de la capacidad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o 3, tal como al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de la capacidad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o 3. Alternativamente vista, capacidad de una etiqueta peptídica mutante para formar un enlace isopeptídico con su respectivo compañero, mediado por el péptido ligasa de la invención, no puede ser más del 40% menor que la capacidad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o 3, por ejemplo, no más del 35, 30, 25 o 20% menor que la capacidad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o 3, tal como no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% menor que la capacidad de una etiqueta peptídica que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o 3.

Así, por ejemplo, una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de lisina en la posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2, debe ser capaz de formar un enlace isopeptídico con una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3, preferiblemente con al menos el 60% de la eficacia de la reacción (por ejemplo, rendimiento, velocidad de reacción, etc.) tal como una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2.

De manera similar, una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de asparagina en la posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3, debe ser capaz de formar un enlace isopeptídico con una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2, preferiblemente con al menos el 60% de la eficacia de la reacción (por ejemplo, rendimiento, velocidad de reacción, etc.), tal como una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3.

Las definiciones de las variantes polipeptídicas de la invención descritas anteriormente, es decir, en relación con sustituciones, eliminaciones e inserciones, son igualmente aplicables a las variantes de etiquetas peptídicas descritas anteriormente en el contexto de los usos y procesos de la invención.

Por lo tanto, se puede realizar cualquier modificación o combinación de modificaciones en la SEQ ID NO: 2 o 3 para producir una etiqueta peptídica variante para usar en la invención, siempre que la etiqueta peptídica variante comprenda un residuo de lisina en una posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 o un residuo de asparagina en una posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3 y conserva las características funcionales definidas anteriormente, es decir, da como resultado una etiqueta peptídica capaz de formar un enlace isopeptídico con su respectivo compañero mediado por el péptido ligasa de la invención en condiciones adecuadas.

Una posición equivalente en las etiquetas peptídicas se determina por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o 3. La posición homóloga o correspondiente se puede deducir fácilmente alineando la secuencia de la etiqueta peptídica homóloga (mutante, variante o derivado) y la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 3 basándose en la homología o identidad entre las secuencias, por ejemplo usando un algoritmo BLAST.

Como se mencionó anteriormente, en algunas realizaciones, las etiquetas peptídicas de la invención se fusionan o conjugan con otras moléculas o con otros componentes o entidades. Tales moléculas o componentes (es decir, entidades) pueden ser una molécula de ácido nucleico, una proteína, un péptido, un compuesto orgánico de molécula pequeña, un fluoróforo, un complejo metal-ligando, un polisacárido, una nanopartícula, un nanotubo, un polímero, una célula, un virus, una partícula similar a un virus o cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, el componente o entidad a la que se fusiona o conjuga la etiqueta peptídica es un soporte sólido, es decir, un sustrato o fase sólida, como se define a continuación.

Por tanto, visto alternativamente, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o cualquier combinación de los mismos o soporte sólido fusionado o conjugado a una etiqueta peptídica de la invención.

La célula puede ser una célula procariota o eucariota. En algunas realizaciones, la célula es una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica puede conjugarse o fusionarse con un compuesto o molécula que tiene un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, un antibiótico, antiviral, vacuna, agente antitumoral, por ejemplo, un compuesto o isótopo radiactivo, citocinas, toxinas, oligonucleótidos y ácidos nucleicos que codifican genes o vacunas de ácidos nucleicos.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica puede conjugarse o fusionarse a una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta radioactiva, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta de cromóforo, así como a sustancias y enzimas que generan un sustrato detectable, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa o fosfatasa alcalina. Esta detección se puede aplicar en numerosos ensayos en los que se utilizan anticuerpos de forma convencional, incluidos los formatos de transferencia Western/inmunotransferencia, histoquímica, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o citometría de flujo (FACS). Las etiquetas para la formación de imágenes por resonancia magnética, las sondas de tomografía por emisión de positrones y el boro 10 para la terapia de captura de neutrones también pueden conjugarse con la etiqueta peptídica de la invención. Particularmente, la etiqueta peptídica puede fusionarse o producirse con otro péptido, por ejemplo la etiqueta His6, y/o puede fusionarse o producirse con otra proteína, por ejemplo, con el propósito de potenciar la expresión de proteínas recombinantes mediante la fusión con la proteína de unión a maltosa.

En una realización particularmente útil, la etiqueta peptídica y/o el péptido ligasa se fusionan o conjugan con otro péptido, oligopéptido o polipéptido. Por ejemplo, la etiqueta peptídica se puede producir como parte de otro péptido, oligopéptido o polipéptido usando técnicas recombinantes como se describe a continuación, es decir, como una proteína o polipéptido recombinante o sintético.

Será evidente que la etiqueta peptídica y/o el péptido ligasa de la invención se fusionarán con cualquier proteína o polipéptido. La proteína se puede derivar u obtener de cualquier fuente adecuada. Por ejemplo, la proteína puede traducirse o purificarse in vitro a partir de muestras biológicas y clínicas, por ejemplo, cualquier muestra de célula o tejido de un organismo (eucariota, procariota), o cualquier fluido corporal o preparación derivada del mismo, así como muestras tales como cultivos celulares, preparaciones celulares, lisados celulares, etc. Se pueden derivar u obtener proteínas, por ejemplo, purificar a partir de muestras ambientales, por ejemplo, también se incluyen muestras de suelo y agua o muestras de alimentos. Las muestras pueden estar recién preparadas o pueden tratarse previamente de cualquier forma conveniente, por ejemplo, para almacenamiento.

Como se indicó anteriormente, en una realización preferida, la proteína se puede producir de forma recombinante y, por tanto, las moléculas de ácido nucleico que codifican dichas proteínas se pueden derivar u obtener de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, cualquier material viral o celular, incluidas todas las células procariotas o eucariotas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y orgánulos. Por tanto, tal material biológico puede comprender todo tipo de células animales de mamíferos y no mamíferos, células vegetales, algas, incluidas algas verde-azules, hongos, bacterias, protozoos, virus, etc. En algunas realizaciones, las proteínas pueden ser proteínas sintéticas. Por ejemplo, el péptido y polipéptido (proteínas) descritos en este documento pueden producirse mediante síntesis química, tal como síntesis de péptidos en fase sólida.

La posición de la etiqueta peptídica dentro de una proteína recombinante no es particularmente importante. Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica puede estar ubicada en el extremo terminal N o terminal C del polipéptido recombinante o sintético. En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica se puede ubicar internamente dentro del polipéptido recombinante o sintético. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica puede verse como un dominio del terminal N, terminal C o interno del polipéptido recombinante o sintético.

El péptido ligasa se localiza preferiblemente en el extremo terminal N o terminal C del polipéptido recombinante o sintético. En algunas realizaciones, el péptido ligasa puede localizarse internamente dentro del polipéptido recombinante o sintético. Por tanto, en algunas realizaciones, el péptido ligasa puede verse como un dominio del terminal N, terminal C o interno del polipéptido recombinante o sintético.

En algunas realizaciones, puede ser útil incluir uno o más espaciadores, por ejemplo, un espaciador del péptido, entre el péptido, oligopéptido o polipéptido que se va a unir o conjugar con la etiqueta peptídica y/o el péptido ligasa. Por lo tanto, el péptido, oligopéptido o polipéptido y la etiqueta peptídica y/o el péptido ligasa pueden unirse directamente entre sí o pueden unirse indirectamente por medio de una o más secuencias espaciadoras. Por lo tanto, una secuencia espaciadora puede interespaciar o separar dos o más partes individuales del polipéptido recombinante o sintético. En algunas realizaciones, un espaciador puede ser del terminal N o terminal C para la etiqueta peptídica y/o el péptido ligasa. En algunas realizaciones, los espaciadores pueden estar a ambos lados de la etiqueta peptídica y/o el péptido ligasa.

La naturaleza precisa de la secuencia espaciadora no es crítica y puede ser de longitud y/o secuencia variable, por ejemplo, puede tener 1-40, más particularmente 2-20, 1-15, 1-12, 1-10, 1-8 o 1-6 residuos, por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. A modo de ejemplo representativo, la secuencia espaciadora, si está presente, puede tener 1-15, 1 12, 1-10, 1-8 o 1-6 residuos, etc. La naturaleza de los residuos no es crítica y pueden ser, por ejemplo, cualquier aminoácido, por ejemplo, un aminoácido neutro o un aminoácido alifático, o alternativamente pueden ser hidrófobos, polares o cargados o formadores de estructura, por ejemplo, prolina. En algunas realizaciones preferidas, el enlazador es una secuencia rica en serina y/o glicina, que preferiblemente comprende al menos 6 residuos de aminoácidos, por ejemplo, 6, 7 u 8 residuos.

Los ejemplos de secuencias espaciadoras incluyen, por tanto, cualquier residuo de aminoácido individual, por ejemplo, S, G, L, V, P, R, H, M, A o E o un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido o hexapéptido compuesto por uno o más de tales residuos.

Por tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido recombinante o sintético que comprende una etiqueta peptídica o péptido ligasa de la invención como se definió anteriormente, es decir, un polipéptido recombinante o sintético que comprende un péptido, oligopéptido o polipéptido fusionado a una etiqueta peptídica o péptido ligasa de la invención. El polipéptido recombinante o sintético comprende opcionalmente un espaciador como se definió anteriormente.

El polipéptido recombinante o sintético de la invención también puede comprender fracciones de purificación o etiquetas para facilitar su purificación (por ejemplo, antes de su uso en los métodos y usos de la invención que se discuten a continuación). Puede incorporarse al polipéptido cualquier fracción o etiqueta de purificación adecuada y dichas fracciones son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polipéptido recombinante o sintético puede comprender una etiqueta o fracción de purificación de péptidos, por ejemplo, una secuencia de etiqueta His. Dichas fracciones o etiquetas de purificación se pueden incorporar en cualquier posición dentro del polipéptido. En algunas realizaciones preferidas, la fracción de purificación se localiza en o hacia (es decir, dentro de 5, 10, 15, 20 aminoácidos) del extremo terminal N o C del polipéptido.

Como se señaló anteriormente, una ventaja de la presente invención surge del hecho de que las etiquetas peptídicas y/o el péptido ligasa incorporados en péptidos, oligopéptidos o polipéptidos (por ejemplo, los polipéptidos recombinantes o sintéticos de la invención) pueden estar completamente codificados genéticamente. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una etiqueta peptídica, un péptido ligasa o un polipéptido recombinante o sintético como se definió anteriormente.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica una etiqueta peptídica definida anteriormente comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en cualquiera de las SEQ ID NOs: 6-7 o una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como la expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 6-7.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica un péptido ligasa definida anteriormente comprende una secuencia de nucleótidos como se indica en la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de nucleótidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO 5.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico anterior es al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a la secuencia con la que se compara.

La identidad de la secuencia de ácido nucleico puede determinarse, por ejemplo, mediante FASTA Search usando paquetes GCG, con valores predeterminados y un pamfactor variable, y penalización por creación de espacios establecida en 12,0 y penalización por extensión de espacios establecida en 4,0 con una ventana de 6 nucleótidos. Preferiblemente, dicha comparación se realiza en toda la longitud de la secuencia, pero se puede realizar en una ventana de comparación más pequeña, por ejemplo, menos de 600, 500, 400, 300, 200, 100 o 50 nucleótidos contiguos.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar formadas por ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos así como por residuos sintéticos, por ejemplo, nucleótidos sintéticos, que son capaces de participar en interacciones de pares de bases análogas o de tipo Watson-Crick. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es ADN o ARN.

Las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente pueden unirse operativamente a una secuencia de control de la expresión, o un vehículo o vector de clonación de ADN recombinante que contenga dicha molécula de ADN recombinante. Esto permite la expresión intracelular de los péptidos y polipéptidos de la invención como un producto génico, cuya expresión está dirigida por el gen o genes introducidos en las células de interés. La expresión génica se dirige a partir de un promotor activo en las células de interés y puede insertarse en cualquier forma de vector de ácido nucleico lineal o circular (por ejemplo, ADN) para su incorporación en el genoma o para la replicación independiente o transfección/expresión transitoria. Las técnicas de transformación o transfección adecuadas están bien descritas en la bibliografía. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico desnuda (por ejemplo, ADN o ARN, que puede incluir uno o más residuos sintéticos, por ejemplo, análogos de bases) se puede introducir directamente en la célula para la producción de péptidos y polipéptidos de la invención. Alternativamente, el ácido nucleico se puede convertir en ARNm mediante transcripción in vitro y las proteínas relevantes se pueden generar mediante traducción in vitro.

Los vectores de expresión apropiados incluyen secuencias de control apropiadas como, por ejemplo, elementos de control de traducción (por ejemplo, codones de inicio y parada, sitios de unión ribosomal) y transcripcionales (por ejemplo, regiones de promotor-operador, secuencias de terminación) enlazados en un marco de lectura coincidente con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los vectores apropiados pueden incluir plásmidos y virus (incluidos virus bacteriófagos y eucariotas). Los vectores virales adecuados incluyen baculovirus y también adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y virus vaccinia/viruela. En la técnica se describen muchos otros vectores virales. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen vectores de expresión bacterianos y de mamíferos pGEX-KG, pEF-neo y pEF-HA.

Como se señaló anteriormente, el polipéptido recombinante o sintético de la invención puede comprender secuencias adicionales (por ejemplo, etiquetas peptídicas/polipeptídicas para facilitar la purificación del polipéptido) y, por lo tanto, la molécula de ácido nucleico puede fusionarse convenientemente con ADN que codifica un péptido o polipéptido adicional, por ejemplo etiqueta His, proteína de unión a maltosa, para producir una proteína de fusión en expresión.

Por tanto, visto desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector, preferiblemente un vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente.

Otros aspectos de la invención incluyen métodos para preparar moléculas de ácido nucleico recombinantes de acuerdo con la invención, que comprenden insertar una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica la etiqueta peptídica y/o polipéptido de la invención en un vector de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente contenidas en un vector, pueden introducirse en una célula por cualquier medio apropiado. Las técnicas de transformación o transfección adecuadas están bien descritas en la bibliografía. Se conocen y pueden usarse numerosas técnicas para introducir dichos vectores en células procariotas o eucariotas para su expresión. Las células huésped preferidas para este propósito incluyen líneas celulares de insectos, levadura, líneas celulares de mamíferos o E. coli, tales como la cepa BL21/DE3. La invención también se extiende a células huésped procariotas o eucariotas transformadas o transfectadas que contienen una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector como se definió anteriormente.

Por tanto, en otro aspecto, se proporciona una célula huésped recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico y/o un vector como se describió anteriormente.

Por "recombinante" se entiende que la molécula de ácido nucleico y/o el vector se ha introducido en la célula huésped. La célula huésped puede contener o no de forma natural una copia endógena de la molécula de ácido nucleico, pero es recombinante porque se ha introducido una copia exógena o endógena adicional de la molécula de ácido nucleico y/o vector.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un proceso para producir o expresar la etiqueta peptídica y/o polipéptido de la invención como se definió anteriormente, que comprende las etapas de: a) transformar o transfectar una célula huésped con un vector que comprende una molécula de ácido núcleo como se define en el presente documento; b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y/o etiqueta peptídica; y opcionalmente c) aislar la etiqueta peptídica y/o el polipéptido. La etiqueta peptídica expresada y/o el polipéptido obtenido a partir del método también se describen en el presente documento.

En algunas realizaciones, las etiquetas peptídicas y/o polipéptidos de la invención, o para su uso en el método y usos de la invención, pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, por ligación de aminoácidos o péptidos más pequeños generados sintéticamente, o más convenientemente por expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido como se describió aquí anteriormente.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden generarse sintéticamente por cualquier medio adecuado conocido en la técnica.

Por tanto, la etiqueta peptídica y/o polipéptido de la invención puede ser una etiqueta peptídica o polipéptido aislado, purificado, recombinante o sintetizado.

El término "polipéptido" se usa aquí de manera intercambiable con el término "proteína". Como se señaló anteriormente, el término polipéptido o proteína típicamente incluye cualquier secuencia de aminoácidos que comprenda al menos 40 residuos de aminoácidos consecutivos, por ejemplo, al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 aminoácidos, tal como 40-1000, 50-900, 60-800, 70-700, 80-600, 90-500, 100-400 aminoácidos.

De manera similar, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser una molécula de ácido nucleico aislada, purificada, recombinante o sintetizada.

Por tanto, visto alternativamente, las etiquetas peptídicas, polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de la invención son preferiblemente moléculas no nativas, es decir, moléculas no naturales.

En la presente memoria se utiliza la nomenclatura estándar de aminoácidos. Por tanto, el nombre completo de un residuo de aminoácido puede usarse indistintamente con un código de una letra o abreviaturas de tres letras. Por ejemplo, la lisina se puede sustituir con K o Lys, la isoleucina se puede sustituir con I o Ile, etc. Además, los términos aspartato y ácido aspártico, y glutamato y ácido glutámico se usan indistintamente en el presente documento y pueden reemplazarse con Asp o D, o Glu o E, respectivamente.

Aunque se prevé que las etiquetas peptídicas y polipéptidos de, y para uso, en la invención se pueden producir de forma recombinante, y esta es una realización preferida de la invención, será evidente que las etiquetas peptídicas de la invención pueden conjugarse con proteínas u otras entidades, por ejemplo, moléculas, como se definió anteriormente por otros medios. En otras palabras, la etiqueta peptídica y otra molécula, componente o entidad, por ejemplo, proteína, se puede producir por separado por cualquier medio adecuado, por ejemplo, de forma recombinante y posteriormente conjugarse (unirse) para formar un conjugado de etiqueta peptídica-otro componente que puede usarse en los métodos y usos de la invención. Por ejemplo, las etiquetas peptídicas de la invención pueden producirse sintéticamente o de forma recombinante, como se describió anteriormente, y conjugarse con otro componente, por ejemplo, una proteína a través de un enlazador o espaciador no peptídico, por ejemplo, un enlazador químico o espaciador.

Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica y otro componente, por ejemplo, proteína, pueden unirse directamente a través de un enlace o indirectamente a través de un grupo de enlace. Cuando se emplean grupos de enlace, dichos grupos pueden elegirse para proporcionar la unión covalente de la etiqueta peptídica y otra entidad, por ejemplo, proteína, a través del grupo de enlace. Los grupos de enlace de interés pueden variar ampliamente según la naturaleza de la otra entidad, por ejemplo, proteína. El grupo de enlace, cuando está presente, es en muchas formas de realización biológicamente inerte.

Los expertos en la técnica conocen una variedad de grupos de enlace y encuentran uso en la invención. En realizaciones representativas, el grupo de enlace es generalmente al menos aproximadamente de 50 daltons, normalmente al menos aproximadamente de 100 daltons y puede ser tan grande como de 1.000 daltons o más, por ejemplo hasta 1.000.000 daltons si el grupo de enlace contiene un espaciador, pero generalmente no excederá los 500 daltons y normalmente no excederá los 300 daltons. Generalmente, tales enlazadores comprenderán un grupo espaciador terminado en cualquier extremo con una función reactiva capaz de unirse covalentemente a la etiqueta peptídica y otra molécula o componente, por ejemplo, proteína.

Los grupos espaciadores de interés pueden incluir cadenas de hidrocarburos alifáticos e insaturados, espaciadores que contienen heteroátomos tales como oxígeno (éteres tales como polietilenglicol) o nitrógeno (poliaminas), péptidos, carbohidratos, sistemas cíclicos o acíclicos que posiblemente pueden contener heteroátomos. Los grupos espaciadores también pueden estar compuestos por ligandos que se unen a metales de manera que la presencia de un ión metálico coordina dos o más ligandos para formar un complejo. Los elementos espaciadores específicos incluyen: 1,4-diaminohexano, xililendiamina, ácido tereftálico, ácido 3,6-dioxaoctanodioico, ácido etilendiamina-N,N-diacético, ácido 1,1'-etilenbis(5-oxo-3-pirrolidinacarboxílico), 4,4'-etilendipiperidina, oligoetilenglicol y polietilenglicol. Las posibles funciones reactivas incluyen grupos funcionales nucleofílicos (aminas, alcoholes, tioles, hidrazidas), grupos funcionales electrofílicos (aldehídos, ésteres, vinil cetonas, epóxidos, isocianatos, maleimidas), grupos funcionales capaces de reacciones de cicloadición, formando enlaces disulfuro o enlazados a metales. Los ejemplos específicos incluyen aminas primarias y secundarias, ácidos hidroxámicos, ésteres de N-hidroxisuccinimidilo, carbonatos de N-hidroxisuccinimidilo, oxicarbonilimidazoles, ésteres de nitrofenilo, ésteres de trifluoroetilo, éteres de glicidilo, vinilsulfonas y maleimidas. Los grupos enlazadores específicos que pueden encontrar uso en el reactivo de bloqueo en cuestión incluyen compuestos heterofuncionales, tales como azidobenzoil hidrazida, N-[4-(pazidosalicilamino)butil]-3'-[2'-piridilditio]propionamida), suberato de bis-sulfosuccinimidilo, dimetil-adipimidato, tartrato de disuccinimidilo, éster de N-maleimidobutiriloxisuccinimida, sulfosuccinimidil-4-azidobenzoato de N-hidroxilo, [4-azidofenil]-1,3'-ditiopropionato de N-succinimidilo, [4-yodoacetil]aminobenzoato de N-succinimidilo, glutaraldehído, y succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato, éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico (SMCC), y similares. Por ejemplo, se puede formar un espaciador con una azida que reacciona con alquino o una tetrazina que reacciona con trans-cicloocteno o norborneno.

En algunas realizaciones, puede ser útil modificar uno o más residuos en la etiqueta peptídica y/o polipéptido para facilitar la conjugación de estas moléculas y/o para mejorar la estabilidad de la etiqueta peptídica y/o polipéptido. Por tanto, en algunas realizaciones, la etiqueta peptídica o polipéptido de, o para uso en, la invención puede comprender aminoácidos no naturales o no estándar.

En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica o polipéptido de, o para uso en, la invención puede comprender uno o más, por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5 aminoácidos no convencionales, tal como 10, 15, 20 o más no convencionales, es decir, aminoácidos que poseen una cadena lateral que no está codificada por el código genético estándar, denominados en el presente documento "aminoácidos no codificados" (véase, por ejemplo, la Tabla 1). Estos pueden seleccionarse de aminoácidos que se forman a través de procesos metabólicos tales como ornitina o taurina, y/o aminoácidos modificados artificialmente tales como 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc), (terc)-(B)util(o)xi (c)arbonilo (Boc), aminoácidos protegidos con 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), o aminoácidos que tienen el grupo benciloxicarbonilo (Z).

Ejemplos de aminoácidos análogos estructurales o no estándar que se pueden usar en los enlazadores peptídicos o polipéptidos de, y para usar en, la invención son D aminoácidos, isósteros de amida (tales como N-metilamida, amida retroinversa, tioamida, tioéster, fosfonato, cetometileno, hidroximetileno, fluorovinilo, (E)-vinilo, metilenamino, metilentio o alcano), L-N metilaminoácidos, D-a metilaminoácidos, DN-metilaminoácidos. En la Tabla 1 se enumeran ejemplos de aminoácidos no convencionales, es decir, no codificados.

Tabla 1

Aminoácidos no convencionales Código Aminoácidos no convencionales Código

ácido a-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala

a-amino-a-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg carboxilato de Cpro L-N-metilasparagina Nmasn

aminociclopropano ácido L-N-metilaspártico Nmasp

ácido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcis

Carboxilato de Norb L-N-metilglutamina Nmgln

aminonorbornilo ácido L-N-metilglutámico Nmglu

ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis ciclopentilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile

D-alanina Dal L-N-metil-leucina Nmleu

D-arginina Darg L-N-metil-lisina Nmlis

ácido D-aspártico Dasp L-N-metil-metionina Nmmet

D-cisteína Dcis L-N-metil-norleucina Nmnle

D-glutamina Dgln L-N-metil-norvalina Nmnva

ácido D-glutámico Dglu L-N-metil-ornitina Nmorn

D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmfe

(continuación)

Aminoácidos no convencionales Código Aminoácidos no convencionales Código D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlis L-N-metiltreonina Nmtr D-metionina Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nmtir D-fenilalanina Dfe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug D-treonina Dtr L-norleucina Nle D-triptófano Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtir a-metil-aminoisobutirato Maib D-valina Dval a-metil-Y-aminobutirato Mgabu D-a-metilalanina Dmala a-metilciclohexilalanina Mchexa D-a-metilarginina Dmarg a-metilcilcopentilalanina Mcpen D-a-metilasparagina Dmasn a-metil-a-naftilalanina Manap D-a-metilaspartato Dmasp a-metilpenicilamina Mpen D-a-metilcisteína Dmcis N-(4-aminobutil)glicina Nglu D-a-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg D-a-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn D-a-metilisoleucina Dmile N-amino-a-metilbutirato Nmaabu D-a-metil-leucina Dmleu a-naftilalanina Anap D-a-metil-lisina Dmlis N-bencilglicina Nfe D-a-metil-metionina Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln D-a-metilornitina Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn D-a-metilfenilalanina Dmfe N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-a-metilprolina Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp D-a-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D-a-metiltreonina Dmtr N-cicloheptilglicina Nchep D-a-metiltriptófano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex D-a-metiltirosina Dmti N-ciclodecilglicina Ncdec D-a-metilvalina Dmval N-cilcododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund D-N-metilaspartato Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm D-N-metilcisteína Dnmcis N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe D-N-metilglutamina Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg D-N-metilglutamato Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Ntr D-N-metilhistidina Dnmhis N-(hidroxietil))glicina Nser D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis (continuación)

Aminoácidos no convencionales Código Aminoácidos no convencionales Código

D-N-metil-leucina Dnmleu N-(3-indolilietil)glicina Nhtrp

D-N-metil-lisina Dnmlis N-metil-Y-aminobutirato Nmgabu

N-metilciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen

N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmfe

N-metilaminoisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro

N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmtr

D-N-metiltriptófano Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval

D-N-metiltirosina Dnmtir N-metila-naftilalanina Nmanap

D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen ácido Y-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtir

L-t-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncis

L-etilglicina Etg penicilamina Pen

L-homofenilalanina Hfe L-a-metilalanina Mala

L-a-metilarginina Marg L-a-metilasparagina Masn

L-a-metilaspartato Masp L-a-metil-t-butilglicina Mtbug

L-a-metilcisteína Mcis L-metiletilglicina Metg

L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu

L-a-metilhistidina Mhis L-a-metilhomofenilalanina Mhfe

L-a-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet

L-a-metil-leucina Mleu L-a-metil-lisina Mlis

L-a-metilmetionina Mmet L-a-metilnorleucina Mnle

L-a-metilnorvalina Mnva L-a-metilornitina Morn

L-a-metilfenilalanina Mfe L-a-metilprolina Mpro

L-a-metilserina Mser L-a-metiltreonina Mtr

L-a-metiltriptófano Mtrp L-a-metiltirosina Mtir

L-a-metilvalina Mval L-N-metilhomofenilalanina Nmhfe

N-(N-(2,2-difeniletil)carbamil-metil) Nnbhm N-(N-(3,3-difenilpropil)carbamil-metil) Nnbhe glicina glicina

1-carboxi-1-(2,2-difenil-etilamino) Nmbc L-O-metil serina Omser ciclopropano L-O-metil homoserina Omhse

Como se discutió anteriormente, en algunas realizaciones, puede ser útil fusionar o conjugar la etiqueta peptídica y/o polipéptido (péptido ligasa) de la invención a un sustrato sólido (es decir, una fase sólida o soporte) y será evidente que esto se puede lograr de cualquier manera conveniente. Por tanto, la manera o los medios de inmovilización y el soporte sólido pueden seleccionarse, según se elija, entre cualquier número de medios de inmovilización y soportes sólidos que se conocen ampliamente en la técnica y se describen en la bibliografía. Por tanto, la etiqueta peptídica y/o el polipéptido pueden unirse directamente al soporte, por ejemplo a través de un dominio o fracción de la etiqueta peptídica o polipéptido (por ejemplo, entrecruzado químicamente). En algunas realizaciones, la etiqueta peptídica o polipéptido puede unirse indirectamente por medio de un grupo enlazador, o mediante un grupo o grupos de unión intermediarios (por ejemplo, por medio de una interacción biotina-estreptavidina). Por tanto, la etiqueta peptídica o el polipéptido pueden unirse covalentemente o no covalentemente al soporte sólido. El enlace puede ser un enlace reversible (por ejemplo, escindible) o irreversible. Por tanto, en algunas realizaciones, el enlace se puede escindir enzimáticamente, químicamente o con luz, por ejemplo, el enlace puede ser un enlace sensible a la luz.

Por tanto, en algunas realizaciones, se puede proporcionar una etiqueta peptídica o polipéptido con medios para la inmovilización (por ejemplo, un compañero de unión por afinidad, por ejemplo, biotina o un hapteno, capaz de unirse a su compañero de unión, es decir, un compañero de unión afín, por ejemplo, estreptavidina o un anticuerpo) proporcionado en el soporte. En algunas realizaciones, la interacción entre la etiqueta peptídica o polipéptido y el soporte sólido debe ser lo suficientemente robusta para permitir las etapas de lavado, es decir, la interacción entre la etiqueta peptídica o polipéptido y el soporte sólido no se interrumpe (se rompe significativamente) por las etapas de lavado descritas anteriormente. Por ejemplo, se prefiere que con cada etapa de lavado, menos del 5%, preferiblemente menos del 4, 3, 2, 1, 0,5 o 0,1% de la etiqueta peptídica o polipéptido se elimine o eluya de la fase sólida.

El soporte sólido (fase o sustrato) puede ser cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos que se utilizan o se proponen actualmente para la inmovilización, separación, etc. Estos pueden tomar la forma de partículas (por ejemplo, perlas que pueden ser magnéticas, paramagnéticas o no magnéticas), láminas, geles, filtros, membranas, fibras, capilares, portaobjetos, matrices o tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, etc.

El soporte puede estar hecho de vidrio, sílice, látex o un material polimérico. Son adecuados los materiales que presentan una gran superficie específica para la unión de la proteína de fusión. Dichos soportes pueden tener una superficie irregular y pueden ser, por ejemplo, porosos o particulados, por ejemplo, partículas, fibras, bandas, sinterizados o tamices. Lo materiales particulados, por ejemplo, las perlas son útiles debido a su mayor capacidad de unión, particularmente perlas poliméricas.

Convenientemente, un soporte sólido particulado usado de acuerdo con la invención comprenderá perlas esféricas. El tamaño de las perlas no es crítico, pero puede ser, por ejemplo, del orden de diámetro de al menos 1 y preferiblemente al menos 2 pm, y tener un diámetro máximo preferiblemente de no más de 10, y por ejemplo, no más de 6 pm.

Las partículas monodispersas, es decir, aquellas que tienen un tamaño sustancialmente uniforme (por ejemplo, un tamaño que tiene una desviación estándar del diámetro de menos del 5%) tienen la ventaja de que proporcionan una reproducibilidad de reacción muy uniforme. Pueden producirse partículas de polímero monodispersas representativas mediante la técnica descrita en el documento US-A-4336173.

Sin embargo, para ayudar a la manipulación y separación, las perlas magnéticas son ventajosas. El término "magnético", como se usa en este documento, significa que el soporte es capaz de recibir un momento magnético cuando se coloca en un campo magnético y, por lo tanto, es desplazable bajo la acción de ese campo. En otras palabras, un soporte que comprende partículas magnéticas puede eliminarse fácilmente mediante agregación magnética, lo que proporciona una forma rápida, sencilla y eficaz de separar las partículas después de las etapas de formación del enlace isopeptídico.

En algunas realizaciones, el soporte sólido es una resina de agarosa.

Como se discutió en los Ejemplos, los inventores han determinado sorprendentemente que el péptido ligasa de la invención puede liofilizarse sin una pérdida significativa de actividad. Esto puede ser particularmente ventajoso para el almacenamiento y/o transporte a largo plazo del polipéptido a temperatura ambiente, es decir, sin necesidad de enfriamiento. Por tanto, en algunas realizaciones, el polipéptido (péptido ligasa) y las etiquetas peptídicas de la invención pueden estar en un estado liofilizado. Visto alternativamente, la invención proporciona un polipéptido liofilizado (péptido ligasa) como se definió anteriormente. La invención también puede proporcionar etiquetas peptídicas liofilizadas como se definió anteriormente. La liofilización se puede lograr usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica.

En una realización adicional, la invención proporciona un kit, particularmente un kit para su uso en los procesos y usos de la invención, es decir, para conjugar dos moléculas o componentes a través de un enlace isopeptídico o para producir un complejo entre tres moléculas o componentes, en el que dos de las moléculas o componentes del complejo se conjugan mediante un enlace isopeptídico, en el que dicho kit comprende:

(a) un péptido ligasa como se definió anteriormente, opcionalmente conjugado o fusionado a una molécula o componente, por ejemplo, una proteína; y

(b) una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2;

(ii) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de lisina en la posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2,

(iii) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3; o

(iv) una secuencia de aminoácidos con al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un residuo de asparagina en la posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3,

en la que dicha etiqueta peptídica está conjugada o fusionada a una molécula o componente, por ejemplo, una proteína tal como un polipéptido recombinante o sintético que comprende una etiqueta peptídica como se definió anteriormente; y/o

(c) una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector, que codifica un péptido ligasa como se define en (a); y (d) una molécula de ácido nucleico, particularmente un vector, que codifica una etiqueta peptídica como se define en (b).

En algunas realizaciones, el kit puede comprender además una segunda etiqueta peptídica conjugada o fusionada a una molécula o componente, por ejemplo, una proteína tal como un polipéptido recombinante o sintético que comprende una etiqueta peptídica como se definió anteriormente, en la que la segunda etiqueta peptídica es capaz de formar un enlace isopeptídico con la etiqueta peptídica en (b) cuando se pone en contacto con un péptido ligasa de (a) en condiciones adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico como se definió anteriormente. Por tanto, en algunas realizaciones, el kit comprende una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 (o una variante de la misma) conjugada o fusionada a una molécula o componente y una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID. NO: 3 (o variante del mismo) conjugada o fusionada a una molécula o componente.

Será evidente que el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas de la invención tienen una amplia gama de utilidades. Visto alternativamente, el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas de la invención pueden emplearse en una variedad de industrias.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas de la invención pueden encontrar utilidad para dirigir sondas o etiquetas fluorescentes u otras sondas biofísicas o etiquetas a proteínas específicas. A este respecto, la proteína de interés puede modificarse para incorporar una primera etiqueta peptídica (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2), como se discutió anteriormente, y la sonda o etiqueta fluorescente u otra sonda biofísica puede fusionarse o conjugarse con la segunda etiqueta peptídica (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3). La proteína modificada y la sonda o etiqueta pueden ponerse en contacto juntos en presencia del péptido ligasa en condiciones adecuadas para permitir la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas, marcando así la proteína con el marcador o sonda mediante un enlace isopeptídico.

En algunas realizaciones, el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas de la invención pueden encontrar utilidad en la inmovilización de proteínas para proteómica. A este respecto, las proteínas de interés pueden modificarse para incorporar una primera etiqueta peptídica (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2) y un sustrato sólido puede fusionarse o conjugarse con la segunda etiqueta peptídica (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3). Las proteínas modificadas y el sustrato sólido pueden ponerse en contacto juntos en presencia del péptido ligasa en condiciones adecuadas para permitir la formación de un enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas, inmovilizando así las proteínas sobre el sustrato sólido mediante un enlace isopeptídico. Será evidente que las etiquetas peptídicas y la ligasa de la invención pueden usarse para inmovilizar simultáneamente múltiples proteínas en una fase sólida/sustrato.

En otras realizaciones más, el péptido ligasa y las etiquetas peptídicas de la invención pueden encontrar utilidad en la conjugación de antígenos con partículas similares a virus, virus, bacterias o estructuras de multimerización para vacunación. Por ejemplo, la producción de partículas similares a virus, virus o bacterias que muestran una primera etiqueta peptídica en la superficie facilitaría la conjugación de antígenos que comprenden una segunda etiqueta peptídica a su superficie a través de un enlace isopeptídico, utilizando el péptido ligasa de la invención para mediar en la formación del enlace isopeptídico. A este respecto, la multimerización de antígenos da lugar a respuestas inmunes muy mejoradas. Por tanto, en algunas realizaciones, la molécula o componente fusionado al primer péptido de la invención es una proteína de la cápside viral y/o la molécula o componente fusionado a la segunda etiqueta peptídica de la invención es un antígeno, por ejemplo, un antígeno asociado con una enfermedad particular, por ejemplo, infección.

En otras realizaciones, las etiquetas peptídicas se pueden usar para ciclar una proteína, por ejemplo, fusionando etiquetas peptídicas en cada extremo de la proteína y posteriormente poniendo en contacto la proteína con el péptido ligasa de la invención para mediar o promover la formación del enlace isopeptídico entre las etiquetas peptídicas. A este respecto, se ha demostrado que la ciclación de proteínas aumenta la resiliencia de las proteínas, por ejemplo, al calor, disolvente orgánico, pH extremo o degradación proteolítica.

En particular, la ciclación de enzimas o polímeros enzimáticos (proteínas de fusión) puede mejorar la termoestabilidad de la proteína o unidades proteicas en el polímero enzimático. En este sentido, las enzimas son herramientas valiosas en muchos procesos, pero son inestables y difíciles de recuperar. Los polímeros enzimáticos tienen una mayor estabilidad a la temperatura, el pH y los disolventes orgánicos y existe un mayor deseo de utilizar polímeros enzimáticos en los procesos industriales. Sin embargo, la generación de polímeros enzimáticos utiliza comúnmente una reacción no específica de glutaraldehído y esto dañará o desnaturalizará (es decir, reducirá la actividad de) muchas enzimas potencialmente útiles. Se espera que el enlace específico de sitio de proteínas en cadenas (polímeros) a través de enlaces isopeptídicos utilizando las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la presente invención mejore la resiliencia de las enzimas, tal como en el diagnóstico o las enzimas añadidas a la alimentación animal. En realizaciones particularmente preferidas, las enzimas pueden estabilizarse mediante ciclación, como se discutió anteriormente.

El péptido ligasa y las etiquetas peptídicas de la invención también podrían usarse para unir múltiples enzimas en rutas para promover la eficiencia metabólica, como se describe en el documento WO 2016/193746. En este sentido, las enzimas a menudo se unen para funcionar en vías dentro de las células y, tradicionalmente, ha sido difícil conectar múltiples enzimas juntas fuera de las células (in vitro). Por tanto, las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención podrían usarse para acoplar o conjugar enzimas para producir proteínas de fusión y, por lo tanto, mejorar la actividad de rutas enzimáticas de múltiples etapas, que podrían ser útiles en una variedad de conversiones industriales y para diagnóstico. Por ejemplo, la proteína de fusión puede crear equipos de señalización para inducir respuestas celulares, por ejemplo, en diferenciación o terapia.

Las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención también encontrarán utilidad en la producción de polímeros de anticuerpos. A este respecto, los anticuerpos son una de las clases más importantes de productos farmacéuticos y, a menudo, se utilizan adheridos a superficies. Sin embargo, la mezcla de antígenos en una muestra y, por tanto, la captura de dicho antígeno en dicha muestra, son ineficaces cerca de superficies. Al extender las cadenas de anticuerpos, se anticipa que se mejorará la eficiencia de captura. Esto será especialmente valioso en el aislamiento de células tumorales circulantes, que en la actualidad es una de las formas más prometedoras de permitir el diagnóstico temprano del cáncer. También se pueden combinar anticuerpos de diferentes especificidades en cualquier orden deseado.

En otra realización más, las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención pueden encontrar utilidad en la producción de fármacos para activar la señalización celular. En este sentido, muchas de las formas más efectivas de activar la función celular son a través de ligandos de proteínas. Sin embargo, en la naturaleza, un ligando de proteína normalmente no funcionará solo sino con una combinación específica de otras moléculas de señalización. Por tanto, las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención permiten la generación de proteínas de fusión adaptadas (es decir, grupos de proteínas), que podrían producir una activación óptima de la señalización celular. Estas proteínas de fusión (grupos de proteínas) podrían aplicarse para controlar la supervivencia, división o diferenciación celular.

En otras realizaciones más, las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención pueden encontrar utilidad en la generación de hidrogeles para el crecimiento de células madre, preparación de biomateriales, funcionalización de anticuerpos con tintes o enzimas y enzimas estabilizantes por ciclación.

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitativos con referencia a los siguientes dibujos:

La Figura 1 (A) muestra un dibujo de cómo se dividió y modificó la RrgA para llegar a las etiquetas peptídicas y el péptido ligasa de la invención. El dominio terminal C de RrgA (Protein Data Bank 2WW8) se dividió en tres partes y se modificó, de manera que la Lys reactiva esté ubicada en SnoopTagJr, la Asn reactiva en DogTag y la Glu catalítica en SnoopLigase. (B) muestra la base molecular para la formación de enlaces isopeptídicos en RrgA, en la que Glu 803 cataliza la formación de enlaces isopeptídicos entre Lys 742 y Asn 854, eliminando el amoníaco (números de residuos como en el archivo PDB). (C) muestra un dibujo del uso de DogTag y SnoopTagJr para la ligación péptidopéptido.

La Figura 2 (A) es un gráfico que muestra la reactividad de diferentes mutantes de RrgALigase, en la que: RrgALigase se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 8; A808P se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 8, en la que el residuo 66 es prolina; A808P Q837P se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 8, en la que los residuos 66 y 95 son ambos prolina; A808P Q837P D838G se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 8, en la que los residuos 66 y 95 son prolina y el residuo 96 es glicina; y SnoopLigase se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1. (B) una fotografía de un gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza la reactividad de SnoopLigase, SnoopTagJr y DogTag junto con controles con mutación de alanina de Lys reactiva de SnoopTagJr (KA) y Asn reactiva de DogTag (NA) y la mutación de glutamina de Glu reactiva de SnoopLigase (EQ), en la que SnoopTagJr se expresó como una proteína de fusión con un Aficuerpo de HER2 y DogTag se expresó como una proteína de fusión con SUMO. La Figura 3 muestra una fotografía de un gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de productos de la reacción de ligación en fase sólida descrita en el Ejemplo 4.

La Figura 4 muestra gráficos que demuestran el efecto de (A) pH y (B) temperatura sobre la actividad de SnoopLigase ligando SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag.

La Figura 5 muestra gráficos que demuestran el efecto de (A) concentración de NaCl, (B) detergentes y (C) glicerol sobre la actividad de SnoopLigase ligando SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag.

La Figura 6 muestra un gráfico de barras que muestra la cantidad relativa de producto formado en reacciones repetidas de SnoopLigase inmovilizado sobre un sustrato sólido después de la elución del producto de reacción usando condiciones de pH bajo. El rendimiento del producto se normalizó con respecto al rendimiento del ciclo de reacción 1. n = 9, media /-1 DE.

La Figura 7 muestra (A) una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de productos de la reacción entre IMX-DogTag y SnoopTagJr-MBP descrita en el Ejemplo 6; y (B) un gráfico que muestra la cuantificación de la reacción descrita en (A) (n = 3, media /-1 DE).

La Figura 8 muestra (A) una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de productos de la reacción entre SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag descrita en el Ejemplo 6; y (B) un gráfico que muestra la cuantificación de la reacción descrita en (A) (n = 3, media /-1 DE).

La Figura 9 muestra una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de elución dependiente de la temperatura del producto de SnoopLigase descrito en el Ejemplo 7, en el que "Competidor" se refiere al péptido SnoopTag unido covalentemente a AffiHER2-DogTag.

La Figura 10 muestra una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de elución dependiente de aditivos del producto de SnoopLigase descrito en el Ejemplo 8, en el que "Control" no tiene aditivo para el tampón de elución y "Reacción" es la mezcla anterior a la captura de resina.

La Figura 11 muestra una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de titulación de imidazol para la elución del producto de SnoopLigase descrito en el Ejemplo 8. "Dejada en resina" se refiere a muestras después de hervir la resina después de la elución con tampón de carga de SDS, para visualizar lo que quedó en la resina. Esta ebullición liberó subunidades de estreptavidina de la estreptavidina-agarosa.

La Figura 12 muestra un gráfico que muestra la cantidad de producto de reacción formado entre SUMO-DogTag y SnoopTag-AffiHER2 o SnoopTagJr-AffiHER2, catalizado por SnoopLigase (n = 3, media /-1 DE).

La Figura 13 muestra un gráfico que muestra la cantidad de producto de reacción formado entre SUMO-DogTag y SnoopTagJr-AffiHER2, catalizado por SnoopLigase a diversas concentraciones de TMAO (n = 3, media /-1 DE). La Figura 14 muestra una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de la reactividad de la proteína de fusión interna DogTag-MBP con SnoopTagJr-AffiHER2, catalizada por SnoopLigase descrita en el Ejemplo 11.

La Figura 15 muestra una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de diferentes métodos de elución para separar el producto de reacción de la proteína SUMO-DogTag con SnoopTagJr-AffiHER2 de SnoopLigase. La "Elución por péptido" se refiere a la elución usando el péptido competidor SnoopTagJr: DogTag descrito en el Ejemplo 12.

La Figura 16 muestra una fotografía de una SDS-PAGE con tinción de Coomassie que caracteriza el análisis de productos de la reacción entre SnoopTagJr-AffiHER2 y la proteína de fusión interna HaloTag7SS-DogTag, catalizada por SnoopLigase descrita en el Ejemplo 11.

La Figura 17 muestra (A) un gráfico de barras que muestra la actividad de SnoopLigase liofilizada después del almacenamiento a 37 °C durante el número especificado de días en relación con la actividad de una muestra no liofilizada como se describe en el Ejemplo 14, y (B) un gráfico de barras que muestra la actividad de SnoopLigase con agentes reductores en relación con SnoopLigase sin agentes reductores como se describe en el Ejemplo 14.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Desarrollo del péptido ligasa (SnoopLigase) y las etiquetas peptídicas

La RrgA (SEQ ID NO: 4) es una adhesina de Streptococcus pneumoniae, una bacteria Gram-positiva que puede causar septicemia, neumonía y meningitis en humanos. Se forma un enlace isopeptídico espontáneo en el dominio de tipo inmunoglobulina D4 de RrgA entre los residuos Lys742 y Asn854.

Los inventores "dividen" el dominio D4 en tres partes, un par de etiquetas peptídicas denominadas SnoopTag (residuos 734-745 de RrgA, SEQ ID NO: 9) y RrgATag2 (residuos 838-860 de RrgA, SEQ ID NO: 10) y una proteína que se denominó RrgALigase (residuos 743-846, SEQ ID NO: 8). En particular, existe una superposición de 9 aminoácidos entre el extremo terminal N de RrgATag2 y el extremo terminal C de RrgALigase. De manera similar, hay una superposición de 3 aminoácidos entre el extremo terminal C de SnoopTag y el extremo terminal N de RrgALigase. Además, las secuencias de RrgALigase y RrgATag2 incorporan modificaciones relativas a la secuencia de RrgA nativa que se sabe que son importantes para promover la velocidad de reacción de la formación del enlace isopeptídico. En particular, la glicina en la posición 842 de RrgA se sustituyó con treonina en la posición correspondiente (equivalente) en RrgALigase y RrgATag2. Además, el ácido aspártico en la posición 848 de RrgA se sustituyó con glicina en la posición correspondiente en RrgATag2.

Se encontró que la selección de los sitios en los que "dividir" el dominio D4 de RrgA era importante para la actividad del péptido ligasa y las etiquetas peptídicas. A este respecto, es un principio general en el diseño de etiquetas peptídicas que deben ser lo más cortas posible, para limitar cualquier interacción no deseada cuando se incorporen en las moléculas o componentes, por ejemplo, proteínas, para unirse entre sí. Por consiguiente, la inclusión de secuencias en etiquetas peptídicas que se solapan con el péptido ligasa no es coherente con los principios de diseño estándar. Sin embargo, se determinó que las secuencias superpuestas son esenciales para la actividad de las etiquetas de ligasa y péptido, ya que se encontró que la eliminación de estas secuencias de las etiquetas o ligasa altera significativamente la eficacia de la reacción de ligación. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, se plantea la hipótesis de que la presencia de secuencias superpuestas mejora la estabilidad de la interacción entre las etiquetas peptídicas y las porciones de ligasa del dominio D4 de RrgA.

Los sitios del terminal N y el terminal C seleccionados para la proteína RrgALigase dieron como resultado la eliminación de 3 cadenas p, que es una modificación importante, particularmente para una proteína pequeña, es decir, el dominio D4 de RrgA. A este respecto, se demostró que la RrgALigase tiene escasa solubilidad y actividad ligasa limitada (véase la Figura 2). De hecho, se demostró que la RrgALigase es insoluble en soluciones que comprenden NaCl, como la solución salina tamponada con fosfato (PBS), que limita severamente su utilidad, particularmente en entornos celulares de organismos vivos. Además, muchos ensayos biológicos in vitro requieren la presencia de NaCl.

Dado que la RrgALigase era más activa a 4 °C, se planteó la hipótesis de que la estabilización de los dominios divididos sería importante para mejorar el rendimiento de la ligasa. Para lograr esta estabilización, los inventores buscaron modificar giros p del dominio de la proteína sustituyendo los residuos apropiados con prolina. Los giros p son elementos proteicos flexibles. La prolina tiene un ángulo 9 fijo de -60° y, por lo tanto, limita la flexibilidad conformacional de la proteína.

La secuencia de RrgALigase se examinó manualmente en busca de sitios adecuados para la mutación a prolina basándose en la estructura cristalina. Se identificaron veinte sitios y se seleccionaron seis para su modificación. Sin embargo, se demostró que solo dos sustituciones de prolina (A66P y Q95P, basadas en la numeración en la SEQ ID NO: 8) mejoraron la actividad, véase la Figura 2.

Se planteó la hipótesis de que la velocidad de la reacción de ligación podría mejorarse estabilizando adicionalmente la proteína. Por consiguiente, los inventores analizaron el dominio terminal C de RrgA utilizando Protein Repair One Stop Shop (PROSS). PROSS analiza proteínas basándose en la homología de secuencia de proteínas y el modelado atomístico de Rosetta. Sin embargo, el alineamiento de secuencia múltiple (MSA) utilizado por PROSS solo identificó 35 secuencias homólogas, lo que es insuficiente para proporcionar resultados significativos. Por consiguiente, los inventores generaron manualmente un MSA separado para que RrgA para ingresar en PROSS.

El análisis PROSS sugirió quince mutaciones que pueden mejorar la estabilidad del dominio terminal C de RrgA y se seleccionaron cinco para un análisis adicional (D737S, A820E, D830N, D838G e I839V según la numeración en RrgA, SEQ ID NO: 4), basándose en la inspección basada en la estructura de los contactos potenciales realizados por las cadenas laterales de aminoácidos recién introducidas. En particular, una de las mutaciones identificadas en el análisis PROSS, D737S, estaba en la secuencia de SnoopTag. Las versiones modificadas de SnoopTag y RrgALigase que incorporan las mutaciones mencionadas anteriormente se denominaron SnoopTagJr (SEQ iD NO: 2) y SnoopLigase (SEQ ID NO: 1), respectivamente. Basándose en estudios de truncamiento de RrgATag2, los inventores también plantearon la hipótesis de que la mutación del residuo de asparagina en la posición 847 de RrgA (posición 10 de RrgATag2, SEQ ID NO: 10) en ácido aspártico también reduciría la heterogeneidad de la proteína etiquetada con péptido. La versión modificada de RrgATag2 se denominó DogTag.

Algunas de las mutaciones PROSS en RrgALigase mejoraron sustancialmente el rendimiento y la velocidad de la reacción (Figura 2), pero A820E y D830N no mejoraron la actividad de la ligasa. De manera similar, la mutación D737S en SnoopTag (es decir, que dio como resultado SnoopTagJr) también tuvo mucho éxito en mejorar la reacción con DogTag.

En vista de la escasa solubilidad de RrgALigase, la proteína se expresó inicialmente como una proteína de fusión de proteína de unión a maltosa (MBP) para reducir la agregación después de la expresión y para facilitar el análisis. Sin embargo, se encontró sorprendentemente que cuando se produjo SnoopLigase sin fusión de MBP, la solubilidad de SnoopLigase mejoró en relación con RrgALigase. SnoopLigase se expresó eficazmente en E. coli (> 10 mg por litro de cultivo) y fue muy soluble (> 500 j M). Como se analiza a continuación en el Ejemplo 3, SnoopLigase es activo en una variedad de condiciones, que incluyen concentraciones extracelulares fisiológicas de NaCl. Por tanto, la mutación de RrgALigase (SEQ ID NO: 8) para generar SnoopLigase (SEQ ID NO: 1) también mejoró la solubilidad de la proteína.

Para validar el mecanismo de reacción propuesto y la especificidad de la ligación de residuos por SnoopLigase, la reacción se analizó mediante SDS-PAg E con cada uno de los residuos clave mutados. SnoopLigase ligó eficientemente un aficuerpo fusionado con SnoopTagJr a un dominio SUMO fusionado a DogTag. Sin embargo, la mutación de Lys 9 en SnoopTagJr, Asn 17 en DogTag o Glu 61 en SnoopLigase abolió la formación del producto (Figura 2B).

Ejemplo 2 - Ligadura péptido-péptido mediada por SnoopLigase

Para validar el mecanismo de reacción propuesto y la especificidad de la ligación de residuos por SnoopLigase, se fusionaron SnoopTagJr y DogTag con proteínas modelo. DogTag se fusionó con el modificador pequeño similar a ubiquitina (SUMO), mientras que SnoopTagJr se fusionó con un aficuerpo contra HER2. La mezcla de SUMO-DogTag y SnoopTagJr-AffiHER2 con SnoopLigase condujo a la aparición de una nueva banda de peso molecular más alto, que representa el producto de ligadura de enlace covalente. La banda tenía el peso molecular esperado y era resistente a la ebullición en tampón de carga de SDS. La mutación de cualquiera de los tres residuos reactivos de la tríada (lisina en la posición 9 en SnoopTagJr, asparagina en la posición 17 en DogTag y ácido glutámico en la posición 61 en SnoopLigase) impidió la aparición de la banda del producto de ligación (Figura 2B). La espectrometría de masas produjo el cambio de peso molecular esperado después de la reacción de los sustratos peptídicos.

Ejemplo 3 - Condiciones de reacción de SnoopLigase

La reacción de SnoopLigase funcionó bien aproximadamente a pH neutro, con poca diferencia de 7,25 a 8,75 (Figura 4A). La ligadura eficiente se produjo en un amplio intervalo de temperaturas (4-37 °C), con un óptimo a 15 °C (Figura 4B). SnoopLigase fue funcional en presencia de concentraciones extracelulares de NaCl, aunque la reacción procede de manera más eficiente con tampón de Tris borato en ausencia de NaCl (Figura 5A). SnoopLigase reaccionó bien en presencia de los detergentes de uso común Tween 20 y Triton X-100 hasta un 2%, pero SDS inhibió la reacción (Figura 5B). La adición del estabilizador de proteínas glicerol al 15-30% (v/v) mejoró la velocidad de reacción (Figura 5C).

La SnoopLigase tenía una temperatura de fusión de 45 °C a partir de DSC y recuperó la actividad completa después de tratamientos térmicos hasta 70 °C. Se restauró la actividad parcial después de calentar a 99 °C.

Ejemplo 4 - Purificación del producto de reacción de SnoopLigase

Tras la reacción, SnoopLigase se unió fuertemente al producto de reacción, lo que permitió una purificación eficaz del producto de reacción de ligación (Figura 3A). Después de hacer reaccionar SnoopTagJr-AffiHER2 con SUMO-DogTag usando SnoopLigase biotinilado, la ligasa fue capturada por estreptavidina-agarosa. La fuerte interacción entre biotinaestreptavidina y el producto de reacción de SnoopLigase permite un lavado riguroso, de modo que se eliminan las proteínas que no han reaccionado. La incubación de la resina con tampón de elución de anticuerpos no afectó la interacción biotina-estreptavidina, pero interrumpió la interacción del producto de reacción SnoopLigase y produjo un producto ligado de alta pureza (Figura 3A), eliminando los productos que no reaccionaron y SnoopLigase. Este procedimiento elimina la necesidad de una purificación posterior que consume mucho tiempo mediante cromatografía de exclusión por tamaño o diálisis. Además, ajustando el volumen de elución, podría eluirse el producto de ligación altamente concentrado, independientemente de las concentraciones de reactivo utilizadas durante la reacción.

Ejemplo 5 - Reacción en fase sólida de SnoopLigase

La inmovilización de enzimas en una fase sólida puede mejorar la eficacia de la reacción y puede facilitar la reutilización rentable de enzimas purificadas. Para probar si SnoopLigase se puede "reciclar" después del tratamiento con tampón de elución de anticuerpos, los inventores inmovilizaron SnoopLigase biotinilada en estreptavidina agarosa y realizaron una reacción de ligación mediante la adición de SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag. Tras el lavado y elución del producto de reacción, se usó la resina de agarosa acoplada a SnoopLigase para otra reacción de ligación. La cantidad de producto formado permaneció constante durante al menos 8 ciclos de reacción, lo que indica que SnoopLigase puede realizar múltiples cambios y el tratamiento de SnoopLigase con pH bajo no desnaturaliza irreversiblemente la enzima (Figura 6).

Ejemplo 6 - Rendimiento de reacción de SnoopLigase

El rendimiento de la reacción entre DogTag y SnoopTagJr catalizada por SnoopLigase se determinó incubando IMX-DogTag a 10 pM con 20 pM de cada uno de SnoopLigase y SnoopTagJr-MBP en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% (v/v) durante una variedad de períodos de tiempo, de 15 minutos a 48 horas, a 4 °C. Las muestras se analizaron usando SDS-PAGE en condiciones reductoras con tinción de Coomassie y las Figuras 7A y B muestran que SnoopLigase facilita el acoplamiento de casi toda la proteína de fusión IMX-DogTag. En particular, se logró un rendimiento de reacción del 96% para IMX-DogTag después de 48 h.

De manera similar, las Figuras 8A y B muestran que la incubación de SnoopTagJr-AffiHER2 a 5 pM con 10 pM de cada uno de SnoopLigase y SUMO-DogTag en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% (v/v) a 4 °C facilita el acoplamiento de casi toda la proteína de fusión SnoopTagJr-AffiHER2 después de 24 horas, es decir, se logró un rendimiento de reacción del 99% para SnoopTagJr-AffiHER2 después de 24 horas.

Ejemplo 7 - Condiciones alternativas para la elución del producto de reacción de una fase sólida

Se investigó el efecto de la temperatura y la competencia sobre la elución del producto de reacción de una fase sólida usando las proteínas de fusión SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag y SnoopLigase biotinilada descritas en el Ejemplo 5. Las proteínas de fusión y SnoopLigase (50 pM cada una) se incubaron en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% (v/v) durante 5 h a 4 °C. Se eXtrajo la biotina-SnoopLigase usando estreptavidina agarosa y la resina se lavó 5 veces con 5 volúmenes de resina de PBS. La elución se realizó dos veces con 10 pl de PBS con o sin 35 pM de una proteína competidora (péptido SnoopTag unido covalentemente a AffiHER2-DogTag), cada una durante 5 min a temperaturas que oscilan entre 25-55 °C. La Figura 9 muestra que se logró una elución eficiente a temperaturas de 55 °C y que la adición de una proteína competidora permitió una elución eficiente a 45 °C.

Ejemplo 8 - Elución de producto dependiente de aditivos de SnoopLigase

Se seleccionaron doce aditivos (mostrados en la Figura 10) para determinar si eran capaces de interrumpir la interacción no covalente entre SnoopLigase y su producto de reacción.

Se incubó SnoopLigase biotinilada con SUMO-DogTag y SnoopTagJr-AffiHER2 a 50 pM cada uno durante 24 h a 4 °C. Se extrajo la biotina-SnoopLigase con estreptavidina agarosa y la resina se lavó 5 veces con 5 volúmenes de resina de tampón PT (Tris fosfato 10 mM, pH 6,5) a 25 °C. La elución se realizó dos veces con 4 volúmenes de resina de tampón PT que contenía un competidor proteico AffiHER2-DogTag:SnoopTag 16 pM (descrito en el Ejemplo 7) y uno de los doce aditivos seleccionados indicados en la Figura 10, pH 6,5 durante 5 min a 37 °C. Una reacción de control no utilizó aditivos en el tampón de elución.

La Figura 10 muestra que una solución que comprende imidazol 1 M y el competidor proteico dio como resultado una elución eficaz del producto de reacción (conjugado covalente) de la fase sólida.

Se investigó el efecto de diferentes concentraciones de imidazol en ausencia de un competidor proteico. Se incubaron SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag con biotina-SnoopLigase a 50 pM cada uno en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% (v/v) durante 24 ha 4 °C. Se extrajo la biotina-SnoopLigase con resina de estreptavidina agarosa y esta resina se lavó 4 veces con 5 volúmenes de resina de tampón PT (Tris fosfato 25 mM pH 7,0) a 25 °C. La elución se realizó con concentraciones de imidazol en el intervalo de 0,5 a 4 M, pH 7,0 en tampón PT a 25 °C durante 5 min.

La Figura 11 muestra que una solución que comprende imidazol 2 M es suficiente para eluir eficazmente el producto de reacción de la fase sólida en condiciones fisiológicamente relevantes, es decir, pH 7,0 y 25 °C. Las concentraciones notablemente más altas de imidazol dieron como resultado la elución de SnoopLigase y estreptavidina de la fase sólida.

Ejemplo 9 - Comparación de la actividad de SnoopTag (SEQ ID NO: 9) y SnoopTagJr (SEQ ID NO: 2)

Se realizó un ensayo comparativo para medir la diferencia en la actividad producida modificando la secuencia de SnoopTag (SEQ ID NO: 9) para generar SnoopTagJr (SEQ ID NO: 2).

Se incubaron SnoopLigase y SUMO-DogTag a 10 pM cada uno con 10 pM de SnoopTag-AffiHER2 o SnoopTagJr-AffiHER2 en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% (v/v) durante intervalos de tiempo entre 15 minutos y 24 horas a 4 °C.

La Figura 12 muestra que SnoopTagJr reaccionó más eficazmente que SnoopTag en todos los puntos de tiempo, medido por la cantidad total de producto de reacción formado.

Ejemplo 10 - Efecto de la chaperona química sobre la actividad de SnoopLigase

Como se describió anteriormente, SpyLigase es capaz de ligar sus sustratos de etiqueta peptídica (SpyTag y KTag) solo en presencia de una chaperona química TMAO (N-óxido de trimetilamina). Por consiguiente, se evaluó la actividad de SnoopLigase en presencia de TMAo .

Se incubaron SnoopLigase, SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag a 10 pM cada uno en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% un intervalo de concentraciones de TMAO (de 0-1,5 M) durante 1,5 ha 4 °C. La actividad de SnoopLigase se evaluó midiendo la cantidad de producto de reacción formado. La Figura 13 muestra que la adición de TMAO a la reacción no produjo ninguna mejora en la actividad de SnoopLigase, que es capaz de funcionar en ausencia de TMAO.

Ejemplo 11 - Evaluación de la reactividad de DogTag (SEQ ID NO: 3) en un sitio interno en una proteína de fusión

Para determinar si las etiquetas peptídicas son capaces de reaccionar entre sí cuando al menos una de las etiquetas está ubicada dentro de una proteína (es decir, donde la etiqueta forma un dominio interno de una proteína), DogTag (SEQ ID NO: 3) fue insertado en la proteína de unión a maltosa (MBP) y HaloTag7. En particular, la secuencia de DogTag estaba flanqueada a ambos lados por diferentes longitudes de secuencias enlazadoras (2-8 aminoácidos) y se insertó en MBP después del residuo 317 y antes del residuo 319, eliminando el residuo 318. Las secuencias enlazadoras que flanqueaban la etiqueta peptídica eran repeticiones de Gly-Ser. La secuencia de DogTag flanqueada con 3 repeticiones de Gly-Ser en cada lado se insertó en HaloTag7SS entre los residuos D139 y E140. HaloTag7SS se refiere a HaloTag7 modificado para reemplazar residuos de cisteína en las posiciones 61 y 261 con residuos de serina.

Las proteínas de fusión DogTag-MBP, SnoopTagJr-AffiHER2 y SnoopLigase a 10 pM cada una se incubaron en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% durante 4 ha 4 °C y se analizaron usando SDS-PAGE con tinción de Coomassie. La Figura 14 muestra que los cuatro constructos de inserción de MBP-DogTag fueron reactivos, con la mayor reactividad mostrada por longitudes de enlazador de 6 u 8 residuos.

La proteína de fusión DogTag-HaloTag7SS (10 pM) se incubó con SnoopTagJr-AffiHER2 y SnoopLigase (ambos 20 pM) en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% durante 0,5-48 h a 4 °C y se analizó usando Sd S- PAGE con tinción de Coomassie. La Figura 16 muestra que el constructo de inserción DogTag-HaloTag7SS fue reactiva, con un rendimiento de reacción de aproximadamente el 90% después de 24 horas.

Ejemplo 12 - Condiciones adicionales para la elución del producto de reacción de una fase sólida

Los ejemplos 4, 7 y 8 demuestran que el producto de reacción de SnoopLigase puede eluirse de una fase sólida en una variedad de condiciones. Sin embargo, la incubación en imidazol a pH 2,0 o 2 M o a temperaturas relativamente altas puede no ser adecuada para todas las proteínas. Los inventores confirmaron que un conjugado de péptido SnoopTagJr:DogTag es capaz de competir con el producto de reacción SnoopLigase con una eficacia equivalente a un tampón de elución de anticuerpos (glicina pH 2,0) e imidazol 2 M (Figura 15).

El péptido competidor SnoopTagJr: DogTag se generó mediante SUMO-DogTag y SUMO proteasa. El péptido SUMO-DogTag y SnoopTagJr se conjugaron covalentemente usando SnoopLigase inmovilizado en una fase sólida mediante HaloTag7. El producto de reacción (SUMO-DogTag:SnoopTagJr) se eluyó usando imidazol como se describió anteriormente. A continuación, el producto de reacción se incubó con SUMO-proteasa Ulp1, que escinde el péptido DogTag:SnoopTagJr de SUMO. La incubación del producto de reacción con Ni-NTA agotó las proteínas SUMO y Ulp1 etiquetadas con His, produciendo un péptido DogTag:SnoopTagJr purificado.

El péptido competidor permitió la elución limpia del producto de reacción de SnoopLigase (SUMO-DogTag: SnoopTagJrAffiHER2) de biotina-SnoopLigase inmovilizada en una columna de estreptavidina-agarosa (Figura 15) en condiciones fisiológicas, es decir, 37 °C. La purificación en fase sólida eliminó la necesidad de una separación posterior del producto de reacción de SnoopLigase y los materiales de partida sin reaccionar mediante cromatografía de exclusión por tamaño, que lleva mucho tiempo y a menudo conduce a pérdidas sustanciales.

Ejemplo 13 - Evaluación de la reactividad de DogTag (SEQ ID NO: 3) y SnoopTagJr (SEQ ID NO: 2) como fusiones del terminal N o del terminal C en una variedad de proteínas

Para validar que las etiquetas peptídicas pueden usarse como enlazadores universales, las etiquetas se fusionaron con varias proteínas (AffiHER2, SUMO, mClover3, MBP, mEGFP y HaloTag7SS) en el terminal N o C y se probaron en combinaciones. La proteína unida a DogTag (10 pM [Tabla 2] o 20 pM [Tabla 3]) se incubó con la proteína unida a SnoopTagJr (20 pM [Tabla 2] o 10 pM [Tabla 3]) y SnoopLigase (20 pM) en TB 50 mM pH 7,25 glicerol al 15% durante 24 ha 4 °C y se analizó usando SDS-PAGE con tinción de Coomassie. Las Tablas 2 y 3 muestran el porcentaje de reacción de la pareja de DogTag y de SnoopTagJr, respectivamente. N/A se refiere a reacciones en las que la superposición de bandas impidió la cuantificación. El orden de los componentes enumerados a continuación indicaba si la etiqueta era del terminal N o del terminal C, es decir, AffiHER2-DogTag se refiere a DogTag enlazado al terminal C de AffiHER2, DogTag-mClover3 se refiere a DogTag enlazado al terminal N de mClover3.

Los resultados muestran que la mayoría de las combinaciones tenían un rendimiento de reacción de más del 95%, lo que demuestra que las etiquetas peptídicas reaccionan eficazmente cuando se ubican en los terminales N y C de diversas proteínas.

T l 2 - P r n l m ñ r D T r i n

T l - P r n l m ñ r n T r r i n

Ejemplo 14 - La reactividad de SnoopLigase es tolerante a la liofilización y los agentes reductores Se liofilizó SnoopLigase y se almacenó durante 0-120 días a 37 °C. En varios momentos, se reconstituyeron muestras de SnoopLigase liofilizada en tampón de reacción con SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag (10 pM cada uno) durante 2 horas a 4 °C en TB pH 7,25 con glicerol al 15% (v/v). La Figura 17A muestra la formación del producto en relación con la muestra de control no liofilizada y demuestra que casi toda la actividad se retuvo después de la reconstitución.

Dado que no hay cisteínas en SnoopLigase o en las etiquetas peptídicas, se planteó la hipótesis de que la reacción no se vería afectada por agentes reductores. Esto se confirmó realizando la reacción descrita anteriormente con o con un agente reductor: p-mercaptoetanol (pME) 100 mM o ditiotreitol (DTT) 20 mM. La Figura 17B muestra la formación de producto en relación con una reacción de control sin agente reductor y demuestra que los agentes reductores no afectan la actividad de SnoopLigase.

Métodos

Clonación

Los constructos de plásmidos para la expresión de proteínas se clonaron usando procedimientos de PCR estándar y ensamblaje isotérmico de Gibson. Las secuencias de nucleótidos de los insertos de genes se validaron mediante secuenciación de Sanger. Los constructos para la expresión en E. coli contenían una etiqueta His6 en el terminal N seguida de un enlazador flexible rico en GS.

La secuencia de RrgA es del Protein Data Bank con código de identificación 2WW8.

Expresión y purificación de proteínas

Los plásmidos de expresión se transformaron en E. coli BL21 (DE3) -RIPL (Agilent) y las células se cultivaron en placas de LB-Agar que contenían 50 pg/ml de kanamicina durante 16 ha 37 °C. Las colonias individuales se cultivaron en 2xYT con glucosa al 0,8% (p/v), 50 pg/ml de kanamicina durante 16 horas a 37 °C, 200 rpm. Los cultivos iniciadores se diluyeron 1:100 en 1 L 2 x Yt con glucosa al 0,8% (p/v), 50 pg/ml de kanamicina y se cultivaron a 37 °C, 200 rpm hasta que se alcanzó una A600 de 0,5. Los cultivos se indujeron con IPTG 0,42 mM y se dejaron crecer durante 4 ha 30 °C, 200 rpm antes de la recolección. Las proteínas se purificaron utilizando métodos estándar de Ni-NTA (Qiagen) y se dializaron tres veces 1:1000. Los tampones para diálisis fueron TB (Tris^HCl 50 mM con pH ajustado con ácido bórico) pH 8,0 para AP-SnoopLigase (en la que AP es un péptido sustrato para la biotinilación de BirA) y SnoopTagJr-MBP, ácido bórico 50 mM pH 10,0 para RrgALigase (y mutantes puntuales), SnoopLigase, SnoopTag-AffiHER2, SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag.

Reconstitución in vitro de SnoopLigase

Para evaluar la formación del enlace isopeptídico entre SnoopTagJr y DogTag mediada por SnoopLigase, se incubaron proteínas a 10 pM cada una en TB pH 7,25 glicerol al 15% (v/v) a 4 °C durante 2 h, a menos que se indique lo contrario. Para terminar la reacción, se añadió tampón de carga de SDS 6x (TrisHCl 0,23 M, pH 6,8, glicerol al 24% (v/v), azul de bromofenol 120 pM, SDS 0,23 M) hasta una concentración final de 1x. Las muestras se calentaron durante 3 min a 95 °C y se dejaron enfriar a 25 °C durante 10 min antes de cargarlas.

Identificación de mutaciones puntuales de SnoopLigase

Para identificar los residuos para la sustitución de prolina, se realizó el análisis de Ramachandran de los residuos de aminoácidos en RrgA (código PDB 2WW8) usando MolProbity. Los residuos con ángulos 9 de -70° a -50° y la ubicación en regiones de bucle se consideraron para la sustitución de prolina. Para utilizar el servidor PROSS, se generó una alineación de secuencia múltiple (MSA) separada. Las secuencias homólogas para los residuos de RrgA 734-860 se recogieron usando la herramienta de búsqueda de alineación local básica iterativa específica de la posición (PSI-BLAST). Se generó una MSA usando comparación de secuencias múltiples mediante expectativa logarítmica (MUSCLE). Se utilizó la base de datos agrupada de alta identidad con tolerancia (CD-HlT) para minimizar la redundancia de secuencia y ajustar el tamaño del conjunto de datos. La MSA modificada y los residuos 734-860 de la estructura 2WW8 de RrgA del PDB se introdujeron en el servidor PROSS. Las sustituciones de aminoácidos sugeridas se revisaron manualmente.

Biotinilación de SnoopLigase

La biotinilación de AP-SnoopLigase se realizó incubando AP-SnoopLigase 220 pM con GST-BirA 14,7 pM, MgCh 0,5 mM, D-biotina 3,3 mM y At P 1 mM en TB pH 8,0 durante 1 ha 25 °C. Se añadió de nuevo la misma cantidad de GST-BirA y D-biotina y se incubó la mezcla durante 1 ha 25 °C. Para agotar GST-BirA, la muestra se incubó con 0,1 ml de resina glutatión-HiCap durante 30 min a 25 °C en un rotor de muestra y se centrifugó durante 30 s a 17.000 g. El sobrenadante se recogió y se dializó tres veces 1:1000 en TB pH 8,0.

Purificación del producto de reacción de SnoopLigase

Se incubaron SUMO-DogTag, SnoopTagJr-AffiHER2 y SnoopLigase biotinilada a 10 pM cada uno en TB pH 7,25 con glicerol al 15% (v/v) en un volumen total de 200 pl durante 20 ha 4 °C. Para capturar SnoopLigase, se añadieron 25 pl de estreptavidina agarosa HiCap lavada y equilibrada (Thermo Fisher, 20357) y las muestras se incubaron durante 30 min a 25 °C en un rotor de tubos. La resina se recogió en una columna poly-prep de 1 ml (Bio-Rad) y se centrifugó durante 1 min a 300 g. Después de lavar la resina dos veces con 125 pl de glicina 50 mM pH 3,0 con NaCl 300 mM y tres veces con 125 pl de glicina 50 mM pH 3,0, una centrifugación adicional durante 1 min a 500 g aseguró la eliminación del exceso de líquido de la resina. Para eluir el producto de reacción de SnoopLigase, la resina se incubó con 25 pl de tampón de elución de anticuerpos (glicina 50 mM pH 2,0) durante 1 min, antes de centrifugar el eluato en un tubo que contenía 2,5 pl de Tris^HCl 1 M durante 1 min a 300 g. La elución se repitió dos veces más.

Espectrometría de masas

Se incubaron SUMO-DogTag a 75 pM y péptido sintetizado en fase sólida SnoopTag (GKLGDIEFIKVNKGY, SEQ ID NO: 11 Insight Biotechnology con una pureza del 95%) a 300 pM con SnoopLigase biotinilado 75 pM en TB pH 7,25 y glicerol al 15% (v/v) en un volumen total de 200 pl durante 36 h a 4 °C. El producto de reacción se purificó como antes, pero con 100 pl de estreptavidina agarosa HiCap y 500 pl de tampones de lavado. El análisis se realizó usando un espectrómetro de masas de ionización por electroaspersión de tiempo de vuelo Micromass LCT (Micromass). El perfil de masa molecular se creó a partir del espectro m/z utilizando el software V4.00.00 (Waters) con un algoritmo de máxima entropía. ExPASy ProtParam predijo las masas moleculares de proteínas, basándose en la secuencia de aminoácidos sin fMet en el terminal N y la pérdida de amoniaco (17,0 Da) durante la formación del enlace isopeptídico.

Ciclos de reacción de ligadura en fase sólida

Se acopló SnoopLigase biotinilada a 50 pM en TB pH 8,0 a 10 pl de estreptavidina agarosa HiCap lavada y equilibrada (Thermo Fisher) en un volumen total de 50 pl durante 30 min a 25 °C en un rotor de tubo. La resina se recogió en una columna poly-prep de 1 ml (Bio-Rad) y se centrifugó durante 1 min a 300 g, seguido de cinco lavados con 100 pl de TB pH 8,0. La reacción se inició mediante la adición de 50 pl de mezcla de reacción (SUMO-DogTag 100 pM y SnoopTagJr-AffiHER2 100 pM en TB pH 7,25 con glicerol al 15% (v/v)) y la muestra se incubó durante 3 ha 25 °C en un ThermoMixer a 800 rpm. La mezcla de reacción se centrifugó durante 1 min a 300 g y la resina se lavó dos veces con 50 pl de glicina 50 mM pH 3,0 con NaCl 300 mM y tres veces con 50 pl de glicina 50 mM pH 3,0. Una centrifugación adicional durante 1 min a 500 g aseguró la eliminación del exceso de líquido de la resina. Para eluir el producto de reacción de SnoopLigase, la resina se incubó con 10 pl de tampón de elución de anticuerpos durante 1 min, antes de centrifugar el eluido en un tubo que contenía 1 pl de Tris^HCl 1 M durante 1 min a 300 g. La elución se repitió tres veces más. La resina se lavó dos veces con 100 pl de glicina 50 mM pH 2,0 y dos veces con 100 pl de TB pH 7,25. El ciclo de reacción se repitió tres veces más.

Prueba de termoestabilidad de SnoopLigase

Se incubó SnoopLigase a 12,5 pM en TB pH 7,25 con glicerol al 15% (v/v) a la temperatura indicada durante 15 min y se enfrió a 4 °C durante 5 min. Se utilizó SnoopLigase tratada térmicamente para la ligadura de SnoopTagJr-AffiHER2 y SUMO-DogTag.

SDS-PAGE y cuantificación de reacciones

Los geles se tiñeron con colorante Coomassie InstantBlue (Expedeon), se decoloraron con agua MilliQ y se obtuvieron imágenes usando un generador de imágenes ChemiDoc XRS con el software ImageLab (Bio-Rad). ImageLab también se utilizó para la cuantificación de las bandas. El porcentaje de etiquetas que reaccionaron se calculó a partir de las intensidades de banda como [banda de producto]/([banda de producto] [bandas de sustrato sobrante]). La reactividad relativa se calculó como el porcentaje de etiquetas que reaccionaron ([muestra]/[control]).

Producción del competidor de DogTag:SnoopTagJr

Se incubó una cantidad de 4 ml de HaloTag7-SnoopLigase a 20 pM en TB 50 mM pH 7,25 con Tween 20 al 0,01% (v/v) con 500 pl de resina HaloLink empaquetada (Promega) durante 2 ha 25 °C en un rotor de tubo. La muestra se dividió en cinco columnas de polipropileno de 1 ml equilibradas con tampón (Bio-Rad) y se centrifugó durante 1 min a 300 g a 25 °C. Cada muestra de resina se lavó dos veces con 500 pl de TB 50 mM pH 7,25 con Tween 20 al 0,01% (v/v). Se taparon las columnas y se añadieron a cada columna 200 pl de tampón de reacción [péptido SUMO-DogTag 50 pM y SnoopTagJr 75 pM en TB pH 7,25 con glicerol al 15% (v/v)]. El péptido SnoopTagJr fue sintetizado en fase sólida por Activotec con una pureza > 95%. Después de incubar durante 4 ha 25 °C a 300 rpm en un ThermoMixer, las muestras se centrifugaron durante 1 min a 300 g a 25 °C, y cada muestra de resina se lavó cinco veces con 640 pl de Tris-fosfato pH 7,0 con imidazol 0,5 M y Tween 20 al 0,01% (v/v). Para eluir el producto de reacción de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende:

a) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1; o

1) prolina en la posición 66;

2) prolina en la posición 95;

3) glicina en la posición 96; y

4) valina en la posición 97,

en el que los residuos de aminoácidos especificados están en posiciones equivalentes a las posiciones en la SEQ ID NO: 1 y en la que dicho polipéptido es capaz de promover la formación de un enlace isopeptídico entre el residuo de lisina en la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición 17 de la SEQ ID NO: 3.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1 y en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende un ácido glutámico en la posición 61 y dos, tres o todos los siguientes:

1) prolina en la posición 66;

2) prolina en la posición 95;

3) glicina en la posición 96; y

4) valina en la posición 97.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido comprende una treonina en la posición 100. 4. Una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

5. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la etiqueta peptídica de la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido o etiqueta peptídica está:

(a) conjugado con una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o una combinación de los mismos; o

(b) inmovilizado sobre un sustrato sólido.

6. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o etiqueta peptídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que opcionalmente la molécula de ácido nucleico está en un vector, además opcionalmente en la que la molécula de ácido nucleico o el vector está en una célula.

7. Un proceso para producir o expresar el polipéptido y/o la etiqueta peptídica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:

a) transformar o transfectar una célula huésped con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6;

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y/o etiqueta peptídica; y opcionalmente

c) aislar el polipéptido y/o la etiqueta peptídica.

8. Uso de un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 para:

(1) conjugar dos moléculas o componentes mediante un enlace isopeptídico; o

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2; o

b) una segunda molécula que comprende una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3; o

y

en el que la tercera molécula o componente del complejo en (2) comprende un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que dicha primera molécula comprende una etiqueta peptídica como se define en a) conjugada con una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o una combinación de los mismos; y/o en el que dicha segunda molécula comprende una etiqueta peptídica como se define en b) conjugada con una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o una combinación de los mismos.

10. Un proceso para conjugar dos moléculas o componentes a través de un enlace isopeptídico que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2; o

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3; o

c) poner en contacto dicha primera y segunda moléculas o componentes con un polipéptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5, preferiblemente en el que dicho polipéptido está inmovilizado sobre un sustrato sólido, en condiciones que permitan la formación de un enlace isopeptídico entre el residuo de lisina en la posición equivalente a la posición 9 de la SEQ ID NO: 2 y el residuo de asparagina en la posición equivalente a la posición 17 de la SEQ ID NO: 3, conjugando así dicha primera molécula con dicha segunda molécula mediante un isopéptido para formar un complejo.

11. El proceso de la reivindicación 10, en el que cuando el polipéptido se inmoviliza sobre un sustrato sólido, el proceso comprende una etapa adicional de separación del complejo del sustrato sólido, en la que dicha etapa comprende:

(a) poner en contacto dicho complejo con un tampón de pH bajo, preferiblemente con un pH de 4,0 o menos; o (b) poner en contacto dicho complejo con una solución que comprende:

(i) imidazol, preferiblemente a una concentración de al menos 1 M; o

(ii) un producto de reacción competidor que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2 ligado a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3.

12. El proceso de la reivindicación 11, que comprende además una etapa de lavar el sustrato sólido con un tampón antes de separar dicho complejo del sustrato sólido.

13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que dicha primera molécula comprende una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en a) conjugada con una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o una combinación de los mismos; y/o en el que dicha segunda molécula comprende una etiqueta peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en b) conjugada con una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o una combinación de los mismos.

14. Un kit, preferiblemente para su uso en el uso de la reivindicación 8 o 9 o el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que dicho kit comprende:

(a) un péptido ligasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5; y

(b) una etiqueta peptídica que comprende:

(i) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 2;

(iii) una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3; o

en la que dicha etiqueta peptídica está conjugada o fusionada a una molécula o componente; y/o

15. El kit de la reivindicación 14, en el que el kit comprende además una segunda etiqueta peptídica conjugada o fusionada a una molécula o componente, en el que la segunda etiqueta peptídica es capaz de formar un enlace isopeptídico con la etiqueta peptídica en (b) cuando se pone en contacto con un péptido ligasa de (a) en condiciones adecuadas para la formación de un enlace isopeptídico; y/o en el que la molécula o componente es una molécula de ácido nucleico, proteína, péptido, compuesto orgánico de molécula pequeña, fluoróforo, complejo metal-ligando, polisacárido, nanopartícula, nanotubo, polímero, célula, virus, partícula similar a virus o una combinación del mismo.