JP2021523937A - ワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
i) i)第一のペプチドタグを含むタンパク質構成要素、および
ii) ii)第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
タンパク質構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そしてタンパク質構成要素が50kDaを超える
前記組成物を提供する。
i)第一のペプチドタグを含むタンパク質構成要素、および
ii)第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
タンパク質構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そしてタンパク質構成要素が多量体性である
前記組成物を提供する。
iii)第一のペプチドタグを含む抗原性構成要素、および
iv)第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
抗原性構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そして抗原性構成要素がおよそ50kDaを超える
前記組成物を提供する。
第二のペプチドタグを、フォールディングし、そして適切なコンホメーションを形成する能力に影響を及ぼさない、部分中の任意の適切な位置に付着させることも可能である。遺伝子融合が好ましい可能性もある。部分のCまたはN末端に第二のペプチドタグを含むことが好ましい可能性もあるが、第二のペプチドタグは、配列の任意の部分中にもまた含まれてもよい。あるいは、第二のペプチドタグを、部分のループ中に配置することも可能でありうる。例えば、RNAバクテリオファージAP205のウイルスコートタンパク質(CP3)のN末端へのSpyCatcherの遺伝子融合が、Bruneら, Scientific Reports volume 6, 論文番号: 19234(2016)に記載される。多量体化プラットフォームとして自己集合合成タンパク質を用いる代替融合が、Bruunら, ACS Nano, 2018, 12(9), pp 8855−8866に論じられる。あるいは、第二のペプチドタグを、化学コンジュゲート化を通じて付着させることも可能である。
別の態様において、部分は、SpyCatcher結合パートナー(第二のペプチドタグ)に付着する。部分は、適切には、HBsAgであることも可能である。適切なSpyCatcherは、配列番号38に示すアミノ酸配列を有する。1つの態様において、SpyCatcherは、リンカーを通じて付着する。リンカーは、剛直性リンカーまたは柔軟性リンカーであることも可能であり、適切には、リンカーは、配列番号39に示すアミノ酸配列を有する。
i)第一のペプチドタグを含む部分
ii)第二のペプチドタグを含むタンパク質
を含み、
前記の第一のペプチドタグおよび前記の第二のペプチドタグはイソペプチド結合を形成する
VLPを提供する。いくつかの態様において、部分はHBsAgである。しかし、先に記載するように、任意の適切な部分を用いることも可能である。
i)第一のペプチドタグを含むタンパク質
ii)第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
前記の第一のペプチドタグおよび前記の第二のペプチドタグはイソペプチド結合を形成する
VLPを提供する。いくつかの態様において、部分はHBsAgである。しかし、先に記載するように、任意の適切な部分を用いることも可能である。
本発明の別の側面において、本明細書に記載するような、SpyTagに連結されたHCMV五量体を提供する。
−第一のペプチドタグへの第一のタンパク質の第一の遺伝子融合物をコードする第一の核酸を、第一の宿主細胞内に導入し;
−前記の第一の宿主細胞を、前記の第一の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし;随意に、発現された構成要素を精製し;
−第二のペプチドタグへの第二のタンパク質の第二の遺伝子融合物をコードする第二の核酸を、第二の宿主細胞内に導入し;
−前記の第二の宿主細胞を、前記の第二の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし;随意に、発現された構成要素を精製し;
−発現された構成要素を、第一のペプチドタグおよび第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合の形成のための条件下でインキュベーションし;随意に、生じた組成物を精製する
工程を含む、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、「HCMV五量体の免疫原性構成要素」がHCMV五量体全体を含む場合、HCMV五量体の構成要素の組換え産生は、五量体が形成されるとともに集合のために正しくフォールディングされるために、各サブユニットが正しい化学量論で発現されることを必要とする。これらの態様において、必要な五量体のパーツのみの複合体(例えばgH/gL二量体および四量体、または5つのサブユニットのいずれか1つを欠く四量体)を、最終産物から排除する必要がある。好適には、本発明は、構成要素を別個に作製し、そして次いでこれらをコンジュゲート化する単純なアプローチを提供することにより、1つの系におけるワクチン構成要素のすべて(すなわちHBsAgおよびHCMV五量体の5つのサブユニット)を発現することによって、そうでなければ関連するであろう問題を克服する。したがって、1つの態様において、精製タグをUL130(Hofmannら、DOI 10.1002/bit 25670)上に取り込む。類似の原理は、他の免疫原性構成要素に適用可能であろう。
本発明のさらなる側面において、ワクチン、好ましくはHCMV感染の予防および/または治療において使用するためのワクチンとして使用するための、本発明の任意の側面にしたがった組成物を提供する。本発明にしたがって、薬剤またはワクチンとして使用するための組成物は、成人、例えば生殖年齢の女性または妊娠女性に投与されることも可能である。
伝統的には、ワクチンアプローチは、弱毒化されたまたは死んだ全病原体を用いていたが、これは、適切な病原体由来のタンパク質を含む組換えサブユニットの使用によって置き換えられてきている。より最近は、ウイルス様粒子(VLP)を用いるアプローチが開発されてきている。VLPは、サイズ(およそ20〜200nm)、その形状およびその反復タンパク質配置がウイルスに似ているが、病原体由来のいかなる遺伝子材料も欠く粒子である。そのサイズのため、VLPはリンパ節により排出されやすく、抗原提示細胞による取り込みおよび提示に理想的となる。さらに、その反復構造は、補体固定およびB細胞受容体架橋を容易にする(Kushnirら Vaccine 2012; Vol 31(1):58−83)。しかし、これらの作用機構は理論には制限されない。
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV、ヒトヘルペスウイルス−5(HHV−5)としてもまた知られる)は、大部分の成人が曝露されたことがあるウイルスであり、最初の感染は通常、単に軽症であるかまたは無症候性である。感染後、ウイルスは体内で潜在性であるが、免疫低下している者または高齢者においては、深刻な疾患を引き起こしうる。HCMVはまた、発展途上国において、先天異常の主な感染性の原因である。最大4人/200人の赤ちゃんが先天性感染のためHCMVを持って生まれ、そしてこれらのうち最大10%が長期の結果に苦しむ。HCMV感染は、成人において、高血圧およびアテローム性動脈硬化症と関連付けられてきている(Cheng ら(2009年5月) Frueh K監修 ”Cytomegalovirus infection causes an increase of arterial blood pressure”. PLoS Pathog. 5(5):e1000427)。
臨床的単離体および実験室株を含むHCMV株は、ゲノム配列が異なる。HCMV株には、マーリン(GI:155573956)、タウン(GI239909366)およびAD169(GI:219879600)、トレド(GI290564358)およびTB40/Eが含まれる。HCMVは、多数の膜タンパク質およびタンパク質複合体を含有する。五量体タンパク質gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131Aは、上皮および内皮細胞のHCMV感染に重要であり、エンドサイトーシス経路を通じると考えられる。この複合体の構成要素の他の組み合わせは、例えば線維芽細胞の感染に重要であると示されてきている。「pUL」サブユニット/構成要素はまた、「UL」とも称され;「pUL131」はまた、「pUL131A」および「pUL131a」、または「UL131A」とも称される。
呼吸器合胞体ウイルスは、世界中で、小児における深刻な呼吸器疾患の主因である。5歳未満の小児、概算340万人が、深刻なRSV下気道感染で毎年入院し、生後6ケ月未満の小児において発生率が最高である。1歳未満の乳児において、そして発展途上国において、大部分の死亡が起こる。現在、防止および制御のためのオプションは限定されている。
F糖タンパク質は、I型ウイルス融合タンパク質である。RSV F前駆体(F0)は2つの部位でフューリン様プロテアーゼによって切断され、3つの断片を生じると考えられる。より短いN末端断片(F2)は、2つのジスルフィド結合によって、より大きいC末端断片(F1)に共有結合する。27アミノ酸の介在する断片は、切断後に解離し、そして成熟タンパク質中には見られない。
自発的なイソペプチド結合形成が可能であるタンパク質(いわゆる「イソペプチドタンパク質」)は、互いに共有結合し、そして不可逆的相互作用を提供するペプチドタグ/ポリペプチド結合パートナー対(すなわち2パーツリンカー)を発展させるために好適に用いられてきている(例えばどちらも本明細書に援用されるWO2011/098772およびWO 2016/193746とともに、どちらも本明細書に援用されるWO2018/189517およびWO2018/197854を参照されたい)。これに関連して、自発的イソペプチド結合形成が可能なタンパク質は、ペプチドタグおよびペプチドタグのポリペプチド結合パートナーを提供する、別個の断片として発現されることも可能であり、ここで2つの断片は、イソペプチド結合形成によって、共有再構築が可能であり、それによって、ペプチドタグおよびそのポリペプチド結合パートナーに融合した分子または構成要素を連結する。ペプチドタグおよびそのポリペプチド結合パートナーによって形成されるイソペプチド結合は、非共有相互作用が、例えば、長時間(例えば数週間)に渡って、高温(少なくとも95℃まで)、高圧で、または厳しい化学処理(例えばpH2〜11、有機溶媒、界面活性剤または変性剤)で、急速に解離するであろう条件下で安定である。
「HBsAg」によって、B型肝炎ウイルスに由来する表面抗原(HBsAg)またはその一部を意味する。1つの態様において、HBsAgは、HBsAgのN末端、例えば、B型肝炎ウイルス(adw血清型)のSタンパク質の226アミノ酸を含む、配列番号41中に示すようなHBsAg配列を指すことも可能である。適切には、HBsAgには、Valenzuelaら, (1979) ’Nucleotide sequence of the gene coding for the major protein of hepatitis B virus surface antigen’ Nature 280:815−819に記載されるような、B型肝炎ウイルス(adw血清型)プレS2タンパク質の4つのカルボキシ末端残基に相当する、4アミノ酸配列、Pro Val Thr Asnが含まれる。HBsAgより形成されるVLPは、Recombivax HB(https://vaccines.procon.org/sourcefiles/recombivax_package_insert.pdf)、およびEnergix B(https://au.gsk.com/media/217195/engerix−b_pi_006_approved.pdf)を含めて、B型肝炎に対する臨床的使用のために認可されてきている(Kushnirら Vaccine 2012; Vol 31(1):58−83)。HBsAgはまた、フェーズIII臨床試験を完了し、そして現在まで、最も進歩したマラリアワクチンである、前赤内期マラリアワクチンRTS,Sの基礎としても用いられてきている(http://www.malariavaccine.org/sites/www.malariavaccine.org/files/content/page/files/RTSS%20FAQs_FINAL.pdf; KaslowおよびBiernaux, Vaccine 2015, Vol. 33(52): 7425−7432)。
タンパク質(例えばVLPおよび装飾抗原)の間の距離は、タンパク質中の抗原性エピトープの利用可能性、単数または複数のタンパク質の安定性に影響を有する可能性もあり、そしてまた、イソペプチド結合パートナー(例えばSpyTag/SpyCatcher)のいずれかのアクセス可能性のため、コンジュゲート化効率にも影響を有する可能性もある。したがって、利用可能性、安定性、および/またはアクセス可能性を最適化するために適切な特性を持つリンカーを選択することも可能である。リンカーは、広く、柔軟性および剛直性サブタイプに下位分類されうる。
連結されるドメインが動きを必要とする場合、柔軟性リンカーを用いてもよい。これらは通常、小分子非極性(例えばGly)または極性(例えばSer、Thr)アミノ酸からなり、ここで、小さなサイズであると柔軟性が提供される(Chenら, 2013 Adv Drug Deliv Rev. Oct 15; 65(10): 1357−1369)。SerまたはThrの付加は、溶液中での安定性維持を補助することも可能であり、そして長さの調節は、タンパク質の適切なフォールディングに影響を及ぼしうる(Chenら、2013)。関連する実体に適した性質および長さを有する、任意の適切な柔軟性リンカーを用いてもよい。適切には、柔軟性リンカーには、こうしたタイプの2〜70アミノ酸の間の組み合わせが含まれてもよい。
いくつかの場合、剛直性リンカーはタンパク質分離の提供を補助しうるため、剛直性リンカーが好ましい可能性もある。剛直性リンカーは二次構造を有する。最も一般的な剛直性リンカーの1つは、αらせん構造を採用する(EAAAK)n(式中、nは反復の数である)である(Araiら, (2001) Protein Eng. Aug;14(8):529−32)。他の剛直性リンカーには、(XP)n、式中、Xは、任意のアミノ酸であるが、優先的にAla(A)、Lys(K)またはGlu(E)である、が含まれることも可能であり、ここでプロリンがコンホメーション上の束縛を提供する(Chenら、2013)。
適切には、本発明にしたがったタンパク質および組成物を産生する核酸の発現のための宿主細胞は、当業者に知られるであろう。
いくつかの態様において、本発明にしたがった組成物の構成要素の発現に使用するための発現構築物には、アフィニティ精製などの精製を容易にする、単数または複数の「タグ」配列が含まれることも可能である。タンパク質構成要素および第一のペプチドタグを、産生した系から分離するため、任意の適切なタグ、例えばアフィニティタグを含めてもよい。組換えタンパク質産生の当業者は、精製目的で含めてもよい、HisタグおよびStrepタグなどの系を知っている。こうしたタグは、タンパク質精製を劇的に補助し、そして生物学的または生化学的活性に不都合に影響を及ぼすことはほとんどなく、そしてしたがって望ましい。適切なタグ配列には、C−タグ、ヒスチジンタグ(His−タグ)、ストレプトアビジンタグ(Strep−タグ)、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)およびFLAGタグが含まれる。
第一および第二のペプチドタグ/結合パートナー/反応性対のコンジュゲート化を4℃で一晩行うことも可能である。あるいは、カップリング速度は、室温で増加すると予期されるため、コンジュゲート化反応を、室温で3〜4時間行うことも可能である。所定のカップリング反応のための最適な第一および第二の結合パートナー比は、各結合パートナーのサイズに依存する。例えば、VLP単量体対抗原の1:1.5モル比がより小さい抗原(〜20kDa)には十分である可能性もある一方、同じVLP単量体と組み合わせたより大きい抗原(>100kDa)に関しては、1:1質量比が十分である可能性もある。しかし、どちらの比も過剰な抗原(より小さい結合パートナー)を生じる。いかなる過剰な抗原も、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)によって、または透析によって除去可能である。透析は、SECほど効率的ではないため、より小さい抗原により適している可能性もある。あるいは、すべての抗原がコンジュゲート化され、そしてしたがって下流精製が不要であるように、VLP/粒子対抗原の比を最適化することも可能である。より低い濃度は反応速度を減少させうるため、およそ1mg/mlの適切な最終タンパク質濃度がコンジュゲート化反応には最適である。中性pHに近い広範囲の緩衝剤がカップリング/コンジュゲート化に適合する。コンジュゲート化緩衝液の標準的な選択は、TBS(20mM Trisおよび150mM NaCl、pH7.4)である。いくつかの状況において、クエン酸緩衝液の10xストック(40mM Na2HPO4、200mMクエン酸ナトリウム、pH6.2)の添加を、Bruneら Sci Rep.(2016)に記載されるように用いることも可能である。
本発明の組成物をワクチンまたは免疫原性組成物内に取り込むことも可能である。適切には、ワクチンまたは免疫原性組成物は、免疫原用量で、本発明の粒子を含むであろう。
本明細書に言及するすべての文書は、その全体が本明細書に援用される。
ポリペプチド配列間の配列同一性は、好ましくは、デフォルトパラメータ(例えば、EBLOSUM62スコアリングマトリックスを用い、ギャップオープニングペナルティ=10.0、およびギャップ伸長ペナルティ=0.5を用いる)を用いて、Needleman−Wunsch広範囲整列アルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch 1970)を用いた対整列アルゴリズムによって決定される。このアルゴリズムは、好適に、EMBOSSパッケージ中のneedleツール中に実装される(Rice, LongdenおよびBleasby 2000)。本発明のポリペプチド配列の全長に渡って、配列同一性を計算すべきである。
例示的な多量体−VLP組成物(HCMV五量体−HBsAg VLP)の生成
ExpiFectamineTM 293トランスフェクション試薬(ThermoFisher Scienticfic)および以下の配列をコードする5つの別個のプラスミドを用いて、Expi293F細胞において、HCMV五量体を一過性に発現させた。以下に記載するHCMV五量体は、グリコシル化を伴わずにおよそ162kDaである(タグおよびリンカーを含むが、シグナルペプチドを含まない)。
HCMV五量体配列は、以下の適切な節に記載する2つの導入された突然変異(1つはgH中、1つはUL128中)を除いて、マーリン株(GenBank:AY446894.2;低継代(すなわち弱毒化)HCMV株)由来の天然配列(イントロンを含む)を発現した。
この配列(配列番号12)において、GeneArt(登録商標)合成のため、1146位にサイレント突然変異C>Aを導入し、これはこのヌクレオチド周囲の天然配列CACCTGCに、潜在的に問題があると警告されたためであった。該構築物は:シグナルペプチド(nt 1〜69)、外部ドメイン(nt 70〜2151)、膜貫通ドメイン(一部切除)(nt 2152〜2157)(シグナルペプチド、外部ドメインおよび膜貫通ドメイン(一部切除)は、ともに、配列番号13に示される)、リンカー(nt 2158〜2175;配列番号14)、SpyTag(nt 2176〜2214;配列番号15)、6xHisタグ(nt 2215〜2232)、停止コドン(nt 2233〜2235)を含む。ヌクレオチド1〜2157(配列番号13)は、gHコード配列に相当する。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜90)、外部ドメイン(nt 91〜834)、停止コドン(nt 835〜837)。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜75)、外部ドメイン(nt 76〜642)、リンカー(nt 643〜687)、C−タグ(nt 688〜699)、停止コドン(nt 700〜702)。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜81)、イントロン:nt 165〜287、nt 423〜542、外部ドメインエクソン(nt 82〜164、nt 288〜422、nt 543〜756)、停止コドン(nt 757〜759)。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜54)、イントロン(nt 237〜344)、外部ドメインエクソン(nt 55〜236、nt 345〜495)、停止コドン(nt 496〜498)。
この配列中:SpyCatcherデルタN1(nt 1〜276)、柔軟性リンカー(nt 277〜303)、PVTNリンカー(nt 304〜315)、HBsAg(nt 316〜993)、C−タグ(nt 994〜1005)、停止コドン(nt 1006〜1008)。
上記ヌクレオチド配列の発現は、以下のアミノ酸配列を生じると予測される。
gH−SpyTag−Hisアミノ酸配列(配列番号27)
予測分子量81.852kDa(シグナルペプチドを含まない)、84.364kDa(シグナルペプチドを含む)。
予測分子量27.522kDa(シグナルペプチドを含まない)、30.815kDa(シグナルペプチドを含む)。
UL130−C−タグアミノ酸配列(配列番号32)
予測分子量23.167kDa(シグナルペプチドを含まない)、26.081kDa(シグナルペプチドを含む)。
予測分子量16.659kDa(シグナルペプチドを含まない)、19.717kDa(シグナルペプチドを含む)。
UL131Aアミノ酸配列(配列番号36)
予測分子量12.985kDa(シグナルペプチドを含まない)、14.989kDa(シグナルペプチドを含む)。
タグおよびリンカーを含む予測分子量、36.824kDa。
この配列中:SpyCatcherデルタN1(aa 1〜92;配列番号38)、柔軟性リンカー(aa 93〜101;配列番号39)、PVTNリンカー(aa 102〜105;配列番号40)、HBsAg(aa 106〜331;配列番号41)、C−タグ(aa 332〜335)。
五量体−SpyTagはEXPI293F細胞中で発現され、そして上清内に分泌された(gHサブユニットからTMドメイン(の一部)を欠失させたため)。アフィニティ精製を用いてHCMV五量体を精製する最初の試みは、C−タグを含むgHサブユニットの発現に頼るが、これはgH/gLヘテロホモ二量体ならびに五量体の単離を生じた。別の戦略において、UL130サブユニット(配列番号17(ヌクレオチド)および配列番号32(アミノ酸))にC−タグを付加して、C−タグアフィニティ精製(ThermoFisher)およびサイズ排除クロマトグラフィを用いた、上清からの五量体の精製を可能にした。五量体は、SDS−PAGEによって分析した際、非還元および還元条件下で予期された通りに現れ(図1A)、そして抗HCMV五量体抗体(Native Antigen Company(AbCMV2450))と反応し(図1B)、〜14kDaで少量の混入物質のみが観察された。
SpyCatcher−HBsAgをピキア・パストリス(Pichia pastoris)中で発現させ、そして細胞ホモジネートから精製した。SDS−PAGEゲル上での還元条件下で、主なタンパク質バンドは、単量体の予期されるサイズ(およそ37kDa)に対応し、さらに大きいバンドは、オリゴマー種の存在を示し、粒子の優れた架橋が起こっていることを示した(図2A、レーン「R」)。非還元条件下で(レーン「NR」)、物質は、主に、ある程度のスメアとともにゲル上部に留まり、これは、VLP粒子がよく形成され、そしてしたがってゲル内に完全に移動するには大きすぎることを示す(図2A)。非還元および還元SpyCatcher−HBsAgは、どちらも、マウス抗HBsAgモノクローナル抗体(Bio−Rad(MCA4658)より得た)と強く反応し(図2B)、SpyCatcherの存在が反応性エピトープに負に影響しないことを示した。HCMV五量体−SpyTagおよびSpyCatcher−HBsAgは、どちらも、s200increase 3.2/300カラム上でのHPLCサイズ排除分析によって評価された際、単一ピークとして溶出した(図3A〜B)。HCMV五量体−SpyTagは、〜400kDaで溶出し(図3A)、これは予期されるよりも大きい。しかし、これは、五量体構造が球状ではなく、こうした場合、サイズ排除クロマトグラフィ中に、タンパク質の保持時間が改変されることが知られていることによって、説明されうる。SpyCatcher−HBsAgは、カラムのボイド体積中に溶出し、これは、粒子が適切に形成され、溶液中に単量体が検出不能であることを示す(図3B)。
HCMV五量体−SpyTagをSpyCatcher−HBsAgに、4℃で一晩コンジュゲート化し、HCMV−五量体でコーティングされたHBsAg VLPを生じた。5mM EDTAを補充した、Tris緩衝生理食塩水を含有する緩衝液(TBS;20mM Trisおよび150mM NaCl、pH7.4)をコンジュゲート化に用いた。SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析ならびにHPLCを用いて、コンジュゲート化を監視した。コンジュゲート化反応を、五量体−SpyTagまたはSpyCatcher−HBsAgのみのいずれかに比較すると、還元条件下で〜130kDaの新規バンドの存在があり(図4A、レーン2)、これはモノクローナル抗HBsAg(図4B)およびポリクローナル抗HCMV五量体(図4C)抗体の両方と反応性であり、該バンドが、少なくともコンジュゲート化HBsAg−gHを含有することが示された。HPLCサイズ排除クロマトグラフィによって分析した際、97%は、コンジュゲート化HCMV五量体−HBsAg単量体の予測されるサイズに対応する主ピーク中に溶出した(図5)。
HCMV−Spy−Tag−−SpyCatcher−HBsAg VLP(アジュバント化)のin vivo試験
コンジュゲート化HCMV五量体−HBsAg VLP、ならびに非コンジュゲート化HCMV五量体−SpyTagを、BALB/cマウスを用いた免疫スケジュール中で用いて、(i)産生されたHCMV五量体−SpyTagの免疫原性を確認し、そして(ii)非コンジュゲート化HCMV五量体−SpyTag対コンジュゲート化HCMV五量体−HBsAg VLPの免疫原性を比較した。
第0日:免疫(プライム);第20日:尾採血;第21日:免疫(ブースト1);第41日:尾採血;第42日:免疫(ブースト2);第63日:心採血。
1)AddaVaxTM(Invivogen)中の1μg HCMV五量体−SpyTag
2)AddaVaxTM中の1μg HCMV五量体−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg VLP(1μgの五量体の同等物)
3)AddaVaxTM中のSpyCatcher−HBsAg VLP(群2中のSpyCatcher−HBsAgの量に対して標準化)
4)AddaVaxTM中の0.1μg HCMV五量体
5)AddaVaxTM中の0.1μg HCMV五量体−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg VLP(0.1μgの五量体の同等物)
6)TBS(20mM Trisおよび150mM NaCl、pH7.4)
AddaVaxTMは、アジュバント化インフルエンザワクチンに関して欧州で認可されているMF59(登録商標)に類似の配合物を含む、スクアレンに基づく水中油ナノエマルジョンである。スクアレン水中油エマルジョンは、細胞性(Th1)および体液性(Th2)免疫反応両方を誘発することが知られる。他の適切なアジュバントは、当業者に知られるであろう。
安定構築物配列
2つの安定構築物(Hofmannら, (2015) Biotech and Bioeng, 112(12):2505−2515より採用)を、HCMV五量体−SpyTagの構成要素をCHO発現するために最適化した。HCMV五量体配列からイントロンを除去したが、シグナル配列を保持した。
安定ベクター構築物HCMV−gH−(GSG)2−SpyTag−His−IRES−gLを、それぞれ、EV71 IRESの上流および下流に、gH−SpyTag−His構成要素(配列番号42)およびgL構成要素(配列番号43)を含むよう設計した。この構築物中で用いるコード配列を以下に記載する。
EV71 IRES上流に挿入されたgH−(GSG)2−SpyTag−His(イントロンを含まない)(配列番号42)
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜69)、外部ドメイン(nt 70〜2151)、一部切除膜貫通ドメイン(nt 2152〜2157)、(GSG)2リンカー(nt 2158〜2175)、SpyTag(nt 2176〜2214)、His−タグ(nt 2215〜2232)、停止コドン(nt 2233〜2235)。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜90)、外部ドメイン(nt 91〜834)、停止コドン(nt 835〜837)
HCMV UL128/UL130/UL131A安定発現構築物
安定構築物HCMV−UL128−IRES−UL130−(G4S)3−C−タグ−IRES−UL131Aは、UL128構成要素(配列番号44)、UL130構成要素(配列番号45)およびUL131A構成要素(配列番号46)を含むように設計された。UL130構成要素を、プラスミドの第一のEV71 IRESの後ろに挿入し、そしてUL131A構成要素を第二のEV71 IRESの後ろに挿入した。この構築物中で用いたコード配列を以下に記載する。
UL128(イントロンを含まない)(配列番号44)
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜81)、外部ドメイン(nt 82〜513)、停止コドン(nt 514〜516)。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜75)、外部ドメイン(nt 76〜642)、(G4S)3リンカー(nt 643〜687)、Cタグ(nt 688〜699)、停止コドン(nt 700〜702)。
この配列中:シグナルペプチド(nt 1〜54)、外部ドメイン(nt 55〜387)、停止コドン(nt 388〜390)。
HCMV−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg(非アジュバント化)のin vivo試験
コンジュゲート化HCMV五量体−HBsAg VLP、ならびに非コンジュゲート化HCMV五量体−SpyTagを、BALB/cマウスを用いた免疫スケジュール中で用いて、コンジュゲート化五量体−HBsAg VLP対非コンジュゲート化五量体−SpyTagタンパク質の免疫原性をさらに研究した。
第0日:免疫(プライム);第20日:尾採血;第21日:免疫(ブースト1);第41日:尾採血;第42日:免疫(ブースト2);第63日:心採血。
1)1μg 非アジュバント化HCMV五量体−SpyTag
2)1μg 非アジュバント化HCMV五量体−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg VLP(1μgの五量体の同等物)
3)0.1μg 非アジュバント化HCMV五量体−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg VLP(0.1μgの五量体の同等物)
ELISAを用いて、免疫原性を評価した。HCMV五量体に対する標準化ELISAを用いて、各群中に生じた抗血清の力価を決定した。プレートを5μg/mlの五量体(SpyTagを含まない)、50μL/ウェルで一晩コーティングし;洗浄し;ミルクで1時間ブロッキングし;洗浄し;マウス血清(PBS中のおよその希釈物)を1時間適用し;洗浄し;ヤギ抗マウス−アルカリホスファターゼ抗体(1:10,000)を1時間適用し;洗浄し;現像した。
RSV−F−SpyTagの発現および精製
抗原RSV−F Sc9−10 DS−Cav1 A149C Y458C由来の配列をSpyTagに融合させて、RSV−F−SpyTagを生成し、そしてExpiCHOTM発現系キットおよびExpiFectamineTMトランスフェクション試薬(ThermoFisher Scienticfic)を用いて、プラスミドpcDNA3.4中のヌクレオチド配列、配列番号47でExpiCHOTM細胞を一過性にトランスフェクションすることによって、発現させた。
RSV−F−SpyTag−Cタグヌクレオチド配列(配列番号47)
Sc9−10 DS−Cav1 A149C Y458Cの元来の配列を、トロンビン部位、6xHis−タグおよびStrep−タグ(登録商標)IIの欠失によって、3’で修飾した。これらの欠失ドメインを、リンカー−SpyTag−C−タグ配列で置換して、Sc9−10 DS−Cav1 A149C Y458C(nt 1〜1515、シグナルペプチド(nt 1〜75)、およびT4フィブリチンfoldonドメイン(nt 1435〜1515)を含む)、(GSG)2リンカー(nt 1516〜1533;配列番号14)、SpyTag(nt 1534〜1572;配列番号15)、C−タグ(nt 1573〜1584)および停止コドン(nt 1585〜1587))を含む、1587ntカセット(配列番号47)を生じた。リンカー、SpyTag、C−タグおよび停止コドンを除いたSc9−10 DS−Cav1 A149C Y458Cヌクレオチド配列が配列番号48に含まれる。シグナルペプチド、リンカー、SpyTagまたはC−タグを除いたSc9−10 DS−Cav1 A149C Y458Cヌクレオチド酸(nucleotide acid)配列が、配列番号49に含まれる。
ヌクレオチド配列、配列番号47の発現は、以下のドメイン:Sc9−10 DS−Cav1 A149C Y458C((aa 1〜505、シグナルペプチド(aa 1〜25)およびfoldonドメイン(aa 479〜505)を含む)、リンカー(aa 506〜511; 配列番号29)、Spyタグ(aa 512〜524;配列番号30), C−タグ(aa 525〜528)を含むRSV−F−SpyTag−Cタグアミノ酸配列(配列番号50)を生じると予期された。タンパク質の予測分子量は、シグナルペプチドを含めて、57.9kDa、シグナルペプチドを含まず、55.3kDaであった。リンカー、SpyTagまたはC−タグを除いたSc9−10 DS−Cav1 A149C Y458Cアミノ酸配列は、配列番号51に含まれる。シグナルペプチド、リンカー、SpyTagまたはC−タグを除いたSc9−10 DS−Cav1 A149C Y458Cアミノ酸配列は、配列番号52に含まれる。
RSF−F−SpyTag抗原は細胞から分泌され、そしてこれをC−タグアフィニティ精製およびサイズ排除クロマトグラフィを用いて、上清から精製した。RSV−F−SpyTagは、SDS−PAGEによって分析した際、非還元および還元条件下で予期されるように出現し(図10A)、そして抗RSV−F[2F7]モノクローナル抗体(ab43812;Abcam)と反応した(図10B)。
SpyCatcher−HBsAg(VLP単量体)を上記実施例1に記載するように調製し、そして精製した。図2もまた参照されたい。
RSV−F−SpyTagを、4℃で一晩、SpyCatcher−HBsAgにコンジュゲート化して、RSV−F三量体でコーティングされたHBsAg VLPを生じた(RSV−F−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg)。Tris緩衝生理食塩水を含有する緩衝液(TBS;20mM Trisおよび150mM NaCl、pH7.4)をコンジュゲート化のために用いた。SDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析を用いて、コンジュゲート化を監視した(図11)。コンジュゲート化反応を、RSV−F−SpyTagまたはSpyCatcher−HBsAgのみのいずれかに比較すると、還元条件下で〜105kDaの新規バンド(レーン2)の存在があり(図11A)、これは抗HBsAgモノクローナル抗体(MCA4658、Bio−Rad)(図11B)および抗RSV−F[2F7]モノクローナル抗体(ab43812;Abcam)(図11C)の両方と反応性であり、該バンドが、コンジュゲート化RSV−F−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAgを含有することが示された。
コンジュゲート化RSV−F−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAgの免疫原性
BALB/cマウスを用いた免疫スケジュールを設計して、産生されたRSV−F抗原の免疫原性を確認し、そしてコンジュゲート化RSV−F−SpyTag−−SpyCatcher−HBsAg VLP対非コンジュゲート化RSV−F−SpyTagタンパク質の免疫原性を比較した。試料中のRSV−F−SpyTagの量に基づいて、群に投薬し、そして3週間間隔のプライム−ブーストスケジュールを選択して、最終時点をブースト免疫の2週間後とした。
Claims (38)
- 抗原性構成要素をディスプレイする粒子を含む組成物であって:
i)第一のペプチドタグを含む抗原性構成要素、および
ii)第二のペプチドタグを含む部分
を含み、
抗原性構成要素および部分が、前記の第一および第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合を通じて連結され、そして抗原性構成要素が50kDaを超える
前記組成物。 - 抗原性構成要素が、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa、150kDa、160kDa、170kDa、180kDa、190kDa、200kDa、300kDaまたは400kDaより大きい、請求項1に記載の組成物。
- 抗原性構成要素が、単量体または多量体であり、随意に、多量体が、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体または十量体である、請求項1または請求項2に記載の組成物。
- 部分が、ウイルス、細菌、ワクチン接種のための多量体化足場、多量体化してウイルス様粒子(VLP)を形成するタンパク質構成要素、ウイルス構造タンパク質、ナノ粒子を形成する多量体化ドメイン、合成ナノ粒子または合成VLPである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- 部分がHBsAgである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- 第一および第二のペプチドタグが、SpyTagおよびSpyCatcher対;SnoopTagまたはSnoopTagJrおよびSnoopCatcher対;RrgATag、RrgATag2またはDogTagおよびRrgACatcher対;IsopepタグPilin−C対;IsopepTag−NおよびPilin−N対;PsCsTagおよびPsCsCatcher対;ならびにSnoopLigaseによって仲介されるSnoopTagJrおよびDogTag対;あるいはその変異体、誘導体または修飾物の任意の1つより選択され、随意に、第一および第二のペプチドタグがSpyTag/SpyCatcher対である、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- 抗原性構成要素がHCMV五量体の免疫原性構成要素を含む、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- HCMV五量体の免疫原性構成要素が、gH、gL、pUL128、pUL130またはpUL131サブユニットの1つまたはそれより多くを含む、請求項7に記載の組成物。
- HCMV五量体の免疫原性構成要素が、gH、gL、pUL128、pUL130およびpUL131サブユニットのすべてを含む、請求項8に記載の組成物。
- HCMV五量体の免疫原性構成要素が、一部切除(truncated)膜貫通ドメインを含むgHサブユニットを含む、請求項7〜請求項9のいずれかに記載の組成物。
- gH、gL、pUL128、pUL130およびpUL131サブユニットが、それぞれ、配列番号28、31、35、33および36に示すアミノ酸配列、またはその機能的同等物を有する、請求項8〜請求項10のいずれかに記載の組成物。
- 第一のペプチドタグが、gHサブユニットに、好ましくはgHサブユニットのC末端に付着している、請求項8〜請求項11のいずれかに記載の組成物。
- 抗原性構成要素がRSV−Fタンパク質の免疫原性構成要素を含む、請求項1〜請求項6のいずれか一項に記載の組成物。
- RSV−Fタンパク質の免疫原性構成要素が、プレ融合Fタンパク質、随意に、安定化プレ融合Fタンパク質である、請求項13に記載の組成物。
- RSVプレ融合Fタンパク質の免疫原性構成要素がF1およびF2サブユニットの三量体を含む、請求項14に記載の組成物。
- 前記RSV−Fタンパク質が、配列番号50〜58のいずれか1つに示す配列を有する、請求項13〜15に記載の組成物。
- 第一のペプチドタグが、プレ融合Fタンパク質のC末端に付着している、請求項13〜16に記載の組成物。
- 第一のペプチドタグがSpyTagである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- SpyTagが配列番号30に示すアミノ酸配列を有する、請求項18に記載の組成物。
- SpyTagがリンカーを通じて付着している、請求項18または請求項19に記載の組成物。
- リンカーが配列番号29に示すアミノ酸配列を有する、請求項20に記載の組成物。
- 部分がHBsAgであり、そして随意に、第二のペプチドタグがSpyCatcherである、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- 第二のペプチドがSpyCatcherであり、前記SpyCatcherが配列番号38に示すアミノ酸配列を有する、請求項22に記載の組成物。
- 部分がリンカー、好ましくは柔軟性リンカーを通じてSpyCatcherに付着している、請求項22または請求項23に記載の組成物。
- リンカーが配列番号39に示すアミノ酸配列を有する、請求項24に記載の組成物。
- 免疫原性またはワクチン組成物である、先行する請求項いずれかに記載の組成物。
- 疾患の予防および/または治療において使用するための、請求項1〜26のいずれかに記載の組成物を含むワクチン。
- 請求項1〜26のいずれかにしたがった組成物を産生する方法であって:
−第一のペプチドタグへの第一のタンパク質の第一の遺伝子融合物をコードする第一の核酸を、第一の宿主細胞内に導入し;
−前記の第一の宿主細胞を、前記の第一の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし;
−第二のペプチドタグへの第二のタンパク質の第二の遺伝子融合物をコードする第二の核酸を、第二の宿主細胞内に導入し;
−前記の第二の宿主細胞を、前記の第二の遺伝子融合物を発現するための条件下でインキュベーションし;
−随意に、発現された構成要素を精製し;
−発現された構成要素を、第一のペプチドタグおよび第二のペプチドタグの間のイソペプチド結合の形成のための条件下でインキュベーションし;そして随意に、生じた組成物を精製する
工程を含む、前記方法。 - 第一のタンパク質が抗原性構成要素を含み、そして第二のタンパク質が部分を含む、請求項28に記載の方法。
- 核酸分子が、配列番号27〜41のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする、請求項28または請求項29に記載の方法において使用するための核酸分子。
- 配列番号12〜26または42〜46のいずれかに示すヌクレオチド配列を有する、請求項30に記載の核酸分子。
- 核酸分子が、配列番号50〜58のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする、請求項28または請求項29に記載の方法において使用するための核酸分子。
- 配列番号47〜55のいずれかに示すヌクレオチド配列を有する、請求項32に記載の核酸分子。
- 請求項30〜33に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項30〜32に記載の核酸分子、または請求項34に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 第一の免疫原性組成物を含む組成物、および随意に第二の免疫原性組成物を含む1つまたはそれより多いブースター組成物を含むキットであって、前記の第一および/または第二の免疫原性組成物が請求項1〜請求項26のいずれかに記載の組成物を含む、前記キット。
- 請求項7〜12のいずれかに記載の組成物を含む、HCMV感染の予防および/または治療において使用するためのワクチン。
- 請求項13〜17のいずれかに記載の組成物を含む、RSV感染の予防および/または治療において使用するためのワクチン。
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