CN112823021A - 稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体 - Google Patents

稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体 Download PDF

Info

Publication number
CN112823021A
CN112823021A CN201980051235.4A CN201980051235A CN112823021A CN 112823021 A CN112823021 A CN 112823021A CN 201980051235 A CN201980051235 A CN 201980051235A CN 112823021 A CN112823021 A CN 112823021A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
glycoprotein
filovirus
recombinant
zaire
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980051235.4A
Other languages
English (en)
Inventor
J·P·M·朗格戴克
L·吕滕
S·布洛克兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Vaccines and Prevention BV
Original Assignee
Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Vaccines and Prevention BV filed Critical Janssen Vaccines and Prevention BV
Publication of CN112823021A publication Critical patent/CN112823021A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14211—Marburgvirus, e.g. lake Victoria marburgvirus
    • C12N2760/14222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14211—Marburgvirus, e.g. lake Victoria marburgvirus
    • C12N2760/14234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14211—Marburgvirus, e.g. lake Victoria marburgvirus
    • C12N2760/14251—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了使糖蛋白的三聚体形式稳定化的丝状病毒糖蛋白突变。这些丝状病毒糖蛋白在糖蛋白序列中的指定位置处具有某些氨基酸取代。与不具有指示的氨基酸取代中的一个或多个的丝状病毒糖蛋白相比，本文所述的丝状病毒糖蛋白具有改善的三聚体形成百分比和/或改善的三聚体产率。还提供了编码这些丝状病毒糖蛋白的核酸分子和载体，以及含有这些丝状病毒糖蛋白、核酸和载体的组合物。

Description

稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体
背景技术
诸如扎伊尔型埃博拉病毒(EBOV)和苏丹型埃博拉病毒(SUDV)等埃博拉病毒以及近缘马尔堡病毒(MARV)与高度致死性的埃博拉出血热(EHF)在北美、欧洲和非洲的人类和灵长类动物中的爆发相关。这些病毒是已知感染人类和非人灵长类动物且带来严重的健康后果(包括死亡)的丝状病毒。丝状病毒感染在人类中已经导致高达90％的病死率。EBOV、SUDV和MARV感染引起EHF，且通常在感染后7至10天内发生死亡。EHF表现为急性发热性综合征，显现为突然发热、恶心、呕吐、腹泻、斑丘疹、乏力、虚脱、血管通透性增加的全身性体征、凝血异常和固有免疫应答失调。大部分的该疾病似乎是由对感染的固有免疫应答失调和病毒在血管内皮细胞中复制引起的，后者诱导宿主细胞死亡和内皮屏障破坏。丝状病毒可以通过小颗粒气溶胶传播，或者通过与人类或NHP起源的受感染血液、器官和体液直接接触而传播。据报道，感染单个病毒体足以在人类中引起埃博拉出血热(EHF)。目前，没有批准用于治疗或预防EHF的治疗剂或疫苗。对于感染了丝状病毒的个体，支持性护理仍然是唯一批准的医疗干预措施。
作为严重人类疾病的病因，丝状病毒既作为自然感染的来源又作为可能的生物恐怖主义药剂持续受到关注。尚未明确鉴定出丝状病毒在野外的储库。已经描述了四种引起EHF的埃博拉病毒亚型，即在扎伊尔、苏丹、本迪布焦和象牙海岸地区的那些(Sanchez,A.等人1996PNAS USA[美国科学院院刊]93:3602-3607)。这些埃博拉病毒亚型具有相似的遗传构成，例如含有七个线性排列的基因的负链RNA病毒。结构基因产物包括例如由RNA编辑产生的介导病毒进入的以两种替代形式(分泌型可溶性糖蛋白(ssGP)和跨膜糖蛋白(GP))存在的包膜糖蛋白(Sanchez等人1996PNAS USA[美国科学院院刊]93:3602-3607)。
已经表明免疫可能可用于针对埃博拉珠感染进行保护，因为埃博拉珠亚型内的核苷酸多态性似乎比其他RNA病毒更少(Sanchez等人1996PNAS USA[美国科学院院刊]93:3602-3607)。直到最近，针对丝状病毒的预防疫苗的开发才具有变化的结果，部分是因为对针对丝状病毒感染的保护性免疫应答的要求知之甚少。另外，在天然储库内循环的大量丝状病毒使得设计针对所有种类的丝状病毒进行保护的疫苗的努力复杂化。
正在基于多种平台技术开发候选疫苗，这些平台技术包括具有复制能力的载体(例如水泡性口炎病毒；狂犬病病毒；副流感病毒)；不具有复制能力的载体(腺病毒、改良安卡拉痘苗病毒)；包括细菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞中表达的病毒样颗粒在内的蛋白质亚基；DNA疫苗；和/或活的和杀死的减毒丝状病毒(Friedrich等人,Viruses.[病毒]2012年9月；4(9):1619-50)。EBOV糖蛋白GP是针对暴露于相同种类的EBOV进行保护的疫苗的必要组分。此外，包括来自EBOV和SUDV(两种最具毒力的埃博拉病毒种类)的GP可以保护猴使其免于EBOV和SUDV肌内暴露、以及暴露于远缘本迪布焦埃博拉病毒(BDBV)、塔伊森林(
Figure BDA0002926712070000021
Forest)埃博拉病毒(TAFV；以前称为象牙海岸或科特迪瓦埃博拉病毒)种类。同样，包括来自MARV的GP可以保护猴使其免于MARV肌内暴露和气溶胶暴露。用于这些病毒的医学防护措施的开发是高度优先的，特别是泛丝状病毒疫苗的开发，该疫苗是针对所有致病丝状病毒进行保护的一种疫苗。
埃博拉珠糖蛋白(GP)基因编码前分泌型糖蛋白(前sGP)、小的非结构性分泌型糖蛋白ssGP和表面表达型GP。作为GP基因的主要产物的ssGP被分泌，但是与表面表达型GP相反，它不被病毒中和性抗GP mAb识别。表面表达型GP由GP1和GP2组成，它们通过天然二硫键连接在一起。GP1由核心、之后是聚糖帽和粘蛋白样结构域组成。GP2含有跨膜区。图1给出了表面表达型丝状病毒GP的结构示意图，它示出了包括粘蛋白样结构域(灰色)的GP1头部结构域(黑色)以及包括重折叠区1(RR1)、碱基螺旋(在RR1与RR2之间)、重折叠区2(RR2)和跨膜结构域(TM)的GP2结构域。
像其他病毒融合蛋白一样，埃博拉珠GP是动态融合机器，它通过从亚稳态融合前构象到稳定的融合后构象的不可逆蛋白质重折叠来驱动膜融合。亚稳态融合前构象是由三个GP1和三个GP2组成的三聚体。
已经确定了在昆虫细胞(Wang等人Cell.[细胞]2016年1月14日；164(1-2):258-268；Bornholdt等人MBio.[微生物学]2016年2月23日；7(1):e02154-15；Pallesen等人NatMicrobiol.[自然·微生物学]2016年8月8日；1(9):16128)和HEK293细胞中表达的埃博拉珠GP的许多晶体结构和EM结构，但是在HEK293细胞中产生的埃博拉珠GP中有两种含有次要纤维蛋白(fibritin)或GCN4三聚化基序。三聚体结构中只有一个不与异源三聚化结构域融合(Lee等人Nature.[自然]2008年7月10日；454(7201):177-82)。这项研究的重点在于获得没有异源三聚化结构域的在哺乳动物细胞中表达的高质量可溶性埃博拉珠融合前GP三聚体。当在HEK293T细胞中表达时，基于胞外域的可溶性GP主要形成二聚体和单体(Lee等人Nature.[自然]2008年7月10日；454(7201):177-82补充附图8)。
为了疫苗开发的目的，使用可以诱导bNAb的糖蛋白是优选的。然而，大多数bNAb在其经历任何构象变化之前仅识别天然GP构象。因此，开发稳定的处于其天然样紧凑和封闭构象的GP同时最小化非天然和(由此)非中和表位的呈递可以改善产生bNAb的效率。在例如国际专利申请PCT/EP2016/070654中已经披露了产生稳定糖蛋白的先前努力，在该国际专利申请中已经描述了丝状病毒糖蛋白的某些稳定化突变。
然而，仍然需要具有改善的稳定性的具有改善的三聚体形成百分比和改善的三聚体产率的丝状病毒糖蛋白三聚体。优选地，丝状病毒糖蛋白的此类稳定化的三聚体也将展示与广泛中和抗体(bNAb)的良好结合和与非广泛中和Ab(非bNAb)的相对有限结合。本发明的目的在于提供具有改善的三聚体百分比并且优选地也具有改善的三聚体产率的丝状病毒GP。
发明内容
本发明涉及与先前描述的丝状病毒GP三聚体相比具有改善的三聚体形成百分比和/或改善的三聚体产率的重组丝状病毒糖蛋白。糖蛋白折叠被优化，使得GP三聚体更类似于天然蛋白质构型，并且对于融合过程重要的融合前封闭构象的区域通过本文所述的突变而稳定化。这提供了用来优化丝状病毒GP三聚体的折叠和稳定性的通用方法。所得的稳定且良好折叠的更类似于天然蛋白质构型的丝状病毒GP三聚体可用于免疫目的，例如以改善在施用重组丝状病毒GP三聚体后诱导广泛中和抗体并且减少非中和抗体和弱中和抗体的诱导的机会。本发明还涉及编码重组丝状病毒糖蛋白的分离的核酸分子和载体，包含分离的核酸分子和载体的细胞，以及重组丝状病毒糖蛋白、核酸分子、载体和/或细胞的组合物。
在一个一般方面，本发明涉及在GP序列的鉴定位置处具有特定氨基酸残基的重组丝状病毒蛋白，这些氨基酸残基使三聚体的形成稳定化。
在某些实施例中，本发明的重组丝状病毒糖蛋白在位置588处包含不带电荷的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。
在某些优选的实施例中，在位置588处的该指示的不带电荷的氨基酸残基是选自以下的组的疏水性氨基酸残基：F、I、A、L、M、V、W和Y。
在某些优选的实施例中，在位置588处的该指示的不带电荷的氨基酸残基是选自以下的组的疏水性氨基酸残基：F、I、L、M、V和Y。
在一个更优选的实施例中，在位置588处的该指示的疏水性氨基酸残基是F。
在某些优选的实施例中，本发明的重组丝状病毒糖蛋白在位置577和/或579处还包含氨基酸残基P，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
在某些优选的实施例中，本发明的重组丝状病毒GP来自选自以下的组的毒株：马英嘉珠(Mayinga)、马科娜珠(Makona)、基奎特株(kikwit)、苏丹古卢株(Sudan Gulu)和马尔堡株(Marburg)。
在某些实施例中，本发明的重组丝状病毒GP选自下组，该组由以下组成：
1)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白或在氨基酸残基320直到476之间具有缺失的包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白；以及
2)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白；以及
3)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白；以及
4)在氨基酸残基255直到423之间具有缺失的包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的马尔堡株糖蛋白，
其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
在另一个一般方面，本发明涉及包含本发明的重组丝状病毒糖蛋白中的三种的非共价低聚物的三聚体复合物。
在另一个一般方面，本发明涉及在其表面上展示本发明的重组丝状病毒GP或三聚体复合物的颗粒，优选地纳米颗粒，例如自组装纳米颗粒。
在另一个一般方面，本发明涉及编码本发明的重组丝状病毒GP的分离的核酸分子和包含可操作地连接至启动子的分离的核酸分子的载体。在一个实施例中，该载体是病毒载体。在另一个实施例中，该载体是表达载体。在一个优选的实施例中，该病毒载体是腺病毒载体。
另一个一般方面涉及包含编码本发明的重组丝状病毒GP的分离的核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞可以用于重组蛋白产生、重组蛋白表达或病毒颗粒产生。
另一个一般方面涉及产生重组丝状病毒GP的方法，该方法包括使包含编码本发明的重组丝状病毒GP的分离的核酸分子或载体的宿主细胞在适于产生该重组丝状病毒GP的条件下生长。
又另一个一般方面涉及包含如本文所述的重组丝状病毒GP、三聚体复合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞以及药学上可接受的载剂的组合物。
本发明的又另一个一般方面涉及改善丝状病毒糖蛋白的三聚体形成的方法，该方法包括用不带电荷的氨基酸残基取代在该糖蛋白的位置588处的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。
在一个优选的实施例中，改善丝状病毒糖蛋白的三聚体形成的方法还包括用P残基取代在该糖蛋白的位置577和/或579处的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的前述发明内容以及以下具体实施方式。应当理解的是本发明不限于附图中示出的准确实施例。
图1.全长丝状病毒GP的结构示意图。
图2.用马科娜珠Δ粘蛋白样GP-T577P-T42A(FIL161615)骨架和突变体进行的蓝色非变性PAGE(Blue NativePAGE)。所有泳道均含有细胞上清液，最后一条泳道除外，该泳道含有纯化的三聚体，指示三聚体跑胶的高度。
图3.对含有具有不同取代的GP的细胞培养上清液进行的分析型SEC。用标有“三聚体”的虚线指示三聚体峰。测试的取代是T577P、K588F和T577P-K588F的组合。披露了每种骨架丝状病毒GP(黑色断线)以及具有T577P(灰色断线)、K588F(黑色实线)和T577P+K588F双取代(灰色实线)的变体的使用分析型SEC测得的蛋白质表达水平。在以下骨架中测试取代：A)马科娜珠GP，B)马科娜珠Δ粘蛋白样结构域GP，C)基奎特株GP，D)基奎特株Δ粘蛋白样结构域GP，E)马英嘉珠GP，F)马英嘉珠Δ粘蛋白样结构域GP。转染后72h测试细胞培养上清液中的蛋白质表达水平。
图4.基于分析型SEC的三聚体含量。基于在图3的分析型SEC模式中测得的三聚体峰高的三聚体含量。测试的突变是T577P、K588F和T577P-K588F。在以下骨架中测试突变：A)马科娜珠GP，B)马科娜珠Δ粘蛋白样结构域GP，C)基奎特株GP，D)基奎特株Δ粘蛋白样结构域GP，E)马英嘉珠GP，F)马英嘉珠Δ粘蛋白样结构域GP。
图5.用抗体100进行的生物膜层干涉测量术。图5A)如在Octet中测得的生物膜层干涉测量术曲线的一个实例(基奎特株GP)，其中星号指示在确定结合斜率的时间点的虚线。图5B-5D示出了以nm/min计的抗体100的结合斜率的条形图。在细胞培养上清液中测试野生型GP和变体(T577P、K588F和T577P-K588F)与Mab 100的结合。在以下骨架中测试突变：B)马科娜珠GP，C)马科娜珠Δ粘蛋白样结构域GP，D)基奎特株GP，E)基奎特株Δ粘蛋白样结构域GP，F)马英嘉珠GP，G)马英嘉珠Δ粘蛋白样结构域GP。
图6.A、C)基于分析型SEC的三聚体含量和B、D)使用用Mab 100进行的生物膜层干涉测量术测得的缔合斜率，其中在马英嘉珠GP骨架中测试用几个疏水性残基取代的K588(A和B)，并且在马英嘉珠Δ粘蛋白样结构域GP骨架中测试用所有可能的氨基酸进行的K588取代(C和D)。
图7.对含有马尔堡株Δ粘蛋白样结构域GP的细胞培养上清液进行的分析型SEC。用标有“三聚体”的虚线指示三聚体峰。示出了使用分析型SEC测得的马尔堡株Δ粘蛋白样GP骨架(黑色断线)以及具有H588F(浅灰色实线)和H588I(深灰色实线)取代的变体的表达水平。
具体实施方式
在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一个均通过援引以其全文并入本文。已经被包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、制品等的讨论用于提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有如说明书中阐述的含义。在本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物如同在本文完全阐述一样通过援引而并入。必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“该(the)”包括复数指示物。
除非另外说明，否则任何数值(诸如本文所述的浓度或浓度范围)应被理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，数值通常包括列举值的±10％。除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的此类范围内的整数和分数。
在整个披露内容中引用了氨基酸。有二十种天然存在的氨基酸以及许多非天然存在的氨基酸。每种已知的氨基酸(包括天然和非天然两种氨基酸)均具有全名、单字母的缩写代码和三字母的缩写代码，所有这些都是本领域普通技术人员所熟知的。例如，用于二十种天然存在的氨基酸的三字母和单字母的缩写代码如下：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬氨酸(Asp；D)、天冬酰胺(Asn；N)、半胱氨酸(Cys；C)、甘氨酸(Gly；G)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)以及缬氨酸(Val；V)。氨基酸可以通过其全名、单字母的缩写代码或三字母的缩写代码来提及。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用的丝状病毒糖蛋白的氨基酸序列中的位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935(也称为马英嘉分离株)中的糖蛋白中的编号，如例如Sanchez等人Proc Natl Acad Sci U S A.[美国科学院院刊]1996年4月16日；93(8):3602-7所述，所述文献通过援引以其全文并入本文。根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935进行编号在丝状病毒GP领域是常规的。Z/Zaire/Yambuku/1976/057935毒株的GP具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。可以使用感兴趣的丝状病毒GP序列与此序列的比对来找到感兴趣的序列中对应的氨基酸编号。
丝状病毒GP中的“对应位置”是指当比对至少两个丝状病毒GP序列时氨基酸残基的位置。除非另外指示，否则按照本领域惯例，用于这些目的的氨基酸位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935分离株中的GP(SEQ ID NO:1)中的编号。
如本文所用的“稳定化突变”或“稳定化取代”是如本文所述的突变，与亲本分子相比，当通过在所述亲本分子中取代对应的氨基酸而引入突变时，所述突变增加丝状病毒GP的三聚体百分比和/或三聚体产率(其可以例如使用本文所述的非变性PAGE、AlphaLISA或分析型SEC测定来测量)。由此类稳定化突变得到的氨基酸通常在野生型丝状病毒分离株的糖蛋白中很少发现(如果有的话)。
当提及丝状病毒株(或来自它们的糖蛋白)时，术语“天然”或“野生型”可互换使用，并且是指自然界中存在的丝状病毒株(或来自它们的糖蛋白)，例如诸如在感染丝状病毒的患者中。
本发明总体上涉及在GP序列的指示位置处包含某些氨基酸取代的重组丝状病毒GP，这些氨基酸取代使糖蛋白的三聚体形式稳定化。将本发明的一个或多个鉴定的氨基酸取代引入丝状病毒糖蛋白的序列中可以导致三聚体形成百分比增加和/或三聚体产率提高。例如，这可以通过使用三聚体特异性抗体、尺寸排阻色谱法或测量解链温度来确定。对与正确折叠的(稳定的三聚体)或可替代地错误折叠的(非稳定的或非三聚体)糖蛋白结合的抗体的结合亲和力、增加的三聚体百分比和/或三聚体产率被认为指示稳定的天然的正确折叠的糖蛋白。
丝状病毒科是几种相关病毒(丝状病毒(filoviruse或filovirid))的分类单位，这些病毒形成丝状感染性病毒颗粒(病毒体)，并且以负义单链RNA的形式编码其基因组。该科中两个通常已知的成员是埃博拉病毒和马尔堡病毒。在1967年发现了第一株马尔堡病毒，当时它与进口的猴一起被运送到德国马尔堡，并且引起了致命的爆发。在1976年发现了第一株埃博拉病毒，它的名字来源于它首次出现的中非的北部刚果盆地的埃博拉河。模式种包括马尔堡型维多利亚湖马尔堡病毒和埃博拉型扎伊尔型埃博拉病毒。已经表征了四个其他埃博拉珠种类：雷斯顿埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒、塔伊森林埃博拉病毒和本迪布焦埃博拉病毒。扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBOV)亚型已经被证明对中非和西非人口最为致命，具有三种主要的爆发变体。1976年的爆发变体马英嘉珠造成380例病例，其中218例死亡(88％病死率(CFR))；并且1995年的基奎特株变体引起315例病例，其中250例死亡(81％CFR)。2013-2016年的西非埃博拉病毒爆发的确诊病例为28,616例，并且死亡11,310例。(http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/208883/ebolasitrep_10Jun2016_eng.pdf；jsessionid＝C2C2F22702591E56868CCE902ED5622F？sequence＝1)
在一个一般方面，本发明涉及重组丝状病毒GP。当有关于蛋白质使用时，术语“重组”是指通过重组技术或通过体外化学合成产生的蛋白质。根据本发明的实施例，“重组”蛋白具有人工氨基酸序列，因为它含有在对应的天然存在的序列中未发现的至少一种序列元件(例如，氨基酸取代、缺失、添加，序列替换等)。优选地，“重组”蛋白是非天然存在的丝状病毒糖蛋白，它被优化以针对一种或多种天然存在的丝状病毒株诱导免疫应答或产生免疫。
术语“丝状病毒糖蛋白”、“丝状病毒GP”和“GP”是指这样的糖蛋白或其片段或衍生物，它本质上在丝状病毒病毒体的包膜上表达并使丝状病毒能够靶向和附着于丝状病毒感染细胞的质膜。
根据本发明的实施例，“丝状病毒GP蛋白”可以是野生型扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的胞外域(氨基酸1-647)，例如来自马英嘉珠、马科娜珠或基奎特株变体。野生型扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的胞外域是已经被截短以便去除GP的跨膜区的糖蛋白。胞外域是可溶的，因此更易于操作和测试稳定性。
根据本发明的实施例，“丝状病毒GP蛋白”也可以是具有缺失的粘蛋白样结构域的野生型扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的胞外域(氨基酸1-647)。粘蛋白样结构域形成悬挂在每个原聚体侧面的单独结构域。此结构域被高度糖基化，并且没有很多针对它的中和抗体。缺少粘蛋白样结构域的埃博拉珠GP形成融合前三聚体，它们比含有粘蛋白样结构域的GP更易于分析和表征。对于马英嘉珠Δ粘蛋白GP，缺失了GP的氨基酸320直到476。对于马科娜珠和基奎特株Δ粘蛋白GP，缺失了氨基酸314直到472。
根据本发明的实施例，“丝状病毒GP蛋白”可以是具有C末端标签(诸如His6标签)的丝状病毒GP蛋白的胞外域。
根据本发明的实施例，“丝状病毒糖蛋白”可以是三聚体或单体，并且优选地是三聚体。该三聚体可以是同源三聚体(例如，包含三种相同的多肽单元的三聚体)或异源三聚体(例如，包含不完全相同的三种多肽单元的三聚体)。优选地，该三聚体是同源三聚体。
“丝状病毒糖蛋白”可以是可溶性蛋白或膜结合蛋白。膜结合包膜蛋白通常包含跨膜结构域，诸如在包含跨膜结构域(TM)的全长丝状病毒糖蛋白中，如图1所示。膜结合蛋白可以具有胞质结构域，但是不需要胞质结构域是膜结合的。可溶性包膜蛋白包含跨膜结构域的至少部分或完全缺失。例如，全长丝状病毒糖蛋白的C末端可以被截短以缺失跨膜结构域，从而产生可溶性蛋白，如图1所示。然而，具有较短的截短和替代截短位置的丝状病毒糖蛋白仍然是可溶的。与天然糖蛋白相比，根据本发明的膜结合糖蛋白可以包含完整或部分的C末端结构域。
信号肽在表达时通常存在于丝状病毒GP的N末端，但是被信号肽酶切除，因此不存在于成熟蛋白中。该信号肽可以与其他信号序列互换，并且在本文以SEQ ID NO:44(埃博拉珠GP的信号肽)和45(马尔堡珠GP的信号肽)提供了信号肽的一些非限制性实例。
根据本发明的实施例，该丝状病毒糖蛋白可以来源于来自任何埃博拉毒株或马尔堡毒株(诸如例如马英嘉珠、马科娜珠、基奎特株、苏丹古卢株、马尔堡株等或其组合)的丝状病毒糖蛋白序列。该丝状病毒糖蛋白序列可以是天然存在的序列、共有序列、合成序列或其任何衍生物或片段。如本文所用，“共有序列”意指基于同源蛋白的氨基酸序列的比对的人工氨基酸序列，例如如通过同源蛋白的氨基酸序列的比对所确定的。“合成序列”是非天然存在的丝状病毒糖蛋白，它被优化以针对超过一种天然存在的丝状病毒株诱导免疫应答或产生免疫。
在本发明的优选实施例中，该丝状病毒GP是在位置588处具有不带电荷的氨基酸残基的天然存在的糖蛋白、共有糖蛋白或合成糖蛋白，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP(SEQ ID N0:1)的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。特别优选的为其中的不带电荷的氨基酸残基是选自以下的组的疏水性氨基酸残基的糖蛋白：F、I、A、L、M、V、W和Y。甚至更优选的为其中的疏水性氨基酸残基是选自以下的组的糖蛋白：F、I、V和W。最优选的为其中的疏水性氨基酸残基是F的糖蛋白。
在本发明的某些实施例中，丝状病毒糖蛋白(无论是天然存在的序列、共有序列、合成序列等)在位置577和/或579处还包含氨基酸残基P，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
在一个或多个指示位置处引入了一个或多个更理想的氨基酸(或指示的氨基酸)取代的丝状病毒糖蛋白的氨基酸序列被称为“骨架丝状病毒GP序列”或“亲本丝状病毒GP序列”。例如，如果将SEQ ID NO:6的“马英嘉珠GP-647Δ粘蛋白样结构域”(即具有320-476a.a.缺失的GP胞外域)序列中的位置588突变为F，则“马英嘉珠GP-647Δ粘蛋白样结构域”序列被认为是“骨架”或“亲本”序列。任何丝状病毒糖蛋白均可以用作“骨架”或“亲本”序列，可以向其中引入根据本发明实施例的新颖的稳定化突变，单独的或与其他突变(诸如在位置处577或579的突变)组合的。
可以用作骨架的丝状病毒GP的非限制性实例包括来自天然丝状病毒分离株的丝状病毒GP、合成丝状病毒GP或共有丝状病毒GP，并且在某些非限制性实例中包括包含SEQID NO:2-42的那些。
在本发明的优选实施例中，该骨架丝状病毒糖蛋白选自下组，该组由以下组成：
1)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白或在氨基酸残基320直到476之间具有缺失的包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白；以及
2)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白；以及
3)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白；以及
4)在氨基酸残基255直到423之间具有缺失的包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的马尔堡株糖蛋白，
其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
根据本发明的实施例，与在位置588处没有指示的氨基酸残基的丝状病毒GP相比，重组丝状病毒GP具有以下至少之一：(a)改善的三聚体形成百分比和(b)改善的三聚体产率。
如本文所用，“改善的三聚体形成百分比”意指当丝状病毒糖蛋白的骨架序列含有本发明的氨基酸取代中的一个或多个时，与当丝状病毒GP序列的骨架序列不含有此类氨基酸取代时形成的三聚体百分比相比，形成的三聚体百分比更大。如本文所用，“改善的三聚体产率”意指当丝状病毒糖蛋白的骨架序列含有本发明的氨基酸取代中的一个或多个时，与当丝状病毒GP序列的骨架序列不含有此类氨基酸取代时获得的包膜蛋白的三聚体形式的总量相比，获得的包膜蛋白的三聚体形式的总量更大。
可以通过使用与丝状病毒GP的三聚体形式特异性结合的抗体的抗体结合测定来测量三聚体形成。可以用于检测三聚体形式的三聚体特异性抗体的实例包括但不限于单克隆抗体(mAb)：Mab 100。鉴于本披露内容，可以使用本领域已知的任何抗体结合测定来测量本发明的重组丝状病毒GP的三聚体形成百分比，诸如ELISA、生物膜层干涉测量术等。
在一个具体的实施例中，通过生物膜层干涉测量术(BLI)来测量三聚体形成。
“将抗体100以10μg/ml的浓度固定在96半孔黑色平底聚丙烯微孔板(FortéBio目录号3694)中的1x动力学缓冲液(FortéBio目录号18-1092)中的抗hIgG(AHC)传感器(FortéBio目录号18-5060)上。该实验在Octet HTX仪器(Pall-FortéBio)上以30℃、振荡速度1,000rpm进行。活化60秒，抗体固定600秒，然后洗涤150秒，然后结合Env 600秒，之后解离60秒，全部以1,000rpm振荡。使用FortéBio数据分析8.1软件(FortéBio)进行数据分析。在10秒时确定以nm/min计的结合斜率。”
AlphaLISA是基于珠的迫近测定，其中通过供体珠的高能辐射产生的单线态氧分子转移到相对于供体珠在大约200nm距离内的受体珠。单线态氧分子转移到受体珠引发了一连串的化学反应，产生化学发光信号，它然后可以被检测到(Eglen等人Curr.Chem.Genomics[当前化学基因组学],2008,25(1):2-10)。例如，可以将标有Flag-His标签的重组丝状病毒糖蛋白和与镍或可以结合GP的抗体缀合的2种不同珠同时孵育。对于三聚体特异性测定，使供体珠与三聚体特异性Mab 100缀合，并且使受体珠与结合His6标签的镍或抗His抗体缀合。为了定量GP，使供体珠与抗Flag抗体缀合，并且使受体珠与镍或抗His抗体缀合。可以通过测量从一对与和三聚体特异性mAb结合的抗体缀合的供体珠和与抗His抗体缀合的受体珠产生的化学发光信号来确定形成的三聚体的量。可以通过测量从一对镍缀合的供体珠和抗Flag缀合的受体珠产生的化学发光信号来确定表达的丝状病毒糖蛋白的总量。例如，可以如实例3中详细描述的通过AlphaLISA测定来测量三聚体的量和表达的总包膜蛋白。可以通过将形成的三聚体的量除以表达的包膜蛋白的总量来计算三聚体形成百分比。
也可以使用能够将三聚体形式与其他形式(例如，单体形式)的丝状病毒糖蛋白分离的色谱技术来确定形成的三聚体的量和表达的包膜蛋白的总量。可以使用的此类技术的实例包括但不限于分析型尺寸排阻色谱法(SEC)。根据某些实施例，使用分析型SEC来确定三聚体形成百分比。根据某些实施例，使用分析型SEC来确定三聚体产率。
核酸、载体和细胞
在另一个一般方面，本发明提供了编码根据本发明的重组丝状病毒GP的核酸分子和包含该核酸分子的载体。本发明的核酸分子可以呈RNA形式或呈通过克隆而获得或以合成方式而产生的DNA形式。DNA可以是双链的或单链的。DNA可以例如包含cDNA、基因组DNA或其组合。这些核酸分子和载体可以用于产生重组蛋白、在宿主细胞中表达蛋白质或产生病毒颗粒。
根据本发明的实施例，编码重组丝状病毒糖蛋白的核酸可操作地连接至启动子，这意味着该核酸在启动子的控制下。该启动子可以是同源启动子(即，来源于与载体相同的遗传来源)或异源启动子(即，来源于不同载体或遗传来源)。适合的启动子的实例包括人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE，或简称“CMV”)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，该启动子位于表达盒内的核酸的上游。
根据本发明的实施例，载体可以是表达载体。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体和用于将核酸递送至受试者中用于在该受试者的组织中表达的载体，诸如病毒载体。适合与本发明一起使用的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、改良安卡拉痘苗(MVA)载体、肠道病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒载体等。该载体也可以是非病毒载体。非病毒载体的实例包括但不限于质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。
在本发明的某些实施例中，该载体是腺病毒载体，例如重组腺病毒载体。重组腺病毒载体可以例如来源于人腺病毒(HAdV或AdHu)或者猿猴腺病毒诸如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)或恒河猴腺病毒(rhAd)。优选地，腺病毒载体是重组人腺病毒载体，例如重组人腺病毒血清型26、或者重组人腺病毒血清型5、4、35、7、48等中的任一种。在其他实施例中，腺病毒载体是rhAd载体，例如rhAd51、rhAd52或rhAd53。
重组腺病毒载体的制备在本领域是熟知的。例如，在例如WO 2007/104792和Abbink等人,(2007)Virol.[病毒学]81(9):4654-63中描述了重组腺病毒26载体的制备。腺病毒26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474和WO 2007/104792的SEQ IDNO:1中。US 2015/0291935中提供了rhAd51、rhAd52和rhAd53的示例性基因组序列。
根据本发明的实施例，本文所述的任何重组丝状病毒GP均可以由本文所述的任何载体表达和/或编码。鉴于遗传密码的简并性，技术人员将充分意识到可以根据本领域完全常规的方法来设计编码同一种蛋白质的几个核酸序列。编码本发明的重组丝状病毒GP的核酸可以任选地被密码子优化，以确保在宿主细胞(例如，细菌或哺乳动物细胞)中正确表达。密码子优化是广泛应用于本领域的技术。
本发明还提供了包含本文所述的任何核酸分子和载体的细胞，优选地分离的细胞。例如，这些细胞可以用于产生重组蛋白，或用于产生病毒颗粒。
因此，本发明的实施例还涉及制备重组丝状病毒GP的方法。该方法包括用表达载体转染宿主细胞，该表达载体包含可操作地连接至启动子的编码根据本发明实施例的重组丝状病毒GP的核酸；使该转染细胞在适于表达该重组丝状病毒GP的条件下生长；以及任选地纯化或分离在该细胞中表达的重组丝状病毒GP。可以通过本领域已知的任何方法(包括亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等)从细胞中分离或收集重组丝状病毒GP。鉴于本披露内容，用于重组蛋白表达的技术将是本领域普通技术人员所熟知的。也可以在不纯化或分离表达的蛋白质的情况下研究表达的重组丝状病毒GP，例如通过分析用编码重组丝状病毒GP的表达载体转染并在适于表达丝状病毒GP的条件下生长的细胞的上清液。
在一个优选的实施例中，在允许缔合该蛋白质以形成稳定化的三聚体复合物的条件下纯化表达的重组丝状病毒GP。例如，可以在33℃-39℃(例如37℃)和2％-12％CO2(例如8％CO2)下培养用可操作地连接至启动子(例如CMV启动子)的编码重组丝状病毒GP的表达载体转染的哺乳动物细胞。表达也可以在替代表达系统诸如昆虫细胞或酵母细胞(都是本领域中常规的)中进行。然后可以例如通过凝集素亲和色谱法从细胞培养物中分离表达的丝状病毒GP，其结合糖蛋白。结合到柱上的丝状病毒GP可以用吡喃甘露糖苷洗脱。可以按需要使从柱上洗脱的丝状病毒GP经受进一步的纯化步骤，诸如尺寸排阻色谱法，以去除任何残留的污染物，例如细胞污染物。也可以使用替代纯化方法来分离表达的丝状病毒GP，非限制性实例包括抗体亲和色谱法、用非bNAb进行的阴性选择、抗标签纯化或其他色谱法(诸如离子交换色谱法等)以及本领域已知的其他方法。
鉴于本披露内容，可以通过本领域已知的任何方法制备编码本发明的重组丝状病毒GP的核酸分子和表达载体。例如，可以使用本领域技术人员所熟知的基因工程技术和分子生物学技术，例如定点诱变、聚合酶链式反应(PCR)等，通过将指示位置处的氨基酸取代中的至少一个引入骨架丝状病毒GP序列中来制备编码重组丝状病毒GP的核酸。然后还可以使用标准分子生物学技术将核酸分子引入或“克隆”到表达载体中。然后可以在宿主细胞中从表达载体表达重组丝状病毒糖蛋白，并且鉴于本披露内容，通过本领域已知的任何方法从细胞培养物中纯化表达的蛋白质。
三聚体复合物
在另一个一般方面，本发明涉及包含根据本发明的重组丝状病毒GP中的三种的非共价低聚物的三聚体复合物。该三聚体复合物可以包含本文所述的任何重组丝状病毒GP。优选地，该三聚体复合物包含根据本发明的重组丝状病毒GP的三种相同的单体。该三聚体复合物可以与其他形式(诸如单体形式)的丝状病毒糖蛋白分离，或者该三聚体复合物可以与其他形式(诸如单体形式)的丝状病毒糖蛋白一起存在。
组合物和方法
在另一个一般方面，本发明涉及包含重组丝状病毒GP、三聚体复合物、分离的核酸、载体或宿主细胞以及药学上可接受的载剂的组合物。该组合物可以包含本文所述的任何重组丝状病毒GP、三聚体复合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞。
载剂可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，诸如粘合剂、崩解剂、蓬松剂、助悬剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂以及涂层。该载剂或其他材料的确切性质可以取决于施用途径，例如肌内、皮内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如，肠)、鼻内或腹膜内途径。对于液体可注射制剂(例如，悬浮液和溶液)，适合的载剂和添加剂包括水、乙二醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂(例如，散剂、胶囊、囊片、软胶囊和片剂)，适合的载剂和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。对于鼻喷雾剂/吸入剂混合物，该水性溶液/悬浮液可以包含作为适合的载剂和添加剂的水、乙二醇、油、软化剂、稳定剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、调味剂等。
本发明的组合物可以配制成适于向受试者施用以便于施用并改善功效的任何物质，包括但不限于口服(肠内)施用和肠胃外注射。肠胃外注射包括静脉注射或输注、皮下注射、皮内注射和肌内注射。本发明的组合物还可以配制用于其他施用途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下施用、舌下、从口腔粘膜绕过门脉循环、吸入或鼻内。
本发明的实施例还涉及制备该组合物的方法。根据本发明的实施例，产生组合物的方法包括将本发明的重组丝状病毒GP、三聚体复合物、分离的核酸、载体或宿主细胞与一种或多种药学上可接受的载剂混合。本领域普通技术人员将熟悉用于制备此类组合物的常规技术。
丝状病毒抗原(例如，来源于丝状病毒糖蛋白基因产物的蛋白质或其片段)和表达丝状病毒抗原的载体(诸如病毒载体)先前已经用于免疫原性组合物和疫苗中，用于针对丝状病毒感染对受试者进行疫苗接种或用于在受试者中产生针对丝状病毒感染的免疫应答。如本文所用，“受试者”意指将施用或已经施用根据本发明实施例的免疫原性组合物的任何动物，优选地哺乳动物，最优选地人。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，优选地人。本发明的重组丝状病毒GP也可以用作抗原，以在有需要的受试者中诱导针对丝状病毒的免疫应答。免疫应答可以针对一种或多种丝状病毒变体，诸如扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠、基奎特株和马科娜珠，或马尔堡病毒。该组合物可以包含表达重组丝状病毒GP的载体，或者该组合物可以包含根据本发明实施例的分离的重组丝状病毒GP。
例如，可以向有需要的受试者施用包含重组丝状病毒蛋白或其三聚体复合物的组合物以在该受试者中诱导针对丝状病毒感染的免疫应答。也可以向有需要的受试者施用包含编码本发明的重组丝状病毒GP的载体(诸如腺病毒载体)的组合物以在该受试者中诱导针对丝状病毒感染的免疫应答，其中该载体表达该重组丝状病毒GP。本文所述的方法还包括将本发明的组合物与优选地由一种或多种载体(诸如腺病毒载体或MVA载体)表达的一种或多种另外的丝状病毒GP组合施用，包括引发和加强免疫应答的方法。
在某些实施例中，该丝状病毒GP可以展示在颗粒诸如脂质体、病毒样颗粒(VLP)、纳米颗粒、病毒体或外来体上，任选地与内源和/或外源性佐剂组合。当与单独可溶性或单体糖蛋白相比时，此类颗粒通常在体内展示增强的抗原呈递功效。
可以例如通过共表达丝状病毒GP与自组装病毒蛋白来制备展示丝状病毒GP的VLP的实例。VLP类似于病毒，但是不具有感染性，因为它们不含有病毒遗传物质。病毒结构蛋白(诸如包膜或衣壳)的表达可以导致VLP的自组装。VLP是本领域技术人员所熟知的，并且它们在疫苗中的用途例如描述于(Kushnir等人,Vaccine.[疫苗]2012年12月17日；31(1):58-83)中。
在某些优选的实施例中，该颗粒是脂质体。脂质体是具有至少一个脂质双层的球形囊泡。丝状病毒GP三聚体蛋白可以例如通过静电相互作用(例如通过向丝状病毒GP三聚体的C末端添加His标签)和并入到脂质体中衍生化脂质的头部基团中的二价螯合原子(诸如Ni2+或Co2+)而非共价偶联到此类脂质体上。在某些非限制性和示例性实施例中，该脂质体包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰基]的镍或钴盐(DGS-NTA(Ni2+)或DGS-NTA(Co2+))，摩尔比为60:36:4。在优选实施例中，丝状病毒GP三聚体蛋白共价偶联到脂质体表面，例如经由整合在脂质体表面的马来酰亚胺官能团。在其某些非限制性示例性实施例中，该脂质体包含DSPC、胆固醇和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对马来酰亚胺基甲基)环己烷-甲酰胺]脂质，摩尔比为54:30:16。丝状病毒GP可以与其偶联，例如经由丝状病毒GP中添加的C末端半胱氨酸。共价偶联的变体更稳定，引起高抗原特异性IgG滴度，并且掩蔽了在抗原性上较不相关的Env三聚体“底部”的表位。用于制备与脂质体偶联的丝状病毒GP三聚体以及表征它们的方法是已知的，并且已经例如描述于通过援引并入本文的(Bale等人,J Virol.[病毒学杂志]2017年7月27日；91(16).pii:e00443-17)中。本发明还提供了融合到和/或展示在脂质体上的本发明的丝状病毒GP。
在某些实施例中，本发明的丝状病毒GP与自组装颗粒融合或展示在纳米颗粒上。抗原纳米颗粒是呈递多个拷贝的抗原(例如本发明的丝状病毒GP)的多肽的组装体，它们产生多个结合位点(亲合力)并且可以提供改善的抗原稳定性和免疫原性。制备自组装蛋白纳米颗粒及其用于疫苗中的用途是技术人员所熟知的，参见例如(Zhao L等人(2014)Vaccine[疫苗]32:327-337)、(López-Sagaseta等人,Comput Struct Biotechnol J.[计算与结构生物技术杂志]2015年11月26日；14:58-68)。作为非限制性实例，自组装纳米颗粒可以基于铁蛋白、细菌铁蛋白或DPS。在表面上展示蛋白质的DPS纳米颗粒例如描述于WO 2011/082087中。其他自组装蛋白纳米颗粒及其制备例如披露于通过援引并入本文的WO 2014/124301和US 2016/0122392中。本发明还提供了融合到和/或展示在自组装纳米颗粒上的本发明的丝状病毒GP。本发明还提供了包含根据本发明的VLP、脂质体或自组装纳米颗粒的组合物。
在某些实施例中，佐剂被包括在本发明的组合物中或与本发明的组合物共同施用。佐剂的使用是任选的，并且当组合物用于疫苗接种的目的时，可以进一步增强免疫应答。适于共同施用或包含在根据本发明的组合物中的佐剂优选地应当是在人体中潜在安全、良好耐受和有效的佐剂。此类佐剂是技术人员所熟知的，并且非限制性实例包括QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、铝盐诸如磷酸铝(例如AdjuPhos)或氢氧化铝以及MF59。
本发明的其他方面涉及包含选自以下的组的氨基酸序列的重组丝状病毒糖蛋白：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27。在某些实施例中，这些丝状病毒GP可以用作骨架蛋白，在其中可以进行上述突变以获得本发明的分子。本发明也涵盖编码这些序列的分离的核酸分子，包含可操作地连接至启动子的这些序列的载体，以及包含蛋白质、分离的核酸分子或载体的组合物。
实施例
实施例1是一种重组丝状病毒糖蛋白，该重组丝状病毒糖蛋白在位置588处包含不带电荷的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。
实施例2是根据实施例1所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该不带电荷的氨基酸残基是选自以下的组的疏水性氨基酸残基：F、I、A、L、M、V、W和Y。
实施例3是根据实施例2所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该疏水性氨基酸残基选自以下的组：F、I、L、M、V和Y。
实施例4是根据权利要求3所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该疏水性氨基酸残基是F。
实施例5是根据实施例1-4中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，该重组丝状病毒糖蛋白在位置577和/或579处还包含氨基酸残基P，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
实施例6是根据实施例1-5中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该丝状病毒来自选自以下的组的毒株：马英嘉珠、马科娜珠、基奎特株、苏丹古卢株和马尔堡株。
实施例7是根据实施例1-6中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该丝状病毒糖蛋白选自下组，该组由以下组成：
1)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白或在氨基酸残基320直到476之间具有缺失的包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白；以及
2)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白；以及
3)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白；以及
4)在氨基酸残基255直到423之间具有缺失的包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的马尔堡株糖蛋白，
其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
实施例8是根据实施例1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，该重组丝状病毒糖蛋白包含选自以下的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2-42。
实施例9是一种三聚体复合物，该三聚体复合物包含根据实施例1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白中的三种的非共价低聚物。
实施例10是一种颗粒，优选地纳米颗粒，在其表面上展示根据实施例1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白或根据实施例8所述的三聚体复合物。
实施例11是一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据实施例1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白。
实施例12是一种载体，该载体包含可操作地连接至启动子的根据实施例11所述的分离的核酸分子。
实施例13是根据实施例12所述的载体，其中该载体是腺病毒载体。
实施例14是一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据实施例11所述的分离的核酸分子或根据实施例12或13所述的载体。
实施例15是一种产生重组丝状病毒糖蛋白的方法，该方法包括使根据实施例14所述的宿主细胞在适于产生该重组丝状病毒糖蛋白的条件下生长。
实施例16是一种组合物，该组合物包含根据实施例1至8中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白、根据权利要求9所述的三聚体复合物、根据权利要求10所述的颗粒、根据权利要求11所述的分离的核酸分子或根据权利要求12或13所述的载体以及药学上可接受的载剂。
实施例17是一种改善丝状病毒糖蛋白的三聚体形成的方法，该方法包括用不带电荷的氨基酸残基取代在该糖蛋白的位置588处的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。
实施例18是根据实施例17所述的方法，该方法还包括用P残基取代在该糖蛋白的位置577和/或579处的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
实例
实例1：重组埃博拉珠和马尔堡珠糖蛋白(GP)的表达和纯化
将重组埃博拉珠和马尔堡珠GP的胞外域(即氨基酸残基1-647)表达并纯化为可溶性蛋白，具有或不具有粘蛋白样结构域。随后，将单突变(氨基酸取代)及其组合(例如双突变和三突变)引入以下不同的骨架序列中：马英嘉珠GP(SEQ ID NO:2)、基奎特株GP(SEQ IDNO:19)、EBOV14 GP(又名马科娜珠，它与2014年的爆发毒株的共有序列相同)(SEQ ID NO:10)、MARV GP(马尔堡株)(SEQ ID NO:41)、马英嘉珠Δ粘蛋白GP(SEQ ID NO:6)、基奎特株Δ粘蛋白GP(SEQ ID NO:23)、EBOV14Δ粘蛋白GP(SEQ ID NO:14)和MARVΔ粘蛋白GP(SEQID NO:27)。
埃博拉珠和马尔堡株糖蛋白构建体和变体的产生和表达
合成了编码SEQ ID NO:2-42中所示的糖蛋白(GP)的DNA，并且对其进行了密码子优化，以在金斯瑞公司(GenScript)(皮斯卡塔韦，新泽西州08854)在人类细胞中表达。然后将密码子优化的序列克隆到载体pcDNA2004中，以产生GP构建体，将其用作骨架序列以引入另外的突变。根据制造商的说明，在Expi293F细胞(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))中表达这些基因。使用ViCell MetaFlex(贝克曼公司(Beckmann))监测葡萄糖水平。在转染后第4天，葡萄糖被耗尽，因此以15mM的浓度添加葡萄糖。在转染后第6天，通过离心和无菌过滤收获转染物。
埃博拉珠或马尔堡珠GP蛋白的纯化
通过使用300cm/h.的流速和5mM NaPO4(pH 6.8)的运行缓冲液在XK16/20柱(通用电气医疗集团(GEHC))中的13mL CHT 1型树脂(伯乐公司(Biorad))上施加上清液来清除干扰性宿主细胞蛋白(HCP)。使用500mM NaPO4(pH 7.4)，通过台阶洗脱来洗脱结合的蛋白质。随后使用300cm/h.的流速和20mM Tris、500mM NaCl(pH 7.4)的运行缓冲液在对His标记的蛋白质具有选择性的HisTrap HP 5mL亲和色谱柱上施加耗尽了HCP的流过物(flowthrough)。使用15％、30％和100％洗脱缓冲液(20mM Tris、500mM NaCl、300mM咪唑，pH7.4)的台阶梯度洗脱结合的蛋白质，同时以升流和600cm/h.的流速运行柱。当施加100mM咪唑时，三聚体级分与聚集体一起被洗脱。使用50K Amicon Ultra浓缩器(密理博公司(Millipore))浓缩此级分，并且使用60cm/h.的流速将其施加到Superdex 16/600尺寸排阻柱(通用电气医疗集团，GEHC)上。随后将三聚体级分与聚集体和单体分离。合并含有三聚体峰的级分，并且使用蛋白质印迹和SDS-PAGE和/或分析型SEC分析确认该峰的身份为GP蛋白。通过测量280nm处的光密度来确定纯化的埃博拉珠或马尔堡珠GP的浓度，并且将纯化的蛋白质在4℃下储存，直到进一步使用。
实例2：可溶性埃博拉珠GP三聚体的表达和稳定性得到改善
选择了几个埃博拉珠糖蛋白(GP)序列作为骨架序列，以研究各种突变对埃博拉珠GP三聚体形成的影响。在expi293F细胞中表达野生型扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白(马英嘉珠、马科娜珠和基奎特株)的胞外域(氨基酸1-647，掺入有His6标签)。对于三种GP中的每一种，还制备了缺少粘蛋白样结构域的变体。粘蛋白样结构域在每个原聚体上形成单独的外周结构域。此结构域可变性更高，被高度糖基化，并且没有很多针对它的中和抗体。缺少粘蛋白样结构域的埃博拉珠GP形成融合前三聚体，它们比含有异源粘蛋白样结构域的GP更易于分析和表征。对于马英嘉珠蛋白：已经缺失了氨基酸320直到476。对于马科娜珠和基奎特株：已经缺失了氨基酸314直到472。已经结晶了Δ粘蛋白样GP，并且它们被认为是潜在的候选疫苗。对粗上清液进行的非变性PAGE和SEC-MALS揭示，产生的主要种类是单体，而只有很小的一部分是三聚体。从制造的角度来看，具有增加的三聚体形成百分比和绝对更高的三聚体产率的可溶性埃博拉珠蛋白是有利的，因为将需要较少的纯化和去除制剂中存在的不希望的非天然构象的包膜蛋白。此外，它们将是更好的载体插入物。
测试了重组GP蛋白变体的三聚体形成，以鉴定相对于骨架序列改善三聚体形成百分比和/或改善三聚体产率的那些突变。最初，使用用加载在凝胶上的细胞上清液进行的非变性PAGE分析对三聚体百分比和三聚体产率进行半高通量筛选。通过使用细胞上清液的分析型尺寸排阻(SEC)确认非变性PAGE的结果。
非变性PAGE分析
根据制造商的方案(生命技术公司(LifeTechnologies))使用4％-16％非变性Page Bis-Tris梯度凝胶(生命技术公司)进行非变性PAGE。具有粘蛋白样结构域的GP三聚体以约800kDa的质量跑胶，而没有粘蛋白样结构域的GP三聚体以约420kDa的质量跑胶。最初，将马科娜珠Δ粘蛋白GP-T577P-T42A(FIL161615)(SEQ ID NO:16)用作骨架。先前已经显示T577P可提高三聚体产率(WO 2017/037196)，并且引入了T42A以敲除PNGS位点以允许蛋白质结晶(Zhao等人Nature.[自然]2016年7月7日；535(7610):169-172)。图2上的非变性PAGE显示，K588F和K588W取代均明显提高了三聚体产率，而大多数测试的突变降低了三聚体产率。
马英嘉珠、基奎特株和马科娜珠中的K588F
分析型SEC分析
还测试了在不存在T42A和T577P的情况下K588F是否使马科娜珠Δ粘蛋白样GP稳定化，以及它是否使马英嘉珠和基奎特株的Δ-粘蛋白样GP稳定化。还在马科娜珠、马英嘉珠和基奎特株GP的完整胞外域中测试了单独的或与T577P组合的K588F。在96孔形式的细胞培养物中表达了EBOV GP变体。使用连接到Optilab T-rEX折射率检测器(怀亚特公司(Wyatt))的高效液相色谱系统(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))和MiniDAWNTREOS仪器(怀亚特公司)进行分析型SEC实验。将澄清的上清液以1mL/min施加到在运行缓冲液(150mM磷酸钠、50mM NaCl，pH 7.0)中平衡的TSK-Gel G3000SWxl柱(东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience))上。使用Astra 6软件包分析数据。
图3中示出了埃博拉珠GP以及含有T577P、K588F或与K588F组合的T577P突变的变体的分析型SEC色谱图。GP的色谱图有多个峰。完整胞外域的三聚体在大约6.3分钟时洗脱，并且Δ-粘蛋白变体的三聚体在约7.5分钟时洗脱。图4示出了图3中的SEC色谱图的三聚体峰高的条形图。使用生物膜层干涉测量术(BLI)，使用Octet测量了细胞培养上清液的抗体100结合，该抗体优先与埃博拉珠GP的三聚体形式结合(图5)。因此，抗体100在10秒时的结合速率(以nm位移/分钟计)很好地表明了正确折叠的三聚体的存在。在600秒时的nm位移不像在10秒时的nm位移那样多变，这可能表明抗体100能够在溶液中诱导单体形成三聚体。如通过分析型SEC所见的，在10秒时的结合速率显示出三聚体含量的非常相似的突变体排名，因此BLI数据验证了分析型SEC的结果。
生物膜层干涉测量术(BLI)
将抗体100以10μg/ml的浓度固定在96半孔黑色平底聚丙烯微孔板(FortéBio目录号3694)中的1x动力学缓冲液(FortéBio目录号18-1092)中的抗hIgG(AHC)传感器(FortéBio目录号18-5060)上。该实验在Octet HTX仪器(Pall-FortéBio)上以30℃、振荡速度1,000rpm进行。活化60s，抗体固定600s，然后洗涤150s，然后结合Env 600s，之后解离60s，全部以1000rpm振荡。使用FortéBio数据分析8.1软件(FortéBio)进行数据分析。在10秒时确定以nm/min计的结合斜率。
实例3：在位置588处的疏水性残基提高三聚体产率
使用针对马英嘉珠GP和马英嘉珠Δ粘蛋白GP的抗体100，通过分析型SEC和BLI(Octet)测试了在位置588处用苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸进行取代(图6)。用苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸进行取代大大提高了三聚体产率。在马英嘉珠Δ粘蛋白GP中，丙氨酸和色氨酸没有这么大地提高三聚体产率。在马英嘉珠Δ粘蛋白GP中测试了所有其他可能的氨基酸取代，但是没有另外的可能性导致三聚体产率提高(图6)。
实例4：三聚体马尔堡珠GP的稳定性
在588处的取代使马尔堡珠GP稳定化
为了证实稳定化取代对其他丝状病毒科的普遍性，还在马尔堡珠GP中引入了在位置588处的取代，马尔堡珠GP与埃博拉珠GP仅具有约32％的同一性。与埃博拉珠GP中的588位同源的位置位于马尔堡珠GP序列(SEQ ID NO:43)中的位置589处。然而，由于我们使用根据马英嘉珠GP(Z/Zaire/Yambuku/1976/057935)(SEQ ID NO:1(Sanchez,A.等人1996PNASUSA[美国科学院院刊]93:3602-3607))的编号的编号，因此我们在本文将提及位置588。作为骨架(FIL171592，SEQ ID NO:27)，我们使用了缺失粘蛋白样结构域并具有四个突变(即F438L、W439A、F445G和F447N)来增加弗林蛋白酶切割的马尔堡珠GP(Hashiguchi等人Cell[细胞],2015 160,904-912,2月26日)，在本文我们将其称为马尔堡株Δ粘蛋白GP。马尔堡株Δ粘蛋白GP中的H588F和H588I取代对马尔堡株Δ粘蛋白GP三聚体的天然折叠具有非常有利的作用。未突变的马尔堡株Δ粘蛋白GP主要产生聚集体，但是相比之下，尤其是H588I产生的聚集体少得多，并且产物峰清晰(图7)。H588I/F突变增加了马尔堡株Δ粘蛋白样结构域GP中的三聚体产率和百分比。
以上实例证明，本发明提供了用来优化融合前封闭丝状病毒GP三聚体蛋白的折叠和稳定性的通用方法。
应理解的是，本文所述的实例和实施例仅用于说明的目的，并且可以在不脱离其广泛的发明构思的情况下对上述实施例进行改变。因此，应理解的是，本发明不限于所披露的具体实施例，而是旨在覆盖如由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的修改。
序列表
用于测试取代的骨架和突变体的序列
SEQ ID NO:1(NP_066246.1刺突糖蛋白[扎伊尔型埃博拉病毒](Z/Zaire/Yambuku/1976/057935))(信号序列以粗斜体表示)
Figure BDA0002926712070000261
Figure BDA0002926712070000271
SEQ ID NO:2(FIL150282马英嘉珠GP-647)(粘蛋白样结构域带下划线)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGT NTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHR RTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:3(FIL180011马英嘉珠GP-647，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:4(FIL170497马英嘉珠GP-647，K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:5(FIL180012马英嘉珠GP-647-T577P，K588F)(引入的突变以灰色阴影表示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:6(FIL150351马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476))
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:7(FIL180018马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:8(FIL170500马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:9(FIL180019马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:10(FIL150352马科娜珠GP-647)(粘蛋白样结构域带下划线)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNGPKNISGQSPARTSSDPET NTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGRKAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKTGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHR RADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:11(FIL150409马科娜珠GP-647，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNGPKNISGQSPARTSSDPETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGRKAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKTGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:12(FIL170494马科娜珠GP-647，K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNGPKNISGQSPARTSSDPETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGRKAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKTGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:13(FIL170495马科娜珠GP-647，T577P、K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNGPKNISGQSPARTSSDPETNTTNEDHKIMASENSSAMVQVHSQGRKAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKTGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVGQHHRRADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:14(FIL150396马科娜珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472))
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:15(FIL161614马科娜珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:16(FIL161615马科娜珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，T577P、T42A)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSALQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:17(FIL170496马科娜珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:18(FIL180022马科娜珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，T577P、K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSVTKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYASGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREVIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYTEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:19(FIL150349基奎特株GP-647)(粘蛋白样结构域带下划线)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNRAKNISGQSPARTSSDPGT NTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHR RTDNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKGTDLLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:20(FIL180013基奎特株GP-647，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNRAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKGTDLLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:21(FIL170498基奎特株GP-647，K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNRAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKGTDLLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:22(FIL180014基奎特株GP-647，T577P、K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNRAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQPPTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKGTDLLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:23(FIL150350基奎特株GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472))
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:24(FIL180020基奎特株GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，T577P)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:25(FIL170499基奎特株GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:26(FIL180021基奎特株GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ314-472)，T577P、K588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTAVSNSASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRARREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATPELRTFSILNRFAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:27(FIL171592马尔堡珠GP-637(MARV)Δ粘蛋白样结构域(Δ255-423))
LPVLEIASNSQPQDVDSVCSGTLQKTEDVHLMGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPSNIRDYPKCKTVHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRVASTTMYRGKVFTEGNIAAMIVNKTVHRMIFSRQGQGYRHMNLTSTNKYWTSSNETQRNDTGCFGILQEYNSTNNQTCPPSLKPPSLPTVTPSIHSTNTQINTAKSGTRPPIYFRKKRSILAKEGDIGPNLDGLINTEIDFDPIPNTETIFDESPSFNTSTNEEQHTPPNISLTFSYFPDKNGDTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSKNISEQIDKIRKDEQKEETG
SEQ ID NO:28(FIL172545马英嘉珠GP-647，K588A)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRAAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:29(FIL172546马英嘉珠GP-647，K588V)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRVAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:30(FIL172547马英嘉珠GP-647，K588I)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRIAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:31(FIL172548马英嘉珠GP-647，K588L)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRLAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:32(FIL172549马英嘉珠GP-647，K588M)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRMAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:33(FIL172550马英嘉珠GP-647，K588Y)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGQSPARTSSDPGTNTTTEDHKIMASENSSAMVQVHSQGREAAVSHLTTLATISTSPQSLTTKPGPDNSTHNTPVYKLDISEATQVEQHHRRTDNDSTASDTPSATTAAGPPKAENTNTSKSTDFLDPATTTSPQNHSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRYAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:34(FIL172532马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588A)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRAAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:35(FIL172533马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588V)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRVAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:36(FIL172534马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588I)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRIAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:37(FIL172535马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588L)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRLAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:38(FIL172536马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588M)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRMAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGH
SEQ ID NO:39(FIL172537马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588Y)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRYAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:40(FIL180327马英嘉珠GP-647，Δ粘蛋白样结构域(Δ320-476)，K588W)(引入的突变以灰色阴影指示)
IPLGVIHNSTLQVSDVDKLVCRDKLSSTNQLRSVGLNLEGNGVATDVPSATKRWGFRSGVPPKVVNYEAGEWAENCYNLEIKKPDGSECLPAAPDGIRGFPRCRYVHKVSGTGPCAGDFAFHKEGAFFLYDRLASTVIYRGTTFAEGVVAFLILPQAKKDFFSSHPLREPVNATEDPSSGYYSTTIRYQATGFGTNETEYLFEVDNLTYVQLESRFTPQFLLQLNETIYTSGKRSNTTGKLIWKVNPEIDTTIGEWAFWETKKNLTRKIRSEELSFTVVSNGAKNISGKLGLITNTIAGVAGLITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTTQDEGAAIGLAWIPYFGPAAEGIYIEGLMHNQDGLICGLRQLANETTQALQLFLRATTELRTFSILNRWAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG
SEQ ID NO:41(FIL171593马尔堡珠GP-637(MARV)Δ粘蛋白样结构域(Δ255-423)，H588F)(引入的突变以灰色阴影指示)
LPVLEIASNSQPQDVDSVCSGTLQKTEDVHLMGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPSNIRDYPKCKTVHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRVASTTMYRGKVFTEGNIAAMIVNKTVHRMIFSRQGQGYRHMNLTSTNKYWTSSNETQRNDTGCFGILQEYNSTNNQTCPPSLKPPSLPTVTPSIHSTNTQINTAKSGTRPPIYFRKKRSILAKEGDIGPNLDGLINTEIDFDPIPNTETIFDESPSFNTSTNEEQHTPPNISLTFSYFPDKNGDTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRFAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSKNISEQIDKIRKDEQKEETG
SEQ ID NO:42(FIL171594马尔堡珠GP-637(MARV)Δ粘蛋白样结构域(Δ255-423)，H588I)(引入的突变以灰色阴影指示)
LPVLEIASNSQPQDVDSVCSGTLQKTEDVHLMGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPSNIRDYPKCKTVHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRVASTTMYRGKVFTEGNIAAMIVNKTVHRMIFSRQGQGYRHMNLTSTNKYWTSSNETQRNDTGCFGILQEYNSTNNQTCPPSLKPPSLPTVTPSIHSTNTQINTAKSGTRPPIYFRKKRSILAKEGDIGPNLDGLINTEIDFDPIPNTETIFDESPSFNTSTNEEQHTPPNISLTFSYFPDKNGDTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRIAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSKNISEQIDKIRKDEQKEETG
SEQ ID NO:43(MARV GP(马尔堡株)(马尔堡珠GP的胞外域，粘蛋白样结构域带下划线)(信号序列以粗斜体表示)
Figure BDA0002926712070000391
SEQ ID NO:44埃博拉珠GP的信号肽
MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFS
SEQ ID NO:45马尔堡珠GP的信号肽
MKTIYFLISLILIQSIKT
参考文献
Sanchez,A.et al.1996PNAS USA 93:3602-3607
Friedrich et al.,Viruses.2012Sep；4(9):1619-50
Wang et al.Cell.2016Jan 14；164(1-2):258-268
Bornholdt et al.MBio.2016Feb 23；7(1):e02154-15
Pallesen et al.Nat Microbiol.2016Aug 8；1(9):16128
Lee et al.Nature.2008Jul 10；454(7201):177-82
Sanchez et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1996Apr 16；93(8):3602-7
Eglen et al.Curr.Chem.Genomics,2008,25(1):2-10
WO 2007/104792
Abbink et al.,(2007)Virol.81(9):4654-63
Kushnir et al.,Vaccine.2012Dec 17；31(1):58-83
Bale et al,J Virol.2017Jul 27；91(16).pii:e00443-17
Zhao L,et al(2014)Vaccine 32:327-337
López-Sagaseta et al,Comput Struct Biotechnol J.2015Nov 26；14:58-68
Zhao et al.Nature.2016Jul 7；535(7610):169-172
Hashiguchi et al.Cell,2015Feb 26；160:904-912
US 2015/0291935
WO 2014/124301
US 2016/0122392
WO 2017/037196

Claims (17)

1.一种重组丝状病毒糖蛋白，该重组丝状病毒糖蛋白在位置588处包含不带电荷的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该不带电荷的氨基酸残基是选自以下的组的疏水性氨基酸残基：F、I、A、L、M、V、W和Y。
3.根据权利要求2所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该疏水性氨基酸残基选自以下的组：F、I、L、M、V和Y。
4.根据权利要求2所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该疏水性氨基酸残基是F。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，该重组丝状病毒糖蛋白在位置577和/或579处还包含氨基酸残基P，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该丝状病毒来自选自以下的组的毒株：马英嘉珠、马科娜珠、基奎特株、苏丹古卢株和马尔堡株。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白，其中该丝状病毒糖蛋白选自下组，该组由以下组成：
1)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白或在氨基酸残基320直到476之间具有缺失的包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马英嘉珠糖蛋白；以及
2)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒马科娜珠GP糖蛋白；以及
3)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白或在氨基酸残基314直到472之间具有缺失的包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的扎伊尔型埃博拉病毒基奎特株糖蛋白；以及
4)在氨基酸残基255直到423之间具有缺失的包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的马尔堡株糖蛋白，
其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
8.一种三聚体复合物，该三聚体复合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白中的三种的非共价低聚物。
9.一种颗粒，优选地纳米颗粒，在其表面上展示根据权利要求1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白或根据权利要求8所述的三聚体复合物。
10.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据权利要求1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白。
11.一种载体，该载体包含可操作地连接至启动子的根据权利要求10所述的分离的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的载体，其中该载体是腺病毒载体。
13.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求10所述的分离的核酸分子或根据权利要求11或12所述的载体。
14.一种产生重组丝状病毒糖蛋白的方法，该方法包括使根据权利要求13所述的宿主细胞在适于产生该重组丝状病毒糖蛋白的条件下生长。
15.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的重组丝状病毒糖蛋白、根据权利要求8所述的三聚体复合物、根据权利要求9所述的颗粒、根据权利要求10所述的分离的核酸分子或根据权利要求11或12所述的载体以及药学上可接受的载剂。
16.一种改善丝状病毒糖蛋白的三聚体形成的方法，该方法包括用不带电荷的氨基酸残基取代在该糖蛋白的位置588处的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号，并且其中该不带电荷的氨基酸残基不是半胱氨酸。
17.根据权利要求16所述的方法，该方法还包括用P残基取代在该糖蛋白的位置577和/或579处的氨基酸残基，其中位置编号是根据Z/Zaire/Yambuku/1976/057935中GP的编号。
CN201980051235.4A 2018-08-13 2019-08-13 稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体 Pending CN112823021A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18188675.5 2018-08-13
EP18188675 2018-08-13
PCT/EP2019/071732 WO2020035497A1 (en) 2018-08-13 2019-08-13 Stabilized filovirus glycoprotein trimers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112823021A true CN112823021A (zh) 2021-05-18

Family

ID=63452359

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980051235.4A Pending CN112823021A (zh) 2018-08-13 2019-08-13 稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11603390B2 (zh)
EP (1) EP3836961A1 (zh)
JP (1) JP2021533772A (zh)
CN (1) CN112823021A (zh)
AU (1) AU2019323115A1 (zh)
BR (1) BR112021001460A2 (zh)
CA (1) CA3107083A1 (zh)
EA (1) EA202190522A1 (zh)
WO (1) WO2020035497A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112823021A (zh) 2018-08-13 2021-05-18 扬森疫苗与预防公司 稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070082011A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Hawaii Biotech, Inc. Recombinant proteins from filoviruses and their use
CN103596587A (zh) * 2010-10-28 2014-02-19 健康和人类服务部秘书长代表的美利坚合众国政府 纤丝病毒融合蛋白及其应用
WO2017037196A1 (en) * 2015-09-02 2017-03-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized viral class i fusion proteins
CN106868025A (zh) * 2017-03-13 2017-06-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法
WO2017172622A1 (en) * 2016-03-28 2017-10-05 Integrated Biotherapeutics, Inc. Pan filovirus vaccine compositions and methods of making

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005289439B2 (en) * 2004-09-27 2011-12-01 Crucell Holland B.V. Optimized vaccines to provide protection against Ebola and other viruses
WO2007104792A2 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
US9241986B2 (en) 2010-01-04 2016-01-26 Kj Biosciences Llc DPS fusion proteins for use in vaccines and diagnostics
EP2920313B1 (en) 2012-11-16 2019-06-12 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Recombinant adenoviruses and use thereof
US10248758B2 (en) 2013-02-07 2019-04-02 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-assembling protein nanostructures
US9630994B2 (en) 2014-11-03 2017-04-25 University Of Washington Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures
AU2016315478B2 (en) * 2015-09-03 2023-07-13 Novavax, Inc. Vaccine compositions having improved stability and immunogenicity
CN112823021A (zh) 2018-08-13 2021-05-18 扬森疫苗与预防公司 稳定化的丝状病毒糖蛋白三聚体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070082011A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Hawaii Biotech, Inc. Recombinant proteins from filoviruses and their use
CN103596587A (zh) * 2010-10-28 2014-02-19 健康和人类服务部秘书长代表的美利坚合众国政府 纤丝病毒融合蛋白及其应用
WO2017037196A1 (en) * 2015-09-02 2017-03-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized viral class i fusion proteins
WO2017172622A1 (en) * 2016-03-28 2017-10-05 Integrated Biotherapeutics, Inc. Pan filovirus vaccine compositions and methods of making
CN106868025A (zh) * 2017-03-13 2017-06-20 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE JE等: "Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry", 《FUTURE VIROL》 *
LEE JE等: "Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor", 《NATURE》 *
RUTTEN L等: "Structure-Based Design of Prefusion-Stabilized Filovirus Glycoprotein Trimers", 《CELL REP》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210292371A1 (en) 2021-09-23
CA3107083A1 (en) 2020-02-20
WO2020035497A1 (en) 2020-02-20
JP2021533772A (ja) 2021-12-09
EP3836961A1 (en) 2021-06-23
EA202190522A1 (ru) 2021-05-25
AU2019323115A1 (en) 2021-01-28
US11603390B2 (en) 2023-03-14
BR112021001460A2 (pt) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11820796B2 (en) Trimer stabilizing HIV envelope protein mutations
AU2014259474B2 (en) Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides
US11732010B2 (en) Trimer stabilizing HIV envelope protein mutations
US11603390B2 (en) Stabilized Filovirus glycoprotein trimers
WO2023110618A1 (en) Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
CA3211034A1 (en) Stabilized pre-fusion rsv fb antigens
CA3211197A1 (en) Trimer stabilizing hiv envelope protein mutation
EA038287B1 (ru) Стабилизирующие тример мутации белка оболочки hiv
NZ750773B2 (en) Trimer stabilizing hiv envelope protein mutations
EA042607B1 (ru) Стабилизирующие тример мутации белка оболочки hiv

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20210518