JP5557254B2 - 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン - Google Patents
薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP5557254B2 JP5557254B2 JP2010550528A JP2010550528A JP5557254B2 JP 5557254 B2 JP5557254 B2 JP 5557254B2 JP 2010550528 A JP2010550528 A JP 2010550528A JP 2010550528 A JP2010550528 A JP 2010550528A JP 5557254 B2 JP5557254 B2 JP 5557254B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- coiled
- seq
- comp
- vaccine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55544—Bacterial toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
COMP-Z運搬体の作製:
(COMP ODのクローニング)
下記の方法によりCOMPのオリゴマー化ドメイン(oligomerization domain:OD)をクローニングした。すなわち、COMP ODの55アミノ酸残基(配列番号5)にスペーサー配列として(G4S)3のアミノ酸配列を付加した産物を得るため、配列番号12のセンスプライマーと配列番号13のアンチセンスプライマーを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、サブクローニングした。
COMP ODのサブクローニング完了後、塩基配列を確認し、再度配列番号14のセンスプライマーおよび配列番号15のアンチセンスプライマーを用いてPCRでCOMP OD遺伝子を増幅し、制限酵素NcoI, XhoIで処理した後に大腸菌発現ベクターであるpET-22bのNcoI-XhoI部位にサブクローニングし、大腸菌DH5アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換した。さらに、ベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行ない、目的の遺伝子導入クローンを選択した。そのクローンをタンパク質発現大腸菌株であるBL21(DE3)に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換し、アンピシリンによるスクリーニング後、COMP ODの発現コンストラクトを構築した。本発現株は一般的なLB-アンピシリン含有(LB-Amp)培地100mlで37℃一昼夜、前培養し、つづいて250mlのLB-Amp培地4本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nmを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、培養上清を遠心分離し(8,000 rpm、20min、4℃、2times)、0.45マイクロメートルのフィルターで濾過後にHis-tagカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製し、精製タンパク質の一部を15%アクリルアミド濃度SDS-PAGEを行なうことで、COMP OD部分の発現を確認した。
COMP(Gly27-Gly72)部分だけを増幅するために先に構築したpET-22b-COMP ODを鋳型にし、配列番号16のセンスプライマーおよび配列番号17のアンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、COMP(Gly27-Gly72)部分を増幅し、制限酵素NcoI、XhoIで処理した後に発現ベクターであるpET-22bのNcoI-XhoI部位にサブクローニングし、COMP(Gly27-Gly72)の発現コンストラクトを構築した(pET-22b-COMP(Gly27-Gly72))。塩基配列を確認後、発現解析を行い、本コンストラクトは培養上清にCOMP(Gly27-Gly72)を優位に分泌発現することが分かった。
次にCOMP(Gly27-Gly72)部分にリンカー領域を導入した。リンカー領域としてGPGPとG4Sを組み合わせ、さらにリンカー領域にタンパク質精製用タグとして使われるHisx6を併用したGPGP(G4S)H6(G4S)GPGP(配列番号18)からなるリンカー領域をCOMP ODのC末端部分に導入した。具体的なリンカー導入方法としては5’をリン酸化した配列番号19のセンスプライマーおよび配列番号20のアンチセンスプライマーを用いてリンカー領域をアニールさせた後、pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)のXhoI部位にサブクローニングして構築を行った(pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)-flexible linker)。塩基配列を確認後、発現解析を行い、本コンストラクトはCOMP(Gly27-Gly72)同様に培養上清にCOMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerを優位に分泌発現することが分かった。
上記COMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerに下記方法によりリガンド部分の構築を行なった。リガンドとしてStaphylococcus aureus 由来タンパク質Protein A (SpA)由来のBドメインホモログである抗体結合ドメイン(Zドメイン)を用いた(配列番号7)。このZドメインを先に構築したCOMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerのC末端側に遺伝子工学的に融合させ構築した。具体的には配列番号21のセンスプライマーおよび配列番号22のアンチセンスプライマーの合成オリゴを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、Zドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、制限酵素SalI、XhoIで処理した後に、pET-22b-COMP(Gly27-Gly72)-flexible linkerのXhoI部位にサブクローニングして構築を完了させた(pET-22b-COMP-Z)。
pET-22b- COMP-Zを含有する大腸菌BL21(DE3)株のフリーズストックから10μlを100 mlの LB-Amp培地に植菌し、37℃で一昼夜前培養した。つづいて250mlのLB-Amp培地4本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nmを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、全ての培養液を統一し、遠心分離し(8,000 rpm、20min、4℃、2times)、菌体と培養上清に分離した。その際、培養上清の一部を発現解析用に回収した。つづいて、培養上清を0.45 マイクロメートルのフィルターで濾過し、クロマトアプライ用サンプルとして調整した。COMP-ZのアフィニティークロマトグラフィーにはIgGセファロース樹脂(GEヘルスケア社)10 mlをオープンカラムに詰めて精製カラムを用意した。カラムの平衡化溶液としてカラム容量の2〜3倍量のTST緩衝液(pH 8.0)でpHが8.0になるまで平衡化し、次にカラム容量の2〜3倍量の0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)を流した。これもpHが3.5になるまで平衡化し、このステップを二回繰り返し、最終的にTST緩衝液(pH8.0)でpHが8.0になるまで平衡化した(TST→酢酸→TST→酢酸→TST)。
次に調整したサンプル溶液を自然落下、もしくはペリスタポンプ等でカラムにアプライし、アフィニティークロマトグラフィーを実施した。
サンプルアプライ終了後、次に洗浄を行なった。10倍量のTST緩衝液(pH 8.0)で洗浄し、次に2倍量の0.5 M酢酸アンモニウム溶液(pH 5.5)で洗浄した。洗浄後、溶出buffer(0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)を用いて50 mlで溶出した。培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15%アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認出来たら、限外濾過膜(Amicon Ultra-4 50K )にて濃縮し、PBSで置換した。PIERCE社のBCA Protein Assay Reagent (bicinchoninic acid)試薬を用いたBCA法により定量したところ、COMP-Z融合タンパク質の濃度は6 mg/mlであり、総タンパク質量は30mgとなった。
大腸菌で作製したリコンビナントはエンドトキシンの混入が考えられるため、免疫実験を行なうにあたってエンドトキシンの除去およびタンパク質溶液のエンドトキシン濃度を検定した。
COMP-Zは高分子量のタンパク質であるのに対し、エンドトキシンは約10 kDaなので50 kDaの透析膜による処理を行なった。透析外液としてはPBSを用い4℃で数時間毎に外液を交換することで最終的に一昼夜透析した(約4〜5回の1LのPBSによって透析した)。
この透析済みサンプルをエンドトキシン除去カラム(PIERCE社;Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel)にアプライし、エンドトキシンを除去した。エンドトキシン除去カラム後のサンプルをBCA定量し、リムルス試験(LAL)によりエンドトキシン濃度を検定した。
すなわち、LALのPyrogen Single Test 25回用を用いて最終容量を0.25 mlに希釈したサンプルを用いて検査した。サンプルの希釈にはエンドトキシンフリー水を用いた。必要濃度に調整したサンプル溶液を注射器でバイアルに注入し、軽く混合し、転倒しないように箱等に入れて37℃で一時間反応させた。反応後、静かに取り出して逆さにし、凝固していたら、エンドトキシン陽性、凝固してないもしくは溶液が一部溶けて落ちてくる場合はエンドトキシン陰性と判断した。陰性になる希釈ポイントの一段階前がエンドポイントと定義されるので、そこからエンドトキシンのUnit数を計算し、500 pg エンドトキシン/μg of proteinのレベル以上であった場合には、再度エンドトキシン除去カラムにアプライし、同様の操作を500 pg エンドトキシン/μg of protein以下となるレベルまで繰り返し行った。
ワクチン−運搬体融合体の作製(1):
三日熱マラリア原虫の伝搬阻止抗原であるPvs25をCOMP-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学的結合によってCOMP-Zに融合した。ワクチン抗原Pvs25は酵母Pichia pastorisで発現した均一な立体構造を持つPvs25H Aフォーム(Pvs25H-A)を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下のような反応経路で融合体COMP-Z/Pvs25H-Aを完了させた。
融合に関しては、COMP-Z 5量体 (1 mg; 373 μl;13,793 pmol;) Pvs25H-A (2.84 mg; 499 μl; 137,864.08pmol)で行なった(COMP-Zの分子量は72.5 kDa、Pvs25H-Aの分子量は20.6 kDaであり、COMP-Zが1 molに対してPvs25H-A 10 molである。)
(還元処理)
まずCOMP-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行なった。COMP-Zは大腸菌で発現させた状態のままでも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSHの数を増加させるためである。COMP-Z 1mgを1,379.3 nmolのDTTを加えた後、37℃で30分間反応させた。その後、限外濾過膜(Amicon Ultra-4 10K;5000 x g 20 min×4 times with PBS)でDTTを除去した。
(融合処理)
使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 45 μlを2.84 mgのPvs25H-A(1.5 mlにPBSで調整)を加え、60分間室温でインキュベートした(Pyridyldithiol-activated Pvs25H-Aの作製)。限外濾過膜(Amicon Ultra-4 10k;5000 x g 20 min×4 times with PBS)を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated Pvs25H-A (solution volumeは200μl)に 還元処理済みの1mg COMP-Z(240μl)を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k(5000 x g 20 min×4 times)を使用し、化学反応の副産物(Pyridine 2-thione)を除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質COMP-Z/Pvs25H-Aを得た。
ワクチン融合運搬体の濃度をBCAで定量した。得られたワクチン融合運搬体(COMP-Zあたりが)100 μgとコントロールとして実施例1で得られたCOMP-Z 100μgについてTotal 300μlにfill upして、IgGセファロース(TSTで平衡化済み、50% スラリー)200μlと反応させ、4℃で2時間ローテーターを用いて吸着させた。遠心し(600 x g 2 min)、上清(500μl)を回収した。つぎにTST 1000μlで洗浄し、遠心し(600 x g 2 min)、洗浄画分1を回収した。さらに0.5 M酢酸アンモニウム溶液(pH 5.5)200μlで洗浄し、遠心し(600 x g 2 min)、洗浄画分2を回収した。最後に0.5 M酢酸溶液(pH 3.5)100μlで懸濁し、10 min間混合処理を行った後、遠心し(600 x g 2 min)、100μlを回収した。回収した各BCA定量によって算出したタンパク質量から非結合分子量を導きだし、最終的に結合分子量を計算した。
すなわち、上清と洗浄画分に存在するタンパク質はフリーのパートナー分子(ワクチン抗原)だと仮定し、アプライしたタンパク質量から逆算して、結合したパートナー分子の割合を算出した。最初にアプライしたタンパク質量は115.7μgであるので、割合としてはPvs25H-Aは85.5698μgでCOMP-Zは30.1302μgとなる。Pvs25H-A 85.35698μg中の48.82326μg(上清と洗浄画分のタンパク質量)が結合しなかった量になり、つまり36.53338μgが結合していることになる。molで計算すると1773.3 pmolのPvs25H-Aが結合していることになる。30.1μgのCOMP-Zは415.17pmolなので、つまりPvs25H-A:COMP-Z=4.3:1のモル比となる。最終的に1分子のCOMP-Zに4.3分子のPvs25H-Aが結合した融合体として作製できていることが示された。
COMP-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、Pvs25H-A特異的ELISA法によってPvs25H-AがCOMP-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96well ELISA plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG(hIgG)を5μg/mlの濃度で各wellに50μlずつアプライし、4℃で一昼夜反応させ、コートさせる。hIgGをコートしたELISAプレートに1% BSA in PBS溶液を150μl/wellで加え、37℃2時間反応させ、ブロッキング反応を行なった。ブロッキング後に各アプライサンプルをCOMP-Zあたり2μg/wellの濃度でCOMP-Z或いはCOMP-Z/Pvs25H-A融合分子を加え、37℃2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体(hIgG)と結合していない可能性のある「フリー」の状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG(5μg/ml)を各wellに50μlずつアプライし37℃2時間反応した。その後、一次抗体として抗Pvs25マウスIgG抗血清(200倍希釈)を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体(3,000倍希釈)を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、Pvs25H-A抗原特異的シグナルを検出した結果、COMP-ZとCOMP-Z/Pvs25H-Aのシグナルの違いからCOMP-ZにPvs25H-Aが結合していることが直接的に証明された。
免疫原性確認試験:
Balb/cマウス、♀、7週齢(日本SLC)に、Pvs25H-A(S)30μgを皮下(s.c.)、腹腔内(i.p)、静脈内(i.v.)、経鼻(i.n.)で3回(0、2、4週目)投与した(n=7、静脈内投与群のみn=2)。同様にして、Pvs25H-A 30μgとCOMP-Z 10.6μgを混合した試料(M)または実施例2で得られたCOMP-Z/Pvs25H-A(L)40.6μgを投与した。さらに、コレラ毒素(CT;LBL)1μgと試料S、L、MをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを経鼻で投与した(i.n./CT)。またフロイントアジュバント(IFA)を抗原投与容量と同量(ここでは100μl)と試料Sを30μgを混合したものを皮下投与した。さらにIFAの非存在下で、S、M、LをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のPvs25H-Aに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に最終採血を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にPvs25H-A(5μg/ml)を用い、50倍希釈の血清、3000倍希釈のAP conjugate抗マウス抗体を用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図1に示す。
伝搬阻止解析:
実施例3で得られた血清を各群(s.c./IFA S、s.c.S、s.c.M、s.c.L、i.n.S、i.n./CT S、i.n./CT M、i.n./CT L)で混合し、混合血清をサンプルとした。アッセイは、4名の患者血液(三日熱マラリア原虫生殖母体)を用いた。患者血液180μlに、混合血清90μlと正常ヒト血清90μlを混合した180μlを添加し、メンブレンフィーダーに入れて蚊(Anopheles dirus)に吸血させた。蚊の中腸におけるオーシスト形成数を顕微鏡観察によって測定した。結果を図2に示す。
細胞標的機能解析:
実施例1で得られたCOMP-Zの細胞標的機能をフローサイトメトリーの手法を用いて解析を行った。すなわち、7週齢のBalb/cマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を調製する。この得られた脾臓細胞約105cellsを用いて、標識B細胞マーカーと標識COMP-Zで検出し、標的機能を調べた。B細胞マーカーとしてはFITC標識した抗CD19抗体を0.2 mg/mlの濃度で用いた。COMP-ZはMaleimide-PEO2-Biotin によってビオチン化し、更に0.0001 mg/ml の濃度でPE-Streptavidin(SA-PE)を用いて検出を行った。より具体的には、0.01mgのビオチン化COMP-Zを1%BSA in PBSで懸濁した105cells/100mlに調製した脾臓細胞と混合し、氷中で30min反応させた。次にマスキングとしてhIgGを50 mg/mlの濃度で加えて、4℃で30min反応させた。更にFc受容体阻害剤としてハムスターイムノグロブリンを加えて、4℃で30min反応させた。その後に遠心分離して(1500 rpm, 5min)上清を捨て、100mlの1%BSA in PBSで懸濁する。次にFITC-抗CD19抗体とSA-PEを加えて、4℃で30min反応させた。その後に遠心分離して(1500 rpm, 5min)上清を捨て、100mlの1%BSA in PBSで懸濁した。つづいて再度、遠心分離して(1500 rpm, 5min)上清を捨て、最終的に1%ホルムアルデヒドで懸濁して、フローサイトメトリー用サンプルとした。リガンドのないサンプルとしてCOMP ODを同時に用いてネガティブコントロールとした。フローサイトメトリー解析はBD社のFACSシステムのマニュアルに準じて行った。結果を図3に示す。
TBCC-Z運搬体の作製:
(TBCC(wt)- flexible linkerのクローニング)
コア分子としてTBCCを用いて融合体を作製した。TBCCは野生型配列(配列番号34)を用いたものをTBCC (wt)と表記する。
COMP-Zの作製ではflexible linkerはCOMPのクローニング後に導入したが、TBCCの場合は便利性を考えて同時にクローニングを行った。具体的な導入方法としては、まず、最初にTBCC(wt)- flexible linkerのクローニングを行った。すなわち、TBCC(wt)- flexible linkerの79アミノ残基(配列番号24)を得るため、配列番号25のセンスプライマーと配列番号26のアンチセンスプライマーを作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、サブクローニングした。
制限酵素Nco I、Xho Iで処理した後に大腸菌発現ベクターであるpET-21dのNco I-Xho I部位にサブクローニングし、大腸菌DH5アルファに一般的なリン酸カルシウム法によって形質転換した。さらに、ベクターに存在する薬剤耐性マーカーであるアンピシリンによってスクリーニングを行い、目的の遺伝子導入クローンを選択した。そのクローンをタンパク質発現大腸菌株であるBL21(DE3)に再度、リン酸カルシウム法によって形質転換し、アンピシリンによるスクリーニング後TBCC(wt)-flexible linkerの発現コンストラクトを構築した。本発現株は一般的なLB-amp培地100mlで37℃一昼夜、前培養し、つづいて250mlのLB-Amp培地4本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nmを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、培養上清を遠心分離し、0.45 μmのフィルターで濾過後にHis-tagカラムを用いてアフィニティークロマトグラフティー精製し、精製タンパク質の一部を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEを行うことで、TBCC(wt)-flexible linker部分の発現を確認した。
上記TBCC(wt)-flexible linkerに下記方法によりリガンド部分の構築を行った。リガンドとしてStaphylococcus aureus由来タンパク質protein A (SpA)由来のBドメインホモログである抗体結合ドメイン(Zドメイン)を用いた(配列番号7)。このZドメインを先に構築したTBCC(wt)-flexible linkerのC末端側に遺伝子工学的に融合させ構築した。具体的には配列番号21のセンスプライマーおよび配列番号22のアンチセンスプライマーの合成オリゴ作製し、アニールさせた後にpCR2.1ベクターに導入し、Zドメインのクローニングを完了した。塩基配列を確認後、制限酵素Sal I, Xho Iで処理した後に、pET-21d-TBCC(wt)-flexible linkerのXho I部位にサブクローニングし、構築を完了させた(pET-21d-TBCC(wt)-Z)。
TBCC(wt)-Z(配列番号27)はワクチン抗原等を遺伝子工学的に結合できるが、化学融合の際に利用するシステイン残基を有していないため、システイン残基を導入したコンストラクトであるTBCC(S52C)-Z(配列番号28)およびTBCC(C60)-Z(配列番号29)を作製した。TBCC(S52C)-ZはTBCC(wt)-Zの52番目のセリン残基をシステイン残基に置換したコンストラクトである。TBCC(C60)-ZはTBCC(wt)-Z の60番目のアミノ酸にシステイン残基を挿入したコンストラクトである。Cysの導入方法はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社)を用いて行った。具体的にはTBCC(S52C)-ZはTBCC(wt)-Zを鋳型に配列番号30のセンスプライマーと配列番号31のアンチセンスプライマーを用い、TBCC(C60)-ZはTBCC(wt)-Zを鋳型に配列番号32のセンスプライマーと配列番号33のアンチセンスプライマーを用い、PCR法により目的産物の増幅を行った。得られた各々のPCR増幅産物に対してDpn Iを1μl添加し37℃で1 hrインキュベートした後、大腸菌XLI-Blue株に形質転換を行った。LB-amp培地によってスクリーニングし、得られた各々のクローンを構築し、塩基配列を確認した。その後各々を大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。
各種pET-21d-TBCC-Zを含有する大腸菌BL21(DE3)株のフリーズストックから10μlを100mlのLB-amp培地に植菌し、37℃で一晩培養した。つづいて250mlのLB-Amp培地4本にOD600 nm = 0.1になるように植菌し、37℃で1.5時間培養した。この時点で濁度OD 600 nmを測定し、OD = 0.4から0.6であることを確認し、最終濃度が1mMになるようにイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて、37℃で一昼夜培養し、タンパク質の発現誘導を行なった。発現誘導後、全ての培養液を統一し、遠心分離し(8,000 rpm、20 min、4℃、2 times)、菌体と培養上清に分離した。培養上清の一部を発現解析用に回収した。
培養上清に最終濃度20 mMとなるようにイミダゾールを添加後、0.45μmフィルターで濾過し、クロマトアプライ用サンプルとして調整した。HisTrapカラム(GEヘルスケア社) 5 mlに、カラムを平衡化するため、洗浄バッファー(20 mM イミダゾール、20 mMリン酸バッファー、pH 7.4)をカラム容量の5倍アプライした。平衡化したカラムに、調整したサンプルに対しペリスタポンプを利用してアプライし、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
サンプルアプライ終了後、次に洗浄および溶出を行った。カラムに対し5倍量の洗浄バッファーで洗浄し、次にカラムに対し5倍量の溶出バッファー(500 mM イミダゾール、20 mMリン酸バッファー、pH 7.4)で溶出した。培養上清、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認されたら、限外濾過膜(Amicon Ultra-15 30kDa)にて濃縮し、PBSに置換した。次いで、さらに精製度を上げるために、濃縮されたTBCC-Z溶液に最終濃度50 mM DTTを添加後30分間室温で振とうし、PBSにて10倍に希釈し(最終濃度5 mM DTT)、再度HisTrapカラム(5 ml)にアプライした。そして次に洗浄バッファーをカラムの5倍量アプライし、次にカラムに対し5倍量の溶出バッファーで溶出させた。カラム処理前サンプル、素通り画分、洗浄画分、溶出画分を15 %アクリルアミド濃度SDS-PAGEで解析した。泳動後、発現パターンを確認し、溶出画分に発現が確認されたら、限外濾過膜(Amicon Ultra-15 30kDa)にて濃縮し、PBSに置換した。BCA protein Assay Reagent(bicinchoninic acid)(PIERCE社)を用いてタンパク質の定量を行った結果TBCC-Zタンパク質の濃度はTBCC(wt)-Zが3.1 mg、TBCC(S52C)-Zが14.5 mgそしてTBCC(C60)-Zが10.2mgとなった。TBCC(S52C)-ZおよびTBCC(C60)-ZをまとめてTBCC(Cys)-Zと標記する。
大腸菌で作製したリコンビナントはエンドトキシンの混入が考えられるため、免疫実験を行うにあたってエンドトキシンの除去およびタンパク質溶液のエンドトキシン濃度を検定した。
TBCC-Zは分子量が約60 kDaであるのに対し、エンドトキシンは分子量が約10 kDaなので50 kDaの透析膜による限外濾過処理を行った。透析外液はPBSを用い、4℃で数時間毎に外液を交換することで最終的に一昼夜透析を行った。
この透析済みサンプルをエンドトキシン除去カラム(PIERCE社:Detoxi-Gel Endotoxin Removal Gel)にアプライし、素通りした画分を回収した後、BCA定量を行いリムルス試験(LAL)によりエンドトキシン濃度を検定した。すなわち、LALのPyrogen Single Test 25回用を用いて最終容量を0.25 mlに希釈したサンプルを用いて検査した。サンプルの希釈にはエンドトキシンフリー水を用いた。必要濃度に調整したサンプル溶液を注射器でバイアルに注入し、軽く混合し、転倒しないように箱等に入れて37℃で一時間反応させた。
1時間後、振動を与えないようにインキュベーターから取り出し、一度転倒させた。サンプル溶液が凝固したならば、エンドトキシン陽性、凝固していないもしくは、一部だけ溶けて落ちる場合はエンドトキシン陰性と判断した。陰性になる希釈ポイントの一段階前がエンドポイントと定義されるので、そこからエンドトキシンのUnit数を計算し、500 pgエンドトキシン/μg of proteinのレベル以上であった場合には、再度エンドトキシン除去カラムにアプライし、同様の操作を500 pgエンドトキシン/μg of protein以下となるレベルまで繰り返し行った。
ワクチン−運搬体融合体の作製(2):
三日熱マラリア原虫の伝播阻止抗原であるPvs25をTBCC(Cys)-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学結合によりTBCC(Cys)-Zに融合した。ワクチン抗原Pvs25は酵母Pichia pastorisで発現した均一な立体構造を持つPvs25H Aフォーム(Pvs25H-A)を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下の反応方法で融合体TBCC-Z/Pvs25H-Aを完了させた。
融合に関しては、TBCC-Z tetramer(2 mg: 1.55 ml: 34 nmol)、Pvs25H-A(2.8 mg:1.46 ml:137.2 nmol)で行った。
まず、TBCC(Cys)-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行った。TBCC(Cys)-Zは大腸菌で発現させた状態でも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSH基の数を増加させるために、還元処理を行った。TBCC(Cys)-Z (4 mg)溶液に最終濃度50 mMのDTTを添加した後、室温で30分間振とうした。その後、限外濾過膜による処理(Amicon Ultra-4 10k;5000×g 20 min×4 times with PBS)でDTTを除去し、BCA定量法によりタンパク質濃度を決定した。
使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 84 μlを5.6 mg/2.8 mlのPvs25H-Aを加え、60分間室温でインキュベートした(Pyridyldithiol-activated Pvs25H-Aの作製)。限外濾過膜(Amicon Ultra-4 10k;5000 x g 20 min×4 times with PBS)を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated Pvs25H-A (2.8 mg/1.46 ml)に 還元処理済みの2 mg TBCC(Cys)-Z(1550 μl)を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k(5000 x g 20 min×4 times)を使用し、化学反応の副産物(Pyridine 2-thione)を 除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質TBCC(Cys)-Z/Pvs25H-Aを得た。
TBCC-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、Pvs25H-A特異的ELISAによってPvs25H-AがTBCC(Cys)-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96 well ELISA Plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG(h IgG)をバイカーボネートバッファーを用いて5 μg/mlの濃度で各wellに50 μlずつアプライし、4℃で一晩反応させ、コートした。hIgGをコートしたELISAプレートに1 % BSA in PBS溶液を150 μl/wellで加え、37℃で2時間反応させ、ブロッキング反応を行った。ブロッキング後に各サンプルTBCC(Cys)-Zあたり2 μg/wellの濃度でTBCC(Cys)-Z或いはTBCC(Cys)-Z/Pvs25H-A融合分子を加え、37℃で2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体(hIgG)と結合していない可能性のある「フリー」状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG(5 μg/ml)を各wellに50 μlずつアプライし37℃で2時間反応させた。その後、一次抗体として抗Pvs25マウスIgG抗血清(200倍希釈)を50 μl/wellでアプライし、37℃で2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体(3,000倍希釈)を50μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、Pvs25H-A抗原特異的シグナルを検出した結果、TBCC(Cys)-ZとTBCC(Cys)-Z/Pvs25H-Aのシグナルの違いからTBCC(Cys)-ZにPvs25H-Aが結合していることが直接的に証明された。
免疫原性確認試験:
Balb/cマウス、♀、7週齢(日本SLC)に、Pvs25H-A(S)30μgを皮下(s.c.)、経鼻(i.n.)で3回(0、2、4週目)投与した(n = 7)。同様にして、Pvs25H-A 30μgとTBCC(S52C)-Z 21.4μgもしくはTBCC(C60)-Z 21.4μgを混合した試料(M)または実施例6で得られたTBCC(S52C)-Z/Pvs25H-A(L)もしくはTBCC(C60)-Z/Pvs25H-A(L)51.4μgを投与した。さらに、コレラ毒素(CT;LBL)1μgと試料S、M、Lを混合し、経鼻投与した(i.n./CT)。また、不完全フロイントアジュバント(IFA)もしくはAlumアジュバントを抗原投与容量と同量(ここでは100μl)と試料Sを30μgを混合したものを皮下投与した(s.c./IFA、s.c./Alum)。
さらにIFAの非存在下で、S、M、LをPvs25H-Aあたり30μgになるように調製したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のPvs25H-Aに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に最終採血を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にPvs25H-A(5μg/ml)を用い、50倍希釈の血清、4000倍希釈のAnti-mouse IgG-APを用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図4に示す。
伝搬阻止解析:
実施例8で得られた血清を各群(s.c./IFA S、s.c.S、s.c.M、s.c.L、s.c./Alum S、s.c./Alum M、s.c./Alum L、i.n.S、i.n./CT S、i.n./CT L)で混合し、混合血清をサンプルとした。アッセイは、4名の患者血液(三日熱マラリア原虫生殖母体)を用いた。患者血液180μlに、混合血清90μlと正常ヒト血清90μlを混合した180μlを添加し、メンブレンフィーダーに入れて蚊(Anopheles dirus)に吸血させた。蚊の中腸におけるオーシスト形成数を顕微鏡観察によって測定した。結果を図5に示す。
ワクチン−運搬体融合体の作製(3):
MSP1-19を搭載した融合体を作製し、その抗体応答機能を調べた。MSP1-19はPvs25と同じマラリア抗原ではあるが、メロゾイト期の抗原であり、伝搬阻止抗原であるPvs25は、蚊の中でマラリア原虫が発現するものであるのに対して、MSP1-19は、ほ乳類の中でマラリア原虫が発現する抗原である。
具体的にはMSP1-19をTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zの内部に存在するSH基を利用し、化学結合によりに融合した。ワクチン抗原MSP1-19は酵母Pichia pastorisで発現した均一な構造を持つMSP1-19 Sフォーム(MSP1-19H-S)を用いた。融合に必要なクロスリンカーとしてSPDPを用い、以下の反応方法で融合体TBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sを完了させた。
融合に関しては、TBCC-Z tetramer(750 μg: 625 μl: 12.5 nmol)、COMP-Z pentamer(750 μg: 625 μl: 10.4 nmol)、MSP1-19H-S (3 mg: 1.5ml: 210nmol)で行った。
まず、TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZのSH基を還元型にするために還元処理を行った。TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Zは大腸菌で発現させた状態でも還元型SH基を有しているが、最大限利用できるSH基の数を増加させるために、還元処理を行った。TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z (4 mg)溶液に最終濃度50 mMのDTTを添加した後、室温で30分間振とうした。その後、限外濾過膜による処理(Amicon Ultra-4 10k;5000×g 20 min×4 times with PBS)でDTTを除去し、BCA定量法によりタンパク質濃度を決定した。
使用直前にSPDP 2 mgを320 μlのDMSOに溶解し、20 mM SPDP溶液を調製した。20 mM SPDP溶液 84 μlを3 mg/1.5 mlのMSP1-19H-Sを加え、60分間室温でインキュベートした(Pyridyldithiol-activated MSP1-19H-Sの作製)。限外濾過膜(Amicon Ultra-4 10k;5000 x g 20 min×4 times with PBS)を用いて精製し、化学反応の副産物と過剰なSPDPを除去した。精製したPyridyldithiol-activated MSP1-19H-S (3mg/1.5 ml)に 還元処理済みの0.5 mg TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z(500 μl)を加え、一晩室温でインキュベートした。Amicon Ultra-4 10k(5000 x g 20 min×4 times)を使用し、化学反応の副産物(Pyridine 2-thione)を除去し、PBSにバッファー交換して融合タンパク質TBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sを得た。
TBCC-ZがイムノグロブリンのFc領域に結合する性質を利用し、MSP1-19H-S特異的ELISAによってMSP1-19H-SがTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z分子に物理的に結合していることを確認した。まず、SUMILON 96 well ELISA Plate S typeにキャプチャー抗体としてHuman IgG(h IgG)をバイカーボネートバッファーを用いて5 μg/mlの濃度で各wellに50 μlずつアプライし、4℃で一晩反応させ、コートした。hIgGをコートしたELISAプレートに1 % BSA in PBS溶液を150 μl/wellで加え、37℃で2時間反応させ、ブロッキング反応を行った。ブロッキング後に各サンプルTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-Z分子あたり2 μg/wellの濃度でTBCC-Z/MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-S融合分子を加え、37℃で2時間反応させた。この反応でFc/Z間の結合により両コンストラクトが捕らえられる。さらに、キャプチャー抗体(hIgG)と結合していない可能性のある「フリー」状態のZドメインをマスキングする目的で過剰量のhIgG(5 μg/ml)を各wellに50 μlずつアプライし37℃で2時間反応させた。その後、一次抗体として抗MSP1-19マウスIgG抗血清(200倍希釈)を50 μl/wellでアプライし、37℃で2時間反応させた。つづいて二次抗体としてAP conjugate抗マウス抗体(3,000倍希釈)を50 μl/wellでアプライし、37℃2時間反応させた。最後にAP基質(Bio-Rad社)を用いて37℃で反応させ、適切な反応時間(5min、10min、20min)でOD415nmを測定することで、MSP1-19H-S抗原特異的シグナルを検出した結果、TBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZとTBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-Sのシグナルの違いからTBCC(Cys)-ZおよびCOMP-ZにMSP1-19H-Sが結合していることが直接的に証明された。
免疫原性確認試験:
C57B/6マウス、♀、7週齢(日本SLC)に、MSP1-19H-S(S)30 μgを皮下(s.c.)、で3回(0、2、4週目)投与した。同様にして、MSP1-19H-S 30 μgとTBCC(Cys)-Z またはCOMP-Z 10.6 μgを混合した試料(M)または実施例10で得られたTBCC(Cys)-Z /MSP1-19H-SおよびCOMP-Z/MSP1-19H-S(L)40.6 μgを投与した。さらに、フロイントアジュバント(IFA)を抗原投与容量と同量(ここでは100μl)と試料Sを30 μgを混合したものを皮下投与した。1、3、5週目に部分採血を行い、5週目のMSP1-19H-Sに対する抗体価の上昇を確認し、6週目に抗体価の解析を行った。抗体価の解析はELISA法により行った。6週目の血清を50倍希釈で用い、コート抗原にMSP1-19H-S (5 μg/ml)を用い、50倍希釈の血清3,000倍希釈のAP conjugate抗マウス抗体を用いてAP基質によるOD415nmを測定することによって行なった。ネガティブコントロールとして非免疫群の血清を用いた。結果を図6に示す。
Claims (19)
- COMP(cartilage oligomeric matrix protein)及びテトラブラキオンコイルドコア(TBCC)よりなる群から選ばれるコイルドコイル構造を有する多量体タンパク質と、スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group G ストレプトコッカス(Streptococcus)G148のGタンパク質(SpG)由来のB1ドメイン、ファインゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)由来のLタンパク質および補体系分子C3dよりなる群から選ばれる免疫細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含み、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質が2〜5量体にオリゴマー化した薬物運搬体中の、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質にワクチン分子が結合したワクチン。
- 融合タンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とがリンカーを介して結合したものである請求項1記載のワクチン。
- コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、COMP(cartilage oligomeric matrix protein)である請求項1記載のワクチン。
- COMP(cartilage oligomeric matrix protein)が、配列番号5で表わされるアミノ酸配列または配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項3記載のワクチン。
- コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、テトラブラキオンコイルドコア(TBCC)である請求項1記載のワクチン。
- テトラブラキオンコイルドコア(TBCC)が、配列番号34で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項5記載のワクチン。
- 免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメインである請求項1ないし6のいずれかの項記載のワクチン。
- スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメインが、配列番号7で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項7記載のワクチン。
- 配列番号23で表されるアミノ酸配列または配列番号27で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載のワクチン。
- ワクチン分子が、節足動物媒介性疾患、寄生虫起因、細菌性またはウイルス性の感染症ワクチン候補抗原である請求項1ないし9のいずれかの項記載のワクチン。
- ワクチン分子が、日本脳炎ウイルス外殻タンパク質またはマラリア原虫表層タンパク質である請求項10記載のワクチン。
- COMP(cartilage oligomeric matrix protein)及びテトラブラキオンコイルドコア(TBCC)よりなる群から選ばれるコイルドコイル構造を有する多量体タンパク質と、スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメイン、Group G ストレプトコッカス(Streptococcus)G148のGタンパク質(SpG)由来のB1ドメイン、ファインゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)由来のLタンパク質および補体系分子C3dよりなる群から選ばれた免疫細胞のレセプターに対するリガンド分子とを含み、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とが結合した融合タンパク質が2〜5量体にオリゴマー化した薬物運搬体中の、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質にアジュバント分子が結合してなるアジュバント。
- 融合タンパク質が、コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質を構成する単量体タンパク質と免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質とがリンカーを介して結合したものである請求項12記載のアジュバント。
- コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、配列番号5で表わされるアミノ酸配列または配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むCOMP(cartilage oligomeric matrix protein)である請求項12記載のアジュバント。
- コイルドコイル構造を有する多量体タンパク質が、配列番号34で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むテトラブラキオンコイルドコア(TBCC)である請求項12記載のアジュバント。
- 免疫担当細胞のレセプターに対するリガンドタンパク質が、スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメインである請求項12記載のアジュバント。
- スタフィロコッカス(Staphylococcus)プロテインA由来の抗体結合ドメインが、配列番号7で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものである請求項16記載のアジュバント。
- 配列番号23で表されるアミノ酸配列または配列番号27で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項12記載のアジュバント。
- アジュバント分子が、コレラトキシン(CT)、コレラトキシンBサブユニット(CTB)、コレラトキシンAサブユニット(CTA)、百日咳菌毒素(PT)、百日咳菌毒素S1サブユニット(PTS1)、Toll様受容体9(TLR9)リガンド、Toll様受容体4(TLR4)リガンドおよび膜透過性機能を有するカチオン性ペプチドよりなる群から選ばれたものである請求項12ないし18のいずれかの項記載のアジュバント。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010550528A JP5557254B2 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-10 | 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009028134 | 2009-02-10 | ||
JP2009028134 | 2009-02-10 | ||
JP2010550528A JP5557254B2 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-10 | 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン |
PCT/JP2010/051915 WO2010092963A1 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-10 | 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2010092963A1 JPWO2010092963A1 (ja) | 2012-08-16 |
JP5557254B2 true JP5557254B2 (ja) | 2014-07-23 |
Family
ID=42561805
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010550528A Expired - Fee Related JP5557254B2 (ja) | 2009-02-10 | 2010-02-10 | 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8580274B2 (ja) |
EP (1) | EP2397547A4 (ja) |
JP (1) | JP5557254B2 (ja) |
WO (1) | WO2010092963A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013166585A1 (en) * | 2012-05-07 | 2013-11-14 | University Of Manitoba | Detection and recovery of chemical elements from fluids with tectrabrachion |
KR102053674B1 (ko) * | 2012-05-25 | 2019-12-09 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 비-천연 컨센서스 알부민 결합 도메인 |
CA2878771A1 (en) * | 2012-07-13 | 2014-01-16 | S-Target Therapeutics Gmbh | Immunoregulatory vaccine |
CN104755619B (zh) * | 2012-10-22 | 2020-04-14 | Km生物医药股份公司 | 用于预防猪水肿病的疫苗 |
WO2014187743A1 (en) * | 2013-05-21 | 2014-11-27 | Tyg Oncology Ltd. | Gastrin peptide immunogenic composition |
CN103990121B (zh) | 2013-12-06 | 2015-07-08 | 上海联合赛尔生物工程有限公司 | 抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒 |
BR112016024419B1 (pt) * | 2014-04-21 | 2023-09-26 | Meiji Animal Health Co., Ltd | Proteína fundida, seu multímero, vacina contra a síndrome da queda de postura (eds), seu uso e kits |
WO2017214261A1 (en) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Georgia Tech Research Corporation | Nanocarriers for intracellular delivery |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050137156A1 (en) * | 2003-08-09 | 2005-06-23 | Johnston Stephen A. | Methods and compositions for generating an immune response |
WO2008068017A1 (en) * | 2006-12-09 | 2008-06-12 | Universität Zürich Prorektorat Forschung | Coiled-coil lipopeptide helical bundles and synthetic virus-like particles |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8601940D0 (sv) | 1986-04-25 | 1986-04-25 | Kabigen Ab | Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefor |
US6289286B1 (en) * | 1998-05-29 | 2001-09-11 | Biacore Ab | Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith |
US6844171B1 (en) | 1998-07-02 | 2005-01-18 | President And Fellows Of Harvard College | Oligomerization of hepatitis delta antigen |
WO2005014654A2 (en) | 2003-08-12 | 2005-02-17 | Avidis Sa | Product comprising a c4bp core protein and a monomeric antigen, and its use |
US20070104726A1 (en) * | 2002-08-14 | 2007-05-10 | Avidis Sa | Multimeric complexes of antigens and adjuvants |
US8575110B2 (en) | 2003-02-17 | 2013-11-05 | Alpha-O Peptides G | Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems |
GB2409456B (en) * | 2003-10-30 | 2006-01-04 | Proimmune Ltd | Oligomeric receptor ligand pair member complexes |
WO2005077976A2 (en) | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Avidis Sa | Coiled-coil domains from c4b-binding protein |
DK2457578T3 (en) | 2004-09-28 | 2015-12-07 | Aprogen Inc | A chimeric molecule comprising angiopoietin-1 and a coiled-coil domain for use in the treatment of erectile dysfunction of the penis |
WO2006078567A2 (en) | 2005-01-21 | 2006-07-27 | Montana State University | Vaccines and mucosal targeting ligands to facilitate vaccine delivery |
CN101222940B (zh) | 2005-04-18 | 2011-06-08 | 阿查亚制药公司 | Rhcc在药物递送、过滤、化学催化及纳米颗粒生产中的用途 |
US20070160628A1 (en) | 2005-08-31 | 2007-07-12 | Birkett Ashley J | Stabilized virus-like particles and epitope display systems |
MX2008007292A (es) | 2005-12-08 | 2008-10-17 | Univ Louisville Res Found | Composiciones inmunoestimuladoras y metodos. |
JP6088123B2 (ja) * | 2008-02-01 | 2017-03-01 | アルファ−オー・ペプチドズ・アーゲーAlpha−O Peptides Ag | ワクチンとして有用な自己会合ペプチドナノ粒子 |
-
2010
- 2010-02-10 JP JP2010550528A patent/JP5557254B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-02-10 EP EP10741240A patent/EP2397547A4/en not_active Withdrawn
- 2010-02-10 WO PCT/JP2010/051915 patent/WO2010092963A1/ja active Application Filing
- 2010-02-10 US US13/148,832 patent/US8580274B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050137156A1 (en) * | 2003-08-09 | 2005-06-23 | Johnston Stephen A. | Methods and compositions for generating an immune response |
WO2008068017A1 (en) * | 2006-12-09 | 2008-06-12 | Universität Zürich Prorektorat Forschung | Coiled-coil lipopeptide helical bundles and synthetic virus-like particles |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014007128; Russ.J.Bioorg.Chem.,2004,Vol.30,No.1,p.35-41 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2397547A4 (en) | 2012-09-05 |
JPWO2010092963A1 (ja) | 2012-08-16 |
WO2010092963A1 (ja) | 2010-08-19 |
US8580274B2 (en) | 2013-11-12 |
EP2397547A1 (en) | 2011-12-21 |
US20120100165A1 (en) | 2012-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5557254B2 (ja) | 薬物運搬体並びにこれを利用したアジュバントおよびワクチン | |
Brune et al. | New routes and opportunities for modular construction of particulate vaccines: stick, click, and glue | |
Bruun et al. | Engineering a rugged nanoscaffold to enhance plug-and-display vaccination | |
Brune et al. | Plug-and-Display: decoration of Virus-Like Particles via isopeptide bonds for modular immunization | |
CN105960412B (zh) | 作为疫苗平台的含鞭毛蛋白的蛋白纳米颗粒 | |
KR20210013571A (ko) | 백신 조성물 | |
CN107617110A (zh) | 诱导t细胞辅助的组合物 | |
CA2354183A1 (en) | Ordered molecular presentation of antigens, method of preparation and use | |
KR20240042570A (ko) | 안정화된 그룹 2 인플루엔자 헤마글루티닌 줄기 영역 삼량체 및 그의 용도 | |
JP7385680B2 (ja) | 変異型rsv fタンパク質及びその利用 | |
KR20230107621A (ko) | 메타뉴모바이러스에 대한 단백질-기반 나노입자 백신 | |
IL300905A (en) | Immunogenic fusion proteins from the corona virus, preparations containing them and their uses | |
JP2018505135A (ja) | ヤツメウナギ由来の配列への融合による組換えタンパク質の多量体化 | |
US20220119457A1 (en) | Antigenic Multimeric Respiratory Syncytial Virus Polypeptides | |
CN107207614B (zh) | 嵌合蛋白 | |
KR20210110318A (ko) | 융합에 의해 변형된 cmv의 바이러스-유사 입자 | |
Ramirez et al. | Engineering Protein Nanoparticles Functionalized with an Immunodominant Coxiella burnetii Antigen to Generate a Q Fever Vaccine | |
JP2021533772A (ja) | フィロウイルス糖タンパク質の安定化された三量体 | |
CN106337038B (zh) | 一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用 | |
WO2023064631A1 (en) | Engineering antigen binding to, and orientation on, adjuvants for enhanced humoral responses and immunofocusing | |
JP2023002492A (ja) | 変異型rsv fタンパク質を含む医薬組成物 | |
CN116813793A (zh) | 融合蛋白以及其应用 | |
Howarth | snoopLigase peptide-peptide conjugation enables modular vaccine assembly |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121226 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121226 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140225 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140402 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140513 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140528 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5557254 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |