KR20210110318A - 융합에 의해 변형된 cmv의 바이러스-유사 입자 - Google Patents

융합에 의해 변형된 cmv의 바이러스-유사 입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드; 및 (ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입이 상기 CMV 폴리펩티드의 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드; 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프로서, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하는, T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)에 관한 것이다.

Description

융합에 의해 변형된 CMV의 바이러스-유사 입자
본 발명은 식물 바이러스 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP), 구체적으로 CMV 폴리펩티드 내의 특이적 위치에 삽입된 항원성 폴리펩티드를 포함하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하는 Th 세포 에피토프를 추가로 포함하는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하는 CMV의 변형된 VLP에 관한 것이다. 또한, 이들 변형된 VLP는 바람직하게, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 융합된 상기 항원성 폴리펩티드에 대한 면역 반응, 구체적으로 항체 반응을 생성하기 위한 백신 플랫폼으로서 작용한다. 또한, 본 발명은 내부에 융합된 항원성 폴리펩티드 및 추가로 상기 항원성 폴리펩티드를 포함하지 않는 CMV 단백질을 포함하는 상기 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하는 모자이크 바이러스-유사 입자인 변형된 바이러스-유사 입자에 관한 것이다.
최근 들어 식물 바이러스 및 이로부터 유래한 바이러스-유사 입자 (VLP)는 독특한 번역후 변형, 효과적인 비용 절감, 유익한 안정성 프로파일, 생산 속도 및 성장가능성 (scalability)을 제공하는 이들의 능력의 측면에서, 주로 VLP 백신을 생산하기 위한 경제적이고 신속한 대안의 플랫폼으로서 식물의 역할로 인해 주목을 받아왔다 (Chen Q and Lai H, Human Vaccines & Immunotherapeutics (2013) 9: 26-49; Zeltins A, Mol Biotechnol (2013) 53: 92-107). 또한, 구체적으로 식물 바이러스의 VLP는 감염성 포유동물 바이러스로 관찰된 것과 유사한 강한 면역 반응을 유도하고자 이들의 표면 상에 상이한 항원을 제시하는 운반체 구조로서 고려되었다 (Balke I, et al., Adv. Drug Deliv. Rev. (2018) https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.08.007).
오이 모자이크 바이러스 (CMV, 브로모비리대 (Bromoviridae) 과, 쿠쿠모바이러스 (Cucumovirus) 속)는 매우 넓은 숙주 범위를 갖는 선형 양성-센스 등경 (isodiametric)의 식물 바이러스이다. 바이러스 게놈은 3개의 단일가닥 RNA (RNA1, RNA2 및 RNA3)로 구성되고, 외피 단백질 (CP) 유전자가 게놈 RNA3 (약 2200개 nt) 및 서브게놈 RNA4 (약 1000개 nt) 둘 다에 존재한다. 캡시드는 약 25 kDa의 단일 단백질 종의 180개 사본을 포함한다. 숙주 식물과 연관된 다양한 증상과 관련되는 CMV로부터 나온 다수의 상이한 균주, 예컨대 CMV-B 균주, CMV-C 균주, CMV-D 균주, CMV-L 균주, CMV-S 균주, CMV-T 균주, CMV-WL 균주, CMV-V 균주, CMV-Fny 균주, CMV-Ix 균주, CMV-Q 균주 또는 CMV-R 균주 등이 공지되어 있다 (Carrere I, et al., Arch Virol (1999), 144: 1846-1857; Edwards MC, et al., Phytopathology (1983), 73: 1117-1120; www.dpvweb.net).
최근 들어, 화학적 링커 커플링 기술학을 사용하여 바이러스의 표면 상에 상이한 항원을 제시하는 CMV VLP을 기반으로 하는 백신 플랫폼이 기술되었다. 기술된 CMV VLP는 삽입된 T 세포 자극 에피토프를 갖는 CMV의 변형된 CP로부터 유래한다 (A. Zeltins, et al. Vaccines 2 (2017), 30; 국제특허출원 WO 2016/062720).
또한, CMV의 키메라 형태가 항원 제시 (presentation) 시스템으로서 작용하고, C형 간염 바이러스 (HCV)로부터 유래한 이들의 외부 표면 에피토프 상에 발현되도록 조작되었다. 자세하게는, CMV 유사-재조합 형태 CMV-D/S가 CMV-S 균주로부터의 게놈 RNA3 및 CMV-D 균주로부터의 RNA1 및 RNA2를 보유하도록 조작되었다. 이러한 시스템은 접종 이후에 잔티 (Xanthi) 담배 식물에서 미약한 모자이크 및 관 투명화 같은 바이러스 증상을 발생시켰다. 다음으로는 CP 유전자가 상이한 위치에서 C형 간염 바이러스 (HCV) 에피토프를 인코딩하도록 조작하였다. 선택된 펩티드는 소위 R9 미모토프 (mimotope)로서, HCV 외투 단백질 E2의 많은 과다가변 영역 1 (HVR1) 서열로부터 유래하는 27개 아미노산의 합성 펩티드이었다. CMV 유전자 내에 R9 미모토프의 삽입 지점의 선택은 필수적 요인으로 (i) 캡시드에서 추가적인 보호 역할을 갖는 특별한 N-말단 헬릭스를 특징으로 하는 CMV 외피 단백질의 N-말단 영역 (CMV를 안정화하는 단백질-RNA 상호작용에 관여하는 내부 R 도메인으로서 알려진 (Wikoff W.R. et al., Virology (1997), 232: 91-97), 고농도 염기성 아미노산을 포함함)을 보호할 필요성 (Smith T.J., et al., J. Virol. (2000), 74: 7578-7686); (ii) 잠정적인 면역원성 성능의 기회를 증가시키는 외래 에피토프의 표면 위치; 및 (iii) 변형된 클론을 생산할 수 있는 돌연변이 생성기전 경로의 이용가능성을 고려해야 한다. 이들 고려사항을 기초로 하여, R9 미모토프의 삽입은 CMV-S RNA3 (AF063610, www.dpvweb.net)의 CP 유전자 내의 상이한 위치에서 효과를 발휘하였다. 상기 CP 유전자 내에 1개의 단일 R9 미모토프의 삽입을 위해, R9 미모토프 뉴클레오티드 서열은 상기 CP 유전자의 253번, 475번 및 529번 위치에 삽입된 반면, 2개의 R9 미모토프의 삽입을 위해 R9 미모토프 뉴클레오티드 서열은 392번 및 529번 위치에 삽입되었다. 이와 같이 제조된 키메라 CMV가 숙주 식물에서 전신적으로 전파되는 능력을 보유하였지만, 처음 2개의 삽입 부위의 경우에 더 낮은 바이러스 추출 수율을 얻었다. 따라서, 감염된 조직에서 더 높은 농도의 바이러스 입자를 보장하기 위하여, CP 유전자의 529번 위치에 삽입된 R9 미모토프를 포함하는 모자이크 CMV를 선별하였고, HCV 환자 혈청 반응성에 대해 시험하였다. 만성 C형 간염에 걸린 60명 환자로부터의 혈청 시료는 상기 키메라 CMV로 감염된 미정제 식물 추출물에 대해 유의한 면역반응성을 나타내었다 (Natilla A, et al., Arch. Virol. (2004), 149: 137-154; Piazzolla G, et al., J. Clin. Immunol. (2005), 25: 142-152; Nuzzaci M, et al., Arch. Virol. (2007), 152: 915-928; Nuzzaci M, et al., Journal of Virological Methods (2009), 155: 118-121; Nuzzaci M, et al., Journal of Virological Methods (2010), 165: 211-215; Piazzolla G, et al., J. Clin. Immunol. (2012), 32: 866-876).
또한, 오이 모자이크 바이러스 기반의 발현 시스템은 알츠하이머병에 대한 잠재적 백신으로서, 뿐만 아니라 돼지 시르코바이러스의 특이적 백신의 생산에 관하여 기술되어 왔다 (Vitti A, et al., J. Virol. Methods (2010), 169: 332-340; Gellert A, et al., PloS ONE (2012), 7(12): e52688). 자세하게, CMV 외피 단백질 (CP) 유전자의 248번, 392번 또는 529번 위치에서 상이한 11개 내지 15개 아미노산 길이의 Aβ 유래한 단편을 보유하는 키메라 구조물이 제작되었으며, 바이러스 산물이 이들의 천연 숙주에서 복제할 수 있는 것으로 증명되었다. 한편, 최대 20개 아미노산 길이의 돼지 시르코바이러스 제 2형 (PCV2) 캡시드 단백질 에피토프가 오이 모자이크 바이러스 (CMV)-R 균주의 식물 바이러스 외피 단백질 내에 아미노산 131번 위치 이후에 도입되었다. 이러한 삽입 지점 131번 및 132번은 CMV CP의 βE-αEF 루프의 중간에 위치하며, 이 위치는 삽입된 에피토프가 항체의 더 효율적인 생산을 허용하는 CMV CP 삼량체의 중간에 삼분지된 군을 형성하는 장점을 갖는 것으로 결론을 내렸다.
또한, 널리 사용되는 전통적인 대장균 발현 시스템에 의한 CMV의 바이러스 캡시드 단백질 (CP)의 발현이 단지 불용성 인클루전 바디 또는 매우 소량의 가용성 단백질을 생성하지만, CMV의 키메라 바이러스-유사 입자 (VLP)의 생성도 기술되어 왔다 (Xu Y, et al., Chem. Commun. (2008), 49-51). 한편, 토마토 바이러스 X (PVX) 기반의 벡터로부터 발현된 키메라 CMV 외피 단백질은 VLP 내에 조립될 수 있었다 (Natilla, A, et al., Arch. Virol. (2006), 151: 1373-1386; Natilla, A, et al., Protein Expression and Purification (2008), 59: 117-121; Chen Q and Lai H, Human Vaccines & Immunotherapeutics (2013), 9: 26-49). 키메라 CMV 외피 단백질은 CMV CP의 아미노산 194번 내지 199번에 해당하는 내부 βH-βI (모티브 5) 내에 유전적으로 융합된 뉴케슬병 바이러스 (NDV)의 17개 내지 25개 아미노산 길이의 에피토프를 포함한다 (He X, et al. (1998) J. Gen. Virol. 79: 3145-3153).
VLP 기반의 백신의 개발 과정에서 진보가 있었지만, 여전히 더 탁월한 VLP 시스템이 필요하다. 구체적으로, 백신은 면역화된 대상체 및 개인에서 다양한 항체 반응을 유도하고, 종종 100배 이상의 다양성 범위를 보인다. 또한, B형 간형에 대한 백신과 같은 일정 백신은 많은 특정 무반응자 때문에 곤란을 겪는다. 무반응성은 특정 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 관련되고, 양호한 T 헬퍼 (Th) 세포 반응을 유도하지 못하는 단점은 이들 개인에서 관찰되는 빈약한 항체 반응을 부여하는 것으로 여겨진다 (Goncalves L, et al., Virology (2004), 326: 20-28). 또한, 노인은 일반적으로 빈약한 항체 반응을 생성하고, 빈약한 Th 세포 반응은 다시 효율적이지 않은 항체 반응의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 필수적으로 모든 대상체 및 개인에서 양호한 Th 세포 반응을 유도하는 백신은 백신 개발 분야에서 중요한 목표가 된다. 더우기, 백신 제작 공정 동안 아직 해결되어야 할 매우 중요한 추가 관련 문제는 항체의 공간 입체형태이다. 백신 제작을 위해, 전반적인 바이러스 구조에 영향을 주지 않고도 입자 표면 상에 최적의 펩티드 제시를 달성하는 것이 중요하다. 이 점은 예외적인 경우에만 VLP가 50개 또는 70개 이상의 아미노산 길이 또는 훨씬 더 긴 단백질 도메인을 수용하고, 전형적인 VLP 형태를 유지할 수 있기 때문에 명백해진다 (I. Balke et al., Adv. Drug Deliv. Rev. (2018), https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.08.007; I. Kalnciema, et al. Mol. Biotechnol. 52 (2012), 129-139).
본 발명자들은 이제 놀랍게도 다양하고 매우 상이한 길이 및 특성의 항원성 폴리펩티드가 T 헬퍼 세포 에피토프의 혼입에 의해 이미 변형된 CMV 폴리펩티드의 특이적 위치에 삽입될 수 있고, 상기 생성된 융합 단백질이 추가적으로 높은 면역원성을 갖는 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 여전히 형성하여 조립할 수 있는 점을 발견하였다. 바람직하게 및 추가로 놀랍게도, 모자이크 변형된 바이러스-유사 입자는 내부에 융합된 항원성 폴리펩티드를 갖는 상기 기술된 융합 단백질을 포함하고, 이러한 내부에 융합된 항원성 폴리펩티드가 없는 CMV 단백질을 추가로 포함하도록 생성되었다. 이러한 모자이크 변형된 CMV VLP는 매우 긴 길이의 항원성 폴리펩티드의 혼입, 예컨대 최대 200개 이상의 아미노산 길이의 항원성 폴리펩티드의 혼입에 매우 유리하고, 심지어 이를 허용하는 것으로 관찰되었다.
제 1 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는
(i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드;
(ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입이 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드; 및
(iii) T 헬퍼 세포 에피토프로서, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역이 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하는, T 헬퍼 세포 에피토프
를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 CMV의 변형된 VLP로서, 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는
(i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 상기 외피 단백질 바람직하게 상기 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드;
(ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입이 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드; 및
(iii) 제 1 아미노산 링커, 바람직하게 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커로서, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, 바람직하게 상기 제 1 아미노산 링커는
(a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n;
(b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및
(c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커
로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노산 링커
를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV의 변형된 VLP를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질 및 적어도 하나의 CMV 단백질을 포함하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서,
(a) 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는
(i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드;
(ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입이 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고,
(b) 적어도 하나의 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
본 발명의 추가의 양태 및 구현예는 본 발명의 상세한 설명이 계속되면서 명확해질 것이다.
도 1은 단일-절단 제한효소 부위와 함께 pET-CMV-Ntt830-Ab36의 플라스미드 맵을 나타낸다. 다른 맵 (pET-CMV-Ntt830-Ab15; pET-CMV-Ntt830-Ab16; pET-CMV-Ntt830-Ab17) 모두는 필수적으로 동일한 서열 및 유전자 구성을 갖고, 이들은 아밀로이드 (베타) 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서만 상이하다.
도 2a는 CMV-Ntt830-Ab36의 발현으로부터 유래한 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전의 세포 추출물에서 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566 세포의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - 튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 상응하는 CMV-Ntt830-Ab36 키메라 CMV 폴리펩티드의 상대 위치를 표시한다.
도 2b는 CMV-Ntt830-Ab15의 발현으로부터 유래한 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전의 세포 추출물에서 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566 세포의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - 튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 상응하는 CMV-Ntt830-Ab15 키메라 CMV 폴리펩티드의 상대 위치를 표시한다.
도 2c는 CMV-Ntt830-Ab16의 발현으로부터 유래한 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전의 세포 추출물에서 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566 세포의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - 튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 상응하는 CMV-Ntt830-Ab16 키메라 CMV 폴리펩티드의 상대 위치를 표시한다.
도 2d는 CMV-Ntt830-Ab17의 발현으로부터 유래한 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전의 세포 추출물에서 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566 세포의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - 튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 상응하는 CMV-Ntt830-Ab17 키메라 CMV 폴리펩티드의 상대 위치를 표시한다.
도 3a는 CMV-Ntt830-Ab36의 발현으로부터 유래한 정제된 VLP의 전자현미경 분석을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 3b는 CMV-Ntt830-Ab15의 발현으로부터 유래한 정제된 VLP의 전자현미경 분석을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 3c는 CMV-Ntt830-Ab16의 발현으로부터 유래한 정제된 VLP의 전자현미경 분석을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 3d는 CMV-Ntt830-Ab17의 발현으로부터 유래한 정제된 VLP의 전자현미경 분석을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 4는 아두카누맙의 가변 영역 서열을 갖는 단일클론 항체의 CMV-Ntt830-Ab36 VLP, 아베타1-42 펩티드 및 CMV-Ntt830 VLP에 대한 결합을 나타낸다.
도 5a는 CMV-Ntt830-Ab16 VLP, CMV-Ntt830-Ab17 VLP 및 CMV-Ntt830-Ab36 VLP가 전장의 아베타1-42 펩티드를 인식하는 항체를 유도하는 것을 나타낸다.
도 5b는 CMV-Ntt830-Ab36 VLP가 알츠하이머병 환자의 뇌에서 플라크를 인식하는 항체를 유도하는 것을 나타낸다.
도 6은 단일-절단 제한효소 부위와 함께 pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 발현 벡터는 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830의 동시 발현을 보장한다.
도 7a는 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pETDu-CMVxArah202-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전의 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 젤에서 CMV-Ntt830-Arah202 키메라 CMV 폴리펩티드의 상대 위치를 표시한다.
도 7b는 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pETDu-CMVxArah202-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전에 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 웨스턴 블럿을 위해, Arah2 (1 : 1000; 인도어 바이오테크놀로지사, 카탈로그 번호 PA-AH2)에 대한 토끼 pAb를 사용하였다. 별표 (*)는 블럿에서 CMV-Ntt830-Arah202 융합 단백질의 상대 위치를 표시한다.
도 8a는 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); 1 - 정제된 CMV-Ntt830 VLP (대조군 시료); 2 - CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830을 포함하는 정제된 모자이크 VLP.
도 8b는 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 전자현미경 분석을 나타낸다. CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830을 포함하는 정제된 모자이크 VLP의 전자현미경 영상. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 9는 Ara-h202 또는 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830를 포함하는 모자이크 VLP (CMV-M-Arah202)로의 면역화 이후 14일째 재조합 Ara-h202에 대한 IgG의 ELISA를 나타낸다.
도 10a는 알레르기성 전신 및 국소 반응에 대한 CMV-M-Arah202로의 백신접종의 보호작용 효과를 연구하는 실험 설계를 나타낸다.
도 10b는 전신 및 국소 접종으로부터의 보호작용을 나타낸다. 땅콩 추출물로의 전신적 접종.
도 10c는 전신 및 국소 백신접종으로부터의 보호작용을 나타낸다. 땅콩 추출물로의 피부 단자 테스트.
도 11은 단일-절단 제한효소 부위와 함께 pET28-CMVBxFeld1-CMVtt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 발현 벡터는 CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830의 동시 발현을 보장한다.
도 12a는 CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); 0 - 유도 이전에 대장균 C2566/pET28-CMVxFeld1-CMVtt 세포의 총 단백질; T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pET28-CMVxFeld1-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 원심분리 이전에 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 젤에서 CMV-Ntt830-Feld12 키메라 CMV 폴리펩티드의 상대 위치를 표시한다.
도 12b는 CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); 1 - CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel을 포함하는 정제된 모자이크 VLP.
도 12c는 CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 전자현미경 분석을 나타낸다. CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel을 포함하는 정제된 모자이크 VLP의 전자현미경 영상.
도 13은 CMV-M-Fel가 Fel d1에 대해 강력한 항체 반응을 유도하는 것을 나타낸다. Fel d1, CMV-Ntt830-Feld12의 VLP 및 CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel을 포함하는 모자이크 VLP로 미감작 마우스의 면역화 이후 14일째, Fel d1에 대한 IgG는 450 nm에서 흡광도로서 관찰된다.
도 14a는 알레르기성 전신 및 국소 반응에 대한 CMV-M-Fel로의 백신접종의 보호작용 효과를 연구하는 실험 설계를 나타낸다.
도 14b는 CMV-M-Fel은 Fel d1으로의 전신 접종에 대한 보호작용을 유도한다. 접종을 3 마이크로그램의 Fel d1 추출물, 재조합 이량체 Fel d1으로 정맥내로 수행하였다.
도 15는 pET28-CMVB2x19nanp-CMVtt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 플라스미드는 CMV-Ntt830-19NANP 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-CSP를 포함하는 모이자이크 VLP의 발현을 위해 작용한다.
도 16은 CMV-Ntt830-19NANP 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-CSP를 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); S - 슈크로스 구배 이전의 세포 추출물에서 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 CMV-Ntt830-19nanp의 상대 위치를 표시한다.
도 17은 정제된 CMP-M-CSP 모자이크 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 18은 클론된 알파-사이뉴클레인 에피토프 cDNA를 갖는 CMVNtt830를 포함하는 pET-CMV-Ntt830-egy 플라스미드 클론을 나타낸다. 이러한 플라스미드의 자세한 묘사는 예시적으로 모두 필수적으로 동일한 서열 및 유전자 구성을 갖는 플라스미드 클론 pET-CMV-Ntt830-egy, pET-CMV-Ntt830-kne 및 pET-CMV-Ntt830-mdv의 묘사를 위한 것이고, 이들은 알파-사이뉴클레인 펩티드 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서만 상이하다.
도 19a는 CMV-Ntt830-egy의 발현으로부터 유래한 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566의 총 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획.
도 19b는 CMV-Ntt830-ㅡmdv의 발현으로부터 유래한 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566의 총 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획.
도 20a는 정제된 CMV-Ntt830 및 알파-사이뉴클레인 펩티드 융합 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사 카탈로그 번호 26620); 1 - 정제된 CMV-Ntt830B-mdv 융합 단백질 VLP; 2 - 정제된 CMV-Ntt830B-egy 융합 단백질 VLP; 3 - 정제된 CMV-Ntt830B-kne 융합 단백질 VLP; 4 - 정제된 CMV-Ntt830 변형되지 않은 VLP.
도 20b는 정제된 CMV-Ntt830B-egy 융합 단백질 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 20c는 정제된 CMV-Ntt830B-kne 융합 단백질 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 20d는 정제된 CMV-Ntt830B-kne 융합 단백질 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 흰색 수평 막대는 100 nm에 해당한다.
도 21a는 pETDu-CMVB3d-CMVB3d-flIL5-CMVtt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 플라스미드는 CMV-Ntt830-fel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel-IL-5를 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 위해 작용한다.
도 21b는 pETDu-CMVB3d-CMVB3-flIL5-CMVtt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 플라스미드는 CMV-Ntt830-fel-IL-5* 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-Fel-IL-5*를 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 위해 작용한다.
도 22a는 CMV-Ntt830-fel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-fel-IL-5을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 0 - IPTG 이전에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3d-flIL5-CMVtt 세포의 단백질; T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3d-flIL5-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전에 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 CMV-Ntt830-Fel-IL-5의 상대 위치를 표시한다.
도 22b는 CMV-Ntt830-fel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-fel-IL-5*을 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 0 - IPTG 이전에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3-flIL5-CMVtt 세포의 단백질; T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3-flIL5-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전에 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 SDS-PAGE 젤에서 CMV-Ntt830-Fel-IL-5*의 상대 위치를 표시한다.
도 23a는 정제된 CMV-M-fel-IL-5 모자이크 VLP의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 1 - 13,000 rpm 정화 이후에 정제된 가용성 CMV-M-fel-IL-5 모자이크 VLP; 2 - 13,000 rpm 정화 이후에 불용성 CMV-Ntt830-fel-IL-5/CMV-Ntt830.
도 23b는 정제된 CMV-M-fel-IL-5 모자이크 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 수평 막대는 200 nm에 해당한다.
도 23c는 정제된 CMV-M-fel-IL-5* 모자이크 VLP의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 1 - 13,000 rpm 정화 이후에 정제된 가용성 CMV-M-fel-IL-5* 모자이크 VLP.
도 23d는 정제된 CMV-M-fel-IL-5* 모자이크 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다.
도 24는 pETDu-CMVB3d-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 플라스미드는 CMV-Ntt830-fel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-2xFel-IL-5를 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 위해 작용한다.
도 25는 CMV-Ntt830-2xfel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-2xfel-IL-5를 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 0 - IPTG 이전에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt 세포의 단백질; T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 (20% 내지 60%) 이전에 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 젤에서 CMV-Ntt830-2xFel-IL-5 단백질의 상대 위치를 표시한다.
도 26a는 정제된 CMV-M-2xfel-IL-5 모자이크 VLP의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 1 - 13,000 rpm 정화 이후에 정제된 가용성 CMV-M-2xfel-IL-5 모자이크 VLP; 2 - 13,000 rpm 정화 이후에 불용성 CMV-Ntt830-2xfel-IL-5/CMV-Ntt830.
도 26b는 정제된 CMV-M-2xfel-IL-5 모자이크 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 수평 막대는 200 nm에 해당한다.
도 27은 pETDu-CMVB3d-CMVB3d-cIL1b-CMVtt의 플라스미드 맵을 나타낸다. 플라스미드는 CMV-Ntt830-cIL-1b 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-cIL-1b를 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 위해 작용한다.
도 28은 CMV-Ntt830-cIL-1b 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-cIL-1b를 포함하는 모자이크 VLP의 정제의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 0 - IPTG 이전에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMVtt 세포의 단백질; T - 20℃로 18시간 배양 이후에 대장균 C2566/pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMVtt 세포의 총 단백질; S - 슈크로스 구배 (20% 내지 30%) 이전에 세포 추출물의 가용성 단백질; P - 불용성 단백질; 1 내지 6 - (튜브 하단의 60%부터 상단의 0%까지) 슈크로스 구배 분획. 별표 (*)는 젤에서 CMV-Ntt830-cIL-1b 단백질의 상대 위치를 표시한다.
도 29a는 정제된 CMV-M-cIL-1b 모자이크 VLP의 SDS-PAGE 젤 분석을 나타낸다. M - 단백질 크기 마커 페이지룰러 (써모 사이언티픽사, 카탈로그 번호 26620); 1 - 13,000 rpm 정화 이후에 정제된 가용성 CMV-M-cIL-1b 모자이크 VLP; 2 - 13,000 rpm 정화 이후에 불용성 CMV-Ntt830-cIL-1b/CMV-Ntt830.
도 29b는 정제된 CMV-M-cIL-1b 모자이크 VLP의 전자현미경 영상을 나타낸다. 수평 막대는 200 nm에 해당한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 및 개시된 구현예, 바람직한 구현예 및 매우 바람직한 구현예는 다시 구체적으로 언급되거나 이의 반복이 간결성을 위해 회피되는지 여부와 상관없이 모든 양태 그리고 다른 구현예, 바람직한 구현예 및 매우 바람직한 구현예에 적용되어야 한다. 본원에 사용된 바, 관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)를 말한다. 본원에 사용된 바, 용어 "또는"는 달리 문맥상 명백하게 표시되지 않는 한, "및/또는"을 의미하도록 이해되어야 한다.
바이러스-유사 입자 (VLP): 본원에 사용된 바, "바이러스-유사 입자 (VLP)"는 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게 비-복제성 및 비-감염성 바이러스 입자를 말하거나, 바이러스 입자 바람직하게 바이러스의 캡시드를 닮은 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게 비-복제성 및 비-감염성 구조를 말한다. 본원에 사용된 바, 용어 "비-복제성"은 VLP에 포함된 게놈을 복제할 수 없는 것을 말한다. 본원에 사용된 바, 용어 "비-감염성"은 숙주 세포에 진입할 수 없는 것을 말한다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 바이러스성 게놈 또는 게놈 기능의 전부 또는 일부가 결여되기 때문에 비-복제성 및 비-감염성이다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 이들의 게놈으로부터 구별되는 핵산을 포함할 수 있다. 재조합으로 생산된 바이러스-유사 입자는 전형적으로 숙주 세포 유래한 RNA를 포함한다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자의 전형적인 및 바람직한 구현예는 본 발명의 폴리펩티드로 구성되는 바이러스 캡시드이다. 전형적으로, 바이러스-유사 입자는 전형적으로 바이러스-유사 입자 당 60개, 120개, 180개, 240개, 300개, 360개 또는 360개 초과의 단백질 소단위체를 포함하는 바이러스 외피 단백질로 구성된 거대분자 조립체이다. 전형적으로 및 바람직하게, 이들 소단위체의 상호작용은 고유의 반복 구성을 갖는 바이러스 캡시드 또는 바이러스 캡시드 유사 구조의 형성을 유도한다. 바이러스-유사 입자의 특징 하나는 소단위체의 매우 정돈된, 반복적인 배열이다.
CMV의 변형된 바이러스-유사 입자: 용어 "CMV의 변형된 바이러스-유사 입자"는 CMV 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자를 말한다. 전형적으로 및 바람직하게, CMV의 변형된 바이러스-유사 입자는 CMV 캡시드의 구조를 닮아있다. CMV의 변형된 바이러스-유사 입자는 비-복제성 및/또는 비-감염이고, 적어도 CMV의 복제 기구를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들이 결여되고, 전형적으로 숙주 세포에 바이러스 부착 또는 진입을 책임지는 단백질 또는 단백질들을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들도 결여된다. 또한, 이러한 정의는 전술한 유전자 또는 유전자들이 여전히 존재하지만 불활성인 변형된 바이러스-유사 입자를 포함한다. 바람직하게, 비-복제성 및/또는 비-감염성 변형된 바이러스-유사 입자는 재조합 유전자 기술학에 의해 획득되고, 전형적으로 및 바람직하게 바이러스 게놈을 포함하지 않는다. 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함하는 변형된 바이러스-유사 입자는 "모자이크 VLP"로서 지칭되고, 구체적으로 본 발명에 의해 포괄된다. 모자이크 변형된 바이러스-유사 입자는 본 발명의 매우 바람직한 구현예 및 양태이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 변형된 바이러스-유사 입자는 적어도 2개의 상이한 종의 폴리펩티드를 포함하고, 매우 바람직하게 상기 모자이크 VLP는 선택적으로 본 발명에 따라 변형되어 모자이크 변형된 CMC VLP를 생성한 2개의 상이한 종의 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, CMV의 변형된 VLP는 본 발명에 따라 변형되고, 전형적으로 VLP 당 180개의 이러한 단백질 소단위체를 포함하는 CMV 폴리펩티드로 구성된 거대분자 조립체이다.
폴리펩티드: 본원에 사용된 바, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체로 구성된 중합체를 말한다. 이것은 아미노산의 분자 사슬을 나타내고, 산물의 특이적 길이를 말하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 속한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 전형적으로 및 바람직하게 이전에 정의되고, 이에 한정되지 않지만 글리코실화를 포함한 번역-후 변형과 같은 변형을 포괄하는 폴리펩티드를 언급해야 한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 사용된 바, 상기 용어 "폴리펩티드"는 이전에 정의되고, 글리코실화와 같은 번역-후 변형과 같은 변형을 포괄하지 않는 폴리펩티드를 언급해야 한다. 구체적으로, 생물학적으로 활성을 갖는 펩티드의 경우, 상기 글리코실화와 같은 상기 변형은 이후 과정에서 생체내에서도 예를 들면 박테리아에 의해 일어날 수 있다.
오이 모자이크 바이러스 (CMV) 폴리펩티드, CMV 폴리펩티드: 본원에 사용된 용어 "오이 모자이크 바이러스 (CMV) 폴리펩티드"는 (i) 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 외피 단백질의 아미노산 서열, 또는 (ii) 돌연변이되는 아미노산 서열이 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열인, 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 폴리펩티드를 말하고, 여기서 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 돌연변이되는 아미노산 서열, 즉 상기 CMV의 외피 단백질은 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 98%, 더욱 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 전형적으로 및 바람직하게, CMV 폴리펩티드는 자가-조립에 의한 발현 시 CMV의 바이러스-유사 입자를 형성할 수 있다. 본원에 사용된 바, 용어 "키메라"는 - 폴리펩티드의 맥락에서 언급할 때 - 2개 이상의 출처로부터의 폴리펩티드성 구성성분을 포함하는 폴리펩티드를 말하려고 의도된다. 이러한 용어는 폴리펩티드 구성성분이 다함께, 즉 융합 및 펩티드 결합에 의해 각각 결합되거나 부착되는 특이적 방식에 부여하려고 추가로 의도된다. 따라서, 용어 "키메라 CMV 폴리펩티드"는 이와 같이, 구체적으로 본 발명에 따라 정의된다.
오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 외피 단백질 (CP): 본원에 사용된 용어 "오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 외피 단백질 (CP)"은 자연적으로 발생하는 오이 모자이크 바이러스의 외피 단백질을 말한다. 오이 모자이크 바이러스의 극도로 넓은 숙주 범위로 인해, CMV의 많은 상이한 균주 및 단리물이 알려져 있고, 상기 균주 및 단리물의 외피 단백질의 서열이 결정되어 왔으며, 따라서 당업자에게 마찬가지로 공지되어 있다. CMV의 상기 외피 단백질 (CP)의 서열은 진뱅크, www.dpvweb.net 또는 www.ncbi.nlm.nih.gov/단백질/와 같은 공지된 데이타베이스에 기재되어 있고, 불러오기 가능하다. CMV의 특이적인 CP 예는 국제특허출원 WO 2016/062720의 12페이지 8줄 내지 13페이지 25줄에 기술되고, 개시 내용이 본원에 참고문헌으로 명시적으로 통합된다. CMV 외피 단백질의 매우 바람직한 예 및 구현예는 서열번호 62에 제공된다. 따라서, 바람직하게 용어 "오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 외피 단백질"은 본원에 사용된 바, CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열을 말하고, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 62 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
이들 균주 및 단리물이 매우 유사한 외피 단백질 서열을, 외피 단백질의 N-말단을 포함하는 상이한 단백질 도메인에서 갖는 것은 주목할만한다. 구체적으로, 완벽하게 서열 결정된 CMV 단리물 모두 중 98.1%가 이들의 외피 단백질 서열의 처음 28개 아미노산 내에서 85% 이상의 서열 동일성을 공유하고, 더 나아가 완벽하게 서열 결정된 CMV 단리물 모두 중 85%는 이들의 외피 단백질 서열의 처음 28개 아미노산 내에서 90% 이상의 서열 동일성을 공유한다.
CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역: 용어 "CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역"은 본원에 사용된 바, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단, 구체적으로 CMV의 외피 단백질의 N-말단, 또는 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 CMV의 외피 단백질의 N-말단의 영역이지만, 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 외피 단백질이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 경우에 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 CMV의 외피 단백질의 N-말단의 두 번째 아미노산으로 시작하는 것을 말한다. 바람직하게, 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 외피 단백질이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 경우에, 실제적인 관점으로부터 메티오닌을 인코딩하는 시작 코돈은 보통 본 발명에 따라 결실되고, Th 세포 에피토프의 N-말단에 첨가된다. 또한 바람직하게, 1개, 2개 또는 3개의 추가적인 아미노산, 바람직하게 1개의 아미노산이 선택적으로, 클로닝 목적으로 출발 메티오닌 및 Th 세포 에피토프 사이에 삽입될 수 있다. 용어 "CMV 폴리펩티드 또는 CMV 외피 단백질의 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단 영역"은 본원에 사용된 바, 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 CMV의 외피 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단, 또는 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 CMV의 외피 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단의 영역이지만, 상기 돌연변이된 아미노산 서열이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 경우에 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 CMV의 외피 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열의 N-말단의 두 번째 아미노산으로 시작하는 것을 말한다. 바람직하게, 상기 CMV 폴리펩티드 또는 상기 외피 단백질이 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 경우에, 실제적인 관점으로부터 메티오닌을 인코딩하는 시작 코돈은 보통 본 발명에 따라 결실되고, Th 세포 에피토프의 N-말단에 첨가된다. 또한 바람직하게, 1개, 2개 또는 3개의 추가적인 아미노산, 바람직하게 1개의 아미노산이 선택적으로, 클로닝 목적으로 출발 메티오닌 및 Th 세포 에피토프 사이에 삽입될 수 있다.
재조합 폴리펩티드: 본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 폴리펩티드의 맥락에서 사용될 때, 재조합 DNA 기술학의 적어도 하나의 단계를 포함하는 공정에 의해 획득되는 폴리펩티드를 말한다. 전형적으로 및 바람직하게, 재조합 폴리펩티드는 원핵세포 발현 시스템에서 생산된다. 대장균과 같은 원핵세포 발현 시스템에서 발현되는 재조합으로 생산된 폴리펩티드가 N-말단 메티오닌 잔기를 포함하는 것은 당업자에게 자명하다. N-말단 메티오닌 잔기는 전형적으로 재조합 폴리펩티드의 성숙 과정 동안 발현 숙주에서 재조합 폴리펩티드로부터 절단된다. 그러나, N-말단 메티오닌의 절단은 완벽하지 못할 수 있다. 따라서, 재조합 폴리펩티드의 제조는 N-말단 메티오닌 잔기가 있거나 없는 달리 동일한 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 전형적으로 및 바람직하게, 재조합 폴리펩티드의 제조는 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 재조합 폴리펩티드를 10% 미만, 더욱 바람직하게 5% 미만, 훨씬 더 바람직하게 1% 미만 포함한다.
재조합 변형된 바이러스-유사 입자: 본 발명의 맥락에서 용어 "재조합 변형된 바이러스-유사 입자"는 재조합 DNA 기술학의 적어도 하나의 단계를 포함하는 공정에 의해 획득되는 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 말한다.
돌연변이된 아미노산 서열: 용어 "돌연변이된 아미노산 서열"은 정의된 돌연이 세트를 돌연변이되는 아미노산 서열 내에 도입함으로써 획득되는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 돌연변이되는 아미노산 서열은 전형적으로 및 바람직하게 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열이다. 따라서, 돌연변이된 아미노산 서열은 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열과 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 상이하고, 여기서 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 돌연변이되는 아미노산 서열은 적어도 90%의 서열 동일성을 나타낸다. 전형적으로 및 바람직하게 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 돌연변이되는 아미노산 서열은 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 바람직하게, 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 돌연변이되는 아미노산 서열은 많아야 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기에서 상이하고, 여기서 더욱 바람직하게 상기 차이는 삽입, 결실 및 아미노산 치환으로부터 선택된다. 바람직하게, 돌연변이된 아미노산 서열은 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열과 적어도 하나의 아미노산에서 상이하고, 바람직하게 상기 차이는 아미노산 치환이다.
잔기....에 상응하는 위치: 또 다른 아미노산 서열의 주어진 잔기에 상응하는 아미노산 서열 상의 위치는 서열 정렬에 의해, 전형적으로 및 바람직하게 BLASTP 알고리즘을 사용하여, 가장 바람직하게 표준 설정을 사용하여 식별될 수 있다. 전형적이고, 바람직한 표준 설정은 예상 한계값: 10; 단어 크기: 3; 질문 범위에서 최대 매칭: 0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트: 존재 11, 확장 1; 조합 적응; 조건부 조합 점수 매트릭스 적응이다.
서열 동일성; 2개의 주어진 아미노산 서열의 서열 동일성은 서열 둘 다의 정렬을 기초로 하여 결정된다. 서열 동일성의 결정을 위한 알고리즘은 당업자에게 입수가능하다. 바람직하게, 2개 아미노산 서열의 서열 동일성은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 상동성 프로그램, 예컨대 "BLAST" 프로그램 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 또는 "CLUSTALW" (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)을 사용하여 그리고 본원에서 바람직하게는 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi의 NCBI 홈페이지 상에 제공된 "BLAST" 프로그램에 의해 여기에 제공된 디폴트 설정을 사용하여 결정된다. 전형적이고, 바람직한 표준 설정은 예상 한계값: 10; 단어 크기: 3; 질문 범위에서 최대 매칭: 0; 매트릭스: BLOSUM62; 갭 코스트: 존재 11, 확장 1; 조합 적응; 조건부 조합 점수 매트릭스 적응이다.
아미노산 치환: 용어 아미노산 치환은 아미노산 서열에서 상이한 화학 구조를 갖는 임의의 다른 아미노산 잔기에 의한, 바람직하게 또 다른 단백질생성 아미노산 잔기에 의한 주어진 아미노산 잔기의 치환을 말한다. 따라서, 아미노산의 삽입 또는 결실과 대조적으로, 아미노산 치환은 상기 아미노산 서열의 아미노산 총수를 변경하지는 않는다.
에피토프: 용어 에피토프는 항원, 바람직하게 폴리펩티드의 연속적 또는 불연속적 부분을 말하고, 상기 부분은 MHC 분자의 맥락 내에서 항체에 의해 또는 T 세포 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있다. 항체와 관련하여, 특이적 결합은 비-특이적 결합을 배제하지만 교차-반응성을 반드시 배제하지는 못한다. 에피토프는 전형적으로 항원성 부위에 독특한 공간적 입체구조에서 5개 내지 20개의 아미노산을 포함한다.
T 헬퍼 (Th) 세포 에피토프: 본원에 사용된 용어 "T 헬퍼 (Th) 세포 에피토프"는 헬퍼 Th 세포에 의한 인식을 할 수 있는 에피토프를 말한다. 전형적으로 및 바람직하게, 본원에 사용된 용어 "Th 세포 에피토프"는 적어도 하나, 바람직하게 하나 이상의 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합할 수 있는 Th 세포 에피토프를 말한다. 펩티드 서열이 Th 세포 에피토프인지 여부를 결정하는 가장 단순한 방식은 개별 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 결합하는 펩티드의 능력을 측정하는 것이다. 이것은 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 알려진 Th 세포 에피토프의 결합과 경쟁하는 펩티드의 능력에 의해 측정될 수 있다. HLA-DR 분자의 대표적인 선별은 예로 Alexander J. et al., Immunity (1994), 1: 751-761에 기술되어 있다. MHC 클래스 Ⅱ 분자에 대한 Th 세포 에피토프의 친화도는 적어도 10-5 M이어야 한다. 상이한 개인에 존재하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자의 대표적인 집합은 Panina-Bordignon P. et al., Eur. J. Immunol. (1989), 19: 2237-2242에 제공된다. 결론적으로, 본원에 사용된 용어 "Th 세포 에피토프"는 바람직하게 면역화 및 추가 감작 시 측정가능한 T 세포 반응을 생성하는 Th 세포 에피토프를 말한다. 또한, 더욱 바람직하게, 본원에 사용된 용어 "Th 세포 에피토프"는 바람직하게 DR1, DR2w2b, DR3, DR4w4, DR4w14, DR5, DR7, DR52a, DRw53, DR2w2a로부터 선택되고, 바람직하게 DR1, DR2w2b, DR4w4, DR4w14, DR5, DR7, DRw53, DR2w2a로부터 선택되는 적어도 1개, 바람직하게 적어도 2개, 훨씬 더 바람직하게 적어도 3개의 DR 유전자좌에 적어도 500 nM의 친화도 (Alexander J. et al., Immunity (1994), 1: 751-761 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술된 바와 같음)로 결합할 수 있는 Th 세포 에피토프를 말하고, 상기 친화도를 평가하는 바람직한 결합 검정법은 Sette A. et al., J. Immunol. (1989), 142: 35-40에 의해 기술된 것이다. 또한, 훨씬 더 바람직한 방식으로, 본원에 사용된 용어 "Th 세포 에피토프"는 바람직하게 DR1, DR2w2b, DR4w4, DR4w14, DR5, DR7, DRw53, DR2w2a로부터 선택되는 적어도 1개, 바람직하게 적어도 2개, 훨씬 더 바람직하게 적어도 3개의 DR 유전자좌에 적어도 500 nM의 친화도 (Alexander J. et al., Immunity (1994), 1: 751-761 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술된 바와 같음)로 결합할 수 있는 Th 세포 에피토프를 말하고, 상기 친화도를 평가하는 바람직한 결합 검정법은 Sette A. et al., J. Immunol. (1989), 142: 35-40에 의해 기술된 것이다. 세포 에피토프는 Alexander J. et al., Immunity (1994), 1: 751-761; Panina-Bordignon P. et al., Eur. J. Immunol. (1989), 19: 2237-2242; Calvo-Calle J.M. et al., J. Immunol. (1997), 159: 1362-1373; 및 Valmori D. et al., J. Immunol. (1992), 149: 717-721에 의해 기술된 바와 같이 기재되고, 당업자에게 공지되어 있다.
항원성 폴리펩티드: 본원에 사용된 바, 용어 "항원성 폴리펩티드"은 항체 또는 MHC 분자에 의해 제시된 경우 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 결합된 분자를 말한다. 항원성 폴리펩티드는 면역계에 의해 인식될 수 있고/거나, 체액성 면역 반응 및 B- 및/또는 T 림프구의 활성화를 안내하는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 항원성 폴리펩티드는 하나 이상의 에피토프 (B- 및 T 에피토프)를 갖을 수 있다. 또한, 본원에 사용된 항원성 폴리펩티드는 여러 개별 항원성 폴리펩티드의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드, 구체적으로 본 발명의 변형된 바이러스-유사 입자를 형성하는 상기 본 발명의 융합 단백질은 항원성 폴리펩티드를 포함한다.
땅콩 알레르기원: 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, 인간에게 알레르기를 유발하는 것으로 제안된 아라키스 하이포가애 (Arachis hypogaea) 종 및 이들의 이소형의 임의의 단백질을 말한다. 바람직하게, 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, www.allergen.org 하에서 불러오기 가능한 임의의 제안된 땅콩 알레르기원 및 이들의 이소형, 또는 이러한 알레르기원 및 이들의 이소형과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 말한다. 더욱 바람직하게, 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, www.allergen.org 하에서 불러오기 가능한 임의의 현재까지지 제안된 17개의 땅콩 알레르기원 및 이들의 이소형, 또는 이러한 알레르기원 및 이들의 이소형과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 말한다. 또한, 더욱 바람직하게, 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, Ara h1, Ara h2, Ara h3, Ara h4, Ara h5, Ara h6, Ara h7, Ara h8, Ara h9, Ara h10, Ara h11, Ara h12, Ara h13, Ara h14, Ara h15, Ara h16 및 Ara h17로부터 선택되는 땅콩 알레르기원 및 이들의 이소형, 또는 이러한 알레르기원 및 이들의 이소형과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 어느 하나를 말한다. 또한, 더욱 바람직하게, 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, Ara h1, Ara h2, Ara h3 및 Ara h6로부터 선택되는 땅콩 알레르기원 및 이들의 이소형, 또는 이러한 알레르기원 및 이들의 이소형과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질 중 어느 하나를 말한다. 또한, 더욱 바람직하게, 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, Ara h1, Ara h2, Ara h3 및 Ara h6로부터 선택되는 임의의 단백질 및 이들의 이소형, 또는 이러한 땅콩 알레르기원과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 말한다. 또한, 더욱 바람직하게, 용어 "땅콩 알레르기원"은 본원에 사용된 바, Ara h1, Ara h2, Ara h201, Ara h202, Ara h3 및 Ara h6로부터 선택되는 임의의 단백질, 또는 이러한 땅콩 알레르기원과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 말한다.
Fel d1 단백질: 용어 "Fel d1 단백질"은 본원에 사용된 바, Fel d1의 사슬 1 및 Fel d1의 사슬 2를 포함하거나, 대안적으로 이로 구성되는 단백질을 말한다. 바람직하게, Fel d1의 사슬 1 및 Fel d1의 사슬 2는 공유 결합된다. 바람직한 구현예에서, Fel d1의 사슬 1 및 Fel d1의 사슬 2는 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 결합된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 사슬 1 및 사슬 2는 직접적으로 또는 스페이서를 통해 융합되고, 이 경우에 상기 Fel d1 단백질은 스페이서를 추가로 포함하거나, 대안적으로 이로 구성된다. 바람직하게, 본원에 정의된 Fel d1 단백질은 총제적으로 많아야 300개, 훨씬 더 바람직하게 많아야 200개의 아미노산으로 구성된다. 전형적으로 및 바람직하게, 본 발명에 따른Fel d1 단백질은 자연 발생 Fel d1에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 생체내에서 유도할 수 있다.
Fel d1의 사슬 1: 용어 "Fel d1의 사슬 1"은 본원에 사용된 바, 서열번호 76 또는 이의 동종유래 서열의 아미노산 서열을 포함하거나, 대안적으로 이로 구성되는 폴리펩티드를 말한다. 용어 "서열번호 76의 동종유래 서열"은 본원에 사용된 바, 서열번호 76과 80% 이상, 더욱 바람직하게 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게 95% 이상인 동일성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 또한, 용어 "Fel d1의 사슬 1"은 본원에 사용된 바, 본원에 정의된 Fel d1의 사슬 1의 적어도 하나의 글리코실화를 포함하나 이에 한정되지 않는, 적어도 하나의 번역-후 변형을 포괄하는 폴리펩티드를 말해야 한다. 바람직하게, 본원에 정의된 Fel d1의 사슬 1은 총체적으로 많아야 130개, 훨씬 더 바람직하게 많아야 100개의 아미노산으로 구성된다.
Fel d1의 사슬 2: 용어 "Fel d1의 사슬 2"는 본원에 사용된 바, 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 79, 또는 이들의 동종유래 서열의 아미노산 서열을 포함하거나, 대안적으로 이로 구성되는 폴리펩티드를 말한다. 본원에 사용된 용어 " 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 79의 동종유래 서열"은 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 79와 80% 이상, 더욱 바람직하게 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게 95% 이상인 동일성을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 또한, 용어 "Fel d1의 사슬 2"는 본원에 사용된 바, 본원에 정의된 Fel d1의 사슬 2의 적어도 하나의 글리코실화를 포함하나 이에 한정되지 않는, 적어도 하나의 번역-후 변형을 포괄하는 폴리펩티드를 말해야 한다. 바람직하게, 본원에 정의된 Fel d1의 사슬 2는 총체적으로 많아야 130개, 훨씬 더 바람직하게 많아야 100개의 아미노산으로 구성된다.
아쥬반트: 본원에 사용된 용어 "아쥬반트"는 본 발명의 백신 및 약제학적 조성물와 각각 조합될 때, 훨씬 더 증진된 면역 반응을 제공할 수 있는 숙주에서 저장소 (depot)의 생성을 허용하는 면역 반응 또는 물질의 비-특이적인 자극인자를 말한다. 바람직한 아쥬반트는 완전 및 불완전 프런드 아쥬반트, 알루미늄 포함하는 아쥬반트, 바람직하게 수산화알루미늄 및 변형된 뮤라밀디펩티드이다. 더욱 바람직한 아쥬반트는 수산화알루미늄과 같은 미네랄 젤, 라이소 레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀전, 키홀 소라 헤모시아닌, 디니트로페닐 그리고 BCG (bacille Calmette Guerin) 및 코리네박테리움 파붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 인간 아쥬반트이다. 또한, 이러한 아쥬반트는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 추가의 아쥬반트는 모노포스포릴 지질 면역조절제, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, 알루미늄염 (알럼), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 및 바이로좀 아쥬반트 기술학을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 아쥬반트는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 바이러스-유사 입자는 일반적으로 아쥬반트로서 기술되어 왔다. 그러나, 용어 "아쥬반트"는 본 출원의 맥락 내에서 사용된 바, 본 발명의 변형된 바이러스-유사 입자가 아닌 아쥬반트를 말한다. 오히려, "아쥬반트"는 본 발명의 조성물, 백신 또는 약제학적 조성물의 추가적인 독특한 구성성분에 관한 것이다.
아미노산 링커: 용어 "아미노산 링커"는 본원에 사용된 바, 아미노산 잔기로 배타적으로 구성되는 링커를 말한다. 아미노산 링커의 아미노산 잔기는 당해 기술분야에 공지된 자연 발생 아미노산 또는 비-천연 아미노산, 모두 L 또는 모두 D 또는 이들의 혼합물로 구성된다. 아미노산 링커의 아미노산 잔기는 바람직하게 자연 발생 아미노산, 모두 L 또는 모두 D 또는 이들의 혼합물이다.
GS 링커: 용어 "GS 링커"는 본원에 사용된 바, 글리신 및 세린 아미노산 잔기 단독으로 구성되는 링커를 말한다. 본 발명에 따른 GS 링커는 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린 잔기를 포함한다. 전형적으로 및 바람직하게, 본 발명에 따른 GS 링커는 많아야 50개 아미노산의 길이를 갖고, 전형적으로 및 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 GS 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다.
GST 링커: 용어 "GST 링커"는 본원에 사용된 바, 글리신, 세린 및 트레오닌 아미노산 잔기를 포함하고, 바람직하게 이들로 구성되는 링커를 말한다. 본 발명에 따른 GST 링커는 적어도 하나의 글리신, 적어도 하나의 세린 및 적어도 하나의 트레오닌 잔기를 포함한다. 전형적으로 및 바람직하게, 본 발명에 따른 GST 링커는 많아야 50개 아미노산의 길이를 갖고, 전형적으로 및 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 GS 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다.
GSED 링커: 용어 "GSED 링커"는 본원에 사용된 바, 글리신, 세린, 글루탐산 및 아스파라긴산 아미노산 잔기를 포함하고, 바람직하게 이들로 구성되는 링커를 말한다. 본 발명에 따른 GSED 링커는 적어도 하나의 글리신, 적어도 하나의 세린, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산 잔기를 포함한다. 전형적으로 및 바람직하게, 본 발명에 따른 GSED 링커는 많아야 50개 아미노산의 길이를 갖고, 전형적으로 및 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 GSED 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다.
면역자극성 물질: 본원에 사용된 바, 용어 "면역자극성 물질"은 면역 반응을 유도하고/거나, 증진할 수 있는 물질을 말한다. 면역자극성 물질은 본원에 사용된 바, 톨-유사 수용체 활성화 물질 및 사이토카인 분비를 유도하는 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 톨-유사 수용체 활성화 물질은 면역자극성 핵산, 펩티도글리칸, 지질다당류, 리포테이콘산, 이미다조퀴놀린 화합물, 플라젤린, 지질단백질 및 택솔과 같은 면역자극성 유기물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
면역자극성 핵산 (ISS-NA): 본원에 사용된 바, 용어 "면역자극성 핵산"은 면역 반응을 유도하고/거나, 증진할 수 있는 핵산을 말한다. 면역자극성 핵산은 리보핵산 및 구체적으로 데스옥시리보핵산을 포함하고, 여기서 리보핵산 및 데스옥시리보핵산 둘 다는 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다, 바람직한 ISS-NA는 데스옥시리보핵산이고, 여기서 더욱 바람직하게 상기 데스옥시리보핵산은 단일가닥이다. 바람직하게, 면역자극성 핵산은 메틸화되지 않은 C를 포함하는 적어도 하나의 CpG 모티브를 포함한다. 매우 바람직한 면역자극성 핵산은 적어도 하나의 CpG 모티브를 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 CpG 모티브는 적어도 하나, 바람직하게 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, C는 메틸화되지 않는다. 바람직하게, 반드시는 아니지만, 상기 CG 디뉴클레오티드는 필린드롬 서열의 일부이다. 또한, 용어 면역자극성 핵산은 변형된 염기, 바람직하게 4-브로모-시토신을 포함하는 핵산을 말한다. 구체적으로, 본 발명의 맥락에서 수지상 세포에서 INF-알파 생산을 자극할 수 있는 ISS-NA가 바람직하다. 본 발명의 목적에 유용한 면역자극성 핵산은, 예를 들면 국제특허출원 WO 2007/068747A1에 기술되어 있다.
올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 바, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게 약 6개 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 약 20개 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 약 20개 내지 약 40개의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 말한다. 매우 바람직하게, 올리고뉴클레오티드는 약 30개의 뉴클레오티드를 포함하고, 더욱 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 정확하게 30개의 뉴클레오티드를 포함하고, 가장 바람직하게 올리고뉴클레오티드는 정확하게 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 올리고뉴클레오티드는 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드이고, 바람직하게 (a) 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 및 (b) 변형된 RNA 또는 DNA로부터 선택된다. 변형은 골격 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 (a) 단일- 및 이중가닥 DNA, (b) 단일- 및 이중가닥 영역의 혼합물인 DNA, (c) 단일- 및 이중가닥 RNA, (d) 단일- 및 이중가닥 영역의 혼합물인 RNA, 및 (e) 단일가닥, 더욱 바람직하게 이중가닥 또는 단일- 및 이중가닥 영역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 뉴클레오티드 변형/유사체는 (a) 펩티드 핵산, (b) 이노신, (c) 트리틸화 염기, (d) 포스포로티오에이트, (e) 알킬포스포로티오에이트, (f) 5-니트로인돌 데스옥시리보플리라노실, (g) 5-메틸데스옥시시토신, 및 (h) 5,6-디히드로-5,6-디히드로데스옥시티민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 포스포티오에이트화된 뉴클레오티드는 세포 또는 유기체에서 분해에 대해 보호되고, 따라서 뉴클레오티드 변형이 바람직하다. 포스포디에스테르 결합된 뉴클레오티드로 배타적으로 구성된 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 변형된 뉴클레오티드보다 활성이 더 크고, 따라서 일반적으로 본 발명의 맥락에서 바람직하다. 포스포디에스테르 결합된 데옥시뉴클레오티드로 배타적으로 구성된 올리고뉴클레오티드가 가장 바람직하고, 여기서 더욱 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 단일가닥이다. 세포에서, 바람직하게 수지상 세포에서 INF-알파 생산을 자극할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 더욱 바람직하다. 세포에서 INF-알파 생산을 자극할 수 있는 매우 바람직한 올리고뉴클레오티드는 A형 CpG 및 C형 CpG로부터 선택된다. Cap이 없는 RNA 분자가 더욱 바람직하다.
CpG 모티브: 본원에 사용된 바, 용어 "CpG 모티브"는 C가 메틸화되지 않고, 중앙 CpG를 (이의 3' 및 5' 말단 상에) 인접하는 적어도 하나의 염기, 바람직하게 1개 또는 2개의 뉴클레오티드에 의해 둘러싸인, 메틸화되지 않은 중앙 CpG, 즉 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 양상을 말한다. 전형적으로 및 바람직하게, 본원에 사용된 CpG 모티브는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드 및 이의 5' 및 3' 말단 상에 2개 뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이로 구성된다. 이론에 얽매이지 않더라도, CpG를 인접하는 염기는 CpG 올리고뉴클레오티드에 대한 활성의 유의한 일부를 부여한다.
메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드: 본원에 사용된 바, 용어 "메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드" 또는 "CpG"는 적어도 하나의 CpG 모티브를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 바람직하게 올리고데스옥시뉴클레오티드를 말한다. 따라서, CpG는 적어도 하나의 메틸화되지 않은 시토신, 구아닌 디뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 CpG는 척추동물 골수 유래한 세포를 자극/활성화하고, 예로 이에 미치는 세포분열생성 효과를 갖거나, 상기 세포에 의한 사이토카인 발현을 유도하거나 증가시킨다. 예를 들면, CpG는 B 세포, NK 세포, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포, 단핵구 및 대식구를 활성화하는데 유용할 수 있다. 바람직하게, CpG는 메틸화되지 않은 시토신, 3'에 이어진 구아노신을 포함하는 올리고데스옥시뉴클레오티드, 바람직하게 단일가닥 올리고데스옥시뉴클레오티드에 관한 것이고, 여기서 상기 메틸화되지 않은 시토신 및 상기 구아노신은 포스페이트 결합에 의해 결합되고, 더욱 바람직하게 상기 포스페이트 결합은 포스포디에스테르 결합이다. CpG는 포스포로티오에스테르 결합을 포함하는 유사체와 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 일반적으로, 이중가닥 분자는 생체내에서 더 안정한 반면, 단일가닥 분자는 면역 활성을 증가시킨다. 바람직하게, 본원에 사용된 바, CpG는 적어도 약 10개 뉴클레오티드의 길이이고, 적어노 하나의 CpG 모티브를 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 추가로 바람직하게 상기 CpG는 10개 내지 60개, 더욱 바람직하게 15개 내지 50개, 훨씬 더 바람직하게 20개 내지 40개, 훨씬 더 바람직하게 약 30개. 가장 바람직하게 정확하게 30개 뉴클레오티드의 길이이다. CpG는 메틸화된 및/또는 메틸화되지 않은 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 상기 적어도 하나의 CpG 모티브는 C가 메틸화되지 않은 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함한다. 또한, CpG는 메틸화된 및/또는 메틸화되지 않은 서열 스트레치를 포함할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 CpG 모티브는 C가 메틸화되지 않은 적어도 하나의 CG 디뉴클레오티드를 포함한다. 매우 바람직하게, CpG는 메틸화되지 않은 시토신, 3'에 이어진 구아노신을 포함하는 단일가닥 올리고데스옥시뉴클레오티드에 관한 것이고, 여기서 상기 메틸화되지 않은 시토신 및 상기 구아노신은 포스페이트 결합에 의해 결합된다. CpG는 포스포로티오에스테르 결합을 포함하는 유사체와 같은 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있고, 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다. 일반적으로, 포스포디에스테르 CpG는 하기에 표시된 바와 같은 A형 CpG인 반면, 포스포디에스테르 안정화된 CpG는 B형 CpG이다. 본 발명의 맥락에서 바람직한 CpG 올리고뉴클레오티드는 A 형 CpG이다.
A형 CpG: 본원에 사용된 바, 용어 "A형 CpG" 또는 "D형 CpG"는 적어도 하나의 CpG 모티브를 포함하는 올리고데스옥시뉴클레오티드 (ODN)를 말한다. A형 CpG는 우선적으로 T세포의 활성화 및 수지상 세포의 성숙화를 자극하고, IFN-알파 생산을 자극할 수 있다. A형 CpG에서, 적어도 하나의 CpG 모티브의 뉴클레오티드는 적어도 하나의 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된다. A형 CpG는 이의 5' 말단에 및/또는 바람직하게 이의 3' 말단에 인접할 수 있는 적어도 하나의 포스포디에스테르 결합 CpG 모티브를 포함한다. 바람직하게, CpG 모티브 및 본원에서는 CG 디뉴클레오티드 및 이의 바로 인접하는 바람직하게 적어도 하나, 바람직하게 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 영역은 포스포디에스테르 뉴클레오티드로 구성된다. 바람직한 A형 CpG는 배타적으로 포스포디에스테르 (PO) 결합 뉴클레오티드로 구성된다. 전형적으로 및 바람직하게, 폴리 G 모티브는 적어도 하나, 바람직하게 적어도 3개, 적어도 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 G (구아노신), 가장 바람직하게 적어도 10개의 G를 포함하거나, 대안적으로 이로 구성된다. 바람직하게, 본 발명의 A형 CpG는 팰린드롬 서열을 포함하거나, 대안적으로 이로 구성된다.
포장: 본원에 사용된 용어 "포장된"은 코아 입자 및 VLP와 관련하여 다중음이온성 거대분자 또는 면역자극성 물질의 상태를 각각 말한다. 본원에 사용된 용어 "포장된"은 공유 결합일 수 있는, 예로 화학적 결합 또는 비공유 결합, 예로 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합 등에 의한 결합을 포함한다. 또한, 용어는 다중음이온성 거대분자의 동봉 또는 부분적 동봉을 포함한다. 따라서, 다중음이온성 거대분자 또는 면역자극성 물질은 실제적인 결합, 구체적으로 공유 결합의 존재가 없이 VLP에 의해 동봉될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 다중음이온성 거대분자 또는 면역자극성 물질은 VLP 내부에, 가장 바람직하게는 비공유적 방식으로 포장된다. 상기 면역자극성 물질이 핵산, 바람직하게 DNA인 경우, 용어 "포장된"은 상기 핵산이 뉴클레아제 가수분해에 접근가능하지 않고, 바람직하게 DNA 분해효소 (예로, DNaseI 또는 벤조나제)에 접근가능하지 않은 것을 의미하고, 여기서 바람직하게 상기 접근가능성은 국제특허출원 WO 2003/024481A2의 실시예 11 내지 17에 설명된 바와 같이 검정된다.
유효량: 본원에 사용된 바, 용어 "유효량"은 원하는 생물제제 효과를 실현하는데 필요한 또는 충분한 양을 말한다. 조성물 또는 대안적으로 약제학적 조성물의 유효량은 이러한 선별된 결과를 달성하는 양일 것이고, 이러한 양은 당업자에 의해 일상적인 문제로서 결정될 수 있다. 바람직하게, 용어 "유효량"은 본원에 사용된 바, 상기 적어도 하나의 땅콩 알레르기원의 수준을 땅콩 알레르기에 의해 유발된 적어도 하나의 증상의 감소를 유도하는 수준으로 감소시키는데 필요한 또는 충분한 양을 말한다. 바람직하게, 용어 "유효량"은 본원에 사용된 바, 상기 적어도 하나의 땅콩 알레르기원의 활성을 중화시키는데 필요한 또는 충분한 양을 말한다. 유효량은 투여되는 구체적인 조성물 및 대상체의 체격에 의존하여 달라질 수 있다. 당업자라면 본 발명의 구체적인 조성물의 유효량을 부당한 실험법을 요구하지 않고도 경험적으로 결정할 수 있다.
치료: 본원에 사용된 바, 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 예방법 및/또는 요법을 말한다. 일 구현예에서, 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 치료적 처치를 말한다. 또 다른 구현예에서, 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 예방적 치료를 말한다.
제 1 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공하고, 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드; (ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드; 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프로서, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하는, T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 아미노산 링커, 바람직하게 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하며, 상기 제 1 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 아미노산 링커, 즉 GS 링커 또는 GSED 링커는 본 발명의 변형된 VLP를 형성하는 조립 공정을 방해하는 구형 장애를 극복하고/거나, 형성된 본 발명의 변형된 VLP 간의 응집 경향성을 극복하고/거나, 심지어 매우 긴 항원성 폴리펩티드의 삽입을 위한 유연성을 증가시키는데 매우 유익한 것으로 확인되었다. 구체적으로, 이것은 상기 GS 링커 또는 GSED 링커가 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커로서 추가로 적용되는 경우이고, 또한 추가로 상기 제 1 아미노산 링커 및 상기 제 2 아미노산 링커가 상기 삽입된 항원성 폴리펩티드가 없는 현재와 같은 아미노산 서열 상황을 모방하는 경우이다. 구체적으로, 이것은 본 발명의 바람직한 CMV 폴리펩티드에 유익하였다. 따라서, 상기 삽입된 항원성 폴리펩티드가 없는 현재와 같은 아미노산 서열 상황을 모방하는 것은 구체적으로 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이, 구체적으로 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 항원성 폴리펩티드의 삽입을 위해 구체적으로 유익한 것으로 확인되었다. GS 이후에 (즉, 각각 서열번호 62의 84번 위치 및 서열번호 5의 88번 위치 이후에) 및 YY 이전에 (즉, 각각 서열번호 62의 85번 위치 및 서열번호 5의 89번 위치 이후에) 바람직하게 GS 링커 또는 GSED 링커를 사용하여, 구체적으로 항원성 폴리펩티드의 C-말단에 위치하는 제 2 아미노산 링커를 사용하고 GS로 종결하는 GS 링커 또는 GSED 링커에 의해 항원성 폴리펩티드의 삽입은 구체적으로 유익한 것으로 확인되었다.
추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 CMV의 변형된 VLP을 제공하여, 여기서 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 상기 외피 단백질 바람직하게 상기 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드; (ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입이 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드; 및 (iii) 제 1 아미노산 링커, 바람직하게 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커로서, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, 바람직하게 상기 제 1 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, 글리신-세린 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는, 아미노산 링커를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 T 헬퍼 세포 에피토프를 추가로 포함하고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 모자이크 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다. 제 1 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 융합 단백질 및 적어도 하나의 CMV 단백질을 포함하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, (a) 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, CMV 폴리펩티드; (ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고; (b) 적어도 하나의 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 CMV 단백질은 서열번호 5를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 T 헬퍼 세포 에피토프를 추가로 포함하고, 여기서 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응한다. 또한, 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 아미노산 링커, 바람직하게 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, 상기 제 1 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, 글리신-세린 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 모든 양태의 경우, 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치인 상기 세린 (S) 잔기 및 서열번호 62의 85번 위치인 상기 타이로신 (Y) 잔기 사이에 삽입에 해당한다.
본원에 기술된 및 개시된 구현예, 바람직한 구현예 및 매우 바람직한 구현예는 구체적으로 다시 구체적으로 언급되거나 이의 반복이 간결성을 위해 회피되는지 여부와 상관없이 모든 양태 그리고 다른 구현예, 바람직한 구현예 및 매우 바람직한 구현예에 적용되어야 한다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열 또는 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 여기서 돌연변이되는 아미노산 서열은 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열이고, 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 CMV의 외피 단백질은 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%, 더욱 바람직하게 적어도 98%, 더욱 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내고, 바람직하게 상기 돌연변이된 아미노산 서열 및 상기 돌연변이되는 아미노산 서열은 적어도 하나에서 그리고 많아야 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기에서 상이하고, 추가로 바람직하게 이러한 차이는 (i) 삽입, (ii) 결실, (iii) 아미노산 치환 및 (i) 내지 (iii)의 임의의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 90%, 바람직하게 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 갖는 CMV의 외피 단백질이다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질로 구성되고, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (i) 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 62와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (i) 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 62와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 아미노산 서열 영역을 포함하고, 상기 아미노산 서열 영역은 서열번호 63과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 (i) 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열번호 62와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, (i) 또는 (ii)에서 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열번호 63을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 치환된 N-말단 영역의 아미노산의 갯수는 상기 T 헬퍼 세포 에피토프를 구성하는 아미노산의 갯수 이하이다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 치환된 N-말단 영역은 5개 내지 15개의 연속적 아미노산으로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 치환된 N-말단 영역은 9개 내지 14개의 연속적 아미노산으로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 치환된 N-말단 영역은 11개 내지 13개의 연속적 아미노산으로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응한다. 바람직한 구현예에서, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 보편적인 T 헬퍼 세포 에피토프이다. 바람직한 구현예에서, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 많아야 20개의 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, Th 세포 에피토프는 HA 307-319 (서열번호 67), HBVnc 50-69 (서열번호 68), TT 830-843 (서열번호 64), CS 378-398 (서열번호 69), MT 17-31 (서열번호 70), TT 947-967 (서열번호 71) 및 PADRE (서열번호 65)으로부터 선택된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 독소로부터 유래한 Th 세포 에피토프이거나, PADRE 서열이다. 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 인간 백신으로부터 유래한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 독소로부터 유래한 Th 세포 에피토프이다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 PADRE 서열이다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65의 아미노산 서열로 구성된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 64의 아미노산 서열로 구성된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 65의 아미노산 서열로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 상기 아미노산 서열은 서열번호 62 또는 서열번호 62와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 상기 아미노산 서열은 서열번호 63을 포함하고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 대체된 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 11개 내지 13개의 연속적인 아미노산, 바람직하게 11개의 연속적인 아미노산으로 구성되고, 추가로 바람직하게 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응한다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함한다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 5의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 서열번호 5의 88번 위치 및 89번 위치의 아미노산 잔기 사이에 삽입되거나, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 66의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 서열번호 66의 86번 위치 및 87번 위치의 아미노산 잔기 사이에 삽입된다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 66의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 서열번호 66의 86번 위치 및 87번 위치의 아미노산 잔기 사이에 삽입된다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 5의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 서열번호 5의 88번 위치 및 89번 위치의 아미노산 잔기 사이에 삽입된다.
바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 아미노산 링커, 바람직하게 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, 상기 제 1 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 2 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, 상기 제 2 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단에 위치하고, 상기 제 2 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 또는 C-말단에 위치하며, 상기 제 1 아미노산 링커 및 제 아미노산 링커는 독립적으로 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 많아야 32개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 많아야 15개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 많아야 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 많아야 15개 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다. 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다. 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 아미노산 링커 및 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단에 위치하고, 상기 제 2 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 C-말단에 위치한다. 바람직한 구현예에서, 제 1 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게, 상기 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커는 GST 링커 또는 GSED 링커이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 GS 링커는 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 글리세린-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 GS 링커는 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖으며, r = 0 또는 1, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3 및 u = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GS 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GS 링커는 많아야 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 글리세린-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 GS 링커는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 47로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 서열번호 10 및 서열번호 30으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 Thr (GST 링커)를 포함하는 아미노산 링커이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커 (GST 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly 및 적어도 하나의 Ser을 포함하는 아미노산 링커 (GS 링커)이거나, 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커 (GST 링커)이거나, 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하고, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하고, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3, u = 0 또는 1, x = 0, y = 0 내지 5, 바람직하게 y = 3 및 z = 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GSED 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GSED 링커는 많아야 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 상기 GSED 링커는 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 바람직하게 상기 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커는 GST 링커 또는 GSED 링커이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 글리세린-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 GS 링커는 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖으며, r = 0 또는 1, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3 및 u = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GS 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GS 링커는 많아야 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 글리세린-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 GS 링커는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 47로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 서열번호 11, 서열번호 31 및 서열번호 47으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 GS 링커는 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커이다.
바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커 (GST 링커)이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커 (GST 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly 및 적어도 하나의 Ser을 포함하는 아미노산 링커 (GS 링커)이거나, 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커 (GST 링커)이거나, 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하고, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하고, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하고, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3, u = 0 또는 1, x = 1, y = 0 내지 5, 바람직하게 y = 0 및 z = 0이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열로 구성되고, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3, u = 0 또는 1, x = 1, y = 0 내지 5, 바람직하게 y = 0 및 z = 0이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (TS)(DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 2 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 (TS)(DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3, u = 0 또는 1, x = 1, y = 0 내지 5, 바람직하게 y = 0 및 z = 0이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GSED 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 GSED 링커는 많아야 20개 아미노산의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 아미노산 링커는 GSED 링커이고, 상기 GSED 링커는 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n; (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및 (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 GS 링커는 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖으며, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 글리신-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 GS 링커는 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖으며, r = 0 또는 1, s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3 및 u = 0 또는 1이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 글리세린-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 GS 링커는 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 47로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커이다.
바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 아미노산 링커 (GSED 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 독립적으로 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u, 여기서 s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1; 또는 (TS)(DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u, 여기서 s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 GSED 링커이고, 여기서 상기 GSED 링커는 독립적으로 (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u, 여기서 s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3, u = 0 또는 1, x = 1, y = 0 내지 5, 바람직하게 y = 3 및 z = 1; 또는 (TS)(DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u, 여기서 s = 3 또는 4, t = 1, 2 또는 3, u = 0 또는 1, x = 1, y = 0 내지 5, 바람직하게 y = 0 및 z = 0의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 GSED 링커이고, 상기 GSED 링커는 서열번호 126 및 서열번호 127로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 5의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 아미노산 잔기 88번 (Ser) 및 아미노산 잔기 89번 (Thr) 사이에 삽입된다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 5의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 아미노산 잔기 88번 (Ser) 및 아미노산 잔기 89번 (Thr) 사이에 삽입되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 및 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는 독립적으로 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)이고, 상기 제 2 아미노산 링커는 이의 N-말단에 Gly-Ser 서열을 갖는다.
일 양태 및 바람직한 구현예에서, 본 발명은 모자이크 바이러스-유사 입자를 제공한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 CMV의 변형된 VLP는 적어도 하나의 CMV 단백질을 추가로 포함하고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 98%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV의 변형된 VLP는 적어도 하나의 CMV 단백질을 추가로 포함하고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질로 구성되고, 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 여기서 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5를 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산 및 많아야 225개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 3개의 아미노산 및 많아야 200개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 40개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 40개의 아미노산 및 많아야 225개, 바람직하게 많아야 200개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 50개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 50개의 아미노산 및 많아야 200개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 70개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 적어도 70개의 아미노산 및 많아야 200개의 아미노산 길이를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) 알레르기원; (b) 바이러스; (c) 박테리아; (c) 기생충; (d) 종양; (e) 자가-분자; (h) 호르몬; (i) 사이토카인; 및 (k) 케모카인으로 이루어진 군으로부터 유래한 폴리펩티드이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 알레르기원, 자가 항원, 종양 항원 또는 병원체의 폴리펩티드이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 알레르기원이고, 바람직하게 상기 알레르기원은 (a) 화분 추출물; (b) 먼지 추출물; (c) 먼지 진드기 추출물; (d) 곰팡이 추출물; (e) 포유동물 표피 추출물; (f) 깃털 추출물; (g) 곤충 추출물; (h) 식품 추출물; (i) 모발 추출물; (j) 타액 추출물; 및 (k) 혈청 추출물로 이루어진 군으로부터 유래한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 알레르기원이고, 상기 알레르기원은 (a) 나무; (b) 잔디; (c) 집 먼지; (d) 집 먼지 진드기; (e) 아스퍼질러스; (f) 동물 털; (g) 동물 깃털; (h) 벌독; (i) 동물 산물; (j) 식물 산물; (k) 동물 비듬; 및 (l) 땅콩 알레르기원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) 벌독 포스포리파제 A2; (b) 돼지풀 화분 Amb aI; (c) 자작나무 화분 Bet vI; (d) 흰색 말벌 독 5 DoI mV; (e) 집 먼지 진드기 Der p1; (f) 집 먼지 진드기 Der f2; (g) 집 먼지 진드기 Der p2; (h) 먼지 진드기 Lep d; (i) 곰팡이 알레르기원 Alt a1; (j) 곰팡이 알레르기원 Asp f1; (k) 곰팡이 알레르기원 Asp f16; (l) 땅콩 알레르기원; (m) 고양이 알레르기원 Fel d1; (n) 개 알레르기원 Can f1, Can f2; (o) 땅콩 유래 알레르기원; 또는 (p) 일본 세다 알레르기원 Cry J2로 이루어진 군으로부터 선택되는 알레르기원으로부터 유래한 재조합 폴리펩티드이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 재조합 알레르기원이고, 상기 알레르기원은 (a) 벌독 포스포리파제 A2; (b) 돼지풀 화분 Amb aI; (c) 자작나무 화분 Bet vI; (d) 흰색 말벌 독 5 DoI mV; (e) 집 먼지 진드기 Der p1; (f) 집 먼지 진드기 Der f2; (g) 집 먼지 진드기 Der p2; (h) 먼지 진드기 Lep d; (i) 곰팡이 알레르기원 Alt a1; (j) 곰팡이 알레르기원 Asp f1; (k) 곰팡이 알레르기원 Asp f16; (l) 땅콩 알레르기원; (m) 고양이 알레르기원 Fel d1; (n) 개 알레르기원 Can f1, Can f2; (o) 땅콩 유래 알레르기원; 또는 (p) 일본 세다 알레르기원 Cry J2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 땅콩 알레르기원이다. 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 땅콩 알레르기원이다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27, 서열번호 72 또는 서열번호 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 땅콩 알레르기원이고, 상기 땅콩 알레르기원은 (a) 서열번호 27; (b) 서열번호 72; (c) 서열번호 73으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 땅콩 알레르기원이고, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 29로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알레르기, 바람직하게 땅콩 알레르기를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 적어도 하나의 CMV 단백질을 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 땅콩 알레르기원이고, 상기 땅콩 알레르기원은 서열번호 27을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 바람직하게 이로 구성되며, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 29로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알레르기, 바람직하게 땅콩 알레르기를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 일본 세다 Cry J2로부터 유래한 알레르기원이다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 74의 일본 세다 Cry J2로부터 유래한다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 일본 세다 Cry J2로부터 유래하고, 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 돼지풀 화분 Amb a1으로부터 유래한 알레르기원이다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 75의 돼지풀 화분 Amb a1으로부터 유래한다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 돼지풀 화분 Amb a1으로부터 유래하고, 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 알레르기원 Fel d1으로부터 유래한 알레르기원이다. 애완용 고양이 (Felis domesticus)는 실내 알레르기원의 중요한 출처이다 (Lau, S., et al. (2000) Lancet, 356: 1392-1397). 증상의 중증도는 비교적 미약한 비염 및 결막염부터 잠재적으로 생명을 위협하는 천식 악화에 이르는 범위를 갖는다. 환자가 가끔 고양이 비듬 및 털에 있는 여러 상이한 분자에 민감화되지만, 주요한 알레르기원은 Fel d1이다. 이러한 알레르기원의 중요성은 수많은 연구에서 강조되어 왔다. 사실상 80% 이상의 고양이 알레르기 환자가 이 강력한 알레르기원에 대해 IgE 항체를 나타낸다 (van Ree, R., et al. (1999) J. Allergy Clin. Immunol., 104: 1223-1230). Fel d1은 10% 내지 20%의 N-결합된 탄수화물을 포함하는 35 내지 39 kDa 산성 당단백질이고, 고양이의 털, 침 및 눈물샘에서 발견된다. 이것은 2개의 비-공유 결합된 이종이량체에 의해 형성된다. 각 이종이량체는 별개의 유전자에 의해 인코딩되는 하나의 70개 잔기 펩티드 ("사슬 1"으로서 알려짐) 및 하나의 78개, 85개, 90개 또는 92개 잔기 펩티드 ("사슬 2"로서 알려짐)로 구성된다 (Duffort, O. A., et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 301-309; Morgenstern, J. P., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9690-9694; 및 Griffith, I. J., et al. (1992) Gene 113: 263-268 참조). Fel d1의 여러 재조합 구조물이 기술되어 왔다 (Vailes LD, et al., J. Allergy Clin. Immunol. (2002) 110: 757-762; Gronlund H, et al., J. Biol. Chem. (2003) 278: 40144-40151 (2003); Schmitz N, et al., J. Exp. Med. (2009) 206: 1941-1955; 국제특허출원 WO 2006/097530; WO 2017/042241).
따라서, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 rFel d1이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 rFel d1 단백질이고, 여기서 상기 Fel d1 단백질은 Fel d1의 사슬 1 및 Fel d1의 사슬 2를 포함하는 융합단백질이며, 상기 Fel d1의 사슬 2는 이의 C-말단에 의해 상기 Fel d1의 사슬 1의 N-말단에 대해 하나의 펩티드 결합을 통해 직접적으로 또는 스페이서를 통해 융합되고, 상기 스페이서는 1개 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열로 구성되고, 바람직하게 상기 스페이서는 10개 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 매우 바람직하게 상기 스페이서는 15개 아미노산 잔기의 아미노산 서열로 구성되고, 추가로 바람직하게 상기 스페이서는 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Fel d1 단백질이고, 여기서 상기 Fel d1 단백질은 Fel d1의 사슬 1 및 Fel d1의 사슬 2를 포함하는 융합단백질이며, 상기 Fel d1의 사슬 1은 이의 C-말단에 의해 상기 Fel d1의 사슬 2의 N-말단에 대해 하나의 펩티드 결합을 통해 직접적으로 또는 스페이서를 통해 융합되고, 상기 스페이서는 1개 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열로 구성되고, 바람직하게 상기 스페이서는 10개 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 바람직하게, 상기 Fel d1의 사슬 1은 서열번호 76의 서열 또는 이의 동종유래 서열을 포함하고, 상기 동종유래 서열은 서열번호 76과 90% 이상 또는 훨씬 더 바람직하게 95% 이상의 동일성을 갖는다. 추가로 바람직하게, 상기 Fel d1의 사슬 2는 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 79의 서열 또는 이들의 동종유래 서열을 포함하고, 상기 동종유래 서열은 서열번호 77, 서열번호 78 또는 서열번호 79와 90% 이상 또는 훨씬 더 바람직하게 95% 이상의 동일성을 갖는다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) 서열번호 38; (b) 서열번호 80; 또는 (c) 서열번호 81로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 Fel d1 단백질이다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 38을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 80을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 81을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Fel d1 단백질은 (a) 서열번호 38; (b) 서열번호 80; 또는 (c) 서열번호 81로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Fel d1 단백질은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Fel d1 단백질은 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 Fel d1 단백질은 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Fel d1 단백질이고, 상기 Fel d1 단백질은 (a) 서열번호 38; (b) 서열번호 80; (c) 서열번호 81로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 Fel d1 단백질은 서열번호 38을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Fel d1 단백질이고, 상기 Fel d1 단백질 서열번호 38을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 39로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알레르기, 바람직하게 고양이 알레르기를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Fel d1 단백질이고, 상기 Fel d1 단백질 서열번호 38을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되며,상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 바람직하게 이로 구성되며, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 39로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알레르기, 바람직하게 고양이 알레르기를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 종양 항원이고, 여기서 바람직하게 상기 종양 항원은 (a) 유방암 세포의 폴리펩티드; (b) 신장암 세포의 폴리펩티드; (c) 전립샘암 세포의 폴리펩티드; (d) 피부암 세포의 폴리펩티드; (e) 뇌암 세포의 폴리펩티드; 및 (f) 백혈병 세포의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) Her2; (b) 갱글리오시드 GD2; (c) EGF-R; (d) 암배아 항원 (CEA); (e) CD52; (f) CD21; (g) 인간 흑색종 gp100; (h) 인간 흑색종 멜란 A/MART-1; (i) 인간 흑색종 멜란 A/MART-1 유사체; (j) 티로시나제; (k) NA17-A nt; (1) MAGE3; (m) p53 단백질; 및 (n) (a) 내지 (m) 중 임의의 종양 항원의 항원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 항원이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) IgE, (b) IL-6 (c) 핵인자 kB 리간드 (RANKL)의 수용체 활성인자; (d) 혈관 내피 성장인자 (VEGF); (e) 혈관 내피 성장인자 수용체 (VEGF-R); 간세포 성장인자 (HGF) (f) 인터류킨-1α; (g) 인터류킨-1β; (h) 인터류킨-5; (i) 인터류킨-8; (j) 인터류킨-13; (k) 인터류킨-15; (1) 인터류킨-17 (IL-17); (m) IL-23; (n) 그렐린; (o) 안지오텐신; (p) 케모카인 (C-C 모티브) (CCL21); (q) 케모카인 (C-X 모티브) (CXCL 12); (r) 간질세포 유래 인자 1 (SDF-I); (s) 대식구 콜로니 자극인자 (M-CSF); (t) 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-I); (u) 엔도그린; (v) 레지스틴; (w) 고나도트로핀 방출 호르몬 (GnRH); (x) 성장호르몬 방출 호르몬 (GHRH); (y) 황체 호르몬 방출 호르몬 (LHRH); (z) 타이레오트로핀 방출 호르몬 (TRH); (aa) 대식구 이동 억제인자 (MIF); (bb) 포도당 의존성 인슐린자극 펩티드 (GIP); (cc) 에오탁신; (dd) 브래디키닌; (ee) Des-Arg 브래디키닌; (ff) B-림프구 화학유인제 (BLC); (gg) 대식구 콜로니 자극인자 M-CSF; (hh) 종양 괴사인자 α (TNFα); (ii) 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβl-42); (jj) 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβ3-6); (kk) 인간 IgE; (ii) CCR5 세포외 도메인; (mm) CXCR4 세포외 도메인; (nn) 가스트린; (oo) CETP; (pp) C5a; (qq) 표피 성장인자 수용체 (EGF-R); (rr) CGRP; (ss) α-신뉴클레인; (tt) 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) (uu) 아밀린; (vv) 미오스타틴; (ww) 인터류킨-4; (xx) 흉선 간질 림포포이에틴; (yy) 인터류킨-33; (zz) 인터류킨-25; (aaa) 인터류킨-13 또는 (bbb) 폴리펩티드 (a) 내지 (aaa) 중 어느 하나의 단편; 및 (ccc) 폴리펩티드 (a) 내지 (aaa) 중 어느 하나의 항원성 돌연변이체 또는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 자가 항원이고, 여기서 자가 항원은 (a) IgE, (b) IL-6 (c) 핵인자 kB 리간드 (RANKL)의 수용체 활성인자; (d) 혈관 내피 성장인자 (VEGF); (e) 혈관 내피 성장인자 수용체 (VEGF-R); 간세포 성장인자 (HGF) (f) 인터류킨-1α; (g) 인터류킨-1β; (h) 인터류킨-5; (i) 인터류킨-8; (j) 인터류킨-13; (k) 인터류킨-15; (1) 인터류킨-17 (IL-17); (m) IL-23; (n) 그렐린; (o) 안지오텐신; (p) 케모카인 (C-C 모티브) (CCL21); (q) 케모카인 (C-X 모티브) (CXCL 12); (r) 간질세포 유래 인자 1 (SDF-I); (s) 대식구 콜로니 자극인자 (M-CSF); (t) 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-I); (u) 엔도그린; (v) 레지스틴; (w) 고나도트로핀 방출 호르몬 (GnRH); (x) 성장호르몬 방출 호르몬 (GHRH); (y) 황체 호르몬 방출 호르몬 (LHRH); (z) 타이레오트로핀 방출 호르몬 (TRH); (aa) 대식구 이동 억제인자 (MIF); (bb) 포도당 의존성 인슐린자극 펩티드 (GIP); (cc) 에오탁신; (dd) 브래디키닌; (ee) Des-Arg 브래디키닌; (ff) B-림프구 화학유인제 (BLC); (gg) 대식구 콜로니 자극인자 M-CSF; (hh) 종양 괴사인자 α (TNFα); (ii) 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβl-42); (jj) 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβ3-6); (kk) 인간 IgE; (ii) CCR5 세포외 도메인; (mm) CXCR4 세포외 도메인; (nn) 가스트린; (oo) CETP; (pp) C5a; (qq) 표피 성장인자 수용체 (EGF-R); (rr) CGRP; (ss) α-신뉴클레인; (tt) 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 (CGRP) (uu) 아밀린; (vv) 미오스타틴; (ww) 인터류킨-4; (xx) 흉선 간질 림포포이에틴; (yy) 인터류킨-33; (zz) 인터류킨-25; (aaa) 인터류킨-13 또는 (bbb) 폴리펩티드 (a) 내지 (aaa) 중 어느 하나의 단편; 및 (ccc) 폴리펩티드 (a) 내지 (aaa) 중 어느 하나의 항원성 돌연변이체 또는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다.
바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 인터류킨 17 (IL-17), 바람직하게 인간 IL-17이다. 인터류킨 17은 넓은 범위의 세포 유형에서 전-염증성 매개인자의 방출을 유도하는 T 세포 유래한 사이토카인이다. 비정상 Th17 반응 및 IL-17의 과다발현은 류마티스 관절염 및 다발성 경화증을 포함하는 많은 자가면역 장애에 연루되어 왔다. IL-17 특이적 단일클론 항체와 같은 IL-17을 차단하는 분자는 동물 모델에서 질환을 개선하는데 효과적인 것으로 입증되었다. 더우기, 최근 들어 재조합 IL-17과 컨쥬게이션된 바이러스-유사 입자를 사용하여 IL-17을 표적하는 활성을 갖는 면역화가 제안되었다 (Rohn TA, et al., Eur. J. Immunol. (2006), 36: 1-11). IL-17 VLP로의 면역화는 높은 수준의 항-IL-17 항체를 유도하여, 추가된 아쥬반트가 없이도 자연적인 내성을 극복하였다. IL-17 VLP로 면역화된 마우스는 콜라겐 유도성 관절염 및 실험적인 자가면역 뇌척수염 둘 다에서 질환의 더 낮은 발병율, 질환으로 더 느린 진행 및 질환 중증도 점수의 감소를 보여주었다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 82를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또한, 본 발명의 변형된 CMV VLP는 동물 또는 인간에서 염증성 질환, 바람직하게 만성 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용된다. 바람직하게, 상기 염증성 질환은 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염)으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게 상기 염증성 질환은 MS이고, 추가로 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 82를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-15, 바람직하게 인간 IL-15이다. 또한, 추가의 바람직한 구현예에서 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 83을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또한, 본 발명의 변형된 VLP는 동물 또는 인간에서 염증성 질환, 바람직하게 만성 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용된다. 바람직하게, 상기 염증성 질환은 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염)으로부터 선택되고, 추가로 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 83을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-5이다. 또한, 추가의 바람직한 구현예에서 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 84 또는 서열번호 84와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 84를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 84로 구성된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-5이다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 85, 서열번호 125, 서열번호 141 또는 서열번호 85, 서열번호 125, 서열번호 141과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가로 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 85, 서열번호 125, 서열번호 141을 포함한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 85, 서열번호 125, 서열번호 141로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 85 또는 서열번호 85와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 125 또는 서열번호 125와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 85를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 85로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 125를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 125로 구성된다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) 서열번호 85; (b) 서열번호 125; (c) 서열번호 141로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 125을 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 125를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 128, 서열번호 132 또는 서열번호 139로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 132로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 동물 또는 인간에서 염증성 질환, 바람직하게 만성 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다. 바람직하게, 상기 염증성 질환은 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염)으로부터 선택된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 적어도 하나의 CMV 단백질을 추가로 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMA 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 125를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질을 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 128로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 132로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 동물 또는 인간에서 염증성 질환, 바람직하게 만성 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다. 바람직하게, 상기 염증성 질환은 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염)으로부터 선택된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-4, 바람직하게 인간 IL-4이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 86을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 86으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-4이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 87 또는 서열번호 87과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 87을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 87로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-4이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 88 또는 서열번호 88과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 88을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 88을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 88로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-13, 바람직하게 인간 IL-13이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 89를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 89로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-13이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 90 또는 서열번호 90과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 90을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 90으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-13이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 91 또는 서열번호 91과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 91을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 91로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 말 IL-13이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 92 또는 서열번호 92와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 92를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 92로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 TNFα이다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 TNFα, 바람직하게 인간 TNFα이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 93을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 93으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 TNFα이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 94 또는 서열번호 94와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 94를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 94로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 TNFα이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 95 또는 서열번호 95와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 95를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 95로 구성된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 말 TNFα이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 96 또는 서열번호 96과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 96을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 96으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-33, 바람직하게 인간 IL-33이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 97을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 97로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-33이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 98 또는 서열번호 98과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 98을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 98로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-33이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 99 또는 서열번호 99와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 99를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 99로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 말 IL-33이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 100 또는 서열번호 100과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 100을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 100으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-25, 바람직하게 인간 IL-25이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 101을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 101로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-25이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 102 또는 서열번호 102와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 102를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 102로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-25이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 103 또는 서열번호 103과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 103을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 103으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 말 IL-25이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 104 또는 서열번호 104와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 104를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 104로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-1β, 바람직하게 인간 IL-1β이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 105를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-1β이다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134, 서열번호 143, 서열번호 144 또는 서열번호 134, 서열번호 143, 서열번호 144와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134, 서열번호 143, 서열번호 144를 포함한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134, 서열번호 143, 서열번호 144로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134 또는 서열번호 134와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 92%, 더욱 바람직하게 적어도 95%, 더욱 더 바람직하게 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 135를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 135로 구성된다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 (a) 서열번호 134; (b) 서열번호 143; (c) 서열번호 144로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 135로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 동물 또는 인간에서 염증성 질환, 바람직하게 만성 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다. 바람직하게, 상기 염증성 질환은 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염)으로부터 선택된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 적어도 하나의 CMV 단백질을 추가로 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMA 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 134를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질, 바람직하게 서열번호 62를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 135로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 132로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 염증성 질환을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-1β이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 145를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IL-31, 바람직하게 인간 IL-31이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 106을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 106로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 IL-31이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 107 또는 서열번호 107과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 107을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 107로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 IL-31이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 108 또는 서열번호 108과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 108을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 108로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 말 IL-31이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 109 또는 서열번호 109와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 109를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 109로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 흉선 간질 림포포이에틴 (TLSP), 바람직하게 인간 흉선 간질 림포포이에틴 (TLSP)이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 110을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 110으로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 개 TLSP이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 111 또는 서열번호 111과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 111을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 111로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 고양이 TLSP이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 112 또는 서열번호 112와 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 112를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 112로 구성된다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 말 TLSP이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 113 또는 서열번호 113과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 113을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 113으로 구성된다.
또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 IgE 또는 IgE에 포함된 펩티드 또는 도메인이다.
또한, 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-42 (서열번호 114)부터의 펩티드 유래한 N-말단, 구체적으로 많아야 7개 연속적인 아미노산의 길이의 Aβ-1-42 (서열번호 114)의 단편, 바람직하게 많아야 6개 연속적인 아미노산의 길이의 Aβ-1-42 (서열번호 114)의 단편이다.
따라서, 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-6 (서열번호 1), Aβ-1-7 (서열번호 2), Aβ-3-6 (서열번호 3), Aβ-1-5 (서열번호 4), Aβ-2-6 (서열번호 115) 또는 Aβ-3-7 (서열번호 116)로부터 선택된다. 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-6 (서열번호 1)이다. 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-7 (서열번호 2)이다. 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-3-6 (서열번호 3)이다. 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-5 (서열번호 4)이다. 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-2-6 (서열번호 115)이다. 추가의 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-3-7 (서열번호 116)이다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-6 (서열번호 1)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-6 (서열번호 1)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 6으로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-7 (서열번호 2)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-7 (서열번호 2)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 7로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-3-6 (서열번호 3)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-3-6 (서열번호 3)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 8로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-5 (서열번호 4)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 Aβ-1-5 (서열번호 4)이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 9로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 α-신뉴클레인 또는 α-신뉴클레인으로부터 유래한 펩티드이고, 바람직하게 상기 펩티드는 6개 내지 14개의 아미노산으로 구성되고, 추가로 바람직하게 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52 중 어느 하나로부터 선택된 α-신뉴클레인으로부터 유래한 펩티드이다. 추가의 α-신뉴클레인으로부터 유래한 바람직한 펩티드는 본원에 참고문헌으로 통합되는, 국제특허출원 WO 2011/020133에 개시되어 있다.
다수의 생리학적 및 병리학적 기능을 갖는 작은 단백질인 알파-신뉴클레인 (α-Syn)은 파킨슨병 (PD)를 포함하는 루이체 장애의 병리학적 표식인 루이체에서 발견되는 지배적인 단백질 중 하나이다. 더욱 최근 들어, α-Syn은 혈액 및 뇌척수액을 포함한 체액에서 발견되어 왔으며, 말단 조직 및 중앙신경계 둘 다에 의해 생산되는 것 같다. 뇌 및 말단 조직 간의 α-Syn의 교환은 중요한 병리생리학적 및 치료적 의미를 갖을 수 있다 (Gardai S.J. et al., PLoS ONE (2013) 8(8): e71634). 파킨슨병 (PD)의 병리기전에서 알파-뉴클레인 (α-Syn)이 관여하는 증거는 넘쳐난다. 그러나, α-Syn이 PD 및 기타 신뉴클레인 병증에서 병리학을 유도하는 방식에 관한 분명한 합의는 없다.
알파-신뉴클레인은 루이체 (LB)의 주요 구성성분이고, 응집을 유도하는 α-Syn 과다발현은 많이 기술되어 있다. 인간 유전적 데이타는 α-Syn 유전자의 미스센스 돌연변이 및 복제가 가족성 PD를 유발하는 것을 입증하였다. 유전자 복제의 경우에, α-Syn 단백질의 수준 증가는 병리학을 유도하는 지배적인 기능 획득을 생성하는 것으로 추측된다. α-Syn 수준의 증가가 응집 및 독성을 유도할 수 있는 반면, 지난 수년에 걸친 연구도 상승된 α-Syn가 소포체 풀의 생성, 국소화 및/또는 유지에 개입할 수 있음을 보여주었다 (Gardai S.J. et al., PLoS ONE (2013), 8(8): e71634; 및 본원에 인용된 참고문헌).
따라서, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 117으로부터 선택된 서열 중 어느 하나로부터 선택된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 49이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 50이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 51이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 117이다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 49이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 49이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 52로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 질환, 장애 또는 생리학적 병태를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 루이체 장애로부터 선택되고, 바람직하게 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 파킨슨병인, 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 50이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 50이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 53으로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 질환, 장애 또는 생리학적 병태를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 루이체 장애로부터 선택되고, 바람직하게 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 파킨슨병인, 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 51이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 51이고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 54로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 질환, 장애 또는 생리학적 병태를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 루이체 장애로부터 선택되고, 바람직하게 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 파킨슨병인, 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 아밀린이다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 안지오텐신 I 또는 안지오텐신 I로부터 유래한 펩티드이다. 또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 안지오텐신 Ⅱ 또는 안지오텐신 Ⅱ로부터 유래한 펩티드이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 GnRH이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 에오탁신이다.
또 다른 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 미오스타틴, 바람직하게 소 미오스타틴이다. 또한, 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 118 또는 서열번호 118과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 118을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 118로 구성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 기생충의 폴리펩티드이고, 바람직하게 상기 병원체는 (a) 톡소플라즈마 종 (Toxoplasma spp.); (b) 플라스모듐 팔리파룸 (Plasmodium falciparum); (c) 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax); (d) 플라스모듐 오발 (Plasmodium ovale); (e) 플라스모듐 말라리애 (Plasmodium malariae); (f) 리슈마니아 (Leishmania); (g) 흡충 (Schistosoma) 및 (h) 선충으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 항원성 폴리펩티드는 플라스모듐 팔시파룸 또는 플라스모듐 비박스 (서열번호 119)로부터 유래한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 플라스모듐 팔시파룸으로부터 유래한다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 플라스모듐 팔시파룸으로부터 유래한 항원성 폴리펩티드는 서열번호 44를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62; 또는 서열번호 62와 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 플라스모듐 팔시파룸으로부터 유래하고, 바람직하게 상기 플라스모듐 팔시파룸으로부터 유래한 항원성 폴리펩티드는 서열번호 44를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65, 더욱 바람직하게 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 여기서 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 44를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 말라리아를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하고, 적어도 하나의 CMV 단백질을 추가로 포함하고, 여기서 상기 적어도 하나의 융합 단백질은 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되고, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 (i) CMV 폴리펩티드, (ii) 항원성 폴리펩티드 및 (iii) T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 항원성 폴리펩티드는 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입은 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있으며, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 44를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질, 바람직하게 서열번호 62를 포함하고, 바람직하게 이로 구성되고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 상기 CMV 단백질의 N-말단 영역을 대체하고, 상기 CMV 단백질의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하고, 바람직하게 상기 T 헬퍼 세포 에피토프는 서열번호 64를 포함하고, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 46으로 구성되고, 상기 CMv 단백질은 서열번호 5로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구현예 및 이의 양태에서, 본 발명은 말라리아를 치료하는 방법에 사용되는 상기 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 박테리아의 폴리펩티드이고, 여기서 상기 박테리아는 (a) 클라미디아 (Chlamydia); (b) 스트렙토코커스 (Streptocmocccus); (c) 뉴모코커스 (Pneumococcus); (d) 스태필로코커스 (Staphylococcus); (e) 살모넬라 (Salmonella); (f) 마이코박테리아 (Mycobacteria); (g) 클로스트리디아 (Clostridia); (h) 비브리오 (Vibrio); (i) 예르시니아 (Yersinia); (k) 메닌고코커스 (Meningococcus); (l) 보렐리아 (Borelia)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 바이러스 항원이고, 바람직하게 상기 바이러스 항원은 (a) HIV 및 기타 레트로바이러스; (b) 인플루엔자 바이러스, 바람직하게 인플루엔자 A형 M2 세포외 도메인 또는 HA 또는 HA 구형 도메인; (c) B형 간염 바이러스의 폴리펩티드, 바람직하게 프리Sl; (d) C형 간염 바이러스; (e) HPV, 바람직하게 HPV16E7; (f) RSV; (g) SARS 및 기타 코로나바이러스; (h) 뎅기 및 기타 플래비바이러스, 예컨대 웨스트나일 바이러스 및 손발과 입병 바이러스; (i) 치쿤군야 및 기타 알파바이러스; (k) CMV 및 기타 헤르페스바이러스; (l) 로타바이러스로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 RSV로부터 유래한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 뎅기 바이러스로부터 유래한다.
바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 A형 바이러스 M2 단백질 또는 이의 항원성 단편이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 A형 M2 단백질의 세포외 도메인을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고, 바람직하게 상기 인플루엔자 A형 M2 단백질의 세포외 도메인은 서열번호 120이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 항원성 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 구형 도메인이다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 29, 서열번호 39, 서열번호 46, 서열번호 52, 서열번호 53 또는 서열번호 54로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 상기 변형된 VLP는 적어도 하나의 면역자극성 물질을 추가로 포함한다. 매우 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 본 발명의 변형된 VLP 내에 포장된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 본 발명의 변형된 VLP와 혼합된다. 본 발명에 유용한 면역자극성 물질은 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있고, 특히 국제특허출원 WO 2003/024481A2에 개시된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 비-진핵세포 기원의 DNA 또는 RNA로 구성된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 (a) 면역자극성 핵산; (b) 펩티도글리칸; (c) 지질다당류; (d) 리포테이콘산; (e) 이미다조퀴놀린 화합물; (f) 플라젤린; (g) 지질단백질 및 (h) (a) 내지 (g) 중 적어도 하나의 물질의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 면역자극성 핵산이고, 상기 면역자극성 핵산은 (a) 리보핵산; (b) 데옥시리보핵산; (c) 키메라 핵산; (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 핵산은 리보핵산이고, 상기 리보핵산은 박테리아 유래한 RNA이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 핵산은 폴리(IC) 또는 이의 유도체이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 핵산은 데옥시리보핵산이고, 상기 데옥시리보핵산은 메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.
매우 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드는 A형 CpG이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 A형 CpG는 팰린드롬 서열을 포함한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 팰린드롬 서열은 구아노신 실체가 이의 5' 말단 및 이의 3' 말단에 인접한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 팰린드롬 서열은 적어도 3개 및 많아야 15개의 구아노신 실체가 이의 5' 말단에 인접하고, 상기 팰린드롬 서열은 적어도 3개 및 많아야 15개의 구아노신 실체가 이의 3' 말단에 인접한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 면역자극성 물질은 메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 바람직하게 상기 메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드 팰린드롬 서열을 포함하고, 추가로 바람직하게 상기 메틸화되지 않은 CpG 포함하는 올리고뉴클레오티드의 CpG 모티브는 팰린드롬 서열의 일부이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용되는 본 발명의 변형된 바이러스-유사 입자를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 바이러스-유사 입자를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 백신을 제공한다. 상기 변형된 VLP가 본원에 개시된 기술적인 특징 중 어느 하나를 단독으로 또는 임의의 가능한 조합으로 포함하는 백신을 포괄한다. 일 구현예에서, 백신은 아쥬반트를 추가로 포함한다 추가의 구현예에서, 백신은 아쥬반트가 없다. 바람직한 구현예에서, 상기 백신은 본 발명의 조성물의 유효량을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 변형된 VLP 또는 본 발명의 백신; 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 희석제는 멸균 수용성 (예로, 생리학적 식염수) 또는 비-수용성 용액 및 현탁액을 포함한다. 비-수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 담체 또는 밀봉 드레싱은 피부 투과성을 증가시키고, 항원 흡수를 증진하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 염, 완충액, 아쥬반트 또는 컨쥬게이트의 효능을 개선하는데 바람직한 기타 물질을 포함하는 형태일 수 있다. 약제학적 조성물의 제조에 사용하는데 적합한 물질의 예는 레밍턴의 약제학적 과학 (Remington's Pharmaceutical Science, Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))을 포함하는 수많은 출처에서 제공된다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 백신의 유효량을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 변형된 VLP, 본 발명의 백신 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 면역화 방법이다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 본 발명의 백신 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 질환, 장애 또는 생리학적 병태를 동물에서 치료하거나, 예방하는 방법으로서, 본 발명의 변형된 VLP, 본 발명의 백신 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 것을 포함하고, 바람직하게 상기 동물은 인간일 수 있는, 방법이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 변형된 VLP, 백신 또는 약제학적 조성물은 상기 동물에게 피하, 정맥내, 피부내, 비강내, 경구, 결절내 또는 경피로 투여된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 알레르기, 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염), 알츠하이머병, 파킨슨병, 인플루엔자 A형 바이러스 감염, 말라리아, RSV 감염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 염증성 질환이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 RA, MS, 건선, 천식, 크론병, 장염, COPD, 당뇨병, 신경피부염 (알레르기성 피부염)으로부터 선택된 염증성 질환이다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 감염성 질환이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 인플루엔자 A형 바이러스 감염, 말라리아, RSV 감염으로부터 선택된다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 말라리아이다.
추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 알츠하이머병 또는 파킨슨병이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 알츠하이머병이다. 추가의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 생리학적 병태는 파킨슨병이다.
실시예
실시예 1
CMV-Abeta-키메라 CMV 폴리펩티드를 생성하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 외피 단백질 내에 Abeta1-42 단편의 클로닝
본 발명에 따른 CMV-Abeta-키메라 CMV 폴리펩티드를 Abeta1-6 (서열번호 1), Abeta1-7 (서열번호 2), Abeta3-6 (서열번호 3) 및 Abeta1-5 (서열번호 4)를 포함하도록 준비하였다.
이들 Abeta 펩티드를 파상풍 독소로부터 유래한 T 헬퍼 세포 에피토프를 포함하는 매우 바람직한 변형된 CMV 외피 단백질인 CMV-Ntt830 (서열번호 5)의 아미노산 잔기 Ser(88) 및 Tyr(89) 사이에 삽입하였다. 본 발명에 따른 이들 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
"CMV-Ntt830-Ab16"의 아미노산 서열: 서열번호 6;
"CMV-Ntt830-Ab17"의 아미노산 서열: 서열번호 7;
"CMV-Ntt830-Ab36"의 아미노산 서열: 서열번호 8;
"CMV-Ntt830-Ab15"의 아미노산 서열: 서열번호 9.
이들 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 둘 다의 말단에서 도입된 Abeta 펩티드를 인접하는 글리신-세린 링커를 추가로 포함한다. 서열번호 6 내지 서열번호 9의 모든 바람직한 융합 단백질은 GGGS 링커 (서열번호 10)를 도입된 Abeta 펩티드의 N-말단에 그리고 GGGSGS 링커 (서열번호 11)를 도입된 Abeta 펩티드의 C-말단에 직접적으로 포함한다.
상기 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
"CMV-Ntt830-Ab16"의 핵산 서열: 서열번호 12;
"CMV-Ntt830-Ab17"의 핵산 서열: 서열번호 13;
"CMV-Ntt830-Ab36"의 핵산 서열: 서열번호 14;
"CMV-Ntt830-Ab15"의 핵산 서열: 서열번호 15.
CMV-Ntt830의 상응하는 CMA DNA 서열에서 Abeta 펩티드 또는 다른 항원성 폴리펩티드 코딩하는 DNA 서열의 도입을 위해, BamHI 부위 포함하는 서열을 후속적 클로닝을 위해 상응하는 위치에 도입하였다. CMV-Ntt830 코딩하는 핵산 서열은 국제특허출원 WO 2016/062720A1의 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조되었으며, 국제특허출원의 서열번호 14에 해당한다.
BamHI 부위는 하기에 열거된 올리고뉴클레오티드 및 주형으로서 이전에 제작된 pET-CMV-Ntt830를 사용한 두 단계 PCR 돌연변이 생성기전에 의해 도입하였다. 주형 pET-CMV-Ntt830를 국제특허출원 WO 2016/062720A1의 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다.
제 1 PCR: 정방향 - pET-90 프라이머 (pET28a+에 아닐링함) (서열번호 16)
역방향 - RGSYrev (서열번호 17)
제 2 PCR 정방향 - RGSYdir (서열번호 18)
역방향- CMV-AgeR (서열번호 19)
PCR 산물 둘 다의 정제 이후에, 후속 PCR을 수행하여 PCR 단편을 연결하였다 (프라이머 없이 5회 주기, 다음으로 프라이머 pET-90 및 CMV-AgeR를 사용한 25회 주기).
유전자의 증폭 이후에, 획득된 PCR 산물을 pTZ57R/T 벡터 (인스타클론 PCR 클로닝 키트, 퍼멘타스사 #K1214) 내에 직접적으로 클로닝하였다. 대장균 XL1-Blue 세포를 클로닝 및 플라스미드 증폭을 위한 숙주로서 사용하였다.
RT-PCR 오류를 피하기 위하여, 다수의 CMV-Ntt830 유전자 포함하는 pTZ57 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, 서열 오류가 없는 도입된 BamHI 부위와 함께 CMV-Ntt830B 유전자를 포함하는 pTZ 플라스미드를 NcoI 및 AgeI 효소로 절단하였다. 다음으로, 이 단편을 pET-CMV-Ntt830의 NcoI/AgeI 부위 내에 서브클로닝하여, 헬퍼 벡터 pET-CMV-Ntt830B를 생성하였다.
아밀로이드-(베타) 펩티드를 코딩하는 DNA의 도입을 위해, 다음의 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응에 사용하였다 (모든 PCR의 주형이 pET-CMV-Ntt830이었음):
제 1 PCR: 정방향 - C-Ab15 (서열번호 20)
역방향 - CMcpR (서열번호 21)
제 2 PCR: 정방향 - C-Ab16 (서열번호 22)
역방향 - CMcpR (서열번호 21)
제 3 PCR: 정방향 - C-Ab17 (서열번호 23)
역방향 - CMcpR (서열번호 21)
제 4 PCR: 정방향 - C-Ab36 (서열번호 24)
역방향 - CMcpR (서열번호 21)
모든 PCR 단편을 pTZ57R/T 벡터 내에 직접적으로 라이게이션하였고, 상응하는 삽입물 포함하는 플라스미드 클론을 대장균 XL1 세포의 형질전환 이후에 단리하였다. PCR 산물 DNA를 포함하는 다수의 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, Ab 포함하는 CMV 3' 말단 단편을 BamHI 및 HindⅢ 제한효소 부위를 사용하여 pET-CMV-Ntt830B 헬퍼 벡터 내에 라이게이션하였다.
또한, 플라스미드 클론 pET-CMV-Ntt830B-Ab15, pET-CMV-Ntt830B-Ab16, pET-CMV-Ntt830B-Ab17 및 pET-CMV-Ntt830B-Ab36을 대장균 C2566 세포의 형질전환에 사용하였다. pET-CMV-Ntt830B-Ab36의 플라스미드 맵을 예시적으로 도 1에 나타낸다.
실시예 2
CMV-Abeta VLP를 생성하는 CMV-Abeta-키메라 CMV 폴리펩티드의 발현
CMV-Abeta VLP, 즉 CMV-Ntt830-Ab16 VLP, CMV-Ntt830-Ab17 VLP, CMV-Ntt830-Ab36 VLP 또는 CMV-Ntt830-Ab15 VLP의 단리를 위해, 대장균 C2566 (뉴잉글랜드 바이오랩사, USA) 적격한 세포를 상응하는 플라스미드 pET-CMV-Ntt830-Ab15, pET-CMV-Ntt830-Ab16, pET-CMV-Ntt830-Ab17 및 pET-CMV-Ntt830-Ab36로 형질전환하였다.
표적 단백질의 가장 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별한 이후, 대장균 배양액을 카나마이신 (25 mg/L)을 포함하는 2TY (트립톤 1.6%, 효모 추출물 1%, 0.5% NaCl, 0.1% 포도당) 배지에 회전 진탕기로 30℃에서 0.8 내지 1.0의 OD(600) 값까지 성장시켰다. 다음으로, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 배양을 회전 진탕기로 20℃에서 18시간 동안 계속하였다. 생성된 바이오매스를 저속 원심분리법에 의해 수집하였고, -20℃에 냉동하였다.
CMV-Abeta VLP의 정제는 다음의 단계를 포함한다:
1) 3 g 바이오매스를 20 mL의 50 mM Na 시트레이트, 5 mM Na 보레이트, 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, pH 9.0에 현탁하고, 현탁액을 초음파 (Hielscher 초음파 파쇄기 UP200S, 16분, 진폭 70%, 0.5 주기)로 처리하고;
2) 용출물을 +4℃에서 20분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하고;
3) 슈크로스 구배 (20% 내지 60%)를 35 mL 튜브에 50 mM Na 시트레이트, 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, 0.5% TX-100를 포함하는 완충액을 넣어 준비하고;
4) 슈크로스 구배 위에 5 mL의 VLP 시료를 중충하고;
5) SW32 회전기, 벡크만사 (25000 rpm, +18℃)를 사용하여 6시간 동안 원심분리하고;
6) 각 구배 튜브의 내용물을 6 mL 분획으로 분할하고, 분획에 상응하는 풀을 만들고;
7) SDS-PAGE 상에서 구배 분획을 분석하고 (도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d);
8) SDS-PAGE 분석이 제 3 슈크로스 구배 분획에서 VLP의 존재를 제시하고, 24 mL의 제 3 분획을 24 mL의 완충액 (5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0)으로 희석하고;
9) VLP를 회전기 타입 70 (벡크만 옵티마사, L100XP 원심분리기; 50,000 rpm, 5℃, 4시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
10) 펠렛을 3 mL의 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0에 용해시키고;
11) VLP 현탁액을 20% 슈크로스 "쿠션" (5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0 완충액 중)의 최상단 위에 중충하고;
12) VLP를 회전기 TLA100.3 (벡크만사; 72,000rpm, 5℃, 1시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
13) 펠렛을 2 mL의 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0에 4℃에서 ON 상태로 용해시키고;
14) VLP를 EM 하에 분석한다 (도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d).
도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 4가지 CMV-Abeta VLP가 대장균 세포에서 성공적으로 발현될 수 있고, 획득된 유의한 부분은 가용성 분획에 있을 수 있다. 또한, 이들 단백질은 슈크로스 구배 분석 (도 2a 내지 도 2d) 및 전자현미경 분석 (도 3a 내지 도 3d)에 의해 입증된 바와 같이, 대장균 세포 추출물에서 등척성 VLP의 형태로 직접적으로 관찰된다.
실시예 3
아두카누맙의 가변 영역 서열을 갖는 단일클론 항체는 CMV-Abeta VLP를 인식한다.
ELISA 플레이트를 Aβ1-42, CMV-Ntt830-Ab36 VLP 또는 CMV-Ntt830 VLP으로 코팅하고, 아두카누맙의 서열을 나타내는 가변 영역와 재조합 항체의 결합을 ELISA에 의해 시험하였다.
ELISA:
ELISA 플레이트 (Nunc Immuno MaxiSorp, Rochester, NY)를 100 μL의 PBS, pH 7.4 중 Aβ1-42, CMV-Ntt830-Ab36 VLP 또는 CMV-Ntt830 VLP (1 μg/mL)과 함께 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비특이적인 결합을 피하기 위하여, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST 중 2% BSA로 차단시키고, RT에서 2시간 동안 배양하였다. 아두카누맙의 가변 영역 서열을 갖는 단일클론 항체를 발현하는 세포의 상청액을 코팅된 플레이트 위에 트랜스퍼하였다. RT에서 2시간 배양 이후에, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST로 5회 세척하였다. 혈청 항체의 결합을 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch)에 의해 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST에서 1 : 1,000으로 희석하고, 시료 당 100 μL 부피를 트랜스퍼하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다. ELISA 플레이트를 이전에 설명한 바와 같이 세척하였다. 세척하기 이전에, 기질 용액을 준비하였다. 마지막에, 1개 정제 (10 mg)의 OPD (1,2-페닐렌디아민 이염산화물) 및 9 μL의 30% H2O2을 25 mL 시트르산 완충액 (0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0)에 용해하였다. 100 μL 부피의 기질 용액을 플레이트 상에 피펫팅하고, 정확하게 RT에서 7분 동안 배양하였다. 반응을 종결하기 위하여, 50 μL의 정지 용액 (H2O 중 5% H2SO4)을 플레이트 상에 직접적으로 피펫팅하였다. 1,2-페닐렌디아민 이염산화물 색상 반응을 450 nm에서 흡광도 판독으로 분석하였다. 도 4는 CMV-Ntt830-Abeta VLP에 대한 아두카누맙의 가변 영역 서열을 갖는 단일클론 항체의 결합을 나타낸다.
실시예 4
CMV-Abeta VLP로 마우스의 면역화
4마리 암컷 Balb/c 마우스의 실험군을 CMV-Ntt830-Ab16 VLP, CMV-Ntt830-Ab17 VLP 또는 CMV-Ntt830-Ab36 VLP 중 어느 하나로 면역화하였다. VLP를 150 mM PBS, pH 7.4 및 150 μL로 제형화하고, 1일째 30 μg으로 정맥내 주사하였다. 마우스를 0일째 (면역화 전) 및 14일째 채혈하고, 혈청을 Abeta1-42 코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 분석하였다. CMV-Ntt830-Ab36 VLP에 의해 유도된 항체를 알츠하이머병 환자로부터 나온 뇌 절편 상에서 면역조직화학법에 의해 분석하였다.
ELISA:
마우스 혈청의 항체 반응을 표시된 시간에 분석하였다. Abeta1 내지 42 특이적 항체 역가를 결정하기 위해, ELISA 플레이트 (Nunc Immuno MaxiSorp, Rochester, NY)를 100 μL의 PBS, pH 7.4 중 Abeta1 내지 42 (1 μg/mL)와 함께 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비특이적인 결합을 피하기 위하여, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST 중 2% BSA로 차단시키고, RT에서 2시간 동안 배양하였다. 혈청 시료를 2% BSA/PBST로 희석하였다. 사전 희석된 혈청을 코팅된 플레이트 위에 트랜스퍼하고, OD50 계산을 기초로 하여 항체 역가를 획득하도록 추가로 일련 희석하였다. RT에서 2시간 배양 이후에, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST로 5회 세척하였다. 혈청 항체의 결합을 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch)에 의해 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST에서 1 : 1,000으로 희석하고, 시료 당 100 μL 부피를 트랜스퍼하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다. ELISA 플레이트를 이전에 설명한 바와 같이 세척하였다. 세척하기 이전에, 기질 용액을 준비하였다. 마지막에, 1개 정제 (10 mg)의 OPD (1,2-페닐렌디아민 이염산화물) 및 9 μL의 30% H2O2을 25 mL 시트르산 완충액 (0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0)에 용해하였다. 100 μL 부피의 기질 용액을 플레이트 상에 피펫팅하고, 정확하게 RT에서 7분 동안 배양하였다. 반응을 종결하기 위하여, 50 μL의 정지 용액 (H2O 중 5% H2SO4)을 플레이트 상에 직접적으로 피펫팅하였다. 1,2-페닐렌디아민 이염산화물 색상 반응을 450 nm에서 흡광도 판독으로 분석하였다. 도 5는 CMV-Ntt830-Ab16 VLP, CMV-Ntt830-Ab17 VLP 또는 CMV-Ntt830-Ab36 VLP에 특이적인 항체를 나타낸다.
면역조직화학법:
알츠하이머병 환자의 파라핀 포매된 뇌 (해마) 조직의 절편을 마이크로톰으로 준비하였다. 박절된 절편을 슬라이드 위에 올리고, 내인성 퍼옥시다제를 3% H2O2와 함께 5분 동안 배양하여 차단시켰다. 다음으로 슬라이드를 PBS-트윈, 이어서 PBS만으로 5분 동안 3회 세척하였다. 슬라이드를 PBS에 추가하여 귀리 혈청 3%, 카제인 0.5%, NaN3 0.1%로 RT에서 30분 동안 차단하였다. 슬라이드를 CMV-Ntt830-Ab36 VLP 면역화된 마우스로부터 나온 1 : 50 희석된 혈청과 함께 1시간 동안 배양하였다. 다음으로 슬라이드를 이차 항체 염소 항-마우스 IgG-HRP (#161) 1 : 1000과 함께 RT에서 2시간 동안 배양하고, PBS-트윈으로 3회, 이어서 PBS만으로 5회 5분 동안 세척하였다. 결합된 항체를 DAB 기질에 의해 (키트 abcam ab64238을 사용함) 시각화하고, 이어서 물로 세척하였다. 반대 염색을 헤마톡실린으로 30초 동안 수행하고, 이어서 물로 세척하였다. 도 5b는 CMV-Ntt830-Ab36 VLP에 의해 유도된 면역 혈청에 의한 플라크의 염색을 나타낸다.
실시예 5
Ara-h202를 포함하는 CMV의 변형된 외피 단백질의 클로닝
본 발명에 따른 단일 플라스미드 시스템으로부터 항원을 포함하는 모자이크 VLP를 획득하기 위하여, 제작 단계는 제 2 T7 프로모터 하에 pETDuet-1 (노바겐사)의 다중링커에서 CMV-Ntt830 유전자의 삽입이었다. 본원에서 CMV-Ntt830 핵산 서열은 국제특허출원 WO 2016/062720A1의 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조되고, 국제특허출원 WO 2016/062720A1의 서열번호 14에 해당한다. 클로닝을 위한 상응하는 제한효소 부위를 갖는 CMV 구조 유전자의 경우, 상기 CMV-Ntt830 유전자를 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 반응으로 증폭하였다:
정방향: CM-830NdeF (서열번호 25)
역방향: CM-cpR (서열번호 26)
유전자의 증폭 이후에, 상응하는 PCR 산물을 pTZ57R/T 벡터 (인스타클론 PCR 클로닝 키트, 퍼멘타스사 #K1214) 내에 직접적으로 클로닝하였다. 대장균 XL1-Blue 세포를 클로닝 및 플라스미드 증폭을 위한 숙주로서 사용하였다. RT-PCR 오류를 피하기 위하여, 다수의 CMV-Ntt830 유전자 포함하는 pTZ57 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, 서열 오류가 없는 CMV-Ntt830B 유전자를 포함하는 pTZ 플라스미드를 HindⅢ 효소로 절단하고, 클레노 효소 및 최종적으로 NdeI 제한효소로 처리하였다. 다음으로, 단편을 pETDuet-1의 NdeI/EcoRI 부위 내에 서브클로닝하여, 헬퍼 벡터 pETDu-CMV-Ntt830를 생성하였다.
CMV-Ntt830 핵산에서 Ara-h202 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 삽입을 위해, BamHI 부위 포함하는 15개 및 10개 아미노산 길이의 Gly-Ser 링커 코딩 서열을 도입하여 CMV-Ntt830의 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 상기 삽입을 생성하였다. Ara-h202 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 27에 기재된 바와 같은 반면, 상응하는 DNA 서열은 서열번호 28에 기재된 바와 같다.
본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 "CMV-Ntt830-Arah202"로서 지칭되고, 서열번호 29이다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 도입된 Ara-h202 단백질을 둘 다의 말단에 인접하는 글리신-세린 링커, 즉 직접적으로 도입된 Ara-h202 단백질의 N-말단에 15개 아미노산 길이의 GS 링커 (서열번호 30) 및 도입된 Ara-h202 단백질의 C-말단에 10개 아미노산 길이의 GS 링커 (서열번호 31)를 포함한다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-Arah202의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 32에 기재된다.
먼저, CMV-Ntt830 유전자 단편 및 Ara-h202 코딩 서열 ("시작" 및 "종결" 코돈이 없이 BamHI이 인접됨)을 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응으로 증폭하였다:
CMV 유전자 5' 말단의 제 1 PCR:
정방향: 830-NcoF (서열번호 33)
역방향: C-5xg4s-R (서열번호 34)
주형: 국제특허출원 WO 2016/062720A1의 실시예 3에 설명된 바와 같이 제조된 pET-CMV-Ntt830이 사용되었다.
CMV 유전자 3' 말단의 제 2 PCR:
정방향: C-5xg4s-F (서열번호 35)
역방향: CMcpR (서열번호 21)
Template: 국제특허출원 WO 2016/062720A1의 실시예 3에 설명된 바와 같이 제조된 pET-CMV-Ntt830이 사용되었다.
Arah202의 제 3 PCR:
정방향: Ara-BamF2 (서열번호 36)
역방향: Ara-BamR2 (서열번호 37)
주형: 국제특허출원 WO 2017/186808A1의 실시예 3에 설명된 바와 같이 제조된 pUCIDT 플라스미드의 유전자 합성된 Ara-h202 유전자.
PCR 단편 모두를 pTZ57R/T 벡터 내에 직접적으로 라이게이션하였고, 상응하는 삽입물 포함하는 플라스미드 클론을 대장균 XL1 세포의 형질전환 이후에 단리하였다. PCR 오류를 피하기 위하여, PCR 산물 DNA를 포함하는 다수의 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, CMV 3' 말단의 단편을 BamHI 및 HindⅢ 제한효소 부위에서 pTZ57-CMV-5-end 벡터 내에 라이게이션하였다. 그 결과, 헬퍼 플라스미드 pTZ-CMVB2를 획득하였고, 이는 Ara-h202 코딩 서열의 추가의 서브클로닝을 위한 GlySer 링커 및 BamHI 부위를 포함한다. 후속 단계로서, 부분적 BamHI 처리 이후의 Ara-h202 단편을 pTZ-CMVB2 BamHI 부위 내에 서브클로닝하였다. 정확한 배향으로 Ara-h202 삽입물을 포함하는 정확한 클론을 프라이머 Ara-BamF2 / CMcpR를 사용한 "콜로니 PCR" 반응에서 찾았다. 양성 PCR 신호를 갖는 플라스미드 클론을 다시 서열 결정하였다. pTZ-CMVB2-Ara-h202 플라스미드 클론의 서열 결정 결과는 CMV와 융합된 Ara-h202의 존재를 검증하였다.
발현 벡터를 제작하기 위하여, CMVB2-Arah202 삽입물을 NcoI 및 HindⅢ 효소를 사용하여 헬퍼 플라스미드로부터 절제하고, 제작된 헬퍼 벡터 pETDu-CMV-Ntt830 내에 서브클로닝하였다. 생성된 pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt의 플라스미드 맵은 도 6에 나타낸다.
실시예 6
CMV의 변형된 외피 단백질 및 내부에 융합된 Ara-h202를 포함하는 모자이크 입자의 발현(CMV-M-Arah202)
모자이크 CMV-Arah202 VLP의 단리를 위해, 대장균 C2566 (뉴잉글랜드 바이오랩사, USA) 적격한 세포를 상응하는 플라스미드 pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt로 형질전환하였다.
표적 단백질의 가장 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별한 이후, 대장균 배양액을 앰피실린 (100 mg/L)을 포함하는 2TY (트립톤 1.6%, 효모 추출물 1%, 0.5% NaCl, 0.1% 포도당) 배지에서 회전 진탕기로 30℃에서 0.8 내지 1.0의 OD(600) 값까지 성장시켰다. 다음으로, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 배양을 회전 진탕기로 20℃에서 18시간 동안 계속하였다. 생성된 바이오매스를 저속 원심분리법에 의해 수집하였고, -20℃에 냉동하였다. 바이오매스 결과 - 대략 12 g 습윤 바이오매스/1개 배양물, OD(600)이 배양의 종결 시 6.8이었다.
본 발명에 따른 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질 ("CMV-M-Arah202"로서 지칭되는 상기 모자이크 VLP)을 포함하는 모자이크 VLP의 정제는 다음의 단계를 포함한다:
1) 6 g 바이오매스를 20 mL의 50 mM Na 시트레이트, 5 mM Na 보레이트, 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, pH 9.0에 현탁하고, 현탁액을 초음파 (Hielscher 초음파 파쇄기 UP200S, 16분, 진폭 70%, 0.5 주기)로 처리하고;
2) 용출물을 +4℃에서 20분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고;
3) 슈크로스 구배 (20% 내지 60%)를 35 mL 튜브에 50 mM Na 시트레이트, 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, 0.5% TX-100를 포함하는 완충액을 넣어 준비하고;
4) 슈크로스 구배 위에 5 mL의 VLP 시료를 중충하고, 4개의 튜브를 준비하고;
5) SW32 회전기, 벡크만사 (25000 rpm, +18℃)를 사용하여 6시간 동안 원심분리하고;
6) 각 구배 튜브의 내용물을 6 mL 분획으로 분할하고, 분획에 상응하는 풀을 만들고;
7) SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 상에서 구배 분획을 분석하고 (도 7);
8) SDS-PAGE 분석이 제 2 슈크로스 구배 분획에서 모자이크 VLP의 존재를 제시하고, 24 mL의 제 3 분획을 24 mL의 완충액 (5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0)으로 희석하고;
9) VLP를 회전기 타입 70 (벡크만 옵티마사, L100XP 원심분리기; 50,000 rpm, 5℃, 4시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
10) 펠렛을 3 mL의 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0에 용해시키고;
11) VLP 현탁액을 20% 슈크로스 "쿠션" (5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0 완충액 중)의 최상단 위에 중충하고;
12) VLP를 회전기 TLA100.3 (벡크만사; 72,000rpm, 5℃, 1시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
13) 펠렛을 2 mL의 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0에 4℃에서 ON 상태로 용해시키고;
14) VLP를 SDS-PAGE 젤 상의 정제 이후에 (도 7), 뿐만 아니라 EM 하에 (도 8) 분석한다.
실시예 7
모자이크 입자 CMV-M-Arah202로 마우스의 면역화
3마리 암컷 Balb/c 마우스의 실험군을 CMV-Ntt830-Arah202 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질 (CMV-M-Arah202)를 포함하는 VLP 둘 중 하나로서 10 μg의 총 Arah202 또는 유리 형태로의 Arah202로 피하로 면역화하였다. VLP를 150 mM PBS, pH 7.4에 제형화하고, 150 μL의 부피에서의 10 μg을 피하로 주사하였다. 마우스를 면역화 이후 14일째 채혈하고, 모든 면역 혈청을 재조합 Arah202에 대한 ELISA에 의해 시험하였다.
ELISA:
마우스 혈청의 항체 반응을 표시된 시간에 분석하였다. Arah202 특이적 항체 역가를 결정하기 위해, ELISA 플레이트 (Nunc Immuno MaxiSorp, Rochester, NY)를 땅콩 추출물 (1 μg/mL)로부터 정제된 PBS 중 100 μL의 Arah202와 함께 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비특이적인 결합을 피하기 위하여, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST 중 2% BSA로 차단시키고, RT에서 2시간 동안 배양하였다. 혈청 시료를 2% BSA/PBST로 희석하였다. 사전 희석된 혈청을 코팅된 플레이트 위에 트랜스퍼하고, OD50 계산을 기초로 하여 항체 역가를 획득하도록 추가로 일련 희석하였다. RT에서 2시간 배양 이후에, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST로 5회 세척하였다. 혈청 항체의 결합을 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch)에 의해 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST에서 1 : 1,000으로 희석하고, 시료 당 100 μL 부피를 트랜스퍼하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다. ELISA 플레이트를 이전에 설명한 바와 같이 세척하였다. 세척하기 이전에, 기질 용액을 준비하였다. 마지막에, 1개 정제 (10 mg)의 OPD (1,2-페닐렌디아민 이염산화물) 및 9 μL의 30% H2O2을 25 mL 시트르산 완충액 (0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0)에 용해하였다. 100 μL 부피의 기질 용액을 플레이트 상에 피펫팅하고, 정확하게 RT에서 7분 동안 배양하였다. 반응을 종결하기 위하여, 50 μL의 정지 용액 (H2O 중 5% H2SO4)을 플레이트 상에 직접적으로 피펫팅하였다. 1,2-페닐렌디아민 이염산화물 색상 반응을 450 nm에서 흡광도 판독으로 분석하였다. 도 9는 Arah202에 특이적인 항체를 나타낸다.
Ara h202 IgG의 결정을 위해, 96-웰 눈크사 MaxisorpTM ELISA 플레이트 (써모피셔 사이언티픽사, Waltham, MA, USA)를 PBS 완충액 중 2 μg/mL Arah2로 4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS/0.15% 카제인 용액으로 2시간 동안 차단한 이후, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈으로 5회 세척하였다, 혈청의 일련 희석을 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다음으로 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 (PBST)으로 5회 세척하였다. 그런 다음에 HRP0-표지된 염소 항-마우스 IgG (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) 항체를 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. ELISA 결과를 TMB (3,30,5,50-테트라메틸-벤지딘) 및 H2O2로 현상하고, 1 mol/L 황산으로 정지시켰다. 광학 밀도를 450 nm에서 측정하였다. 최대-절반의 항체 역가는 포화 시 측정된 OD의 절반을 유도하는 희석의 역수로서 정의한다. 도 9는 Ara-h202에 특이적인 항체를 나타낸다.
실시예 8
CMV-M-Arah202로의 면역화는 아나필락시스 반응에 대해 보호한다.
민감화 및 백신접종
마우스를 200 μL 백반에 제형화된 땅콩 추출물의 복강내 주사에 의해 0일째 및 7일째 땅콩 알레르기원에 대해 면역화하였다. 다음으로 마우스를 대조군의 경우 (200 μL PBS 중 30 μg, 21일째) CMV-M-Arah202 또는 CMV-Ntt830 VLP로 백신접종하였다. 도 10a는 알레르기성 전신 및 국소 반응에 대한 CMV-M-Arah202로의 백신 접종의 보호 효과를 조사하는 실험적 설계를 나타낸다.
전신 및 국소 접종
접종을 민감화된 및 백신 접종된 Balb/c의 귀 위에 정맥내 땅콩 추출물 20 μg과 함께 또는 피부 단자 테스트 (180 μg/20 μL PBS)에 의해 수행하였다. 전신 및 국소 알레르기 반응을 체온 강하 (도 10b; 단순하게 CMV로서 약어화된 CMV-Ntt830 VLP) 또는 체액 조직 유출 (도트의 직경, 도 10c; 단순하게 CMV로서 약어화된 CMV-Ntt830 VLP)에 의해 각각 결정하였다. 그래프는 2회의 독립적인 실험을 예시한다. 실험군 당 5마리 마우스의 평균값 +/- SEM을 나타낸다. 아나필락시스 곡선을 투웨이 아노바 테스트에 의해 분석하였다. 피부 단자 테스트를 투테일 스튜던트 t-테스트에 의해 분석하였다.
실시예 9
CMV의 변형된 외피 단백질 및 내부에 융합된 FEL D 1 (CMV-M-Fel)을 포함하는 모자이크 입자의 제작 및 발현
먼저, "CMV-Ntt830-Feld12"로서 지칭되는 본 발명에 따른 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 코딩 서열을 제조한다.
CMV-Ntt830-Feld12은 사슬 1 및 사슬 2를 연결하는 15개 아미노산 GS 링커를 갖는 Fel d1의 상기 사슬 1 및 상기 사슬 2의 융합 단백질에 상응하는 서열번호 38의 Fel d1 단백질을 포함한다. 서열번호 38의 구조물은 국제특허출원 WO 2017/042241의 실시예 7에 기술되어 있다. 추가로 CMV-Ntt830-Feld12 내에서, 서열번호 38의 상기 Fel d1 단백질은 글리신-세린 링커에 의해 인접되고, 자세하게 서열번호 38의 상기 Fel d1 단백질은 서열번호 30의 15개 아미노산 길이의 GS 링커에 의해 이의 N-말단이 직접적으로 인접되고, 서열번호 31의 10개 아미노산 길이의 GS 링커에 의해 이의 C-말단이 직접적으로 인접된다. 또한, 상기 전술된 전체 구조물, 즉 설명된 글리신-세린 링커에 의해 인접되는 서열번호 38의 구조물은 CMV-Ntt830-Feld12를 만드는 CMV-Ntt830의 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 삽입된다.
본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 39이고, "CMV-Ntt830-Feld12"로서 지칭된다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-Feld12의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 40이다.
CMV-Ntt830-Feld12 유전자는 본원에 이의 전문이 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2017/042241의 실시예 7에 설명된 바와 같이 유사하게 제조하였다. 상기 CMV-Ntt830-Feld12 유전자를 획득하기 위하여, 먼저 Fel d1에 상응하는 유전자를 PCR에 의해 다음의 올리고뉴클레오티드로 증폭하였다.
정방향: FG4S-BamF (서열번호 41)
역방향: FG4S-BamR (서열번호 42)
둘 다의 말단에 인접하는 Gly-Ser 링커 및 BamHI 부위를 포함하는 PCR 단편을 pTZ57R/T pTZ57R/T 벡터 내에 직접적으로 라이게이션하였고, 상응하는 삽입물 포함하는 플라스미드 클론을 대장균 XL1 세포의 형질전환 이후에 단리하였다. PCR 오류가 없는 삽입물을 찾기 위하여, PCR 산물 DNA를 포함하는 다수의 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, 정확한 Fel d1 단편을 헬퍼 벡터 pET-CMV-Ntt830B의 BamHI 부위 내에 라이게이션하였다. 정확한 배향으로 Fel d1 삽입물을 포함하는 정확한 클론을 프라이머 FG4S-BamF / CMcpR을 사용하는 "콜로니 PCR"로 찾았다. 양성 PCR 신호를 갖는 플라스미드 클론을 다시 서열 결정하고, 정확한 클론을 추가의 클로닝을 위해 선별하였다. 그 결과, 헬퍼 플라스미드 pET- CMVB-Feld1을 획득하였다, 후속 단계로서, NcoI/HindⅢ 처리 이후의 CMVB-Feld1 단편을 헬퍼 벡터 pETDu-CMV-Ntt830 내에 서브클로닝하였다 (실시예 5 참조). Amp 저항성 유전자가 없는 발현 벡터를 제작하기 위하여, CMV-Ntt830-Feld12 융합 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 유전자를 포함하는 전제 카세트를 절제하여 pET28a+ (노바겐사)의 NcoI/XhoI 부위 내에 서브클로닝하여, 발현 벡터 pET28-CMVBxFeld1-CMVtt를 생성하였다. 플라스미드 맵은 도 11에 나타낸다.
본 발명에 따른 모자이크 CMV-Feld1 VLP, 즉 CMV-Ntt830-Feld12 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질 ("CMV-M-Fel"로 지칭됨)을 포함하는 모자이크 VLP의 단리는 다음의 단계를 포함한다.
대장균 C2566 (뉴잉글랜드 바이오랩사, USA) 적격한 세포를 상응하는 플라스미드 pET28-CMVBxFeld1-CMVtt로 형질전환하였다.
표적 단백질의 가장 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별한 이후, 대장균 배양액을 카나마이신 (25 mg/L)을 포함하는 2TY (트립톤 1.6%, 효모 추출물 1%, 0.5% NaCl, 0.1% 포도당) 배지에서 회전 진탕기로 30℃에서 0.8 내지 1.0의 OD(600) 값까지 성장시켰다. 다음으로, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 배양을 회전 진탕기로 20℃에서 18시간 동안 계속하였다. 생성된 바이오매스를 저속 원심분리법에 의해 수집하였고, -20℃에 냉동하였다.
모자이크 CMV-Feld1 VLP의 정제는 다음의 단계를 포함한다:
1) 6 g 바이오매스를 20 mL의 50 mM Na 시트레이트, 5 mM Na 보레이트, 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, pH 9.0에 현탁하고, 현탁액을 초음파 (Hielscher 초음파 파쇄기 UP200S, 16분, 진폭 70%, 0.5 주기)로 처리하고;
2) 용출물을 +4℃에서 20분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고;
3) 슈크로스 구배 (20% 내지 60%)를 35 mL 튜브에 50 mM Na 시트레이트, 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, 0.5% TX-100를 포함하는 완충액을 넣어 준비하고;
4) 슈크로스 구배 위에 5 mL의 VLP 시료를 중충하고;
5) SW32 회전기, 벡크만사 (25000 rpm, +18℃)를 사용하여 6시간 동안 원심분리하고;
6) 각 구배 튜브의 내용물을 6 mL 분획으로 분할하고, 분획에 상응하는 풀을 만들고;
7) SDS-PAGE 상에서 구배 분획을 분석하고 (도 12a);
8) SDS-PAGE 분석이 제 2 슈크로스 구배 분획에서 모자이크 VLP의 존재를 제시하고, 24 mL의 제 3 분획을 24 mL의 완충액 (5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0)으로 희석하고;
9) VLP를 회전기 타입 70 (벡크만 옵티마사, L100XP 원심분리기; 50,000 rpm, 5℃, 4시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
10) 펠렛을 3 mL의 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0에 용해시키고;
11) VLP 현탁액을 20% 슈크로스 "쿠션" (5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0 완충액 중)의 최상단 위에 중충하고;
12) VLP를 회전기 TLA100.3 (벡크만사; 72,000rpm, 5℃, 1시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
13) 펠렛을 2 mL의 5 mM Na 보레이트, 2 mM EDTA, pH 9.0에 4℃에서 ON 상태로 용해시키고;
14) VLP를 SDS-PAGE 젤 상의 정제 이후에 (도 12b), 뿐만 아니라 EM 하에 (도 12c) 분석한다.
실시예 10
모자이크 입자 CMV-M-Fel로 마우스의 면역화
4마리 암컷 Balb/c 마우스의 실험군을 CMV-M-Fel 또는 CMVNtt830 VLP에 화학적으로 결합된 Fel d1 또는 재조합 Fel d1 추출물로 면역화하였다. VLP를 150 mM PBS, pH 7.4에 제형화하고, 20 μg을 150 μL의 부피에 피하로 주사하였다. 재조합 Fel d1 추출물을 PBS 중에 제형화하고, 10 μg을 피하로 주사하였다. 2주 경과 후, 마우스를 채혈하고, Fel d1에 대한 항체 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 모든 면역 혈청을 Schmitz N, et al., J. Exp. Med. (2009), 206: 1941-1955에 기술된 바와 같이 재조합 Fel d1에 대한 ELISA에 의해 시험하였다.
ELISA:
마우스 혈청의 항체 반응을 표시된 시간에 분석하였다. Fel d1 특이적 항체 역가를 결정하기 위해, ELISA 플레이트 (Nunc Immuno MaxiSorp, Rochester, NY)를 100 μL의 PBS 중 Fel d1 (1 μg/mL)와 함께 4℃에서 밤새 코팅하였다. 비특이적인 결합을 피하기 위하여, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST 중 2% BSA로 차단시키고, RT에서 2시간 동안 배양하였다. 혈청 시료를 2% BSA/PBST로 희석하였다. 사전 희석된 혈청을 코팅된 플레이트 위에 트랜스퍼하고, OD50 계산을 기초로 하여 항체 역가를 획득하도록 추가로 일련 희석하였다. RT에서 2시간 배양 이후에, ELISA 플레이트를 200 μL의 PBST로 5회 세척하였다. 혈청 항체의 결합을 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch)에 의해 검출하였다. 검출 항체를 2% BSA/PBST에서 1 : 1,000으로 희석하고, 시료 당 100 μL 부피를 트랜스퍼하였다. 플레이트를 RT에서 1시간 동안 배양하였다. ELISA 플레이트를 이전에 설명한 바와 같이 세척하였다. 세척하기 이전에, 기질 용액을 준비하였다. 마지막에, 1개 정제 (10 mg)의 OPD (1,2-페닐렌디아민 이염산화물) 및 9 μL의 30% H2O2을 25 mL 시트르산 완충액 (0.066 M Na2HPO4, 0.035 M 시트르산, pH 5.0)에 용해하였다. 100 μL 부피의 기질 용액을 플레이트 상에 피펫팅하고, 정확하게 RT에서 7분 동안 배양하였다. 반응을 종결하기 위하여, 50 μL의 정지 용액 (H2O 중 5% H2SO4)을 플레이트 상에 직접적으로 피펫팅하였다. 1,2-페닐렌디아민 이염산화물 색상 반응을 450 nm에서 흡광도 판독으로 분석하였다. 도 13은 Fel d1에 특이적인 항체를 나타낸다.
실시예 11
CMV-M-Fel로의 면역화는 아나필락시스 반응에 대항하여 보호한다.
마우스를 1일째 백반에 제형화된 고양이 털로부터 단리된 1 μg의 천연 Fel d1를 사용하여 복강내로 민감화시킴으로써 Fel d1에 대한 알레르기를 발생시켰다. 다음으로 마우스를 CMV-M-Fel 또는 CMV-Ntt830 VLP (PBS 중 30 μg, 14일째)로 체온 강하가 측정되는 정맥내 전신 아나필락시스 반응 이전에 면역화하였다.
민감화
마우스를 200 μL 백반에 제형화된 천연 Fel d1 추출물 (1 μg)의 정맥내 주사에 의해 0일째 Fel d1에 대해 면역화하였다. 다음으로 마우스를 대조군의 경우 (200 μL PBS 중 30 μg, 21일째) CMV-M-Fel 또는 CMV-Ntt830 VLP로 백신 접종하였다. 도 14a는 알레르기성 전신 및 국소 반응에 대한 CMV-M-Fel로의 백신 접종의 보호 효과를 조사하는 실험적 설계를 나타낸다.
전신 접종
접종을 민감화된 및 백신 접종된 Balb/c에서 Fel d1 추출물로 정맥내로 수행하였다. 전신 알레르기 반응을 체온 강하에 의해 결정하였다 (도 14b). 그래프는 2회의 독립적인 실험을 예시한다. 실험군 당 5마리 마우스의 평균값 +/- SEM을 나타낸다. 아나필락시스 곡선을 투웨이 아노바 테스트에 의해 분석하였다.
실시예 12
CMV의 변형된 외피 단백질 및 P. 팔시파룸 의 포자소체 단백질 (CSP)의내부에 융합된 내부 반복서열을 포함하는 모자이크 입자( CMV-M-CSP)의 제작 및 발현
플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) CS 단백질 단편, 즉 중앙 반복 서열로부터 서열번호 44 (19nanp)를 생성하는 NANP (서열번호 43)의 19개 반복서열의 클로닝을 위해, 서열번호 45의 서열을 시판업체 (유전자 합성)으로부터 획득하였다.
서열번호 45는 CMV-Ntt830 유전자의 3' 말단 부분 및 필요한 제한효소 부위 BamHI 및 HindⅢ도 역시 코딩한다.
다음으로, 유전자 합성 산물로부터의 DNA 단편을 BamHI/HindⅢ로 처리하고, 헬퍼 벡터 pTZ-CMVB2 내에 서브클로닝하였다 (실시예 5 참조). 19NANP 삽입물을 포함하는 정확한 클론을 제한효소 분석 (BamHI/HindⅢ)을 사용하여 찾았다. 정확한 제한효소 양상을 갖는 플라스미드 클론을 다시 서열 결정하였다. 후속 단계로서, BamHI/HindⅢ 처리 이후의 CMVB-19NANP 단편을 헬퍼 벡터 pETDu-CMV-Ntt830 내에 서브클로닝하였다 (실시예 5 참조). Amp 저항성 유전자가 없는 발현 벡터를 제작하기 위하여, pETDu-CMV-Ntt830로부터 CMV-19NANP 융합 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 유전자를 포함하는 전체 카세트를 절제하고, pET28a+ (노바겐사)의 NcoI/BlpI 부위 내에 서브클로닝하여 pET28-CMVB2x19nanp-CMVtt를 생성하였다. 플라스미드 맵 및 서열 세부사항은 도 15에 나타낸다..
본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 "CMV-Ntt830-19NANP" (또는 본원에 상호교환적으로 사용되는 바 "CMV-Ntt830-19nanp")로 지칭되고, 서열번호 46이다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 이러한 아미노산 서열은 서열번호 44의 도입된 19nanp 단백질을 둘 다의 말단에 인접하는 글리신-세린 링커, 즉 직접적으로 도입된 19nanp 단백질의 N-말단에 15개 아미노산 길이의 GS 링커 (서열번호 30) 및 도입된 19nanp 단백질의 C-말단에 12개 아미노산 길이의 GS 링커 (서열번호 47)를 포함한다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-19NANP의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 48에 기재된다.
또한, CMV-Ntt830-19NANP 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질을 포함하는 모자이크 VLP, 즉 CMV-M-CSP의 합성을 위해 생성된 플라스미드 클론 pET28-CMVB2x19nanp-CMVtt을 대장균 C2566 세포의 형질전환에 사용하였다, CMV-M-CSP의 단리를 위해 대장균 세포 배양, 바이오매스의 처리 및 정제를 실시예 6에서와 같이 수행하였다. SDS-PAGE 젤에서 슈크로스 구배 정제 이후의 VLP의 분석은 도 16에 나타낸다. 전자현미경 분석 이후에 정제된 CMV-M-CSP의 영상은 도 17에 나타낸다.
실시예 13
CMV-M-CSP의 보호 효능
4마리 암컷 Balb/c 마우스의 실험군을 CMV-M-CSP로 면역화한다. VLP를 150 mM PBS, pH 7.4에 제형화하고, 10 μg을 150 μL의 부피에 피하로 주사한다. 백신 효능을 검토하기 위하여, 8주령 실험군 당 6마리 암컷 Balb/c 근교배 마우스 및 실험군 당 8마리 암 CD1 비근교배 마우스를 영국 할란사로부터 구입하고, 마우스 당 20 μg (50 μL)의 CMV-Ntt830 또는 CMV-M-CSP를 근육내로 백신 접종한다. 백신 접종을 0일째 및 21일째 시행한다. 시료 (혈액)를 각 백신 접종 이전에 0일, 21일, 42일째 수집하였고, CSP 특이적 면역 반응을 ELISA에 의해 측정한다. 42일째, 마우스를 P. 팔시파룸 단백질의 CSP 단백질을 발현하는 P. 베르게이 (P. bergei)로 교체 감염시킨다. 기생충혈증을 접종 이후 4일째 시작하여 마우스가 1% 기생충혈증에 도달할 때까지 검토한다.
ELISA에 의한 CSP 특이적 항체 반응의 측정
항체 생산, 총 IgG 및 이의 서브클래스의 평가를 위해, 효소-결합된 면역흡착 검정법 (ELISA)을 수행한다. 이를 위해, 96-웰 플레이트 마이크로타이터 ELISA 플레이트 (써모사이언티픽사, Nottingham, UK)를 정제된 CSP의 1 μg/mL 농도에서 웰 당 100 μL으로 코팅하고, 카보네이트 완충액 (CBB) 50 mM에 pH = 9.6로 희석하며, 4℃에 밤새 배양한다. 다음 날, 플레이트에 200μL의 2% BSA-PBS를 충전하여 비특이적인 결합을 피하고, 실온에서 2시간 동안 배양한다. 다음으로 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청을 0.2% BSA-PBS 완충액, 처음 1 ; 100으로 시작하여 ELISA 플레이트 상에서 이어진 11회의 1/3 일련 희석으로 희석한다. 총 IgG 측정을 위해, 웰 당 100 μL의 1 : 2000 희석된 염소 항-마우스 IgG (이차 항체, HRP 컨쥬게이트 (써모피셔 사이언티픽, Paisley, UK)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. IgG 서브클래스의 평가를 위해, 염소 항-마우스 IgG 서브클래스 (HRP 결합된 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, 라이프 테크놀로지사)를 1 : 2000의 희석으로 사용하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 반응을 현상하기 위하여, 100 μL/웰의 TMB 기질 (시그마 알드리치사)을 적용하고, 실온에서 10분 동안, 광보호용 알루미늄 호일 하에 배양한다. 이후에, 반응을 0.5 M H2SO4 (100 μL/웰)로 정지시키고, 450 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독한다. 역가는 최대-절반 OD (OD50)을 생성하는 희석으로서 표현된다.
보호 효능의 측정
본 연구에 사용된 기생충은 P. 팔시파룸의 CSP 단백질을 발현하는 P. 베르게이이다 (Sci Rep. 2015년 7월 3일; 5:11820. doi: 10.1038/srep11820.). 암컷 아노펠리스 스테펜시 (Anopheles stephensi) 모기가 감염된 보통의 턱 (TO) 마우스에 기생한다. 감염된 모기가 습윤화된 배양기로 19℃ 내지 21℃의 온도에서 12시간 밤낮 주기로 21일 동안 유지되고, 과당-p-아미노벤조산 (PABA) 용액이 공급된다. 21일 후, 침샘을 모기로부터 얻어 쉬나이더 배지 (팬바이오테크사, 독일 아이덴바흐) 내에서 해부하고, 포자소체를 유리 호모게나이저를 사용하여 가만히 분리시킨다. 포자소체를 100 μL 중 1000개 기생충의 농도로 희석하고, 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사한다. 기생충혈증을 접종 이후 4일째 시작하여 마우스가 1% 기생충혈증에 도달할 때까지 검토한다.
실시예 14
알파-신뉴클레인 펩티드와 CMV 융합을 포함하는 VLP의 제작 및 발현
본 발명에 따른 CMV-알파-신뉴클레인-키메라 CMV 폴리펩티드를 알파-신뉴클레인 펩티드 egy (서열번호 49), kne (서열번호 50) 및 mdv (서열번호 51)를 포함하도록 준비하였다.
이들 알파-신뉴클레인 펩티드를 CMV-Ntt830 (서열번호 5)의 아미노산 잔기 Ser(88) 및 Tyr(89) 사이에 삽입하였다. 본 발명에 따른 이들 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
"CMV-Ntt830-egy"의 아미노산 서열: 서열번호 52;
"CMV-Ntt830-kne"의 아미노산 서열: 서열번호 53;
"CMV-Ntt830-mdv"의 아미노산 서열: 서열번호 54.
이들 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 둘 다의 말단에서 도입된 알파-신뉴클레인 펩티드를 인접하는 글리신-세린 링커를 추가로 포함한다. 서열번호 52 내지 서열번호 54의 모든 바람직한 융합 단백질은 GGGS 링커 (서열번호 10)를 도입된 알파-신뉴클레인 펩티드의 N-말단에 그리고 GGGSGS 링커 (서열번호 11)를 도입된 알파-신뉴클레인 펩티드의 C-말단에 직접적으로 포함한다.
상기 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
"CMV-Ntt830-egy"의 핵산 서열: 서열번호 55;
"CMV-Ntt830-kne"의 핵산 서열: 서열번호 56;
"CMV-Ntt830-mdv"의 핵산 서열: 서열번호 57.
발현 벡터에 알파-신뉴클레인 펩티드 변이체를 코딩하는 DNA의 도입을 위해, 다음의 올리고뉴클레오티드가 PCR 반응에 사용되는 한편, 모든 PCR의 주형은 pET-CMV-Ntt830이었다.
제 1 PCR 정방향: CM-egyF (서열번호 58)
역방향: CMcpR (서열번호 59)
제 2 PCR 정방향: CM-kneF (서열번호 60)
역방향; CMcpR (서열번호 59)
제 3 PCR 정방향: CM-mdvF (서열번호 61)
역방향: CMcpR (서열번호 59)
PCR 단편 모두를 pTZ57R/T 벡터 내에 직접적으로 라이게이션하였고, 상응하는 삽입물 포함하는 플라스미드 클론을 대장균 XL1 세포의 형질전환 이후에 단리하였다. PCR 산물 DNA를 포함하는 다수의 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, 알파-신뉴클레인 단편 포함하는 CMV 3' 말단 단편을 BamHI 및 HindⅢ 제한효소 부위를 사용하여 pET-CMV-Ntt830B 헬퍼 벡터 내에 라이게이션하였다 (실시예 1 참조).
또한, 플라스미드 클론 pET-CMV-Ntt830B-egy, pET-CMV-Ntt830B-kne 및 pET-CMV-Ntt830B-mdv를 대장균 C2566 세포의 형질전환에 사용하였다. 플라스미드 맵 및 서열 세부사항은 예시적으로 도 1에 나타낸다.
상응하는 알파-신뉴클레인 펩티드 포함하는 VLP의 단리를 위한 대장균 세포 배양, 바이오매스의 처리 및 정제가 실시예 2에 설명된 바와 같이 효과를 발휘하였다.
SDS-PAGE 젤에서 슈크로스 구배 정제 이후의 VLP의 분석은 도 19a, 도 19b 및 도 19c, 뿐만 아니라 도 20a에 나타낸다. 전자현미경 영상은 도 20b, 도 20c 및 도 20d에 나타낸다.
실시예 15
CMV의 변형된 외피 단백질 및 내부에 융합된 고양이 인터류킨 5를 포함하는 모자이크 입자 (CMV-M-fel-IL-5)의 제작 및 발현
고양이 IL-5 항원을 포함하는 CMV의 변형된 외피 단백질의 클로닝을 위해, 2개의 상이한 벡터가 제작되었다.
고양이 IL-5 항원의 말단 둘 다에 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하고, 심지어 적어도 하나의 Asp을 추가로 포함하는 아미노산 링커의 도입을 허용하는 제 1 벡터를 PCR 돌연변이 생성기전 및 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제작하였다:
제 1 PCR 방향:
정방향: 830-NcoF (서열번호 33)
역방향: Cmded-BamR (서열번호 121)
주형: pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt
제 2 PCR 반응:
정방향: CMded-BamF (서열번호 122)
역방향: CM-cpR (서열번호 26)
주형: pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt
유전자 단편의 증폭 이후에, 상응하는 PCR 산물을 pTZ57R/T 벡터 (인스타클론 PCR 클로닝 키트, 퍼멘타스사 #K1214) 내에 직접적으로 클로닝하였다. 대장균 XL1-Blue 세포를 클로닝 및 플라스미드 증폭을 위한 숙주로서 사용하였다. RT-PCR 오류를 피하기 위하여, 다수의 CMV-Ntt830 유전자 포함하는 pTZ57 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, 제 1 PCR 반응으로부터 얻은 산물을 포함하는 pTZ 플라스미드 클론을 NcoI/BamHI 제한효소로 절단하고, 제 2 PCR로부터 얻은 클론을 BamHI/HindⅢ로 절단하였으며, NcoI/HindⅢ로 절단된 헬퍼 벡터 pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt와 라이게이션 반응으로 접합시켰다. 본원에서, 본 발명자는 헬퍼 벡터로서 pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt를 사용하여 새로운 CMV 기반의 발현 벡터를 생성하였다. NcoI/HindⅢ 처리가 CMVB2xArah202 유전자를 완벽하게 제거하였다, 3개 DNA 단편의 라이게이션이 헬퍼 플라스미드 pETDu-CMVB3d-CMVtt를 생성하였다. 상기 벡터는 파상풍 독소로부터 유래한 Th 세포 에피토프를 갖는 CMV-Ntt830 유전자를, 인코딩되는 단백질 및 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하고, 심지어 적어도 하나의 Asp을 추가로 포함하는 아미노산 링커를 코딩하는 도입된 서열, 자세하게 제 1 T7 프로모터 하의 CMV-Ntt830 유전자에 항원 DNA 서열의 서브클로닝을 위한 추가적인 Asp-Glu-Asp 스트레지 및 BamHI/SpeI 부위를 포함하는 서열 둘 다에서 포함한다.
또한, 고양이 IL-5 항원의 N-말단 상에 GS 링커 및 고양이 IL-5 항원의 C-말단 상에 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커의 도입을 허용하는 제 2 벡터를 PCR 돌연변이 생성기전 및 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제작하였다:
제 3 PCR 방향:
정방향: CM-BamSpeF (서열번호 137)
역방향: CM-cpR (서열번호 26)
주형: pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt
제 3 반응으로부터 얻은 PCR 산물도 pTZ57R/T 벡터 내에 직접적으로 클로닝되었으며, 생성된 라이게이션 혼합물을 대장균 XL1-Blue 세포의 형질전환에 사용하였다. 플라스미드 DNA의 단리 이후에, 다수의 클론을 서열 결정하였다. 정확한 플라스미드 클론을 BamHI/HindⅢ 제한효소로 절단하고, 생성된 단편을 동일한 효소로 절단된 pETDu-CMVB2xArah202-CMV-tt 내에 서브클로닝하였다. 라이게이션 반응은 헬퍼 플라스미드 pETDu-CMVB3-CMVtt를 생성하였다.
고양이 인터류킨 5 (IL-5) 유전자를 유전자 합성 회사 (제너럴 바이오시스템사, USA)로부터 플라스미드 pET42-felIL5N의 형태로 획득하였다. 클로닝을 위해, felIL5 유전자를 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 반응으로 증폭하였다:
정방향: I5-BamF (서열번호 123)
역방향: I5-SpeR (서열번호 124)
주형: pET42-felIL5N
PCR 산물을 pTZ57 내에 라이게이션하고, 플라스미드 DNA 단리 이후에 다수의 클론을 서열 결정하였다. 서열 오류가 없는 클론의 식별 이후에, felIL5 유전자를 pETDu-CMVB3d-CMV-tt 또는 pETDu-CMVB3-CMV-tt 내에 부위 BamHI/SpeI로 추가로 서브클로닝하였다. 생성된 pETDu-CMVB3d-flIL5-CMV-tt 및 pETDu-CMVB3-flIL5-CMV-tt의 플라스미드 맵은 도 21a 및 도 21b에 나타낸다. 상기 플라스미드 및 발현 벡터는 CMV-Ntt830-fel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-fel-IL-5을 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 보장하고, 제공한다.
CMV-Ntt830-fel-IL-5은 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하는 아미노산 링커에 의해 인접되는 서열번호 125의 고양이 IL-5 단백질을 포함한다. 자세하게, 서열번호 125의 상기 고양이 IL-5 단백질은 이의 N-말단에서 서열번호 126의 18개 아미노산 길이의 GSED 링커에 의해 직접적으로 인접되고, 이의 C-말단에서 서열번호 127의 15개 아미노산 길이의 GSED 링커에 의해 직접적으로 인접된다. 또한, 상기 전술한 전체 구조물, 즉 기술된 GSED 링커에 의해 인접된 서열번호 125의 구조물이 CMV-Ntt830의 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 삽입되어 CMV-Ntt830-fel-IL-5를 생성하였다. 본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 "CMV-Ntt830-fel-IL-5"로서 지칭되고, 서열번호 128이다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-fel-IL-5의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 129에 기재된다.
CMV-Ntt830-fel-IL-5*은 N-말단에 GS 링커 및 C-말단에 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Thr를 포함하는 아미노산 링커에 의해 인접되는 서열번호 125의 고양이 IL-5 단백질을 포함한다. 자세하게, 서열번호 125의 상기 고양이 IL-5 단백질은 이의 N-말단에서 서열번호 30의 15개 아미노산 길이의 GS 링커에 의해 직접적으로 인접되고, 이의 C-말단에서 서열번호 138의 11개 아미노산 길이의 GST 링커에 의해 직접적으로 인접된다. 또한, 상기 전술한 전체 구조물, 즉 기술된 GS 및 GST 링커에 의해 인접된 서열번호 125의 구조물이 CMV-Ntt830의 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 삽입되어 CMV-Ntt830-fel-IL-5*를 생성하였다. 본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 "CMV-Ntt830-fel-IL-5"로서 지칭되고, 서열번호 139이다. 이러한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-fel-IL-5*의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 140에 기재된다.
따라서, 모자이크 CMV-M-fel-IL-5 및 CMV-M-fel-IL-5*의 발현 및 정제를 위해, 대장균 C2566 (뉴잉글랜드 바이오랩사, USA) 적격한 세포를 상응하는 플라스미드 pETDu-CMVB3d-flIL5-CMVtt 및 pETDu-CMVB3-flIL5-CMVtt로 형질전환하였다.
표적 단백질의 가장 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별한 이후, 대장균 배양액을 앰피실린 (100 mg/L)을 포함하는 2TY (트립톤 1.6%, 효모 추출물 1%, 0.5% NaCl, 0.1% 포도당) 배지에서 회전 진탕기로 30℃에서 0.8 내지 1.0의 OD(600) 값까지 성장시켰다. 다음으로, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 배양을 회전 진탕기로 20℃에서 18시간 동안 계속하였다. 생성된 바이오매스를 저속 원심분리법에 의해 수집하였고, -20℃에 냉동하였다. 바이오매스 결과 - 대략 14 g 습윤 바이오매스/1개 배양물, OD(600)이 배양의 종결 시 7.6이었다.
CMV-Ntt830-fel-IL-5 또는 CMV-Ntt830-fel-IL-5* 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질 (CMV-M-fel-IL-5 및 CMV-M-fel-IL-5*로서 지칭되는 상기 모자이크 VLP)를 포함하는 모자이크 VLP의 정제는 다음의 단계를 포함한다:
1) 1.5 g 바이오매스를 10 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 현탁하고, 현탁액을 초음파 (Hielscher 초음파 파쇄기 UP200S, 16분, 진폭 70%, 0.5 주기)로 처리하고;
2) 용출물을 +4℃에서 20분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고;
3) 슈크로스 구배 (20% 내지 60%)를 35 mL 튜브에 20 mM 트리스 HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 0.5% TX-100를 포함하는 완충액을 넣어 준비하고;
4) 슈크로스 구배 위에 5 mL의 VLP 시료를 중충하여 2개의 튜브를 준비하고;
5) SW32 회전기, 벡크만사 (25,000 rpm, +18℃)를 사용하여 6시간 동안 원심분리하고;
6) 각 구배 튜브의 내용물을 6 mL 분획으로 분할하고, 분획에 상응하는 풀을 만들고;
7) SDS-PAGE 상에서 구배 분획을 분석하고 (도 22a 및 도 22b);
8) SDS-PAGE 분석이 제 2 및 제 3 슈크로스 구배 분획에서 모자이크 VLP의 존재를 제시하고, 제 2 및 제 3 분획을 동등량의 완충액 (20 mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0)으로 희석하고;
9) VLP를 회전기 타입 70 (벡크만 옵티마사, L100XP 원심분리기; 50,000 rpm, 5℃, 4시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
10) 펠렛을 2 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 용해시키고;
11) VLP 현탁액을 20% 슈크로스 "쿠션" (20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤 완충액 중)의 최상단 위에 중충하고;
12) VLP를 회전기 TLA100.3 (벡크만사; 72,000rpm, 5℃, 1시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
13) 펠렛을 2 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 4℃에서 ON 상태로 용해시키고;
14) 현탁액을 원심분리법 (5분, 13,000 rpm, 에펜도르프 5418)에 의해 정화하고;
15) VLP를 SDS-PAGE 젤 상의 정제 이후에 (도 23a 및 도 23c), 뿐만 아니라 EM 하에 (도 23b 및 도 23d) 분석한다.
EM 사진은 CMV-Ntt830-fel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질을 포함하는 모자이크 VLP 그리고 이에 따른 모자이크 VLP CMV-M-fel-IL-5가, CMV-Ntt830-fel-IL-5* 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질를 포함하는 모자이크 VLP 그리고 이에 따른 모자이크 VLP CMV-M-fel-IL-5*와 비교하여 유의하게 더 적은 수의 응집된 VLP를 포함하는 것을 나타낸다.
실시예 16
CMV의 변형된 외피 단백질 및 내부에 융합된 이중 고양이 인터류킨 5를 포함하는 모자이크 입자 (CMV-M-2xfel-IL-5)의 제작 및 발현
고양이 IL-5 항원의 2개 사본을 포함하는 CMV의 변형된 외피 단백질의 클로닝을 위해, 고양이 IL-5 항원의 말단 둘 다에 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하고, 심지어 적어도 하나의 Asp을 추가로 포함하는 아미노산 링커 및 고양이 IL-5 항원 둘 다를 연결하는 아미노산 링커의 도입을 허용하는 상응하는 벡터를 PCR 돌연변이 생성기전 및 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제작하였다:
제 1 PCR 방향:
정방향: I5-BamF (서열번호 123)
역방향; 2xIL5-gsKpnR (서열번호 130)
주형: pETDu-CMVB3d-flIL5-CMV-tt
제 2 PCR 반응:
정방향: 2xIL5-gsKpnF (서열번호 131)
역방향: I5-SpeR (서열번호 124)
주형: pETDu-CMVB3d-flIL5-CMV-tt
유전자 단편의 증폭 이후에, 상응하는 PCR 산물을 pTZ57R/T 벡터 (인스타클론 PCR 클로닝 키트, 퍼멘타스사 #K1214) 내에 직접적으로 클로닝하였다. 대장균 XL1-Blue 세포를 클로닝 및 플라스미드 증폭을 위한 숙주로서 사용하였다. RT-PCR 오류를 피하기 위하여, 다수의 fel-IL-5 유전자 포함하는 pTZ57 플라스미드 클론을 BigDye 순환 시퀀싱 키트 및 ABI 프리즘 3100 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템사)를 사용하여 서열 결정하였다. 서열 결정 이후, 제 2 PCR 반응으로부터 얻은 산물을 포함하는 정확한 pTZ 플라스미드 클론을 Kpn2/EcoRI 제한효소로 절단하고, 생성된 단편을 동일한 제한효소로 절단된 제 1 PCR 반응으로부터 얻은 PCR 산물을 포함하는 pTZ 플라스미드 내에 클로닝하였다. 라이게이션 반응을 Gly-Ser 링커로 연결된 flIL5 유전자의 2개 사본을 포함하는 헬퍼 플라스미드 pTZ-2xflIL5를 생성하였다. 이중 felIL5 유전자를 포함하는 플라스미드를 XL1 세포로부터 정제하였더. 2xfel-IL5 유전자를 BamHI/SpeI 제한효소를 사용하여 추가로 절제하고, 발현 벡터 pETDu-CMVB3d-CMVtt 내에 동일한 제한효소 부위로 라이게이션하였다. 생성된 벡터는 Gly-Ser 링커에 의해 분리되고, 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하고, 심지어 적어도 하나의 Asp을 추가로 포함하고, 자세하게 추가적인 Asp-Glu-Asp 스트레지를 갖는 Gly-Ser 링커를 포함하는 아미노산 링커에 의해 인접되는 2개의 고양이 IL5를 코딩하는 도입된 서열과 함께 CMV-Ntt830을 포함한다. 생성된 pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMV-tt의 플라스미드 맵은 도 24에 나타낸다. 상기 플라스미드 및 발현 벡터는 CMV-Ntt830-2xfel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-2xfel-IL 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 보장하고, 제공한다.
CMV-Ntt830-2xfel-IL-5은 Gly-Ser 링커 (서열번호 30)으로 연결되고, 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하는 아미노산 링커에 의해 인접되는 서열번호 125의 고양이 IL-5 단백질의 2개 사본을 포함한다. 자세하게, Gly-Ser 링커 (서열번호 30)으로 연결된 서열번호 125의 상기 고양이 IL-5 단백질의 2개 사본은 이의 N-말단에서 서열번호 126의 18개 아미노산 길이의 GSED 링커에 의해 직접적으로 인접되고, 이의 C-말단에서 서열번호 127의 15개 아미노산 길이의 GSED 링커에 의해 직접적으로 인접된다. 또한, 상기 전술한 전체 구조물, 즉 Gly-Ser 링커 (서열번호 30)으로 연결되고, 기술된 GSED 링커에 의해 인접된 서열번호 125의 2개 사본의 구조물은 CMV-Ntt830의 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 삽입되어 CMV-Ntt830-2xfel-IL-5를 생성하였다.
본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 "CMV-Ntt830-2xfel-IL-5"로서 지칭되고, 서열번호 132이다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-fel-IL-5의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 133에 기재된다.
따라서, 모자이크 CMV-M-2xfel-IL-5의 발현 및 정제를 위해, 대장균 C2566 (뉴잉글랜드 바이오랩사, USA) 적격한 세포를 플라스미드 pETDu-CMVB3d-2xflIL5-CMVtt로 형질전환하였다.
표적 단백질의 가장 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별한 이후, 대장균 배양액을 앰피실린 (100 mg/L)을 포함하는 2TY (트립톤 1.6%, 효모 추출물 1%, 0.5% NaCl, 0.1% 포도당) 배지에서 회전 진탕기로 30℃에서 0.8 내지 1.0의 OD(600) 값까지 성장시켰다. 다음으로, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 배양을 회전 진탕기로 20℃에서 18시간 동안 계속하였다. 생성된 바이오매스를 저속 원심분리법에 의해 수집하였고, -20℃에 냉동하였다. 바이오매스 결과 - 대략 15 g 습윤 바이오매스/1개 배양물, OD(600)이 배양의 종결 시 8.0이었다.
본 발명에 따른 CMV-Ntt830-2xfel-IL-5 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질 (CMV-M-2xfel-IL-5로서 지칭되는 상기 모자이크 VLP)를 포함하는 모자이크 VLP의 정제는 다음의 단계를 포함한다:
1) 1.5 g 바이오매스를 10 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 현탁하고, 현탁액을 초음파 (Hielscher 초음파 파쇄기 UP200S, 16분, 진폭 70%, 0.5 주기)로 처리하고;
2) 용출물을 +4℃에서 20분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고;
3) 슈크로스 구배 (20% 내지 60%)를 35 mL 튜브에 20 mM 트리스 HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 0.5% TX-100를 포함하는 완충액을 넣어 준비하고;
4) 슈크로스 구배 위에 5 mL의 VLP 시료를 중충하여 2개의 튜브를 준비하고;
5) SW32 회전기, 벡크만사 (25,000 rpm, +18℃)를 사용하여 6시간 동안 원심분리하고;
6) 각 구배 튜브의 내용물을 6 mL 분획으로 분할하고, 분획에 상응하는 풀을 만들고;
7) SDS-PAGE 상에서 구배 분획을 분석하고 (도 25);
8) SDS-PAGE 분석이 제 2 및 제 3 슈크로스 구배 분획에서 모자이크 VLP의 존재를 제시하고, 제 2 및 제 3 분획을 풀로 만들고, 동등량의 완충액 (20 mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0)으로 희석하고;
9) VLP를 회전기 타입 70 (벡크만 옵티마사, L100XP 원심분리기; 50,000 rpm, 5℃, 4시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
10) 펠렛을 2 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 용해시키고;
11) VLP 현탁액을 20% 슈크로스 "쿠션" (20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤 완충액 중)의 최상단 위에 중충하고;
12) VLP를 회전기 TLA100.3 (벡크만사; 72,000rpm, 5℃, 1시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
13) 펠렛을 2 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 4℃에서 ON 상태로 용해시키고;
14) 현탁액을 원심분리법 (5분, 13,000 rpm, 에펜도르프 5418)에 의해 정화시키고;
15) VLP를 SDS-PAGE 젤 상의 정제 이후에 (도 23a 및 도 23c), 뿐만 아니라 EM 하에 (도 23b 및 도 23d) 분석한다.
실시예 17
CMV의 변형된 외피 단백질 및 내부에 융합된 개 인터류킨 1b를 포함하는 모자이크 입자 (CMV-M-cIL-1b)의 제작 및 발현
인접하는 BamHI 및 Spe I 부위를 갖는 개 인커류킨 1b를 시판업체(pUCcIL1b에서의 유전자 합성 산물, 제너랄 바이오시스템사)로부터 획득하였다. BamHI/SpeI 단편을 플라스미드 pUCcIL1b-BS로부터 절제하고, 헬퍼 벡터 pETDu-CMVB3d-CMVtt (BamHI 및 SpeI 부위) 내에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드를 대장균 XL1 세포로부터 단리하고, 도입된 cIL-1b 서열을 확인하도록 다시 서열 결정하였다. pETDu-CMVB3d-cIL1b-CMV-tt의 플라스미드 맵은 도 27에 나타낸다. 상기 플라스미드 및 발현 벡터는 CMV-Ntt830-cIL-1b 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질, 즉 CMV-M-cIL-1b을 포함하는 모자이크 VLP의 발현을 보장하고, 제공한다.
CMV-Ntt830-cIL-1b는 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 적어도 하나의 Glu를 포함하는 아미노산 링커에 의해 인접되는 서열번호 134의 개 IL-1b 단백질을 포함한다. 자세하게, 서열번호 134의 상기 개 IL-1b 단백질은 이의 N-말단에서 서열번호 126의 18개 아미노산 길이의 GSED 링커에 의해 직접적으로 인접되고, 이의 C-말단에서 서열번호 127의 15개 아미노산 길이의 GSED 링커에 의해 직접적으로 인접된다. 또한, 상기 전술한 전체 구조물, 즉 기술된 GSED 링커에 의해 인접된 서열번호 134의 구조물은 CMV-Ntt830의 서열번호 5의 Ser(88) 및 Tyr(89)에 상응하는 위치 사이에 삽입되어 CMV-Ntt830-cIL-1b를 생성하였다.
본 발명에 따른 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드의 아미노산 서열은 "CMV-Ntt830-cIL-1b"로서 지칭되고, 서열번호 135이다. 이러한 바람직한 키메라 CMV 폴리펩티드 CMV-Ntt830-cIL-1b의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 136에 기재된다.
따라서, 모자이크 CMV-M-cIL-1b의 발현 및 정제를 위해, 대장균 C2566 (뉴잉글랜드 바이오랩사, USA) 적격한 세포를 플라스미드 pETDu-CMVB3d-cIL-1b-CMVtt로 형질전환하였다.
표적 단백질의 가장 높은 발현 수준을 갖는 클론을 선별한 이후, 대장균 배양액을 앰피실린 (100 mg/L)을 포함하는 2TY (트립톤 1.6%, 효모 추출물 1%, 0.5% NaCl, 0.1% 포도당) 배지에서 회전 진탕기로 30℃에서 0.8 내지 1.0의 OD(600) 값까지 성장시켰다. 다음으로, 세포를 0.2 mM IPTG로 유도하고, 배지에 5 mM MgCl2를 보충하였다. 배양을 회전 진탕기로 20℃에서 18시간 동안 계속하였다. 생성된 바이오매스를 저속 원심분리법에 의해 수집하였고, -20℃에 냉동하였다. 바이오매스 결과 - 대략 15 g 습윤 바이오매스/1개 배양물, OD(600)은 배양의 종결 시 8.8이었다.
본 발명에 따른 CMV-Ntt830-cIL-1b 및 변형되지 않은 CMV-Ntt830 단백질 (CMV-M-cIL-1b로서 지칭되는 상기 모자이크 VLP)를 포함하는 모자이크 VLP의 정제는 다음의 단계를 포함한다:
1) 1.5 g 바이오매스를 10 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 현탁하고, 현탁액을 초음파 (Hielscher 초음파 파쇄기 UP200S, 16분, 진폭 70%, 0.5 주기)로 처리하고;
2) 용출물을 +4℃에서 20분 동안 11,000 rpm으로 원심분리하고;
3) 슈크로스 구배 (20% 내지 60%)를 35 mL 튜브에 20 mM 트리스 HCl (pH 8), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 0.5% TX-100를 포함하는 완충액을 넣어 준비하고;
4) 슈크로스 구배 위에 5 mL의 VLP 시료를 중충하여 2개의 튜브를 준비하고;
5) SW32 회전기, 벡크만사 (25,000 rpm, +18℃)를 사용하여 6시간 동안 원심분리하고;
6) 각 구배 튜브의 내용물을 6 mL 분획으로 분할하고, 분획에 상응하는 풀을 만들고;
7) SDS-PAGE 상에서 구배 분획을 분석하고 (도 28);
8) SDS-PAGE 분석이 제 2 및 제 3 슈크로스 구배 분획에서 모자이크 VLP의 존재를 제시하고, 제 2 및 제 3 분획을 풀로 만들고, 동등량의 완충액 (20 mM 트리스 HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0)으로 희석하고;
9) VLP를 회전기 타입 70 (벡크만 옵티마사, L100XP 원심분리기; 50,000 rpm, 5℃, 4시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
10) 펠렛을 2 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 용해시키고;
11) VLP 현탁액을 20% 슈크로스 "쿠션" (20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤 완충액 중)의 최상단 위에 중충하고;
12) VLP를 회전기 TLA100.3 (벡크만사; 72,000rpm, 5℃, 1시간)을 사용한 초원심분리법에 의해 수집하고;
13) 펠렛을 2 mL의 20 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 10% 슈크로스에 4℃에서 ON 상태로 용해시키고;
14) 현탁액을 원심분리법 (5분, 13,000 rpm, 에펜도르프 5418)에 의해 정화시키고;
15) VLP를 SDS-PAGE 젤 상의 정제 이후에 (도 29a), 뿐만 아니라 EM 하에 (도 29d) 분석한다.
SEQUENCE LISTING <110> Saiba GmbH <120> VIRUS-LIKE PARTICLES OF CMV MODIFIED BY FUSION <130> P5412PC00 <150> EP18214639.9 <151> 2018-12-20 <160> 145 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Abeta 1-6 <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Abeta 1-7 <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Abeta 3-6 <400> 3 Glu Phe Arg His 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Abeta 1-5 <400> 4 Asp Ala Glu Phe Arg 1 5 <210> 5 <211> 222 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CMVNtt830 <400> 5 Met Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Pro Ser Ser Ala 20 25 30 Asp Ala Asn Phe Arg Val Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn Lys 35 40 45 Thr Leu Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly 50 55 60 Ser Glu Arg Cys 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Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn Lys 35 40 45 Thr Leu Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly 50 55 60 Ser Glu Arg Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu Lys 65 70 75 80 Pro Pro Lys Ile Asp Arg Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ala Glu Phe 85 90 95 Arg His Gly Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu Leu Leu 100 105 110 Pro Asp Ser Val Thr Glu Tyr Asp Lys Lys Leu Val Ser Arg Ile Gln 115 120 125 Ile Arg Val Asn Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr Val Trp Val Thr 130 135 140 Val Arg Lys Val Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Ala Ala Ile Ser 145 150 155 160 Ala Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gln Tyr Ala 165 170 175 Ala Ser Gly Val Gln Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala 180 185 190 Met Arg Ala Asp Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr 195 200 205 Ser Lys Asp Asp Ala Leu Glu Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp 210 215 220 Val Glu His Gln Arg Ile Pro Thr Ser Gly Val Leu Pro Val 225 230 235 <210> 7 <211> 239 <212> PRT <213> artificial 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Leu Pro 100 105 110 Asp Ser Val Thr Glu Tyr Asp Lys Lys Leu Val Ser Arg Ile Gln Ile 115 120 125 Arg Val Asn Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr Val Trp Val Thr Val 130 135 140 Arg Lys Val Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser Val Ala Ala Ile Ser Ala 145 150 155 160 Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Val Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Gly Val Gln Ala Asn Asn Lys Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met 180 185 190 Arg Ala Asp Ile Gly Asp Met Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser 195 200 205 Lys Asp Asp Ala Leu Glu Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Val 210 215 220 Glu His Gln Arg Ile Pro Thr Ser Gly Val Leu Pro Val 225 230 235 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GGGS-linker <400> 10 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GGGSGS-linker <400> 11 Gly Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 12 <211> 726 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CMV-Ntt830-Ab16 <400> 12 ccatgggcca gtatattaag gccaactcca aatttatcgg gattaccgag cgtcgacgtc 60 gtccgcgtcg tggttcccgc tccgccccct cctccgcgga tgctaacttt agagtcttgt 120 cgcagcagct ttcgcgactt aataagacgt tagcagctgg tcgtccaact attaaccacc 180 caacctttgt agggagtgaa cgctgtaaac ctgggtacac gttcacatct atcaccctaa 240 agccaccaaa aatagaccgt ggatccggtg gcggtagcga tgcggagttt cgccatgggg 300 gtggttcggg ttcctattat ggtaaaaggt tgttattacc tgattcagtc acggaatatg 360 ataagaaact tgtttcgcgc attcaaattc gagttaatcc tttgccgaaa tttgattcaa 420 ccgtgtgggt gacagtccgt aaagttcctg cctcttcgga cttatccgtt gccgccattt 480 ctgctatgtt tgcggacgga gcctcaccgg tactggttta tcagtacgct gcatctggag 540 tccaagctaa caacaaactg ttgtatgatc tttcggcgat gcgcgctgat ataggcgaca 600 tgagaaagta cgccgtcctc gtgtattcaa aagacgatgc actcgagaca gacgagttag 660 tacttcatgt tgacgtcgag caccaacgta ttcccacatc tggggtgctc ccagtttgat 720 aagctt 726 <210> 13 <211> 729 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CMV-Ntt830-Ab17 <400> 13 ccatgggcca gtatattaag gccaactcca aatttatcgg gattaccgag cgtcgacgtc 60 gtccgcgtcg tggttcccgc tccgccccct cctccgcgga tgctaacttt 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Glu Asn Val Asn Lys Gln Val Val Phe His Met Ser Phe Val His 35 40 45 Gly Asp Glu Ser Asn Asn Lys Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu 115 120 125 Gly Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Arg Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser Ser 145 150 <210> 144 <211> 152 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> canine IL-1b <400> 144 Ala Ala Leu Pro Ser Val Asp Cys Thr Leu Gln Asp Ile Asn His Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Val Leu Ser Asn Ser Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn 20 25 30 Gly Glu Asn Val Asn Lys Gln Val Val Phe His Met Ser Phe Val His 35 40 45 Gly Asp Glu Ser Asn Tyr Lys Ile Pro Val Val Leu Gly Ile Lys Gln 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Lys Val Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Arg Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Lys Asn Thr Val Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ser Gln Tyr Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Val Glu 115 120 125 Gly Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Glu Phe Ser Ser 145 150 <210> 145 <211> 152 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fel IlL-1b <400> 145 Ala Ala Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Thr Phe Arg Asp Ile Ser Gln Lys 1 5 10 15 Ser Leu Val Leu Ser Gly Ser Tyr Glu Leu Arg Ala Leu His Leu Asn 20 25 30 Gly Gln Asn Met Asn Gln Gln Val Val Phe Arg Met Ser Phe Val His 35 40 45 Gly Glu Glu Asn Ser Lys Lys Ile Pro Val Val Leu Cys Ile Lys Lys 50 55 60 Asn Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Met Lys Asp Gly Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Met Leu Asp Pro Lys Val Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Thr Glu Ile Lys Gly Asn Val Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ser Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Glu Met Pro Val Phe Leu Gly Asn Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Ile Met Glu Ser Ala Ser 145 150

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP)로서, 상기 적어도 하나의 융합 단백질은
    (i) CMV 폴리펩티드로서, CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, CMV 폴리펩티드;
    (ii) 항원성 폴리펩티드로서, 상기 CMV 폴리펩티드 내에 삽입되고, 상기 항원성 폴리펩티드의 상기 삽입이 서열번호 62의 84번 위치 및 85번 위치의 아미노산 잔기에 상응하는 상기 CMV 폴리펩티드의 아미노산 잔기 사이에 있는, 항원성 폴리펩티드; 및
    (iii) T 헬퍼 세포 에피토프로서, 상기 CMV 폴리펩티드의 N-말단을 대체하는, T 헬퍼 세포 에피토프
    를 포함하는 키메라 CMV 폴리펩티드를 포함하는, 오이 모자이크 바이러스 (CMV)의 변형된 바이러스-유사 입자 (VLP).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 1 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 위치하고, 바람직하게 상기 제 1 아미노산 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는, CMV의 변형된 VLP.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 제 2 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 상기 제 1 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 N-말단에 위치하고, 상기 제 2 아미노산 링커는 상기 항원성 폴리펩티드의 C-말단에 위치하고, 바람직하게 상기 제 2 아미노산 링커는 많아야 30개 아미노산의 길이를 갖는, CMV의 변형된 VLP.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는
    (a) n = 2 내지 10의 길이의 폴리글리신 링커 (Gly)n;
    (b) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, 바람직하게 (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및
    (c) 적어도 하나의 Gly, 적어도 하나의 Ser 및 Thr, Ala, Lys, Asp 및 Glu로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 아미노산 링커
    로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, CMV의 변형된 VLP.
  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    상기 제 1 및 상기 제 2 아미노산 링커는
    (i) 적어도 하나의 글리신 및 적어도 하나의 세린을 포함하는 글리신-세린 링커 (GS 링커)로서, (GS)r(GsS)t(GS)u의 아미노산 서열을 갖고, r = 0 또는 1, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5 및 u = 0 또는 1인, GS 링커; 및
    (ii) 적어도 하나의 글리신, 적어도 하나의 세린, 적어도 하나의 글루탐산 및 적어도 하나의 아스파라긴산을 포함하는 글리신-세린-글루탐산-아스파라긴산 링커 (GSED 링커)로서, (DED)x(GsS)t(G)y(DED)z(GS)u의 아미노산 서열을 포함하고, s = 1 내지 5, t = 1 내지 5, u = 0 또는 1, x = 0 또는 1, y = 0 내지 5 및 z = 0 또는 1인, GSED 링커
    로부터 독립적으로 선택되는, CMV의 변형된 VLP.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CMV 폴리펩티드는 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 90%, 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열인, CMV의 변형된 VLP.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CMV 폴리펩티드는
    (i) CMV의 외피 단백질의 아미노산 서열로서, 서열번호 62를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는, 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 62와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되고,
    (i) 또는 (ii)에 정의된 바와 같은 상기 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 서열번호 63과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 영역을 포함하는, CMV의 변형된 VLP.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CMV 폴리펩티드의 상기 N-말단 영역은 서열번호 62의 아미노산 2번 내지 12번에 상응하는, CMV의 변형된 VLP.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Th 세포 에피토프는 파상풍 독소로부터 유래하거나, PADRE 서열인, CMV의 변형된 VLP.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Th 세포 에피토프는 서열번호 64 또는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는, CMV의 변형된 VLP.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 5의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 서열번호 5의 88번 위치 및 89번 위치의 아미노산 잔기 사이에 삽입되거나, 상기 항원성 폴리펩티드는 서열번호 66의 상기 키메라 CMV 폴리펩티드 내에 서열번호 66의 86번 위치 및 87번 위치의 아미노산 잔기 사이에 삽입되는, CMV의 변형된 VLP.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CMV의 변형된 VLP는 적어도 하나의 CMV 단백질을 포함하고, 상기 CMV 단백질은 CMV의 외피 단백질 또는 서열번호 62와 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 CMV 단백질은 선택적으로 T 헬퍼 세포 에피토프에 의해 변형되고, 바람직하게 상기 CMV의 외피 단백질은 서열번호 62를 포함하는, CMV의 변형된 VLP.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 폴리펩티드는 (a) 알레르기원; (b) 바이러스; (c) 박테리아; (c) 기생충; (d) 종양; (e) 자가-분자; (h) 호르몬; (i) 사이토카인; 및 (k) 케모카인으로 이루어진 군으로부터 유래한 폴리펩티드인, CMV의 변형된 VLP.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원성 폴리펩티드는 알레르기원, 자가 항원, 종양 항원 또는 병원균의 폴리펩티드인, CMV의 변형된 VLP.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 CMV 폴리펩티드는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 29, 서열번호 39, 서열번호 46, 서열번호 52, 서열번호 53, 서열번호 54, 서열번호 128, 서열번호 132, 서열번호 134 또는 서열번호 139로 이루어진 군으로부터 선택되는, CMV의 변형된 VLP.
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