TW202140526A - 針對垂體腺苷酸環化酶激活胜肽的胜肽免疫原及其預防和治療偏頭痛的製劑 - Google Patents

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Abstract

本揭露是關於靶向垂體腺苷酸環化酶激活多胜肽(PACAP)之部分的胜肽免疫原結構、含有此結構的組成物、利用此結構所引發的抗體，以及用以製備和使用此結構及其組成物的方法。揭露的胜肽免疫原結構具有超過約20個的胺基酸，且含有(a)具有來自全長PACAP蛋白之PACAP受體結合或活化區域的約9個以上連續胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；(b)異源性Th抗原決定位；以及(c)任選的異源性間隔子。揭露的PACAP胜肽免疫原結構可刺激針對PACAP的高特異性抗體的產生，用於預防及/或治療偏頭痛。

Description

針對垂體腺苷酸環化酶激活胜肽的胜肽免疫原及其預防和治療偏頭痛的製劑
本揭露是關於靶向垂體腺苷酸環化酶激活胜肽(PACAP)的胜肽免疫原結構及其製劑，以用於預防和治療包括頭痛和偏頭痛在內的疼痛。
垂體腺苷酸環化酶激活多胜肽，也稱為PACAP，是一種在人類中由ADCYAP1基因編碼的蛋白質。PACAP38和PACAP27是藉由稱為prepro-PACAP的PACAP前體蛋白的選擇性加工所產生。Prepro-PACAP (GenBank登錄號CAA42962.1)具有176個胺基酸，且其最初被信號蛋白酶代謝以產生訊息胜肽(第1-25個胺基酸)和pro-PACAP (第26-176個胺基酸)。pro-PACAP被前激素轉化酶和羧胜肽酶代謝以產生小片段(第26-79個胺基酸)、大的PACAP相關胜肽(PRP) (第82-129個胺基酸)，其生理功能尚不清楚，以及羧基端胜肽(第132-170個胺基酸和第132-159個胺基酸)。羧基端胜肽被肽基甘胺酸-阿爾法-醯胺化單加氧酵素(peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase，PAM)代謝以分別形成PACAP38和PACAP27。PACAP38和PACAP27均具有醯胺化的羧基端(第1圖)。
PACAP與血管活性腸胜肽(VIP)和胰泌素相似。第2圖顯示來自不同物種的PACAP、VIP和胰泌素的序列比對。PACAP可與VIP受體和PACAP受體結合。由腺苷酸環化酶激活多胜肽1受體介導，PACAP在目標細胞中可刺激腺苷酸環化酶並隨後增加cAMP水平。PACAP是促垂體素(即，在垂體中誘導活性的物質)，並且還充當神經傳導物質和神經調節物質。另外，它在某些類型的細胞的旁分泌和自泌調節中起作用。
最近，一種形式的PACAP與女性(而非男性)的創傷後精神壓力障礙(PTSD)有關。這種疾病涉及對創傷(即威脅生存的事件)的適應不良的心理反應。Ressler, K.J.等人(2011年)確定編碼PACAP基因中的SNP的關聯性，此意謂在PTSD中與此胜肽及其受體(PAC1)有關。
研究顯示，在大多數發生偏頭痛的個體中，靜脈內給予PACAP-38可以引發延遲的“偏頭痛樣頭痛”。正在開發利用靶向PACAP或其受體之單株抗體的治療方法，以治療原發性頭痛。其中包括：由Amgen Inc.開發的AMG 301，其靶向PAC1受體並已完成II期試驗；以及由Alder BioPharmaceuticals開發的ALD1910，其靶向此胜肽並於2019年10月開始I期研究。
雖然這種單株抗PACAP或抗PAC1抗體可以證明在偏頭痛的免疫治療是有效的，但是它們價格昂貴且必須每月施用以維持對血清和體液PACAP水平的充分抑制以及由此衍生的臨床效益。透過安全且耐受性良好的疫苗接種方法靶向PACAP分子的具有成本效益的免疫療法對於偏頭痛療法而言仍然是一項令人興奮的新干預手段。
採用胜肽/半抗原-載體蛋白免疫原製備方法的典型疫苗存在許多缺點和不足之處。例如，製備方法可能涉及複雜的化學偶聯步驟，它們使用昂貴的醫藥級KLH或類毒素蛋白作為T輔助細胞載體，由此蛋白免疫原所引發的大多數抗體都是針對載體蛋白而不是針對標靶B細胞抗原決定位等。
鑑於單株抗體療法和採用胜肽/半抗原-載體蛋白製備的典型疫苗於經濟和實踐上的缺點和侷限性，顯然尚未滿足開發有效的免疫治療組成物的需求，而此組成物要能夠引發針對位於PACAP上之功能性位點的具有高度特異性的免疫反應，其可以很容易地對患者給藥，可以按照嚴格的優良藥品製造規範(GMP)進行生產，並且對於在全世界應用以治療偏頭痛的患者具有成本效益。
針對在上述背景技術部分中所作陳述，可以找到引用其他支持文件的三篇文獻綜述，在此透過引用將其整體併入本文。第一篇文章含有有關PACAP的最新回顧(網站： en.wikipedia.org/wiki/Pituitary_adenylate_cyclase-activating_peptide)；第二篇文章表明建立PACAP系統在人類生物學及其治療應用中的作用的廣泛努力(Denes, V., et al., 2019)；而第三篇文章回顧了PACAP/升糖素超家族的起源和功能(Sherwood, N.M, et al., 2000)。
參考文獻： 1.  CHANG, J.C.C., et al., “Adjuvant activity of incomplete Freund’s adjuvant.” Advanced Drug Delivery Reviews, 32(3):173-186 (1998) 2.  DENES, V., et al., “Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide: 30 Years in Research Spotlight and 600 Million Years in Service” J. Clin. Med. 8(9): 1488 (2019). 3.  FIELDS, G.B., et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, p.77 (1992) 4.  HIRABAYASHI, T., et al., “Discovery of PACAP and its receptors in the brain”, J. Headache Pain, 19(1):28 (2018) 5.  RESSLER, K.J., et al., “Post-traumatic stress disorder is associated with PACAP and the PAC1 receptor.” Nature, 470(7335):492-497 (2011) 6.  SHERWOOD, N.M, et al., “The origin and function of the pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)/glucagon superfamily.” Endocrine Reviews, 21(6):619-670 (2000). 7.  TRAGGIAI, E., et al., “An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus”, Nature Medicine, 10:871-875 (2004). 8.  WIKIPEDIA, The free encyclopedia, “Pituitary adenylate cyclase-activating peptide” available at website: en.wikipedia.org/wiki/Pituitary_adenylate_cyclase-activating_peptide (accessed January 10, 2020). 9.  WO 1990/014837, by VAN NEST, G., et al., “Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion.” (1990-12-13)
本揭露是關於作為B細胞抗原決定位之垂體腺苷酸環化酶激活胜肽(PACAP)的部分。本揭露還關於含有來自PACAP之B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構、含有此胜肽免疫原結構的組成物、製備和使用此胜肽免疫原結構的方法，以及利用此胜肽免疫原結構製造的抗體。
本揭露的一範疇是關於源自來自多種生物之PACAP的不同部分的B細胞抗原決定位。非結構化的PACAP非特異性地結合至細胞膜上，從而有利於在胜肽的中央和羧基端部分形成穩定的螺旋構型。PACAP的螺旋部份特異性地與PAC1受體的氨基端功能區塊交互作用，將PACAP的氨基端無序功能區塊定位在受體的近膜區功能區塊附近。揭露的功能性B細胞抗原決定位胜肽具有來自人類/大鼠/小鼠PACAP38胜肽(即SEQ ID NO: 1)的約9至約22個胺基酸。在某些實施例中，功能性B細胞抗原決定位胜肽位於PACAP分子的氨基端至中央或羧基端區域(例如SEQ ID NOs: 2-20，如表1所示)，其中氨基端片段可以採用特定構型以活化PAC1受體。
可將衍生自PACAP的揭露的B細胞抗原決定位胜肽透過任選的異源間隔子連接至異源T輔助細胞(Th)抗原決定位胜肽，以形成胜肽免疫原結構。在某些實施例中，異源性間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的任何分子或化學結構，其可包括化學化合物、天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸，或其任意組合。異源Th抗原決定位可以是能夠增強針對B細胞抗原決定位的免疫反應的任何Th抗原決定位。在某些實施例中，Th抗原決定位衍生自具有SEQ ID NOs: 70-109和160-171的胺基酸序列的病原體蛋白，如表2所示。
揭露的胜肽免疫原結構含有PACAP B細胞抗原決定位胜肽，其於氨基端或羧基端透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性Th抗原決定位。揭露的胜肽免疫原結構含有B細胞抗原決定位和Th抗原決定位，具有20個或更多個的總胺基酸。在某些實施例中，胜肽免疫原結構具有SEQ ID NOs: 110-159的胺基酸序列，如表3所示。
揭露的PACAP胜肽免疫原結構含有設計的B細胞和Th抗原決定位胜肽，二者共同作用以刺激高特異性抗體的產生，此抗體是針對PACAP功能位點，其包括位於PACAP之中央和羧基端的PACAP受體結合區域或位於氨基端的受體活化區域。這些抗體為易患或患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者提供治療性免疫反應。
本揭露的另一範疇是關於胜肽組成物，包括醫藥組成物，其含有PACAP胜肽免疫原結構。此組成物可含有一種或多種PACAP胜肽免疫原結構、藥學上可接受的遞送載體、佐劑及/或利用CpG寡聚物配製成穩定的免疫刺激複合物。在某些實施例中，PACAP胜肽免疫原結構的混合物具有衍生自不同病原體的異源性Th抗原決定位，其可用於允許覆蓋患者中廣泛的遺傳背景，導致免疫後更高百分比的反應率，用於患有PACAP介導疾病(包括疼痛、頭痛和偏頭痛)的患者的預防及/或治療。
本揭露還關於針對揭露之PACAP胜肽免疫原結構的抗體。特別地，本揭露的PACAP胜肽免疫原結構能夠刺激與全長PACAP分子交叉反應的高度特異性功能性抗體的產生。揭露的抗體利用高特異性結合至PACAP，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與利用用於此種胜肽免疫原性增強的常規KLH或類毒素蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。因此，相較於其他胜肽或蛋白質免疫原，揭露的PACAP胜肽免疫原結構能夠破壞針對自身PACAP的免疫耐受性，具有高反應率。基於它們獨特的特徵和性質，由PACAP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性和免疫治療方法來治療患有PACAP介導疾病(包括疼痛、頭痛和偏頭痛)的患者。
在一些實施例中，揭露的抗體是針對負責下游細胞活化事件之PACAP的氨基端區域，或是針對涉及受體結合之PACAP的中央及/或羧基端區域(例如SEQ ID NOs: 2-20)。由PACAP胜肽免疫原結構引發的高特異性抗體可以抑制(1) 下游活化事件或(2) PACAP和PAC1結合，從而抑制細胞cAMP的升高。基於它們獨特的特徵和性質，由PACAP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性和免疫治療方法來治療患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者。
在另一範疇，本發明提供針對PACAP的人類單株抗體，所述單株抗體是由接受含有本揭露PACAP胜肽免疫原結構的組成物的患者所誘發的。Traggiai, E.等人於2004年描述一種由從人類患者血液中分離的B細胞製備人類單株抗體的有效方法，此文獻透過引用併入本文。
本揭露還關於製備和使用揭露的PACAP胜肽免疫原結構、組成物和抗體的方法。揭露的方法可提供用於PACAP胜肽免疫原結構與含有此結構之組成物的低成本製造和品質控管。揭露的方法還關於使用揭露的PACAP胜肽免疫原結構及/或由PACAP胜肽免疫原結構引發的抗體來預防及/或治療易患或患有PACAP介導疾病(包括疼痛、頭痛和偏頭痛)的個體。揭露的方法還包括用於投予PACAP胜肽免疫原結構的給藥方案、劑型和給藥途徑，以於預防及/或治療PACAP介導疾病(包括疼痛、頭痛和偏頭痛)。
本揭露是關於作為B細胞抗原決定位之垂體腺苷酸環化酶激活胜肽(PACAP)的部分。本揭露還關於含有來自PACAP之B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構、含有此胜肽免疫原結構的組成物、製備和使用此胜肽免疫原結構的方法，以及利用此胜肽免疫原結構製造的抗體。
本揭露的一範疇是關於源自來自多種生物之PACAP的不同部分的B細胞抗原決定位。非結構化的PACAP非特異性地結合至細胞膜上，從而有利於在胜肽的中央和羧基端部分形成穩定的螺旋構型。PACAP的螺旋部份特異性地與PAC1受體的氨基端功能區塊交互作用，將PACAP的氨基端無序功能區塊定位在受體的近膜區功能區塊附近。揭露的功能性B細胞抗原決定位胜肽具有來自人類/大鼠/小鼠PACAP38胜肽(即SEQ ID NO: 1)的約9至約22個胺基酸。在某些實施例中，功能性B細胞抗原決定位胜肽位於PACAP分子的氨基端至中央或羧基端區域(例如SEQ ID NOs: 2-20，如表1所示)，其中氨基端片段可以採用特定構型以活化PAC1受體。
可將衍生自PACAP的揭露的B細胞抗原決定位胜肽透過任選的異源間隔子連接至異源T輔助細胞(Th)抗原決定位胜肽，以形成胜肽免疫原結構。在某些實施例中，異源性間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的任何分子或化學結構，其可包括化學化合物、天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸，或其任意組合。異源Th抗原決定位可以是能夠增強針對B細胞抗原決定位的免疫反應的任何Th抗原決定位。在某些實施例中，Th抗原決定位衍生自具有SEQ ID NOs: 70-109和160-171的胺基酸序列的病原體蛋白，如表2所示。
在某些實施例中，用於增強PACAP B細胞抗原決定位胜肽的異源性Th抗原決定位衍生自天然病原體EBV BPLF1 (SEQ ID NO: 108)、EBV CP (SEQ ID NO: 105)、破傷風梭菌(SEQ ID NOs: 70、73、100和102-104)、霍亂毒素(SEQ ID NO: 77)和曼氏血吸蟲(SEQ ID NO: 76)，以及衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)和B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位，其為單一序列或組合序列形式(例如SEQ ID NOs: 71、78-95和160-171)。
揭露的胜肽免疫原結構含有PACAP B細胞抗原決定位胜肽，其於氨基端或羧基端透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性Th抗原決定位。揭露的胜肽免疫原結構含有B細胞抗原決定位和Th抗原決定位，具有20個或更多個的總胺基酸。在某些實施例中，胜肽免疫原結構具有SEQ ID NOs: 110-159的胺基酸序列，如表3所示。
揭露的PACAP胜肽免疫原結構含有設計的B細胞和Th抗原決定位胜肽，二者共同作用以刺激高特異性抗體的產生，此抗體是針對PACAP功能位點，其包括位於PACAP之中央和羧基端的PACAP受體結合區域或位於氨基端的受體活化區域。這些抗體為易患或患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者提供治療性免疫反應。
本揭露的另一範疇是關於胜肽組成物，包括醫藥組成物，其含有PACAP胜肽免疫原結構。此組成物可含有一種或多種PACAP胜肽免疫原結構、藥學上可接受的遞送載體、佐劑及/或利用CpG寡聚物配製成穩定的免疫刺激複合物。在某些實施例中，PACAP胜肽免疫原結構的混合物具有衍生自不同病原體的異源性Th抗原決定位，其可用於允許覆蓋患者中廣泛的遺傳背景，導致免疫後更高百分比的反應率，用於患有PACAP介導疾病(包括疼痛、頭痛和偏頭痛)的患者的預防及/或治療。
在本揭露胜肽組成物中可以觀察到於PACAP免疫原結構的協同性增強。衍生自這種含有PACAP胜肽免疫原結構之組成物給藥的抗體反應大多數(＞90%)是集中在針對PACAP功能性位點或受體結合區域胜肽之B細胞抗原決定位的欲求交叉反應上，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位。這與使用常規載體蛋白(例如用於此種胜肽抗原性增強的KLH、類毒素或其他生物載體)的標準方法形成鮮明對比。
本揭露也關於用於預防及/或治療偏頭痛的醫藥組成物和製劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含穩定化的免疫刺激複合物，其是藉由混合CpG寡聚合物和含有PACAP胜肽免疫原結構混合物的胜肽組成物以透過靜電結合所形成，以進一步增強關於與全長PACAP38胜肽(例如SEQ ID NO:1)之欲求交叉反應性的PACAP胜肽免疫原性。
在其他實施例中，醫藥組成物包含揭露的PACAP胜肽免疫原結構或結構混合物，其與例如礦物鹽(包括鋁膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJU-PHOS))之藥學上可接受的遞送載體或佐劑一同配製以形成懸浮液劑型，或與作為佐劑之MONTANIDE™ ISA 51或720一同配製以形成油包水乳液，此可用於預防及/或治療疼痛(包括頭痛和偏頭痛)。
本揭露還關於針對揭露之PACAP胜肽免疫原結構的抗體。特別地，本揭露的PACAP胜肽免疫原結構能夠刺激與全長PACAP分子交叉反應的高度特異性功能性抗體的產生。揭露的抗體利用高特異性結合至PACAP，沒有很多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與利用用於此種胜肽免疫原性增強的常規蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。因此，相較於其他胜肽或蛋白質免疫原，揭露的PACAP胜肽免疫原結構能夠破壞針對自身PACAP的免疫耐受性，具有高反應率。
在一些實施例中，揭露的抗體是針對負責下游細胞活化事件之PACAP的氨基端區域，或是針對涉及受體結合之PACAP的中央及/或羧基端區域(例如SEQ ID NOs: 2-20)。由PACAP胜肽免疫原結構引發的高特異性抗體可以抑制(1) 下游活化事件或(2) PACAP和PAC1結合，從而抑制細胞cAMP的升高。基於它們獨特的特徵和性質，由PACAP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性和免疫治療方法來治療患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者。
基於它們獨特的特徵和性質，由PACAP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性和免疫治療方法來治療患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者。
在另一範疇，本發明提供針對PACAP的人類單株抗體，所述單株抗體是由接受含有本揭露PACAP胜肽免疫原結構的組成物的患者所誘發的。Traggiai, E.等人於2004年描述一種由從人類患者血液中分離的B細胞製備人類單株抗體的有效方法，此文獻透過引用併入本文。
本揭露還關於製備揭露的PACAP胜肽免疫原結構、組成物和抗體的方法。揭露的方法可提供用於PACAP胜肽免疫原結構與含有此結構之組成物的低成本製造和品質控管，其可用於用以治療患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者的方法。
本揭露也包括使用揭露的PACAP胜肽免疫原結構及/或針對PACAP胜肽免疫原結構的抗體來預防及/或治療易患或患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的個體的方法。用於在個體中預防及/或治療偏頭痛的方法包括投予此個體含有揭露的PACAP胜肽免疫原結構或結構混合物的組成物。在某些實施例中，方法中使用的組成物含有揭露的PACAP胜肽免疫原結構，此胜肽免疫原結構是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此穩定化的免疫刺激複合物是利用帶負電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)透過靜電結合所形成，此複合物可進一步補充佐劑，用以投予患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的患者。
揭露的方法還包括用於投予PACAP胜肽免疫原結構的給藥方案、劑型和給藥途徑，以於個體中預防及/或治療疼痛(包括頭痛和偏頭痛)。通則
本文使用的章節標題僅用於組織的目的，不應被理解為限制所述主題。本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的部分出於任何目的透過引用明確地將整體併入本文。
除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包括複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，術語“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，本文揭露的材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。PACAP 胜 肽免疫原結構
本揭露提供胜肽免疫原結構，其含有具有約9至約22個胺基酸的B細胞抗原決定位胜肽，此B細胞抗原決定位胜肽具有來自人類/大鼠/小鼠/綿羊PACAP38胜肽(SEQ ID NO: 1)或來自不同生物的胺基酸序列。在某些實施例中，B細胞抗原決定位胜肽具有選自SEQ ID NOs: 2-20的胺基酸序列，如表1所述。
B細胞抗原決定位直接地或是透過任選的異源性間隔子共價地連接至衍生自病原體蛋白質的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位(例如SEQ ID NOs: 13-64和160-171，如表2所示)。這些結構(含有設計的B細胞和Th細胞抗原決定位共同作用)刺激與全長人類ACAP38 (SEQ ID NO: 1)交叉反應的高特異性抗體的產生。
本文使用術語“PACAP胜肽免疫原結構”或“胜肽免疫原結構”是指具有約20個以上胺基酸的胜肽，其含有(a)具有來自全長PACAP38胜肽(SEQ ID NO: 1)之約9個以上連續胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；(b)異源性Th抗原決定位；以及(c)任選的異源性間隔子。
在某些實施例中，PACAP胜肽免疫原結構可利用以下分子式作為代表： (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–X 或 (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 或 (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 其中 Th為異源性T輔助細胞抗原決定位； A為異源性間隔子； (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有來自PACAP的7至30個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位胜肽，其涉及受體結合或受體活化； X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2 ； m為1至約4；以及 n為0至約10。
基於許多理論基礎設計和選擇本揭露的PACAP胜肽免疫原結構，包括： i.   PACAP B細胞抗原決定位胜肽本身是非免疫原性的，以避免自體T細胞活化； ii. 透過使用蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位，可以使PACAP B細胞抗原決定位胜肽具有免疫原性； iii. 當PACAP B細胞抗原決定位胜肽成為免疫原性的並投予宿主時，胜肽免疫原結構： a. 引發優先針對PACAP B細胞抗原決定位(而非蛋白質載體或T輔助細胞抗原決定位)的高效價抗體； b. 在接受免疫的宿主中破壞免疫耐受性並產生與全長PACAP38胜肽(SEQ ID NO: 1)交叉反應的高度特異性抗體； c.  產生可以抑制PACAP和PACAP受體結合以及相關下游事件(例如細胞內cAMP產量增加)的高度特異性抗體；以及 d. 產生能夠在體內造成辣椒素誘導的皮膚血流減少的高度特異性抗體。
揭露的PACAP胜肽免疫原結構及其製劑可有效地發揮醫藥組成物的作用，以預防及/或治療易患或患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的個體。
揭露的PACAP胜肽免疫原結構的各種組分在下文進一步詳細描述。a . 來自 PACAP 的 B 細胞抗原決定位胜肽
本揭露關於用於產生高效價抗體的新穎胜肽組成物，所述高效價抗體對多種物種之垂體腺苷酸環化酶激活胜肽(PACAP) (例如SEQ ID NO: 1)具有特異性。胜肽免疫原結構的位點特異性使針對位於PACAP上其他區域的不相關位點或位於載體蛋白上的不相關位點的抗體產生最小化，從而提供高安全係數。
表1顯示本揭露中使用的PACAP B細胞抗原決定位的胺基酸序列(SEQ ID NOs: 2-66)。人類PACAP由ADCYAP1基因編碼。PACAP與血管活性腸胜肽(VIP)相似，且可與VIP受體和PACAP受體(PAC1)結合。由腺苷酸環化酶激活多胜肽1受體介導，PACAP在目標細胞中可刺激腺苷酸環化酶並隨後增加cAMP水平。PACAP是促垂體素(即，在垂體中誘導活性的物質)，並且還充當神經傳導物質和神經調節物質。另外，它在某些類型的細胞的旁分泌和自泌調節中起作用。
研究顯示，在大多數發生偏頭痛的個體中，靜脈內給予PACAP38可以引發延遲的“偏頭痛樣頭痛”。PACAP38誘發的偏頭痛與畏光、畏聲和噁心有關，並對藥物和翠普登類藥物(triptans)有反應。與病人無痛期(發作間歇期)的基線水平相比，偏頭痛發作(發作期)期間之PACAP38血漿水平升高。在偏頭痛發作的患者中，以司麥普坦(sumatriptan)治療後血漿PACAP水平降低，此與症狀改善相關。目前尚不清楚PACAP38和CGRP是否介導重疊或互補的途徑。研究表明，PACAP38輸注可誘發與長時間臉紅有關的獨特的延遲性偏頭痛樣發作。相反，CGRP誘發的偏頭痛樣發作幾乎是立即發生的。
非結構化的PACAP非特異性地結合至細胞膜上，從而有利於在胜肽的中央和羧基端部分形成穩定的螺旋構型。PACAP的螺旋部份特異性地與PAC1受體的氨基端功能區塊交互作用，將PACAP的氨基端無序功能區塊定位在受體的近膜區功能區塊附近。氨基端片段可以採用特定構型以活化PAC1受體。
本揭露的另一範疇是預防及/或治療PACAP介導疾病(包括偏頭痛)，其利用靶向PACAP的主動免疫療法以展現長期PACAP阻斷和臨床功效。因此，本發明是關於靶向全長PACAP蛋白(SEQ ID NO: 1)之部分的胜肽免疫原結構及其製劑，以預防和/或治療PACAP介導的疾病。
PACAP胜肽免疫原結構的B細胞抗原決定位部分可含有來自以SEQ ID NO: 1代表之全長PACAP38蛋白的任何部分的約9至約22個的胺基酸。在某些實施例中，B細胞抗原決定位是基於設計原理進行篩選和選擇，具有SEQ ID NOs: 2-66的胺基酸序列，如表1所示。
在一些實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於PACAP38分子之中央/羧基端區域的PAC1結合區域(例如SEQ ID NOs: 7-20)。在其他實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於PACAP38之氨基端區域附近的PACAP受體活化區域(例如SEQ ID NOs: 2-6)。
本揭露的PACAP B細胞抗原決定位胜肽還包括PACAP38的免疫功能類似物或同源物，包括來自不同生物的PACAP38序列。PACAP B細胞抗原決定位胜肽的免疫功能類似物或同源物包括保留與原始胜肽實質相同免疫原性的的變異物。免疫功能類似物可具有於胺基酸位置的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合。
由含有來自PACAP的這些B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構產生的抗體是高度特異性的，並且與各種物種的全長PACAP有交叉反應。基於它們獨特的特徵和性質，由PACAP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性和免疫治療方法以預防及/或治療疼痛(包括頭痛和偏頭痛)。b . 異源性 T 輔助細胞抗原決定位 (Th 抗原決定位 )
本揭露提供胜肽免疫原結構，其含有來自PACAP的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位直接地或是透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
於胜肽免疫原結構中的異源性Th抗原決定位可增強PACAP B細胞抗原決定位的免疫原性，其促進針對基於設計理論篩選和選擇的優化目標PACAP B細胞抗原決定位胜肽之特異性高效價抗體的產生。
本文使用術語“異源性”是指衍生自並非PACAP野生型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，異源性Th抗原決定位為衍生自非天然存在於PACAP之胺基酸序列的Th抗原決定位(即Th抗原決定位對PACAP而言不是自體衍生的)。因為Th抗原決定位對PACAP而言是異源性的，當異源性Th抗原決定位共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽時，PACAP的天然胺基酸序列不會向氨基端或羧基端方向延伸。
本揭露的異源性Th抗原決定位可為不具有天然存在於PACAP之胺基酸序列的任何Th抗原決定位。Th抗原決定位還可具有針對多種物種第2類MHC分子的混雜結合基序。在某些實施例中，Th抗原決定位包含多個混雜的第2類MHC結合基序，以允許T輔助細胞的最大活化，從而導致免疫反應的啟動和調節。優選的Th抗原決定位本身為非免疫原性的(即如果有的話，很少利用PACAP胜肽免疫原結構所產生抗體是針對Th抗原決定位)，因此允許針對PACAP分子之目標B細胞抗原決定位胜肽的非常集中的免疫反應。
本揭露的Th抗原決定位包括，但不限於，衍生自外來病原菌之胺基酸序列，如表2所例示(例如SEQ ID NOs: 70-109和160-171)。在某些實施例中，用於增強PACAP B細胞抗原決定位胜肽的異源性Th抗原決定位衍生自天然病原體EBV BPLF1 (SEQ ID NO: 108)、EBV CP (SEQ ID NO: 105)、破傷風梭菌(SEQ ID NOs: 70、73、100)、霍亂毒素(SEQ ID NO: 77)和曼氏血吸蟲(SEQ ID NO: 76)，以及衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)和B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位，其為單一序列(例如SEQ ID NOs: 71、78、82-86、88-89、91-92、94-95、160-163、165-166和168-171)或組合序列(例如SEQ ID NOs: 81、87、90、93、164和167)形式。組合的理想化人工Th抗原決定位含有基於特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽骨架內於特定位置處作為代表的胺基酸殘基的混合物。可以利用在合成過程期間在特定位置添加選定受保護之胺基酸的混合物，而非一個特定的胺基酸，於單一過程中合成組合胜肽的集合。此種組合異源性Th抗原決定位胜肽集合可允許對具有不同遺傳背景之動物廣泛的Th抗原決定位覆蓋。異源性Th抗原決定位胜肽之代表性組合序列包括如表2所示的SEQ ID NOs: 81、87、90、93、164和167。本發明的Th抗原決定位胜肽對來自基因多樣性群體的動物和患者提供廣泛的反應性和免疫原性。c . 異源性間隔子
揭露的PACAP胜肽免疫原結構任選地含有異源性間隔子，其將PACAP B細胞抗原決定位胜肽共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
如上所述，術語“異源性”是指衍生自並非PACAP天然型式序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，當異源性間隔子共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽時，PACAP的天然胺基酸序列不會向氨基端或羧基端方向延伸，因為間隔子對PACAP序列而言是異源性的。
間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的任何分子或化學結構。依據應用的不同，間隔子的長度或極性可能會有所不同。間隔子連接可透過醯胺或羧基連結，但是其他官能基也是可能的。間隔子可包括化學化合物、天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。
間隔子可為PACAP胜肽免疫原結構提供結構特徵。結構上，間隔子提供Th抗原決定位與PACAP片段的B細胞抗原決定位的物理分離。透過間隔子的物理分離可破壞透過將Th抗原決定位連接至B細胞抗原決定位所產生的任何人工二級結構。另外，透過間隔子之抗原決定位的物理分離可消除Th細胞及/或B細胞反應之間的干擾。此外，可設計間隔子以產生或修飾胜肽免疫原結構的二級結構。例如，可設計間隔子以作為柔性鉸鏈，用以增強Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的分離。柔性鉸鏈間隔子也可允許所呈現之胜肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞之間更有效率的交互作用，以增強對Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的免疫反應。編碼柔性鉸鏈之序列的例示見於通常富含脯胺酸的免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 67)提供了一種作為間隔子使用之特別有用的柔性鉸鏈，其中Xaa是任意胺基酸，以天門冬胺酸為優選。
間隔子也可為PACAP胜肽免疫原結構提供功能特徵。例如，可設計間隔子以改變PACAP胜肽免疫原結構的總電荷，其可影響胜肽免疫原結構的溶解度。此外，改變PACAP胜肽免疫原結構的總電荷可影響胜肽免疫原結構與其他化合物和試劑結合的能力。如下文進一步詳細討論的，PACAP胜肽免疫原結構可透過靜電結合與高度帶電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成穩定的免疫刺激複合物。PACAP胜肽免疫原結構的總電荷對於形成這些穩定的免疫刺激複合物是重要的。
可作為間隔子的化學化合物包括，但不限於，(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(AEEA, mini-PEG1)、12-氨基-4,7,10-三氧雜十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid (Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
天然存在的胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
非天然存在的胺基酸包括，但不限於，ε-N離胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、氨基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca; 6-胺基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪胺酸、焦麩胺酸等。
PACAP胜肽免疫原結構中的間隔子可共價連接在Th抗原決定位和PACAP B細胞抗原決定位胜肽的氨基端或羧基端。在一些實施例中，間隔子共價連接至Th抗原決定位的羧基端和PACAP B細胞抗原決定位胜肽的氨基端。在其他實施例中，間隔子共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端和Th抗原決定位的氨基端。在某些實施例中，可使用一個以上的間隔子，例如，當在PACAP胜肽免疫原結構中存在一個以上的Th抗原決定位時。當使用一個以上的間隔子時，每個間隔子可以彼此相同或不同。此外，當PACAP胜肽免疫原結構中存在一個以上的Th抗原決定位時，可利用間隔子分隔開Th抗原決定位，間隔子可為相同或不同，利用間隔子將Th抗原決定位與PACAP B細胞抗原決定位胜肽分開。間隔子相對於Th抗原決定位或PACAP B細胞抗原決定位胜肽的排列沒有限制。
在某些實施例中，異源性間隔子是天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。在其他實施例中，間隔子含有一個以上的天然存在或非天然存在的胺基酸。在具體實施例中，間隔子為Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)或Lys-Lys-Lys- ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)。d. PACAP 胜肽免疫原結構的具體實施例
在某些實施例中，PACAP胜肽免疫原結構可利用以下分子式作為代表： (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–X 或 (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 或 (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 其中 Th為異源性T輔助細胞抗原決定位； A為異源性間隔子； (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有來自PACAP的7至30個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位胜肽，其涉及受體結合或受體活化； X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2 ； m為1至約4；以及 n為0至約10。
B細胞抗原決定位胜肽可含有來自以SEQ ID NO: 1表示之全長PACAP38蛋白質的任何部分介於約7至約30個胺基酸。在一些實施例中，B細胞抗原決定位具有選自SEQ ID NOs: 2-20任一的胺基酸序列，如表1所示。在某些實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於PACAP38分子之中央或羧基端區域的PACAP受體結合區域(SEQ ID NOs: 7-20)。在其他實施例中，B細胞抗原決定位胜肽來自位於PACAP38之氨基端區域附近的PAC1活化區域(SEQ ID NOs: 2-6)。
PACAP胜肽免疫原結構中的異源性Th抗原決定位具有選自SEQ ID NOs: 70-109和160-171及其組合任一的胺基酸序列，如表2所示。在一些實施例中，一個以上的Th抗原決定位存在於PACAP胜肽免疫原結構中。
任選的異源性間隔子是選自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 67)、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)及其任意組合的任一者，其中Xaa是任意胺基酸，但以天門冬胺酸為優選。在具體實施例中，異源性間隔子是ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68) 或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)。
在某些實施例中，PACAP胜肽免疫原結構具有選自SEQ ID NOs: 110-159任一的胺基酸序列，如表3所示。
包含Th抗原決定位之PACAP胜肽免疫原結構是於與PACAP片段串聯的單一固相胜肽合成中同時產生。Th抗原決定位也可包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激對PACAP B細胞抗原決定位胜肽的免疫反應。
在PACAP胜肽免疫原結構中的Th抗原決定位可共價連接於PACAP B細胞抗原決定位胜肽的氨基端或羧基端。在一些實施例中，Th抗原決定位是共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的氨基端。在其他實施例中，Th抗原決定位是共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端。在某些實施例中，一個以上的Th抗原決定位共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽。當一個以上的Th抗原決定位連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽時，每一個Th抗原決定位可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列。另外，當一個以上的Th抗原決定位連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽時，Th抗原決定位可以任何順序排列。例如，Th抗原決定位可連續地連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的氨基端，或連續地連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端，或當不同的Th抗原決定位共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的羧基端時，Th抗原決定位可共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽的氨基端。Th抗原決定位相對於PACAP B細胞抗原決定位胜肽的排列並無限制。
在一些實施例中，Th抗原決定位直接地共價連接至PACAP B細胞抗原決定位胜肽。在其他實施例中，Th抗原決定位透過異源性間隔子共價連接至PACAP片段。e. 變異物、同源物和功能類似物
也可使用上述免疫原胜肽結構的變異物和類似物，其可誘導抗體及/或與抗體交叉反應，而此抗體是針對優選的PACAP B細胞抗原決定位胜肽。類似物(包括等位基因、物種以及誘導變異物)，通常於一個、兩個或幾個位置上有別於天然存在的胜肽，通常是由於保留性取代。類似物通常展現與天然胜肽至少75%、80%、85%、90%或95%的序列一致性。一些類似物還包括非天然胺基酸或在一個、兩個或幾個位置上之氨基端或羧基端胺基酸的修飾。
作為功能類似物的變異物可具有於胺基酸位置上的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合。
保留性取代是指一個胺基酸殘基被另一個具有相似化學性質的胺基酸殘基所取代。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；帶正電的(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；而帶負電的(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。
在特定實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少50％的一致性。在另一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少80%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少85%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少90%的一致性。
Th抗原決定位胜肽的功能免疫類似物也是有效的，且被包括作為本發明的一部分。功能免疫Th類似物可包括於Th抗原決定位中從1至約5個胺基酸殘基的保留性取代、添加、刪除和插入，其實質上未改變Th抗原決定位的Th刺激功能。如上文針對PACAP B細胞抗原決定位胜肽所描述的，可以利用天然或非天然胺基酸完成保留性取代、添加和插入。表2辨識了Th抗原決定位胜肽之功能類似物的另一種變異物。具體而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs: 71和78分別是MvF4和MvF5 Th的SEQ ID NOs: 88-90和94的功能類似物，因為利用在氨基端和羧基端將各兩個胺基酸刪除(SEQ ID NOs: 71和78)或插入(SEQ ID NOs: 88-90和94)而使其胺基酸骨架有所區別。在類似序列的這兩個系列之間的差異並不會影響包含於此些序列中之Th抗原決定位的功能。因此，功能免疫Th類似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths (SEQ ID NOs: 71、78、79-81、88-90、94和160-168)和衍生自肝炎表面蛋白質HBsAg 1-3 Ths (SEQ ID NOs: 82-87、91-93、95和169-171)之Th抗原決定位的多種版本。
在其他實施例中，用於增強PACAP B細胞抗原決定位胜肽的異源性Th抗原決定位衍生自天然病原體EBV BPLF1 (SEQ ID NO: 108)、EBV CP (SEQ ID NO: 105)、破傷風梭菌(SEQ ID NOs: 70、73、100)、霍亂毒素(SEQ ID NO: 77)和曼氏血吸蟲(SEQ ID NO: 76)。組成物
本揭露還提供包含揭露的PACAP免疫原胜肽結構的組成物。a . 胜肽組成物
含有揭露的PACAP胜肽免疫原結構的組成物可為液體或固體/凍乾形式。液體組成物可包括不改變PACAP胜肽免疫原結構之結構或功能特性的水、緩衝液、溶劑、鹽及/或任何其他可接受的試劑。胜肽組成物可含有一種或多種揭露的PACAP胜肽免疫原結構。b . 醫藥組成物
本揭露還關於含有揭露的PACAP胜肽免疫原結構的醫藥組成物。
醫藥組成物可含有藥學上可接受的遞送系統中的載體及/或其他添加劑。因此，醫藥組成物可含有PACAP胜肽免疫原結構的藥學上有效劑量以及藥學上可接受的載體、佐劑及/或其它賦形劑(例如稀釋劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、助溶劑、緩衝劑等)。
醫藥組成物可含有一種或多種佐劑，其作用是加速、延長或增強針對PACAP胜肽免疫原結構的免疫反應，而本身不具有任何特異性抗原作用。醫藥組成物中使用的佐劑可包括油、油乳液、鋁鹽、鈣鹽、免疫刺激複合物、細菌和病毒衍生物、仿病毒顆粒(virosomes)、碳水化合物、細胞因子、聚合物微粒。在某些實施例中，佐劑可選自明礬(磷酸鋁鉀)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、磷酸鈣、弗氏不完全佐劑(IFA)、弗氏完全佐劑、MF59、佐劑65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、EMULSIGEN®、單磷酸脂質A (MPL)、Quil A、QS21、MONTANIDE® ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂質體、磷脂質、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、親脂性磷脂質(脂質A)、γ菊糖、藻類菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)，以及其他佐劑和乳化劑。
在一些實施例中，醫藥組成物含有MONTANIDE™ ISA 51 (由植物油和二縮甘露醇油酸酯所組成的油質佐劑組成物，用以製造油包水乳液)、TWEEN® 80 (也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組成物是以EmulsIL-6n或EmulsIL-6n D作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳液。
醫藥組成物還可包括藥學上可接受的添加劑或賦形劑。例如，醫藥組成物可含有抗氧化劑、黏結劑、緩衝劑、增積劑、載劑、螫合劑、著色劑、稀釋劑、崩散劑、乳化劑、填充劑、膠化劑、pH緩衝劑、防腐劑、助溶劑、穩定劑等。
醫藥組成物可配製成立即釋放或緩續釋放劑型。另外，可配製醫藥組成物用於透過免疫原包封和與微粒共同投予以誘導系統性或局部性黏膜免疫。所屬技術領域中具有通常知識者很容易判定此種遞送系統。
醫藥組成物可以以液體溶液或懸浮液型式配製成注射劑。含有PACAP胜肽免疫原結構的液體載體也可在注射前製備。醫藥組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製醫藥組成物供靜脈內、皮下、皮內或肌內投予。也可製備適用於其它給藥方式的醫藥組成物，包括口服和鼻內應用。
醫藥組成物也可以適合的劑量單位形式配製。在一些實施例中，醫藥組成物含有每公斤體重約0.1 μg至約1 mg的PACAP胜肽免疫原結構。醫藥組成物的有效劑量取決於許多不同的因素，包括投予方式、靶點、患者的生理狀態、患者是人類或動物、投予的其它藥物，以及處理是供預防還是治療。通常，患者是人類，但也可治療包括基因轉殖哺乳類動物的非人類哺乳類動物。當以多劑量遞送時，醫藥組成物可以方便地分成每個劑量單位形式的適當量。如治療領域眾所周知的，投予的劑量取決於個體的年齡、體重和一般健康狀況。
在一些實施例中，醫藥組成物含有一種以上的PACAP胜肽免疫原結構。含有一種以上PACAP胜肽免疫原結構之混合物的醫藥組成物允許協同性增強結構的免疫功效。含有一種以上PACAP胜肽免疫原結構的醫藥組成物可在更大的遺傳群體中更為有效，這是由於廣泛的第2類MHC覆蓋，因此提供針對PACAP胜肽免疫原結構之經改善的免疫反應。
在一些實施例中，醫藥組成物含有選自SEQ ID NOs: 110-159 (表3)的PACAP胜肽免疫原結構，以及同源物、類似物及/或其組合。
在某些實施例中，將具有組合形式之衍生自MVF和HBsAg的異源性Th抗原決定位(分別為SEQ ID NOs: 81、87、90和93)的PACAP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 141-144)以等莫耳比率混合，用於製劑中，以允許對具有不同遺傳背景之宿主群體最大覆蓋。
此外，藉由PACAP胜肽免疫原結構(例如利用序列為SEQ ID NO: 94的UBITh®1)所引發的抗體反應大部分(＞90%)是集中在針對PACAP之B細胞抗原決定位胜肽的所欲求的交叉反應性，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位(實施例6，表7)。此與利用用於此種PACAP胜肽免疫原性增強的常規蛋白(例如KLH)或其他生物蛋白載體所製造的抗體形成鮮明對比。
在其他實施例中，包含胜肽組成物的醫藥組成物，例如PACAP胜肽免疫原結構混合物與作為佐劑之礦物鹽(包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJUPHOS))接觸形成懸浮液劑型，用以投予宿主。
含有PACAP胜肽免疫原結構的醫藥組成物可用以於投予後在宿主中引發免疫反應並產生抗體。c . 免疫刺激複合物
本揭露也關於含有與CpG寡核苷酸形成免疫刺激複合物的PACAP胜肽免疫原結構的醫藥組成物。此種免疫刺激複合物特別適合作為佐劑及/或胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物呈微粒形式，其可有效地將PACAP胜肽免疫原呈現給免疫系統的細胞以產生免疫反應。免疫刺激複合物可配製成用於腸胃外投予的懸浮液。免疫刺激複合物還可配製成油包水(w/o)乳液形式，作為與礦物鹽或原位凝膠聚合物結合的懸浮液，用於在腸胃外投予後將PACAP胜肽免疫原結構有效遞送至宿主免疫系統的細胞。
穩定化的免疫刺激複合物可藉由透過靜電結合將PACAP胜肽免疫原結構與陰離子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其組合複合而形成。穩定化的免疫刺激複合物可作為免疫原遞送系統併入醫藥組成物中。
在某些實施例中，將PACAP胜肽免疫原結構設計成含有陽離子部份，其於範圍為5.0至8.0的pH下帶有正電荷。PACAP胜肽免疫原結構或結構的混合物的陽離子部份的淨電荷計算是依據，每個離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)帶有+1電荷，每個天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)帶有-1電荷，以及序列中其他胺基酸所帶的電荷為0。將在PACAP胜肽免疫原結構之陽離子部份中的電荷相加，並表示為淨平均電荷。適合的胜肽免疫原具有淨平均正電荷為+1的陽離子部份。優選地，胜肽免疫原具有範圍大於+2之淨正電荷。在一些實施例中，PACAP胜肽免疫原結構的陽離子部份為異源性間隔子。在某些實施例中，當間隔子序列為(α, ε-N)Lys、(α,ε-N)-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)或Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)時，PACAP胜肽免疫原結構的陽離子部份具有+4的電荷。
如本文所述的“陰離子型分子”是指在範圍為5.0至8.0的pH下帶有負電荷的任何分子。在某些實施例中，陰離子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的淨負電荷計算是依據，在寡聚合物中的每個磷酸二酯或硫代磷酸酯基團帶有-1電荷。適合的陰離子型寡核苷酸是具有8至64個核苷酸鹼基的單鏈DNA分子，CpG基序的重複數在1至10的範圍內。優選地，CpG免疫刺激性單鏈DNA分子含有18至48個核苷酸鹼基，CpG基序的重複數在3至8的範圍內。
更優選地，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' X1 CGX2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X1 是選自由A (腺嘌呤)、G (鳥嘌呤)和T (胸腺嘧啶)組成的群組；且X2 是C (胞嘧啶)或T (胸腺嘧啶)。或者，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' (X3 )2 CG(X4 )2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X3 是選自由A、T或G組成的群組；且X4 是C或T。在具體實施例中，CpG寡核苷酸具有以下序列。CpG1: 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT TTg TCg TT 3' (完全硫代磷酸化) (SEQ ID NO: 172)、CpG2: 5'磷酸TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3' (完全硫代磷酸化) (SEQ ID NO: 173)或CpG3: 5' TCg TCg TTT TgT CgT TTT gTC gTT 3' (完全硫代磷酸化) (SEQ ID NO: 174)。
所得到的免疫刺激複合物呈顆粒形式，其大小通常在1-50微米的範圍內，且是許多因素(包括交互作用成份的相對電荷化學計量和分子量)的函數。微粒免疫刺激複合物具有提供佐劑化和體內特異性免疫反應之向上調節的優點。此外，穩定化的免疫刺激複合物適用於透過各種方法(包括油包水乳液、礦物鹽懸浮液和聚合凝膠)製備醫藥組成物。
本揭露也關於用於預防及/或治療偏頭痛的醫藥組成物，包括製劑。在一些實施例中，醫藥組成物包含穩定化的免疫刺激複合物，其是藉由混合CpG寡聚合物和含有PACAP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs: 110-159)之混合物的胜肽組成物以透過靜電結合所形成，以進一步增強PACAP胜肽免疫原結構的免疫原性，並引發與SEQ ID NO: 1之全長PACAP38胜肽交叉反應的抗體，此抗體針對PAC1結合或受體活化區域。
在又一實施例中，醫藥組成物含有PACAP胜肽免疫原結構之混合物(例如SEQ ID NOs: 110-159的任意組合)，其與CpG寡聚合物形成穩定化的免疫刺激複合物，優選地，將免疫刺激複合物與具有高安全係數之作為佐劑的礦物鹽(包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJUPHOS))混合，以形成用以投予宿主的懸浮液劑型。抗體
本揭露還提供利用PACAP胜肽免疫原結構所引發的抗體。
本揭露提供PACAP胜肽免疫原結構及其製劑，其於製造中具有成本效益，其最佳設計可引發靶向PACAP38分子上之PAC1結合區域(例如SEQ ID NOs: 7-20)或受體活化區域(SEQ ID NOs: 2-6)的高效價抗體，其於接受免疫的宿主中具有高反應率能夠破壞針對自身蛋白PACAP的免疫耐受性。利用PACAP胜肽免疫原結構產生的抗體對PAC1結合或受體活化區域具有高親和力。
在一些實施例中，用於引發抗體的PACAP胜肽免疫原結構包含PACAP胜肽的雜合，抗體靶向PACAP38分子上之PAC1結合區域或受體活化區域(分別例如SEQ ID NOs: 7-20和2-6)，PACAP胜肽透過任選的間隔子連接至衍生自病原體蛋白質的異源性Th抗原決定位(例如衍生自麻疹病毒融合(MVF)蛋白和其他蛋白質(SEQ ID NOs: 70-109和160-171))。PACAP胜肽免疫原結構之B細胞抗原決定位和Th抗原決定位胜肽共同作用以刺激與PACAP38分子(SEQ ID NO: 1)上之PACAP受體結合或活化區域交叉反應的高度特異性抗體的產生。
用以使胜肽免疫原性增強的傳統方法，例如透過化學偶聯載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH)或其他載體蛋白(例如白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)蛋白))，通常導致產生大量針對載體蛋白的抗體。因此，此種胜肽–載體蛋白組成物的主要缺陷在於利用此種免疫原所產生的大部分(＞90%)抗體是可導致抗原決定位抑制之針對載體蛋白KLH、DT或TT的非功能性抗體。
有別於用以使胜肽免疫原性增強的傳統方法，利用揭露的PACAP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs: 110-159)所產生的抗體可以高特異性結合至PACAP B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs: 2-20)，沒有太多，如果有的話，抗體則是針對異源性Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs: 70-109和160-171)或任選的異源性間隔子。
基於它們獨特的特徵和性質，由PACAP胜肽免疫原結構引發的揭露的抗體能夠提供預防性和免疫治療方法來預防及/或治療PACAP介導疾病(包括疼痛、頭痛和偏頭痛)。方法
本揭露也關於用以製備和使用PACAP胜肽免疫原結構、組成物和醫藥組成物的方法。a . 製備 PACAP 胜肽免疫原結構的方法
本揭露的PACAP胜肽免疫原結構可利用普通技術人員所熟知的化學合成方法加以製備(參見例如Fields, G.B., et al., 1992)。PACAP胜肽免疫原結構可利用自動化美利弗德(Merrifield)固相合成法來合成，利用側鏈受保護之胺基酸，以t-Boc或F-moc化學保護α-NH2 ，在例如應用生物系統胜肽合成儀430A或431型(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A或431)上進行。包含Th抗原決定位之組合資料庫胜肽的PACAP胜肽免疫原結構的製備可透過提供用於在給定可變位置進行偶聯的替代性胺基酸的混合物而達成。
在欲求之PACAP胜肽免疫原結構組裝完成後，依照標準程序處理樹脂，將胜肽從樹脂上切下，並將胺基酸側鏈上的官能基切除。可利用HPLC純化游離的胜肽，並利用例如胺基酸分析或定序以描述生化特性。胜肽的純化和表徵方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。
可以控制和確定透過此化學過程所產生之胜肽的品質，且結果是PACAP胜肽免疫原結構的再現性、免疫原性和產量可以獲得保證。透過固相胜肽合成之PACAP胜肽免疫原結構的製造的詳細描述於實施例1中提供。
已經發現允許保留欲求免疫活性之結構變異範圍比起允許保留小分子藥物特定藥物活性或與生物來源藥品共同產生的大分子中存在欲求活性及非欲求毒性的結構變異範圍更具包容性。
因此，與欲求胜肽具有相似的色層分析和免疫學特性的胜肽類似物，不論是刻意設計或因合成過程錯誤而無法避免地作為刪除序列副產物的混合物產生的，其通常如經純化之欲求的胜肽製劑具有相同的效果。只要建立嚴格的QC程序，以監控製造過程與產品評估過程，確保使用這些胜肽之終產物的再現性與功效，則經設計的類似物與非預期的類似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、載體及/或宿主細胞的重組DNA技術來製備PACAP胜肽免疫原結構。因此，編碼PACAP胜肽免疫原結構及其免疫功能類似物的核酸分子也包括在本揭露中作為本發明的一部分。類似地，包括核酸分子的載體(包括表現載體)以及含有載體的宿主細胞也包括在本揭露中作為本發明的一部分。
各種例示性實施例也包括製造PACAP胜肽免疫原結構及其免疫功能類似物的方法。例如，方法可包括在表現胜肽及/或類似物的條件下培養宿主細胞之步驟，宿主細胞包含含有編碼PACAP胜肽免疫原結構及/或其免疫功能類似物之核酸分子的表現載體。較長的合成胜肽免疫原可利用公知的重組DNA技術來合成。這些技術可於具有詳細實驗計畫之眾所周知的標準手冊中加以提供。為了構建編碼本發明胜肽的基因，將胺基酸序列反向轉譯以獲得編碼胺基酸序列的核酸序列，優選地利用對於其中具有待表現基因的生物體來說最適合的密碼子。接下來，通常透過合成編碼胜肽和任何調節因子(如有必要的話)的寡核苷酸以製造合成基因。將合成基因插入適合的選殖載體內並轉染到宿主細胞中。然後在適合所選表現系統和宿主的合適條件下表現胜肽。利用標準方法純化胜肽並描述其特性。b . 製備免疫刺激複合物的方法
各種例示性實施例還包括製造包含PACAP胜肽免疫原結構和CpG寡去氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激複合物的方法。穩定化的免疫刺激複合物(ISC)衍生自PACAP胜肽免疫原結構的陽離子部份和聚陰離子CpG ODN分子。自行組合系統是由電荷的靜電中和所驅動。PACAP胜肽免疫原結構之陽離子部分對陰離子寡聚合物的莫耳電價比例的化學計量決定締合的程度。PACAP胜肽免疫原結構和CpG ODN的非共價靜電結合是完全可再現的過程。此胜肽/CpG ODN免疫刺激複合物聚集體有助於呈現至免疫系統中“專業的”抗原呈現細胞(APC)，因此可進一步增強複合物的免疫原性。在製造過程中，可輕易地描繪此些複合物的特徵以控制品質。胜肽/CpG ISC在體內具有良好的耐受性。設計這種包含CpG ODN和PACAP胜肽免疫原結構的新穎微粒系統，以利用與CpG ODN使用相關的廣義B細胞促有絲分裂(mitogenicity)，但促進平衡的Th-1/Th-2型反應。
在揭露的醫藥組成物中的CpG ODN在由相反電荷靜電中和所介導的過程中100％結合至免疫原，導致微米大小之微粒的形成。微粒形式允許來自CpG佐劑常規使用之CpG劑量的顯著減少，不利的先天性免疫反應的可能性更低，且促進包括抗原呈現細胞(APC)在內的替代性免疫原處理途徑。因此，此種劑型在概念上是新穎的，且透過替代的機制藉由促進免疫反應的刺激而提供潛在的優點。c . 製備醫藥組成物的方法
各種例示性實施例還包括含有PACAP胜肽免疫原結構的醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥組成物是利用油包水乳液和具有礦物鹽的懸浮液的劑型。
為了使醫藥組成物可被廣大群體所使用，安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在許多臨床試驗中都使用了油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是製劑中使用的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽磷酸鋁(ADJUPHOS)經常作為製劑中的佐劑供臨床應用。
其他佐劑和免疫刺激劑包括3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A (MPL)或3-DMP、聚合或單體胺基酸，例如聚麩胺酸或聚離胺酸。此種佐劑可以與或不與其他特定的免疫刺激劑一起使用，免疫刺激劑例如胞壁醯肽(muramyl peptides) (例如N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP)、N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (nor-MDP)、N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1′-2′ dipalmitoyl -sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine (MTP-PE)、N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxy propylamide (DTP-DPP) Theramide™)，或其他細菌細胞壁成份。水包油乳液包括MF59 (參見Van Nest, G.等人的專利申請案WO 1990/014837，其透過引用整體併入本文)，含有5%角鯊烯、0.5% TWEEN 80，以及0.5% Span 85 (任選含有不同量的MTP-PE)，利用微射流機配製成次微米顆粒；SAF，含有10%角鯊烯、0.4% TWEEN 80、5% pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩渦震盪以產生大顆粒乳液；以及Ribi™佐劑系統(RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.)，含有2%角鯊烯、0.2% TWEEN 80，以及一種或多種的細菌細胞壁成份，細菌細胞壁成份選自由monophosphoryl lipid A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)以及細胞壁骨架(CWS)組成的群組，優選為MPL+CWS (Detox™)。其他佐劑包括弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)，以及細胞因子(例如介白素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)，以及腫瘤壞死因子(TNF-α))。
佐劑的選擇取決於含有佐劑之免疫原製劑的穩定性、給藥途徑、給藥計畫、佐劑對接受免疫之物種的功效，且在人類，藥學上可接受的佐劑是指已經被相關監管機構批准或可批准用於人類給藥的佐劑。例如單獨明礬、MPL或弗氏不完全佐劑((Chang, J.C.C., et al., 1998)，其透過引用整體併入本文)或其任選地所有組合適於人類投予。
組成物可包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，其被定義為通常用於配製供動物或人類給藥的醫藥組成物的載體。選擇稀釋劑以免影響組成物的生物活性。此種稀釋劑的範例是蒸餾水、生理磷酸緩衝鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液和漢克溶液。此外，醫藥組成物或劑型還可包括其他載體、佐劑或無毒的，非治療性的，非免疫原性的穩定劑等。
醫藥組成物還可包括大的緩慢代謝的大分子(例如蛋白質、多醣類(例如甲殼素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如膠乳功能化瓊脂糖(latex functionalized sepharose)、瓊脂糖(agarose)、纖維素等）、聚合胺基酸、胺基酸共聚物，以及脂質聚集體(例如油滴或脂質體)。另外，這些載體可作為免疫刺激劑(即佐劑)。
本發明的醫藥組成物可進一步包括合適的遞送載體。合適的遞送載體包括，但不限於，病毒、細菌、可生物降解的微球體、微粒、奈米粒子、脂質體、膠原蛋白微球和螺旋體(cochleates)。d . 使用醫藥組成物的方法
本揭露也包括使用含有PACAP胜肽免疫原結構之醫藥組成物的方法。
在某些實施例中，含有PACAP胜肽免疫原結構之醫藥組成物可用於治療偏頭痛。
在一些實施例中，方法包含投予包含PACAP胜肽免疫原結構之藥學上有效劑量的醫藥組成物給有其需要的宿主。在某些實施例中，方法包含投予包含PACAP胜肽免疫原結構之藥學上有效劑量的醫藥組成物給溫血動物(例如人類、食蟹獼猴、小鼠)，以引發可與全長人類/大鼠/小鼠/綿羊PACAP38分子(SEQ ID NO: 1)交叉反應的高特異性抗體。
在某些實施例中，含有PACAP胜肽免疫原結構的醫藥組成物可用於治療偏頭痛，如在體內辣椒素誘導的背側血流模型所示。e . 體外功能分析和體內概念驗證研究
由PACAP胜肽免疫原結構在接受免疫的宿主中所引發的抗體可用於體外功能分析。這些功能分析包括但不限於： (1)  與PACAP蛋白(SEQ ID NO: 1)的體外結合； (2)  體外抑制PACAP與其受體的結合; (3)  體外抑制細胞內cAMP升高; (4)  在小鼠體內抑制辣椒素誘導的背側血流模型。具體實施例
(1) 一種PACAP胜肽免疫原結構，其具有約20個或更多個的胺基酸，以以下分子式表示： (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–X 或 (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 或 (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 其中 Th為異源性T輔助細胞抗原決定位； A為異源性間隔子； (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有PACAP (SEQ ID NO: 1)的9至約22個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位胜肽； X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2 ； m為1至約4；以及 n為0至約10。 (2) 如(1)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽是選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組。 (3) 如(1)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中Th抗原決定位是選自由SEQ ID NOs: 70-109和106-171組成之群組。 (4) 如(1)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽是選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組，且Th抗原決定位是選自由SEQ ID NOs: 70-109和106-171組成之群組。 (5) 如(1)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中胜肽免疫原結構是選自由SEQ ID NOs: 110-159組成之群組。 (6) 一種PACAP胜肽免疫原結構，包含： a.   B細胞抗原決定位，其包含來自SEQ ID NOs: 1的該PACAP38序列的約9至約22個的胺基酸殘基； b.   T輔助細胞抗原決定位，其包含選自由SEQ ID NOs: 70-109和160-171及其任意組合組成之群組的胺基酸序列；以及 c.   任選的異源性間隔子，其是選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys- ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 67)及其任意組合組成之群組， 其中B細胞抗原決定位是直接或透過任選的異源性間隔子共價連接至T輔助細胞抗原決定位。 (7) 如(6)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中B細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組。 (8) 如(6)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中任選的異源性間隔子為(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 67)，其中Xaa為任意胺基酸。 (9) 如(6)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中T輔助細胞抗原決定位是共價連接至B細胞抗原決定位的氨基端或羧基端。 (10)       如(6)所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中T輔助細胞抗原決定位是透過任選的異源性間隔子共價連接至B細胞抗原決定位的氨基端或羧基端。 (11)       一種組成物，其包含如(1)所述之PACAP胜肽免疫原結構。 (12)       一種醫藥組成物，其包含： a.   如(1)所述之胜肽免疫原結構；以及 b.   藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。 (13)       如(12)所述之醫藥組成物，其中 a.   PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽是選自由SEQ ID NO: 2-20組成之群組； b.   Th抗原決定位是選自由SEQ ID NOs: 70-109和160-171組成之群組；以及 c.   異源性間隔子是選自由胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO:67)及其任意組合組成之群組；以及 其中PACAP胜肽免疫原結構與CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成穩定化的免疫刺激複合物。 (14)       如(12)所述之醫藥組成物，其中 a.  PACAP胜肽免疫原結構是選自由SEQ ID NOs: 110-131和132-159組成之群組；以及 其中PACAP胜肽免疫原結構與CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成穩定化的免疫刺激複合物。 (15)       一種用以在動物中產生針對PACAP之抗體的方法，其包含投予動物如(12)所述之醫藥組成物。 (16)       一種分離的抗體或其抗原決定位結合片段，其特異性地結合至SEQ ID NOs: 2-20的PAC1結合或活化區域。 (17)       如(16)所述之分離的抗體或其抗原決定位結合片段，其結合至PACAP胜肽免疫原結構。 (18)       一種組成物，其包含如(16)所述之分離的抗體或其抗原決定位結合片段。 (19)       一種用以在動物中預防及/或治療偏頭痛的方法，其包含投予動物如(12)所述之醫藥組成物。實施例 1. PACAP 相關胜肽的合成及其製劑的製備 a. PACAP 相關胜肽的合成
描述了包含在PACAP胜肽免疫原結構開發工作中用以合成PACAP相關胜肽的方法。以小規模量合成的胜肽用於血清學分析、實驗室試驗和田間試驗，大規模(千克)量合成的胜肽則用於醫藥組成物的工業/商業生產。為了抗原決定位鑑定，以及為了篩選和選擇用於有效靶向PACAP之治療性疫苗中的最佳胜肽免疫原結構，設計了具有長度為約9至38個胺基酸之序列的大量PACAP B細胞抗原決定位胜肽。
來自人類/小鼠/大鼠之代表性全長PACAP38 (SEQ ID NO: 1)、PACAP胜肽片段，以及在各種血清學分析中供抗原決定位鑑定使用的10-mer胜肽(SEQ ID NOs: 2-66)，列於表1中。
將選擇的PACAP B細胞抗原決定位胜肽透過合成方法連接至衍生自病原體蛋白(包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)、B型肝炎表面抗原蛋白(HBsAg)、流行性感冒病毒、破傷風梭菌，以及Epstein-Barr病毒(EBV))之經周密設計的T輔助細胞(Th)抗原決定位胜肽(如表2所示(SEQ ID NOs: 70-109和160-171))，以製成PACAP胜肽免疫原結構。Th抗原決定位胜肽是以單一序列(例如SEQ ID NOs: 71、78、82-86、88-89、91-92、94-95、160-163、165-166和168-171)或組合序列(例如SEQ ID NOs: 81、87、90、93、164和167)形式使用，以增強其各自PACAP胜肽免疫原結構的免疫原性。
表3 (SEQ ID NOs: 110-159)中鑑定了選自數百種胜肽結構的代表性PACAP胜肽免疫原結構。用於供抗PACAP抗體偵測及/或測量之免疫原性研究或相關血清學測試的所有胜肽是在應用生物系統胜肽合成儀430A、431及/或433型上利用F-moc化學小規模合成。每一個胜肽是透過在固相載體上的獨立合成所製備，在三官能基胺基酸的氨基端與側鏈保護基團具有F-moc保護。將完整的胜肽從固相載體上切下，並用90％三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基團。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀評估合成的胜肽產物以確定正確的胺基酸組成。也利用反相HPLC (RP-HPLC)評估各個合成胜肽以確認產物的合成樣態與濃度。儘管嚴格控制合成過程(包括逐步地監測偶合效率)，由於在延長循環中某些意外事件，包括胺基酸的插入、刪除、取代及提前終止，仍可能產生胜肽類似物。因此，合成產物一般包括多種胜肽類似物與目標胜肽。
儘管包括這些非預期的胜肽類似物，但最後的合成胜肽產物仍可用作免疫應用，包括免疫診斷(作為抗體捕捉抗原)與醫藥組成物(作為胜肽免疫原)。一般來說，只要開發嚴格的QC程序來監測製造過程及產品品質評估程序，以確保使用這些胜肽之最終產物的再現性與功效，此胜肽類似物，包括刻意設計或合成程序中產生的副產物混合物，通常可如欲求胜肽的純化產物同樣有效。可利用客製的自動胜肽合成儀UBI2003或類似機型以15 mmole至150 mmole的規模合成數百至數千克的大量胜肽。
對於供臨床試驗之最終醫藥組成物使用的活性成分，可利用預備的RP-HPLC於淺洗湜梯度下純化PACAP胜肽免疫原結構，並利用MALDI-TOF質譜、胺基酸分析和RP-HPLC描繪純度與一致性的特性。b . 含有 PACAP 胜肽免疫原結構之組成物的製備
製備採用油包水乳液和具有礦物鹽之懸浮液的劑型。為了設計醫藥組成物供廣大族群使用，安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在人類許多醫藥組成物的臨床試驗中使用油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是用於醫藥組成物中的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽ADJUPHOS (磷酸鋁)經常作為佐劑供臨床應用製劑的使用。
簡而言之，在以下描述的每個實驗組中所指定的劑型通常含有所有類型專門設計的PACAP胜肽免疫原結構。對於其相對免疫原性(此免疫原性是針對作為B細胞抗原決定位胜肽之相對應PACAP胜肽)，在天竺鼠中仔細評估了超過40種專門設計的PACAP胜肽免疫原結構。利用塗覆胜肽的孔盤(使用胜肽選自表格所列序列SEQ ID NOs: 1-66)以ELISA試驗在各種同源性胜肽中分析抗原決定位鑑定和血清學交叉反應。
如指定，利用經核准供人類使用的油劑Seppic MONTANIDE™ ISA 51以油包水乳液形式，或與礦物鹽ADJUPHOS (磷酸鋁)或ALHYDROGEL (明礬)混合，以配製不同量的PACAP胜肽免疫原結構。通常利用將PACAP胜肽免疫原結構以約20至2000 µg/mL濃度溶解於水中，並與MONTANIDE™ ISA 51配製成油包水乳液(1:1體積)，或者與礦物鹽ADJUPHOS或ALHYDROGEL (明礬) (1:1體積)配製，以製成組成物。將組成物置於室溫下約30分鐘，並在免疫接種前利用漩渦震盪混合約10至15秒。利用2至3個劑量的特定組成物免疫接種動物，其在時間0 (初次免疫)和初次免疫後(wpi) 3週(加強免疫)投予，任選5或6 wpi進行第二次加強免疫，透過肌內途徑投藥。然後利用選定的B細胞抗原決定位胜肽測試來自接受免疫接種之動物的血清，以評估存在於劑型中的各種PACAP胜肽免疫原結構的免疫原性，以及相對應血清與PACAP蛋白的交叉反應性。針對其相對應血清的功能特性，將最初在天竺鼠篩選中發現的那些具有強免疫原性的PACAP胜肽免疫原結構在體外實驗中做進一步測試。然後，以油包水乳液、礦物鹽和基於明礬的配方製備所選的候選PACAP胜肽免疫原結構，按照免疫方案在指定的特定期間內進行給藥方案。
在試驗用新藥申請之後於患有偏頭痛之患者中進行臨床試驗的提交準備中，只有最有希望的PACAP胜肽免疫原結構會在被納入供於GLP指導的臨床前研究中針對免疫原性、持續時間、毒性和功效研究之最終劑型之前會進行進一步廣泛的評估。
以下實施例是用於說明本發明，且不用以限制本發明的範圍。實施例 2. 血清學試驗和試劑
以下詳細描述用以評估PACAP胜肽免疫原結構及其製劑之功能性免疫原性的血清學試驗和試劑。a . 供免疫原性和抗體特異性分析之基於 PACAP 或 PACAP B 細胞抗原決定 位胜肽的 ELISA 試驗
開發並於下文描述於以下實施例中所述用以評估免疫血清樣品的ELISA試驗。利用配製於pH 9.5之10mM碳酸氫鈉緩衝液(除非另有說明)中濃度為2 μg/mL (除非另有說明)的PACAP或PACAP B細胞抗原決定位胜肽(例如SEQ ID NOs: 1至66)，將其以100 μL體積於37°C下作用1小時，以分別地塗覆96孔盤的孔洞。
將以PACAP或PACAP B細胞抗原決定位胜肽塗覆的孔洞與250 μL配製於PBS中濃度為3重量百分比的明膠於37°C下反應1小時，以阻斷非特異性蛋白質結合位點，接著利用含有0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞三次並乾燥。利用含有20體積百分比正常山羊血清、1重量百分比明膠和0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS以1:20比例(除非另有說明)稀釋待測血清。將100微升(100 μL)稀釋樣品(例如血清、血漿)加入每個孔洞並於37°C下反應60分鐘。然後利用配製於PBS中濃度為0.05體積百分比的TWEEN® 20洗滌孔洞6次，以移除未結合的抗體。使用辣根過氧化物酶(HRP)共軛物種(例如天竺鼠或大鼠)特異性山羊多株抗IgG抗體或蛋白質A/G作為標記的示蹤劑，以在陽性孔洞中與形成的抗體/胜肽抗原複合物結合。將100微升(100 μL) HRP標記的偵測試劑以預滴定的最佳稀釋倍數配製於內含1體積百分比正常山羊血清與0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS中，將其加到每個孔洞中，並在37°C下再反應30分鐘。利用內含0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞6次以移除未結合的抗體，並與100 μL含有 0.04重量百分比3’, 3’, 5’, 5’-四甲基聯苯胺(TMB)和0.12體積百分比過氧化氫於檸檬酸鈉緩衝液中的受質混合物再反應15分鐘。藉由形成有色產物利用受質混合物以偵測過氧化物酶標記。藉由加入100 μL的1.0M硫酸終止反應並測定450 nm處的吸光值(A450 )。為了測定接受各種胜肽疫苗製劑之疫苗接種動物的抗體效價，將從1:100至1:10,000之10倍連續稀釋的血清或從1:100至1: 4.19x 108 之4倍連續稀釋的血清進行測試，且利用A450 臨界值設為0.5之A450 的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10 表示。b . 利用基於 Th 胜肽的 ELISA 試驗評估針對 Th 胜肽的抗體反應性
以類似的ELISA方法並如上所述進行，利用配製於pH 9.5之10mM碳酸氫鈉緩衝液(除非另有說明)中濃度為2 μg/mL (除非另有說明)的100 μL Th胜肽於37°C下作用1小時，以分別地塗覆96孔ELISA盤的孔洞。為了測定接受各種PACAP胜肽疫苗製劑之疫苗接種動物的抗體效價，將從1:100至1:10,000之10倍連續稀釋的血清進行測試，且利用A450 臨界值設為0.5之A450 的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10 表示。c . 透過基於 B 細胞抗原決定位簇 10-mer 胜肽之 ELISA 試驗利用抗原決定位鑑定對目標 PACAP B 細胞抗原決定位胜肽進行精細特異性分析
利用基於B細胞抗原決定位簇10-mer胜肽之ELISA試驗利用抗原決定位鑑定對來自利用PACAP胜肽免疫原結構免疫接種之宿主的抗PACAP抗體進行精細特異性分析。簡而言之，依照上述抗體ELISA方法的步驟，以二重複方式，利用每孔洞每0.1mL含有0.5 μg之個別PACAP或相關10-mer胜肽(SEQ ID NOs: 21-66)塗覆96孔盤的孔洞，然後將100 μL血清樣品(配製於PBS中，稀釋倍數為1:100)於10-mer盤孔洞中進行反應。為了特異性確認，利用相對應PACAP胜肽或非相關的對照胜肽對來自接受免疫之宿主的抗PACAP抗體進行目標B細胞抗原決定位特異性分析。d . 免疫原性評估
依照實驗疫苗接種程序收集來自動物或人類個體的免疫前和免疫血清樣品，並在56°C下加熱30分鐘以使血清補體因子失活。在投予疫苗製劑後，根據程序獲得血液樣品，並利用基於相對應PACAP B細胞抗原決定位胜肽的ELISA試驗評估其針對特定靶點的免疫原性。測試了連續稀釋的血清，並將稀釋倍數之倒數取對數(Log10 )以表示陽性效價。對於其能力(引發針對目標抗原內欲求抗原決定位特異性之高效價抗體反應和與PACAP蛋白高交叉反應性，且同時將針對用以提供欲求B細胞反應增強之T輔助細胞抗原決定位之抗體反應性維持在低至可忽略)，而評估特定疫苗製劑的免疫原性。實施例 3. 在針對細胞內 cAMP 產生之體外試驗中評估利用 PACAP 胜 肽免疫原結構及其製劑所引發之抗體的功能特性
進一步測試免疫疫苗中之免疫血清或純化的抗PACAP抗體抑制PACAP誘導的細胞內cAMP產生的能力。a . 抗體純化
根據蛋白質A瓊脂糖凝膠CL-4B抗體純化樹脂(GE Healthcare, Life Sciences, 貨號17-0963-03)的使用手冊，遵循所有抗體純化程序。針對每個組別各自的IgG純化濃度被仔細校正以用於體外測定。b . 細胞製備和維持
SH-SY5Y細胞株購自美國典型培養物保藏中心(CRL-2266TM , Manassas, VA)。此細胞株的基礎培養基是將ATCC配製的伊格爾最低限度必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)(貨號為30-2003)和F12培養基以1:1比例配製的混合物。加入胎牛血清至終濃度為10%以製成完整的生長培養基。將細胞維持於溫度為37°C含有5% CO2 之加濕的細胞培養箱中。c . cAMP 水平檢測
在cAMP測定中，針對其中和PACAP38誘導的cAMP產生的能力，評估了來自免疫接種代表性PACAP胜肽免疫原結構之天竺鼠之12 wpi免疫血清的個別的純化抗體的效力。將來自免疫接種天竺鼠的血清(體積為300 µL)利用蛋白A進行純化。將這些來自個別免疫血清之純化的抗體與人類重組PACAP38蛋白(5nM)在37°C下反應1小時。在用於細胞內cAMP偵測之cAMP分析中，將人類SH-SY5Y細胞進行胰蛋白酶消化，並以2 x106 /mL的密度重新懸浮，在0.3%含有IBMX的血清培養基中含有20,000個細胞。將PACAP38蛋白/抗體混合物分別以相等的比例轉移到96孔白色聚苯乙烯微量盤上，並在室溫下反應30分鐘。下述cAMP-Glo分析(Promega, 貨號V1501)，將7.5 µL裂解緩衝液添加到每個孔洞中，然後反應30分鐘。在反應期間，在反應緩衝液中新鮮製備蛋白質激酶A，並將15 µL PKA緩衝液添加到每個孔洞中且再反應20分鐘。反應後，將30 µL激酶-Glo緩衝液加入每個孔洞中且再反應10分鐘。反應後，透過冷光分析儀(SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader)讀取來自微量盤的信號。針對其抑制PACAP38誘導的細胞內cAMP產生的能力，將來自免疫接種動物之免疫血清或純化的抗PACAP38抗體做進一步測試。實施例 4. 用於安全性、免疫原性、毒性和功效研究的動物 a. 天竺鼠：
在成熟，未與抗原接觸或未受抗原刺激的(naïve)，成年雄性和雌性Duncan-Hartley天竺鼠(300-350 g/BW)中進行免疫原性研究。實驗中每一組使用至少3隻天竺鼠。在聯合生物醫學公司(UBI)作為試驗委託者之簽訂合約的動物設施依照經核准的IACUC申請進行涉及Duncan-Hartley天竺鼠(8–12週齡；Covance Research Laboratories, Denver, PA, USA)的試驗計畫。b . 利用 PACAP 38 胜肽免疫原結構免疫天竺鼠
總共使用66隻天竺鼠進行免疫，並將所有天竺鼠分為22組。利用個別PACAP胜肽免疫原結構(與ISA 51和CpG一同配製，PACAP胜肽免疫原結構含量為400μg/1.0mL/劑)給實驗組的動物注射，以肌內途徑進行初次免疫和加強免疫。在0、3、6、9、12 WPI投予總共五劑。所有動物都可以自由進食飼料和水。在0、3、6、9、12和15 WPI對動物進行採血。為了進行針對PACAP38的效價測定，收集血液樣品透過ELISA進行免疫原性評估。如上所述，針對其抑制細胞內cAMP產生的個別能力，透過使用cAMP分析檢測cAMP水平，對於從12 wpi免疫血清中收集的純化抗體做進一步的分析。所有試驗計畫均遵循實驗動物護理原則。如試驗計畫所述進行採血。利用ELISA分析針對抗PACAP (小鼠)檢測抗體效價。實施例 5. 提供於天竺鼠中進行 PACAP 胜 肽結構免疫原性評估的疫苗製劑
在各個實驗中使用的醫藥組成物和疫苗製劑如以下內容所示更加詳細地描述。
簡而言之，在每個實驗組中所指定的劑型通常含有所有類型專門設計的PACAP胜肽免疫原結構，其具有PACAP B細胞抗原決定位胜肽片段，PACAP B細胞抗原決定位胜肽片段透過不同類型間隔子(例如εLys (εK)或lysine-lysine-lysine (KKK)以增強胜肽結構的溶解度)連接至混雜T輔助細胞抗原決定位，混雜T輔助細胞抗原決定位包含衍生自麻疹病毒融合蛋白和B型肝炎表面抗原的兩組人工T輔助細胞抗原決定位。PACAP B細胞抗原決定位胜肽連接至專門設計的胜肽結構的氨基端或羧基端。最初針對其與相對應PACAP B細胞抗原決定位胜肽的相對免疫原性在天竺鼠中對許多專門設計的PACAP胜肽免疫原結構進行評估。如指定，將不同量的PACAP胜肽免疫原結構配製於使用經核准供人類疫苗使用的油劑Seppic MONTANIDE ISA 51的油包水乳液中或使用礦物鹽(ADJUPHOS)或ALHYDROGEL (明礬)的懸浮液中。通常利用將PACAP胜肽結構以約20至800 µg/mL濃度溶解於水中，並與MONTANIDE ISA 51配製成油包水乳液(1:1體積)，或者與礦物鹽(ADJUPHOS)或ALHYDROGEL (明礬) (1:1體積)配製，以製成製劑。將製劑置於室溫下約30分鐘，並在免疫接種前利用漩渦震盪混合約10至15秒。
利用2至5個劑量的特定疫苗製劑免疫接種一些動物，其在時間0 (初次免疫)和初次免疫後(wpi) 3週(加強免疫)投予，任選5或6 wpi進行第二次加強免疫，透過肌內途徑投藥。然後，針對其與相對應PACAP B細胞抗原決定位胜肽或全長PACAP的交叉反應性，對於在個別製劑中使用之相對應PACAP胜肽免疫原結構的免疫原性，評估這些接受免疫的動物。針對在如免疫方案指定之特定期間內的給藥方案，將在天竺鼠初次篩選中具有強免疫原性的那些PACAP胜肽免疫原結構在其他生物體中於油包水乳液、礦物質鹽類和以明礬為基底的製劑內進行進一步測試。
利用PACAP胜肽免疫原結構，針對突破免疫耐受性的能力，只將最有希望的PACAP胜肽免疫原結構候選物進行進一步廣泛評估。在小鼠中具有最佳免疫原性的PACAP胜肽免疫原結構，其可引發針對內源性PACAP的抗PACAP抗體效價；特別是由於其具有在小鼠模型中抑制辣椒素誘導的皮膚血流的能力。將優化的PACAP胜肽免疫原結構納入最終疫苗劑型中，提供在提交研究性新藥申請準備之GLP指導的免疫原性、持續時間、毒性和功效證明的研究中和在偏頭痛患者進行的臨床試驗中使用。實施例 6. 用於治療偏頭痛之包含 PACAP 胜 肽免疫原結構的多組分疫苗製劑的設計合理性、篩選、鑑定、功能特性評估和優化
基於在背景技術部分中描述的科學資訊，選擇PACAP作為目標分子供揭露的胜肽免疫原結構設計使用。第1圖描述基於高精密度專門設計合成胜肽的疫苗製劑從發現到商業化(工業化)的途徑。對每個步驟詳細評估和分析在過往導致無數的實驗，最終將導致安全且有效含有PACAP胜肽免疫原結構的藥物製劑的商業化。a . 設計歷史
每種胜肽免疫原結構或免疫治療產品都需要自己的設計重點和方法，設計重點和方法是基於其特定的疾病機制和干預所需的目標蛋白。對於疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的治療，選擇PACAP作為干預的目標分子。如第1圖所示，從發現到商業化的過程通常需要一至數十年才能完成。與用於干預之功能位點相關的PACAP B細胞抗原決定位胜肽的鑑定是免疫原結構設計的關鍵。在各種製劑中包含各種T輔助細胞支持物(T helper support)(載體蛋白或合適的T輔助細胞胜肽)在天竺鼠中進行連續的先導免疫原性研究，且之後在特定體外功能分析或於選定的動物模型所進行的體內概念驗證研究中評估所引發純化抗體或使用特定PACAP胜肽免疫原結構之疫苗製劑的功能特性。經過廣泛的血清學驗證，然後在非人類靈長類動物中進一步測試候選PACAP B細胞抗原決定位胜肽免疫原結構，以進一步驗證PACAP胜肽免疫原設計的免疫原性和方向。以不同的混合物配製選擇的PACAP胜肽免疫原結構，以評估當組合使用時在胜肽結構間與各自交互作用有關之功能特性的細微差異。經過額外的評估，確定最終的胜肽結構、胜肽組成物及其藥物製劑，以及製劑的各個物理參數，從而導致最終產品的開發過程。
基於多種設計理論選擇PACAP胜肽免疫原結構的胺基酸序列。這些理論中的幾個包括使用PACAP B細胞抗原決定位胜肽序列，此序列： (i)        PACAP內缺乏自體T輔助細胞抗原決定位以避免自體T細胞活化； (ii)       本身是非免疫原性的，因為其為自身的分子； (iii)      當投予宿主時，透過使用蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位，可以使其獲得免疫原性； (iv)      引發針對PACAP胜肽序列(B細胞抗原決定位)且非針對蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位的高效價抗體； (v)       引發高效價的抗體，其可抑制由於PACAP和PACAP受體交互作用以及細胞活化所引起的細胞內cAMP升高； 以及 (vi)      此疫苗製劑在投予動物模型(例如BALB/C小鼠)時可抑制辣椒素誘導的背側血流，可作為治療疼痛(包括頭痛和偏頭痛)的概念驗證證據。b. 用於醫藥組成物之 PACAP 胜肽免疫原結構的設計和驗證，此醫藥組成物具有治療易患或患有疼痛(包括頭痛和偏頭痛 ) 的患者的潛力
為了產生最有效的胜肽免疫原結構以包含進入醫藥組成物中，人類PACAP B細胞抗原決定位胜肽的組庫(例如SEQ ID NOs: 2-20)和衍生自各種病原體或人工T輔助細胞抗原決定位的混雜T輔助細胞抗原決定位(例如SEQ ID NOs: 70-109和160-171)被進一步設計並製成例如代表性PACAP胜肽免疫原結構(例如SEQ ID NOs: 110-159)，提供最初用於天竺鼠的免疫原性研究。i) 從受體結合或受體活化區域中選擇 PACAP B 細胞抗原決定位胜肽序列進行設計
選擇位於PACAP中央/羧基端的PAC1結合區域和位於PACAP氨基端C2-C7環狀結構/中央區域的受體活化區域進行PACAP B細胞抗原決定位設計。然後這些B細胞抗原決定位胜肽被製成胜肽免疫原結構以在天竺鼠引發免疫血清，免疫血清起初提供透過在PACAP B細胞抗原決定位胜肽塗覆的微量盤上利用ELISA進行免疫原性測定，之後提供進行體外功能分析評估。
PACAP與PAC1結合後，PAC1會在細胞內傳遞活化訊號，從而在其他細胞事件中導致細胞內cAMP水平升高。當與缺乏抗體的對照組相比時，如第8圖和在第8圖內顯示之表格所示，來自天竺鼠免疫血清針對特定PACAP胜肽免疫原結構之純化的抗體具有能力去中和PACAP功能特性，能力評估為抑制50%的cAMP升高的IC50 。
起初利用ISA 51和CpG配製這些PACAP胜肽免疫原結構，以400 μg/1mL的劑量在天竺鼠中進行初次免疫，並以100μg/0.25mL的劑量進行加強免疫(3、6和9 wpi)，供免疫原性研究。為了測試在天竺鼠中的免疫原性，使用ELISA試驗，將來自各次(wpi)採血的天竺鼠免疫血清以10倍連續稀釋的方式從1: 100稀釋至1:10,000。以每孔洞0.5 µg胜肽的量利用相對應PACAP B細胞抗原決定位胜肽和全長PACAP38胜肽塗覆ELISA微量盤。利用A450 臨界值設為0.5之A450 的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10 表示，如第5圖所示，在表4、5和6則顯示代表性B細胞抗原決定位衍生的PACAP胜肽免疫原結構的詳細效價。儘管設計的短PACAP B細胞抗原決定位胜肽由於其缺乏內源性Th抗原決定位而本身通常是非免疫原性的，但是外源性Th抗原決定位的添加可增強特定PACAP胜肽免疫原結構的免疫原性。表4、5和6以及第5圖顯示各種結構之反應性/特異性模式的詳細分析。可以評估PACAP分子內某些殘基所賦予的免疫原性，此將有助於進一步設計最佳的胜肽免疫原結構。ii) 在所選 PACAP B 細胞抗原決定位內缺乏自體 T 輔助細胞抗原決定位以避免自體 T 細胞活化
測試未與異源性Th抗原決定位胜肽連接的代表性PACAP B細胞抗原決定位自身產生抗體的能力。進行實驗並發現，B細胞抗原決定位胜肽沒有引發針對PACAP的任何抗體，因此在所選的PACAP B細胞抗原決定位內沒有非欲求的內源性Th抗原決定位(數據未顯示)。iii) 利用 PACAP 胜 肽免疫原結構所引起的集中抗體反應僅靶向 PACAP B 細胞抗原決定位
眾所周知，用以加強針對標靶B細胞抗原決定位胜肽之免疫反應的所有載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH)、白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)蛋白))，透過將這種B細胞抗原決定位胜肽與各自載體蛋白化學共軛可引發超過90％的抗體是針對增強載體蛋白，而少於10％的抗體是針對免疫宿主中的標靶B細胞抗原決定位。因此，對於本發明PACAP胜肽免疫原結構之特異性的評估感興趣。
測試了含有SEQ ID NOs: 3和5之B細胞抗原決定位的代表性PACAP胜肽免疫原(SEQ ID NOs: 111和114)，以確定胜肽免疫原結構所引發的抗體是否針對胜肽免疫原結構的B細胞抗原決定位部分或Th抗原決定位部分。如表7所示，由這些胜肽免疫原結構引發的抗體特異性地針對胜肽免疫原結構的PACAP B細胞抗原決定位，而非異源Th抗原決定位部分。iv) 利用針對所選 PACAP 胜 肽免疫原結構的免疫血清進行精細的抗原決定位鑑定 (epitope mapping)
在精細抗原決定位鑑定研究中，將抗體結合位點定位至在目標B細胞抗原決定位區域內的特定殘基上，設計46個重疊的10-mer胜肽(SEQ ID NOs: 21-6)，其涵蓋涵蓋PACAP全長區域以及PACAP分子加工前後的前驅物序列第-10個胺基酸至第45個胺基酸的序列。將這些10-mer胜肽作為固相免疫吸附物分別塗覆至96孔微量盤的孔洞上。將以1:100稀釋比例配製於樣品稀釋緩衝液中的匯集的天竺鼠抗血清加到利用2.0 μg/mL的10-mer胜肽塗覆的微量盤孔洞中，隨後在37˚C下培養1小時。在利用洗滌緩衝液洗滌微量盤孔洞後，加入辣根過氧化物酶(HRP)共軛重組蛋白A/G並培養30分鐘。利用PBS再次洗滌後，將受質加入孔洞中，利用ELISA微量盤式分析儀測量450nm處的吸光值，以二重複方式分析樣品。PACAP胜肽免疫原所引發免疫血清與相對應PACAP B細胞抗原決定位胜肽塗覆孔洞的結合代表最大的抗體結合信號。
總而言之，設計的合成PACAP胜肽免疫原結構在天竺鼠中誘導了強大的免疫反應，產生了針對PACAP中不同的10-mer胜肽簇的多株抗體，這些10-mer胜肽簇與PAC1結合和活化區域非常接近，可提供重要的醫學干預。抗原決定位鑑定和功能分析評估將允許鑑定用於疫苗製劑的最佳胜肽免疫原結構。實施例 7. 在體外模式下對利用 PACAP 胜 肽免疫原結構及其製劑所引發的抗體進行功能特性評估
如表4、5、6、7、8和9所示，在證明從利用精心挑選的候選PACAP免疫原結構免疫之天竺鼠的免疫血清純化而來的抗體具有高免疫原性和交叉反應性之後，設計了以下研究以評估來自每隻動物在6 wpi收集之這些免疫血清的代表性純化的IgGs是否能夠抑制在PACAP與其受體(PAC1)結合後由於藉由PACAP中C2-C7環狀結構的活化而導致cAMP的細胞內升高。
在平滑肌細胞內的分子層次上，PACAP可透過其羧基端區域與其受體結合，然後使用其環狀結構區域活化受體。具有雙硫鍵之環狀的C2-C7環狀結構在受體活化中具有核心作用，受體活化與細胞內cAMP的升高密切相關。在中和測定中，使用多種抗PACAP IgGs來表徵其潛在的抗PACAP影響。使用細胞內cAMP水平的改變透過功能藥理學評估效果。此體外功能評估對於評估那些針對本發明PACAP胜肽免疫原結構之天竺鼠免疫血清的抗PACAP作用特別重要，在上述實施例中詳述測定方法。利用抗 PACAP 抗體在 PACAP 活化的磷酸化中抑制細胞內 cAMP 升高
如實施例4所述收集來自每隻動物之6 wpi採血的免疫血清並純化抗體。如實施例6所示，針對其個別免疫原性在天竺鼠中測試21種PACAP胜肽免疫原結構。基於其在胜肽免疫原結構中所使用的個別目標B細胞抗原決定位胜肽而將純化的抗體分為三類。它們分別地針對來自氨基端、中央和羧基端區域的B細胞抗原決定位胜肽。以在PACAP處理的L6細胞中檢測到之cAMP的百分比記錄數據。0%代表僅L6細胞，而100%代表PACAP處理的L6細胞。如第7和8圖以及隨附的表格所示，對於cAMP水平而言，包含來自氨基端、中央或羧基端區域之PACAP B細胞抗原決定位胜肽的結構展現從0.60至＞20的IC50 (µg/mL)。出於實用目的，小於10µg/mL的IC50 數值被視為在抗體介導的cAMP產生抑制中具有重要意義。表現出有效功能免疫原性之代表性結構的排名(具有從低到高的IC50 µg/mL)為SEQ ID NOs: 130 ＞ 127 ＞ 150 ＞ 125 ＞ 137 ＞ 123 ＞ 121 ＞ 119 ＞ 124 ＞ 131 ＞ 126 ＞ 133 ＞ 120 ＞ 129 ＞ 135 ＞ 116 ~ 117 ~ 118 ~ 128 ~ 139，如第9圖所示。這些數據有助於描述PACAP胜肽免疫原結構的最佳設計，此結構的精確度最高可達PACAP結構內的幾個殘基。
總之，如上所示之PACAP胜肽免疫原結構在其個別功能特性的相對排名對於在後續PACAP疫苗製劑中的使用具有價值以證明功能性功效。實施例 8. 辣椒素誘導的皮膚血管舒張小鼠模型
如下所述，針對其減少辣椒素誘導的皮膚血流的能力，測試了三種不同的PACAP38胜肽免疫原結構。方法
從BioLASCO Taiwan Co., Ltd.購買28隻4週齡雌性BALB/c小鼠。在適應環境3天後，將動物隨機分組以接受安慰劑或含有PACAP38胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 112、127和114)的製劑。對動物進行的所有操作均依照設於UBIA之實驗動物照護及使用委員會(IACUC)審查和批准的規章和指引。用以總結實驗的示意圖如第10A圖所示。
依據指引，將BALB/c小鼠(10–12週，25–28 g)以12小時光照/黑暗週期圈養在籠中。可自由飲水與進食標準飼料。將總共28隻小鼠隨機分為4組(n= 7)：(1) 安慰劑、(2) SEQ ID NO: 112、(3) SEQ ID NO: 127以及(4) SEQ ID NO: 114。
利用Seppic MONTANIDE™ ISA 51VG (1:1體積)、濃度為100 µg/mL的CpG3以及0.2% TWEEN80，將PACAP胜肽免疫原結構SEQ ID NOs: 112、127和114配製於油包水乳液中。利用4劑相關製劑(安慰劑或PACAP38胜肽免疫原結構)對小鼠進行免疫，這些製劑是在時間0 (初次免疫)投予，並在初次免疫後(wpi) 3、6和9週加強免疫，透過肌內途徑投藥，如第10A圖所示。在第2、3和4組中的小鼠分別接受含有SEQ ID NOs: 112、127和114的製劑，其劑量為配製於0.1 ml體積中具有40 µg相關胜肽免疫原結構。
配製辣椒素溶液，將9.6 mg辣椒素(Sigma, 貨號M2028, 批號SLCB0726)溶於50% EtOh、33.3% TWEEN20、16.7% 2dH2 O中以製備濃度為40 mg/mL之濃縮的儲備辣椒素溶液。
從6 wpi開始，評估每組小鼠之辣椒素誘導的皮膚血流(DBF)。對於實驗，將小鼠麻醉(1.5-2體積百分比異氟醚)並置於加熱墊上，以在整個實驗過程中將它們的體溫維持在恆定的37°C。連續三天進行實驗。在研究開始之前，將右耳展平以施用辣椒素。將受測小鼠的右耳展平後，使用雷射都卜勒血流監視器(MoorVMS-LDF1, Moor Instruments, Devon UK) (雷射都卜勒血流監視器配備光學探針，探針以直角放置在耳朵皮膚上方)以獲得耳朵皮膚血流的基線掃描。獲得基線掃描後，將5 µL含有0.2 mg辣椒素的溶液(來自40 mg/mL儲備辣椒素溶液)局部地用於耳朵皮膚表面，並且監測血流和溫度。連續15分鐘使用雷射都卜勒血流監視器測量對辣椒素之血流反應的時程。使用moorVMS-PC-軟體分析數據。結果
在第10B圖中提供此研究的結果。透過使用不成對雙尾司徒頓t檢定(unpaired two-tailed Student’s t-test)將每個測試組與安慰劑組進行比較以評估數據。P值= 0.001至0.01，以“ ** ”表示；P值= 0.01至0.05，以“ * ”表示；且數據以帶有平均值的標準誤差(±SEM)的平均值的形式表示。
結果顯示，相對於在整個實驗過程中接受含有PACAP38胜肽免疫原結構之製劑的第2-4組的小鼠，給予安慰劑的第1組小鼠皮膚血流(DBF)流量增加的幅度最大。因此，與第1組的小鼠相比，第2-4組的小鼠流量增加的幅度始終較低，表明本研究中測試的所有PACAP38胜肽免疫原結構均能夠減少辣椒素誘導的DBF。
在6和9 wpi的結果顯示，辣椒素誘導的DBF降低幅度從最大到最小的排名如下：SEQ ID NO: 112 ＞ 127 ＞ 114 ＞安慰劑。
在12 wpi的結果顯示，辣椒素誘導的DBF降低幅度從最大到最小的排名如下：SEQ ID NO: 114 ＞ 127 ＞ 112 ＞安慰劑。
在15 wpi的結果顯示，辣椒素誘導的DBF降低幅度從最大到最小的排名如下：SEQ ID NO: 112 ≈ 127 ＞ 114 ＞安慰劑。
合起來看，這項研究的結果表明，在這項研究中測試的PACAP38胜肽免疫原結構能夠減少辣椒素誘導的DBF。另外，如第9圖所示，含有SEQ ID NOs: 112、127和114之製劑的結果與其引發中和抗體以抑制細胞內cAMP釋出的能力是一致的。實施例 9. 利用針對 PACAP38 胜 肽免疫原結構的免疫血清進行精細的抗原決定位鑑定
進行精細的抗原決定位鑑定研究，以將抗體結合位點定位至位於PACAP38多胜肽內的特定殘基。方法
合成46個重疊的10-mer胜肽(SEQ ID NOs: 21-66)，其涵蓋涵蓋PACAP38全長區域以及PACAP38多胜肽加工前後的前驅物序列的第-10個胺基酸至第45個胺基酸序列。
將10-mer胜肽溶解在二甲基甲醯胺中製成1 mg/ml儲備液，並保持在-20°C直至使用之時。每孔洞利用100 µL胜肽(濃度為2 µg/mL)在室溫下進行胜肽塗覆隔夜反應。對於多胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 112、115、117、119、122、125、127和128)，12 wpi的天竺鼠抗血清以1/100的稀釋倍數使用，但將陽性對照做進一步稀釋(至1/10,000)。將每個樣品(100 µl/孔洞)在37°C下反應2小時。使用250 µL洗滌緩衝液(1X)洗滌微量盤六次。使用標準化製備的HRP-重組蛋白A/G (1:100)在37°C下作用1小時以檢測結合的抗體，然後使用洗滌緩衝液洗滌微量盤6次。最後，以100 µL/孔洞的量將TMB受質工作溶液加到每個孔洞內，並在黑暗中於37°C反應15分鐘，然後透過添加100 µL/孔洞的終止溶液來終止反應。利用ELISA微量盤式分析儀(Molecular Device, Model: VersaMAx)測量450 nm處的吸光值。顯示450 nm處的吸光值高於1的結果作為陽性截止值。針對相對應PACAP38 B細胞抗原決定位胜肽塗覆孔洞評估得自利用PACAP38胜肽免疫原結構免疫之動物的免疫血清的抗體結合，以確定最大的抗體結合信號。結果
表8顯示此精細的抗原決定位鑑定實驗的結果。結果摘要如下： a.   衍生自或含有PACAP38之氨基端區域的胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 112和115)引發針對全長PACAP38胜肽(SEQ ID NO: 1)具有高反應性的抗體。這些結構引發針對來自PACAP38之氨基端區域(aa3-18)的10-mer胜肽的強抗體，且未發現對PACAP38的其他B細胞抗原決定位區域具有反應性。 b.   衍生自或含有PACAP38之中央區域的胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 117、119、122和125)對全長PACAP38多胜肽(SEQ ID NO: 1)具有弱至中等的反應性。胜肽免疫原結構SEQ ID NO: 117對全長PACAP38多胜肽具有中等反應性，而胜肽免疫原SEQ ID NOs: 119、122和125僅對全長多胜肽具有弱反應性。然而，衍生自或含有PACAP38之中央區域的胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 117、119、122和125)對PACAP38的中央區域具有反應性。 c.   衍生自或含有涵蓋PACAP38之羧基端區域的B細胞抗原決定位胜肽的胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 127和128)對全長PACAP38多胜肽(SEQ ID NO: 1)和PACAP38之羧基端胜肽(aa23-38)具有相對強的反應性。
總之，設計的合成PACAP38胜肽免疫原結構，其具有衍生自或含有PACAP38之氨基端或羧基端區域的B細胞抗原決定位，可在天竺鼠中誘導強烈的免疫反應，從而產生針對位於PACAP38內不同10-mer胜肽簇的多株抗體。抗原決定位鑑定研究以及其他功能分析評估可用以鑑定最佳胜肽免疫原結構製劑。
表1. 在血清學測定中所使用的PACAP38及其片段的胺基酸序列
Figure 02_image001
Figure 02_image003
表2. 用於PACAP38胜肽免疫原結構設計包括理想化人工Th抗原決定位之病原體蛋白衍生的Th抗原決定位的胺基酸序列
Figure 02_image005
Figure 02_image007
表3. PACAP38胜肽免疫原結構的胺基酸序列
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
表4A. PACAP38胜肽免疫原結構在天竺鼠中的免疫原性評估
Figure 02_image015
Figure 02_image017
表4B
Figure 02_image019
表5. PACAP38胜肽免疫原結構在天竺鼠中的免疫原性評估
Figure 02_image020
Figure 02_image022
表6. PACAP38胜肽免疫原結構在天竺鼠中的免疫原性評估
Figure 02_image024
表7. 針對選定之PACAP38胜肽免疫原結構的Th抗原決定位部分在天竺鼠中的免疫原性評估
Figure 02_image026
表8. 利用來自PACAP38胜肽免疫原結構的免疫血清鑑定PACAP38結合B細胞抗原決定位
Figure 02_image028
Figure 02_image029
無
第1圖描述被稱為prepro-PACAP之人類PACAP前體的結構特徵示意圖。PACAP38和PACAP27是透過prepro-PACAP的選擇性加工所產生。Prepro-PACAP具有176個胺基酸，且其最初被信號蛋白酶代謝以產生訊息胜肽(第1-25個胺基酸)和pro-PACAP (第26-176個胺基酸)。Pro-PACAP被前激素轉化酶和羧胜肽酶代謝以產生小片段(第26-79個胺基酸)、大的PACAP相關胜肽(PRP) (第82-129個胺基酸)，其生理功能尚不清楚，以及羧基端胜肽(第132-170個胺基酸和第132-159個胺基酸)。羧基端胜肽被肽基甘胺酸-阿爾法-醯胺化單加氧酵素(PAM)代謝以分別形成PACAP38和PACAP27，其具有醯胺化的羧基端。
第2圖描述來自不同動物的PACAP、VIP和胰泌素蛋白的序列比對。人類、大鼠、小鼠和綿羊均具有相同的PACAP 38序列。實施例中所描述在天竺鼠中進行的免疫原性研究使用人類/大鼠/小鼠/綿羊PACAP38序列作為胜肽免疫原性結構設計探索的基礎。
第3圖描述用於治療疼痛(包括頭痛和偏頭痛)之高精密度PACAP專門設計胜肽免疫原結構及其製劑從發現到商業化的途徑。
第4圖描述全面性的免疫原設計和抗原決定位鑑定，其採用大小介於9至22個胺基酸的PACAP B細胞抗原決定位，具有個別的SEQ ID NOs。
第5圖描述使用包含ISA51VG作為佐劑之標準製劑於天竺鼠(每組n=3)中之PACAP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 110至131)的免疫原性研究。在初次免疫後(wpi) 0、3、6、9和12週肌內注射投予個別PACAP胜肽免疫原結構。利用全長PACAP38作為微量盤塗覆抗原，透過ELISA檢測在特定時間點收集的免疫血清。以Log10 表示ELISA效價。將每組的平均效價以短水平條顯示，而每隻動物的個別效價以點顯示。
第6圖描述使用包含ISA51VG作為佐劑之標準製劑於天竺鼠(每組n=3)中之PACAP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 110至131)的免疫原性研究。在初次免疫後(wpi) 0、3、6、9和12週肌內注射投予個別PACAP胜肽免疫原結構。利用全長重組PACAP38蛋白作為微量盤塗覆抗原，透過ELISA檢測在特定時間點收集的免疫血清。以Log10 表示ELISA效價。對於每次採血(3、6、9和12 wpi)，將每組的平均效價以條狀圖顯示。
第7圖描述使用包含ISA51VG作為佐劑之標準製劑於天竺鼠(每組n=3)中之PACAP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 110至131)的功能研究。在初次免疫後(wpi) 0、3、6、9和12週肌內注射投予個別PACAP胜肽免疫原結構。在中和測試中測試來自每隻動物的12wpi收集的免疫血清的純化抗體。使用單獨培養基(對照組)，以及針對來自從利用個別PACAP胜肽免疫原結構免疫之天竺鼠收集之匯集免疫血清的每一組別的純化抗體，以測定cAMP水平。針對每種代表性PACAP胜肽免疫原結構，以劑量依賴方式(從0、3.9、15.6、62.5和250 µg/mL)針對相對應純化抗體的效力測試測定相對於對照組cAMP水平的% cAMP水平。
第8圖描述來自選定的PACAP胜肽免疫原結構(SEQ ID NOs: 112、127、128、115和119)之天竺鼠免疫血清的純化抗體的中和活性(以µg或nM/mL表示IC50 )。
第9圖描述個別PACAP胜肽免疫原結構之免疫原性的排序，此排序是基於PACAP胜肽結合概況和來自天竺鼠免疫血清之純化抗體中和cAMP水平的能力。
第10A-10B圖顯示辣椒素誘導的皮膚血流(DBF)免疫和攻毒方案以及從中獲得的結果。第10A圖是用以說明使用含有安慰劑(陰性對照)或胜肽免疫原SEQ ID NOs: 112、127或114之製劑對雌性Balb/c小鼠的免疫給藥方案以及辣椒素引發攻毒方案的示意圖。第10B圖是用以說明在初次免疫後(wpi)6、9、12和15週利用PACAP38胜肽免疫原免疫進行接種抑制辣椒素誘導的耳皮膚血流的圖式。
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Claims (19)

  1. 一種PACAP胜肽免疫原結構，其具有約20個或更多個的胺基酸，以以下分子式表示： (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–X 或 (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 或 (Th)m –(A)n –(PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)–(A)n –(Th)m –X 其中 Th為一異源性T輔助細胞抗原決定位； A為一異源性間隔子； (PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽)為具有PACAP (SEQ ID NO: 1)的9至約22個胺基酸殘基的一B細胞抗原決定位胜肽； X為一胺基酸的一α-COOH或α-CONH2 ； m為1至約4；以及 n為0至約10。
  2. 如請求項1所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽係選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組。
  3. 如請求項1所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該Th抗原決定位係選自由SEQ ID NOs: 70-109和106-171組成之群組。
  4. 如請求項1所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽係選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組，且該Th抗原決定位係選自由SEQ ID NOs: 70-109和106-171組成之群組。
  5. 如請求項1所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該胜肽免疫原結構係選自由SEQ ID NOs: 110-159組成之群組。
  6. 一種PACAP胜肽免疫原結構，包含： a.      一B細胞抗原決定位，其包含來自SEQ ID NO: 1的PACAP38序列的約9至約22個的胺基酸殘基； b.      一T輔助細胞抗原決定位，其包含選自由SEQ ID NOs: 70-109和160-171及其任意組合組成之群組的一胺基酸序列；以及 c.      一任選的異源性間隔子，其係選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys- ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 67)及其任意組合組成之群組， 其中該B細胞抗原決定位係直接或透過該任選的異源性間隔子共價連接至該T輔助細胞抗原決定位。
  7. 如請求項6所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該B細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組。
  8. 如請求項6所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該任選的異源性間隔子係(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)或Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 67)，其中Xaa係任意胺基酸。
  9. 如請求項6所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該T輔助細胞抗原決定位係共價連接至該B細胞抗原決定位的氨基端或羧基端。
  10. 如請求項6所述之PACAP胜肽免疫原結構，其中該T輔助細胞抗原決定位係透過該任選的異源性間隔子共價連接至該B細胞抗原決定位的氨基端或羧基端。
  11. 一種組成物，其包含如請求項1所述之PACAP胜肽免疫原結構。
  12. 一種醫藥組成物，其包含： a.      如請求項1所述之一胜肽免疫原結構；以及 b.      一藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。
  13. 如請求項12所述之醫藥組成物，其中 a.      該PACAP功能性B細胞抗原決定位胜肽係選自由SEQ ID NOs: 2-20組成之群組； b.      該Th抗原決定位係選自由SEQ ID NOs: 70-109和160-171組成之群組；以及 c.      該異源性間隔子係選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α, ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 68)、Lys-Lys-Lys-ε-N-Lys (SEQ ID NO: 69)和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO:67)及其任意組合組成之群組；以及 其中該PACAP胜肽免疫原結構與一CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成一穩定化的免疫刺激複合物。
  14. 如請求項12所述之醫藥組成物，其中 a. 該PACAP胜肽免疫原結構係選自由SEQ ID NOs: 110-131和132-159組成之群組；以及 其中該PACAP胜肽免疫原結構與一CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成一穩定化的免疫刺激複合物。
  15. 一種用以在一動物中產生針對PACAP之抗體的方法，其包含投予該動物如請求項12所述之醫藥組成物。
  16. 一種分離的抗體或其抗原決定位結合片段，其特異性地結合至SEQ ID NOs: 2-20的PAC1結合或活化區域。
  17. 如請求項16所述之分離的抗體或其抗原決定位結合片段，其結合至PACAP胜肽免疫原結構。
  18. 一種組成物，其包含如請求項16所述之分離的抗體或其抗原決定位結合片段。
  19. 一種用以在一動物中預防及/或治療偏頭痛的方法，其包含投予該動物如請求項16所述之該醫藥組成物。
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