CN114437211B - 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114437211B CN114437211B CN202210095763.3A CN202210095763A CN114437211B CN 114437211 B CN114437211 B CN 114437211B CN 202210095763 A CN202210095763 A CN 202210095763A CN 114437211 B CN114437211 B CN 114437211B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- centrifuging
- stirring
- cat allergen
- fel
- allergen fel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 title claims abstract description 52
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 30
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 24
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 17
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 17
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 11
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 4
- SWECWXGUJQLXJF-BTJKTKAUSA-N Dimetindene maleate Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O.CN(C)CCC=1CC2=CC=CC=C2C=1C(C)C1=CC=CC=N1 SWECWXGUJQLXJF-BTJKTKAUSA-N 0.000 claims description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 claims description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 20
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 20
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 12
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 10
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 5
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- SKHCUBQVZJHOFM-NAKRPEOUSA-N Ala-Arg-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SKHCUBQVZJHOFM-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- ZDYNWWQXFRUOEO-XDTLVQLUSA-N Ala-Gln-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDYNWWQXFRUOEO-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JBDLMLZNDRLDIX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- WXASLRQUSYWVNE-FXQIFTODSA-N Asp-Cys-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N WXASLRQUSYWVNE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LXKLDWVHXNZQGB-SRVKXCTJSA-N Asp-Cys-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O LXKLDWVHXNZQGB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RRKCPMGSRIDLNC-AVGNSLFASA-N Asp-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RRKCPMGSRIDLNC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N Asp-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O QCVXMEHGFUMKCO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000001840 Dandruff Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- GMGKDVVBSVVKCT-NUMRIWBASA-N Gln-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GMGKDVVBSVVKCT-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N Glu-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LWYUQLZOIORFFJ-XKBZYTNZSA-N Glu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O LWYUQLZOIORFFJ-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- CTGZVVQVIBSOBB-AVGNSLFASA-N His-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CTGZVVQVIBSOBB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WEWCEPOYKANMGZ-MMWGEVLESA-N Ile-Cys-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N WEWCEPOYKANMGZ-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- NGKPIPCGMLWHBX-WZLNRYEVSA-N Ile-Tyr-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N NGKPIPCGMLWHBX-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Cys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WLCYCADOWRMSAJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZXEUFAVXODIPHC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZXEUFAVXODIPHC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OJDFAABAHBPVTH-MNXVOIDGSA-N Lys-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O OJDFAABAHBPVTH-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- URGPVYGVWLIRGT-DCAQKATOSA-N Lys-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O URGPVYGVWLIRGT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IPSDPDAOSAEWCN-RHYQMDGZSA-N Lys-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IPSDPDAOSAEWCN-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N Met-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N Phe-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N)O CMHTUJQZQXFNTQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N Pro-Glu-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BCNRNJWSRFDPTQ-HJWJTTGWSA-N Pro-Ile-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BCNRNJWSRFDPTQ-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO FKYWFUYPVKLJLP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GFDUZZACIWNMPE-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O GFDUZZACIWNMPE-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N TZVUSFMQWPWHON-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CVIXTAITYJQMPE-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- VLDMQVZZWDOKQF-AUTRQRHGSA-N Val-Glu-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N VLDMQVZZWDOKQF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- QPPZEDOTPZOSEC-RCWTZXSCSA-N Val-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O QPPZEDOTPZOSEC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003503 anal sac Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004561 lacrimal apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/02—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，方法包括以下步骤：将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；将混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。将猫过敏原Fel d1，通过注射禽类，产生的的特异性抗体高效的富集在卵黄中，是一种非侵入性的方法，既减少和完善了动物的使用，又安全高效且经济实惠。
Description
技术领域
本发明涉及生物抗体技术领域，具体涉及一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法。
背景技术
接触来自其他物种的蛋白质，无论是通过空气传播还是通过食物或注射，都会导致人类的免疫反应，这可能导致过敏化，可能会诱发鼻炎甚至是危及生命的哮喘性炎症疾病。空气中来自家猫的过敏原是全世界最常见和最有力的过敏原因之一，而猫的主要过敏原Fel d1与90％以上的猫过敏患者会产生免疫反应。Fel d1产于皮脂腺、唾液、泪腺和肛腺，存在于唾液、眼泪、皮肤和皮毛中，它通过空气中的头皮屑从猫流到环境中。目前对于猫过敏有如下解决办法：建议移除家庭内所有可能含有过敏原或受污染的物件，例如枕头、毛毯、地毯、地毯等，以避免接触过敏原；建议做好环境清洁和使用空气加湿器和HEPA过滤器，也有助于缓解症状；建议移除产生过敏原的猫。然而，主人和他们的猫之间的联系往往十分紧密，以至于他们更有可能接受过敏对他们的健康的威胁，而不是放弃他们的宠物。另一种解决猫过敏问题的方法是降低猫科动物自身的Fel d1，这一方法不涉及猫与其主人的分离。可以采取的办法之一是让猫主动免疫，目的是在动物体内诱导抗fel d1抗体，但宠物每年都要忍受注射疫苗的痛苦且生产猫Fel d1疫苗成本高，效果不稳定。
如果可以从猫粮中加入从鸡蛋中提取的抗Fel d1 IgY，可使猫唾液和皮毛中的Fel d1活性降低。且从蛋黄中获得抗体是一种非侵入性的方法，不需要采血；而哺乳动物抗体的产生还包括对动物造成痛苦和痛苦的程序，故卵黄抗体的应用既减少和完善了动物的使用，又安全高效且经济实惠，为解决猫过敏这一难题提供了新的思路。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，所述猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，所述方法包括以下步骤：
S1、将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；
S2、将所述混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。
上述的制备方法，进一步的，所述一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂；或，氢氧化铝、CpG-ODN 和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
上述的制备方法，进一步的，每次疫苗注射的Fel d1重组蛋白的量为100～300μg/只。
上述的制备方法，进一步的，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
上述的制备方法，进一步的，所述制备方法还包括以下步骤：
S3、三周后进行加强免疫，加强免疫时，猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂混合；
S4、之后每间隔两周，按照所述S3的方法进行加强免疫。
上述的制备方法，进一步的，所述一次免疫佐剂和加强免疫佐剂为以下A或B中的一种：
A：一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；
B：一次免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物，加强免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
上述的制备方法，进一步的，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合；所述猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
上述的制备方法，进一步的，所述S1中，所述猫过敏原Fel d1重组抗原采用以下方法制备得到：
S1-1、以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
S1-2、将所述PCR扩增产物PET-30a(+)连接构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至Top10感受态细胞中获得转化子；
S1-4、提取所述转化子中的蛋白即为猫过敏原Fel d1重组抗原。
上述的制备方法，进一步的，所述S1-4具体包括以下步骤：
(1)挑取所述转化子中的阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG诱导；
(2)离心收集沉淀，加入Buffer A进行超声、离心得到沉淀一；
(3)沉淀一用Buffer B重悬，搅拌、离心得到沉淀二；
(4)沉淀二再用Buffer C重悬，搅拌、离心得到沉淀三；
(5)沉淀三再用2M尿素重悬，搅拌、离心得到沉淀四；
(6)沉淀四用Buffer D重悬，搅拌、离心，留上清，即为蛋白提取液。
上述的制备方法，进一步的，所述Buffer A的成分包括：20mM Tris-HCl，150mMNaCl；
所述BufferB的成分包括：20mM Tris-HCl，0.3％Triten X-100；
所述Buffer C的成分包括：20mM Tris-HCl，1M NaCl；
所述Buffer D的成分包括：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，6M尿素。
上述的制备方法，进一步的，所述(1)中，所述诱导具体为：37℃下诱导4h；
所述(2)，所述超声、离心具体为：以超声功率为35％～45％超声50min，每超声5s，间隔5s；超声结束后10000r/min，4℃离心40min；
所述(3)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(4)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(5)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌60min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(6)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌过夜，以10000r/min转速20℃离心30min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，将猫过敏原Fel d1，通过注射禽类，产生的的特异性抗体高效的富集在卵黄中，是一种非侵入性的方法，既减少和完善了动物的使用，又安全高效且经济实惠。
(2)本发明提供了一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，将猫过敏原Fel d1 与佐剂混合使用，可以显著提高卵黄抗体的效价，检测卵黄抗体效价达到1:65536以上。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中SDS-PAGE凝胶电泳分析结果。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种猫Fel d1重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，具体为： MHHHHHHEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSVLDKIYTSPLCGSGSSGSGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNAT EPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR。
本实施例的猫Fel d1重组蛋白，根据Uniprot数据库猫Fel d1蛋白氨基酸序列(Fel d1肽链Ⅰ和肽链Ⅱ的登录号分别为P30438和P30440)，拼接形成完整蛋白序列。
猫Fel d1利用重组蛋白原核表达的方法制备抗原，具体步骤为：
(1)PCR扩增：利用分子生物学引物设计软件DNAMANV6设计了一对PCR引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：catatgcatcaccaccaccaccac；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：taccctgggccgttaatgaaagctt。
PCR反应体系(20μL)为：dd H2O 9μL，LA Taq 0.5μL，cDNA 3μL，上、下游引物(10 μL/L)各1μL，Buffer 2μL，d NTP 3.5μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34 个循环；72℃延伸10min。
通过PCR扩增获得PCR产物，将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(恒压80V电泳约40min，紫外灯观察结果，自动凝胶成像扫描仪拍照)并回收目的片段。
(2)目的片段的克隆：
将目的片段与PET-30a(+)连接构建重组质粒，经Ndel和HindⅢ双酶切鉴定连接产物，连接产物转化至Top10感受态细胞，37℃恒温培养10h后，挑取挑取单克隆菌落经PCR和双酶切鉴定后，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到转化子。
(3)Fel d1的原核表达和纯化：
3.1、将转化子进行培养获得菌液。
3.2、将得到的菌液接种到筛选培养基中过夜，挑取阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温200r/min培养至OD值达到0.6～0.8时，加入IPTG(IPTG的终浓度为0.5～1mM)，37℃下诱导4h，使蛋白高丰度表达。
3.3、8000r/min，4℃离心5min收集沉淀，沉淀中含有表达Fel d1蛋白的大肠杆菌菌体。将沉淀加入Buffer A(20mM Tris-HCl；150mM NaCl；pH 8.0)进行超声(超声工作时间为 50min，超声5s，间隔5s，超声功率为35％～45％)，超声结束后10000r/min，4℃离心40min，弃上清，留沉淀。
3.4、将上述沉淀用Buffer B(20mM Tris-HCl；0.3％Triten X-100；pH 8.0)重悬，4℃搅拌40min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.5、将上述沉淀再用Buffer C(20mM Tris-HCl；1M NaCl；pH 8.0)重悬，4℃搅拌40min， 10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.6、将上述沉淀再用2M尿素重悬，4℃搅拌60min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.7、最后沉淀用Buffer D(50mM Tris-HCl；150mM NaCl；20％甘油；6M尿素；pH8.0) 重悬，4℃搅拌过夜，过夜后于10000r/min，20℃离心30min，弃沉淀，留上清。上清即为蛋白提取液，储存于-80℃。
将上清液用Ni-NTA柱进行纯化，通过15％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度。鉴定结果参见图1。
图1为SDS-PAGE凝胶电泳分析结果，M1和M2为蛋白Marker，1号泳道为纯化前样品，2号泳道为Ni-NTA柱流穿样品，3号泳道为Ni-NTA柱洗杂样品，4号泳道为Ni-NTA 柱纯化浓缩后样品。从图中可以看出：猫Fel d1利用重组蛋白原核表达的方法制备抗原，经Ni-NTA柱纯化后，经15％SDS-PAGE电泳分析，提纯后重组蛋白在15kDa～20kDa之间有一个清晰的单一条带，纯度高，杂蛋白少。
实施例2：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白用高压灭菌的PBS稀释后，通过颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡的方法，按照100μg/羽、200μg/羽及300μg/羽免疫蛋鸡。一免时，Feld1 重组蛋白与弗氏完全佐剂1:1混合。三周后进行二次免疫，再间隔两周后进行三次免疫。二次和三次加强免疫时，Fel d1重组蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。
实验一：考察不同剂量抗原免疫蛋鸡生产卵黄抗体的效价。不同剂量抗原免疫蛋鸡生产卵黄抗体效价比较结果见表1。
表1：猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫剂量产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)
从表1的结果可知：在首免后第一周，各剂量组卵黄抗体效价差异较小，在首免后第2～8 周，100μg/羽与200μg/羽、300μg/羽剂量组的抗体效价水平差异增大，而200μg/羽和300 μg/羽剂量组卵黄抗体效价之间无显著性差异。收集鸡蛋，检测卵黄抗体效价达到1:65536 以上。
实施例3：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1 重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实施例4：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂C(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1 重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实施例5：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂D(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1 重组蛋白与佐剂D(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实验二：考察实施例2至5中不同免疫佐剂组合免疫蛋鸡生产卵黄抗体效价比较
猫Fel d1重组蛋白纯化后，与不同佐剂组合按照1:1比例(体积比)充分混匀后，按照 200μg/羽剂量(按免疫原量计算)，根据相同免疫程序免疫蛋鸡，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体，检测抗体效价。表2为不同试验分组使用免疫佐剂组合；表3为猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫佐剂组合产生特异卵黄抗体效价的变化。
表2：不同试验分组使用免疫佐剂组合
| 组别 | 首次免疫 | 2～3次加强免疫 |
| A组 | 弗氏完全佐剂 | 弗氏不完全佐剂 |
| B组 | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7) | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7) |
| C组 | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4) | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4) |
| D组 | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4) | 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4) |
表3：猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫佐剂组合产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)
从表3中不同免疫佐剂组合免疫蛋鸡后产生卵黄抗体效价结果可以看出：在首免后第一周，各免疫佐剂组卵黄抗体效价差异较小，三周后，随着增强免疫的注射，D组的抗体效价明显高于A组、B组与C组，且这种效价的优势一直持续到第8周。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 南京麦西崴克生物科技有限公司
<120> 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met His His His His His His Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val
20 25 30
Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu
35 40 45
Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Val Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Ser Gly Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr
85 90 95
Asp Val Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu
100 105 110
Ser Leu Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys
115 120 125
Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu
130 135 140
Asp Gly Leu Val Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly
145 150 155 160
Glu Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly
165 170 175
Arg
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catatgcatc accaccacca ccac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccctgggc cgttaatgaa agctt 25
Claims (5)
1.一种基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述猫过敏原Feld1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；
S2、将所述混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体；
S3、三周后进行加强免疫，加强免疫时，猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂混合；
S4、之后每间隔两周，按照所述S3的方法进行加强免疫；
所述一次免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为3:3:4混合的混合物；所述加强免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为3:3:4混合的混合物；
所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合；所述猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1中，所述猫过敏原Fel d1重组抗原采用以下方法制备得到：
S1-1、以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
S1-2、将所述PCR扩增产物PET-30a(+)连接构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至Top10感受态细胞中获得转化子；
S1-4、提取所述转化子中的蛋白即为猫过敏原Fel d1重组抗原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1-4具体包括以下步骤：
(1)挑取所述转化子中的阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG诱导；
(2)离心收集沉淀，加入Buffer A进行超声、离心得到沉淀一；
(3)沉淀一用Buffer B重悬，搅拌、离心得到沉淀二；
(4)沉淀二再用Buffer C重悬，搅拌、离心得到沉淀三；
(5)沉淀三再用2M尿素重悬，搅拌、离心得到沉淀四；
(6)沉淀四用Buffer D重悬，搅拌、离心，留上清，即为蛋白提取液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Buffer A的成分包括：20mMTris-HCl，150mM NaCl；
所述BufferB的成分包括：20mM Tris-HCl，0.3％Triten X-100；
所述Buffer C的成分包括：20mM Tris-HCl，1M NaCl；
所述Buffer D的成分包括：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，6M尿素。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述(1)中，所述诱导具体为：37℃下诱导4h；
所述(2)，所述超声、离心具体为：以超声功率为35～45％超声50min，每超声5s，间隔5s；超声结束后10000r/min，4℃离心40min；
所述(3)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(4)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(5)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌60min，以10000r/min转速4℃离心30min；
所述(6)，所述搅拌、离心具体为：4℃搅拌过夜，以10000r/min转速20℃离心30min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210095763.3A CN114437211B (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210095763.3A CN114437211B (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114437211A CN114437211A (zh) | 2022-05-06 |
| CN114437211B true CN114437211B (zh) | 2024-03-12 |
Family
ID=81369554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210095763.3A Active CN114437211B (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114437211B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103554254A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-05 | 四川理工学院 | 一种抗人a组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用 |
| CN108025059A (zh) * | 2015-09-08 | 2018-05-11 | 苏黎世大学 | 抗猫过敏的组合物 |
| CN108064276A (zh) * | 2014-10-22 | 2018-05-22 | 塞坝有限责任公司 | Cmv的修饰病毒样颗粒 |
| CN109111518A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-01 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 防治猫瘟热的特异性卵黄抗体及其制备方法 |
| CN113301918A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-08-24 | 塞坝股份公司 | Cmv的通过融合修饰的病毒样颗粒 |
-
2022
- 2022-01-26 CN CN202210095763.3A patent/CN114437211B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103554254A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-05 | 四川理工学院 | 一种抗人a组轮状病毒的鸡卵黄抗体及其制备方法和应用 |
| CN108064276A (zh) * | 2014-10-22 | 2018-05-22 | 塞坝有限责任公司 | Cmv的修饰病毒样颗粒 |
| CN108025059A (zh) * | 2015-09-08 | 2018-05-11 | 苏黎世大学 | 抗猫过敏的组合物 |
| CN109111518A (zh) * | 2018-08-31 | 2019-01-01 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 防治猫瘟热的特异性卵黄抗体及其制备方法 |
| CN113301918A (zh) * | 2018-12-20 | 2021-08-24 | 塞坝股份公司 | Cmv的通过融合修饰的病毒样颗粒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114437211A (zh) | 2022-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI357906B (en) | Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccin | |
| CN108586618B (zh) | 一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用 | |
| CN101489584B (zh) | 重组减毒梭状芽孢杆菌生物体和疫苗 | |
| CN107812183B (zh) | 一种腐败梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| EP3818079A2 (en) | Antibodies against disease causing agents of poultry and uses thereof | |
| CN111471701B (zh) | 高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的orf2基因的方法及其应用 | |
| CN108578686B (zh) | 一种制备羊梭菌病基因工程亚单位疫苗的方法 | |
| CN114437211B (zh) | 基于猫过敏原Fel d1的卵黄抗体的制备方法 | |
| CN101094685B (zh) | 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途 | |
| Leiva et al. | Use of adjuvant ISA VG 71 to produce neutralizing egg yolk antibodies against bothropic venom | |
| CN110746496B (zh) | 一种鲍曼不动杆菌的pal重组蛋白及其编码基因和它们的应用 | |
| CN109627316A (zh) | 草鱼IFN-γ2基因及其编码的重组蛋白和应用 | |
| CN111440815A (zh) | 一种新型鸭呼肠孤病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法 | |
| CN103233013A (zh) | 一种尼罗罗非鱼转化生长因子TGF-β1基因，相关蛋白及应用 | |
| CN113855795B (zh) | 禽戊型肝炎病毒orf2亚单位疫苗 | |
| CN109021115A (zh) | 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗 | |
| CN114699521A (zh) | 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用 | |
| CN111303276B (zh) | 旋毛虫肠道期半胱氨酸蛋白酶抑制剂的b细胞表位多肽、杂交瘤细胞株、单克隆抗体、应用 | |
| CN101421296B (zh) | 用于治疗过敏的属于欧蓍草（Parietaria judaica）脂质转移家族的低变应原的嵌合蛋白质 | |
| CN107469076B (zh) | Il-2蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用 | |
| CN107362358B (zh) | Il-17a蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用 | |
| CN109517044B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体 | |
| CN109608541B (zh) | 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN114487439A (zh) | 检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法 | |
| CN110257390A (zh) | 刺参Bax基因、编码蛋白及其克隆方法、重组刺参Bax基因工程菌构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240415 Address after: Room A512, No. 53 Jiefang Road, Qinhuai District, Nanjing City, Jiangsu Province, 210000 Patentee after: Nanjing Shengyu Century Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 210000 room 630, building a, phase I, Zhongdan Ecological Life Science Industrial Park, No. 3-1, xinjinhu Road, Jiangbei new area, Nanjing, Jiangsu Patentee before: Nanjing maixiweike Biotechnology Co.,Ltd. Country or region before: China |