CN114487439A - 检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法，包括以下步骤：用包被缓冲液将猫过敏原Fel d1包被在所述包被缓冲液中；用封闭液封闭所述猫过敏原Fel d1的非特异性抗体结合位点；加入卵黄抗体进行孵育；加HRP标记的二抗进行孵育；加显色液进行显色后，加终止液终止反应；猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示。本发明的方法可以对猫主要过敏原Fel d1进行有效监测，为过敏原筛查、疾病诊断和疫苗免疫效果评价提供了快速、简便的工具。

Description

检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法
技术领域
本发明涉及生物抗体技术领域，具体涉及一种检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法。
背景技术
据估计，在欧洲，猫致敏的流行率从南方的15％到北欧的30％不等；在美国，5％的儿童和12％的成年人有特异性猫IgE；2005年至2014年，我国宠物过敏敏感率从16.5％上升到28.5％，这些都充分说明采取更有效的预防和治疗措施的重要性。猫，作为世界上最受欢迎的宠物之一，他们与人类密切接触，成为了越来越多人类家庭中必不可少的一员，但是却增加了那些对猫敏感的人患上与猫过敏原有关疾病的风险，如过敏性鼻结膜炎和哮喘。在这种情况下，主人为了避免猫过敏原的暴露，而抛弃最喜欢的宠物，或者因为害怕过敏而不敢饲养宠物，通常是不太被接受的解决办法。研究表明，在90％～95％的猫变态反应患者中，猫过敏原fel d1是引起IgE介导的过敏反应最常见的室内过敏原，占猫提取物总致敏活性的60％～90％。减少Fel d1过敏原的新方法是利用抗体与过敏原的相互作用，在猫科动物产生fel d1后，扩散到环境之前，与之中和。最近的一项中试研究表明，猫科动物饮食中添加含有抗fel d1 IgY的鸡蛋制品成分，可导致猫唾液中活跃的fel d1显著减少。为从源头有效预防人类发生猫过敏原引发的相关疾病提供了全新的思路与办法。
明确病因是为了更有效的做好防治工作。当务之急，做好猫过敏原的源头切断是摆在科研工作者，临床兽医和宠物主人面前的一道难关，建立起系统而完善的猫过敏原Feld1卵黄抗体的检测方法，对猫主要过敏原Fel d1进行有效监测，为过敏原筛查、疾病诊断和疫苗免疫效果评价提供了有力工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法，该方法通过对鸡所产蛋的卵黄提取抗体，进行免疫检测，可对猫过敏原Fel d1蛋白含量进行有效监测，判断免疫效果，方法简单易行，用以规模化生产猫过敏原Fel d1卵黄抗体，减少损失，提高效益。
为了实现上述目的，本发明提供了一种检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法，所述方法包括以下步骤：
一、用包被缓冲液将猫过敏原Fel d1包被在所述包被缓冲液中；
二、用封闭液封闭所述猫过敏原Fel d1的非特异性抗体结合位点；
三、加入卵黄抗体进行孵育；
四、加HRP标记的二抗进行孵育；
五、加显色液进行显色后，加终止液终止反应；
所述猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述包被缓冲液包括1.59g/L Na2CO3和2.93g/LNaHCO3；所述封闭液为5％BSA。
所述显色液配制方法：按照南京建成生物科技有限公司货号B019-1-2的ELISATMB显色液说明书，将A:B:C按照体积比为5000:5000:4配制。
上述的间接ELISA方法，进一步的，猫过敏原Fel d1包被浓度为40～160ng/μL；所述二抗稀释度为1:4000～6000。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述猫过敏原Fel d1采用以下方法制备的得到：
S1、将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；
S2、将所述混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂；或，氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物；
和/或，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述制备方法还包括以下步骤：
S3、三周后进行加强免疫，加强免疫时，猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂混合；
S4、之后每间隔两周，按照所述S3的方法进行加强免疫。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述一次免疫佐剂和加强免疫佐剂为以下A或B中的一种：
A：一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；
B：一次免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物，加强免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合；所述猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述S1中，所述猫过敏原Fel d1重组抗原采用以下方法制备得到：
S1-1、以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
S1-2、将所述PCR扩增产物PET-30a(+)连接构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至Top10感受态细胞中获得转化子；
S1-4、提取所述转化子中的蛋白即为猫过敏原Fel d1重组抗原。
上述的间接ELISA方法，进一步的，所述S1-4具体包括以下步骤：
(1)挑取所述转化子中的阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG，37℃下诱导4h；
(2)离心收集沉淀，加入Buffer A进行以超声功率为35％～45％超声50min，每超声5s，间隔5s；超声结束后10000r/min，4℃离心40min得到沉淀一；所述Buffer A的成分包括：20mM Tris-HCl，150mM NaCl；
(3)沉淀一用Buffer B重悬，4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min得到沉淀二；所述Buffer B的成分包括：20mM Tris-HCl，0.3％Triten X-100；
(4)沉淀二再用Buffer C重悬，4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min得到沉淀三；所述Buffer C的成分包括：20mM Tris-HCl，1M NaCl；
(5)沉淀三再用2M尿素重悬，4℃搅拌60min，以10000r/min转速4℃离心30min得到沉淀四；
(6)沉淀四用Buffer D重悬，4℃搅拌过夜，以10000r/min转速20℃离心30min，留上清，即为蛋白提取液；所述Buffer D的成分包括：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，6M尿素。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种建立的检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法，该方法可以对猫主要过敏原Fel d1进行有效监测，为过敏原筛查、疾病诊断和疫苗免疫效果评价提供了快速、简便的工具。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为SDS-PAGE检测Fel d1重组蛋白的纯化效果。M1和M2为蛋白分子量标准，泳道1为未过柱纯化前的菌液、泳道2和泳道3为菌液超声后Buffer D溶解的样品，泳道4为蛋白挂柱时流出的样品(表示蛋白被结合在了Ni柱上)，泳道5为洗去蛋白纯化柱杂质蛋白的样品，泳道5为洗脱目的蛋白的前5mL样品，泳道7为蛋白纯化后的样品，泳道8为最后清洗柱子的样品。介于17kDa～25kDa之间的唯一条带即为Fel d1，表明纯化效果较好，得浓度很高。
图2为Fel d1卵黄抗体检测方法的特异性检测。可见其他疫苗免疫过的样品不能与阴性血清分开，P/N值始终小于2，而注射了Fel d1的样品P/N值一直大于2。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
一种猫Fel d1重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示，具体为：MHHHHHHEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCVDAKMTEEDKENALSVLDKIYTSPLCGSGSSGSGVKMAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGR。
本实施例的猫Fel d1重组蛋白，根据Uniprot数据库猫Fel d1蛋白氨基酸序列(Fel d1肽链Ⅰ和肽链Ⅱ的登录号分别为P30438和P30440)，拼接形成完整蛋白序列。
猫Fel d1利用重组蛋白原核表达的方法制备抗原，具体步骤为：
(1)PCR扩增：利用分子生物学引物设计软件DNAMANV6设计了一对PCR引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：catatgcatcaccaccaccaccac；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：taccctgggccgttaatgaaagctt。
PCR反应体系(20μL)为：dd H2O 9μL，LA Taq 0.5μL，cDNA 3μL，上、下游引物(10μL/L)各1μL，Buffer 2μL，d NTP 3.5μL。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸10min。
通过PCR扩增获得PCR产物，将PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(恒压80V电泳约40min，紫外灯观察结果，自动凝胶成像扫描仪拍照)并回收目的片段。
(2)目的片段的克隆：
将目的片段与PET-30a(+)连接构建重组质粒，经Ndel和HindⅢ双酶切鉴定连接产物，连接产物转化至Top10感受态细胞，37℃恒温培养10h后，挑取挑取单克隆菌落经PCR和双酶切鉴定后，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到转化子。
(3)Fel d1的原核表达和纯化：
3.1、将转化子进行培养获得菌液。
3.2、将得到的菌液接种到筛选培养基中过夜，挑取阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃恒温200rpm培养至OD值达到0.6～0.8时，加入IPTG(IPTG的终浓度为0.5mM～1.0mM)，37℃下诱导4h，使蛋白高丰度表达。
3.3、8000r/min，4℃离心5min收集沉淀，沉淀中含有表达Fel d1蛋白的大肠杆菌菌体。将沉淀加入Buffer A(20mM Tris-HCl；150mM NaCl；pH 8.0)进行超声(超声工作时间为50min，超声5s，间隔5s，超声功率为35％～45％)，超声结束后10000r/min，4℃离心40min，弃上清，留沉淀。
3.4、将上述沉淀用Buffer B(20mM Tris-HCl；0.3％Triten X-100；pH 8.0)重悬，4℃搅拌40min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.5、将上述沉淀再用Buffer C(20mM Tris-HCl；1M NaCl；pH 8.0)重悬，4℃搅拌40min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.6、将上述沉淀再用2M尿素重悬，4℃搅拌60min，10000r/min，4℃离心30min，弃上清，留沉淀。
3.7、最后沉淀用Buffer D(50mM Tris-HCl；150mM NaCl；20％甘油；6M尿素；pH8.0)重悬，4℃搅拌过夜，过夜后于10000r/min，20℃离心30min，弃沉淀，留上清。上清即为蛋白提取液，储存于-80℃。
将上清液用Ni-NTA柱进行纯化，通过15％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度。鉴定结果参见图1。
图1为SDS-PAGE检测Fel d1重组蛋白的纯化效果。M1和M2为蛋白分子量标准，泳道1为未过柱纯化前的菌液、泳道2和泳道3为菌液超声后Buffer D溶解的样品，泳道4为蛋白挂柱时流出的样品(表示蛋白被结合在了Ni柱上)，泳道5为洗去蛋白纯化柱杂质蛋白的样品，泳道5为洗脱目的蛋白的前5mL样品，泳道7为蛋白纯化后的样品，泳道8为最后清洗柱子的样品。介于17kDa～25kDa之间的唯一条带即为Fel d1，表明纯化效果较好，得浓度很高。
实施例2：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白用高压灭菌的PBS稀释后，通过颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡的方法，按照100μg/羽、200μg/羽及300μg/羽免疫蛋鸡。一免时，Feld1重组蛋白与弗氏完全佐剂按照体积比为1:1混合。三周后进行二次免疫，再间隔两周后进行三次免疫。二次和三次加强免疫时，Fel d1重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。
实验一：考察不同剂量抗原免疫蛋鸡生产卵黄抗体的效价。不同剂量抗原免疫蛋鸡生产卵黄抗体效价比较结果见表1。
表1：猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫剂量产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)
Figure BDA0003490429090000061
从表1的结果可知：在首免后第一周，各剂量组卵黄抗体效价差异较小，在首免后第2～8周，100μg/羽与200μg/羽、300μg/羽剂量组的抗体效价水平差异增大，而200μg/羽和300μg/羽剂量组卵黄抗体效价之间无显著性差异。收集鸡蛋，检测卵黄抗体效价达到1:65536以上。
实施例3：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实施例4：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂C(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1重组蛋白与佐剂B(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实施例5：
一种用实施例1的抗原免疫鸡产生蛋黄抗体的方法，其具体步骤为：
将实施例1的纯化后的Fel d1重组蛋白按照200μg/羽免疫蛋鸡，一免时，Fel d1重组蛋白与佐剂D(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4))按照体积比为1:1混合，加强免疫时Feld1重组蛋白与佐剂D(氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4))按照体积比为1:1混合，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体。其余参数与实施例2一致。
实验二：考察实施例2至5中不同免疫佐剂组合免疫蛋鸡生产卵黄抗体效价比较
猫Fel d1重组蛋白纯化后，与不同佐剂组合按照1:1比例(体积比)充分混匀后，按照200μg/羽剂量(按免疫原量计算)，根据相同免疫程序免疫蛋鸡，定期收集免疫蛋鸡所产鸡蛋，提取卵黄抗体，检测抗体效价。表2为不同试验分组使用免疫佐剂组合；表3为猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫佐剂组合产生特异卵黄抗体效价的变化。
表2：不同试验分组使用免疫佐剂组合
组别 首次免疫 2～3次加强免疫
A组 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂
B组 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7) 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(1:2:7)
C组 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4) 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(2:4:4)
D组 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4) 氢氧化铝+CpG-ODN+BSF-1(3:3:4)
表3：猫重组蛋白Fel d1抗原不同免疫佐剂组合产生特异卵黄抗体效价的变化(Log2X)(n＝4)
组别 1周 2周 3周 4周 5周 6周 7周 8周
A组 2.75±0.25 6.50±0.50 9.50±0.25 12.50±0.25 13.50±0.50 15.50±0.25 14.25±0.25 13.25±0.25
B组 2.50±0.25 7.00±0.50 10.50±0.50 13.50±0.50 14.50±0.25 16.25±0.25 15.50±0.50 14.25±0.25
C组 2.50±0.25 7.25±0.25 10.50±0.50 12.75±0.25 14.25±0.25 17.50±0.50 16.25±0.50 14.75±0.50
D组 2.75±0.25 7.75±0.25 11.25±0.25 14.75±0.50 16.75±0.25 18.75±0.25 19.25±0.25 17.25±0.25
从表3中不同免疫佐剂组合免疫蛋鸡后产生卵黄抗体效价结果可以看出：在首免后第一周，各免疫佐剂组卵黄抗体效价差异较小，三周后，随着增强免疫的注射，D组的抗体效价明显高于A组、B组与C组，且这种效价的优势一直持续到第8周。
对比例1：
一种阴性卵黄抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
收集没有免疫过猫Fel d1疫苗的健康鸡所产鸡蛋，超净台中打开鸡蛋，吸取0.5mL卵黄液，与0.5mL灭菌生理盐水充分混匀，再加入1mL氯仿，充分混匀，10000r/min，4℃离心20min，收集上清，备用。
实施例6：
一种本发明的猫过敏原Fel d1卵黄抗体间接ELISA方法检测最适抗原抗体浓度的方法：
(1)以矩阵法测定。用包被缓冲液(称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g，加蒸馏水800mL，用1M的NaOH和1M的HCL调pH为9.6，用双蒸水定容到1L，制成包被缓冲液)将纯化好的Fel d1稀释20、40、80、160、320、640倍，稀释液每孔100μL分别加入96孔酶标板竖向两排，37℃孵育2h，4℃过夜。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(2)每孔加入200μL封闭液(5％BSA：称取胎牛血清(BSA)5g，溶解于100mL PBST洗涤液中)，37℃孵育3h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(3)分别将实施例5的阳性卵黄抗体于对比例1的阴性卵黄抗体样本稀释25、50、100、200倍。第一横排加入25倍稀释阳性卵黄抗体100μL，第二横排加入25倍稀释阴性卵黄抗体100μL，第三排加入50倍稀释阳性卵黄抗体100μL，第四横排加入50倍稀释阴性卵黄抗体100μL，以此类推。加完所有卵黄抗体样本之后，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(4)添加HRP标记的驴抗鸡IgY二抗(1:5000倍稀释，溶剂为封闭液)，每孔100μL，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(5)加底物TMB显色(按照南京建成生物科技有限公司货号B019-1-2的ELISA TMB显色液说明书，将A:B:C按照体积比为5000:5000:4配制),每孔100μL，37℃避光显色10min～15min。
(6)取出后加入终止液(2mol/L H2SO4溶液)，每孔100μL。反应终止后，立即用多功能酶标仪读取450nm波长处的OD值。
P/N值最大的所在孔对应的抗原浓度和卵黄抗体稀释度分别作为最佳抗原包被浓度以及卵黄抗体稀释度。其中P为阳性卵黄抗体OD450值，N为阴性卵黄抗体OD450的值。表4是检测结果。
表4：间接ELISA抗原包被浓度、血清稀释倍数的确定
Figure BDA0003490429090000081
Figure BDA0003490429090000091
按照上述实施例2(1),用包被缓冲液将纯化好的Fel d1稀释20、40、80、160、320、640倍，阴阳性血清稀释25、50、100、200倍，进行ELISA检测，以P值为1.0左右，P/N值最大且N值较低者，作为最适抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数。结果显示，当抗原包被浓度为80ng/μL时，1:200倍稀释阳性鸡血清时，P/N值最大，为3.77。因此该条件作为最优。
实施例7：
一种本发明的猫过敏原Fel d1卵黄抗体间接ELISA方法检测酶标二抗浓度及临界值的方法：
(1)用包被缓冲液(配制方法同上)将纯化后的稀释至最佳稀释倍数；然后把稀释后的抗原液加入96孔酶标板，每孔100μL，37℃孵育2h，4℃过夜。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(2)每孔加入200μL封闭液(配制方法同上)，37℃孵育3h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(3)分别将阴性和阳性卵黄抗体用PBS稀释50倍，每孔100μL依次加入到酶标板中，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(4)将HRP标记的驴抗鸡IgY二抗分别按照质量比为1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:20000倍稀释，每孔100μL，分别加入到阴阳孔中，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(5)加底物TMB显色(南京建成，B019-1-2，配制方法如说明书A:B:C＝5000:5000:4),每孔100μL，37℃避光显色10min～15min。
(6)取出后加入终止液(2mol/L H2SO4溶液)，每孔100μL。反应终止后，立即用多功能酶标仪读取450nm波长处的OD值。以阳性卵黄抗体OD450接近1，P/N值最大的所在孔对应的抗原浓度和卵黄抗体稀释度分别作为最佳抗原包被浓度以及卵黄抗体稀释度。按照上述实施例2(2),将HRP标记的驴抗鸡IgY二抗以1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:20000倍稀释，在上述最优条件下检测各二抗稀释浓度对结果的影响，其他步骤不变。
检测上述酶标二抗的稀释度，检测结果参见表5。
表5：间接ELISA酶标二抗稀释度的确定
Figure BDA0003490429090000092
Figure BDA0003490429090000101
表5的结果显示，当二抗稀释度为1:5000时，P/N值最大，为3.96。选择1:5000为最佳二抗稀释度。
实施例8：
一种本发明的猫过敏原Fel d1卵黄抗体间接ELISA方法检测特异性的方法：
(1)以免疫过其他种类的疫苗鸡群所产鸡蛋的卵黄抗体特异性检验。按照上述方法提取卵黄抗体后备用。
(2)将已纯化的猫Fel d1抗原用包被缓冲液稀释50倍包被于96孔板中，每孔100μL，37℃孵育2h，4℃过夜。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(3)每孔加入200μL封闭液，37℃孵育3h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。将其他种类的疫苗鸡群的阴阳性卵黄抗体稀释50倍，每孔100μL依次加入到酶标板中，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(4)HRP标记的驴抗鸡IgY二抗稀释1000倍，每孔100μL，分别加入到阴阳孔中，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用洗涤液清洗，每孔300μL，洗涤三次，每次3min，拍干。
(5)加底物TMB显色(配制方法如说明书A:B:C＝5000:5000:4)，每孔100μL，37℃避光显色10min～15min，取出后加入终止液(2mol/L H2SO4溶液)，每孔100μL。反应终止后，立即用多功能酶标仪读取450nm波长处的OD值。
在上述最优条件下检测免疫过其它疫苗及Fel d1疫苗的卵黄抗体，其他步骤不变。
结果参见图2。从图中可以看出：只有免疫过Fel d1疫苗的鸡的样品P/N值能大于2。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Figure BDA0003490429090000111
Figure BDA0003490429090000121
序列表
<110> 南京麦西崴克生物科技有限公司
<120> 检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 177
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met His His His His His His Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp
1 5 10 15
Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val
20 25 30
Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu
35 40 45
Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala
50 55 60
Leu Ser Val Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Ser Gly Ser Gly Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr
85 90 95
Asp Val Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu
100 105 110
Ser Leu Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys
115 120 125
Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu
130 135 140
Asp Gly Leu Val Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly
145 150 155 160
Glu Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly
165 170 175
Arg
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catatgcatc accaccacca ccac 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccctgggc cgttaatgaa agctt 25

Claims (10)

1.一种检测猫过敏原Fel d1卵黄抗体的间接ELISA方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
一、用包被缓冲液将猫过敏原Fel d1包被在所述包被缓冲液中；
二、用封闭液封闭所述猫过敏原Fel d1的非特异性抗体结合位点；
三、加入卵黄抗体进行孵育；
四、加HRP标记的二抗进行孵育；
五、加显色液进行显色后，加终止液终止反应；
所述猫过敏原Fel d1的氨基酸序列如SEQ ID.NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述包被缓冲液包括1.59g/LNa2CO3和2.93g/L NaHCO3；所述封闭液为5％BSA。
3.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，猫过敏原Fel d1包被浓度为40～160ng/μL；所述二抗稀释度为1:4000～6000。
4.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述猫过敏原Fel d1采用以下方法制备的得到：
S1、将猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂混合得到混合物；
S2、将所述混合物颈部皮下注射给产蛋高峰期的蛋鸡，收集鸡蛋；鸡蛋的卵黄中富集有对猫过敏原Fel d1特异的卵黄抗体。
5.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂；或，氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物；
和/或，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
6.根据权利要求1所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：
S3、三周后进行加强免疫，加强免疫时，猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂混合；
S4、之后每间隔两周，按照所述S3的方法进行加强免疫。
7.根据权利要求6所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述一次免疫佐剂和加强免疫佐剂为以下A或B中的一种：
A：一次免疫佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫佐剂为弗氏不完全佐剂；
B：一次免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物，加强免疫佐剂为氢氧化铝、CpG-ODN和BSF-1按照质量比为1～3:2～4:4～7混合的混合物。
8.根据权利要求7所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述猫过敏原Fel d1重组抗原与一次免疫佐剂按照体积比为1:1混合；所述猫过敏原Fel d1重组抗原与加强免疫佐剂按照体积比为1:1混合。
9.根据7或8所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述S1中，所述猫过敏原Fel d1重组抗原采用以下方法制备得到：
S1-1、以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为下游引物进行PCR扩增获得PCR扩增产物；
S1-2、将所述PCR扩增产物PET-30a(+)连接构建重组质粒；
S1-3、将所述重组质粒转化至Top10感受态细胞中获得转化子；
S1-4、提取所述转化子中的蛋白即为猫过敏原Fel d1重组抗原。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述S1-4具体包括以下步骤：
(1)挑取所述转化子中的阳性单菌落至含卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达到0.6～0.8，加入IPTG，37℃下诱导4h；
(2)离心收集沉淀，加入Buffer A进行以超声功率为35％～45％超声50min，每超声5s，间隔5s；超声结束后10000r/min，4℃离心40min得到沉淀一；所述Buffer A的成分包括：20mM Tris-HCl，150mM NaCl；
(3)沉淀一用Buffer B重悬，4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min得到沉淀二；所述Buffer B的成分包括：20mM Tris-HCl，0.3％Triten X-100；
(4)沉淀二再用Buffer C重悬，4℃搅拌40min，以10000r/min转速4℃离心30min得到沉淀三；所述Buffer C的成分包括：20mM Tris-HCl，1M NaCl；
(5)沉淀三再用2M尿素重悬，4℃搅拌60min，以10000r/min转速4℃离心30min得到沉淀四；
(6)沉淀四用Buffer D重悬，4℃搅拌过夜，以10000r/min转速20℃离心30min，留上清，即为蛋白提取液；所述Buffer D的成分包括：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，20％甘油，6M尿素。
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