CN107362358B

CN107362358B - Il-17a蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用

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Publication number: CN107362358B
Application number: CN201710656559.3A
Authority: CN
Inventors: 曹永生; 卢彤岩; 徐黎明; 李绍戊; 王荻; 赵景壮; 刘红柏
Original assignee: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2037-08-03
Also published as: CN107362358A

Abstract

本发明公开了IL‑17A蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用。IL‑17A蛋白为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。实验证明，与注射传染性造血器官坏死病毒G蛋白的虹鳟相比，注射传染性造血器官坏死病毒G蛋白和IL‑17A蛋白的虹鳟的IgT基因、IgM基因、Mx基因、Viperin基因和CD8基因的表达水平显著提高，中和抗体的效价显著提高，淋巴细胞的增殖显著增强且传染性造血器官坏死病毒G蛋白的保护力有效提升。因此，IL‑17A蛋白在制备动物疫苗佐剂中具有重要的应用价值。

Description

IL-17A蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用

技术领域

本发明涉及养殖领域，具体涉及IL-17A蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用。

背景技术

鱼类和水产品仍是目前全世界人类的食品和营养获取的重要来源。目前，虹鳟是多数国家商品化冷水鱼的重要组成，但是随着养殖密度的加大和养殖环境的恶化，虹鳟养殖时常遭受传染性病害的威胁。疫苗被证实是防治虹鳟致病微生物侵害的有效手段。

许多国家鉴于生物安全的顾虑限制活疫苗的使用，而灭活疫苗或基因工程疫苗却在某些情况下无法提供预期的保护效果。此外，注射免疫是目前鱼类疫苗接种的主要方式，该方式不仅耗时、耗力，更是不适宜于幼鱼免疫。从经济角度来讲，口服免疫是鱼类疫苗接种的理想途径。但是单独的经口投递抗原激发的免疫反应常常较弱。佐剂是可通过增强抗原诱导特异性免疫反应的能力和持续性来提高疫苗的有效性。诸多实验表明鱼类疫苗中佐剂的使用可从不同角度对疫苗的免疫效果进行优化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高动物疫苗的有效性。

为解决上述技术问题，本发明首先保护了IL-17A蛋白的应用，IL-17A蛋白的应用可为a1)至a6)中的至少一种：a1)制备动物疫苗佐剂；a2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；a3)提高动物机体中中和抗体的效价；a4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖；a5)提升动物疫苗的保护力；a6)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品。

上述应用中，所述IL-17A蛋白可为b1)至b6)中的任一种：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

b4)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

b5)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

b6)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上文中，将序列表中序列4所示的IL-17A蛋白自N端起第1至25位去除，即得到序列表中序列2所示的IL-17A蛋白。本领域技术人员一般认为去除的这25个氨基酸序列编码信号肽，不影响IL-17A蛋白具体的功能。

编码所述IL-17A蛋白的核酸分子，或，含有编码所述IL-17A蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌，的应用也属于本发明的保护范围；所述应用可为a1)至a6)中的至少一种：a1)制备动物疫苗佐剂；a2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；a3)提高动物机体中中和抗体的效价；a4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖；a5)提升动物疫苗的保护力；a6)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品。

上述应用中，所述重组载体可为重组质粒pIL-17A。

所述重组质粒pIL-17A的构建过程如下：(1)提取虹鳟的总RNA，反转录，获得cDNA第一条链；(2)以cDNA第一条链为模板，以5’-GAATTCGCCACCATGAAAGGAATGAAGGTGACAAAGG-3’和5’-CTCGAGTCAAGTAGTCCTTGCCCA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(3)将PCR扩增产物和pMD18T载体连接，得到中间质粒；(4)取中间质粒，用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，回收约387bp的酶切产物；(5)取pcDNA3.1载体，用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，回收约5.4kb的载体骨架；(6)将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒pIL-17A。重组质粒pIL-17A中含有序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pIL-17A表达序列表中序列2所示的IL-17A蛋白。

上述应用中，所述核酸分子可为c1)至c6)中的任一种：

c1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

c3)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子；

c4)核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

c5)与c1)或c2)或c3)或c4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述IL-17A蛋白的DNA分子；

c6)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述IL-17A蛋白的DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，其含有t1)或t2)或t3)：

t1)所述IL-17A蛋白；

t2)编码所述IL-17A蛋白的核酸分子；

t3)含有编码所述IL-17A蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

所述产品可具有如下f1)至f6)中至少一种功能：f1)动物疫苗佐剂；f2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；f3)提高动物机体中中和抗体的效价；f4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖；f5)提升动物疫苗的保护力；f6)促进动物机体对抗原的免疫应答。

本发明还保护一种促进动物机体对抗原的免疫应答的方法，可包括如下步骤：在动物机体中表达所述IL-17A蛋白。

本发明还保护一种提升动物疫苗的保护力的方法，可包括如下步骤：在动物机体中表达所述IL-17A蛋白。

上述任一所述促进动物机体对抗原的免疫应答具体可体现为a2)至a4)中的至少一种：a2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；a3)提高动物机体中中和抗体的效价；a4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖。

上述任一所述免疫相关基因可为IgT基因、IgM基因、Mx基因、Viperin基因和CD8基因中的至少一种。

当所述IL-17A蛋白(作为疫苗佐剂)的使用量为2.5μg/尾时，可增强动物机体中IgT基因的表达水平。当所述IL-17A蛋白(作为疫苗佐剂)的使用量为5.0μg/尾以上时，可增强动物机体中IgM基因和/或Mx基因和/或Viperin基因和/或CD8基因的表达水平。

上述任一所述疫苗可为核酸疫苗。所述核酸疫苗具体可为传染性造血器官坏死病核酸疫苗。

上述任一所述抗原可为传染性造血器官坏死病毒G蛋白。

上述任一所述传染性造血器官坏死病毒G蛋白可为d1)或d2)或d3)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；

d2)在序列表中序列6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

d3)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述动物可为(h1)、(h2)、(h3)、(h4)、(h5)或(h6)：(h1)非人动物；(h2)鱼纲动物；(h3)鲑形目动物；(h4)鲑形科动物；(h5)太平洋鲑属动物；(h6)虹鳟(Oncorhynchus mykiss)。

实验证明，与注射传染性造血器官坏死病毒G蛋白的虹鳟相比，注射传染性造血器官坏死病毒G蛋白和IL-17A蛋白的虹鳟的IgT基因、IgM基因、Mx基因、Viperin基因和CD8基因的表达水平显著提高，中和抗体的效价显著提高，淋巴细胞的增殖显著增强且传染性造血器官坏死病毒G蛋白的保护力有效提升。因此，IL-17A蛋白在制备动物疫苗佐剂中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例2步骤三的实验结果。

图2为实施例2步骤四的实验结果。

图3为实施例2步骤六的实验结果。

图4为实施例2步骤七的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)为常规虹鳟鱼种，饲养于玻璃钢水族箱中，饲养温度为14-16℃。

尼龙网为Fisher Scientific公司的产品；尼龙网的网格大小为70μm。RNA提取试剂盒为Promega公司的产品。pMD18T载体为Takara公司的产品。pET32a载体为Novagen公司的产品。M-MLV反转录试剂盒为Takara公司的产品，产品目录号为2640A。Ni-NTA Agarose为QIAGEN公司产品，产品目录号为30210。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均为Sigma公司的产品，产品目录号分别为F5881和F5506。BALB/c小鼠为哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心的产品。pcDNA3.1载体和脂质体转染试剂均为Invitrogen公司的产品，产品目录号分别为V79020和L3000008。抗鼠FITC标记抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体和辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗均为Abcam公司的产品，产品目录号分别为ab6785、ab6728和ab6721。pEE12.4载体为Lonza biologics公司的产品。Ficoll-Paque PLUS试剂为GEHealthcare公司的产品。WST-1溶液为碧云天公司的产品，产品目录号C0036。

IHNV-Sn1203记载于如下文献中：徐黎明，刘红柏，尹家胜，卢彤岩.传染性造血器官坏死病毒-Sn1203株的基因型及糖蛋白的生物信息学分析.中国水产科学.2014，21(1)：180-188.IHNV-Sn1203的GenBank号为KC660147.1。

IHNV G截短蛋白记载于如下文献中：陶健，徐黎明，刘淼，赵景壮，曹永生，卢彤岩，尹家胜，刘红柏.传染性造血器官坏死病毒抗原表位富集区的原核表达及应用.淡水渔业，2015，45(2)，49-55.

包被液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。

PBST缓冲液：将NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.24g和0.5mLTween溶于1L去离子水。

抗体稀释液：向pH7.4、0.01mM PBS缓冲液中加兔源虹鳟IgM多克隆抗体至其含量为0.4％(v/v)。兔源虹鳟IgM多克隆抗体记载于如下文献中：赵景壮，徐黎明，刘淼，曹永生，尹家胜，刘红柏，卢彤岩.虹鳟IgM重链恒定区的表达及兔抗血清的制备,水产学报，2014，38(8)，1175-1181.

Lysis Buffer溶液：含100mM NaH₂PO₄和8M urea的pH8.0、10mM的Tris·HCl缓冲液。

底物溶液：由100μL A液(将0.0125g TMB溶解于80％(v/v)DMSO水溶液)和5mL B液(将过氧化氢尿素0.05g、柠檬酸1.057g和Na₂HPO₄·12H₂O 3.94g溶于100mL去离子水，调节pH值至4.0)混合而成。

实施例1、佐剂的制备及其生物学活性的鉴定

一、虹鳟IL-17A基因的克隆

根据虹鳟IL-17A基因的核苷酸序列(GenBank：NM_001124619)，设计并人工合成引物F1：5’-GGATCCAAAGGAATGAAGGTGACAAAGG-3’(单下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)、引物R1：5’-AAGCTTTTATCAAGTAGTCCTTGCCCA-3’(单下划线为限制性内切酶HindⅢ的识别位点)、引物F2：5’-GAATTC

ATGAAAGGAATGAAGGTGACAAAGG-3’(单下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点，双下划线为kozak序列)和引物R2：5’-CTCGAGTCAAGTAGTCCTTGCCCA-3’(单下划线为限制性内切酶XhoI的识别位点)。

1、处死虹鳟，迅速于冰上无菌剥取头肾和脾脏，然后加入适量含10％(v/v)FBS的MEM培养基，注射器内柱碾压后，用尼龙网过滤，收集细胞滤液。

2、取细胞滤液，加入浓度为5μg/mL的植物血凝素溶液(将植物血凝素溶解于pH7.4、0.01mM PBS缓冲液得到)，15℃静置培养4h。

3、完成步骤1后，弃培养液，收集细胞并采用RNA提取试剂盒提取总RNA，按照M-MLV反转录酶说明书，以引物Oligo(dT)18进行反转录，获得cDNA第一条链。

4、以cDNA第一条链为模板，采用引物对甲(由引物F1和引物R1组成)进行PCR扩增，得到381bp的PCR扩增产物甲。以cDNA第一条链为模板，采用引物对乙(由引物F2和引物R2组成)进行PCR扩增，得到387bp的PCR扩增产物乙。

6、将PCR扩增产物甲和pMD18T载体连接，得到重组质粒甲。将PCR扩增产物乙和pMD18T载体连接，得到重组质粒乙。

将重组质粒甲和重组质粒乙分别进行测序。测序结果表明，重组质粒甲和重组质粒乙中均含有序列表中序列1所示的DNA分子。将序列表中序列1所示的DNA分子命名为虹鳟IL-17A基因。

二、多克隆抗体的制备

1、重组质粒pET32a-IL-17A的构建

(1)取重组质粒甲，用限制性内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，回收约381bp的酶切产物甲。

(2)取pET32a载体，用限制性内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，回收约5.9kb的载体骨架甲。

(3)将酶切产物甲和载体骨架甲进行连接，得到重组质粒pET32a-IL-17A。

将重组质粒pET32a-IL-17A进行测序。测序结果表明，重组质粒pET32a-IL-17A中含有序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pET32a-IL-17A中，序列表的序列1所示的DNA分子与载体骨架甲上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成融合基因，表达具有His-tag标签的融合蛋白(即重组IL-17A蛋白)。

2、重组IL-17A蛋白的表达

(1)将重组质粒pET32a-IL-17A导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌，将该重组菌命名为Rosetta－pET32a-IL-17A。

(2)取Rosetta－pET32a-IL-17A单克隆，接种至5mL LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素(Amp))，37℃、180rpm振荡培养12h，得到培养菌液。

(3)取培养菌液，按体积比为1:100接种至500mL LB液体培养基(含100μg/mLAmp)，37℃、180rpm振荡培养至OD_600nm值达到0.4～0.6，然后加入IPTG并使其浓度为1mM，37℃、120rpm振荡培养4h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。

(4)完成步骤(3)后，取菌体沉淀，加入pH8.0、100mM的Tris-HCl缓冲液重悬，超声破碎(超声波功率600W，循环程序为：破碎4s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm离心10min，得到菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。

将菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀分别进行SDS-PAGE。结果表明，重组IL-17A蛋白主要存在于包涵体，大小约为32kDa。

3、重组IL-17A蛋白的纯化

(1)取步骤2中(4)得到的菌体破碎沉淀，加入6mL Lysis Buffer溶液重悬，然后4℃静置直至沉淀完全溶解，经0.45μm过滤器过滤，得到溶解液。

(2)向层析柱中加入2mL Ni-NTA Agarose，采用重力法或低速离心法进行沉淀，然后轻轻吸去上清，再依次加入6mL去离子水清洗和6mL Lysis buffer溶液(经0.45μm过滤器过滤)润洗，来回旋转3min，弃液体。

(3)完成步骤(2)后，向所述层析柱中加入步骤(1)得到的溶解液，4℃来回旋转60min(目的为使Ni²⁺与重组IL-17A蛋白充分结合)，弃液体。

(4)完成步骤(3)后，重复如下步骤三次：向所述层析柱中加入5mL Wash buffer1(含100mM NaH₂PO₄和8M urea的pH6.0、10mM Tris·HCl缓冲液)，来回旋转3min，弃液体。

(5)完成步骤(4)后，重复如下步骤三次：向所述层析柱中加入5mL Wash buffer2(含100mM NaH₂PO₄和8M urea的pH5.3、10mM Tris·HCl缓冲液)，来回旋转3min，弃液体。

(6)完成步骤(5)后，重复如下步骤三次：向所述层析柱中加入2mL Elutionbuffer(含100mM NaH₂PO₄和8M urea的pH4.5、10mM Tris·HCl缓冲液)，来回旋转3min，收集液体。

(7)检测步骤(6)收集的液体的OD_280nm，然后4℃透析，收集透析产物。

(8)完成步骤(7)后，将透析产物进行SDS-PAGE。

Wash buffer1、Wash buffer2和Elution buffer均经0.45μm过滤器过滤。

结果表明，透析产物即为重组IL-17A蛋白溶液。经检测，重组IL-17A蛋白溶液中重组IL-17A蛋白的浓度约为0.204mg/mL。

4、多克隆抗体的制备

(1)将1体积份重组IL-17A蛋白溶液(含200μg重组IL-17A蛋白)和1体积份弗氏完全佐剂混合，乳化，得到混合液甲。将1体积份融合蛋白溶液(含200μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合，乳化，得到混合液乙。

(2)取混合液甲，经背、腹等部位皮下多点注射至5只BALB/c小鼠(每只BALB/c小鼠注射混合液甲的体积相同)。

(3)完成步骤(2)的第14d，经背、腹等部位皮下多点注射至5只BALB/c小鼠(每只BALB/c小鼠注射混合液乙的体积相同)。

(4)完成步骤(2)的第35d，分别对BALB/c小鼠的尾静脉采血，分离血清；然后采用间接ELISA法测定抗血清效价。具体步骤如下：

a、用包被液稀释步骤3得到的重组IL-17A蛋白溶液，得到蛋白溶液；

b、取微孔板，每孔加入蛋白溶液(含0.1μg重组IL-17A蛋白)，用封口膜封好，4℃、50rpm包被12h，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

c、完成步骤b后，每孔加入含5％(v/v)脱脂乳的PBST缓冲液，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

d、完成步骤c后，每孔加入2倍倍比稀释的步骤(4)分离的血清，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

5、完成步骤4后，每孔加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体，用封口膜封好，37℃静置30min，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

7、完成步骤6后，每孔加入100μL底物溶液，避光显色15min，然后每孔加入70μL浓度为1M的H₂SO₄水溶液，测量各孔在450nm处的OD值。

实验结果表明，经过免疫的小鼠(即依次注射混合液甲和混合液乙的小鼠)的血清的最终效价超过1:25600，完全可以满足后续实验需求。

(5)完成步骤(4)后，将经过免疫的小鼠通过眼球采血，然后分离血清，冻存于-20℃备用。该血清即为制备的多克隆抗体。

三、佐剂的制备及其生物学活性的鉴定

1、佐剂的制备

本发明提供的佐剂即重组质粒pIL-17A。

(1)取步骤一中6构建的重组质粒乙，用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，回收约387bp的酶切产物乙。

(2)取pcDNA3.1载体，用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，回收约5.4kb的载体骨架乙。

(3)将酶切产物乙和载体骨架乙进行连接，得到重组质粒pIL-17A。

将重组质粒pIL-17A进行测序。测序结果表明，重组质粒pIL-17A中含有序列表中序列1所示的DNA分子。重组质粒pIL-17A表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下简称IL-7蛋白或蛋白质IL-7)。

2、佐剂的生物学活性的鉴定

虹鳟性腺细胞RTG-2为ATCC(网址为：https://www.atcc.org)的产品，产品编号为CCL-55。

(1)取24孔板，每孔加入1.0×10⁵个虹鳟性腺细胞RTG-2和0.3mL含10％(v/v)新生犊牛血清的MEM培养基，5％CO₂、15℃培养至细胞单层达到40-60％。

(2)向完成步骤(1)的体系中加入1-3μg重组质粒pIL-17A，然后采用脂质体转染试剂进行转染(具体参考脂质体转染试剂说明书的操作步骤)。

(3)取完成步骤(2)的体系，5％CO₂、15℃培养48h，然后用4％(v/v)多聚甲醛水溶液固定，再用pH7.4、0.01mM的PBS缓冲液洗涤3次。

(4)取完成步骤(3)的体系，加入200μL多克隆抗体稀释液(由49体积份pH7.4、0.01mM的PBS缓冲液和1体积份步骤二制备的多克隆抗体混合而成)，37℃孵育1h，然后用pH7.4、0.01mM的PBS缓冲液洗涤3次。

(5)取完成步骤(4)的体系，加入300μL抗鼠FITC标记抗体稀释液(由999体积份pH7.4、0.01mM的PBS缓冲液和1体积份抗鼠FITC标记抗体混合而成)，37℃孵育30min，然后用pH7.4、0.01mM的PBS缓冲液洗涤3次。

(6)完成步骤(5)后，置于荧光倒置显微镜下观察，记录结果。

按照上述步骤，将步骤(2)中的重组质粒pIL-17A替换为pcDNA3.1载体，其它步骤均不变，作为对照。

结果表明，重组质粒pIL-17A可在虹鳟性腺细胞RTG-2中高水平的表达，具有生物学活性，可以进行下一步体内实验。

实施例2、实施例1制备的佐剂的应用

一、DNA疫苗(重组质粒pEE12.4-G)的制备

1、人工合成序列表中序列5所示的双链DNA分子并以其为模板，采用引物对丙(由引物F3：5’-GAATTCATGGACACCATGATCACCACTCCG-3’(单下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点)和引物R3：5’-GGATCCTCAGGACCGGTTTGCCAGGTGAT-3’(单下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)组成)进行PCR扩增，得到1539bp的PCR扩增产物丙。

2、取PCR扩增产物丙，用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，回收约1539bp的酶切产物丙。

3、取pEE12.4载体，用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，回收约6.9kb的载体骨架丙。

4、将酶切产物丙和载体骨架丙进行连接，得到重组质粒pEE12.4-G。

将重组质粒pEE12.4-G进行测序。根据测序结果，对重组质粒pEE12.4-G进行结构描述如下：将pEE12.4载体的限制性内切酶EcoRI和BamHI识别序列间的小片段替换为序列表中序列5所示的DNA分子。重组质粒pEE12.4-G表达序列表中序列6所示的蛋白质(即传染性造血器官坏死病毒G蛋白，以下简称G蛋白)。

重组质粒pEE12.4-G即为制备的DNA疫苗。

二、免疫

将300尾体重为9.5-10.5g的虹鳟随机分成联合免疫组甲、联合免疫组乙、联合免疫组丙、单独免疫组和对照组(每组60尾)，分别进行如下处理：

联合免疫组甲：肌肉注射重组质粒pEE12.4-G和重组质粒pIL-17A。注射剂量为2.5μg重组质粒pEE12.4-G/尾和0.5μg重组质粒pIL-17A/尾。

联合免疫组乙：肌肉注射重组质粒pEE12.4-G和重组质粒pIL-17A。注射剂量为2.5μg重组质粒pEE12.4-G/尾和2.5μg重组质粒pIL-17A/尾。

联合免疫组丙：肌肉注射重组质粒pEE12.4-G和重组质粒pIL-17A。注射剂量为2.5μg重组质粒pEE12.4-G/尾和5.0μg重组质粒pIL-17A/尾。

单独免疫组：肌肉注射重组质粒pEE12.4-G。注射剂量为2.5μg重组质粒pEE12.4-G/尾。

对照组：肌肉注射pcDNA3.1载体。注射剂量为2.5μg pcDNA3.1载体/尾。

三、实施例1制备的佐剂对免疫相关基因表达的影响

1、完成步骤二后的第3d，各组处死3尾虹鳟，然后迅速于冰上无菌剥取脾脏。

2、分别取脾脏，进行液氮研磨后采用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后采用M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。

3、以步骤3得到的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测脾脏中IgM基因、IgT基因、Mx基因、Viperin基因、CD4基因、CD8基因和TNF-α基因的的相对表达量(以β-Actin基因为内参基因)。

鉴定IgM基因、IgT基因、Mx基因、Viperin基因、CD4基因、CD8基因、TNF-α基因和β-Actin基因的引物的核苷酸序列详见表1。

其中荧光定量PCR上样体系为25μL，由0.5μL上游引物(浓度为10μM)、0.5μL下游引物(浓度为10μM)、12.5μL SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×Conc.)、2μL模板溶液、0.5μL ROX Reference Dye(50×Conc.)和9μL ddH₂O组成。上游引物即表1中引物名称中含有“sense”的引物，下游引物即表1中引物名称中含有“anti”的引物。

Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)为Takara公司的产品，产品目录号为RR420A。SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×Conc.)和ROX Reference Dye(50×Conc.)均为

Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)中的组件。

表1

将单独免疫组中免疫相关基因(IgM基因、IgT基因、Mx基因、Viperin基因、CD4基因、CD8基因或TNF-α基因)的相对表达量作为1，检测联合免疫组甲、联合免疫组乙和联合免疫组丙中免疫相关基因的相对表达量。免疫相关基因表达采用单因素方差分析进行比较，T检验用于成对样品间的比较，P<0.05为差异显著。

实验结果见图1(2.5μg pEE12.4-G+0.5μg pIL-17A为联合免疫组甲，2.5μgpEE12.4-G+2.5μg pIL-17A为联合免疫组乙，2.5μg pEE12.4-G+5μg pIL-17A为联合免疫组丙)。结果表明，与单独免疫组相比，联合免疫组乙中IgT基因的表达水平显著提高(3.3倍，P<0.05)，联合免疫组丙中IgM基因、Mx基因、Viperin基因和CD8基因的表达水平显著提高(分别为8.0倍、3.7倍、3.6倍和9.8倍，P<0.05)，但联合免疫组(联合免疫组甲、联合免疫组乙或联合免疫组丙)中CD4基因和TNF-α基因的表达水平无显著差异。因此，重组质粒pIL-17A作为的佐剂最佳使用量为5μg/尾。

四、实施例1制备的佐剂对特异性IgM抗体产生的影响

分别在完成步骤二后的第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，采集免疫组(联合免疫组丙、单独免疫组或对照组)3尾虹鳟的血液并分离血清，然后采用ELISA方法检测血清中特异性IgM抗体的水平。具体步骤如下：

1、用包被液稀释IHNV G截短蛋白，得到浓度为0.001μg/μL的蛋白溶液；

2、取微孔板，每孔加入100μL蛋白溶液，用封口膜封好，4℃、50rpm包被12h，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

3、完成步骤2后，每孔加入100μL含5％(v/v)脱脂乳的PBST缓冲液，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

4、完成步骤3后，每孔加入100μL血清稀释液(向PBST缓冲液中加血清至其含量为1％(v/v)用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

5、完成步骤4后，每孔加入100μL抗体稀释液，用封口膜封好，37℃静置30min，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

6、完成步骤5后，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(工作浓度为1:120000，用pH7.4、0.01mM PBS缓冲液稀释)，用封口膜封好，37℃静置30min，然后弃上清，用PBST缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；

实验结果见图2(pEE12.4-G为单独免疫组，pEE12.4-G+pIL-17A为联合免疫组丙，pcDNA3.1为对照组)。结果表明，免疫后第7天，单独免疫组和联合免疫组丙中均有特异性IgM抗体产生；联合免疫组丙在免疫后第7天和第14天的特异性IgM抗体水平均显著高于单独免疫组(P<0.05)；之后特异性IgM抗体水平继续升高，在免疫后第28天达到最高水平，此时单独免疫组和联合免疫组中特异性IgM抗体的水平无显著差异。

五、实施例1制备的佐剂对中和抗体效价的影响

分别在完成步骤二后的第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，采集免疫组(联合免疫组丙、单独免疫组或对照组)3尾虹鳟的血液并分离血清，然后采用PNT法(记载于如下文献中：SS Ristow，JD Avila，SE Lapatra，K Lauda.Detection and characterizationof rainbow trout antibody against Infectious hematopoietic necrosis virus，Diseases of Aquatic Organisms，1993，15(2)，109-114.)检测血清中中和抗体效价。具体步骤如下：

1、将血清置于56℃水浴灭活30min，冷却，得到待检血清；

2、取细胞培养板，用MEM培养基将待检血清做2倍系列稀释，每孔液体容量为50μL(即第1个孔加入50μL待检血清；第2个孔先加入50μL待检血清和50μL MEM培养基，充分混匀，然后吸取50μL加入第3个孔；向第3个孔加入50μL MEM培养基，充分混匀，然后吸取50μL加入第4个孔；依次类推)；

3、完成步骤2后，每孔加入50μL IHNV-Sn1203(效价为100TCID50/50μL)，充分混匀，然后置于15℃温箱静置1h；

4、完成步骤3后，将所述细胞培养板每孔中的液体转移至另一细胞培养板的对应孔中，置于15℃温箱静置1h，弃上清。

5、完成步骤4后，每孔加入500μL含1％(V/V)甲基纤维素的MEM培养基，待阴性对照出现明显噬斑后，弃上清，用结晶紫进行染色，记录各孔噬斑形成数量，噬斑减少50％的最高稀释度即为中和抗体效价。

上述步骤中，将步骤2中的待检血清替换为健康虹鳟血清，其它步骤均不变，即为阴性对照。

上述步骤中，将步骤2中的待检血清替换为IHNV-Sn1203感染虹鳟血清，其它步骤均不变，即为阳性对照。

上述步骤中，将步骤2中的待检血清替换为MEM培养基，其它步骤均不变，即为病毒对照。

上述步骤中，将步骤3中的IHNV-Sn1203替换为MEM培养基，其它步骤均不变，即为正常对照。

实验结果见表2(效价>1:20的中和抗体认为是阳性)。结果表明，免疫后第7天和第14天，联合免疫组丙可诱导中和抗体产生(1:40)，此时单独免疫组无中和抗体产生；免疫后第21天，单独免疫组和联合免疫组丙中的中和抗体达到最高值(1:160)，随后在免疫后第28天下降为1:80；免疫后第35天，联合免疫组丙中的中和抗体仍可维持在1:80，而单独免疫组中的中和抗体此时则下降至1:40，对照组在免疫后各周均未检测到阳性中和抗体。因此，实施例1制备的佐剂可以影响中和抗体效价。

表2

六、实施例1制备的佐剂对淋巴细胞增殖的影响

G蛋白记载于如下文献中：陶健，徐黎明，刘淼，赵景壮，曹永生，卢彤岩，尹家胜，刘红柏.传染性造血器官坏死病毒抗原表位富集区的原核表达及应用.淡水渔业，2015，45(2)，49-55.

分别在完成步骤二后的第14天和第28天，将联合免疫组丙和单独免疫组各处死3尾虹鳟，迅速于冰上无菌剥取脾脏，然后采用MTT法测定淋巴细胞增殖指数。具体步骤如下：

1、用注射器内柱碾压脾脏，经尼龙网过滤，然后采用Ficoll-Paque PLUS试剂分离淋巴细胞，5000rpm离心3min，用无菌的pH7.4、0.01mM PBS缓冲液洗涤两次。

2、完成步骤1后，向所述淋巴细胞中加入含10％(v/v)血清的MEM培养基重悬，得到浓度为5×10⁶个/mL的细胞悬浮液。

3、取96孔细胞培养板，每孔加入100μL细胞悬浮液和50μL浓度为2μg/mL的G蛋白溶液(将G蛋白溶解于pH7.4、0.01mM PBS缓冲液得到)，5％CO₂、15℃培养60h，然后每孔加入10μL WST-1溶液继续培养2h，测量在450nm处的OD值，即刺激孔的OD_450nm。

4、按照步骤3的步骤，将浓度为2μg/mL的G蛋白溶液替换为浓度为5μg/mL PHA水溶液，其它步骤均不变，得到对照孔的OD_450nm。

计算刺激指数。刺激指数(SI)＝刺激孔的OD_450nm/对照孔的OD_450nm。

实验结果见图3(pEE12.4-G为单独免疫组，pEE12.4-G+pIL-17A为联合免疫组丙)。结果表明，免疫后第14天，联合免疫组丙和单独免疫组的刺激指数无显著差异(P<0.05)；免疫后第28天，联合免疫组丙在PHA或G蛋白刺激下的刺激指数显著高于单独免疫组(P<0.05)。因此，实施例1制备的佐剂可影响淋巴细胞的增殖。

七、实施例1制备的佐剂对DNA疫苗(即重组质粒pEE12.4-G)的保护力的影响

完成步骤二后的第28d，免疫组(联合免疫组丙、单独免疫组或对照组)取30尾虹鳟，采用腹腔注射的方式，以IHNV-Sn1203进行攻毒(剂量为300pfu/尾)，然后逐日观察鱼体健康情况，记录鱼的死亡数量，绘制累积存活率曲线。

实验结果见图4(pEE12.4-G为单独免疫组，pEE12.4-G+pIL-17A为联合免疫组丙，pcDNA3.1为对照组)。结果表明，攻毒后14天，单独免疫组的存活率(43.3％)显著高于对照组(13.3％)，而联合免疫组丙的保护率可达到76.7％。因此，实施例1制备的佐剂可从多角度对重组质粒pEE12.4-G诱导的免疫反应进行优化，有效提升DNA疫苗(即重组质粒pEE12.4-G)的保护力。

<110> 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所

<120> IL-17A蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 366

<212> DNA

<213> 虹鳟（Oncorhynchus mykiss）

<400> 1

aaaggaatga aggtgacaaa ggagaggtgt aacgaaacac tgatcatccc ttcagacttc 60

tacaagattc ccacagagga atcagaggga aatgggaaca ttcacacacg ctctctgtca 120

ccctggacct ggaaaagcac tacagtggag aaccgtattc ctcagaccat gtgggaggcc 180

gagtgcagct ctatgtactg tgtctacccc accaacagaa gccagtacat gcgctacagg 240

cagaactctg tacctatcta ccagcaggtc gtggtactct acacttcagc caccaggaag 300

tgctacagcg cctccttcct gtctgtggcc gtggggtgca cctgtgcctg ggcaaggact 360

acttga 366

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 虹鳟（Oncorhynchus mykiss）

<400> 2

Lys Gly Met Lys Val Thr Lys Glu Arg Cys Asn Glu Thr Leu Ile Ile

1 5 10 15

Pro Ser Asp Phe Tyr Lys Ile Pro Thr Glu Glu Ser Glu Gly Asn Gly

20 25 30

Asn Ile His Thr Arg Ser Leu Ser Pro Trp Thr Trp Lys Ser Thr Thr

35 40 45

Val Glu Asn Arg Ile Pro Gln Thr Met Trp Glu Ala Glu Cys Ser Ser

50 55 60

Met Tyr Cys Val Tyr Pro Thr Asn Arg Ser Gln Tyr Met Arg Tyr Arg

65 70 75 80

Gln Asn Ser Val Pro Ile Tyr Gln Gln Val Val Val Leu Tyr Thr Ser

85 90 95

Ala Thr Arg Lys Cys Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly

100 105 110

Cys Thr Cys Ala Trp Ala Arg Thr Thr

115 120

<210> 3

<211> 441

<212> DNA

<213> 虹鳟（Oncorhynchus mykiss）

<400> 3

atggagctca aaagcaacgt gtcgaagtac ctggttgtgt gctgtgtgtc tatgctgctg 60

ggcctgacca tggcgaaagg aatgaaggtg acaaaggaga ggtgtaacga aacactgatc 120

atcccttcag acttctacaa gattcccaca gaggaatcag agggaaatgg gaacattcac 180

acacgctctc tgtcaccctg gacctggaaa agcactacag tggagaaccg tattcctcag 240

accatgtggg aggccgagtg cagctctatg tactgtgtct accccaccaa cagaagccag 300

tacatgcgct acaggcagaa ctctgtacct atctaccagc aggtcgtggt actctacact 360

tcagccacca ggaagtgcta cagcgcctcc ttcctgtctg tggccgtggg gtgcacctgt 420

gcctgggcaa ggactacttg a 441

<210> 4

<211> 146

<212> PRT

<213> 虹鳟（Oncorhynchus mykiss）

<400> 4

Met Glu Leu Lys Ser Asn Val Ser Lys Tyr Leu Val Val Cys Cys Val

1 5 10 15

Ser Met Leu Leu Gly Leu Thr Met Ala Lys Gly Met Lys Val Thr Lys

20 25 30

Glu Arg Cys Asn Glu Thr Leu Ile Ile Pro Ser Asp Phe Tyr Lys Ile

35 40 45

Pro Thr Glu Glu Ser Glu Gly Asn Gly Asn Ile His Thr Arg Ser Leu

50 55 60

Ser Pro Trp Thr Trp Lys Ser Thr Thr Val Glu Asn Arg Ile Pro Gln

65 70 75 80

Thr Met Trp Glu Ala Glu Cys Ser Ser Met Tyr Cys Val Tyr Pro Thr

85 90 95

Asn Arg Ser Gln Tyr Met Arg Tyr Arg Gln Asn Ser Val Pro Ile Tyr

100 105 110

Gln Gln Val Val Val Leu Tyr Thr Ser Ala Thr Arg Lys Cys Tyr Ser

115 120 125

Ala Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly Cys Thr Cys Ala Trp Ala Arg

130 135 140

Thr Thr

145

<210> 5

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

atggacacca tgatcaccac tccgctcatt ctcattctaa tcacctgtgg agcaaacagc 60

caaacagtcc cccccgacac cgcaagcgaa tcagaccaac ccacctggtc aaacccgctc 120

ttcacctacc ccgagggatg cactctggac aaactctcca aggtcaatgc ttctcaactg 180

agatgcccaa ggatcttcga tgatgagaac agggggctaa tttcttatcc cgcctccatc 240

cggtccctgg cggtcggaaa cgacctcggg gcgattcaca cccaagggaa ctacatccac 300

aaagtcctgt accgcaccat ctgctcaaca gggttcttcg ggggtcagac gatagagaag 360

gtacttgtag aaatgaaact ctcaacgaga gaagcagggg catatgacac cacaaccgcg 420

gccgctctgt acttcccagc tccccgatgc caatggtaca ccgacaacgt acaaaatgat 480

ctcatcttct actacacaac ccaaaagagt gttctgagag atccctacac cagagacttc 540

ctggactcag attttgttgg aggaaaatgc actaaatcac cctgccagac tcattggtcc 600

aacgtagttt ggattggtga tgcagggata ccagcctgtg acgccagccc agaaataaac 660

ggtcacctct ttgttgataa aatctccagt cgagccgtga aggcaacgag ctacggacac 720

cacccctggg gactgcatcg ggcctgtatg attgagttct gtgggaaaca gtggatacgg 780

acagatctcg gtgacctgat atctgtagga tacaattctg gagcaaaaac cctctccttc 840

ccgaagtgtg aggacgagac ggtggggatg aggggaaacc tggatgactt tgcctatcta 900

gacgacctgg tgaaggcctc agagagcaga gaggaatgtc ttgaggcgca tgccgagata 960

atatcaacaa acagtgtgac tccatacctc ctatccaagt tccgatctcc acatcccgga 1020

ataaatgacg tctacgctat gcacaaaggc tccatctatc atgggatgtg catgacggtc 1080

gctgtggacg aggtatccaa ggacaggacg acgtacaggg cccatcacgc caccaacttc 1140

actaaatggg aacgaccctt tggggatgag tgggaaggct ttcacggatt gcacggaaac 1200

aacatcacca ttattccaga cctggagaaa tacgtcgccc agtacaagat gagcatgatg 1260

gaaccgatgg gcatcaaatc cgtaccccat ccaagcatcc tggccttcta caatgagaca 1320

gaagtatcgg ggatctccat caggaaattg gactcgttcg accttcaatc actccactgg 1380

agtttctggc ccacaatctc cacactgggt gggattcccc tggttctcct ccttgctgtt 1440

gccgcgtgct gctgctggtc agggagactt cccactccct ccgcgccgca gagtatcccc 1500

atgtatcacc tggcaaaccg gtcctga 1527

<210> 6

<211> 508

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

Met Asp Thr Met Ile Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ile Leu Ile Thr Cys

1 5 10 15

Gly Ala Asn Ser Gln Thr Val Pro Pro Asp Thr Ala Ser Glu Ser Asp

20 25 30

Gln Pro Thr Trp Ser Asn Pro Leu Phe Thr Tyr Pro Glu Gly Cys Thr

35 40 45

Leu Asp Lys Leu Ser Lys Val Asn Ala Ser Gln Leu Arg Cys Pro Arg

50 55 60

Ile Phe Asp Asp Glu Asn Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Pro Ala Ser Ile

65 70 75 80

Arg Ser Leu Ala Val Gly Asn Asp Leu Gly Ala Ile His Thr Gln Gly

85 90 95

Asn Tyr Ile His Lys Val Leu Tyr Arg Thr Ile Cys Ser Thr Gly Phe

100 105 110

Phe Gly Gly Gln Thr Ile Glu Lys Val Leu Val Glu Met Lys Leu Ser

115 120 125

Thr Arg Glu Ala Gly Ala Tyr Asp Thr Thr Thr Ala Ala Ala Leu Tyr

130 135 140

Phe Pro Ala Pro Arg Cys Gln Trp Tyr Thr Asp Asn Val Gln Asn Asp

145 150 155 160

Leu Ile Phe Tyr Tyr Thr Thr Gln Lys Ser Val Leu Arg Asp Pro Tyr

165 170 175

Thr Arg Asp Phe Leu Asp Ser Asp Phe Val Gly Gly Lys Cys Thr Lys

180 185 190

Ser Pro Cys Gln Thr His Trp Ser Asn Val Val Trp Ile Gly Asp Ala

195 200 205

Gly Ile Pro Ala Cys Asp Ala Ser Pro Glu Ile Asn Gly His Leu Phe

210 215 220

Val Asp Lys Ile Ser Ser Arg Ala Val Lys Ala Thr Ser Tyr Gly His

225 230 235 240

His Pro Trp Gly Leu His Arg Ala Cys Met Ile Glu Phe Cys Gly Lys

245 250 255

Gln Trp Ile Arg Thr Asp Leu Gly Asp Leu Ile Ser Val Gly Tyr Asn

260 265 270

Ser Gly Ala Lys Thr Leu Ser Phe Pro Lys Cys Glu Asp Glu Thr Val

275 280 285

Gly Met Arg Gly Asn Leu Asp Asp Phe Ala Tyr Leu Asp Asp Leu Val

290 295 300

Lys Ala Ser Glu Ser Arg Glu Glu Cys Leu Glu Ala His Ala Glu Ile

305 310 315 320

Ile Ser Thr Asn Ser Val Thr Pro Tyr Leu Leu Ser Lys Phe Arg Ser

325 330 335

Pro His Pro Gly Ile Asn Asp Val Tyr Ala Met His Lys Gly Ser Ile

340 345 350

Tyr His Gly Met Cys Met Thr Val Ala Val Asp Glu Val Ser Lys Asp

355 360 365

Arg Thr Thr Tyr Arg Ala His His Ala Thr Asn Phe Thr Lys Trp Glu

370 375 380

Arg Pro Phe Gly Asp Glu Trp Glu Gly Phe His Gly Leu His Gly Asn

385 390 395 400

Asn Ile Thr Ile Ile Pro Asp Leu Glu Lys Tyr Val Ala Gln Tyr Lys

405 410 415

Met Ser Met Met Glu Pro Met Gly Ile Lys Ser Val Pro His Pro Ser

420 425 430

Ile Leu Ala Phe Tyr Asn Glu Thr Glu Val Ser Gly Ile Ser Ile Arg

435 440 445

Lys Leu Asp Ser Phe Asp Leu Gln Ser Leu His Trp Ser Phe Trp Pro

450 455 460

Thr Ile Ser Thr Leu Gly Gly Ile Pro Leu Val Leu Leu Leu Ala Val

465 470 475 480

Ala Ala Cys Cys Cys Trp Ser Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro

485 490 495

Gln Ser Ile Pro Met Tyr His Leu Ala Asn Arg Ser

500 505

Claims

1.IL-17A蛋白的应用，为a1)或a2)：a1)制备动物疫苗佐剂；a2)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品；

所述IL-17A蛋白为b1)或b2)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

所述动物为虹鳟；

所述疫苗为传染性造血器官坏死病核酸疫苗；

所述抗原为传染性造血器官坏死病毒G蛋白。

2.编码权利要求1中所述IL-17A蛋白的核酸分子或含有编码权利要求1中所述IL-17A蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌的应用，为a1)至a2)：a1)制备动物疫苗佐剂；a2)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品；

所述动物为虹鳟；

所述疫苗为传染性造血器官坏死病核酸疫苗；

所述抗原为传染性造血器官坏死病毒G蛋白。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为c1)或c2)：

c1)序列表中序列1所示的DNA分子；

c2)编码区如序列表中序列3所示的DNA分子。