JPH02500799A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワ　り　チ　ン 鼓」弓五肚 本発明は寄生性線虫（ｎｅａ＋ａ　ｔｏｄｅｓ　）による感染、例えばトリキネ ラ・スピラリス（旋毛虫、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ　５ｐｉｒａｌｉｓ）または アンキロストマ・カニヌム（イヌ鉤虫、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｃａｎｉｎｕ ｍ）のヒトでの感染、ストロンギルス・ブルガリス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓνｕ １ｇａｒｉｓ）のウマでの感染、トリコストロンギルス・コルブリフォルミス（ コルブリフォルミス毛様線虫、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｃｏｌｕｂｒ ｉｆｏｒｍｉｓ）のヒツジでの感染、ヘモンカス・コントルクス（捻転毛様線虫 、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）のヒツジおよびヤギでの感染、 オスチルカシア・オステルタジ（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａｏｓｔｅｒｔａｇｉ）の ウシでの感染、アスカ−リス・スーム（ブタ相生、Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ） または旋毛虫のブタでの感染、トキサスカリス・レオニテ（ライオン・トキサス カリス、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ　１ｅｏｎｉｎａ）またはランシナリア・ステノ セファラ（挟頭鉤虫、Ｌｌｎｃｉｎａｒｉａｓ　ｔｅｎｏＣ／ｅｐｈａ　ｌａ　 ）のネコでの感染、イヌ鉤虫またはトリクリス・プルビス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ νｕｌｐｉｓ）のイヌでの感染、ジロフィラリア・イミチス（イヌ糸状束、Ｄｉ ｒｏｆｉｒａｒｉａ　ｉｎ＋＋＋＋１ｔｉｓ）のイヌでの感染、トキソカラ（Ｔ ｏｘｏｃａｒａ　）種の幼虫によるヒトの感染並びにネカトール・アメリカ鉤虫 （アメリカ鉤虫、Ｎｅｃａ　ｔｏｒａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）　、アンキロストマ ・デュオデナレ（ズビニ鉤虫、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ　ｄｕｏｄｅｎａｌｅ） 、アスカ−リス・ルンブリコイデス（回虫、Ａｓｃａｒｉｓ　ｌｕｍｂｒｉｃｏ ｉｄｅｓ）、トリクリス・トリキウラ（ヒト鞭虫、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ　ｔｒｉ ｃｈｉｕｒａ）、エンテロビウス・ベルミクラルス（ぎよう虫、Ｅｎｔｅｒｏｂ ｉｕｓ　ｖｅｒｉｉｃｕｌａｒｕｓ）、ストロンギルスデス・ステルコラルス（ 糞線虫、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒａｌｓ　）またはブーケレ リア・パンクロフチ（バンクロフト糸状束、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ　ｂａｎｃｒ ｏｆｔｉ）による感染に対して防御免疫を与える蛋白質の同定に関する。

本発明は更に、これら蛋白質またはその誘導体をコードするヌクレオチドシーケ ンス（配列）並びにこのようなヌクレオチドシーケンスを含有する組換え体分子 およびこれらヌクレオチドシーケンスを発現する宿主細胞を提供する。本発明は また、本発明のヌクレオチドシーケンス、組換え体分子および宿主の製造法も提 供する。

更に、本発明は寄生性線虫の感染、例えば旋毛虫またはイヌ鉤虫のヒトでの感染 、ストロンギルスブルガリスのウマでの感染、コルブリフォルミス毛様線虫のヒ ツジでの感染、捻転毛様線虫のヒツジまたはヤギでの感染、オステルタジアオス テルタジのウシでの感染、ブタ畑土または旋毛虫のブタでの感染、ライオン・ト キサス力リスまたは狭頭鉤虫のネコでの感染、イヌ鉤虫またはトリクリス・プル ビスのイヌでの感染、イヌ糸状束のイヌでの感染並びにトキソカラ種の幼虫によ るヒトの感染およびアメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒト鞭虫、ぎょう虫、糞 線虫またはバンクロフト糸状束によるヒトの感染に対して防御免疫を与えるワク チンに関する。

背景荻街 小麦で覆われた細長い、紡錘状または貴様の体を持ち、分裂しない畑土である線 虫（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ　：　ｎｅｍａ−系；　ｏｉｄｅｓ　−Ｉｉ似体）は実 質的に天然に遍在し、土壌、水および植物に生息しており、動物および植物の広 範囲の寄生性症に大いに関わっている。

哺乳動物の畑土寄生虫は線形動物門に属する。畑虫には鉤虫（例えばアメリカ鉤 虫およびズビニ鉤虫）、畑土（例えば、通常の畑土のアスカ−リス・ルンブリコ イデス）、鞭虫（例えばヒト鞭虫）およびぎょう虫または線状虫（例えばエンテ ロビウス・ベルミクラルス）並びに糞線虫、旋毛虫（ヒトおよびブタでの感染） およびフィラリア系状虫のバンクロフト糸状束がある。他の重要な相生寄生虫に は、イヌ鉤虫（ヒトでの感染）、ストロンギルス・ブルガリス（ウマでの感染） 、コルブリフォルミス毛様線虫（ヒツジでの感染）、捻転毛様線虫（ヒツジおよ びヤギでの感染）、オステルタジア・オステルタジ（ウシでの感染）、ブタ畑土 、ライオン・トキサスカリスまたは挾頭鉤虫（イヌでの感染）、トキソカラ種（ ヒトの循環器系感染）並びにイヌ糸状束（ネコおよびイヌでの循環器系感染）が ある。

症状がない場合であっても、寄生虫感染は多くの理由により宿主動物に有害であ る；例えば、寄生虫は宿主から食物を奪い、臓器を損傷させまたは管を塞ぎ、宿 主に有害な物質を作り出すことがあり、そして他の生物への入口をもたらす。他 の場合には、宿主は食物で成育する種であり、寄生虫は摂食によって伝達されて 摂取動物に感染する。このような寄生虫は発見され次第すぐに除去することが極 めて望ましい。

更に一般的には、このような感染は無症状ではない。哺乳動物の螺虫怒染、殊に 寄生性線虫による寄生虫感染は、特に家畜類およびペット、例えばヒツジ、ウシ 、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコおよびトリ、殊に家出に関する大きな経済的損 失のもとである（ＣＳＩＲＯ／ＢＡＥ報告−「農業分野における社会経済的発展 および傾向：今後の研究との関連」参照）。これらの動物はこのような感染を制 御するために駆虫剤で定期的に処置しなければならず、そうしなければこの病気 により貧血、下痢、脱水、食欲不振が生じ、そして更には死亡する。

寄生虫感染の制御に現在利用できる唯一の方法は駆虫剤を使用することであるが 、これらの方法は治療時に存在する寄生虫に対してしか有効でない。それ故、動 物は常に感染にさらされているので、治療を継続しなければならない。例えば、 ジエチルカルバマシンを用いる駆虫剤治療はジロフィラリア・イミチスまたはイ ヌの糸状束を制御するために１年の内の大部分、毎日または隔日に実施する必要 がある。これは高価で労働集約的な方法である。駆虫剤の広範な使用によって、 寄生虫は耐性となるので、新規で且つ更に効力の高いクラスの化学薬剤が開発さ れなければならない。別の試みをすることが明らかに望ましい。

寄生性線虫に対するワクチンが開発されれば、寄生虫感染の阻止および治療の化 学療法に伴う固有の欠点の多くが克服されると思われる。感染防御は確実により 長く続き、ワクチンを投与した動物のみが影響を受け、そして毒性および残留物 持続の問題は最小になるかまたは回避されよう。従って、寄生性線虫を使用して このようなワクチンを開発する幾つかの研究が先行技術で報告さｎている９残念 乍ら、それらの成功は■られフでものであり、材料の入手可能性およびワクチン の安定性のようなファクターによってこれらワクチンの広範な使用が妨げられて いる。

ジェイ・ケイ・ディニーン（Ｊ、に、Ｄｉｎｅｅｎ）等（１９７７年）が記載し た１つの上記通用は照射幼虫ワクチンの使用に関わるものである。他の同様な試 みと同じく、この方法の有用性は生存線虫を長期間維持する必要があるので制限 される。

死滅ワクチン調製物が良好な駆虫防御になり得ないのは、多数のファクターによ るものと考えられている。例えば、ジェイ・ティー・エム・ネイルマン（Ｊ、Ｔ 、Ｍ、Ｎｅ１ｌｓｏｎ）　（１９７５年）は、寄生性線虫が宿主の免疫系を抑制 しまたは調節する生成物を分泌し得るメカニズムを生じさせ、それによって有効 な免疫応答の発展が妨げられそして宿主が他の感染にかかり易くなると考えてい る。ディニーンおよびワグランド（Ｗａｇｌａｎｄ）　（１９８２年）は、免疫 抑制物および免疫調節物が死滅ワクチンで使用される寄生性線虫の粗調製物中に 存在している可能性があると考えている。この総説論文によって示唆された第２ の問題は、自然感染に際して、感染防御寄生虫抗原が激しい免疫反応を起こさな いように、寄生性線虫がその抗原プロフィールを宿主の抗原プロフィールに類領 するものに変えることである。このような現象は、死滅線虫またはその抽出物の 不純な調製物を用いてワクチン投与した後にも生じるものと思われる。

バイオテクノロジー、特に組換え体ＤＮＡ技術における最近の進歩により実際上 、ヒトおよび家畜のある範囲の経済的に重要な寄生虫に対する商業的に実施可能 なワクチンを製造する機会が提供される。多くの寄生虫蛋白質は寄生虫感染中の 宿主動物によって認識されることが示されている（例えば、０’　ｄｏｎｅｌｌ 等、１９８５年）が、免疫応答の多くは再感染に対する耐性の点から実用的な重 要性は有していない。主要な段階は、寄生性生物に存在する何千もの蛋白質の中 から、宿主動物を再感染から防御する免疫応答を該動物に誘導できる個々の蛋白 質を同定することである。１度同定されると、それら蛋白質または感染防御エピ トープを有する蛋白質の部分を合成する微生物を構築するために組換え体ＤＮＡ 技術を使用することができ、そして該寄生虫での感染から動物を防御するために 組換え体生物によって合成された生成物をワクチンに使用できよう。この試みに より、上記した粗製の寄生虫調製物を使用する死滅ワクチンの有効性の欠除を説 明するために持ち出された問題の多くが克服されよう。例えば、組換え体ＤＮＡ 技術により製造されたワクチンは、寄生性線虫の粗製抽出物中に見い出される免 疫抑制物または免疫調節物を含有していないであろう。

Ｃ５ＩＲＯ／ＢＡＨの研究論文「農業分野における社会経済的発展および傾向： 今後の研究との関連」はオーストラリアのヒツジ産業における３つの最も緊ゑ、 な健康聞届の１つとして腸内寄生虫を挙げ、そしてワクチンの開発によりこれら の感染をより良く制御することに大きな期待が持たれることを示した。

コルブリフォルミス毛様線虫および捻転毛様線虫はヒツジの最も重要な寄生虫の 内の２つである。これらの種の寄生虫による感染に対して動物にワクチン投与す るために幾つかの研究がなされた（ＡｄａｍｓおよびＣｏｂｏｎの総説参照）。

例えば、ロスウェル（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ）と共同研究者（１９７４，１９７７゜ １９７８年）は、コルブリフォルミス毛様線虫の第４期幼虫から得た全ホモジネ ートがヒツジの実験室用モデルである異系交配のモルモットから該寄生虫の駆除 を促進することを示すために多くの研究をした。その後、ドデシル硫酸ナトリウ ム含有ポリアクリルアミドゲル（ＳＯＳ　−ＰＡＧＥ　）での電気泳動によって 単離された上記全ホモジネートのサブフラクションも上記の駆除を促進させるこ とが示された（０’　ｄｏｎｎｅｌｌ等、１９８５年）。捻転毛様線虫の体細胞 抽出物並びにインビトロ発育中に単離された幼虫の排泄物および分泌物から得ら れた高分子フラクションをワクチンに使用し、対照と比較して５９％の成虫数減 少が生じたことが最近報告されているＮｅｉ　ｌ５ｏｎおよびνａｎ　ｄｅ　Ｗ ａｌｌｅ＋　１９８７年）。

シルバーマン（Ｓｉ１νｅｒｍａｎ）は米国特許第８９４６６０３号およびオー ストラリア特許第２４７３５４号で同様なりレームをしている。

しかし乍ら、これらの報告の全てにおいて、粗製抽出物が使用されており、そし て抽出物のどの特定の抗原または個々の成分が感染防御に寄与しているのかは全 く同定されていない。特定された抗原で現在までに最も感染防御性であると証明 されている唯一の線虫−宿主系はデスボミア（Ｄｅｓｐｏｍｍｉｅｒ　）と共同 研究者が研究した旋毛虫−マウス系である（ＳｉｌνｅｒｓｔｅｉｎおよびＤｅ ｓｐｏｍｍｉｅｒ、　１９８５年参照）。分子量４８ｋＤおよび５０〜５５ｋＤ の２つの抗原はそれぞれ６８％および３９％の宿主感染防御を示した。更に、捻 転毛様線虫から単離されたコントルチンと称される分子はヒツジの寄生虫感染症 を軽減するためにワクチンに使用できると主張されている（ＭｕｎｎおよびＧｒ ｅｅｎｗｏｏｄ、　１９８７年）。しかし乍ら、この！！７１質は分子レベルで は特徴化されておらず、該フラクションを製造する手段は、その調製物が非常に 不純であり多くの成分を含有していると思われる程のものである。どの成分が観 察された限界的な効果に寄与しているのかは証明されて本願発明では、４１ｋＤ と称する分子はコルブリフォルミス毛様線虫から単離されるものである。非天然 形態で製造すると、この分子はモルモットがコルブリフォルミス毛様線虫により 感染されるのを４３〜５１％防御する。４１ｋＤの蛋白質をコードする遺伝子を コルブリフォルミス毛様線虫からのクローン化し、そしてこれに密接に関係のあ る、捻転毛様線虫から得た遺伝子もクローン化した。この２つの遺伝子のハイブ リッド形成試験およびＤ　Ｎ　Ａシーケンス分析によって、これらは密接に関係 のあることが示される。コルブリフォルミス毛様線虫由来のＤＮＡシーケンスを 含有する組換え体生物により製造されたポリペプチドはコルブリフォルミス毛様 線虫による寄生虫症からモルモットを防御することが可能である。更に、捻転毛 様線虫由来のＤＮＡシーケンスを含有する組換え体生物から製造されたポリペプ チドは捻転毛様線虫感染からヒツジを防御することが可能であり、またモルモッ トをフルプリフォルミス毛様線虫感染から防御することも可能である。それ故、 本願発明で記載した組換え体蛍白質を用いるワクチン投与により、または他の種 の寄生虫由来の関係のある遺伝子生成物を使用する組換え体技術で製造された蛋 白質によって、成る範囲の寄生虫線虫に対する感染防御が他の種の動物で得られ ることを確信的ムこ予言できる。蛋白質およびＤＮＡシーケンスの分析によって 、これら蛋白質は密接に関連しており、そして寄生性線虫種の他の全ての関連形 態で存在していると期待されることが示される。類推によって、本発明は全ての 主要な動物の線虫寄生虫を含むように拡張される。

本発明を更に詳細に記載するため、コルプリフォルミス毛様線虫の第３期幼虫を リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ　”）で可及的に良く洗い、次いでデオキシコ ール酸ナトリウム含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ　−ＤＯＣ）で抽出した。ＰＢＳ　 −ＤＯＣ抽出物は２，３の主要な蛋白質バンドしか有していないことがわかった 。これらの蛋白質を単離し、これらがモルモットからコルブリフォルミス毛様線 虫の駆除を促進させる能力を試験した。蛋白質の１つ、即ち４１ｋｌ）蛋白質と 称する蛋白質は腹腔内注射後にコルプリフォルミス毛様線虫感染に対する免疫を 誘発することが示された。

４１ｋＤＷ白質はコルブリフォルミス毛様線虫の第３期幼虫から精製し、アルミ ラリア・メリア（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｍｅｌｌｅａ）プロテアーゼで消化し 、そのペプチドフラグメントを分析し、そしてこれらペプチドの部分的アミノ酸 配列を決定した。ハイブリッド形成プローブに適するオリゴヌクンオチドシーケ ンスをＣ１計し、を含む組換え体細菌細胞を同定するために使用した。この遺伝 子のＤＮＡシーケンスを決定した。コルブリフォルミス毛様線虫の４１ｋＤ蛋白 質の成る部分を合成する組換え体生物を構築し、そしてこの細菌細胞から単離さ れた組換え体融合蛋白質は、モルモットにワクチン投与するために使用したとき 、コルプリフォルミス毛様線虫投与による感染の拒絶を加速させることが示され た。

ハイブリッド形成プローブとしてコルブリフォルミス毛様線虫の４１ｋＤ蛋白質 をコードするＤＮＡを使用して、若い成虫の捻転毛様線虫から抽出したｍＲＮＡ から構築されるｃＤＮＡライブラリー中の関連抗原をコードする遺伝子の存在を 同定した。この遺伝子から製造した蛋白質はフルプリフォルミス毛様線虫の４１ ｋＤ蛋白質に対して生じた抗血清によって認識される。

捻転毛様線虫のＤＮＡシーケンスをクローン化し、この蛋白質を発現するように 細菌を構築した。これらの細菌から精製した蛋白質はヒツジにワクチン投与する ために使用した。引き続いて、これらのヒツジに捻転毛様線虫を投与すると、動 物は寄生虫症からかなり防御されることが示された。更に、捻転毛様線虫の４１ ｋＤペプチドを発現する細菌から精製した蛋白質をモルモットのワクチン投与に 使用し、それに続いてコルブリフォルミス毛様線虫に感染させると、寄生虫症か ら顕著に防御されることが示された。これらの実験によって、コルブリフォルミ ス毛様線虫および捻転毛様線虫抗原をクローン化しそして発現させるために使用 する研究はまた、旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルス・ブルガリス、オステルタ ジア・オステルタ゛ジ、ブタ畑土、ライオン・トキサスカリス、扶頭鉤虫、イヌ 鉤虫、トリクルス・プルビス、イヌ糸状虫、トキソカラ種の幼虫、アメリカ鉤虫 、ズビニ鉤虫、回虫、ヒ）９２虫、ぎょう虫、糞線虫またはバンクロフト糸状虫 のような他の種の寄生性線虫に対するワクチンの提供にも通用可能であることが 示される。

最初の実施態様で、本発明は寄生性腺虫種由来で寄生性線虫種による宿主の感染 に対し感染防御免疫を与え得る蛋白質を提供し、その際該蛋白質はＳＤＳ　−Ｐ ＡＧＥで見積るとき４１ｋＤの概算分子量を有する。または本発明は寄生性線虫 による宿主感染に対し感染防御免疫を与え得る上記蛋白質の全部分、１部分、類 似体、相同体若しくはそれらを組合せたものを提供する。

好ましくは、上記寄生性線虫は旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルス・ブルガリス 、オステルタジア・オステルタジ、ブタ畑虫、旋毛虫、ライオン・トキサスカリ ス、狭頭鉤虫、イヌ鉤虫、トリクルス・プルビス、イヌ糸状虫、トキソカラ種の 幼虫、コルブリフォルミス毛様線虫、捻転毛様線虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫 、回虫、ヒト作土、ぎょう虫、糞線虫またはバンクロフト糸状虫である。

好ましくは、上記蛋白質はコルブリフォルミス毛様線虫または捻転毛様線虫から 誘導される。

本発明の特に好ましい蛋白質は、寄生性線虫による感染に対し感染防御免疫を与 え得る表３若しくは表８に示したアミノシーケンスを有する蛋白質またはその全 部分、１部分、類似体、相同体若しくは誘導体またはそれらを組み合せたもので ある。

もう１つの実施態様で、本発明は、病原性線虫による感染に対して免疫を提供し 得る蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体若しくはそれらを組み合 せたもののアミノ酸配列をコードする第のヌクレオチドシーケンス、上記第１の ヌクレオチドシーケンスとハイブリッドを形成しているヌクレオチドシーケンス または１塩基および多塩基置換、挿入並びに欠失を含む突然変異によって上記第 １のヌクレオチドに関連化したヌクレオチドシーケンスを提供する。

本発明の好ましいヌクレオチドシーケンスには表１．２．３．７および８に示し たアミノ酸配列をコードするヌクレオチドシーケンスがある。特に好ましい本発 明のＤＮＡシーケンスは表３．７および８に記載する。

本発明で好ましいシーケンスは４１ｋＤの抗原に相当するポリペプチドをコード するシーケンスである。本願発明に含まれるＤｌｌ・Ａシーケンスは、例えば、 コルブリフォルミス毛様線虫または捻転毛様線虫細胞から総ＤＮＡを抽出し、標 準技術で上記シーケンスを単離することによって製造される。または、ＤＮＡは ｍＲＮＡ鋳型の使用によるようなインビトロで合成的または生合成的に製造する ことができる。

更に、本発明による蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体若しくは それらを組み合せたものをコードするＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを選択する 方法も本願発明の範囲内であり、該方法は、１つ若しくはそれ以上のＤＮＡまた はＲＮＡシーケンスを提供し、該シーケンスの内のどれが上記活性を有するポリ ペプチドの全部分、１部分、Ｗ４Ｕ体、相同体、誘導体若しくはそれらを組み合 せたものをコードすることが知られているＤＩＪＡ若しくはＲＮＡシーケンスと ハイブリッド形成するのかを決定する、または上記蛋白質基しくはその１部分に 対する抗血清を提供し上記蛍白質を発現する宿主−ベクターの組み合せを同定す ることからなる。

上記シーケンスは天然起源由来であることができ、ＲＮＡシーケンス、合成シー ケンス、組換え体ＤＮＡ分子由来のＤＮＡシーケンスまたはこれらシーケンスの 組み合せであることができる。

本願発明の好ましい態様では、該蛋白質の少なくとも１部分をコードするＤＮＡ を同定し特性を決定するために使用する方法は、蛋白質を製造する細胞からｍＲ ＮＡ種の抽出、それらの二重鎖ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ　）への変換およびプラスミ ドのような自発的複製因子への２　ｎ　Ｎ　Ａの挿入に関わっている。次いで、 自発的複製因子を有する細菌株のような宿主細胞の形質転換、および他の全ての 細胞蛋白質成分に敵対する蛋白質をコードするＤＮＡを含有するクローンを検出 するためにｍＲＮＡまたはＤＮＡシーケンスをコードする蛋白質に相補的な合成 りＮＡプローブを用いて製造したライブラリーのスクリーニングが行われる。

もう１つの実施態様では、本発明は、本発明による蛋白質の全部分、１部分、ｉ （以体、相同体、誘導体若しくはそれらを組合せたもののアミノ酸シーケンスを コードする第１のＤＮＡシーケンスまたは該第１のシーケンスとハイブリッドを 形成しているＤＮＡシーケンス（その際上記シーケンスは天然、合成、生合成ま たは半合成起源を含む全ゆる起源由来のものであり、突然変異、１塩基若しくは 多塩基置換、欠失、挿入および逆位によって関連化したシーケンスが含まれそし て本願発明による蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体若しくはそ れらの組み合せをコードするシーケンスを含んでいる〕からなるＤＮＡ挿入物お よびベクターＤＮＡを特徴とする組換え体ＤＮＡ分子を提供する。本発明の好ま しい組換え体ＤＮＡ分子には上記ＤＮＡ挿入物に有効に結合した発現制御シーケ ンスが含まれる。本発明の１つの好ましい態様では、上記ＤＮＡ挿入物はイー・ コリ（大腸菌、Ｅ、ｃｏｌｉ）のβ−がラクトシダーゼ遺伝子に有効に結合して いる。他の好ましい制御系にはトリプトファンの制御系（Ｔｒｐオペロン）、バ クテリオファージラムダの左側プロモーター（ｐｔ）およびタック（ｔａ’ｃ） またはウィルス性プロモーター、例えばモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病ウィ ルスの長い末端反復のプロモーターのようなハイブリッドプロモーターがある。

本願発明の好ましい組換え体ＤＮＡ分子は上記したＤＮＡ挿入物を含有するプラ スミドである。適当なプラスミドヘクターにはプラスミドｐＬ］Ｒ２９０および ｐＵｃ１８並びにそれらの誘導体がある。本発明の好ましいプラスミドは以下で 詳細に記載するが、ｐＢＴＡ５９３．　ｐＢＴＡ５９７、　ｐＢＴＡ５９８．ｐ ＢＴＡ７０２およびｐＢＴＡ７０４が含まれる。

或いは、上記組換え体ＤＮＡ分子は、バクテリオファージラムダのような適当な バクテリオファージまたはそれらの誘導体のＤＮＡに結合した上記ＤＮＡ挿入物 からなることができる。

本発明は更に、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび本発明によるＤＮＡシー ケンスであるＤＮＡシーケンスからなる融合遺伝子も提供する。

また、組換え体ＤＮＡ分子の製造法も本願発明の範囲内に含まれ、該方法は本発 明によるＤＮＡシーケンスである第１のＤＮＡシーケンスからなるＤＮＡ挿入物 を提供しそして該ＤＮＡ挿入物をクローニングベクターに導入することからなる 。

好ましくは、上記ＤＮＡ挿入物は発現制御シーケンスと共に正しい空間位置で且 つ正しい読み取り枠でクローニング担体に導入される。

本願発明のもう１つの実施態様では、本願発明の少なくとも１つの組換え体ＤＮ Ａで形質転換され、そして本発明による蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同 体、誘導体若しくはそれらを組み合せたものまたは上記感染防御抗原に対して類 憤の免疫学的若しくは生物学的活性を有するポリペプチドを発現することのでき る宿主が提供される。適当な宿主には細菌細胞、酵母、他の真菌、を椎動物細胞 もしくは昆虫細胞、植物細胞、ヒト細胞、ヒト組繊細胞または全真核生物が含ま れる。適当な細菌宿主には大腸菌および他の小腸生物、シュードモナス並びにバ シラス種がある。好ましい宿主培養株は大腸菌に１２誘導体、特にＪＭ１０９お よびＹ１０９０であると確認されている。

本発明による特に好ましい形質転換株はＢＴＡ１６２１．　ＢＴＡ１６３７゜Ｂ ＴＡ１６３８およびＢＴＡ１６８４と命名した大腸菌に一１２株であり、それぞ れｐＢＴＡ５９３．　ｐＢＴＡ５９７．　ｐＢＴＡ５９ＢおよびｐＢＴＡ７０２ で形質転換されており、それらは米国２０８５２メリーランド州ロツクビル、パ ークローンドライブ１２３０１所在のアメリカンタイプカルチャーコレクション （ＡＴＣＣ）に前３者は１９８７年６月１７日にそしてＢＴＡ１６８４に関して は１９８８年６月２８日に寄託され、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ６７４３８、Ａ ＴＣＣ６７４３９，ＡＴＣＣ６７４４０およびＡＴＣＣ６７７３８で受理されて いる。

宿主を提供しそして該宿主に本願発明の組換え体ＤＮＡ分子を正しい読み取り伜 で導入することからなる宿主形質転換方法も本願発明の範囲内に含まれる。

本発明は更に本願発明の形質転換した宿主の発現生成物を提供し、その際該生成 物は本発明による蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体またはそれ らを組み合せたものからなっている。好ましくは、発現生成物は実質的に純粋で 提供される。

本願発明の好ましい実施態様では、発現生成物は宿主と相同性の第１のポリペプ チドシーケンスおよび本発明による蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、 誘導体またはそれらを組み合せをコードするアミノ酸シーケンスである第２のポ リペプチドシーケンスからなる。

本願発明の好ましい実施態様では、第１のアミノ酸シーケンスはβ−ガラクトシ ダーゼの１部または全部分であり、宿主細胞は大腸菌である。

本発明の更に好ましい実施態様では、第１のシーケンスは発現生成物のＮＨｚ− 末端シーケンスである。

本願発明のもう１つの実施態様では、本発明による蛋白質の全部分、１部分、類 似体、相同体、誘導体またはそれらを組み合せたものからなるポリペプチドの生 合成の方法が提供され、該方法は： 宿主が本発明による蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体またはそ れらを組み合せたものからなるポリペプチドを有する蛋白性生成物を発現できる ように本願発明の組換え体ＤＮＡ分子で宿主を形質転換し；上記発現を得るため に上記宿主を培養し；そして上記ポリペプチドを採集する、ことからなる。

もう１つの実施態様では、本発明は製薬的に受容可能な担体または希釈剤と共に 本発明の１つ若しくはそれ以上の発現生成物または蛋白質からなるワクチンを提 供する。好ましいワタチンには経口投与または注射可能な形態に適するものが含 まれ、好ましくは製薬的に受容可能なアジュバントが含まれる。

もう１つの態様では、本発明は、本発明の１つ若しくはそれ以上の発現生成物、 蛋白質またはワクチンを投与して宿主に免疫学的に抗原投与した結果製造される 抗体調製物を含む。このような抗体調製物にはポリクローナルおよびモノクロー ナル抗体調製物が含まれる。

本発明はまたその範囲内に、怒染防御免疫応答の原因となる蛋白質の１つのエピ トープまたは複数のエピトープも含まれる。

これらのエピトープは、細菌中で製造される蛋白質のフラグメントでの免疫化学 試験の結果から予測できる蛋白質の１部のシーケンスを有するオリゴペプチドの 合成製造によって人工的に創り出すかまたは天然若しくは組換え体ペプチドの化 学的若しくは酵素的開裂の結果生じさせることができる。

本発明はまた、上記エピトープに対して生じた抗体および上記第１の抗体の可変 領域に対して生じた抗体、即ち所謂イディオタイプ抗体にも関し、その際それら 抗体は蛋白質の保護エピトープによく僚ており、動物の受動的防御（イディオタ イプ）かまたは動物の能動的免疫化（抗イデイオタイプ）かのいずれかにおける 有効なワクチンとして使用することが出来るので、有効な怒染防御が得られる。

図面の簡単な説明 図１は、コルブリフォルミス毛様線虫の第３期幼虫のＰＢＳおよびＰＢＳ　−Ｄ ＯＣ抽出物のＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析を示す。

図２は、コルブリフォルミス毛様線虫から得た残渣のＰＢＳ抽出物（ａ）および ＰＢＳ　−ＤＯＣ抽出物（第３期幼虫（ロ）、第４期幼虫（Ｃ）および成虫（ｄ ）の免疫プロントを示す。

図３は、コルブリフォルミス毛様線虫の４］ｋＤ蛋白質β−ガラクトシターゼ融 合蛋白質を発現する細菌から得た蛋白質のＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析および免疫プ ロットを示す。

木　日　する　の　？上 以下の実施例を参照して本発明を更に記載する。以下に記載した方法に類似する 他の方法論は当該技術分野の熟練者には明白であり、それらは記載された本発明 の範囲内であることを了解すべきである。

尖隻■上 揺±生ｑｍ製 寄生まヱ桓肢止−コルブリフォルミス毛様線虫の第３期幼虫はヒツジの糞を培養 しペアマナイジング（Ｂｅａｒｍａｎｉｚｉｎｇ）　Ｌ　”’ｉ：　４’４−ら れた。これらはリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ　（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、 １５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７，４）中４°Ｃで保持した。

コルブ夏フタルミス　Ｌ−線ＪＬＱ］ム迂−コルブリフォルミス毛様線虫の第３ 期幼虫２．０〜２．５ｇ　（遠沈重量）を各回２．ＯｄのＰＢＳプラス３．５− の水を用いて４回抽出した。最初の抽出で使用した緩衝液は、更に１ｍＭのフェ ニルメチルスルホニルフルオライド、０．２ｍＭのｐ〜クロロマーキュリ−ベン ゾエート、５１ＩＩＭのエチレンジアミン四酢酸塩（εＤＴＡ　）を含存しでい たが、４回目の抽出で使用した緩衝液はデオキシリボヌクレアーゼ（１ｇｇ／ｒ ｎｆｌ）を含有していた。これらの抽出に続いて、１％のデオキシコール酸ナト リウム含有ＰＢＳ　（ＰＢＳ　−ＤＯＣ）および１ｇｇ／ｍｉのデオキシリボヌ クレアーゼを用いて２回抽出した。抽出はモーター作動性すりガラス製のボッタ ー・エルベージエム（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｊｈｅｎ）ホモジナイザーを使用 して実施した。ＰＢＳ　−ＤＯＣ抽出抽出法料は更に、約６０ワツトのミュラー ド（Ｍｕｌｌａｒｄ）の超音波壊変器７６８５／２型を用いて、水中で、１分間 隔で３回処理した。ゲル電気泳動（０’　Ｄｏｎｎｅｌｌ等、１９８５年）用に は、各遠心抽出物２０μｎを乾燥し、次いで１５μでの試料緩衝液と共に１００ °Ｃで３分間加熱した（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０年）　。ＰＢＳ−ＤＯＣ抽 出物は使用前に１００，０００ｇで１時間遠心し、そのペレットは廃棄した。

図１はフルプリフォルミス毛様線虫の第３期幼虫を連続的にＰＢＳで抽出しつい でＰＢＳ　−ＤＯＣで抽出したもののＳＯＳ　−ＰＡＧＥパターンを示す。ＰＢ Ｓ　−ＤＯＣ抽出物中ムこは４つの主要な蛋白質バンドがあり、それらはそれぞ れ２００ｋｌ）、　９３ｋＤ、　４３ｋＤおよび４１ｋＤと称する。超音波壊変 器を使用した場合には、４１ｋＤおよび４３ｋＤ蛋白質のバンドは１％のＤＣＩ Ｃを含有しないＰＢＳを使用じて抽出することができたが、９３ｋＤおよび２０ ０ｋＤは効率的には抽出できなかった。

ＰＢＳ　−ＤＯＣ抽出物中の蛋白質バンドの数が限られているのはＰＢＳ抽出で 多数であるのと対照をなしている。　４１ｋＤおよび４３ｋＤ蛋白質は、超音波 壊変器を使用しないで、ＰＢＳ−１％ＤＯＣで効率的に抽出できたがＰＢＳ−０ ，１％ＤＯＣではそうではなかった。超音波壊変器は蛋白質の収量をかなり増加 させた。デオキシリボヌクレアーゼ処理を実施しなかった場合、超音波壊変器を 使用した後でさえ、ＰＢＳ　−ＤＯＣ抽出物はＤ！ＪＡの存在によって非常に粘 性であった。

実隻拠Ｉ 蛋良亘公折 ＰＢＳ　−ＤＯＣの二゛−へ百 ルビン（Ｒｕｂｉｎ　）およびレオナレイ（Ｌｅｏｎａｒａｉ）　（１９８３年 ）の方法は、−次元では３謙のディスクゲルおよび１．５ｍ＋ｎ厚さのレムリ（ Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　）ゲルでそして二次元では１０％のポリアクリルアミドを含 有するもので、等電点電気泳動用のバイオライト（Ｂｉｏｌｙｔｅｓ）　（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ社）を使用して行った。蛋白質は冷塩化カリウムで視覚化し、４１ｋ Ｄ蛋白質は記載されているようにして電気的に溶出し、冷メタノールで沈殿させ た（Ｓｔｅａｒｎｅ等、　１９８５年）。

この物質はワクチン投与試験およびエンドプロティナーゼ消化用に使用した。

一次元または二次元ゲルからニトロセルロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）への電気泳 動的移送は標準法で実施した。次いでニトロセルロースをホーエ（Ｈｏｗｅ）お よびヘルシエイ（Ｈｅｒｓｈｅｙ）　（１９８１年）の方法によって種々の抗血 清を用いて処理して精査した。コンプレックスは最終的には、結合抗体とヤギ抗 −ウサギＴｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に抱合した西洋ワサビペルオキシダーゼと の反応、次いで４−クロロ−１−ナフトールおよびＨ２０□との反応によって視 覚化した。

４１ｋＤ蛋白質で免疫化したウサギから得た抗血清によって、４１ｋＤ蛋白質は 第３および第４幼虫期並びに成虫に存在することが免疫プロットで示される（図 ２Ｄ）。炭水化物の存在は、酸加水分解物中のグルコサミンまたはガラクトサミ ンの存在を分析しそしてラフセン（Ｒａｃｕｓｅｎ）　（１９７９年）の方法を 使用してゲルを染色することによって、電気的溶出後のＰＢＳ　−ＤＯＣ抽出物 の各成分で推定した。４１ｋＤ蛋白質中には検出可能な炭水化物は分析では示さ れなかった。

精製した４１ｋＤ蛋白質をオツドネル（０’　Ｄｏｎｎｅｌｌ）　（１９７３年 ）が記載した方法に従って８Ｍの尿素中ｐＨ１０，５で還元し、カルボキシメチ ル化した。次いで、該蛋白質は５０Ｉｌ１Ｍの炭酸水素アンモニウム中、ｐＨ約 ８．０．３７°Ｃで１６時間、アルミシリア・メリアプロテアーゼを用いて、１ ：５０の酵素：蛋白質比率で消化した。次いで反応混合物はサバント・スピード ・バク・コンセントレータ−（Ｓａｖａｎｔ　５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ　Ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａｔｏｒ）で濃縮した。

４１ｋＤのプロテアーゼ消化で得られたオリゴペプチドは、バイダック（Ｖｙｄ ａ’ｃ）　ＣＩｓカラム並びにそれぞれ０．１％のトリフロロ酢酸および７０％ アセトニトリル中０．１％トリフロロ酢酸からなる初期および最終緩衝液を用い てＨＰＬＣで分離した。

ＨＰＬＣで単離されたペプチドは、マツタケルン（ＭｃＫｅｒｎ）等（１９８５ 年）の方法を使用して手操作で配列を決定するかまたはガス相シーケンサ−を使 用して自動的に配列を決定した。ＰＴ）ｌ　（フェニルチオヒダントイン）アミ ノ酸はＨＰＬＣで同定した。

還元しそしてカルボキシメチル化した４１ｋＤのアルミラリア・メリアプロテア ーゼ消化で得たＨＰＬＣ−単離ペプチドのアミノ酸配列の幾つかを表１に示す。

表−」− コルブリフォルミス４１ｋＤ蛋白質のアルミシリア・メリアプロテアーゼによる 消化後に生じたポリペプチドから得られた幾つかのアミノ酸配列 １、ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＭＥＴ　ＧＬＬＩ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＡＥＲＰＨＥ　ＧＬ Ｎ　ＡＳＰ　ＧＬｔｌ　ＧＬＵ　ＡＲＧ２、ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＭＥＴ　ＧＬＮ　 Ｔ）ＩＲＧＩ　ＡＳＮ　ＡＳＰ　ＬＥＤ３、　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＪＬＥ　ＳＥＲ ＧＬＬＩ　ＧＬＵ　ＬＥＩＩ　ＡＳＰ　ＳＥＲＡＲＧ　ＰＨＥ　ＧＩＪ　ＧＬｔ ｌ　ＬＥＩＩ４、ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　ＡＲＧ　ＬＥＬＩ　ＧＬＩ Ｉ　ＡＳＰ　ＧＬＵ　ＬＥＬＩ　ＶＡＬ　ＨＩＳ５、ＬＹＳ　ＴＹＲＡＳＰ　Ｇ ＬＵＶＡＬ　ＡＬＡ　ＡＲＧ６、ＬＹＳ　ＳＥＲＬＥＵ　ＧＬＩＩ　ＶＡＬ　Ｓ ＥＲＧＬＵ　ＧＬＩＩ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＬＥＩＩ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＧＬＬＩ ７、ＬＹＳ　ＬＥＤ　ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＶＡＬガス相シーケンサ−では非消化４ １ｋＤ蛋白質の末゛端基は見い出すことができなかった。それ故、末端基はプロ ・ツクされていると考えなければならない。

皇族旦主 コルプ：フォルミス１　の４１ｋＤ”　に　するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンの５　 および　′；２ Ｔ、ｃＤＮＡライブラリーの構築 メツセンジャーＲＮＡは、コルブリフォルミス毛様線虫の第４期幼虫を６Ｍの塩 酸グアニジン、０．２１の酢酸ナトリウムおよび５０ｍＭのβ−メルカプトエタ ノールを含有する緩衝液中で摩砕し、次いでエタノールで沈殿させ、オリゴ（ｔ ｌＴ）−セルロースカラム上で分画して上記幼虫から単離した。このｎ＋ＲＮＡ は、アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｎｌ）リボヌクレアーゼＨ／ＤＮＡポリメラ ーゼＩキット　（＾ｍｅｒｓｈａａ＋　ｃＤＮＡ合成システム、＃ＲＰＮ、１２ ５６）を製造者が推奨するように使用して二重鎖ｃＤＮＡの合成用鋳型として使 用した。　ＥｃｏＲＩリンカ−の添加後、二重鎖ｃＤＮＡをラムダｇｔｌｌと連 結し、Ｙ１０９０細胞を感染させるのに使用した生存バクテリオファージ中に、 本質的にはヒューン（）ｌｕｙｎｈ）等（１９８５年）が記載したようにして組 み入れた。上記方法を使用して、ｃＤＮＡライブラリーは２Ｘ１０’個の独立組 換え体からなっていることが確立された。このライブラリーを増幅し、そして分 別物のワラス（Ｗａｌｌａｃｅ）等（１９８５年）並びにベントン（Ｂｅｎｔｏ ｎ）およびディビス（Ｄａｖｉｓ）　（１９７７年）が記載したようにして合成 オリゴヌクレオチドプローブおよび二重フィルターリフトを使用してスクリーニ ングした。

■、ハイブリッド形成プローブ ライブラリーのスクリーニングに使用した２３−　ｌｌ１ｅｒオリゴヌクレオチ ドシーケンスは４１ｋＤ蛋白質のアミノ酸シーケンス２（表１）から得られたペ プチドシーケンスに基づいていた。

ペプチド　ＬＹＳ、？ＩＥＴ、ＭＥＴ、ＧＬＮ、Ｔ）ｌＲ，ＧＬｌｊ、ＡＳＮ、 ＡＳＰ。

逆補体シーケンスを合成してスクリーニングに使用した。

（スレオニンコドンに使用したコドンはシー・エレガンス（Ｃ，ｅｌｅｇａｎｓ ）の好ましいコドン使用に基づいている：　Ｍａｒｕｙａｍａ等、１９８６年） 。

約２Ｘ１０５個の組換え体バクテリオファージをスクリーニングし、４８個の陽 性物を検出した。

ＩＩｌ、ＤＮＡシーケンス決定 選択したクローンの１つ、即ちラムダｇｔｌ　１−４−４１−６は、ＥｃｏＲＩ で切除できそして同じ酵素で消化されたＭ１３ｍｐＨ中にサブクローン化できる ７ｏｏｂｐ挿入物を含んでいた。サブクローン化した挿入物のＤＮＡシーケンス はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等（１９８０年）の方法を使用して決定した（表２ ）。

得られたシーケンスを蛋白質データバンクのシーケンスと比較すると、４１ｋＤ 蛋白質は種々の生物から得たトロボミオシンのアミノ酸シーケンスと相同である （例えばウサギとの相同製は約７０％であった）ことが示される。

表−１ クローンＢＴＡ１６２１中のプラスミドｐＢＴＡ５９３に含まれるＥｃｏＲＩ　 ｃＤＮＡフラグメントのＤＮＡシーケンスおよびコルブリフォルミス毛様線虫の ４１ｋＤ蛋白質の１部分をコードしている翻訳されたアミノ１３０　１４０’　 １５０　１６０ ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧｊｌＡ　ＧＣＣＣＡＧ　ＡＴＧ　 ＣＴＴ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＥＡ［１ＬｋＥＡＱ　ｌ′１ＬＡＥＥ ＡＥＡＤＬＥＲＡＥＥＲＡＥＡＧ ５９０　６００　．６１０　６２０　６３０ＳＳＲＬＫＥＡＥＴＲＡ ７００ｂｐ挿入物はｃＤＮＡライブラリーを更にスクリーニングするために使用 し、コルプリフォルミス毛様線虫の４１ｋＤ遺伝子のコード領域および非コード 領域をより多く含むクローンを単離した。これらクローンのＤＮＡシーケンスを 決定し、４１ｋＤ遺伝子のＤＮＡシーケンスおよび翻訳されたアミノ酸シーケン スを表３にコルブリフォルミス毛様線虫のシーケンス（４１ｋＤ抗原）Ｍｅｔ　 Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｈａ　 ｌ’ｌｅｔ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ＧｌｕＡＡＧ　ＧＡＣＡＡＴ　ＧＣＴ　ＣＴＣＧ ＡＴ　ＣＧＡ　ＧＣＣＧＡＴ　ＧＣＣＧＣＣＧへへＧＡＧ　ＡＡＡＬｙｓ　Ａｓ ｐ　Ａｓｎ　Ａｈａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｈ ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＬｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ 　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＡｓｐＬｅｕ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＧｉｎＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＡｒ ｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｉ ｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＡＣＣ ＧＡ　ＡＡＡ　ＴＡＣＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＧＣＣＣＧＴ　ＡＡＡＡｌａ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｏ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＬｙｓＬｅｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｈ ａ　Ｌｓｐ　Ｇｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＧｌｕ 　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ 　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｉｎＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ ６　−ガラクトシダーゼとの　え５人　′としての■杜！血ｉ■製遺 ＴＶ、　７００ｂｐの４１ｋＤｃＤＮＡフラグメントのｐｔｌＲ２９０へのサブ クローン化 Ａ、　フラグメントの２周製 ＤＮＡはマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等（１９８２年）に従ってクローンラ ムダｇｔＬ４／４１／６から製造した。ＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲＴで切断して ７００ｂｐの挿入物を放出させ、次いでこの挿入物は引き続きサブクローン化す るために精製した。精製は次のようにして実施した：　ＥｃｏＲＩ−切断ＤＮＡ はアガロースゲルでの電気泳動によって分離し、次いで７ｏｏｂｐのフラグメン トを製造者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）の指示に従ってＮＡ ４５紙に集めそして溶出した。次いで７００ｂｐのＤＮＡをイソプロパツールで 沈殿させ、そしてＴＥ（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７，５１ｍＨのＥＤＴＡ　）に 再溶解した。

Ｂ、ｐＬＩＲ２９０へのクローン化： 発現ベクターｐＵＲ２９０［Ｒｕｔｈｅｒおよび？ｌｕ］１ｅｒ−Ｈｉ１１．１ ９８３年〕は、異なるシーケンスを挿入できる３′末端近くに多数の制限酵素部 位を有する細菌性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するプラスミドである。精 製した７ｏｏｂｐのｃＤＮＡフラグメントは、マニアチス等（１９８２年）が記 載した方法を使用してＥｃｏＲＴ消化ｐＬＩＲ２９０と結合させた。同時に、Ｅ 　ｃ　ｏ　ＲＩ　Ｉ］限酵素部位でのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の読み取り枠 は４１ｋＤの７００ｂｐｃＤＮＡフラグメントのフレームを有する和尚にある。

■、融合蛋白質を製造するｐＵＲクローンの検出４１ｋＤ抗原を発現するｐＵＲ クローンは、精製した４１ｋＤ蛋白質でワクチン投与したウサギから得た血清を 使用して確認した。

コロニーは、アンピシリンおよびＩＰＴＧを含有する寒天上で増殖させ、コロニ ーのレプリカはニトロセルロース上で製造した。４１ｋＤ抗原を発現するコロニ ーは標準的免疫学的スクリーニング法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２年））に 従って確認し、抗血清−ベルオキシダーゼで精査した。多数の陽性コロニーを取 り出し、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで分析するため液体培養基で増殖させた（図３）。

■、　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる融合蛋白質の大きさＢＴＡ１６２１株が製造した 組換え体β−ガラクトシダーゼ／４１ｋＤ蛋白質（これはプラスミドｐＢＴＡ５ ９３を有している）は約１４０ｋＤの分子量であり、その内約２７ｋＤはコルブ リフォルミス毛様線虫起源である。融合していないβ−ガラクトシダーゼは約１ ２０ｋＤの分子量である（図３）。

■、液体培地＋Ｉ　ＰＴＧ中でのＢＴＡ１６２１の増殖ｐｔｌＲ２９０の細菌性 β−ガラクトシダーゼ遺伝子の３′末端に、フレーム内に相された４１ｋＤｃＤ ＮＡフラグメントを含有する組換え体クローンＢＴＡ１６２１　（プラスミドｐ ＢＴＡ５９３）は、ＬＢ細菌培地十アンピシリン＋ＩＰＴＧ中、２１°Ｃで一夜 増殖させた〔Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２年）〕。次いで細菌を採集し、蛋白 質を精製するために更に処理した。

■、動物試験のため融合蛋白質の精製 β−ガラクトシダーゼ／４１ｋＤ融合蛋白質を精製するために、クローンＢＴＡ １６２１を５αＯｄのＬＢ＋アンピシリン（５０μｇ７ａｆｔ）＋ＩＰＴＧ（１ μｇ／ｍｆｆ）中、２０°Ｃで増殖させた。細菌は遠心して集め、リゾチームで 処理（トリスＥＤＴＡ緩衝液中５００μｇｏｄ、４°Ｃで５分）し、そしてＮ　 Ｐ　４０をＶ／ν％になるまで加えて細胞を溶解させた。デオキシリボヌクレア ーゼを加えて１００μｇ／−とし、ｎｇｃｔ２を加えて５０ｍＭとし、その溶解 物は４℃で１夜インキユベートした。次いで、該溶解物はベックマンＪＡ２０ロ ーター中１０’、　０００ｒｐｍで１０分間遠心した。融合蛋白質の大部分を含 有するペレットは、５０ｗ１Ｆ′Ｉのトリス−Ｈ（Ｊ（ｐＨ８）、１００ｍＭの ＮａＣ１中８Ｍの尿素／１％のβ−メルカプトエタノールに溶解し、次いでスー パロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　６カラム（１、６ｃｍ　Ｘ　８０ｃｍ　）でク ロマトグラフィーにかけた。ＳＤＳ　−ＰＡＧＥを使用して、融合蛋白質を含有 するフラクションを確認してから集めた。ウェスターン法［Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ， 等〕によってウサギ抗４１ｋＤ抗体と精製蛋白質との間の陽性反応が示される（ 図３参照）。

裏隻拠土 実験動物は以前に記載された（０’　Ｄｏｎｎｅｌｌ等、１９８５年）ようにし て選択した。

４１ｋＤはコルブリフォルミス毛様線虫の第３期幼虫のＰＢＳ　−ＤＯＣ抽出物 から精製し、二次元ＳＤＳ　−ＰＡＧＥで分離し、そして電気的溶出をした。こ の物質をモルモットの腹腔内にワクチン投与するために使用した（０’　Ｄｏｎ ｎｅｌｌ等、１９８５年）。精製した４１ｋＤフラクシヨンが、ワクチン投与後 のモルモットでのコルブリフォルミス投与による感染に対して実質的な感染防ｔ ｌ（４３〜５１％の範囲）を示したことが見られる（表４）。

裏−土 コルブリフォルミス毛様線虫から得た精製４１ｋＤ蛋白質によるモルモットのワ クチン投与 動物には全て、第３３１Ｊｌの幼虫から単離したコルブリフォルミス毛様線虫４ １ｋＤ蛋白質を腹腔内に注射した。動物には、２８日後に２，０００匹の感染性 幼虫を投与し、投与１３日後に層殺して寄生虫数を調べた。

レムリゲルから溶出したとき、４１ｋＤの免疫原性フラクションは４３〜５１％ の感染防御を示した。非変性手段で製造すると、感染防御は一層有効であろうと 期待することは合理的である。

この４１ｋＤフラクシヨンは、５Ｏ５−ＰＡＧＥ後に電気的に溶出した物質に対 するウサギ抗血清での免疫プロット法によって示されるように、幼虫および成虫 期の全てに存在している（図２）。

しかし乍ら、４１ｋＤ蛋白質に対する抗体（ＩｇＡ、　ＩｇＧまたはＩｇＭ）は 自然感染した数匹のモルモットおよびヒツジから得た血清中でも、コルブリフォ ルミス毛様線虫で感染させたヒツジから得た腸間膜リンパ液中でも検出できなか った（免疫プロット技術によって研究した）。

４１ｋＤ１人　の＝とじての 表５に示すように、ＢＴＡ１６２１から精製した組換え体４１ｋＤ融合蛋白質を 腹腔内注射すると、コルブリフォルミス幼虫から抽出した最初の４１ｋＤ蛋白質 によって達成されたのと同様の感染防御が得られた。

表−ｉ クローンＢＴＡ１６２１由来の４１ｋＤ＝融合蛋白質によるモルモットのワクチ ン投与 （寄生虫数） 対　照　ワクチン投与　感染防御％ 平均　１１３５±［２６３）　（ｎ＝１２）　４１６±［２２０）　（ｎ＝３） 　６３％Ｔ−検定の存意性＜０．００１ 動物は、モルモット当たり４５０μｇの融合蛋白質でワクチン投与し、２１日後 に２．０００匹の感染性コルブリフォルミス毛様線虫を投与した。動物は投与１ ３日後に層殺して寄生虫数を調べた。

災施五ｉ ポリアデニル化したｍＲＮＡは若い成虫捻転毛様線虫から抽出し、ｃＤＮＡライ ブラリーは、本質的に国際特許出１ｔＪ［Ｎｏ、ＰｃＴ／ＡＬｉ８７１００４０ １に記載したような方法を使用してラムダｇｔｌｌで構築した。

概ね３Ｘ１０’個の組換え体バクテリオファージを、コルブリフォルミス毛様線 虫４１ｋＤ蛋白質をコードするクローンから単離したＩＩＮＡフラグメントを用 いてスクリーニングした。ニトロセルロースフィルター２枚は１９８２年マニア チスが記載したようにして言周製した。プローブ ォーゲルスタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　（１９８４年）の方法に従って標 識した。使用したハイブリッド形成条件はリード（Ｒｅｅｄ）が記載したのと同 じであった。４個の陽性クローンを検出し、精製した。

単離したクローンの１つ、即ち４１八は約１．３８ｋｂの捻転毛様線虫ｃＤＮＡ を含んでおり、内部ＥｃｏＲ１部位を有していた。クローンから単離したＤＮＡ をＥｃｏＲＩで消化して、約９００および４８０ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを 製造した。

ＤＮＡはクローン八から調製しくｔｌａｎｉａｔｉｓ．１９８２年）、部分消化 または完全消化を生じさせる条件下でＥｃｏＲＩを用いて消化した。このＤＮＡ をアガロースゲルで電気泳動し、４８０ｂｐ．　９００ｂｐおよび１　、　３８ ｋｂのフラグメントをＮ　Ａ　４　５紙（ＳｃｈｌｅｉｄｅｒおよびＳｃｈｕｅ ｌ］）を用いて単離した。４８０および９００ｂｐのフラグメントはｐｌｊｌ’ ！２９０の誘導体で、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の外側のＥｃｏＲ］部位が除 去されているベクターｐＢＴＡ２２４中にサブクローン化した（Ｒｕｔｈｅｒお よびＭｉｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ．　１９８２年）　、　】、３ａｋｂの部分消化フ ラグメントは、ｐＵｃ１８の誘導体であるｐＢＴＡ５０２にサブクローン化した （Ｙａｍｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，　ＶｉｅｉｒａおよびＭａｓｓｉｎｇ　（１ ９８５年））。

３個のクローンを単離した。これらを以下に記載する：クローンＢＴＡ１６３７ は、ｐＢＴＡ２２４中の４８０ｂｐフラグメントであるプラスミドｐＢＴＡ５９ ７を含んでいる：クローンＢＴＡ１６３８はｐＢＴＡ２２４中の９００ｂｐフラ グメントであるプラスミドｐＢＴＡ５９８を含んでいる：クローンＢＴＡ１６８ ４はプラスミドｐＢＴＡ５０２中の１．３８ｋｂの部分消化フラグメントである プラスミドｐＢＴＡ７０２を含んでいる（全ての場合において、宿主株はＪ旧０ ９である）。

ｐＢＴＡ７０２に含まれる１．３８ｋｂフラグメントの一連の欠失は、ＤＮＡ試 料をＢａｍ旧およびＰｓｔｌで消化し、次いで直線化したＤＮＡをエコヌクレア ーゼ■およびマングビーン（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼで種々の期間消 化して、その反応生成物を再結合して作成した。

次いで、ＤＮＡｆｃＪＭ１０９中に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを釣 り上げた。これらプラスミドの特徴を決定し、これら形質転換体の選択に際して の挿入物のＤｔ４Ａシーケンスはハソトリ（Ｈａｔｔｏｒｉ　）およびサカキ（ Ｓａｋａｋｉ）　（１９８６年）が修正したサンガー等の方法を使用して決定し た。ｐＢＴＡ７０２のｃＤＮＡ断片の完全なシーケンス（表６）は、クローン化 したコルブリフォルミス毛様線虫遺伝子と非常によく相同じでいることがわかる 。

ＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧ　ＡＡＴＣＧＣＣＧＣＡ　ＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴ　ＴＧＡ ＧＧＡＧＧＡＴ　ＴＴＧＧＡＡＣＧＴＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＧ　ＡＧＧＣＴＧＡ ＡＣＧ　ＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡ　ＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡ　ＡＴＣＧＴＧ丁ＣＧＡ ＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧ　ＧＡＴＣＧＴＴＧＴＧ　ＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡ　ＡＡＣ ＧＡＡＡＣＴＡ　ＣＧＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣ丁ＴＣＴ　ＧＣＡＴＧＡＡ ＡＣＡ　ＧＡＧＡＧＴＡＡＧＡ　ＧＣＧＡＡＧＡＧＧＴ　ＣＧＣＣＣＧＴＡＡＧ ＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧ　ＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡ　ＴＣＴＣＧＡＡＡＧＡ　ＧＣＣ ＧへＡＧＡＡＣ　ＧＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＧＡＧＡＡＣ　ＡＡＧＡＴＣＧ ＴＣＧ　ＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡ　ＧＧＡＡＣＴＴＣＧＴ　ＧＴＣＧＴＣＧＧＡＡ ＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡ　ＧＲＣＡＣＴＴＧＡＧ　ＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧ　ＡＡＡ ＡＧＧＣＣＣＴ　ＴＣＡＡＣＧＴＧＡＡＧＡＣＴＣＡＴＡＣＧ　ＡＧＧＡへＣＡ ＧＡＴ　ＴＣＧＴＡＣＴＡＴＣ　ＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣ　ＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣ ＡＡＧＴＣＧＡＣＡＧ　ＡＣＴＧＧＡＧＧＡＴ　ＧＡＡＴＴＧＧＴＡＣ　ＡＴＧ ＡＧＡＡＧＧＡ　ＧＡＧＡＴＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＴＴＣＣＧ　ＡＧＧＡＧＣＴ ＴＧＡ　ＣＴＣＧＡＣＣＴＴＣ　ＣＡＡＧＡＡＣＴＧＴ　ＣＣＧＧＣＴＡＴＴＧ このＤＮＡシーケンスから、３４４個のアミノ■を含有する蛋白質をコードする １０３２塩基対の読み取り枠を同定することができる（表６）。コルブリフォル ミス抗原のアルミラリア・ミレア消化により生じたペプチドフラグメントの幾つ かに相当するアミノ■シーケンスは捻転毛様線虫のクローン化したシーケンス（ 表７の下線部）で同定することができる。捻転毛様線虫クローンとコルブリフォ ルミス毛様線虫クローンとの間では１３０番目から３４４番目までのアミノ酸領 域でそのＤＮＡシーケンス相同性が高い。しかし乍ら、Ｉ〈−末端の１３０個の アミノ酸はこのような相同性を有していない。このＤＮＡシーケンスを更に分析 すると、捻転毛様線虫シーケンスのＮ−末端断片はβ−ガラクトシダーゼの１０ 個のアミノ酸、次に関連性のない７７個のアミノ酸および推定上の開始コドンか ら伸びている４３個のアミノ酸の断片をコードするＤＮＡに由来することがしめ される。該ＤＮＡは偶発的に相中に入り、３４４アミノ酸に連続する読み取り枠 を生じさせる。

この提案は、捻転毛様線虫抗原の開始コドンと推定されるＡＴＧが、を椎動物遺 伝子のシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）の配列のコンセ ンサスシーケンスとａｇｃＣＡｃＣに関して密接に類似しているシーケンスＴＧ ＣＣＡＴＣによって先行されていることによって支持される。

、表−ｊ− ＢＴＡ１６８４株によって製造された融合蛋白質のシーケンスワクチン接種−試 験用に天然の捻転毛様線虫抗原類僚を製造するために、関連性のないＮ−末端ア ミノ酸８７残基を欠失する組換え体止物を構築した。ｐＢＴＡ７０２由来のＤＮ Ａは、制限酵素Ｓｍａ　ＩおよびＡｓｕ　ＩＩを組み合せたもので消化しそして ３５１４ｂｐおよび５１３ｂｐのフラグメントを精製した。次いで、５１３ｂｐ フラグメントはＤｄｅ　Ｉで消化して、２３８ｂｐのフラグメントを精製した。

次いで、この２３８ｂｐフラグメントを上記３５１４ｂｐフラグメントに連結さ せ、非−付着炎をＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ（Ｈｅｎｏｗ）フラグメント で処理してプラント末端とし、その後ＤＮＡを連結して環状を形成させて大腸菌 株ＪＭ１０９を形質転換するために使用した。

アンピシリン耐性コロニーを選び出し、プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＤＮ Ａシーケンスを制限酵素分析によって確認した。

プラスミドｐＢＴＡ７０４　（８７１１６８６株）中のＤＮＡは、成熟捻転毛様 線虫抗原よりアミノ酸が４個しか短くない２５２個のアミノ酸（表８）の分子を コードしている。Ｎ−末端での６個のアミノ酸はβ−ガラクトシダーゼに由来し 、開始メチオニンはβ−ガラクトシＢＴＡ１６８６株によって製造された融合蛋 白質のシーケンス実１１吐ｉ Ｑえ　による念Ｆ−５ハの　１ 組換え体大腸菌株ＢＴＡ１６３７．　ＢＴＡ１６３８．　ＢＴＡ１６８４および ＢＴＡ１６８６を光学密度（ＯＤ）が概ね１になるまでアンピシリン（５０μｓ ／ｍ）含有ＴＳＢ中で増殖させた。次いで、イソプロビルチオカ゛ラクトピラノ シド（ＩＰＴＧ）を加えて最終濃度を１０ｍＭとし、更に８〜１６時間インキュ ベーションを継続した。細胞は遠心して集め、音波処理によって溶解させ、そし てこの音波処理物を１３，０ＯＯＸ　ｇで１０分間遠心した。ペレットおよび上 澄液をＳＤＳ　−ＰＡＧＥ分析（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０年）およびコルブ リフォルミス毛欅線虫４１ｋＤ土元原に対してウサギで生じた抗血清を使用して 免疫フ゛口・ノド）去るこ付した。免疫複合体は＋２５１−蛋白質ＡまたＬまア ルカ１ノホスファターゼに抱合したヤギー抗−ウサギ抗体を使用して検出した。

融合蛋白質は主として細胞溶解物のペレット中で封入体の形態で見られた。ＢＴ Ａ１６３７は、クーマシー染色ゲルおよび蛋白質フ゛ロフトで検出された約１２ ０ｋｄの融合体を生成した。ＢＴＡ１６３８は約１４８ｋｄの融合蛋白質を生成 した。この蛋白質は蛋白質プロット法で検出可能であったが、クーマシー・ブル ー染色ゲルは容易には検出できなかった。ＢＴＡ１６８４およびＢＴＡ］６８６ はそれぞれ約４４ｋｄおよび３０ｋｄの蛋白質を生成し、これらは染色ゲルおよ び蛋白質プロットの両方で容易に視覚化された。各生成物の分子量は概ね、全事 例のＤＮＡシーケンス分析で予測された分子量であった。

動物試験用材料を製造するために、ＢＴＡ１６８４を、最少培地および栄養要求 用件含有隙酵器中に接種し、そしてＯＤが１５．５に達するまで醗酵させた。Ｉ ＰＴＧを加えて最終濃度を１＋ｎＭとし、トリプトン酵母抽出物に冨む培地を加 え、そしてグルコース供給を開始した。接種１５４時間後に、細胞を遠心して採 集し、再懸濁し、そして９，０００ｐｓｉのフレンチプレスを４回通して溶解し た。

溶解物は概ね　で遠心し、そのペレットを８　Ｍの尿素、１００ｍＭのＤＴＴ、 ２０ｍＭのトリス−ＨＣＺ、　ｐＨ８，０中で再懸濁した。遠心後、上澄液はＤ ＥＡＥセファロースカラムを通過させ、ＮａＣ１のＯ〜１Ｍ密度勾配で分画した 。融合蛋白質含有フラクションを集め、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ −４００ＨＲカラム上で１Ｍ酢酸で脱塩した。

融合蛋白質含有フラクションを再び集め、ノーイダ・ツクの０４カラムに０．１ ％のトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）で結合させ、このものを３０％〜４５％のアセト ニトリルの直線的密度勾配で分画した。融合蛋白質含有蛋白質を集め、貯蔵する ためにＩＭの酢酸中に移した。精製した物質の分別物を取り出し、Ｎ−末端アミ ノ酸シーケンスはアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ）アミノ酸分析器を使用して決定した。最初の２０個のアミノ酸はＭｅ ｔ　Ｉｃｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｘ　Ｐｒｏ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ｐｈｅ　Ｘ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　ＡｌａＡｈａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ に関して予測されたとおりであった。アミノ酸分析および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 によって組換え体生成物は少なくとも８５％純粋であると示されよう。

尖施何１ クチン１ト　キ″′７、′　− 寄生虫なしで育った１０匹のヒツジ群は、実施例６に記載したＢＴＡ１６８４株 から精製した組換え体抗原でワクチン投与した。各動物にはワクチンを２回皮下 投与した。第１回目のワクチン投与物は完全フロインドアジュバントで乳化した 約１１１１ｇの蛋白質を含有しており、２８日後の第２回目のワクチン投与物に は、不完全フロインドアジュバントで乳化し１こ約２５０μｇ蛋白質を含有して いた。動物１０匹の２群を更に追加し、第１群には感染対照としてワクチンを投 与せず、そして第２群にはアジュバントだけを投与した。第一回目のワクチン投 与後６３日目には、動物は全て、捻転毛様線虫の感染性Ｌ３幼虫１５，０００匹 を用いて経口的に感染させた。抗原投与後２２．２８．３６．４２．５０．５６ および６３日目に糞便試料を採取し、糞便１ｇ当たりの卵を測定した。更に、感 染後３７．５６および６３日目にヘマトクリット値を分析した。動物は全て６３ 日目に屠殺し、皺胃中の成虫捻転毛様線虫数を計数した。その結果（表９，１０ および１１）は、組換え体抗原を用いてワクチン投与するとヒツジの寄生虫症に 対して顕著な感染防御を示していたことを示している。

実験期間中、ワクチン投与群は対照群に比べて卵数が減少していた：卵数は最初 の４時点では約２５％、最後の３時点では約６０％、全体の平均では４０％減少 していた。ヘマトクリット値を測定した３時点の全てで、ワクチン投与群はその 値がより高かったので、動物はストレスがより少なかった。屠殺時に、ワクチン 投与群は対照群より寄生虫が平均して５２％少なかった。

この実験によって、組換え体４１ｋｄ蛋白質に対して生じた免疫応答によって感 染したヒツジの非産生および寄生虫負荷を５０％以上減少させることができ、こ れはこれら動物での血液損失の減少に関係があったと確認、さｎる。

注＝２匹の動物はそれらのへマドクリット値が任意に選択した植１５以下に下が ったとき、倫理的理由により試験から除外しなければならなかった。これらの動 物の内１匹は抗原投与対照群のものであり、５２日目に屠殺した（糞の卵数（５ ０日目）は１６８、０００、寄生虫数は６４４０）　、２匹目のワクチン投与群 のものは３４日目に屠殺した（糞の卵数（２８日目）　６２，４００．寄生虫数 ６７７５　）。これら動物のデータは表９〜１１ムこは含まれていない。

表９のデータを分析してわかるように、ワクチン投与の主要な効果は寄生虫駆除 を促進することであった。２２〜４２日目でのワクチン投与の効果は群全体で非 常に小さかったので、投函かの動物がこの早期期間中には余り感染防御されなか ったことは驚くべきことではない。ワクチン投与法が最も効果的になると、得ら れる怒染防御度は、この抗原に基づいて非常に有効なワクチンが開発されたよう な程度にまで上昇すると期待されると理解すべきである。

１−一史 １ぶり１改 屠殺時の寄生虫数 裏施班主 ４１ｋｄクローン　した−原による　六　感汎′５匹のモルモットの２群は、実 施例６に記載したＢＴＡ１６８４株から精製した組換え体抗原でワクチン投与し た。各群には腹腔内に１回ワクチンを投与した。１つの群には蛋白質１００μｇ を緩衝液で、もう１つの群には不完全フロインドアジュバントで乳化した蛋白質 １００μｇを与えた。別の１つの群の４匹の動物、即ち感染対照にはワクチンは 投与しなかった。ワクチン投与２８日後に、動物は全てコルブリフォルミス毛様 線虫の感染性のし、幼虫２，０００匹を用いて経口的に感染させた。１４日後に 、動物は全て層殺し、寄生虫数を計数した。その結果（表１２）によって、抗原 単独でのワクチン投与は３１％の感染防御をもたらしたが、不完全フロインドア ジュバントでの抗原ワクチン投与は４６％の感染防御をもたらしたことが示され る。

これらの数字は、コルブリフォルミス毛様線虫から単離した天然の４１ｋＤ抗原 によってもたらされる感染防御（実施例４）に類似している。

これらの結果は捻転毛様線虫の４１ｋＤ抗原がコルブリフォルミス毛様線虫での 感染に対して有意な種交叉感染防御を動物に生じさせることができることを示し ている。敷桁すると、本願明細書に記載した組換え体抗原のワクチン投与によっ てまたは本研究で記載した技術を使用した寄生性線虫の他の種に由来する組換え 体抗原のワクチン投与によって、成る範囲の他の種の寄生性線虫に対して同様な 種交叉恣染防御を可能にすることができると思われる。

宿主動物にもたらされる感染防御の程度は、抗原精製法、処方法およびワクチン 投与法を最適にすることによって実質的に上昇して有効なワクチンが提供される であろう。

産粟桓１里 本願発明は、コルブリフォルミス毛様線虫および捻転毛様線虫による動物の寄生 虫症ムこ対して感染防御するのに有効なワクチンとして使用できる蛋白質および 該蛋白質をコードするＤＮＡシーケンスの記載を提供する。

更に、コルブリフォルミス毛様線虫から単離された精製蛋白質に対して生じる抗 体およびこの蛋白質をコードするＤＮＡシーケンスは、コルブリフォルミス毛様 線虫以外の寄生性線虫の種から得た関連ポリベペチドおよび該ポリベペチドをコ ードする遺伝子を同定するために使用できることが示されている。それ故、同じ ＤＮＡシーケンスおよび抗体は、ヒトおよび家畜動物に寄生性である成る範囲の 他の種の線虫の関連蛋白質並びにそれら蛋白質をコードする遺伝子を同定するた めに使用でき、そしてこれら蛋白質は寄生虫自体から単離されようと組換え体Ｄ ＮＡ技術で製造されようと線虫のそれら種による寄生虫症に対し有効なワクチン を特徴する請求する。寄生虫の種および感染する可能性のある宿主には例えば次 のものがある。

ヒトでの旋毛虫またはイヌ鉤虫感染、ウマでのストロンギルス・ブルガリス感染 、ヒツジでのコルブリフォルミス毛様線虫感染、ヤギでの捻転毛様線虫感染、ウ シでのオステルタジアーオステルタジ感染、ブタでのブタ蝙虫または旋毛虫怒染 、ネコでのライオン・トキサスカリス又は狭頭鉤虫感染およびイヌでのイヌ鉤虫 またはトリクリス・プルビス感染並びにトキッヵラ種によるヒトの循環器系感染 、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、ヒ）ｆｆ虫、ぎょう虫、糞線虫またはバン クロフト糸状束による感染およびイヌ糸状束によるイヌの循環器系感染並びに動 物のこれら種および他の種の循環器系、泌尿生殖器系、呼吸器系、皮膚および皮 下組織の感染。この表は決して完全でないことに注意すべきである。

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Ｊ、　ｏｆ　ＰａｒａＳｉｔｏｌｏｇｙ　６３　７６１〜７６２゜Ｒｏｔｈｗｅ ｌｌ、　Ｔ、Ｌ、Ｗ、返よびＬｏｖｅ、Ｒ，Ｌ、（１９７４年）−線虫綱コルブ リフォルミス毛様線虫に対するワクチン投与−１，寄生虫ホモジネートおよびイ ンビトロ維持中に放出された可溶性生成物によるモルモットへのワクチン投与− Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｏｒ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏ ｇｙ　４＋　２９：３−２９９゜ Ｒｕｂｉｎ、Ｒ，Ｗ、およびＬｅｏｎａｒｃｌｉ、Ｃ，Ｌ、（１９８３年）−膜 蛋白質の二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動。’Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＲｕ ｔｈｅｒ、Ｕ、およびＭｕｌｌｅｒ　Ｈｉｌｌ、Ｂ、（１９８３年）、　Ｅｔｌ ＢＯＪ、　１．１２１７゜Ｓａｎｇｅｒ＋Ｆ、＋　Ｃｏｕｌｓｏｎ＋＾、Ｒ，、 Ｂａｒｒｅｌｌ、Ｂ、Ｇ、、　Ｓｍ１ｔｈ、Ａｊ、Ｈ，およびＲｏｅ、Ｂ、Ａ、 、　１９８０年、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１４３　１６１〜１７８゜５ｉｌ ｖｅｒｓｔｅｉｎ、Ｄ、Ｓ、およびＤｅｓｐｏ＋ｎｍ１ｅｒ、Ｄ、Ｄ、（１９８ ５年）−精製抗原に対する宿主応答の旋毛虫に与える影９−５ｃｉｅｎｃｅＵ二 　９４８〜９５０゜ ５ｔｅａｖｎｅ＋Ｐ、Ａ、＋　ｖａｎ　Ｄｒｉｅｌ、１．Ｒ，＋　Ｇｒｅｇｏ＋ Ｂ、、　Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｊ、およびＧｏｃｌｉｎｇ、Ｊ、Ｗ、（１９８５ 年）−ネズミ血漿細胞抗原ＰＣ−１：精製および部分アミノ酸シーケンス。Ｊ、 ｏｆ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＵ紅　４４３〜４４８゜ Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，、５ｔａｅｎｅｌｉｎ、Ｔ、およびＧｏｒｄｏｎ、Ｊ、（１ ９７９年）。

ＰＮＡＳ　測（９）、４３５０〜４３５４゜Ｗａｌｌａｃｅ、Ｒ，Ｂ、、　Ｐ、 Ｆｊｏｎｎｓｏｎ、Ｓ、Ｔａｎｅｋａ、　Ｍ、５ｃｈｏｌｄ、　Ｋ、Ｉｔａｋｕ ｒａおよびＪ、八ｂｅｌｓｏｎ、１９８５年、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　１３ ９６〜１４００゜Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、お よび？Ｉｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、　（１９８５年）Ｇｅｎｅ　３３．　１０３〜１１ ９　。

ＰＣＴ比軸比軸子引−鮒工誓閤コ ｐｃ丁出１人の手引−附仄誓Ｍ３ ＰＣＴ出願人の手引−附Ｉｌｌ釘Ｍ３ ＰＣＴ出１人の手引−附名誓間３ ０ＲＩＧ工ｌ〉コｊ＝−二口。

３５ＨＥＥＴＳ、ＳＨＥΣＴ１ ＦＩＧじＲＥ　〕 ０Ｒ１Ｇ上ＮＡＬ ＯＲ工Ｇ工ＮＡＬ ３５ｒ−Ｅ′ＥＴＳ　ｇ　５ＨＥＥＴ　２＋＋　−、、−９４にｄ −ｍｗｗ　”にｄ ａ　ｂｃ　ｄ ＦＴＧＩＪＲＥ　２ 国際調査報告 ｂ・−−−雫−−・−轟−−１−ｅ、＠＋’−ＰＣＴ／ＡＵ８８１００２３９層 　７６７２９／８７　ＪＰ　６３０５７５９９

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. １．寄生性線虫種による宿主の感染に対して感染防御免疫を与えることのできる 寄生性線虫種由来の蛋白質、その際該蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見積ると き４１ｋＤの概算分子量を有している、または寄生性線虫による宿主の感染に対 して感染防御免疫を与えることのできる上記蛋白質の全部分、一部分、類似体、 相同体、誘導体若しくはそれらを組み合せたもの。
2. ２．上記寄生性線虫が旋毛虫、イヌ鉤虫、ストロンギルス・ブルガリス、オステ ルタジア・オステルタジ、ブタ蛔虫、旋毛虫、ライオン・トキサスカリス、狭頭 鉤虫、イヌ鉤虫、トリクリス・ブルピス、イヌ糸状虫、トキソカラ種の幼虫、コ ルプリフォルミス毛様線虫、捻転毛様線虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、回虫、 ヒト鞭虫、ぎょう虫、糞線虫またはバンクロフト糸状虫である請求の範囲第１項 に記載の蛋白質。
3. ３．上記蛋白質がコルプリフォルミス毛様線虫または捻転毛様線虫由来である請 求の範囲第１項または２項に記載の蛋白質。
4. ４．上記蛋白質が下記のシーケンスを有する請求の範囲第１項から３項のいずれ か１項に記載の蛋白質：【配列があります】
5. ５．上記蛋白質が下記のシーケンスを有する請求の範囲第１項から３項のいずれ か１項に記載の蛋白質：【配列があります】
6. ６．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の全部分、１部分 、類似体、相同体、誘導体またはそれらを組み合せたもののアミノ酸シーケンス をコードする第１のヌクレオチドシーケンス、上記第１のヌクレオチドシーケン スとハイブリッドを形成しているヌクレオチドシーケンスまたは１塩基および多 塩基置換、挿入並びに欠失を含む突然変異によって上記第１のヌクレオチドシー ケンスに関連したヌクレオチドシーケンスからなるポリヌクレオチドシーケンス 。
7. ７．上記ポリヌクレオチドシーケンスがＤＮＡシーケンスである請求の範囲第６ 項に記載のポリヌクレオチドシーケンス。
8. ８．ＤＮＡシーケンス： 【配列があります】
9. ９．ＤＮＡシーケンス： 【配列があります】
10. １０．ＤＮＡシーケンス 【配列があります】
11. １１．合成的にかまたは生合成的にかのいずれかでインビトロて製造される、請 求の範囲第６項から１０項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドシーケンス 。
12. １２．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法であ って、該方性は１つ若しくはそれ以上のＤＮハまたはＲＮＡシーケンスを提供し そして該シーケンスのどれが当該活性を有するポリペプチドの全部分、１部分、 類似体、相同体、誘導体若しくはそれらを組み合せたものをコードすることが知 られているＤπハ若しくは只ドハシｒケンスとハイブリツドを形成するのかを決 定する、または上記蛋白質若しくはその１部分に対する抗血清を提供し上記蛋白 質を発現する宿主一ベクターの組み合せを同定することからなる。
13. １３．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の少なくとも１ 部分をコードするＤＮ吾の同定法および特徴決定法であって、該方性は上記蛋白 質を製造する細胞からｍｍ“ハ種を抽出し、がｍＲ鵬を二重鎖ＤＨハ（ｃＤ拝肴 ）に変換させ、該ｏＤＮＡを自発的複製因子中に挿入させ〔上記因子で宿主細胞 を形質転換させ、そして他の任意の蛋白質性細胞成分とは異なる蛋白質をコード するＤＨλを倉有するようなクローンを検出するために、蛋白質をコードするｍ ＲＮ吾またはＤＭシーケンスに相補性である合成ＤＮＡプローブを用いて上記形 質変換で生じるライブラリーをスクリーニングすることからなっている。
14. １４．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の全部分、１部 分、類似体、相同体、誘導体もしくはそれらを組み合せたもののアミノ酸シーケ ンスをコードする第１のＤＮＡシーケンスまたは該第１のシーケンスとハイブリ ツド形成しているＤＮＡシーケンスからなるＤＮＡ挿入物およびベツターＤＮＡ を特徴とする組換え体ＤＮＡ分子であって、その際の上記シーケンスは天然、合 成、生合成若しくは半合成起源を含む全ゆる起源由来のものであり、そして該シ ーケンスは突然変異、１塩基若しくは多塩基置換、欠失、挿入および逆位により 関連化したものを含み、そして請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載 の蛋白質であるポリペプチドの全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体または それらを組み合せたものをコードするシーケンスを含んでいる。
15. １５．上記組換え体ＤＮＡ分子が上記ＤＮＡ挿入物に有効に結合した発現制御シ ーケンスを有している請求の範囲第１４項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
16. １６．上記ＤＮＡ挿入物が大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に有効に結合し ている請求の範囲第１５項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
17. １７．上記ＤＮＡ挿入物がトリプトファン（Ｔｒｐオベロン）、バクテリオファ ージラムダの左側プロモーター（ＰＬ）、タックまたはモロニー白血病ウイルス の長い末端反復に有効に結合している請求の範囲第１５項に記載の組換え体ＤＮ Ａ分子。
18. １８．上記ベクターＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求の範囲第１４項から１ ７項のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
19. １９．上記プラスミドがｐＵＲ２９０またはその誘導体である請求の範囲第１８ 項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
20. ２０．上記プラスミドがｐＵＣ１８またはその誘導体である請求の範囲第１８項 に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
21. ２１．上記で定義したｐＢＴＡ５９３。
22. ２２．上記で定義したｐＢＴＡ５９７。
23. ２３．上記で定義したｐＢＴＡ５９８。
24. ２４．上記で定義したｐＢＴＡ７０２。
25. ２５．上記で定義したｐＢＴＡ７０４。
26. ２６．上記ベクターＤＮＡがバクテリオファージＤＮＡである請求の範囲第１４ 項から１７項のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
27. ２７．上記ベクターＤＮＡがバクテリオファージラムダＤＮＡまたはその誘導体 である請求の範囲第２６項に記載の組換え体ＤＮＡ分子。
28. ２８．プロモーター、翻訳開始シグナルおよび請求の範囲第７項から１０項のい ずれか１項に記載のＤＮＡシーケンスからなる融合遺伝子。
29. ２９．組換え体ＤＮＡ分子の製造方法であって、その際該方法は請求の範囲第７ 項から１０項のいずれか１項に記載のＤＮＡシーケンスである第１のＤＮＡシー ケンスからなるＤＮＡ挿入物を提供することおよび該ＤＮＡをクローニングベク ター中に導入することからなる。
30. ３０．上記ＤＮＡを発現制御シーケンスと共に正しい空間位置で且つ正しい読み 取り枠でクローニング担体に導入する請求の範囲第２９項に記載の方法。
31. ３１．融合遺伝子： 【配列があります】
32. ３２．融合遺伝子： 【配列があります】
33. ３３．請求の範囲第１４項から２７項のいずれか１項の少なくとも１つの組換え 体ＤＮＡ分子で形質転換した宿主。
34. ３４．上記宿主が細菌細胞、酵母若しくは他の真菌、脊推動物細胞若しくは昆虫 細胞、植物細胞、ヒト細胞、ヒト組織細胞または全真核生物である請求の範囲第 ３３項に記載の宿主。
35. ３５．上記宿主が大腸菌または他の小腸生物、シューモードモナスおよびバシラ ス種である請求の範囲第３４項に記載の宿主。
36. ３６．上記宿主が大腸菌Ｋ１２株ＪＮ１０９またはＹ１０９０である請求の範囲 第３５項に記載の宿主。
37. ３７．上記で定義したＡＴＣＣ６７４３８。
38. ３８．上記で定義したＡＴＣＣ６７４３９。
39. ３９．上記で定義したＡＴＣＣ６７４４０。
40. ４０．上記で定義したＡＴＣＣ６７７３８。
41. ４１．請求の範囲第３４項から３６項のいずれか１項に記載の宿主を提供し、該 宿主に請求の範囲第１４項から２７項のいずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分 子を正しい読み取り枠で導入することかちなる、宿主の形質転換方法。
42. ４２．請求の範囲第３３項から４０項のいずれか１項に記載の形質転換宿主の発 現生成物であって、その際該生成物は請求の範囲第１項から５項のいずれか１項 に記載の蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体、誘導体またはそれらを組み 合せたものからなる。
43. ４３．実質的に純粋な形態の請求の範囲第４２項に記載の発現生成物。
44. ４４．上記宿主に相同性の第１のポリペプチドシーケンス、および請求の範囲第 １項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の全部分、１部分、類似体、相同体 、誘導体またはそれらを組み合せたものをコードするアミノ酸シーケンスである 第２のポリペプチドシーケンスからなる請求の範囲第４２項に記載の発現生成物 。
45. ４５．上記第１のアミノ酸シーケンスがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の１部分ま たは全部分であり、そして上記宿主が大腸菌である請求の範囲第４４項に記載の 発現生成物。
46. ４６．上記第１のシーケンスが発現生成物のＮＨ２−末端シーケンスである請求 の範囲第４４項に記載の発現生成物。
47. ４７．上記生成物が下記のシーケンスを有する請求の範囲第４６項に記載の発現 生成物： 【配列があります】
48. ４８．上記生成物が下記のシーケンスを有する請求の範囲第４６項に記載の発現 生成物： 【配列があります】
49. ４９．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の全部分、１部 分、類似体、相同体、誘導体またはそれらを組み合せたものからなるポリペプチ ドの生合成方法であって、その際該方法は： 宿主が請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質の全部分、１部 分、類似体、相同体、誘導体またはそれらを組み合せたものであるポリペプチド を有する蛋白質性生成物を発現できるように請求の範囲第１５項から２７項のい ずれか１項に記載の組換え体ＤＮＡ分子で上記宿主を形質転換させること、上記 宿主を培養して上記発現を得ること、そして上記ポリペプチドを採集すること、 からなる。
50. ５０．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの蛋白 質または請求の範囲第４２項から４８項のいずれが１項に記載の発現生成物と製 薬的に受容可能な担体若しくは希釈剤からなるワクチン。
51. ５１．上記組成物が経口投与に適するかまたは注射可能な形態である請求の範囲 第５０項に記載のワクチン。
52. ５２．上記ワクチンが製薬的に受容可能なアジュバントを含有している請求の範 囲第５０項または請求の範囲第５１項に記載のワクチン。
53. ５３．請求の範囲第４２項から４８項のいずれか１項に記載の少なくとも１つの 発現生成物若しくは請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の少なくと も１つの蛋白質または請求の範囲第５０項から５２項のいずれか１項に記載の少 なくとも１つのワクチンを宿主に投与して免疫学的抗原投与の結果製造される抗 体調製物。
54. ５４．上記抗体調製物がポリクローナル抗体調製物である請求の範囲第５３項に 記載の抗体調製物。
55. ５５．上記抗体調製物がモノクローナル抗体調製物である請求の範囲第５３項に 記載の抗体調製物。
56. ５６．請求の範囲第１項から５項のいずれか１項に記載の蛋白質または請求の範 囲第４２項のいずれか１項に記載の発現生成物のエピトープであって、その際該 エピトープは寄生性線虫に対し感染防御免疫応答に寄与する。
57. ５７．上記エピトープが合成のものである請求の範囲第５６項のエピトープ。
58. ５８．上記エビトープが請求の範囲第１項から４項に定義した天然蛋白質または 組換え体蛋白質の化学的または酵素的開裂によって生成される請求の範囲第５６ 項に記載のエピトープ。
59. ５９．請求の範囲第５６項から５８項のいずれか１項に記載のエピトープに対し て発生した抗体。
60. ６０．請求の範囲第５９項に記載の抗体の変動可能領域に対して発生した抗体。