JPS60169498A - 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド誘導体 - Google Patents
成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド誘導体Info
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- JPS60169498A JPS60169498A JP59024187A JP2418784A JPS60169498A JP S60169498 A JPS60169498 A JP S60169498A JP 59024187 A JP59024187 A JP 59024187A JP 2418784 A JP2418784 A JP 2418784A JP S60169498 A JPS60169498 A JP S60169498A
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2740/10011—Retroviridae
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵
素との融合蛋白質、該ペプチドおよび融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、咳
プラスミドを含む微生物および該微生物を用いる成人Ｔ
細胞白血病ウィルス抗原ペプチドまたは該ペプチドと酵
素との融合蛋白質の製造法に関する。
素との融合蛋白質、該ペプチドおよび融合蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、咳
プラスミドを含む微生物および該微生物を用いる成人Ｔ
細胞白血病ウィルス抗原ペプチドまたは該ペプチドと酵
素との融合蛋白質の製造法に関する。
成人Ｔ細胞白血病ウィルス［ａｄｕｌｆ Ｔ ｃｅｌｌ
ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ 、以下ＡＴＬＶと略記
する、ＡＴＬＶは、またヒトＴ細胞白血病ウィルス（Ｈ
ＴＬＶ）とも言うがここではＡＴＬＶを用いる。〕は、
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ以下ＡＴＬと略記する）患者より分離された
Ｃ型し）ｏウィルスである［ Ｈｉｎｕｍａ ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ 、以下ＡＴＬＶと略記
する、ＡＴＬＶは、またヒトＴ細胞白血病ウィルス（Ｈ
ＴＬＶ）とも言うがここではＡＴＬＶを用いる。〕は、
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ以下ＡＴＬと略記する）患者より分離された
Ｃ型し）ｏウィルスである［ Ｈｉｎｕｍａ ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 ＬＩＳＡ、 ７８．６４７６−６４８０
（１９８０） ］ 。ＡＴＬ患者の予後は極めて不良で
あり有効な治療法もなく、患者の半数は半年以内に死亡
するという報告が多い。
（１９８０） ］ 。ＡＴＬ患者の予後は極めて不良で
あり有効な治療法もなく、患者の半数は半年以内に死亡
するという報告が多い。
近年、ＡＴＬ患者血清中にＡＴＬＩＩｌｌ１ｍ由来培養
株であるＭＴ−１細胞と特異的に反応する抗体の存在が
発見されたく同」二文献）。その後ＡＴＬ患者全例にこ
の抗体の存在が確認され、この抗体に体する抗原はＡＴ
Ｌ−関連抗原（ＡＴＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉ
ｇｅｎ （ｓ）以下ΔＴＬＡと略記する）と呼ばれてい
る。このＡＴＬＡに対する抗体く以下抗ΔＴＬＡ抗体と
略記する）は、ＡＴＬ多発地帯の正常健康人の２５％に
も存在すること、さらに抗ＡＴＬ−Ａ抗体保持者の分布
はＡＴＬ多発地帯に一致することが判明している（同上
文献）。ＭＴ−１細胞にはＣ型レトロウィルスの生成が
見出され、ＡＴＬＡの主体がこのレトロウィル抗原であ
り、抗ＡＴＬΔ抗体は、このウィルスの構成蛋白質（と
くにｐ２４）と反応することが判明してきた。また、Ｍ
Ｔ−１細胞ならびに患者末梢血リンパ球中にはＡＴＬＶ
のゲノムの存在が証明されるとともに［Ｙｏｓｈｉｄａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、。
株であるＭＴ−１細胞と特異的に反応する抗体の存在が
発見されたく同」二文献）。その後ＡＴＬ患者全例にこ
の抗体の存在が確認され、この抗体に体する抗原はＡＴ
Ｌ−関連抗原（ＡＴＬ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉ
ｇｅｎ （ｓ）以下ΔＴＬＡと略記する）と呼ばれてい
る。このＡＴＬＡに対する抗体く以下抗ΔＴＬＡ抗体と
略記する）は、ＡＴＬ多発地帯の正常健康人の２５％に
も存在すること、さらに抗ＡＴＬ−Ａ抗体保持者の分布
はＡＴＬ多発地帯に一致することが判明している（同上
文献）。ＭＴ−１細胞にはＣ型レトロウィルスの生成が
見出され、ＡＴＬＡの主体がこのレトロウィル抗原であ
り、抗ＡＴＬΔ抗体は、このウィルスの構成蛋白質（と
くにｐ２４）と反応することが判明してきた。また、Ｍ
Ｔ−１細胞ならびに患者末梢血リンパ球中にはＡＴＬＶ
のゲノムの存在が証明されるとともに［Ｙｏｓｈｉｄａ
ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、。
ｌＩｓ八、７９．２０：３Ｌ−２０３５（１９８２）１
、正常人で抗ΔＴＬＡ抗体陽性者のリンパ球を培養し
てもＡＴＬＶが検出される。
、正常人で抗ΔＴＬＡ抗体陽性者のリンパ球を培養し
てもＡＴＬＶが検出される。
このようにＡＴＬとＡＴＬＶは密接な関係があり、ＡＴ
ＬＶはＡＴＬの原因ウィルスと考えられているが、いま
だ感染経路等は知られていない。
ＬＶはＡＴＬの原因ウィルスと考えられているが、いま
だ感染経路等は知られていない。
家族内集積性のみられることから、夫婦間、母子間の感
染が主なものであろうことは指摘されている。
染が主なものであろうことは指摘されている。
さらに重要な経路としては輸血が挙げられており、実際
抗ＡＴＬＡ抗体陽性の血液を輸血した際、受血者の抗Ａ
ＴＬＡ抗体が陽転した臨床例も報告されている。ＡＴＬ
多発地帯の健康人の２５％が抗ΔＴＬΔ抗体陽性者であ
り、これらの人々はＡＴＬＶの保持者である可能性が極
めて高いため、これらの人々からの血液を輸血に用いる
のは避けなければならない。
抗ＡＴＬＡ抗体陽性の血液を輸血した際、受血者の抗Ａ
ＴＬＡ抗体が陽転した臨床例も報告されている。ＡＴＬ
多発地帯の健康人の２５％が抗ΔＴＬΔ抗体陽性者であ
り、これらの人々はＡＴＬＶの保持者である可能性が極
めて高いため、これらの人々からの血液を輸血に用いる
のは避けなければならない。
従来、抗ΔＴＬΔ抗体の検出は、ＡＴＬ由来培養株のア
セトン固定スライドを用いた間接螢光抗体法により行わ
れているが、一度に多数の血清を迅速に検定するという
目的のだ約には不便である。
セトン固定スライドを用いた間接螢光抗体法により行わ
れているが、一度に多数の血清を迅速に検定するという
目的のだ約には不便である。
他の感染症の場合には、細胞ではなく抗原そのものを検
定に用いる方法が、このような目的にかなった方法上し
て有効であることが明らかとなっている。現在、ＡＴＬ
由来培養細胞株であるＭＴ−２等の細胞抽出液を抗原と
して用いる方法も検討されているが、この方法では、■
細胞の培養が高価につくこと、■ＡＴＬＶを産生ずるこ
れらの細胞を大量生産に用いるには安全性の面で問題が
あること、■細胞から抽出する場合はその生産量が限ら
れるこさなどの問題があり、ＡＴＬ八を安価に大量に１
尋る為の有効な手段がめられている。
定に用いる方法が、このような目的にかなった方法上し
て有効であることが明らかとなっている。現在、ＡＴＬ
由来培養細胞株であるＭＴ−２等の細胞抽出液を抗原と
して用いる方法も検討されているが、この方法では、■
細胞の培養が高価につくこと、■ＡＴＬＶを産生ずるこ
れらの細胞を大量生産に用いるには安全性の面で問題が
あること、■細胞から抽出する場合はその生産量が限ら
れるこさなどの問題があり、ＡＴＬ八を安価に大量に１
尋る為の有効な手段がめられている。
本発明者らは、抗ΔＴＬＡ抗体の検出に役立つＡＴＬ八
を大量かつ安価に供給できる方法について研究を行った
。その結果、ＡＴＬＶゲノム中主な抗原ペプチドｐ２４
をコードするｇａｇ遺伝子中のＤＮＡ断片を組換えＤＮ
Ａの手法を用いて、ベクターＤＮＡに組み込み、得られ
た組み換え体ＤＮＡを含む微生物を培養した結果、ΔＴ
ＬＶ抗原ペプチドが著量生成蓄積されることを見出した
（特願昭５８−１７０９０８）。
を大量かつ安価に供給できる方法について研究を行った
。その結果、ＡＴＬＶゲノム中主な抗原ペプチドｐ２４
をコードするｇａｇ遺伝子中のＤＮＡ断片を組換えＤＮ
Ａの手法を用いて、ベクターＤＮＡに組み込み、得られ
た組み換え体ＤＮＡを含む微生物を培養した結果、ΔＴ
ＬＶ抗原ペプチドが著量生成蓄積されることを見出した
（特願昭５８−１７０９０８）。
そこで、さらに効率のよい発現を目的に研究を行った。
また同時に、抗原ペプチドの検出を簡便にし、かつ実際
の抗ΔＴＬＡ抗体の検定の際にも有用ξあると期待され
る抗原ペプチドと酵素との融合蛋白質を生成させる組換
えＤＮＡと該ＤＮＡを含む微生物による該融合蛋白質の
効率よい生成を確認し、本発明を完成した。
の抗ΔＴＬＡ抗体の検定の際にも有用ξあると期待され
る抗原ペプチドと酵素との融合蛋白質を生成させる組換
えＤＮＡと該ＤＮＡを含む微生物による該融合蛋白質の
効率よい生成を確認し、本発明を完成した。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、ＡＴＬＶ抗原ペプチドと酵素との融合蛋白質
、該ペプチドおよび該融合蛋白質をコードするＤＮＡ断
片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含
む微生物および該微生物を用いるΔＴＬＶ抗原ペプチド
およびＡＴＬＶ抗原ペプチドと酵素との融合蛋白質の製
造法を提供する。
、該ペプチドおよび該融合蛋白質をコードするＤＮＡ断
片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを含
む微生物および該微生物を用いるΔＴＬＶ抗原ペプチド
およびＡＴＬＶ抗原ペプチドと酵素との融合蛋白質の製
造法を提供する。
本発明の組換え体プラスミドの造成は以下の通り行われ
る。
る。
ΔＴＬＶ抗原ペプチドをコードするＤＮＡと酵素の遺伝
子とを供給したＤＮＡを組換えＤＮＡ技法によりベクタ
ーＤＮＡに組み込むことにより、ΔＴＬＶ抗原ペプチド
と酵素との融合蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ
組換え体プラスミドを造成することができる。
子とを供給したＤＮＡを組換えＤＮＡ技法によりベクタ
ーＤＮＡに組み込むことにより、ΔＴＬＶ抗原ペプチド
と酵素との融合蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ
組換え体プラスミドを造成することができる。
ＡＴＬＶ粒子の構成蛋白質としては、ｐｌｌ。
ｐ１４．ｐｌ？、ｐ２４．ｐ４５などが知られている。
このうち最も量的に多く、かつＡＴＬ患者血清七の反応
性の高いのはｐ２４である。すなわち、患者血清中の抗
体のうちでｐ２４と反応する抗体が最も多いと考えられ
る。また、ＭＴ−１。
性の高いのはｐ２４である。すなわち、患者血清中の抗
体のうちでｐ２４と反応する抗体が最も多いと考えられ
る。また、ＭＴ−１。
ＭＴ−２等のＡＴＬ細胞由来の培養株においても、ｐ２
４は高い発現量を示している。このように、ｐ２４がＡ
ＴＬＶ抗原ペプチドとして主要なものであることは明白
であるが、このことは、ｐ２４が最も早く精製され、研
究が進められてきたことでも明らかである。
４は高い発現量を示している。このように、ｐ２４がＡ
ＴＬＶ抗原ペプチドとして主要なものであることは明白
であるが、このことは、ｐ２４が最も早く精製され、研
究が進められてきたことでも明らかである。
さらに、抗ＡＴＬＡ抗体陽性の血清ではほとんど例外な
く、ｐ２４を免疫沈降させることから、はとんどの抗Δ
Ｔ Ｌ Ａ抗体患者は少なくともｐ２４に体する抗体を
持っているものと推測され、広汎な血清の検定を行う場
合、抗原としてｐ２４を用いるのが最も普遍性があり、
妥轟であろうと考えられる。
く、ｐ２４を免疫沈降させることから、はとんどの抗Δ
Ｔ Ｌ Ａ抗体患者は少なくともｐ２４に体する抗体を
持っているものと推測され、広汎な血清の検定を行う場
合、抗原としてｐ２４を用いるのが最も普遍性があり、
妥轟であろうと考えられる。
近年、酵素を結合させた抗体を用いた抗原の検出法がさ
かんに行われている。この方法では最終的に、その酵素
に対応ず基質を加え、分解された基質の発現により酵素
と抗体よの複合体、さらに抗原を検出しようとするもの
で、極めて簡便かつ高感度の方法である。現在この目的
に用いられる酵素としては、パーオキシダー七、アルカ
リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼが一般的で
ある。そこで、抗原であるＡＴＬＶのペプチドにこのよ
うな酵素を融合させて得られる融合蛋白質はＡＴＬＶ抗
原ペプチドとしての抗原性と、このような酵素活性を合
わせもつので、上記の抗原検出法に適当な修飾を加える
ことにより、極めて高い利用価値を持つものと期待され
る。さらに、ＡＴＬＶ抗原ペプチドを生産させる場合、
精製等においてその定量や純度の検定等に適当な手段が
ない。唯一の方法は患者の抗血清によるものであるが、
そのような抗血清は量的に限られるし、安全性の面から
も望ましくない。そこで、最初から抗原ペプチドと適当
な酵素の融合蛋白質をつくらせるように設計しておけば
、その定量や検出は、その融合させた酵素の活性を測定
することにより容易に行なえる。
かんに行われている。この方法では最終的に、その酵素
に対応ず基質を加え、分解された基質の発現により酵素
と抗体よの複合体、さらに抗原を検出しようとするもの
で、極めて簡便かつ高感度の方法である。現在この目的
に用いられる酵素としては、パーオキシダー七、アルカ
リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼが一般的で
ある。そこで、抗原であるＡＴＬＶのペプチドにこのよ
うな酵素を融合させて得られる融合蛋白質はＡＴＬＶ抗
原ペプチドとしての抗原性と、このような酵素活性を合
わせもつので、上記の抗原検出法に適当な修飾を加える
ことにより、極めて高い利用価値を持つものと期待され
る。さらに、ＡＴＬＶ抗原ペプチドを生産させる場合、
精製等においてその定量や純度の検定等に適当な手段が
ない。唯一の方法は患者の抗血清によるものであるが、
そのような抗血清は量的に限られるし、安全性の面から
も望ましくない。そこで、最初から抗原ペプチドと適当
な酵素の融合蛋白質をつくらせるように設計しておけば
、その定量や検出は、その融合させた酵素の活性を測定
することにより容易に行なえる。
本発明者らは、ＡＴＬＶ抗原ペプチドに酵素とくにβ−
ガラクトシダーゼを融合させた蛋白質の製造法について
研究を行っｊこ。
ガラクトシダーゼを融合させた蛋白質の製造法について
研究を行っｊこ。
ＡＴＬＶ抗原ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例
えば清水らによりクローン化されｊこｐＡＴＫ Ｏ３［
５ｅｉｋｉ ｅｔ ａユ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ。
えば清水らによりクローン化されｊこｐＡＴＫ Ｏ３［
５ｅｉｋｉ ｅｔ ａユ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 ８０．３６１８−３６２２ （１９８３）
：ｌ ヤ、本発明者らにより、造成されたその誘導体ｐ
ＡＴＫ１０５（特願昭５８−１７０９０８）を用いるこ
とができる。
：ｌ ヤ、本発明者らにより、造成されたその誘導体ｐ
ＡＴＫ１０５（特願昭５８−１７０９０８）を用いるこ
とができる。
ΔＴＬＶのゲノムは両端のＬＴＲとｇａｇ、ｐｏｌ。
ｅｎｖの少なくとも３つの遺伝子からなる。ウィルス抗
原として最も詳細な研究が行われているｐ２４は、ウィ
ルスのコア蛋白質であることから、ｇａｇ遺伝子産物で
あることが推定されていたが、実際０ｒｏｓｚｌａｎ
らにより決定されたｐ２４のアミノ酸配列Ｃ０ｒｏｓｚ
ｌａｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
原として最も詳細な研究が行われているｐ２４は、ウィ
ルスのコア蛋白質であることから、ｇａｇ遺伝子産物で
あることが推定されていたが、実際０ｒｏｓｚｌａｎ
らにより決定されたｐ２４のアミノ酸配列Ｃ０ｒｏｓｚ
ｌａｎ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、−ヱ９．１２９１−１２９４ （１９
Ｂ２） ：ｌをコードし得るＤＮＡ配列がｇａｇ遺伝子
中に見出される。
Ｂ２） ：ｌをコードし得るＤＮＡ配列がｇａｇ遺伝子
中に見出される。
ｐＡＴＫＯ３は５’ＬＴＲ，ｇａｇとｐａｌの一部まで
を含むクローンであるが、ｐＡＴＫ１０５は、このうち
５’ Ｌ Ｔ Ｒとｐａｌの一部を除き、ｇａｇ部分だ
けを含むため、ｇａｇ遺伝子ＤＮＡの操作をする上では
より望ましい形 となっている。
を含むクローンであるが、ｐＡＴＫ１０５は、このうち
５’ Ｌ Ｔ Ｒとｐａｌの一部を除き、ｇａｇ部分だ
けを含むため、ｇａｇ遺伝子ＤＮＡの操作をする上では
より望ましい形 となっている。
β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡとしては、例
えば大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むｐＭｃ１
５８７［第２図に制限地図を示したプラスミドでＢｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ８ＭＣ１５８７。
えば大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むｐＭｃ１
５８７［第２図に制限地図を示したプラスミドでＢｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ８ＭＣ１５８７。
ＦＥＲＭ ＢＰ−４８４から常法により採取することが
できる〕を用いることができる。ｐＭＣ１５８７のβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ’Ｚと呼ばれる）では
、Ｎ末端から８つのアミノ酸が欠失させてあり、その直
前にＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ。
できる〕を用いることができる。ｐＭＣ１５８７のβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃ’Ｚと呼ばれる）では
、Ｎ末端から８つのアミノ酸が欠失させてあり、その直
前にＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ。
１３ａｍＨＩの制限酵素切断部位が設けである。β−ガ
ラクトシダーゼは、そのＮ末端２２個のアミノ酸を除い
ても活性に変化がなく、ｐＭｃ１５８７にコードされる
該酵素も当然酵素活性を有する。
ラクトシダーゼは、そのＮ末端２２個のアミノ酸を除い
ても活性に変化がなく、ｐＭｃ１５８７にコードされる
該酵素も当然酵素活性を有する。
上記３種の制限酵素切断部位を用い、ｇａｇ遺伝子と結
合することによりｇａｇ遺伝子と］ａｃ’Ｚとの融合遺
伝子を造成することができる。
合することによりｇａｇ遺伝子と］ａｃ’Ｚとの融合遺
伝子を造成することができる。
ベクターＤＮＡとしては、挿入した目的ＤＮＡが微生物
中で発現できるものなら、いかなるものも用いることが
できる。好ましくは、適当なプロモーター、たとえばト
リプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（Ｉａｃ）系の
プロモーターを持ち、その下流に目的ＤＮＡを挿入でき
、しかもシャインダルガーノ配列（以下ＳＤ配列と略記
する）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）との間を適当な距離
、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミドを用いる
ことができる。具体的に好適なプラスミドとしては、ｐ
ＴｒＳ３をあげることができる。ｐＴｒＳ３は参考例に
示した方法で製造される。ｐＴｒＳ３はトリプトファン
プロモーターの下流ＳＤ配列と翻訳開始コドン（ＡＴＣ
）との間の距離（ＳＤ−ＡＴＣ）が１３塩基対で、しか
もＡＴＣの直後に外来ＤＮＡを挿入できるため、いかな
る遺伝子でもこのＡＴＣとフレームさえ合えば、このベ
クターを用いて直接かつ高率に外来ＤＮＡを発現させる
ことができる。
中で発現できるものなら、いかなるものも用いることが
できる。好ましくは、適当なプロモーター、たとえばト
リプトファン（ｔｒｐ）系、ラクトース（Ｉａｃ）系の
プロモーターを持ち、その下流に目的ＤＮＡを挿入でき
、しかもシャインダルガーノ配列（以下ＳＤ配列と略記
する）と翻訳開始コドン（ＡＴＧ）との間を適当な距離
、例えば６〜１８塩基対に調節したプラスミドを用いる
ことができる。具体的に好適なプラスミドとしては、ｐ
ＴｒＳ３をあげることができる。ｐＴｒＳ３は参考例に
示した方法で製造される。ｐＴｒＳ３はトリプトファン
プロモーターの下流ＳＤ配列と翻訳開始コドン（ＡＴＣ
）との間の距離（ＳＤ−ＡＴＣ）が１３塩基対で、しか
もＡＴＣの直後に外来ＤＮＡを挿入できるため、いかな
る遺伝子でもこのＡＴＣとフレームさえ合えば、このベ
クターを用いて直接かつ高率に外来ＤＮＡを発現させる
ことができる。
ＡＴＬＶ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ、たとえばｐ
ＡＴＫｌ ０５からのｐ２４をコードするＤＮＡと、ベ
クターＤＮＡたとえばｐＴｒＳ３との組換えは、制限酵
素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮ／ｌガーゼを用
いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を用いて行うこと
ができる。
ＡＴＫｌ ０５からのｐ２４をコードするＤＮＡと、ベ
クターＤＮＡたとえばｐＴｒＳ３との組換えは、制限酵
素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮ／ｌガーゼを用
いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を用いて行うこと
ができる。
また、ΔＴＬＶ抗原ペプチドをコードするＤＮＡたとえ
ばｐΔＴＫ１０５からのｐ２４をコードするＤＮＡと酵
素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）をコードするＤＮ
ＡたとえばｐＭｃ１５８７のｌａｃ’ Ｚ遺伝子との結
合ならびにベクターＤＮＡたとえばｐＴｒＳ３への組換
えも、制限酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を
用いて行うことができる。結合に際してはＤＮＡポリポ
リーゼＩ−ＫＩｅｎｏｗ断片を用いる埋め込み反応（［
１ｌｌ−ｉｎ）や、ＤＮＡリンカ−を用いる方法によっ
ても行うことができる。
ばｐΔＴＫ１０５からのｐ２４をコードするＤＮＡと酵
素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）をコードするＤＮ
ＡたとえばｐＭｃ１５８７のｌａｃ’ Ｚ遺伝子との結
合ならびにベクターＤＮＡたとえばｐＴｒＳ３への組換
えも、制限酵素を用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼを用いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を
用いて行うことができる。結合に際してはＤＮＡポリポ
リーゼＩ−ＫＩｅｎｏｗ断片を用いる埋め込み反応（［
１ｌｌ−ｉｎ）や、ＤＮＡリンカ−を用いる方法によっ
ても行うことができる。
具体例として示した、ｐＡＴＫｌ ０５．ｐＭＣ１５８
７とｐＴｒＳ３の場合は第２図に示すごとく、ｐＡＴＫ
ｌ（１５のｐ２４の大部分を含むＮｃｏｌ−３ｍａ Ｉ
断片と、ｐＭｃ１５８７のｌａｃ’Ｚを含むＳｍａｌ−
ＰｓｔＩ断片と、ｐＴｒＳ３のトリプトファンプロモー
ターを含むＰｓｔｌ−ＣＩａＩ断片を結合し、ｐ２４と
β−ガラクトシダーセ融合蛋白質をコードする組換え体
プラスミドｐΔＦΔ１０を造成することができる。また
、ｐΔＦＡＩＯをＢａｍＨｌと５ａｌＩで切断してβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子部分を除き、Ｔ４ポリメラーゼ
で埋め込み反応を行った後再結合することにより、ｐ２
４の大部分をコードする組換え体プラスミドｐΔＦＣ６
を造成することができる。
７とｐＴｒＳ３の場合は第２図に示すごとく、ｐＡＴＫ
ｌ（１５のｐ２４の大部分を含むＮｃｏｌ−３ｍａ Ｉ
断片と、ｐＭｃ１５８７のｌａｃ’Ｚを含むＳｍａｌ−
ＰｓｔＩ断片と、ｐＴｒＳ３のトリプトファンプロモー
ターを含むＰｓｔｌ−ＣＩａＩ断片を結合し、ｐ２４と
β−ガラクトシダーセ融合蛋白質をコードする組換え体
プラスミドｐΔＦΔ１０を造成することができる。また
、ｐΔＦＡＩＯをＢａｍＨｌと５ａｌＩで切断してβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子部分を除き、Ｔ４ポリメラーゼ
で埋め込み反応を行った後再結合することにより、ｐ２
４の大部分をコードする組換え体プラスミドｐΔＦＣ６
を造成することができる。
上記組換えプラスミド作成に必要な反応の条件は次のと
おりである。
おりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化は通常０．１〜１００μｇ
のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（ｐ Ｈ６，０〜９．５、好ま
しくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、１〜１５０ミリモルの
ＮａＣＣ２〜２０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモ
ル）のＭ ｇ ＣＩｔ Ｒ中で制限酵素０．１〜３００
単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対し１〜３単位の酵
素）を用い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）
において、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停
止は通常５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５
〜３０分間加熱することによるが、フェノールやジエチ
ルピロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活さ
せる方法も用いることができる。合成オリゴヌクレオチ
ドはリン酸ジエチル法（ＩＩ、Ｇ、 ｋｈｏｒａｎａｅ
ｔ ａｌ、 ： Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ７２
巻、２０９頁（１９７２年）〕、リン酸トリエステル法
１：Ｒ，Ｃｒｅａ ｅｔ ａｔ。
のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（ｐ Ｈ６，０〜９．５、好ま
しくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、１〜１５０ミリモルの
ＮａＣＣ２〜２０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモ
ル）のＭ ｇ ＣＩｔ Ｒ中で制限酵素０．１〜３００
単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対し１〜３単位の酵
素）を用い、１８〜４２℃（好ましくは３２〜３８℃）
において、１５分〜２４時間消化反応を行う。反応の停
止は通常５５〜７５℃（好ましくは６３〜７０℃）で５
〜３０分間加熱することによるが、フェノールやジエチ
ルピロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活さ
せる方法も用いることができる。合成オリゴヌクレオチ
ドはリン酸ジエチル法（ＩＩ、Ｇ、 ｋｈｏｒａｎａｅ
ｔ ａｌ、 ： Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ７２
巻、２０９頁（１９７２年）〕、リン酸トリエステル法
１：Ｒ，Ｃｒｅａ ｅｔ ａｔ。
：Ｐｒｏ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、１１．
ｓ、Ａ、 ７５巻、５７６５頁（１９７８年）〕あるい
はホスファイト法ＣＭ、口。
ｓ、Ａ、 ７５巻、５７６５頁（１９７８年）〕あるい
はホスファイト法ＣＭ、口。
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ、 ： Ｊ、八ｍ、Ｃ
ｈｅｍ、Ｓｏｃ、 １０３巻、３１８５頁（１９８１年
）〕などによって合成することができる。
ｈｅｍ、Ｓｏｃ、 １０３巻、３１８５頁（１９８１年
）〕などによって合成することができる。
合成したオリゴヌクレオチドをリン酸化するには、２〜
２００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のト
リス塩酸（ｐ Ｈ６，０〜９，５、好ましくはｐＨ７，
０〜８．０）、３〜２０ミリモル（好ましくは４〜１０
ミリモル）のＭｇＣｊ！２．１〜１０ミリモルのジチオ
スレイトール中でＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ０．
１〜１００単位を用い、２０〜４０℃（好ましくは３５
〜３８℃）で、５分間から２時間の反応を行う。ＤＮＡ
断片を結合させる場合は２〜２００ミ！Ｊモル（好まし
くは１０〜７０ミリモル）のトリス塩酸（ｐ Ｈ６，０
〜９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０
ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル）のＭ ｇ Ｃ
ｊ！ ２．０．１〜１０ミリモル（好ましくは０．５〜
２ミリモル）のΔＴＰ、１〜５０ミリモル（好ましくは
５〜１０ミリモル）のジチオスレイトール中でＴ４ＤＮ
Ａリガー七〇、１〜１０単位を用いて１〜３７℃（好ま
しくは３〜２０℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２
〜２０時間）結合反応を行う。
２００ミリモル（好ましくは１０〜７０ミリモル）のト
リス塩酸（ｐ Ｈ６，０〜９，５、好ましくはｐＨ７，
０〜８．０）、３〜２０ミリモル（好ましくは４〜１０
ミリモル）のＭｇＣｊ！２．１〜１０ミリモルのジチオ
スレイトール中でＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ０．
１〜１００単位を用い、２０〜４０℃（好ましくは３５
〜３８℃）で、５分間から２時間の反応を行う。ＤＮＡ
断片を結合させる場合は２〜２００ミ！Ｊモル（好まし
くは１０〜７０ミリモル）のトリス塩酸（ｐ Ｈ６，０
〜９．５、好ましくはｐＨ７，０〜８．０）、２〜２０
ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモル）のＭ ｇ Ｃ
ｊ！ ２．０．１〜１０ミリモル（好ましくは０．５〜
２ミリモル）のΔＴＰ、１〜５０ミリモル（好ましくは
５〜１０ミリモル）のジチオスレイトール中でＴ４ＤＮ
Ａリガー七〇、１〜１０単位を用いて１〜３７℃（好ま
しくは３〜２０℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２
〜２０時間）結合反応を行う。
ＤＮＡ断片、組換え体プラスミドなどの精製はアガロー
スゲル電気泳動法によって行う。
スゲル電気泳動法によって行う。
組換え体プラスミド、たとえばｐＡＦＡｌｏ。
ｐＡＦＣ６を微生物に形質転換して入れ、得られる形質
転換株を培養することによってＡＴＬＶ抗原ペプチドを
得ることができる。− 微生物としては、組換え体プラスミドの発現ができるも
のならいかなる微生物も用いることができるが、大腸菌
が好ましく用いられ、具体的には、大腸菌に一１２株Ｈ
ＢＩＯＩまたは５Ｇ４００８［Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＆
２ｉｐｓｅｒ、 Ｊ、 Ｂａｃｔ、１３３． ８４４
−８５１（１９７８） ）が用いられる。
転換株を培養することによってＡＴＬＶ抗原ペプチドを
得ることができる。− 微生物としては、組換え体プラスミドの発現ができるも
のならいかなる微生物も用いることができるが、大腸菌
が好ましく用いられ、具体的には、大腸菌に一１２株Ｈ
ＢＩＯＩまたは５Ｇ４００８［Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＆
２ｉｐｓｅｒ、 Ｊ、 Ｂａｃｔ、１３３． ８４４
−８５１（１９７８） ）が用いられる。
形質転換はＳ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ。
、 Ｎａｔｌ。
八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 ［ＩＳＡ ６９．２１１０
（１９７２） ：Ｉ ｌこ従って行うことができる。形
質転換株はｐＡＦＡｌｏ。
（１９７２） ：Ｉ ｌこ従って行うことができる。形
質転換株はｐＡＦＡｌｏ。
ｐＡＦＣ６の場合、アンピシリン耐性菌株として得るこ
とができる。ｐＡＦＡｌｏまたはｐＡＦＣ６を有する大
腸菌を培地に培養することにより培養物中にＡＴＬＶ抗
原ペプチドとβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を生
成させることができる。
とができる。ｐＡＦＡｌｏまたはｐＡＦＣ６を有する大
腸菌を培地に培養することにより培養物中にＡＴＬＶ抗
原ペプチドとβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を生
成させることができる。
ｐＡＦｃｌｏのβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮ
Ａ断片を除いて得られるＡＴＬＶ抗原ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を組み込んだｐΔＦＣ６を含む微生物に
よるＡＴＬＶ抗原ペプチドの生産は、融合を経ていない
ＡＴＬＶ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドを含む微生物を用いる場合よりも優れた
ものを選択するのに都合がよい。それはβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を指標として生産性の高いものを選ぶことが
容易であり、その後にβ−ガラクトシダーゼ部分をプラ
スミドから除去することも容易であるからである。
Ａ断片を除いて得られるＡＴＬＶ抗原ペプチドをコード
するＤＮＡ断片を組み込んだｐΔＦＣ６を含む微生物に
よるＡＴＬＶ抗原ペプチドの生産は、融合を経ていない
ＡＴＬＶ抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み込
んだプラスミドを含む微生物を用いる場合よりも優れた
ものを選択するのに都合がよい。それはβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を指標として生産性の高いものを選ぶことが
容易であり、その後にβ−ガラクトシダーゼ部分をプラ
スミドから除去することも容易であるからである。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに該融合
蛋白質の生産に好適なものならば合成培地、天然培地の
いずれも使用できる。
蛋白質の生産に好適なものならば合成培地、天然培地の
いずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース。
ラクトース、クリセロール、マンニトール、ソルビトー
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ，ｌ。
ルなどが、窒素源としては、ＮＨ，ｌ。
（ＮＨ４）２ ＳＯ４、カザミノ酸、酵母エキス、ポリ
ペプトン、肉エキス、バクトドリブトン、コーン・ステ
イープ・リカーなどが、その他の栄養素としては、ＮＨ
，ＨＰＯ，、に２ＨＰＯ，。
ペプトン、肉エキス、バクトドリブトン、コーン・ステ
イープ・リカーなどが、その他の栄養素としては、ＮＨ
，ＨＰＯ，、に２ＨＰＯ，。
ＫＨ２Ｐ Ｏ−、Ｎ ａ Ｃｊ！ 、 Ｍｇ ＳＯ４、
ビタミンＢ１． Ｍ ｇ ＣＬなどが使用できる。
ビタミンＢ１． Ｍ ｇ ＣＬなどが使用できる。
培養はｐ Ｈ５，５〜８．５、温度１８〜４０℃で通気
攪拌培養により行われる。
攪拌培養により行われる。
培養５〜９０時間で培養菌体中にＡＴＬＶ抗原ペプチド
と大腸菌β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質が蓄積す
るので、培養物から菌体を集菌し、超音波破砕し、遠心
して得られる上清から通常の方法に従ってポリペプチド
を採取する。
と大腸菌β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質が蓄積す
るので、培養物から菌体を集菌し、超音波破砕し、遠心
して得られる上清から通常の方法に従ってポリペプチド
を採取する。
ＡＴＬＶ抗原ペプチドとβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白
質の定量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ｌ
ａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７．６８０ （
１９７０））にて分画後景白質を染色し、ゲルスキャナ
ーにより行う。またＭｉｌｌｅｒの方法ＣＭｉｌｌｅｒ
、 ｉ！ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐｐ３５２−３５５ Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９７２）］に従い、β−ガラクトシダーゼの活性
を測定することにより行う。
質の定量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ｌ
ａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７．６８０ （
１９７０））にて分画後景白質を染色し、ゲルスキャナ
ーにより行う。またＭｉｌｌｅｒの方法ＣＭｉｌｌｅｒ
、 ｉ！ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｐｐ３５２−３５５ Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（１９７２）］に従い、β−ガラクトシダーゼの活性
を測定することにより行う。
微生物中からのプラスミドの分離はＨ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍら ：Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ７． １５１３ （１９７９）：１の方法に従
って行う。
ｏｉｍら ：Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ７． １５１３ （１９７９）：１の方法に従
って行う。
以下本発明の実施例を示す。
実施例１゜
ｐΔＴＫ１０５のｇａｇ遺伝子とｐＭｃ１５８７のβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子の結合とそのｐＴｒＳ３への組
み込み（第１図）。
ガラクトシダーゼ遺伝子の結合とそのｐＴｒＳ３への組
み込み（第１図）。
ｐＡＴＫ１０５からｐ２４の大部分をコードする領域と
その下流部分を含むＤＮＡ断片を切り出し、ｐＭｃ１５
８７から切り出したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａ
ｃ’Ｚ）と連結し、発現ベクターｐＴｒｓ３のＴｒｐプ
ロモーターの下流に挿入する。
その下流部分を含むＤＮＡ断片を切り出し、ｐＭｃ１５
８７から切り出したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａ
ｃ’Ｚ）と連結し、発現ベクターｐＴｒｓ３のＴｒｐプ
ロモーターの下流に挿入する。
ｐＡＴＫ １０５ ［５，８キロベース（以下キロベー
スをＫｂと略記する） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＥＡＴＫ１０５、 ＦＢＲＭ ＢＰ−３４０から
参考例１の方法により採取する〕１１０Ａｔを１０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ７，５）１０ｍＭ ＭｇＣｊ２．．１
０ｍＭジチオスレイトールおよび５０ｍＭ ＮａＣｊ！
（以下Ｙ−５０緩衝液と略記する）を含む全量１００μ
ｌの溶液に溶かし、Ｎ ｃ ｏ Ｉ （Ｎｅｗ Ｂｎｇ
ｌａｎｄ ［１ｉｏｌａｂｓ社製）２０単位とＨｊｎｆ
Ｉ （全酒造社製、以下制限酵素については特記しな
い限り全酒造社製）２０単位を加え、３７℃３時間消化
反応を行った。反応液を６５℃１０分間加熱処理して酵
素を失活させ、低融点アガロースゲル電気泳動法（以下
ＬＧＴ法と略記する）にて精製し、０．６７Ｋｂのｐ２
４の大部分を含むＤＮＡ断片０．５μｇを得た。該ＤＮ
Ａ断片０．５ μｇを６７ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，８
）。
スをＫｂと略記する） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＥＡＴＫ１０５、 ＦＢＲＭ ＢＰ−３４０から
参考例１の方法により採取する〕１１０Ａｔを１０ｍＭ
）リス塩酸（ｐＨ７，５）１０ｍＭ ＭｇＣｊ２．．１
０ｍＭジチオスレイトールおよび５０ｍＭ ＮａＣｊ！
（以下Ｙ−５０緩衝液と略記する）を含む全量１００μ
ｌの溶液に溶かし、Ｎ ｃ ｏ Ｉ （Ｎｅｗ Ｂｎｇ
ｌａｎｄ ［１ｉｏｌａｂｓ社製）２０単位とＨｊｎｆ
Ｉ （全酒造社製、以下制限酵素については特記しな
い限り全酒造社製）２０単位を加え、３７℃３時間消化
反応を行った。反応液を６５℃１０分間加熱処理して酵
素を失活させ、低融点アガロースゲル電気泳動法（以下
ＬＧＴ法と略記する）にて精製し、０．６７Ｋｂのｐ２
４の大部分を含むＤＮＡ断片０．５μｇを得た。該ＤＮ
Ａ断片０．５ μｇを６７ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，８
）。
６．７ｍＭ ＭｇＣｌ１２．１０ｍＭ ２−メルカプト
エタノール、６．７μＭ ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ（Ｎ
ｌ（、）２Ｓｏ、およびｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。
エタノール、６．７μＭ ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ（Ｎ
ｌ（、）２Ｓｏ、およびｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ各々１ｍＭを含む溶液（以下Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ緩衝液と略記する）３０μβに溶かし
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製）５単位を加え
、３７℃１時間埋め込み反応を行い、次いで６５℃１０
分間加熱処理をして酵素を失活させた。該ＤＮＡ断片は
ΔＴＬＶｇａｇ遺伝子のうちｐ２４をコードするＤＮＡ
の５′末端から４１番目の塩基より、３′末端の下流６
６番目の塩基までを含む。
ＮＡポリメラーゼ緩衝液と略記する）３０μβに溶かし
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製）５単位を加え
、３７℃１時間埋め込み反応を行い、次いで６５℃１０
分間加熱処理をして酵素を失活させた。該ＤＮＡ断片は
ΔＴＬＶｇａｇ遺伝子のうちｐ２４をコードするＤＮＡ
の５′末端から４１番目の塩基より、３′末端の下流６
６番目の塩基までを含む。
ｐＭｃ１５８７ （１６，６Ｋｂ）１．０μｇを１００
μβのＹ−５０緩衝液に溶かし、各々２０単位のＳｍａ
ＩとＰｓｔｌを加え、３７℃、３時間消化反応を行っ
た。反応液を６５℃、１０分間加熱処理して酵素を失活
させ、ＬＧＴ法にて約９Ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を含む断片約２μｇを得た。
μβのＹ−５０緩衝液に溶かし、各々２０単位のＳｍａ
ＩとＰｓｔｌを加え、３７℃、３時間消化反応を行っ
た。反応液を６５℃、１０分間加熱処理して酵素を失活
させ、ＬＧＴ法にて約９Ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を含む断片約２μｇを得た。
一方ｐ Ｔ ｒ Ｓ ３ （３，８Ｋ ｂ’ Ｂｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＩＴｒＳ３．ＦＥＲＭ ＢＰ
−２３８から参考例３の方法により採取する）を全量１
００μβのＹ−５０緩衝液に溶かし、Ｃｆ１ａＩ（ベー
リンガーマンハイム社製）２０単位を加え３７℃３時間
消化反応を行った。６５ｔｌ’ＩＯ分間加熱処理により
酵素を失活させ、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。このＤＮＡを１００μｍのＴ４ＤＮＡポリメラー七
を加え、３７℃１時間埋め込み反応を行った。６５℃１
０分間加熱処理し、酵素を失活させ、エタノール沈殿に
よりＤＮＡを回収した。
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＩＴｒＳ３．ＦＥＲＭ ＢＰ
−２３８から参考例３の方法により採取する）を全量１
００μβのＹ−５０緩衝液に溶かし、Ｃｆ１ａＩ（ベー
リンガーマンハイム社製）２０単位を加え３７℃３時間
消化反応を行った。６５ｔｌ’ＩＯ分間加熱処理により
酵素を失活させ、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し
た。このＤＮＡを１００μｍのＴ４ＤＮＡポリメラー七
を加え、３７℃１時間埋め込み反応を行った。６５℃１
０分間加熱処理し、酵素を失活させ、エタノール沈殿に
よりＤＮＡを回収した。
このＤＮＡを１００μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、２
０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃３時間消化反応を行い
、次いでＬＧＴ法によりＴｒｐプロモーターを含む約０
．９ Ｋ ｂのＤＮＡ断片約１μｇを得た。
０単位のＰｓｔＩを加え、３７℃３時間消化反応を行い
、次いでＬＧＴ法によりＴｒｐプロモーターを含む約０
．９ Ｋ ｂのＤＮＡ断片約１μｇを得た。
このＤＮＡ断片０．１μｇと前記の埋め込みを行ったｐ
ＡＴＫ １０５のＮｃｏｌ−Ｈｉｎｆｌ断片０．１ｔ、
ｔｇ、ｐＭｃ１５８？のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片１μｇ
を２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）。
ＡＴＫ １０５のＮｃｏｌ−Ｈｉｎｆｌ断片０．１ｔ、
ｔｇ、ｐＭｃ１５８？のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片１μｇ
を２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）。
１．０ｍＭ Ｍｇ（１！、、１０ｍＭジチオスレイトー
ルおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液（以下Ｔ４リガーゼ
緩衝液と略記する）５０μβに溶かし、Ｔ ４ Ｄ Ｎ
Ａ ＩＪガーゼ（全酒造社製）２．５単位を加え４℃
１６時間結時間部を行った。この反応液を用いて常法に
より大腸菌に−１２，Ｉ−１８１０１株を形質転換し、
アンピシリン耐性（Δｐ’ ）の菌株を得た。本菌株か
ら常法によりプラスミドＤＮＡを分離し、組換え体プラ
スミドｐＡＦＡ１０（約１０、６ Ｋ ｂ ）を得た。
ルおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む溶液（以下Ｔ４リガーゼ
緩衝液と略記する）５０μβに溶かし、Ｔ ４ Ｄ Ｎ
Ａ ＩＪガーゼ（全酒造社製）２．５単位を加え４℃
１６時間結時間部を行った。この反応液を用いて常法に
より大腸菌に−１２，Ｉ−１８１０１株を形質転換し、
アンピシリン耐性（Δｐ’ ）の菌株を得た。本菌株か
ら常法によりプラスミドＤＮＡを分離し、組換え体プラ
スミドｐＡＦＡ１０（約１０、６ Ｋ ｂ ）を得た。
ｐＡＦＡＩＯの構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｂａ
ｍＨＩで消化して、アガロースゲル電気泳動法にて確認
した。ｐＡＦＡＩＯにコードされるポリペプチドはｐ２
４のＮ末端から１７番目のアミノ酸であるメチオニンか
ら始まり、Ｃ末端側にｐ２４以外のｇａｇ遺伝子産物の
アミノ酸２４個を付けた２２１アミノ酸のΔＴＬＶ抗原
ペプチド部分と、Ｎ末端より７個のアミノ酸を欠いたβ
−ガラクトシダーゼが結合した形の融合蛋白質（総計１
２４９個のアミノ酸）である（第１図参照）。
ｍＨＩで消化して、アガロースゲル電気泳動法にて確認
した。ｐＡＦＡＩＯにコードされるポリペプチドはｐ２
４のＮ末端から１７番目のアミノ酸であるメチオニンか
ら始まり、Ｃ末端側にｐ２４以外のｇａｇ遺伝子産物の
アミノ酸２４個を付けた２２１アミノ酸のΔＴＬＶ抗原
ペプチド部分と、Ｎ末端より７個のアミノ酸を欠いたβ
−ガラクトシダーゼが結合した形の融合蛋白質（総計１
２４９個のアミノ酸）である（第１図参照）。
プラスミドｐＡＦＡ１０を含む大腸菌に−１２゜）１１
３１０１株は米国・アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅ
ＡＦＡＩＯ，ＡＴＣＣ３９５８２として昭和５９年１月
１９日付で寄託されている。
３１０１株は米国・アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅ
ＡＦＡＩＯ，ＡＴＣＣ３９５８２として昭和５９年１月
１９日付で寄託されている。
実施例２゜
ｐＡＦＡｌｏからのβ−ガラクトジダーセ遺伝子の除去
ΔＴＬＶ抗原ペプチドと大腸菌β−ガラクトシダーセの
融合蛋白質をコードするｐＡＦＡｌｏからβ−ガラクト
シダーセ遺伝子部分を除去し、ΔＴＬＶ抗原ペプチドを
生産させる。
融合蛋白質をコードするｐＡＦＡｌｏからβ−ガラクト
シダーセ遺伝子部分を除去し、ΔＴＬＶ抗原ペプチドを
生産させる。
実施例１で得たｐＡＦＡｌｏ（約１０．６ Ｋ ｂ ）
ＩＯμｇを１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）。
ＩＯμｇを１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）。
１０ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１０ｍＭジチオスレイトール
、１５０ｍＭ ＮａＣ，ｉ！を含む全量１００μＡの溶
液に溶かし、Ｂａｍ１−１１，５ａＡｊ各々２０単位を
加え、３７℃３時間消化反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法により約４．５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片約１．５
μｇを回収した。このＤＮＡ断片１．５μｇを５０μｌ
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ５単位を加え、３７℃１時間埋め込み反応
を行った。６５℃１０分間加熱処理を行い酵素を失活さ
せ、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
、１５０ｍＭ ＮａＣ，ｉ！を含む全量１００μＡの溶
液に溶かし、Ｂａｍ１−１１，５ａＡｊ各々２０単位を
加え、３７℃３時間消化反応を行った。この反応液から
ＬＧＴ法により約４．５ Ｋ ｂのＤＮＡ断片約１．５
μｇを回収した。このＤＮＡ断片１．５μｇを５０μｌ
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液に溶かし、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ５単位を加え、３７℃１時間埋め込み反応
を行った。６５℃１０分間加熱処理を行い酵素を失活さ
せ、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
該ＤＮＡ断片０．１μｇを５０μｍのＴ４リガーセ緩衝
液に溶かし２．５単位のＴ４１Ｊガーセを加え、４℃１
６時間結時間芯を行った。この反応液を用いて常法通り
大腸菌に−１２，８８１０１株を形質転換し、Ａｐｒ株
を得た。本菌株から常法によりプラスミドＤＮＡを分離
し、組換え体プラスミドｐΔＦＣ６（約４．５ Ｋ ｂ
）を得た。ｐΔＦＣ６の構造はＥｃｏＲＩ、Ｐｓ ｔ
Ｉで切断してアガロースゲル電気泳動法にてｍＷした
。ｐＡＦＣ６にコードされているポリペプチドは、ｐ２
４のＮ末端から１７番目のアミノ酸メチオニンから始ま
りＣ末端側にｐ２４以外のｇａｇ蛋白質のアミノ酸２４
個と、ｐＢＲ３２２由来のアミノ酸７個がイ」加してい
る（第１図参照）。
液に溶かし２．５単位のＴ４１Ｊガーセを加え、４℃１
６時間結時間芯を行った。この反応液を用いて常法通り
大腸菌に−１２，８８１０１株を形質転換し、Ａｐｒ株
を得た。本菌株から常法によりプラスミドＤＮＡを分離
し、組換え体プラスミドｐΔＦＣ６（約４．５ Ｋ ｂ
）を得た。ｐΔＦＣ６の構造はＥｃｏＲＩ、Ｐｓ ｔ
Ｉで切断してアガロースゲル電気泳動法にてｍＷした
。ｐＡＦＣ６にコードされているポリペプチドは、ｐ２
４のＮ末端から１７番目のアミノ酸メチオニンから始ま
りＣ末端側にｐ２４以外のｇａｇ蛋白質のアミノ酸２４
個と、ｐＢＲ３２２由来のアミノ酸７個がイ」加してい
る（第１図参照）。
プラスミドｐΔＦＣ６を含む大腸菌に−１２゜８８１０
１株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンにＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅ Ａ Ｆ
Ｃ６、ＡＴＣＣ３９５８１として昭和５９年１月１９
日付で寄託されている。
１株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンにＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅ Ａ Ｆ
Ｃ６、ＡＴＣＣ３９５８１として昭和５９年１月１９
日付で寄託されている。
実施例３゜
ｐＡＦＣ６およびｐＡＦＡｌｏを保有する大腸菌による
ＡＴＬＶ抗原ペプチドおよびΔＴＬＶ抗原ペプチドとβ
−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の生産 実施例１〜２で得た組換え体プラスミドｐΔＦＡ１０、
ｐＡＦＣ６および対照としてベクターとして用いたｐ
Ｔ ｒ Ｓ ３を持つ大腸菌８８１０１株をＭＣＧ培
地（Ｎ ａ２ＨＰ ０４０．６％、ＫＨ２Ｐ○４０．３
％、ＮａＣｌ ０．５％、ＮＨＩＣｊ！ ０．１％。
ＡＴＬＶ抗原ペプチドおよびΔＴＬＶ抗原ペプチドとβ
−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の生産 実施例１〜２で得た組換え体プラスミドｐΔＦＡ１０、
ｐＡＦＣ６および対照としてベクターとして用いたｐ
Ｔ ｒ Ｓ ３を持つ大腸菌８８１０１株をＭＣＧ培
地（Ｎ ａ２ＨＰ ０４０．６％、ＫＨ２Ｐ○４０．３
％、ＮａＣｌ ０．５％、ＮＨＩＣｊ！ ０．１％。
グルコース０．５％、カザ゛ミノ酸０．５％、 Ｍ ｇ
ＳＯ＋１ ｍＭ、ビタミンＢ＋ ４／ｊｇ／ｍｌ、ｐ
Ｈ７，２）に接種し、３０℃で４〜１６時間培養する。
ＳＯ＋１ ｍＭ、ビタミンＢ＋ ４／ｊｇ／ｍｌ、ｐ
Ｈ７，２）に接種し、３０℃で４〜１６時間培養する。
培養液を１０，０００ ｒｐｍ 、 ５分間遠心集菌後
、３０ｍＭＮａＣβ、３０ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｉ−１
７，５＞で洗浄後、蛋白質量にして約２０μｇの菌体を
Ｌａｅｍｍ ｌ ｉのザンプルバッフ７− ［Ｌａｅｍ
＋＋＋ｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７゜６８０ （１
９７０）：］ ｌ Ｏ〜２０μｌに懸濁した。懸濁液を
１００℃５分間加熱し、菌体を溶解した。この溶液をＬ
ａｅｍｍｌｉの方法（同上文献）により５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後クマシーブリ
リアントブルーにより染色し蛋白質のハンドを検出した
。
、３０ｍＭＮａＣβ、３０ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｉ−１
７，５＞で洗浄後、蛋白質量にして約２０μｇの菌体を
Ｌａｅｍｍ ｌ ｉのザンプルバッフ７− ［Ｌａｅｍ
＋＋＋ｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７゜６８０ （１
９７０）：］ ｌ Ｏ〜２０μｌに懸濁した。懸濁液を
１００℃５分間加熱し、菌体を溶解した。この溶液をＬ
ａｅｍｍｌｉの方法（同上文献）により５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけ、泳動後クマシーブリ
リアントブルーにより染色し蛋白質のハンドを検出した
。
この結果ｐＡＦΔ１０では対照のｐＴｒＳ３には見られ
ない分子量約１４Ｌ ０００のバンドが、またｐＡＦＣ
６では同様な分子量約２５．０００のハンドが検出され
た。ｐＡＦＡｌｏおよびｐＡＦＣ６のバンドが示す分子
量はそれぞれが有するΔＴＬＶ抗原ペプチドーβ−ガラ
クトシダーゼ融合蛋白質をコードする遺伝子とＡＴＬＶ
抗原ペプチド遺伝子のＤＮＡ配列から予想されるポリペ
プチドの分子量とほぼ同じである。各々のポリペプチド
の生産量は、その検出に用いた５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲルを乾燥後、ゲルスキャナーにかげ各バンドの強
度から各々の蛋白質量を定量した。その結果ｐＡＦＡ
１０の分子量約１４１．０００の蛋白質。
ない分子量約１４Ｌ ０００のバンドが、またｐＡＦＣ
６では同様な分子量約２５．０００のハンドが検出され
た。ｐＡＦＡｌｏおよびｐＡＦＣ６のバンドが示す分子
量はそれぞれが有するΔＴＬＶ抗原ペプチドーβ−ガラ
クトシダーゼ融合蛋白質をコードする遺伝子とＡＴＬＶ
抗原ペプチド遺伝子のＤＮＡ配列から予想されるポリペ
プチドの分子量とほぼ同じである。各々のポリペプチド
の生産量は、その検出に用いた５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲルを乾燥後、ゲルスキャナーにかげ各バンドの強
度から各々の蛋白質量を定量した。その結果ｐＡＦＡ
１０の分子量約１４１．０００の蛋白質。
ｐＡＦＣ６の分子量約２５．０００の蛋白質いずれも全
菌体蛋白質の約２０％に達する生成量を示した。
菌体蛋白質の約２０％に達する生成量を示した。
またｐＡＦＡｌｏについてはＭｉｌｌｅｒの方法［Ｍｉ
ｌｌｅｒ、［！ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ ＧｅｎｅＬｉｃｓｐｐ３５２−３５５ Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｌａｔ
ｏｒｙ （１９７２）］に従ってβ−ガラクトシダーセ
活性の測定を行った。その結果培地１ｍｌ当り、約２０
．０００単位の該酵素活性がみとめられ、この融合蛋白
質がβ−ガラクトシダーゼとしての活性を有することが
示され、今後臨床検査試薬として用いる際にも、また精
製等の過程においても極めて有用である。
ｌｌｅｒ、［！ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ ＧｅｎｅＬｉｃｓｐｐ３５２−３５５ Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｌａｔ
ｏｒｙ （１９７２）］に従ってβ−ガラクトシダーセ
活性の測定を行った。その結果培地１ｍｌ当り、約２０
．０００単位の該酵素活性がみとめられ、この融合蛋白
質がβ−ガラクトシダーゼとしての活性を有することが
示され、今後臨床検査試薬として用いる際にも、また精
製等の過程においても極めて有用である。
参考例１゜
発現ベクターｐＴｒＳ３への△Ｔ Ｌ Ｖｇａｇ遺伝子
断片の組み込み： （１）プラスミドｐＡＴＫＯ３のｇａｇ遺伝子のザブク
ローン化： ｐＡＴＫＯ３の６００ｕｇを２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ
７，５） 、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭ Ｎ ａ Ｃ１を含む
全量２ｍｌの溶液に溶かし、制限酵素Ａｐａ１（ベーリ
ンガー・マンハイムｌ１ｌ） １．０００単位を加え、
３７℃で６時間消化反応を行った。
断片の組み込み： （１）プラスミドｐＡＴＫＯ３のｇａｇ遺伝子のザブク
ローン化： ｐＡＴＫＯ３の６００ｕｇを２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ
７，５） 、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ！２．１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭ Ｎ ａ Ｃ１を含む
全量２ｍｌの溶液に溶かし、制限酵素Ａｐａ１（ベーリ
ンガー・マンハイムｌ１ｌ） １．０００単位を加え、
３７℃で６時間消化反応を行った。
この反応液をアガロースゲル電気泳動にかけてＤＮＡ断
片を分離した。すなわぢ、ゲル上、目的とする２、 ７
ｋ ｂ断片の直前に溝を掘り、ハイトロキシルアパタ
イト（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製以下ＨＡＰと略記する）を充
填した。泳動を続は目的バンドがＨＡ Ｐに吸着したら
、パスツールピペットにてＤＮＡ断片の吸着したＨＡＰ
を回収し、１０ｍＭ ）リス塩酸（ｐ＋＋ ７．５ ＞
で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −５０カラム（１
ｃｍＸ２０ｃｍ）に重層した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ （
ｐＨ８，０）にてＨＡＰからＤＮＡ断片を解離させ、１
０ｍＭ）ＩＪス塩酸（ｐＨ７，５）にて溶出を続け、Ｄ
ＮΔ画分をえた。この両分をフェノール抽出、クロロホ
ルム抽出後、エタノール沈澱にて２．７ Ｋ ｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。以後このアガロースゲル電気泳動と
ＨＡＰを用いたＤＮＡ断片回収法をΔＧＥ−ＨΔＰと略
記する。
片を分離した。すなわぢ、ゲル上、目的とする２、 ７
ｋ ｂ断片の直前に溝を掘り、ハイトロキシルアパタ
イト（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製以下ＨＡＰと略記する）を充
填した。泳動を続は目的バンドがＨＡ Ｐに吸着したら
、パスツールピペットにてＤＮＡ断片の吸着したＨＡＰ
を回収し、１０ｍＭ ）リス塩酸（ｐ＋＋ ７．５ ＞
で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −５０カラム（１
ｃｍＸ２０ｃｍ）に重層した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ （
ｐＨ８，０）にてＨＡＰからＤＮＡ断片を解離させ、１
０ｍＭ）ＩＪス塩酸（ｐＨ７，５）にて溶出を続け、Ｄ
ＮΔ画分をえた。この両分をフェノール抽出、クロロホ
ルム抽出後、エタノール沈澱にて２．７ Ｋ ｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。以後このアガロースゲル電気泳動と
ＨＡＰを用いたＤＮＡ断片回収法をΔＧＥ−ＨΔＰと略
記する。
このＤＮＡ断片４０μｇを２０ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｈ
７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ１２．１０ｍＭジチオス
レイトールを含む全量１００μｌの溶液に溶かし、制限
酵素）１ａｅｎｌＯ単位を加え、３７℃で１５分間反応
させ、ＤＮＡ断片の部分消化を行った。この反応液をＡ
ＧＥ、）ｊＡＰ法にて回収し、１．７９５塩基対（ｂｐ
）のＤＮＡ断片５μｇを得た。このＤＮＡ断片５μｇを
５０ｍＭトリス塩酸（ｐ Ｈ７，８＞、５ｍＭＭｇＣβ
２および１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に溶かし
、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを各１
ｍＭ なるように加え、さらに大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片〔ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（以下ＢＲＬと略記する）社製〕１５単位を加
え、１５℃で３時間埋め込み（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応を
行った。
７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ１２．１０ｍＭジチオス
レイトールを含む全量１００μｌの溶液に溶かし、制限
酵素）１ａｅｎｌＯ単位を加え、３７℃で１５分間反応
させ、ＤＮＡ断片の部分消化を行った。この反応液をＡ
ＧＥ、）ｊＡＰ法にて回収し、１．７９５塩基対（ｂｐ
）のＤＮＡ断片５μｇを得た。このＤＮＡ断片５μｇを
５０ｍＭトリス塩酸（ｐ Ｈ７，８＞、５ｍＭＭｇＣβ
２および１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液に溶かし
、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを各１
ｍＭ なるように加え、さらに大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片〔ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（以下ＢＲＬと略記する）社製〕１５単位を加
え、１５℃で３時間埋め込み（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応を
行った。
一方、ＥｃｏＲＩリンカ−（全酒造社製）４、８ ｐ、
ｇを５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
ＭｇＣＣ，５ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ Ａ
ＴＰを含む全量３０μｌの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（全酒造社製）５単位を加え、リン酸
化反応を行った。リン酸化したＥｃｏＲＩリンカ−２，
４μｇを先の）ｌａｅｌＩ部分消化断片５μｇと混合し
、２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ１２ １０ｍＭジチオメチオストルおよび１ｍＭ
ＡＴＰを含む全量５０μｌの溶液に溶かし、２．５単位
のＴ４ＤＮΔリガーゼを加え、４℃で１６時間結合反応
を行った後、エタノール沈澱により全ＤＮＡを回収した
。
ｇを５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ
ＭｇＣＣ，５ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ Ａ
ＴＰを含む全量３０μｌの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（全酒造社製）５単位を加え、リン酸
化反応を行った。リン酸化したＥｃｏＲＩリンカ−２，
４μｇを先の）ｌａｅｌＩ部分消化断片５μｇと混合し
、２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ１２ １０ｍＭジチオメチオストルおよび１ｍＭ
ＡＴＰを含む全量５０μｌの溶液に溶かし、２．５単位
のＴ４ＤＮΔリガーゼを加え、４℃で１６時間結合反応
を行った後、エタノール沈澱により全ＤＮＡを回収した
。
ＥｃｏＲＩ！Ｊンカーの付いたＤＮＡ断片４μｇを２０
ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｈ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＡ２
右よび６０ｍＭ ＮａＣ１を含む溶液１００μｆｆｌに
溶かし、ＥｃｏＲＩおよび）１ｉｎｄｌ［Ｉを各５単位
ずつ加え、３７℃で２時間消化反応を行った。この反応
液から八〇Ｅ。
ｍＭ）リス塩酸（ｐ Ｈ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＡ２
右よび６０ｍＭ ＮａＣ１を含む溶液１００μｆｆｌに
溶かし、ＥｃｏＲＩおよび）１ｉｎｄｌ［Ｉを各５単位
ずつ加え、３７℃で２時間消化反応を行った。この反応
液から八〇Ｅ。
ＦＩＡＰ法により１．４５３塩基対のＥｃｏＲＩ−ト１
ｉｎｄＩＩ［消化断片１．５μｇを得た。
ｉｎｄＩＩ［消化断片１．５μｇを得た。
一方、ｐＢＲ３２２［Ｂｏｌ １ｖａｒら、Ｇｅｎａ、
２．９５ （１９７７））（４，４Ｋｂ）の５μｇを２
０ｍＭ）リス塩酸、ｌＱｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む１００μｌの溶液に溶かし
、ＥｃｏＲＩおよびＨｊｎｄＩＩＩを各５単位加え、３
７℃で２時間消化し、へ〇Ｅ−ＨＡＰ法により約４．３
Ｋ ｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［ｒ断片２．５ ｐ
ｇを得た。
２．９５ （１９７７））（４，４Ｋｂ）の５μｇを２
０ｍＭ）リス塩酸、ｌＱｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｍ
Ｍジチオスレイトールを含む１００μｌの溶液に溶かし
、ＥｃｏＲＩおよびＨｊｎｄＩＩＩを各５単位加え、３
７℃で２時間消化し、へ〇Ｅ−ＨＡＰ法により約４．３
Ｋ ｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［ｒ断片２．５ ｐ
ｇを得た。
この断片０．２μｇと前記ｐＡＴＫＯ３がらの１、４５
３塩基対のＥｃ ｏＲＩ−Ｈｉ ｎｄ１ｍ断片０．３５
μｇを２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ
ＭｇＣＬ 、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ
ＡＴＰを含む全量５０μｍの溶液に溶かし、２．５単
位のＴ４ＤＮΔリガーゼを加え、４℃で１６時間結合反
応を行った。
３塩基対のＥｃ ｏＲＩ−Ｈｉ ｎｄ１ｍ断片０．３５
μｇを２０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ
ＭｇＣＬ 、１０ｍＭジチオスレイトールおよび１ｍＭ
ＡＴＰを含む全量５０μｍの溶液に溶かし、２．５単
位のＴ４ＤＮΔリガーゼを加え、４℃で１６時間結合反
応を行った。
この反応液を用いて常法により大腸菌に−１２、ＨＢＩ
ＯＩ株ＣＢｏｌｉｖａｒ ら、Ｇｅｎａ２．７５ （１
９７７）］を形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｐ”）
の菌株を得た。本菌株からプラスミドを常法により分離
し、組換え体プラスミドｐＡＴＫ１０５を得た。ｐＡＴ
Ｋ １０５の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ ｎｄＩＩＩお
よびＰｓｔＩで消化してＡＧＥにより確認した。プラス
ミドｐΔＴＫ１０５を含む大腸菌に−１２，Ｈ８１０１
株は工業技術院微生物工業技術研究所（微工研） Ｂｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＡＴＫ １０５ 、
ＦＥＲＭ ＢＰ−３４０として寄託されている。
ＯＩ株ＣＢｏｌｉｖａｒ ら、Ｇｅｎａ２．７５ （１
９７７）］を形質転換し、アンピシリン耐性（Ａｐ”）
の菌株を得た。本菌株からプラスミドを常法により分離
し、組換え体プラスミドｐＡＴＫ１０５を得た。ｐＡＴ
Ｋ １０５の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ ｎｄＩＩＩお
よびＰｓｔＩで消化してＡＧＥにより確認した。プラス
ミドｐΔＴＫ１０５を含む大腸菌に−１２，Ｈ８１０１
株は工業技術院微生物工業技術研究所（微工研） Ｂｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＡＴＫ １０５ 、
ＦＥＲＭ ＢＰ−３４０として寄託されている。
参考例２． ｐにＹＰｌｏｏの造成：
５０μｇのｐＫＹＰｌｏ（特開昭５８−１１０６００に
記載の方法で製造した）に５０単位のＨｈａｌを加え、
１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣｊ！
２．６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む全量１０
０μｌの反応液中３７℃で２時間反応させた。）Ｉｈａ
ｌによる消化後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動［
：Ａ、 ＭｌＭａｘａｍ ら： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
。
記載の方法で製造した）に５０単位のＨｈａｌを加え、
１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣｊ！
２．６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む全量１０
０μｌの反応液中３７℃で２時間反応させた。）Ｉｈａ
ｌによる消化後５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動［
：Ａ、 ＭｌＭａｘａｍ ら： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、、第７４巻、５６０頁（１９７７
年）、以下ＰＡＧＥと略す〕により、ｔｒｐプロモータ
−を含む約１８０ｂｐＩ：ＤＤＮＡ断片を精製した。
年）、以下ＰＡＧＥと略す〕により、ｔｒｐプロモータ
−を含む約１８０ｂｐＩ：ＤＤＮＡ断片を精製した。
この際、このＤＮＡ断片以外の２つのＤＮＡ断片がＰＡ
ＧＥによって良好に分離できないために一緒に精製され
る。精製した３つのＤＮＡ断片（言］約４ｔ−ｚｇ）を
５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、７ｍＭ ＭｇＣＡ
２．１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ ５
ｍＭ ｄＡＴＰ 、０．２５ｍＭ ｄｃＴＰ 、０．２
５ｍＭ ｄＧＴＰ 。
ＧＥによって良好に分離できないために一緒に精製され
る。精製した３つのＤＮＡ断片（言］約４ｔ−ｚｇ）を
５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、７ｍＭ ＭｇＣＡ
２．１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ ５
ｍＭ ｄＡＴＰ 、０．２５ｍＭ ｄｃＴＰ 、０．２
５ｍＭ ｄＧＴＰ 。
０．２５ｍＭ ｄＴＴＰを含む全量３０μｌの反応液中
で、８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ ４１ｅｎｏ
ｗ断片を加え、１５℃、２時間反応させた。この反応に
より、ＨｈａＩ消化によって生じた３′−突出末端はＤ
ＮＡポリポリーゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片が持つ３′−５
′のエキソヌクレアー士活性および５’−３’の修複合
成活性により平坦末端に変えられる。続いて７２℃、３
０分間の熱処理によってＤＮＡポリポリーゼ■・ｋｌｅ
ｎｏｗ断片を失活させた後、ＩＭＮａＣＡでＮａＣｊ！
！度を５０ｍＭとし、８単位のＨｉｎｄｌＩＩを加え、
３７℃で２時間反応させた。
で、８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌ ４１ｅｎｏ
ｗ断片を加え、１５℃、２時間反応させた。この反応に
より、ＨｈａＩ消化によって生じた３′−突出末端はＤ
ＮＡポリポリーゼ■・Ｋｌｅｎｏｗ断片が持つ３′−５
′のエキソヌクレアー士活性および５’−３’の修複合
成活性により平坦末端に変えられる。続いて７２℃、３
０分間の熱処理によってＤＮＡポリポリーゼ■・ｋｌｅ
ｎｏｗ断片を失活させた後、ＩＭＮａＣＡでＮａＣｊ！
！度を５０ｍＭとし、８単位のＨｉｎｄｌＩＩを加え、
３７℃で２時間反応させた。
ト１ｉｎｄｌｌｌによる消化後、ＰＡＧＥにより、ｔｒ
ｐプロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片を分離
精製した。
ｐプロモーターを含む約１００ｂｐのＤＮＡ断片を分離
精製した。
一方、５μｇのプラスミドｐＢＲ３２２に８単位のＥＣ
０ＲＩを加え、１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、５
０ｍＭ ＮａＣ１１７ｍＭ ＭｇＣＡ２．６ｍＭ ２
−メルカプトエタノールを含む全量２０μｌの反応液中
、３７℃で２時間反応させた。反応後、フェノールおよ
びクロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、ＤＮＡ断片
を全量２０μｍの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）１（１（ｐＨ
７，６）、７ｍＭ ＭｇＣｆｆ１２．６ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ 、 ０．
２５ｍＭｄ ＣＴ Ｐ、 ０．２５ｍＭ ｄＧＴＰ 、
０．２５ｍＭ ｄＴＴＰに溶解し、続いて８単位の大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・Ｋｌｅｎｏｗ 断片を加え
、１５℃、２時間反応させた。ＥｃｏＲＩ消化によって
生じた５′−突出末端をＤＮＡポリポリーセ■・Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片の修複合成活性により平坦末端に変えた。７
２℃、３０分間の熱処理によって、ＤＮＡポリポリーセ
Ｉ・Ｋｌｅｎｏｗ断片を失活させた後、ＩＭＮａＣＡで
ＮａＣｊ７濃度を５０ｍＭとし、８単位の）ＩｉｎｄＩ
ＩＩを加え、３７℃で２時間反応させた。ＨｉｎｄＩＩ
Ｉによる消化後、低融点アガロースゲル電気泳動法によ
り大きいプラスミドＤＮＡ断片（約４．３３ Ｋ ｂ
）を精製した。
０ＲＩを加え、１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、５
０ｍＭ ＮａＣ１１７ｍＭ ＭｇＣＡ２．６ｍＭ ２
−メルカプトエタノールを含む全量２０μｌの反応液中
、３７℃で２時間反応させた。反応後、フェノールおよ
びクロロホルム抽出とエタノール沈殿の後、ＤＮＡ断片
を全量２０μｍの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）１（１（ｐＨ
７，６）、７ｍＭ ＭｇＣｆｆ１２．６ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ 、 ０．
２５ｍＭｄ ＣＴ Ｐ、 ０．２５ｍＭ ｄＧＴＰ 、
０．２５ｍＭ ｄＴＴＰに溶解し、続いて８単位の大
腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・Ｋｌｅｎｏｗ 断片を加え
、１５℃、２時間反応させた。ＥｃｏＲＩ消化によって
生じた５′−突出末端をＤＮＡポリポリーセ■・Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片の修複合成活性により平坦末端に変えた。７
２℃、３０分間の熱処理によって、ＤＮＡポリポリーセ
Ｉ・Ｋｌｅｎｏｗ断片を失活させた後、ＩＭＮａＣＡで
ＮａＣｊ７濃度を５０ｍＭとし、８単位の）ＩｉｎｄＩ
ＩＩを加え、３７℃で２時間反応させた。ＨｉｎｄＩＩ
Ｉによる消化後、低融点アガロースゲル電気泳動法によ
り大きいプラスミドＤＮＡ断片（約４．３３ Ｋ ｂ
）を精製した。
このようにして得られたｔｒｐプロモーターを含む約１
００ｂｐのＤＮＡ断片〈約５０ｎｇ、）とｐＢＲ３２２
由来の約４．３３ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約０．２μｇ
）に５０ｎＨの５′−リン酸化されたＸｈｏｌリンカ−
（ｐｃｃＴｃＧＡＧＧ、−］５ボレイティブ・リサーチ
社製）を加え、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６＞、１
０ｍＭ Ｍ ｇ Ｃｊ！ ２ ！１０ｍＭジチオスレイ
トール、０．５ｍＭ ＡＴＰを含む全量２０μｌの反応
液中で、１単位のＴ４ＤＮΔリガーゼを加え、４℃で４
０時間、結合反応を行った。このようにして得られる組
換えプラスミドＤＮＡを用い、大腸菌８８１０１株を形
質転換し、得られるＡｐ” 、ＴｃＲの形質転換株が持
つプラスミドＤＮＡを分離精製した。これらのプラスミ
ドＤＮＡを８種類の制限酵素ＥｃｏＲＩ。
００ｂｐのＤＮＡ断片〈約５０ｎｇ、）とｐＢＲ３２２
由来の約４．３３ Ｋ ｂのＤＮＡ断片（約０．２μｇ
）に５０ｎＨの５′−リン酸化されたＸｈｏｌリンカ−
（ｐｃｃＴｃＧＡＧＧ、−］５ボレイティブ・リサーチ
社製）を加え、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７，６＞、１
０ｍＭ Ｍ ｇ Ｃｊ！ ２ ！１０ｍＭジチオスレイ
トール、０．５ｍＭ ＡＴＰを含む全量２０μｌの反応
液中で、１単位のＴ４ＤＮΔリガーゼを加え、４℃で４
０時間、結合反応を行った。このようにして得られる組
換えプラスミドＤＮＡを用い、大腸菌８８１０１株を形
質転換し、得られるＡｐ” 、ＴｃＲの形質転換株が持
つプラスミドＤＮＡを分離精製した。これらのプラスミ
ドＤＮＡを８種類の制限酵素ＥｃｏＲＩ。
Ｘｈｏｌ、ＨｉｎｄｌＩｌ、Ｈａｅｎｌ、Ｃ１ａＬＴａ
ｑｌ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製）、Ｒｓ
ａｌ （二ニー・イングランド・バイオラボ社製）で消
化することにより、約１００ｂｐのｔｒｐプロモーター
を含むＤＮＡ断片とＸｈ。
ｑｌ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製）、Ｒｓ
ａｌ （二ニー・イングランド・バイオラボ社製）で消
化することにより、約１００ｂｐのｔｒｐプロモーター
を含むＤＮＡ断片とＸｈ。
Ｉリンカ−がクローン化されたプラスミドを選び、りＫ
ＹＰ１００と命名した。
ＹＰ１００と命名した。
参考例３
ｔｒｐプロモーターおよびリポソーム結合部位の下流に
翻訳開始信号ΔＴＧおよびｓｐｈ Ｉ切断部位を有する
プラスミドベクターｐＴｒＳ３の造成： 参考例２で造成されたｐＫｙｐ １００から次のように
してｐＴｒｓ３を得る。５μｇのｐＫＹＰｌｏｏを１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！ （ｐＨ７，５）、７ｍＭ
ＭｇＣｊ！２．６ｍＭ ２−メルカブトエ９）−）Ｌｒ
を含む全量２０μｌの反応液中で、５単位のＣ１ａＩを
加え、３７℃、２時間反応させた。次いで、６５℃、５
分間の熱処理によって反応を停止させた後、２μβの１
００ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、７０ｍＭ ＭｇＣ
ｊ！２．１．ＯＭ ＮａＣｌ１．６０ ｍＭ ２−メル
カプトエタノールと１６μｌの蒸留水と７単位の５ｐｈ
Ｉ（ベーリンガー・マンハイム社製）を加え、３７℃、
２時間反応させた。６５℃、５分間の熱処理によって反
応を停止させた後、低融点アガロースゲル電気泳動法に
より、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約３．８２Ｋｂ）
を精製した。
翻訳開始信号ΔＴＧおよびｓｐｈ Ｉ切断部位を有する
プラスミドベクターｐＴｒＳ３の造成： 参考例２で造成されたｐＫｙｐ １００から次のように
してｐＴｒｓ３を得る。５μｇのｐＫＹＰｌｏｏを１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！ （ｐＨ７，５）、７ｍＭ
ＭｇＣｊ！２．６ｍＭ ２−メルカブトエ９）−）Ｌｒ
を含む全量２０μｌの反応液中で、５単位のＣ１ａＩを
加え、３７℃、２時間反応させた。次いで、６５℃、５
分間の熱処理によって反応を停止させた後、２μβの１
００ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，５）、７０ｍＭ ＭｇＣ
ｊ！２．１．ＯＭ ＮａＣｌ１．６０ ｍＭ ２−メル
カプトエタノールと１６μｌの蒸留水と７単位の５ｐｈ
Ｉ（ベーリンガー・マンハイム社製）を加え、３７℃、
２時間反応させた。６５℃、５分間の熱処理によって反
応を停止させた後、低融点アガロースゲル電気泳動法に
より、大きいプラスミドＤＮＡ断片（約３．８２Ｋｂ）
を精製した。
次にまず２種のオリゴヌクレオチド５ ’−ＣＧＡＴΔ
ＡＧＣＴΔＴＧＣＡ’ＩＣ，−３’および５′−ＣＡＴ
ＡＧＣＴＴＡＴ−３’をリン酸トリエステル法によって
合成した。これら２種の合成オリゴヌクレオチドを５′
−リン酸化した後に、それぞれの濃度が２０μＭとなる
ように、１０ ｍ Ｍ ） ＩＪス塩酸（ｐ Ｈ７，５
）、１００ｍＭ Ｎａ（Ｊ！、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で混
合し、６５℃に１０分間、３７℃に１２０分間、ついで
室温に１２０分間放置し、両者を対合させた。両者を対
合させると下図に示すように対合によってできた２末鎖
Ｄ Ｎ Ａのそれぞれの端が ｐＣＧＡＴΔＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧ ＴＡＴＴＣＧＡＴΔＣｐ Ｃ１ａｌ消化あるいはＳ ｐ ｈ Ｔ消化によって生じ
る粘着末端と連結でき、しかも連結後、Ｃｏａｌ切断部
位あるいはＳｐｈ Ｉ切断部位が再形成される構造を持
つ。この２種の合成オリゴヌクレオチドを対合させたも
のに上記の精製したプラスミドＤＮＡ断片を加え、両者
をＴ／ＩＤＮΔリガーゼを用い連結させた。すなわち、
２種の合成オリゴヌクレオチド、ｐＣＧＡＴＡＡＧＣＴ
Δ’ｒ ｃ ｃΔＴＧおよびｐｃΔＴΔＧＣＴＴΔＴを
それぞれ１ピコモルずつ対合させ、さらに約０．１５μ
ｇの精製したプラスミドＤＮＡ断片を加え、２０ｍＭ）
！１ス塩酸（１）Ｈ７，６）、１０ｍＭＭｇＣｊ２２．
１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ ｍ Ｍ ΔＴＰ
を含む全量２０μｌの反応液中で、０，５単位のＴ４Ｄ
Ｎ△リガーゼを加え、４℃で１６時間結合反応を行った
。
ＡＧＣＴΔＴＧＣＡ’ＩＣ，−３’および５′−ＣＡＴ
ＡＧＣＴＴＡＴ−３’をリン酸トリエステル法によって
合成した。これら２種の合成オリゴヌクレオチドを５′
−リン酸化した後に、それぞれの濃度が２０μＭとなる
ように、１０ ｍ Ｍ ） ＩＪス塩酸（ｐ Ｈ７，５
）、１００ｍＭ Ｎａ（Ｊ！、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で混
合し、６５℃に１０分間、３７℃に１２０分間、ついで
室温に１２０分間放置し、両者を対合させた。両者を対
合させると下図に示すように対合によってできた２末鎖
Ｄ Ｎ Ａのそれぞれの端が ｐＣＧＡＴΔＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧ ＴＡＴＴＣＧＡＴΔＣｐ Ｃ１ａｌ消化あるいはＳ ｐ ｈ Ｔ消化によって生じ
る粘着末端と連結でき、しかも連結後、Ｃｏａｌ切断部
位あるいはＳｐｈ Ｉ切断部位が再形成される構造を持
つ。この２種の合成オリゴヌクレオチドを対合させたも
のに上記の精製したプラスミドＤＮＡ断片を加え、両者
をＴ／ＩＤＮΔリガーゼを用い連結させた。すなわち、
２種の合成オリゴヌクレオチド、ｐＣＧＡＴＡＡＧＣＴ
Δ’ｒ ｃ ｃΔＴＧおよびｐｃΔＴΔＧＣＴＴΔＴを
それぞれ１ピコモルずつ対合させ、さらに約０．１５μ
ｇの精製したプラスミドＤＮＡ断片を加え、２０ｍＭ）
！１ス塩酸（１）Ｈ７，６）、１０ｍＭＭｇＣｊ２２．
１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ ｍ Ｍ ΔＴＰ
を含む全量２０μｌの反応液中で、０，５単位のＴ４Ｄ
Ｎ△リガーゼを加え、４℃で１６時間結合反応を行った
。
このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用い
、大腸菌８８１０１株を形質転換し、得られるアンピシ
リン耐性、テトラサイクリイ感受性（Ａ ｐ ” Ｔｃ
ｓ ）の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精
製した。これらのプラスミドＤＮ。
、大腸菌８８１０１株を形質転換し、得られるアンピシ
リン耐性、テトラサイクリイ感受性（Ａ ｐ ” Ｔｃ
ｓ ）の形質転換株が持つプラスミドＤＮＡを分離精
製した。これらのプラスミドＤＮ。
をＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、Ｃ１ａｌ。
ｓｐｈ Ｉなどの制限酵素で消化することにより、目的
のプラスミドベクターｐＴｒＳ３が造成されたことをｍ
認した。さらにｐＴｒＳ３のＣｌａｌ部位からＳｐｈ
１部位までのＤＮＡの塩基配列がＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣ
ＴＡＴＧＣＡＴＧＣであることをマキサム・ギルバート
の方法［八、 Ｍ。
のプラスミドベクターｐＴｒＳ３が造成されたことをｍ
認した。さらにｐＴｒＳ３のＣｌａｌ部位からＳｐｈ
１部位までのＤＮＡの塩基配列がＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣ
ＴＡＴＧＣＡＴＧＣであることをマキサム・ギルバート
の方法［八、 Ｍ。
Ｍ ａ ’ｘ ａ ｍ ら 二 Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ
ｌ Δ ｃａｄ。
ｌ Δ ｃａｄ。
Ｓｃｉ第７４巻、５６０頁（１９７７年）〕を用い確認
した。ｐＴｒＳ３を含む大腸菌菌株は工業技術院微生物
工業技術研究所にエッシエリヒア・コ リ （Ｂｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＩＴｒＳ−３ＦＥＲＭＢ
Ｐ〜３２８として寄託されている。
した。ｐＴｒＳ３を含む大腸菌菌株は工業技術院微生物
工業技術研究所にエッシエリヒア・コ リ （Ｂｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＩＴｒＳ−３ＦＥＲＭＢ
Ｐ〜３２８として寄託されている。
第１図はｐΔＦＡＩＯおよびｐΔＦＣ６の造成のフロー
シートを示す。 （財団法人）癌 研 究 会 理事長 安 西 浩 ＼ 手 続 補 正 書 昭和６θ年３月２θ日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２４１８７号 ２、発明の名称 成人工細胞白血病ウィルス抗原ペプチド誘導体３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置： ０３−２０１
−７２１１ 内線２７５１）５、補正の内容 （１つ 明細書第５頁２０−２１行目の［（Ｈｉｎｕｍ
ａ ｅｔａｌ、 （１９８０）〕Ｊを「〔吉田ら（Ｙｏ
ｓｈｉｄａ。 ｅｔａｌ、）、プロシープインク・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・ザイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ 、７９ 、 ２０
３１−６２０３５ （１９８２） ） Ｊに訂正する。 （２）明細書第５頁３行目の「（同上文献）」を「〔日
沼ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｃｌ、Ｓｃｉ、、Ｕ
ＳＡ卦、６４７６〜６４８０ 、（１９８０） 〕Ｊに
訂正する。 （３）明細書第１１頁１２行目の「より、造成」を「よ
り造成」に訂正する。 （４）明細書第１２頁６行目および同１４頁１０行目の
「第２図」を「第１図」に訂正する。 （５）明細書箱１５頁１６行目の「Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、Ｊを［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジイ（Ｊ、 Ｍｏｌ、 ［１ｉｏｌ、 ） Ｊに訂正
する。 （６）明細書箱１５頁２０行目の「Ｊ、 Ａｍ、Ｃｈｅ
ｍ、 Ｓｏｃ、 Ｊを「ジャーナル・オブ・ケミカル・
ソザイエティ（Ｊ、 Ａｍ、’ Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、
） Ｊに訂正する。 （７）明細書第１７頁４行目の「Ｊ、Ｂａｃｔ、 Ｊを
「ジャーナル・オブ・ハクテリオロシイ（ＪＢａｃｔ、
） Ｊに訂正する。 （８）明細書第１８頁１１行目の「ＮＨ２）ＩＰＯ４，
Ｊを削除する。 （９）明細書第１８頁２３行目の「ＮａｔＩＩｒｅ」を
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） Ｊに訂正する。 αＱ 明細書箱１９頁１〜２行目の［口ｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＧｅｎｅｔｉｃｓＪ
を「エクスペリメンツーイン・モレキュラー・ジエネテ
ィクス （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） Ｊに訂正する。 Ｑｌ） 明細書第１９頁６行目のｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＪを［ヌクレイツク瞭アシ
ッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ） Ｊに訂正する。 Ｑ２１ 明細書第１９頁１０〜１２行目を次のとおり訂
正する。 ｒｇａｇとβ−ガラクトシダーセとの融合蛋白質を生産
する組換えプラスミドｐＡＦＡ１０の造成（第１図）。 」 αつ 明細書第２１頁６行目の「一方」の後に１１０翼
の」を加入する。 αつ 明細書第２１頁７行目のｒ ２３８Ｊをｒ ３２
８Ｊに訂正する。 Ｑ５） 明細書第２１頁１３〜１６行目の「このＤＮＡ
を回収した。」を削除する。 Ｏｅ 明細書第２６頁２０行目のｒ （１） Ｊを削除
する。 αつ 明細書第２９頁１３行目の「ＧｅｎｅＪを「ジー
ン（Ｇｅｎｅ） Ｊに訂正する。 ０の 明細書第５頁ｌＯ行目の「８種類の」を削除する
。
シートを示す。 （財団法人）癌 研 究 会 理事長 安 西 浩 ＼ 手 続 補 正 書 昭和６θ年３月２θ日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第２４１８７号 ２、発明の名称 成人工細胞白血病ウィルス抗原ペプチド誘導体３、補正
をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（置： ０３−２０１
−７２１１ 内線２７５１）５、補正の内容 （１つ 明細書第５頁２０−２１行目の［（Ｈｉｎｕｍ
ａ ｅｔａｌ、 （１９８０）〕Ｊを「〔吉田ら（Ｙｏ
ｓｈｉｄａ。 ｅｔａｌ、）、プロシープインク・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・ザイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、ＵＳＡ 、７９ 、 ２０
３１−６２０３５ （１９８２） ） Ｊに訂正する。 （２）明細書第５頁３行目の「（同上文献）」を「〔日
沼ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｃｌ、Ｓｃｉ、、Ｕ
ＳＡ卦、６４７６〜６４８０ 、（１９８０） 〕Ｊに
訂正する。 （３）明細書第１１頁１２行目の「より、造成」を「よ
り造成」に訂正する。 （４）明細書第１２頁６行目および同１４頁１０行目の
「第２図」を「第１図」に訂正する。 （５）明細書箱１５頁１６行目の「Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉ
ｏｌ、Ｊを［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジイ（Ｊ、 Ｍｏｌ、 ［１ｉｏｌ、 ） Ｊに訂正
する。 （６）明細書箱１５頁２０行目の「Ｊ、 Ａｍ、Ｃｈｅ
ｍ、 Ｓｏｃ、 Ｊを「ジャーナル・オブ・ケミカル・
ソザイエティ（Ｊ、 Ａｍ、’ Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、
） Ｊに訂正する。 （７）明細書第１７頁４行目の「Ｊ、Ｂａｃｔ、 Ｊを
「ジャーナル・オブ・ハクテリオロシイ（ＪＢａｃｔ、
） Ｊに訂正する。 （８）明細書第１８頁１１行目の「ＮＨ２）ＩＰＯ４，
Ｊを削除する。 （９）明細書第１８頁２３行目の「ＮａｔＩＩｒｅ」を
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） Ｊに訂正する。 αＱ 明細書箱１９頁１〜２行目の［口ｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＧｅｎｅｔｉｃｓＪ
を「エクスペリメンツーイン・モレキュラー・ジエネテ
ィクス （Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） Ｊに訂正する。 Ｑｌ） 明細書第１９頁６行目のｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈＪを［ヌクレイツク瞭アシ
ッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ） Ｊに訂正する。 Ｑ２１ 明細書第１９頁１０〜１２行目を次のとおり訂
正する。 ｒｇａｇとβ−ガラクトシダーセとの融合蛋白質を生産
する組換えプラスミドｐＡＦＡ１０の造成（第１図）。 」 αつ 明細書第２１頁６行目の「一方」の後に１１０翼
の」を加入する。 αつ 明細書第２１頁７行目のｒ ２３８Ｊをｒ ３２
８Ｊに訂正する。 Ｑ５） 明細書第２１頁１３〜１６行目の「このＤＮＡ
を回収した。」を削除する。 Ｏｅ 明細書第２６頁２０行目のｒ （１） Ｊを削除
する。 αつ 明細書第２９頁１３行目の「ＧｅｎｅＪを「ジー
ン（Ｇｅｎｅ） Ｊに訂正する。 ０の 明細書第５頁ｌＯ行目の「８種類の」を削除する
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１１ｒ＆人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素
との融合蛋白質。 （２）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドがｇａｇ
遺伝子によりコードされるペプチドであることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の融合蛋白質。 （３）ｇａｇ遺伝子がｇａｇ遺伝子中のｐ２４領域であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の融合蛋
白質。 （４）該酵素がβ−ガラクトシダー七、パーオキシダー
ゼおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特許請
求の範囲第３項記載の融合蛋白質。 （５）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素と
の融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組
換え体プラスミド。 （６）トリプトファンプロモーターまたはラクトースプ
ロモーターを有することを特徴とする特許請求の範囲第
５項記載の組換え体プラスミド。 （７）該酵素がβ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダー
ゼおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特許請
求の範囲第５項記載の組換え体プラスミド。 （８） ｐ Ａ Ｆ Ａ １０であることを特徴とする
特許請求の範囲第５項記載の組換え体プラスミド。 （９）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素と
の融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組
換え体プラスミドを保有する微生物を培地に培養し、培
養物中に成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素
との融合蛋白質を生成蓄積せしめ、該培養物から融合蛋
白質を採取することを特徴とする成人Ｔ細胞白血病ウィ
ルス抗原とβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質の製造
法。 ＯＱ 該組換え体プラスミドがトリプトファンプロモー
ターまたはラクトースプロモーターを有する組換え体プ
ラスミドであることを特徴とする特許請求の範囲第９項
記載の方法。 （１１）該酵素がβ−ガラクトーシダーゼ、パーオキシ
ダーゼおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特
許請求の範囲第９項記載の方法。 （１２）該微生物がエッシェリヒア属に属することを特
徴とする特許請求の範囲第９または第１０項記載の方法
。 （１３）該微生物がエッシエリヒア・コリに属すること
を特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の方法。 （１４）該組換え体プラスミドがｐＡＦＡ １０である
ことを特徴とする特許請求の範囲第９項記載の方法。 （１５）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素
との融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた
組換え体プラスミドを含む微生物。 （１６）該組換え体プラスミドがトリプトファンプロモ
ーターを有する組換え体プラスミドであることを特徴と
する特許請求の範囲第１５項記載の微生物。 （１７）該酵素がβ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダ
ーゼおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特許
請求の範囲第１５項記載の微生物。 （１８）該微生物がエッシエリヒア・コリに属すること
を特徴とする特許請求の範囲第１５項記載の微生物。 （１９）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素
との融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片から酵素をコー
ドするＤＮＡ断片を除いて得られる成人Ｔ細胞白血病ウ
ィルス抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み込ん
だ組換え体プラスミド。 （２０）該酵素がβ−ガラクトシダーゼ、ノく−オキシ
ダーゼおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特
許請求の範囲第１９項記載の組換え体プラスミド。 （２１） ｐ Ａ Ｆ Ｃ６であることを特徴とする特
許請求の範囲第１９項記載の組換え体プラスミド。 （２２）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素
との融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片から酵素をコー
ドするＤＮＡ断片を除いて得られる成人Ｔ細胞白血病ウ
ィルス抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み込ん
だ組換え体プラスミドを含む微生物。 （２３）該酵素がβ−ガラクトシダーセ、パーオキシダ
ーセおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特許
請求の範囲第２２項記載の微生物。 （２４）成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドと酵素
との融合蛋白質をコードするＤＮＡ断片から酵素をコー
ドするＤＮＡ断片を除いて得られる成人Ｔ細胞白血病ウ
ィルス抗原ペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み込ん
だ組換え体プラスミドを含む微生物を培地に培養し、培
養物中に成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドを生成
蓄積せしめ、該培養物から該ペプチドを採取することを
特徴とする成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ペプチドの製
造法。 （２５）該酵素がβ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダ
ーゼおよびアルカリフォスファターゼから選ばれる特許
請求の範囲第２４項記載の方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59024187A JPS60169498A (ja) | 1984-02-10 | 1984-02-10 | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド誘導体 |
| EP85101354A EP0152076B1 (en) | 1984-02-10 | 1985-02-08 | Derivative of adult t cell leukemia virus antigen peptide |
| DE198585101354T DE152076T1 (de) | 1984-02-10 | 1985-02-08 | Derivat des adult-t-zell-leukemiavirus-antigenpeptids. |
| DE8585101354T DE3577722D1 (de) | 1984-02-10 | 1985-02-08 | Derivat des adult-t-zell-leukemiavirus-antigenpeptids. |
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