JPH03500361A - ヒトｂ‐リンパ栄養性ウイルスの免疫学的に活性なタンパク質の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、工程： ａ１宿主細胞を組み換えベクターで形質転換し、前記組み換えベクターは免疫反 応性ＨＢＬＶタンパク質をエンコードするＨＢＬＶ　ＤＮＡ配列を発現可能な形 態で含有し、 ｂ１形質転換された宿主細胞を培養し、そしてｃ１タンパク質を宿主細胞から分 離する、からなる、ＨＢＬＶ免疫反応性タンパク質を産生ずる方法。

１５、宿主細胞はバクテリア細胞であり、そしてベクターはプラスミドである、 請求の範囲第１４項記載の方法。

１６、ＨＢＬＶ　ＤＮＡ配列は第３図のＤＮＡ配列である、請求の範囲第１４項 記載の方法。

１７、工程： ａ、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性である組み換え体ＨＢＬＶタンパク質を 取り付けて有する固相からなる抗原免疫吸着体を準備し、ｂ、試験すべき生物学 的流体の試料と前記免疫吸着体とインキュベーションし、前記インキュページタ ンは試料中の抗体を抗原免疫吸着体と複合化する条件下に実施し、 ｃ１前記免疫吸着体を試料から分離し、そしてｄ、前記免疫吸着体に結合した抗 体を試料中のＨＥＬＶに対する抗体として決定する、 からなる、生物学的流体中のＨＢＬＶに対する抗体を検出する方法。

ｌ８、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢの１（ｉｎｄｌ ｌｌサブゲノム断片の部分によりエンコードされる、請求の範囲第１７項記載の 方法。

１９、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質は第３図の配列のタンパク質またはその免 疫学的同等体である、請求の範囲第１７項記載の方法。

２０、生物学的流体はヒト血清または廁漿である、請求の範囲第１７項記載の方 法。

２１、免疫吸着体に結合した抗体を検出する工程は、ａ）生物学的流体を誘導す る種の免疫グロブリンに対する標識抗体と免疫吸着体をインキュベーションし、 ｂ）免疫吸着体を標識抗体から分離し、そしてＣ）免疫吸着体と関連する標識を 試料中のＨＢＬＶに対する抗体指示として検出する、 からなる、請求の範囲第１７項記載の方法。

２２、生物学的流体はヒト血清または血漿であり、そして標識抗体は標識抗ヒト Ｉｇ抗体である、請求の範囲第２１項記載の方法。

２３、工程： ａ）抗原免疫吸着体を準備し、前記免疫吸着体は免疫反応性の組み換え体ＨＢＬ Ｖタンパク質の本質的に均質な精製した調製物で被覆されたポリエチレンビーズ からなり、 ｂ）ヒト血漿または血清の試料と前記免疫吸着体とインキュベーションし、前記 インキュベーションは試料中の抗ＨＢＬＶ抗体を前記タンパク質と複合化する条 件下に実施し、 Ｃ）前記免疫吸着体を試料から分離し、ｄ）前記免疫吸着体を標識抗ヒｌ−１， ｇ抗体とインキュベーションし、ｅ）前記免疫吸着体を標識抗体の溶液から分離 し、そ［７てｆ）前記免疫吸着体と関連する標識を試料中の抗ＨＢＬＶタンパク 質の指示として検出する、 からなる、ヒト血漿または血清中のＨＢ　Ｌ　Ｖコアタンパク質に対する抗体を 検出する方法。

２４、）（ＢＬＶに対する抗体と免疫反応性の組み換え体ＨＢ　Ｌ　Ｖタンパク 質をそれに取り付けて有する固相支持体からなる免疫吸着体。

２５、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄｌｌ ｌサブゲノム断片の部分によりエンコードされる、請求の範囲第２４項記載の免 疫吸着体。

２６、構成成分： ａ、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性の組み換え体ＨＢＬＶタンパク質をそれ に取り付けて有する固相支持体からなる免疫吸着体、およびす、標識抗ヒトＩｇ 。

からなる、ＨＢＬＶ抗体を検出するムノアツセイの実施のだめのキット。

２７、ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄ工１■サブゲノ ム断片の０ＲＦ３のすべてまたは部分によりエンコードされる、請求の範囲第２ ６項記載のキット。

２８、さらに、構成成分： ｃ１試験すべき試料の希釈剤、 ｄ１陽性の制御、および ｅ１陰性の制御、 からなる、請求の範囲第２６項記載のキット。

２９、ＨＢＬＶに対する抗体免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質の免疫原量および 生理学的に許容されうるベヒクルからなる免疫原組成物。

３０、免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質は、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨ４ｎｄサ ブゲノム断片の領域によりエンコードされる、請求の範囲第２９項記載の免疫原 組成物。

３１、ＨＢＬＶタンパク質は第３図の配列によりエンコードされる、請求の範囲 第２９項記載の免疫原組成物。

明細書 ヒ）Ｂ−リンパ栄養性ウィルスの免疫学的に活性なタンパク質の発現 に ヒトＢ−リンパ栄養性ウィルス（ＨＢ　Ｌ　Ｖ）あ、ある種のリンパ増殖性の病 気をもつ幾人かの患者から最近分離された。Ｓ、Ｚ、サラフジン（Ｓａｌａｈｕ ｄｄｉｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３４．５９６　（１９８６） ；Ｓ、　Ｆ、ジョセ７ス（Ｊｐｓｅｐｈｓ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２ ３４．６０１　（１，９８６）、電子顕微鏡を使用する形態学的研究は、ヘルペ スウィルスの族における分類されたＨＢＬＶを有する。しかしながら、培養した 細胞中のウィルスの生物学的研究は、それを他の既知の形質転換性ヒトおよび霊 長類ウィルスと区別する、多くの特徴を有する。ＨＢＬＶは厳格な向性を有し、 そして新しく分離された細胞のみを感染する。それは細胞病理学の性質を有し、 そして毒素遺伝子リンパ球を感染後約２週以内に殺す。さらに、免疫化学的研究 により、種々の既知のヘルペスウィルス、例えば、ニブスティン・バール・ウィ ルス（ＥＢＶ）およびヒトサイトメガロウィルス（ＣＨＭＶ）はＨＢＬＶの交差 反応性をほとんどもたない。

ＨＢＬＶゲノムは、大きさが６０Ｘ１０’ダルトンより大きいＤＮＡの二重らせ んから成る。ＤＮＡの複製は、感染しＩ；細胞の核内で起こる。

ヴイリオンのＤＮＡは、１６２カブツマ−から構成されている二十面体のキャプ シド内に含有されている。ＨＢＬＶの構造および由来の研究は、慢性的に感染し ｆ：ＨＢＬＶを産生する細胞系に欠乏したため困難であった。少量のＨＢＬＶヴ イリオン粒子は、感染したコア血球培養の上澄み液やら精製された。精製したウ ィルスから分離されたＤＮＡを、Ｈ４ｎｄｌｌＩで消化し、そしてバクテリアの プラスミド中にクローニンクシた。１つのこのようなりローン、ｐＺＶＨ１４と 表示する、は部分的に特性決定された。参照、ジョセ７ス（Ｊｏ　ｓ　ｅ　ｐ　 ｓ）ら、５ｕｐｒａａＨＢＬＶおよび病気におけるこのウィルスの参加が発見さ れて、このウィルスの存在を検出することができる試験の要求が発生した。疑い 無＜、ＨＢＬＶは血液産生物を通して移送されうる。このウィルスの移送を防止 するために、血液産生物をスクリーニングして、血液産生物がＨＢＬＶで感染さ れた供与体から得られＩ；かどうかを決定することができるが重要である。

血液中のウィルスに対する抗体の存在は、ウィルスに対する暴露のインジケータ ーである。ＨＢＬＶに対する抗体についての免疫化学的試験は、全ウィルスの使 用に基づくか、あるいは抗体の検出のための抗原として分離されたウィルス成分 の使用に基づく。しかしながら、ウィルスの増殖のだめの適合性の宿主細胞系は 開発されてきいないので、試験において使用する試薬を供給するための大量のウ ィルスの産生は困難であることがある。

発明の説明 本発明は、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫学的に反応性性である、分離された、組 み換え体ＨＢＬＶタンパク質、および前記タンパク質を使用するＨＢＬＶに対す る抗体を検出する免疫化学的アッセイに関する。本発明は、血清ＨＢＬＶ惑染個 体における抗ＨＢＬＶ抗体と反応するタンパク質をエンコードする、ＨＢＬＶゲ ノムのある種のオープンリーディングフレーム領域の発見に基づく。免疫反応性 の組み換え体ＨＢＬＶタンパク質は、原核生物または真核生物の発現系において ＨＢＬＶゲノムのクローニングしたＤＮＡセグメントにより発現されて、ＨＢＬ Ｖ検出のためのイムノアッセイにおいて使用する量のタンパク質を提供すること ができる。タンパク質は、種々のフォーマットのアッセイにおいて使用して、生 物学的流体、例えば、血液および血液成分中のＨＢＬＶに対する抗体を検出する ことができる。

免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列は、ショットガン クローニング技術により同定され、ここでＨＢＬＶゲノムの断片を融合した遺伝 子としてＥ、ｃｏｌｉ中に不規則にクローニングし、そいてβ−ガラクトシダー ゼ融合タンパク質として発現した。この方法で発生した少なくとも２つのクロー ンは、患者の血清と免疫反応性のタンパク質を産生じた。クローンのＨＢＬＶ　 ＤＮＡセグメントを配列決定し、この融合タンパク質のＨＢＬＶ誘導部分はＨＢ ＬＶゲノムのオープンリーディングフレームのセグメント（ＯＲＦ３と表示する ）によりエンコードされることが決定された。こうして、このＨＢＬＶゲノムの 領域は免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質をエンコードすることが決定された。

ここで使用するクローニング／発現のプロトコル（後に詳述する）は、免疫性タ ンパク質をエンコードするかも知れない、ＨＢＬＶゲノムの追加のオープンリー ディングフレーム領域を同定するために使用することができる。

ＨＢＬＶに対する抗体の検出に本発明のＨＢＬＶタンパク質を使用する免疫化学 的アッセイは、免疫測定（ｉｍｍｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイおよび抗原サンド イッチアッセイを包含する、いくつかの形態を取ることができる。アッセイの好 ましい型は、同相免疫測定（二重抗体）アッセイである。精製した組み換え体Ｈ ＢＬＶタンパク質は、これを固相に取り付けて、抗原免疫吸着体を形成すること によって固定化する。この免疫吸着体を使用して生物学的流体の試料中の抗ＨＢ ＬＶ抗体を吸着する。吸着されｔ；抗ＨＢＬＶ抗体は抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体で検 出し、この抗（ヒト１ｇＧ）抗体は放射性同位元素で、酵素で、蛍光測定的にま たは他の方法で標識する。この第２抗体は、一般にヒトＩｇＧに対して向けられ 、免疫吸着体に吸着された抗ＨＢＬＶ抗体に結合し、そして検出可能なシグナル を発生し、このシグナルは試料中の抗ＨＢＬＶ抗体の存在の指示として評価する ことができる。

本発明の組み換え体ＨＢＬＶタンパク質は、宿主動物または個体への投与のｔ； めの免疫原として使用することができる一般に、免疫原組成物は、免疫反応性の ＨＢＬＶタンパク質および生理学的に許容されうるベヒクルからなる。免疫原組 成物は、ＨＢＬＶに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生 のために動物を免疫化するｔ；めに使用することができる。さらに、免疫原組成 物は個体においてＨＢＬＶに対する免疫応答を刺激するために使用することがで きる。

図面の簡単な説明 第１（ａ）図は、発現ベクターｐＭＬＢ１１１１およびＨＢＬＶ　ＤＮＡの挿入 部位を示す。

第１　（ｂ）図は、ｐＭＬＢｌｌｌｌのポリリンカー領域のためのヌクレオチド およびアミノ酸配列を示す。

第２図は、ＨＢＬＶサブゲノムのＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲ Ｆ）領域を示す。

第３図は、りｏ−ンｐＨＢＬＶ６（１）ＨＢＬＶ誘導インサート（７）ＤＮＡ配 列を示す。

第４図は、ＨＢＬＶ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質のＳＤＳポリアクリルア ミドゲルの分析およびウェスタン・プロットを示す。

発明の詳細な説明 組み合わせクローニング／発現のプロトコルを使用して、ＨＢＬＶに対する抗体 と反応性であるタンパク質をエンコードするＨＢＬＶ遺伝子を同定した。プロト コルは、「挿入活性化」の厘理に基づいた。参照、例えば、ペルマン（ｂｅｒｍ ａｎ）ら、米国特許第４．５０３．１４２号。発現ベクターを使用し、これは遺 伝子のＮ末端領域にフレームシフトの突然変異（ポリリンカーＤＮＡ断片の挿入 から生ずる）を有するＬａｃＺを含有した。オープンリーディングフレームＤＮ Ａセグメントのこの領域中への挿入は、正しいリーディングフレームを回復させ 、セしてβ−ガラクトシダーゼを活性化することができる。これが起こるとき、 融合タンパク質が発現され、このタンパク質は機能的β−ガラクトシダーゼＣ末 端領域に結合した挿入ＤＮＡによりエンコードされるタンノくり質から構成され ている。こうして、融合タンパク質としてＨＢＬＶ　ＤＮＡを発現するクローン は、β−ガラクトシダーゼ活性を有し、そしてこの表現型に基づいて同定するこ とができる。次いで、発現されたタンバク質は、例えば、ウェスタン・プロット 技術により、ＨＢＬＶ抗体との免疫反応性について検査することができる。

この手順を使用して、免疫性タンパク質をエンコードするＨＢＬＶゲノムＤＮＡ のＤＮＡ配列を同定することができる。クローニングしりＨＢＬＶゲノムの９Ｋ ＢのＨ４ｎｄＩ［Ｉサブゲノム断片は、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のロバート・ガロ（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｇａ１ｌｏ ）博士から得た（ｐＺＶＨｌ　４）。

２つの方法を使用して、９．ｋｂのＨＢＬＶ　ＤＮＡサブゲノム断片からランダ ムＤＮＡサブ断片を発生させた：）ｌ）ＤＮａｓｅ　Ｂａ１３１使用して、誘導 されたサブゲノムＤＮＡをほぼ１０００塩基対の領域にに消化し、そして（２） ＨＢＬＶサブゲノムＤＮＡを超音波処理により約３００ｂｐ〜Ｉ　ＤＯＯｂｐ断 片に剪断した。これらのＤＮＡ断片を発現ベクターのｐＭＢｌ１１１中に挿入し 、そしてＨＢ　Ｌ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列をβ−ガラクトシダーゼに融合したタン パク質としてＥ、ｃｏｌｉ中で発現させた。次いで、ＨＥＬＶに対する抗体を含 有するＨＢＬＶ”Ｃ’感染した患者からの血清を使用して、免疫反応性融合タン パク質についてスクリーニングした。２つの発現プラスミド（ｐＨＢＬＶ５およ びｐＨＢＬＶ６）を分離し、これらはウェスタン・プロット分析において患者の 血清と組み換えベクターした融合タンパク質を特定した。発現プラスミドにおい て発現されＩ；ＨＢＬＶ　ＤＮＡ配列は、ＨＢＬＶゲノム上の○ＲＦ３と表示す る単一のオープンリーディングフレーム内でマツピングされた。

上に記載しかつ下の実施例においてさらに詳述する方法を使用して、免疫学的活 性なタンパク質をエンコードするＨＢＬＶゲノムの他の配列を同定することがで きる。

診断および治療の技術に８いて使用するための免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質 は、いくつかの異なる方法により調製することができる。

１つについて、免疫性タンパク質をエンコードするＨＥＬＶ　ＤＮＡ配列を原核 生物または真核生物の系において発現させるすることができる。発現のための） （ＢＬＶ配列はゲノムＨＢＬＶ　ＤＮＡから得ることができる。

好ましい免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質は、第２図に示すＨＢＬＶゲノムの９ ＫＢのＨｉｎｃｌｌＩＩサブゲノム断片のオープンリーディングフレーム領域（ ＯＲＦ３）によりエンコードされる。第３図に記載するアミノ酸配列（およびＤ ＮＡ配列）をもつＯＲ，Ｆ　３によりエンコードされるＨＢＬＶタンパク質は好 ましい、、（この毒素プラスミドはｐＨＢＬＶ６により融合タンパク質として発 現される。前述のように、この配列によりエンコードされるタンパク質は、ＨＢ ＬＶに暴露された患者の血清中の抗体と免疫反応性である。

第３図に示すＤＮＡは、ゲノムＨＢＬＶ　ＤＮＡから得ることができるか、ある いは後述するようにして合成することができる。

０ＲＦ３によりエンコードされるＨＢＬＶタンパク質は、）ｉＢＬＶ抗原の天然 に産出する形態の一部分である。こうして、その抗原をエンコードする遺伝子全 体は、多分、第３図において同定した配列を包含するか、あるいはそれとオーバ ーラツプする。この遺伝子をクローニングすることができ、そして産生物はＨＢ ＬＶ患者の血清と同等であるか、あるいはそれよりも優れる反応性を示すことが できる。さらに、ポリペプチドの解読領域を包含するＨＢＬＶ　ＤＮＡまたはこ の領域とオーバーラツプするもののセグメント、およびヌクレオチドの欠失、挿 入または置換により修飾されるＤＮＡセグメントは、また、免疫学的性質を示す ＨＢＬＶタンパク質またはポリペプチドを生ずることができる：すべてのこのよ うな「免疫学的同等体」は本発明により包含される。

ＨＢＬＶの増殖のだめの細胞系は入手可能ではないが、十分なゲノムＨＢＬＶ　 ＤＮＡは、次の文献に記載されているようにして調製することができる：Ｓ、Ｆ 、ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３４．６０１　（１９８６）、その教 示をここに引用によって加える。ゲノムＤＮＡはサブクローニングすることがで き、例えば、これはジョセプス（Ｊｏ　ｈ　ｓ　ｅ　ｐ　ｓ）、５ｕｐｒａ、に よりなされた。所望のＨＢＬＶ配列はゲノムＤＮＡから切除しく一般に制限酵素 の消化により）、そして適当なりローニングベヒクル、例えば、ｐＵｃまたはｐ ＥＭＢＬ中にクローニングすることができる。調製をＨＢＬＶ　ＤＮＡから調製 して、所望の挿入を含有するクローンをその場で同定することができる。例えば 、ＨＢＬＶゲノムの０ＲＦ３領域のｔ；めのプローブは、第３図に記載するＤＮ Ａ配列に基づいて調製することができる。

必要に応じて、免疫性タンパク質をエンコードする配列はサブクローニングして 、不必要なあるいは望ましくない配列を除去し、そして制限部位を末端に付加し て、発現ベクター中へのクローニングを促進することができる。次いで、ＨＢＬ Ｖ配列を発現ベクター、好ましくは特定の宿主において高いレベルでエンコード されたタンパク質を発現することができるもの、の中に挿入して、ＨＢＬＶ配列 を含有する組み換え発現ベクターを形成することができる。形質転換された宿主 細胞を適当な培地中で培養し、次いで発現されたＨＢＬＶタンパク質を宿主細胞 から分離する。

ゲノム（またはクローニングし！；サブゲノム）ＤＮＡかうＨＢ　Ｌ　ＶＤＮＡ セグメントをの分離す−る代わりに、ＨＢＬＶ　ＤＮＡセグメント解読抗原領域 を化学的に合成することができる。いくつかの技術を利用して、所望のヌクレオ チド酢酸ナトリウムのＤＮＡを合成することができる。参照。例えば、マッテウ チ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ イアティー（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、（１９８１）上皇３：３１８５ ；アルバラドーウルビナ（Ａｌｖａｒａｄ−Ｕｒｂｊｎａ）ら、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、（１９８１）２１４　：　２７０．ＤＮＡセグメントを合成す る好ましい技術は、β−シアンエチルポスポルアミダイト化学である。参照、例 えば、シンハ（Ｓ　１ｎｈａ）　、Ｎ−Ｄ−ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１３．４５３９　（１９８４）、第３図は、 好ましいタンパク質の配列の情報を提供する。合成したＤＮＡは適合し、そして 発現ベクター中に挿入し、そしてこれを使用してベクター適合性宿主細胞を形質 転換し、そして前述したようにエンコードされた遺伝子産生物の発現を提供する ことができる。

免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質の発現のだめの発現系は、原核生物または真核 生物であることができる。述べたように、好ましい系はタンパク質を高いレベル で発現することができる系である。タンパク質は真核生物細胞中で誘発性プロモ ーターの制御下に発現することができる。プロモーター／細胞系のいくつかの例 は、次のとおりである１）ＳＶ４０プロモーター／ＣＨＯ細胞、２）メタロチオ ニンプロモーター／ウシ、乳頭腫ウィルス／ネズミＣ１２７細胞、および ３）アデノウィルス後期（ｌａｔｅ）プロモーター／Ｃ０３−Ｍ胞。

サラに、組み換え体ワクシニアウィルスを使用して、タンパク質を発現すること ができる（ならびに後述するように生きているワクチンを提供することができる ）。ＨＢＬＶタンパク質を発現する他のモードはこの分野において知られている 。

宿主細胞系において異質タンパク質として発現するとき、いくつかの精製工程の いずれをも使用して、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質を精製することができる。

参照、例えば、オスロン（Ｏｓｌｏｎ）、米国特許第４，５１８．５２６号。さ らに、親和性精製技術を後述するように使用することができる。イムノアッセイ において使用するために、ＨＢＬＶタンパク質を実質的に免疫学的純度に精製し なくてはならない、すなわち、調製物はヒト血清中で他の抗体と反応しうる宿主 細胞の汚染物質寅質的に含有すべきではない。このような汚染物質は、アッセイ の精度を減するであろう、誤った陽性の結果を生じうる。

ＨＢＬＶゲノムの同定した抗原領域によりエンコードされるＨＢＬＶタンパク質 は、新しく化学的に合成することができる。例えば、指摘したように、クローン ｐＨＢＬＶ６により発現されたタンパク質のアミノ酸配列は第２図に示す；タン パク質はメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の固相手順により合成するこ とができる。提供される配列の情報に基づいて、より小さい免疫学的に活性なペ プチドを合成することができる。このようなペプチドの化学的合成は、より簡単 でありかつコストがかからない。

ＨＥＬＶ血清と免疫学的に反応性のＨＢＬＶタンパク質またはポリペプチド（例 えば、０ＲＦ３によりエンコードされるタンパク質）は、免疫原性ウィルスのタ ンパク質である、こうして、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をこ れらの組み換え体ＨＢＬＶタンパク質に対して調製することができる。これらの 抗体を使用してタンパク質を精製することができる（例えば、免疫親和性精製に より）。さらに、抗体は生物学的流体中のＨＢＬＶの直接の検出のための化学的 イムノアッセイにおいて使用することができる（後述するＨＢＬＶに対する抗体 の検出と反対に）。ＨＢＬＶタンパク質に対するモノクローナル抗体は、標準の 体細胞のハイブリダイゼーション技術によす産生ずることができる（Ｋｏｈｌｅ ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６：４９５　（ １９５７））。ポリクローナル抗体は従来の技術により産生ずることができる。

本発明の免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質からなる、ＨＢＬＶに対する抗体の産 生を刺激するための免疫原組成物は後述する。

生物学的流体中のウィルスに対する抗体を検出するためにＨＢＬＶタンパク質を 使用するイムノアッセイは、種々の形態を取ることができる。好ましいをは固相 免疫測定アッセイである。この型のアッセイにおいて、精製しＩ；組み換え体Ｈ ＢＬＶタンパク質は固相上に固定化して、抗原−免疫吸着体を形成する。免疫吸 着体を試験すべき試料とインキュベーションする。インキュベーションの期間お よび条件はは、抗原−抗体複合体の形成に適当なものである。次いで、免疫吸着 体を試料から分離し、そして標識した抗（ヒトＩｇＧ）抗体を使用して、免疫吸 着体に結合したヒト抗ＨＢＬＶ−１１Ｉ抗体を検出する。免疫吸着体と関連する 標識の量を、陽性および陰性の対照と比較して、抗ＨＢＬＶ−Ｉ　Ｉ　Ｉ抗体の 存在を評価する。

免疫吸着体は、固相に精製したＨＢＬＶタンパク質を吸着または結合することに よって調製することができる。種々の固相、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポ リプロピレン、デキストランまたは他の材料のビーズを使用することができる。

他の適当な同相は、これらの材料から形成するか、あるいはそれらで被覆した管 またはマイクロウェルを包含する。　組み換え体ＨＢＬＶタンパク質は、技術、 例えば、アミドまたはエステルの結合をを経る共有結合または吸着により、固相 へ共有結合または非共有結合することができる。タンパク質を固相に固定した後 、固相は動物タンパク質、例えば、３％の魚ゼラチンで後被覆することができる 。これは遮断タンパク質を提供し、このタンノ（り質は試験すべき試料中のタン パク質が免疫吸着体表面に非特異的に吸着するのを減少する。

免疫吸着体は、試験した液状試料中の抗ヒト抗体を不溶性化する機能をする。抗 ヒト抗体についの血液スクリーニングにおいて、免疫吸着体を血液血清または血 漿とインキュベーションする。インキュベーション前に、血漿または血清を正常 な動物血漿または血清で希釈する。

希釈剤の血漿または血清は、抗（ヒトＩｇＧ）抗体の源である同一動物種から誘 導される。好ましい抗（ヒトＩｇ）抗体はヤギ抗（ヒ目ｇＧ）抗体である。こう して、好ましいフォーマットにおいて、希釈剤はヤギ血清または血漿であろう。

ヒト血漿および血清のための最適な希釈倍数は約１０〜１１倍である。

インキュベーションの条件、例えば、ｐＨおよび温度、およびインキュベーショ ンの期間は臨界的ではない。これらのパラメーターは日常の実験により最適化す ることができる。一般に、インキュベーションはｐＨ７〜８の緩衝液中で約４５ °Ｃにおいて１〜２時間実施するであろう。

インキュベーション後、免疫吸着体および試料を分離する。分離は普通の技術、 例えば、沈降および遠心により達成することができる。

免疫吸着体を洗浄して、試料から妨害性物質を除去することができる。

免疫吸着体へ結合したヒト抗体を評価するために、免疫吸着体を標識した抗（ヒ トＩｇＧ）抗体（トレーサー）とインキュベーションする。免疫グロブリン、免 疫吸着体は、抗（ヒトＩｇＧ）抗体源として働く動物種の血清または血漿の少量 （約１％）を含有する、標識した抗（ヒトＩｇＧ）抗体の溶液とインキュページ コン。抗（ヒトＩｇＧ）抗体は動物源から得ることができる。しかしながら、ヤ ギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体はヒトＩｇＧのＦ８断片に対する抗体、例えば、ヤギ抗 （ヒト１ｇＧ）Ｆ’、抗体であることができる。

抗（ヒ）ＩｇＧ）抗体または抗（ヒトＩｇＧ）Ｆ、抗体は、放射性物質、例えば 　Ｉｌｌ　１１光学的標識、例えば、蛍光性物質、または酵素、例えば、ペルオ キシダーゼで標識することができる。抗ヒト抗体は、また、ビオチニル化し、そ してアビジンで標識し、免疫吸着体へのその結合を検出するために使用すること ができる。

標識した抗体とのインキュベーション後、免疫吸着体を溶液から分離し、そして 免疫吸着体と関連する標識を評価する。ｌＩ識の選択に依存して、標識は、標識 が放射性ガンマカウンターエミターである場合・ガンマカウンターで、あるいは 標識が蛍光性物質である場合、フルオリメーターで検出することができる。酵素 の標識の場合において、検出は酵素のための発色性基質？使用して比色的に実施 することができる・例えば、酵素、セイヨウワサビペルオキシダーゼを発色性基 質の免疫吸着体と関連する標識の量は、陽性および陰性の対照と比較して、抗Ｈ ＢＬＶ抗体の存在を決定する。対照は一般に試験すべき試料と同時に展開する。

陽性の対照はＨＢＬＶタンパク質に対する抗体を含有する試料である；陰性の対 照はＨＢ　Ｌ　Ｖタンパク質に対する抗体を含有しない、感染しない個体からの 血清である。

便宜上および標準化のために、アッセイの実施のための試薬はアッセイキットと して組み立てることができる。抗ＨＢＬＶ抗体について血液をスクリーニングす るだめのキットは、例えば、次の構成成分を含むことができる（別の容器中に） ： ａ）免疫吸着体、例えば、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質（好ましくは、第３図 に示すような０ＲＦ３によりエンコードされるタンパク質）で被覆したポリスチ レンビーズ、 ｂ）抗（ヒト１ｇＧ）抗体、例えば、約１％のヤギ血清または血漿を含有する緩 衝化した水溶液中の、ヤギ抗（ヒトＩｇＧ）抗体、Ｃ）血清または血漿のための 希釈剤、例えば、正常なりギ血清または血漿、 ｄ）陽性の対照、すなわち、ＨＢＬＶに対する抗体を含有する珈清、および ｅ）陰性の対照、例えば、ＨＢＬＶに対する抗体を含有しない、健康な個体から プールした血清。

標識が酵素である場合、キットの追加の要素は酵素のための基質であることがで きる。

抗ＨＢＬＶ−ＩＩＩ抗体についてのアッセイの他の童は、抗原サンドイッチアッ セイである。この型のアッセイにおいて、標識ＨＢＬＶ組み換え体タンパク質を 抗（ヒトＩｇＧ）抗体の代わりに使用して、免疫吸着体に結合した抗ＨＢＬＶ抗 体を検出する。このアッセイは原理的には抗体分子の二価性に基づく。抗体の結 合部位で、固相に付加された抗原に結合する；第２は標識した抗原に利用されう る。アッセイ手順はイムノアッセイについて前述のものと本質的に同一であるが 、ただし試料のインキュベーション後、免疫吸着体を標識したコアポリペプチド の溶液とインキュベーションする。ＨＢＬＶタンパク質は放射性同位元素、酵素 などとこの型のアッセイのために標識することができる。

第３のフォーマットにおいて、抗原−抗体相互作用を妨害しないで、ＩｇＧ分子 のＦｔ上セグメント結合する、バクテリアタンパク質、例えば、プロティンＡを 標識したトレーサーとして使用して、免疫吸着体に吸着した抗体を検出すること ができる。プロティンＡは放射性同位元素、酵素または他の検出可能な種で容易 に標識することができる。

ＨＢＬＶタンパク質に対する抗体の検出のために組み換え体ＨＢＬ■タンパク質 を使用する免疫化学的アッセイは、この目的に全ウィルス（または崩壊したウィ ルス）使用するものより幾つかの利点を有する。１つについて、組み換え体タン パク質に基づくアッセイは、大量の感染性ウィルスを増殖すること、および細胞 の培養およびウィルスの産生に関連する固有の変動性についての考慮を軽減する であろう。

他の宿主系としてＥ、ｃｏｌｉ中のウィルス抗原の効率よい発現は、アッセイ試 薬の大規模産生の安全な手段を提供する。さらに、このアッセイは、試験を実施 する病院、クリニックおよび血液銀行において技術者によりＨＢＬＶの感染の実 際のまたは予測される危険を軽減する助けをするであろう。前述のように、全ウ ィルスに基づくアッセイのための試薬（例えば、全ウィルス抗原免疫吸着体）は 、崩壊された、不活性化したウィルスで作ってさえ、生きているウィルスとの汚 染の危険を表す。例えば、生きているウィルスの汚染の可能な源はウィルス分離 プロセスからの残留する細胞の破片であることがある。広範な予防手段を払って 汚染の危険を減少することができるが、それを完全に排除することは不可能であ る。有意には、危険は、最小であるが、試験試薬を取り扱う人による実際の危険 より、大きいことがあり得る。

本発明のＨＢＬＶタンパク質は、個体におけるＨＢＬＶに対する体液および／ま たは細胞の免疫応答の刺激において活性であることがある。この目的で、免疫化 量の免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質（好ましくはＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨ ｉｒｘｄｌＩ！サブゲノム断片の０ＲＦ３によりエンコードされるタンパク質、 およびことに第２図に記載する配列を有するタンパク質）および生理学的に許容 されうるベヒクル（例えば、緩衝液）からなる、免疫原組成物を調製することが できる。さらに、免疫原組成物は少量の組成物の有効性を増強する補助物質、例 えば、水酸化アルミニウムを含有することができる。免疫原は非経口的に、注射 により、例えば、皮下的にまたは筋肉内に投与することができる。

あるいは、ＨＢＬＶタンパク質を発現するＨ　Ｂ　Ｌ　Ｖ／ワシニアウイルスの 組み換え体を形成することができる。例えば、第３図の０ＲＦ３配列を７クシニ アウイルスと組み換えてＨＢＬＶに対する生きているワクチンを形成することが できる。参照、米国特許第４．６０３゜１１２号（Ｐａｏｌｅｔｔｔ　ｅｔ　ａ ｌ、）。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

９ｋｂ（’）Ｈｉｎｄｌｌｌ　ＨＢＬＶ　ＤＮＡ断片を、ｐＺＶＨ１４から、制 限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩ　Ｉにより切除し、そして低融点のアガロー スゲルから回収した。Ｌ、Ｈ，グオ（Ｇｕｏ）およびＲ，ウー（Ｗｕ）、メンッ ズ・イン・工ンジモロジー（Ｍｅｔｈ。

ａｓ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｒｎｏｉｏｇｙ）、１０００．６０（１９８３）から回 収した。このＨＢＬＶ　ＤＮＡの断片は２つの方法により発生させブニ：　（ｉ ）　９ｋｂのＨＢＬＶ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１で消化し、 そし′〔エキソヌクレアーゼＢａ　ｌ　３１で２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　 （ｐＨ７，５）、６００ミリモルのＮａＣ１，１２，５ミリモルのＭｇＣ＋、お よび１ミリモルのＥＤＴＡの存在下に２．４ま７日は６分間処理した；　（ｉ　 １）９ｋｂの断片を７４　ＤＮＡリガーゼで結合して、非常に大きい長さの直線 または円形の断片を゛形成し、次いで１００ミリモルののトリス−ＭＣＩ　（ｐ Ｈ７，５）、１０ミリモルのＥＤＴＡの存在下に超音波処理した。これらの不規 則に剪断したＤＮＡ断片を低分子のアガロースゲル上で電気泳動させ、そして長 さが３００〜１ｏｏｏｂｐの断片をゲルから回収した。参照、Ｌ、Ｈ，グオ（Ｇ ｕｏ）ｊ；よびＲ９つ（Ｗｕ）、次いで、上の２つの方法により調製したＨＢＬ Ｖ断片を、Ｎｒｕｌ開裂ｐＭＬＢ１１１１ｆ：Ｔ４　ＤＮＡ！Ｊガーゼで結合し 、そしてＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１の形質転換に使用した。Ｌａｃ”９０−ン をマクコンキー（ＭｃＣｏｎｋｅｙ）寒天平板上でスクリーニングし、そしてそ れ以上の研究のために取り上げｌ；。

Ｃ＋クローンのＤＮＡインサートを、次の文献に記載されているコロニーハイブ リダイゼーション法を使用してマツピングした二Ｍ、ブルンステイン（Ｇｒｕｎ ｓｔｅｉｎ）およびり、ホブ不ス（ＨｏｇｎｅＳＳ）、グロシーディングス・オ ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１． Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡｓ７２．３９６１　（１９７５）。プローブは次 のようにして調製した：ｐ　ＺＶＨ１４から誘導した９ｋｂのＨ４ｎｄＩＩＩか らを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩまたは両者で消化し、 次いでｌｆｆ−”Ｐ］　ｄＡＴＰでクレノー断片を使用して充填した。　［σ− ３２ｐｌ標識されｔ：　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を電気泳動により０．１％のアガロース ゲル上で分離した。個々の［σ−３２ｐ］ｉ識したＤＮＡ断片を含有するアガロ ースゲルの部分をゲルから切断し、そして特異的”ｐ標ＷＩｔＤＮＡプローブは 、２００μＱのＴＥ緩衝液（１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、 １ミリモルのＥＤＴＡ）をゲル片に添加し、そして１００℃において１０分間沸 騰させてＤＮＡ変性することによって得た。ハイブリダイゼーションは６７℃に おいて、１．５ＸＳＳＰＨ７，Ｏ）、１０ミリモルのＥＤＴＡ）、１％のＳＤＳ 尾０．５％の非脂肪ドライミルクを含有する緩衝液中で実施した。種々のプロー ブとハイブリダイゼーションするクローンを比較し、モしてＯＲＦ　ｌ〜４と表 示する２つの別々の非交差反応性領域に分割した。各群からの３つのコロニーを 不規則に取り上げ、そして増殖した。これらのクローンからのプラスミドを分離 し、そして分析してインサートの大きさを決定し、そして種々の制限酵素の切り 放し部位をマツピングした。

ＯＲＦ間の接合の間のＤＮＡセグメントを含有するいくつかのクローンを、部分 的に配列決定して、ＨＢＬＶインサートの接合領域の配列を決定し、そしてＨＢ ＬＶ　ＤＮＡ上へ特異的リーディングフレームをドロップ（ｄｒｏｐ）した。第 ２図においてｐＨＢＬＶ５および６を示す矢印は、２つのクローン中に含有され るＨＢＬＶ　ＤＮＡインサートの位置および大きさを特定する。それらは、また 、左から右へエンコードされた遺伝子の転写の向きを定める。波の線は４つのＯ ＲＦの近似の境界を定める。開いた箱はｐＺＶＨ１４のベクターのブルースクラ イブ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ）上に含有されるＴ、およびＴ。

である。矢印はこれらの２つのプロモーターの転写の方向を示す。

プラスミドｐＨＢＬＶ６又はｐＭＬＢ１１１５を、ｌ　ＯＯｐ　ｇ／ｍＡのアン ピシリンを含むし一ブロスｌＱ中で３７℃で１４時間増殖させた。バクテリア細 胞を遠心分離により集め、そしてＥＤＴＡＩＯｍＭとフェニルメチルスルホニル フルオライド１ｍＭを含むトリス−ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）１００ｍＭ中に 再懸濁させた。フレンチプレスを使用して細胞を破壊し、細胞デブリスを遠心分 離により除去した。上澄液中のタンパク質を飽和硫酸アンモニウム溶液で沈でん させた。沈でんしたタンパク質の半分を、モノクローナル抗βガラクトシダーゼ と結合したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを使用して、イムノアフイニティク ロマトグラフィーにより更に精製した。デブリス・ビー・ヤ。（Ａ）においては 、タンパク質試料を、７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析し、ニト ロセルロース紙に電気的に転写し、アミドブラック（ａｍｉｄｏ　ｂｌａｃｋ） で染色した。レーンｌ及び３は、それぞれｐＨＢＬ■６及びｐＭＬＢ　ｌ　１１ ５から抽出した未精展タンパク質であった。レーン２及び４は、ｐＨＢＬＶ６及 びｐＭＬＢ１１１５からの精製したタンパク質試料であり、（レーン６及び８） は、７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離されそして（Ａ）の場合の如くしてニトロ セルロース濾紙上に転写された。ニトロセルロース紙を、トリス緩衝液（Ｔｒ　 １ｓ−ｂｕｆ　ｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅＸｐＨ７、５）中の５％乾燥脱脂乳、 Ｏ，１％発泡防止剤Ａ及び０．１％チメロサールと共に室温で１時間インキュベ ーションしＩ；。ｌ：１００の希釈率の正常な供血者の血清（レーン５及び６） 及びＨＢＬＶ感染患者の血清（レーン７及び８）を加えそして４℃で一夜インキ ユベーションした。この血清は、Ｅ、ｃｏｌｉ溶解物及び精製したβ−ガラクト シダーゼにより４℃で一夜予め吸収させてあった。０゜０５％ツイーン（Ｔｖｅ ｅｎ）２０を含むトリス緩衝液（ｐＨ７，５）で室温で３０分間３回洗浄した後 、ニトロセルロース濾紙ストリップを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩＧｇ と共に室温で１時間インキュベーションし、洗浄しそして基質４−クロロ−１− す７トール及び０．０１５％過酸化水素と反応させた。

結果 ｐＺＶＨ１４由来のＤＮＡからの断片を発生させるのに２つの異なる方法を使用 した。１つの方法では、ｐＺＶＨ１４からの９　ｋｂＨ１ｎｄｌ［［ＨＢＬＶ断 片を最初に制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化し、次いでエキソヌクレア ーゼＢａｌ　３１で短時間処理した。他の方法では、９　ｋｂＨ１ｎｄＩ［［断 片を最初に自己連結させ（ｓｅｌｆ−１ｆｇａＬｅ）、次いで音波処理してラン ダムに剪断されたＤＮＡ断片を発生させＩ；。断片をアガロースゲルでの電気泳 動により分離し、３００−１０００ｂｐ長さの断片を単離した。精製したＤＮＡ 断片を、オープンリーディングフレーム発現ベクターｐＭＬＢ　ｌ　ｌ　ｌ　ｌ （第１図）を使用してプラスミドを構成するのに使用した。ｐＭＬＢｌｌｌｌは 、野性型ＬａｃＺ遺伝子の５′末端の近くに挿入されたポリリンカーＤＮＡセグ メント上に多数のりローン化部９を含む。このポリリンカ〜の挿入は、ＬａｃＺ 選伝子のフレームシフト突然変異を引き起こす。かくしてｐＭＬＥＩＩｉｌは、 大腸菌ＭＣ１０６１［ｒ−ｍ＋（Δ１ａｃ）Ｕ　ｌ　６９　］宿主に挿入されて も、機能性ガラクトシダーゼを生成しない。エム・カサダバンＣＭ、Ｃａ５ａｄ ａｂａ、ｎ）及びニス・コーユン（Ｓ、Ｃｏｈｅｎ）、ジャーナル・オブ・モレ キュラー・／＜４　オロ’；−（Ｊ、　Ｎｏ１．　Ｂｉｏｌ）、±３８．１７９ （］、９８０）。しかしながら、オープンリーディングフレームを含む外来ＤＮ Ａは、それがその５′及び３′末端において分割されたＬａｃＺ遺伝子と同相の （ｉｎ−ｐｈａｓｅ）　３　Ｎ　＋　Ｉ　ｂｐｓ（Ｎは整数である）の連続オー ブンリーディングフレームであるという条件の下ではフレームシフト突然変異を 復帰させることがある。プラスミドの大腸菌形質転換体は、分割ＬａｅＺ遺伝子 セグメントによりコードされた２つのβ−ガラクトシダーゼペプチド間の不活性 化されｔ；外来ＤＮＡ”ｓによりコードされたポリペプチドとの融合タンパク質 を生成するであろう。融合タンパク質中のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性は保 持されている。

形質転換体をマツコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｙ）の寒天プレートでスクリーニン グして、β−ガラクトシダーゼ活性を発現する個々のクローンをその場で検出し た。約３．１００のアンピシリン耐性Ｌａｃ＋形質転換体が得られた。これらの クローンを、プローブとしてｐＺＶＨｌ４がらの［ｔ−”Ｐ］　ＤＡＴＰ標識ニ ックトランレーテッド９ｋｂＨｉｎｄｎ［断片［ビー・ダブリュ・リグバイ（Ｐ 、Ｗ、Ｒｉｇｂｙ）等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ＝、１１ ３，２３７（１９７７）］を使用してコロニーハイブリダイゼーション［８］に より更に分析したところ、それらの約３０％は、９　ｋｂＨ１ｎｄＩ［［断片か らのＤＮＡ挿入配列を含むことが見出だされた。残りのＬａｅ＋形質転換体は、 多分、ｐＭ、ＬＢＩｌｌｌＤＮＡのＮｒｕ？による不正確なフレームシフト復帰 突然変異から生じたかヌはコロニーハイブリダイゼーション法により検出するに は余りにも少ないＨＢＬＶ　ＤＮＡ断片の挿入から生じたのであろう。

これらのＬａｃ＋形質転換体中のＨＢＬＶ　ＤＮＡ挿入配列を分析しそしてｐＺ ＶＨｌ　４ＤＮＡ中のそれらの位置を決定するために、我々は、プローブとして ｐＺＶＨｌ、４の別々の領域由来の種々の３２ｐ標識制＠ＤＮＡ断片を使用する コロニーハイブリダイゼーション法によりこれらのクローンをハイブリダイゼー ションした。Ｌａｃ＋クローンを含むこれらのＨ，Ｂ　Ｌ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａは、 ４つの別々の非交差反応性グループに分けられた。これらのＬａ、ｃ＋形質転換 体中の挿入ＨＢＬＶ　ＤＮＡ’　ｓ及びｐＺＶＨ１４ＤＮＡのＤＮＡ配列決定に よる追加の分析（データは示されていない）は、第２図に示された如く、ｐＺＶ Ｈｌ４上に、オープンリーディングフレームコード配列を含む４つの領域が多分 存在することを示唆している。

Ｌａｃ＋形質転換体により生成したタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［ニー・ケー・ラムリ（Ｕ 、に、Ｌａｅｍｌ　ｉ）、ネイチャー（践胆朋）、ロンドンｌスヱ：６８（１９ ７０）］により、ｐＭＬＢ１１１５［エム・エル・バーマン（ＩＪ、Ｌ、Ｂｅｒ ｍａｎ）から得られる；ジー・エム・ワインストック（Ｇ、Ｍ、ＷｅｉｎｓＬｏ ｃｋ）等、χカヱ（並酔）、旦、４４３２参照］を有する対照Ｌａｃ“バクテリ アからのそれと共に分析した。ｐＭＬＢ１１１５のＬａｃＺ遺伝子のＮ−末端に 挿入されｔ；リンカ−ＤＮＡは、挿入リンカ−をＬａｃＺ遺伝子と同相（ｉｎ− ｐｈａｓｅ）ならしめる余分の塩基を含有することを除いては、ｐＭＬＢ　１１ １５のそれと同一である。故に、ｐＭＬＢ　１１１５を含んでいるバクテリアは 、機能性β−ガラクトシダーゼを生成する。β−ガラクトシダーゼとその融合タ ンパク質は、非常に大きいサイズのため、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で 細胞溶解物中のタンパク質のバルクから分離され、クーマシーブリリアントプル ー染色により容易に同定することができる（第３Ａ図）。

１２０のＬａｃ＋クローンを、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そしてそれらの ６７は、ｐＭＬＢｌ　１．１５において生成されたそのままのβ−ガラクトシダ ーゼよりも１５，０００乃至３５，０００ダルトン大きいポリペプチドを生成し ｔ；。それらのサイズについての発見は、これらのＬａｃ“形質転換体中の挿入 されたＨＢＬＶ　ＤＮＡ’　ｓのサイズが３００　１０００ｂｐｓの長さである ことを示すデータと合致している。分析したＬａ−クローンの残りは、生の（ｎ ａｖｉｖｅ）β−ガラクトシダーゼの電気泳動移動度と同様な電気泳動移動度を 持ったタンパク質を生成した。同様な発現系で以前に観察されている如く、成る ＨＢＬＶ　ＤＮＡ挿入配列の非常に小さいサイズ又は融合タンパク質の成るタン パク質分解劣化によるものであるかも知れない。エヌ・ティー・シャング（Ｎ　 、Ｔ　、Ｃｈａｎｇ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８．９３、（１９ ８５）参照。クーマシーブリリアントブルーで染色したタンパク質バンドの色強 度により判定したところでは、発現したＨＢＬＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タ ンパク質は、全細胞タンパク質の約０．５−１％に相当する。

発現した）ＩＢＬＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の免疫反応性を、患 者からの血清を使用してウェスターンプロット法により検査しＩ；。これらの血 清は、イムノ蛍光染色法を使用して培養物中のＨＢＬＶ感染リンパ球との特異的 反応性により決定して、それらの血清がＨＢＬＶに体する抗体を含有することが 予め見出だされたが故に選ばれた。ニス・ゼット・サラディン（Ｓ、Ｚ、５ａｌ ｈｕｄｄｉｎ）等、前記文献。

更に、血清を採取したこれらの患者では、ＨＢ　Ｌ　Ｖが単離又は同定されプこ 。

ウェスターンプロット法により分析されたもとのままのβ−ガラクトシダーゼよ りも１５．０００−３５．ＯＱ　Ｑダルトン大きい融合タンパク質を含む６７の Ｌａｃ＋クローンの内、２クローン（ｐｌ（Ｂ　Ｌ　Ｖ　５およびｐＨＢＬＶ６ ）からの融合タンパク質は、ＨＢＬＶ感染患者からの血清と特異的に反応した（ 第３Ｂ図）。１つの血清は組換え体タンパク質と強く免疫反応性であり、他の２ つは弱い反応性を有していた。ＨＢＬＶ感染した培養リンパ球のイムノ蛍光染色 に関するこれらの患者の抗体の先の検査は、平行な結果を与えた。ニス・ゼット ・サラディン等、前記文献。組換えＨＢＬＶタンパク質とこれらの血清との異な る反応性は、異なるアフイニティによるか又は血清中に存在するＨＢＬＶ特異的 抗体の濃度による可能性がある。

ＤＮＡハイブリダイゼーションのデータは、０ＲＦ３と命名された単一のオーブ ンリーディング７レーム領域由来のものであることを示した。これらの結果は、 ０ＲＦ３を含む遺伝子がＨＢＬＶで感染した患者に８いて発現されること及び提 唱したタンパク質が免疫原性であることを示唆する。クローンｐＨＢＬＶ６が更 に分析するために選ばれＩ；。この理由は、それがより高いレベルの組換えＨＢ ＬＶペプチドを生成した苧）らである。細胞溶解物中の組換え融合タンパク質を 、β−ガラクトシダーゼに特異的なマウスモノクローナル抗体と結合Ｌ　ｆユセ ファローカー４Ｂのカラムを使用してアフイニティ精製した。ダブエンザイモロ ジー、３４（１９７５）参照。

ｐＨＢ　Ｌ　Ｖ　６から精製したタンパク質は、５Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲ ルで４つの明白なり−マシーブリリアントブルー染色バンドを含む。２つの主要 なバンドの１つのペプチドは、約１５０キロダルトン（ｋｄ）の分子量ををし、 これは、ＨＢＬＶ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質のそれに相当する。他 の主要なポリペプチドは、約１２０Ｍであり、生のβ−ガラクトシダーゼに似た サイズである。１５０ｋｄバンドは、ＨＢＬＶ感染患者からの血清と免疫反応性 でありそして１２０ｋｄは免疫反応性ではないので、１２０ｋｄバンドは、多分 、バクテリア宿主細胞中の部分的分解により１５０ｋｄＨＢＬＶ−β−ガラクト シダーゼ融合タンパク質から誘導され、従ってＨＢＬＶコード部分（）ＩＢＬＶ −ｅｎｃｏｒｄｅｄｍｏｉｅｔｙ）を殆ど含まない。１３５ｋｄ少量種は、多分 、他の部分的に分解したＨＢＬＶ−β−ガラクトシダーゼ中間体ポリペプチドで ある。１５５ｋｄ種の性質は、現時点では知られていない。１５５ｋｄ及び１３ ５ｋｄタンパク質は患者の血清と反応性ではないので（第３図、レーン２及び７ ）、これらの両方とも、アフイニティ力ラムにより組換えタンパク質と同時に精 製される大腸菌起源の汚染物の可能性がある。ＨＢＬＶタンパク質の更なる精製 は、種々のタンパク質の生物学的性質を解明するために進行中である。

ｐＨＢ　Ｌ　Ｖ　５に挿入されたＨＢＬＶ　ＤＮＡは、ジデオキシ鎖ターミネー ション法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ ｄｓ）により配列けっていされた。イー・ワイ・チェ７（Ｅ、Ｙ、Ｃｈｅｎ）及 びピー°エイチ°シー″−グ（Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ）ｓ　Ｄ　ＮΔ　互、１ ６５（１９８５）。ｐＨＢＬＶ６の挿入。（第４図）。結果は、ｐＨＢＬＶ６に 存在する３つのＤＮＡリーティング７レームの１つに単一連続コードフレームが 存在することを示す。かくして、ｐＨＢＬＶ６に包含されているＤＮＡセグメン トは、多分、構造遺伝子の一部である。このＤＮＡ配列とＤＮＡデータバンク、 遺伝子バンク、のすべての既知のＤＮＡ配列との比較は、このＨＢＬＶ　ＤＮＡ が新規であり、これまでに配列決定された既知のＤＮＡとの有為な配列相同性を 持たないことを示した。推測されｔ；ポリペプチド配列のハイドロバシシテイ分 析（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ）　［ジェー・キール（ Ｊ、Ｋｙｌｅ）及びアール・エフ・ドーリットル（Ｒ，Ｆ。

ド（ｐＨＢ　Ｌ　Ｖ　６−ｅｎｃｏｄｅｄ　ＨＢ　Ｌ　Ｖ　ｐｅｐｔｉｄｅ）は 親水性であることを示す。更に、このペプチドは、可能生のあるＮ−リンクグリ コジル化部位を含まず、そして疎水性残基のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ） を含まない。ウィルスペプチドのグリコジル化は、ペプチドがコート又はエンベ ロープタンパク質であること及び疎水性アミノ酸残基（しばしば１５残基の付近 の）のストレッチの存在を普通は示しそしてペプチドは細胞血漿膜を通ってまた がっている（ｓｐａｎ）ことを示唆するであろう。

予想される第２の構造は主としてら旋構造である。ピリオン及び感染細胞におけ るｐＨＢＬＶ−６により部分的に特定され１；ウィルスタンパク質の位置を述べ ることはまだできない。

我々は、０ＲＦ２．０ＲＦ３及び０ＲＦ４領域由来の多数のクローン及ｔＦｔＱ ’）当てらＦＬｆ：０ＲＦｓ間ニマｔ：がるｐＺＶＨｌ　４　ＤＮＡ（７）接合 領域に関して追加のＤＮＡ配列決定分析を行った（データは示されていない）。

結果は、個々のオーブンリーディング７レームの正確な境界を決定するのにはま だ十分ではないけれども、０ＲＦ２及び０ＲＦ３がＨＤの異なるリーディングフ レーム由来のものでありそして多分ウィルスの別々の遺伝子をコードしていると いう我々の以前の示唆を確証する。重なりあっている０ＲＦ３及び０ＲＦ４は、 互いにインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）であり、そして多分１００ｋｄより大 きいポリペプチドをコードすることができる非常に長い（３ｋｂ以上）オープン リーディング７レーム（ＯＲＦ３＋４）由来のものである。

！熊 ｐＨＢＬＶ６と名付けられ！；クローン細胞系は、アメリカ合衆国、２０８５２ メリーランド州、ロックビレの、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン（ＡＴＣＣ）に、１９８７年６月１日に寄託された。ＡＴＣＣ番号は６７４２ ３である。寄託は、ブダペスト条約の条項に従ってなされた。

良！惣 当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの均等物を、認め 又は普通の笑験により確認することができるであろう。

このような均等物は、下記の請求の範囲に包含されることを意図する。

（ａ）。

ＨＢＬＶＤＮＡ （ｂ）。

Ｆｉｇｕｒｅ　１゜ Ｆ工ＧＵＲＥ　３ ａｌａ　ｌｅｕ　ｇｉｎ　ａｒｇ　Ｍｓ　ｔｈｒ　ｇｌｕ　ｇｌｕ　ｇｉｎ　ｒ ｎｅｔ　ｌｙｓ　ｇｉｎ　ｔｈｒ　ａｌａ　ｇｌｕ　ａｓｎ@ａｓｐ　Ａｙｓ ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＣＴＡ　入λＧ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＣへＡＴＴτ　丁ＣＧ　Ｔ ＣＴ　ＣτＧＧＡＡ　へＣへ入ＴＧ　ＣＲＴ　ＴτＧ入八Ｔ■嘯s ｌｅｕ　工１ｅ　ｌｅｕ　ｌｙｓ　ａｓｐ　ｇｌｙ　ｇｉｎ　ｐｈｅ　ｓｅｒ　 ｓｅｒ　ｌｅｕ　ｇｌｕ　ｔｈｒ　ｍｅｔ　ｈｉｓ　ｌｅｕ@ａｓｎ　１ｅｕ ２２１　、−　２４１　２６１ ＴＴＡ　ＧＡＡ　ｋＣＣＴＴＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　Ｇ ＡＴ　ＡＡＣＡＡＴ　ＧτＣＡτＣＡττ　ＣＡＣＴＴＴ　`ＣＣ ｌｅｕ　ｇｌｕ　ｃｈｒ　ｐｈｅ　ｌｅｕ　ｌｙｓ　ｇｉｎ　ｌｅｕ　ｇｉｎ　 ａｓｐ　ａｓｒｘ　ａｓｎ　ｖａｌ　ｉｌｅ　ｉｌｅ　ｈｉ刀@’ｐｈｅ　ｔｈ ｒ ２８１　３０１　３２ユ ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＣＡ ＴＡ　ＣＡＡ　ＡＣＧ　入ＣＣ八ＴＣＡＧＣ入ＡＧ　八τＣ■qＣ ｈｉｓ　ａｈａ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　ｐｘｏ　ｖａｌｌｅｕ　ｌｙ！Ｉａｓｐ　ｉ ｌｅ　ｇｌｕ　ｔｈｒ　ｔｈｒ　ｉｌｅ　ｓｅｒ　Ａｙｓ　奄撃■@’ｒ工ε ｓｅｒ　ａｓｐ　ｖａｌ　ｉｌｅ　ｇｌｕ　Ａｙｓ　ｉｌｅ　ｌｅｕ　ｉｌｅ　 ｌｙｓ　ｔｈｒ　ｐｒｏ　ｌｅｕ　ａｓｎ　ｐｒｏ　ｇｌｕ@ｇｉｎ　ｍｅｔ ｓｅｒ　ｉｌｅ　ｔｈｒ　ｐｈｅ　１ｅｕ工ｙｔ　ｌｙｓ　ｉｌ＠ａｌａ　ｔｈ ｒ　ｓｅｘ　ａｌａ　ａｓｎ　１ｙｓ　ｈｉｓ　ｔｈｒ　ａ嘯■@１ｅｕ ＡＧＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＧＧＡ　ＣＡＡ　ＧＣｋ　ＴＴＡ、ＡＡＣＣＴ ＣＴＡＣＧＡＡ　ＣＡＡ　ＣＧＣＡＴＴ　ＡＣＡ　ＧＡＧｓｅｒ　ｈ：ｉｓ　ｓ ｅ：　ｉｌｅ　ｔｙｒ　ｇｌｙ　９工ｎ　ａｌａ　ｌ（ｕ　ａｓｎ　ｌｅｕ　ｔ ｙｒ　ｇｌｕ　ｇｌｕ　ａｒｇ　ａｌ＝@ｔｈｒ　ｇｌｕ Ｆ工ＧＵＲＥ　３　（ＣＯＮＴ、） ＧＣＴ　ＧＡＡ　Ａ７戊　ＡＡＡ　ＡＴＴ　０丁丁　ＣＴＣ丁ＣＧ　ＴＣＡ　ｃ ｘ八　ＧＡＴ　ＧＣＡ　λ入ＡＡＣτ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　入`Ｔ　丁 ａｌａ　ｇｌｕ　１ｙｓ　ｌｙｓ　ｉｌ＠　ｌ＠ｕ　１ｅｕ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　 ｇｉｎ　ａｓｐ　ａｌａ　１ｙｓ　ｔｈｒ　ｇｌｕ　ｇユ６@６ｓｎ　１ ＴＣＴ　ＡＧＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　Ｔ７ＶＣＧＣＡ　ＣＡＣＧＣＴ　ＣＡＡ　Ａ ＧＡ　入ＡＴ　へへへ　ＡＡＡ　ＣＡＣＴＣＡ　入子ＴＣへf　八 ｓｅｒ　ｓｅｒ　ｓｅｒ　Ａｙｓ　ｔｙｚ　ａｌａ　ｈｉｓ　ａ工ａｇｌυａｒ ｇ　ａｓｎ　ｌｙｓ　ｌｙｓ　ｈｉｓ　ｓｅｒ　ｉｌｅ　ｇ奄氏@ａ ｌａ１ ＣＲＴ　入子へ　ＡＣＡ　へへへ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　τ丁Ｃｈ４ｓ　ｊｌｏ　ｔ ｈｒ　１％ｌｓ　ＩＱｕ　！Ｉａｒ　ｐｈｅＦＩＧＵＲＥ　４σ 補正書の写しく翻訳文）提出口　（特許法第１８４条の８）平成１年１２月１日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１８０７ ２、発明の名称 ヒトＢ−リンパ栄養性ウィルスの免疫学的に活性なタンパク質の発現 ３、特許出願人 名称　ベイラー・カレンダ・オブ・メディシン　（ほか１名）４、代理人　〒１ ０７ 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正書の提出年月日 １９８９年６月１１３ ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通（２）補正の説明　１通 請求の範囲（補正） １、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性である分離されたＨＢＬＶポリペプチド 。

２、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩサブゲノム断片の部分によりエン コードされ、前記ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性であ る、分離された免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質。

３、第３図のアミノ酸配列またはその免疫学的同等体からなる分離されｊ；免疫 反応性ＨＢＬＶタンパク質。

４、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性のポリペプチドをエンコードする、ＨＢ ＬＶゲノムの部分からなる分離されたＤＮＡ配列。

５、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄｌＩＩサブゲノム断片のオープンリーデ ィングフレーム領域からなり、前記領域はＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性で あるタンパク質をエンコードする、分離されたＤＮＡ配列。

６、第３図の配列またはその実質的な解読同等体からなるＤＮＡ配列。

７、ＨＢＬＶタンパク質をエンコードするＨＢＬＶ　ＤＮＡ配列を発現可能な形 態で含有し、前記ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性であ る、組み換え体発現ベクター。

８、プラスミドである、請求の範囲第７項記載のベクター。

９、ＨＢＬＶ　ＤＮＡ配列はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩサブゲノ ム断片のオープンリーディングフレーム領域から誘導される、請求の範囲第７項 記載の発現ベクター。

１０、ＤＮＡ配列は第３図の配列からなる、請求の範囲第８項記載の発現ベクタ ー。

１１、請求の範囲第７項記載の発現ベクターで形質転換された細胞。

１２、組み換えプラスミドで形質転換され、前記プラスミドはＨＢＬＶに対する 抗体と免疫反応性のＨＢＬＶポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列に結合し ている原核生物の転写シグナルおよび翻訳シグナルからなる、バクテリア細胞。

１３、Ｅ、ｃｏｌｉの菌株である、請求の範囲第１２項記載のバクテリア細胞。

１４、工程： ａ１宿主細胞を組み換えベクターで形質転換し、前記組み換えベクターはＨＢＬ Ｖに対する抗体と免疫反応性であるＨＢＬＶタンパク質をエンコードするＨＢＬ Ｖ　ＤＮＡ配列を発現可能な形態で含有し、ｂ、形質転換された宿主細胞を培養 し、そしてｃ１タンパク質を宿主細胞から分離する、からなる、ＨＢＬＶ免疫反 応性タンパク質を産生ずる方法。

１５、宿主細胞はバクテリア細胞であり、そしてベクターはプラスミドである、 請求の範囲第１４項記載の方法。

ｄＳ陽性の制御、および ｅ、陰性の制御、 ２９、ＨＢＬＶに対する抗体免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質の免疫原量および 生理学的に許容されうるベヒクルからなる免疫原組成物。

３０、免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質は、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄセ グメントの断片のオープンリーディング７レーム領域によりエンコードされる、 請求の範囲第２９項記載の免疫原組成物。

３１、ＨＢＬＶタンパク質は第３図の配列によりエンコードされる、請求の範囲 第２９項記載の免疫原組成物。

国際調査報告 １＋＋＋＊＋ｖｕＭ＊＋ｖ−噌＾５ｅｌｉｃ暑”””ＰＣＴ／ＵＳＥ１８１０１ ８０７国際調査報告　ＵＳ　８８０１８０７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分離された免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質。 ２、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩサプゲノム断片の部分によりエン コードされた分離された免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質。 ３、第３図のアミノ酸配列またはその免疫学的同等体からなる分離された免疫反 応性ＨＢＬＶタンパク質。 ４、免疫反応性タンパク質をエンコードするＨＢＬＶゲノムの部分からなる分離 されたＤＮＡ配列。 ５、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩサブゲノム断片のオープンリーデ ィングフレーム領域からなり、前記領域はＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性で あるタンパク質をエンコードする、分離されたＤＮＡ配列。 ６、第３図の配列またはその実質的な解読同等体からなるＤＮＡ配列。 ７、免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質をエンコードするＨＢＬＶＤＮＡ配列を発現 可能な形態で含有する組み換え体発現ベクター。 ８、プラスミドである、請求の範囲第７項記数のベクター。 ９、ＨＢＬＶＤＮＡ配列はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩサプゲノム 断片のオープンリーディングフレーム領域から誘導される、請求の範囲第７項記 載の発現ベクター。 １０、ＤＮＡ配列は第２図の配列からなる、請求の範囲第８項記載の発現ベクタ ー。 １１、請求の範囲第７項記載の発現ベクターで形質転換された細胞。 １２、組み換えプラスミドで形質転換され、前記プラスミドは免疫反応性のＨＢ ＬＶタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列に結合している原核生物の転写シグ ナルおよび翻訳シグナルからなる、バクテリア細胞。 １３、Ｅ．ｃｏｌｉの菌株である、請求の範囲第１２項記載のバクテリア細胞。 １４、工程： ａ、宿主細胞を組み換えベクターで形質転換し、前記組み換えベクターは免疫反 応性ＨＢＬＶタンパク質をエンコードするＨＢＬＶＤＮＡ配列を発現可能な形態 で含有し、 ｂ、形質転換された宿主細胞を培養し、そしてＣ、タンパク質を宿主細胞から分 離する、からなる、ＨＢＬＶ免疫反応性タンパク質を産生する方法。 １５、宿主細胞はバクテリア細胞であり、そしてベクターはプラスミドである、 請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、ＨＢＬＶＤＮＡ配列は第３図のＤＮＡ配列である、請求の範囲第１４項記 載の方法。 １７、工程： ａ、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性である組み換え体ＨＢＬＶタンパク質を 取り付けて有する固相からなる抗原免疫吸着体を準備し、ｂ、試験すべき生物学 的流体の試料と前記免疫吸着体とインキュベーションし、前記インキュベーショ ンは試料中の抗体を抗原免疫吸着体と複合化する条件下に実施し、 Ｃ、前記免疫吸着体を試料から分離し、そしてｄ、前記免疫吸着体に結合した抗 体を試料中のＨＢＬＶに対する抗体として決定する、 からなる、生物学的流体中のＨＢＬＶに対する抗体を検出する方法。 １８、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｊｎｄＩＩ Ｉサブゲノム断片の部分によりエンコードされる、請求の範囲第１７項記載の方 法。 １９、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質は第３図の配列のタンパク質またはその免 疫学的同等体である、請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０、生物学的流体はヒト血清またけ血漿である、請求の範囲第１７項記載の方 法。 ２１、免疫吸着体に結合した抗体を検出する工程は、ａ）生物学的流体を誘導す る種の免疫グロブリンに対する標識抗体と免疫吸着体をインキュベーションし、 ｂ）免疫吸着体を標識抗体から分離し、そしてｃ）免疫吸着体と関連する標識を 試料中のＨＢＬＶに対する抗体指示として検出する、 からなる、請求の範囲第１７項記載の方法。 ２２、生物学的流体はヒト血清または血漿であり、そして標識抗体は標識抗ヒト Ｉｇ抗体である、請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、工程： ａ）抗原免疫吸着体を準備し、前記免疫吸着体は免疫反応性の組み換え体ＨＢＬ Ｖタンパク質の本質的に均質な精製した調製物で被覆されたポリエチレンビーズ からなり、 ｂ）ヒト血漿または血清の試料と前記免疫吸着体とインキュベーションし、前記 インキュベーションは試料中の抗ＨＢＬＶ抗体を前記タンパク質と複合化する条 件下に実施し、 ｃ）前記免疫吸着体を試料から分離し、ｄ）前記免疫吸着体を標識抗ヒト１ｇ抗 体とインキュベーションし、ｅ）前記免疫吸着体を標識抗体の溶液から分離し、 そしてｆ）前記免疫吸着体と関連する標識を試料中の抗ＨＢＬＶタンパク質の指 示として検出する、 からなる、ヒト血漿または血清中のＨＢＬＶコアタンパク質に対する抗体を検出 する方法。 ２４、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性の組み換え体ＨＢＬＶタンパク質をそ れに取り付けて有する固相支持体からなる免疫吸着体。 ２５、組み換え体ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩ Ｉサプゲノム断片の部分によりエンコードされる、請求の範囲第２４項記載の免 疫吸着体。 ２６、構成成分： ａ、ＨＢＬＶに対する抗体と免疫反応性の組み換え体ＨＢＬＶタンパク質をそれ に取り付けて有する固相支持体からなる免疫吸着体、およびｂ、標識抗ヒト１ｇ 、 からなる、ＨＢＬＶ抗体を検出するムノアッセイの実施のためのキット。 ２７、ＨＢＬＶタンパク質はＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄＩＩＩサブゲノ ム断片のＯＲＦ３のすべてまたは部分によりエンコードされる、請求の範囲第２ ６項記載のキット。 ２８、さらに、構成成分： Ｃ、試験すべき試料の希釈剤、 ｄ、陽性の制御、および ｅ、陰性の制御、 からなる、請求の範囲第２６項記載のキット。 ２９、ＨＢＬＶに対する抗体免疫反応性のＨＢＬＶタンパク質の免疫原量および 生理学的に許容されうるベヒクルからなる免疫原組成物。 ３０、免疫反応性ＨＢＬＶタンパク質は、ＨＢＬＶゲノムの９ＫＢのＨｉｎｄサ プゲノム断片の領域によりエンコードされる、請求の範囲第２９項記載の免疫原 組成物。 ３１、ＨＢＬＶタンパク質は第３図の配列によりエンコードされる、請求の範囲 第２９項記載の免疫原組成物。