KR100201760B1 - 사람 면역결핍 바이러스 타입 1항원 단백질 지피 1(gp41) 및 지에이지 3(gag3)의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HIV-1 항원 단백질 gp41 또는 gag3을 코딩하는 유전자와 적당한 프로모터 및 융합단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 형질 발현에 의해 융합 단백질과 gp41 또는 gag3을 포함하는 인크루전 바디를 생산한 다음, 이 인크루전 바디를 하이드록실아민으로 gag3을 유리시키고, EDAE-세파로즈 컬럼에서 비 gp41 단백질 또는 비 gag3 단백질을 흡착시킴으로써 gp41 또는 gag3단백질을 순수하게 분리하는 단계를 포함하는 재조합 HIV-1 항원의 제조방법을 제공한다.

Description

사람 면역결핍 바이러스 타입 1항원 단백질 지피 1(gp41) 및 지에이지 3(gag3)의 제조방법

제1도는 HIV-1항원 단백질 gp41 발현 플라스미드 pYCM-env2의 제조과정을 도시한 것이고,

제2도의 (a) 및 (b)는 각각 gp41 단백질의 이온교환수지를 이용한 크로마토그래피 용출 패턴 및 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이며,

제3도는 HIV-1항원 단백질 gag3 발현 플라스미드 pYCM-gag3의 제조과정을 도시한 것이고,

제4도의 (a) 및 (b)는 각각 gag3 단백질의 이온교환수지를 이용한 크로마토그래피 용출 패턴 및 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이며,

제5도는 gp41과 gag3단백질을 이용한 효소면역측정법으로 HIV-1양성과 음성 혈액의 판정 결과를 도시한 것이고,

제6도는 정제된 gp41과 gag3단백질을 이용한 효소면역측정진단키트의 특이도와 민감도 판정결과를 도시한 것이다.

본 발명은 후천성 면역결핍증(AIDS)을 일으키는 사람의 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)에서 강한 항원성을 나타내는 항원인 지피 41(gp41)과 지에이지 3(gag3)단백질의 유전자를 대장균내에서 발현시킨 후에 신속하면서도 용이하게 고순도로 정제하여 민감도와 특이성이 높은 HIV-1항원 단백질 gp41 및 gag3을 제조하는 방법에 관한 것이다.

AIDS의 확산을 막기 위한 조기 진단을 위하여 유전공학적 기법으로 대장균내에서 생산된 HIV-1항원을 이용한 많은 진단시약이 개발되었다. HIV-1항원 및 코아항원을 대장균내에서 대장균 단백질과 융합된 형태로 생산하여 진단법에 응용하였는데(Dowbenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7748-7752(1985); Crowl et al., CELL 41, 979-980(1985); Windheuser et al., Gene 64, 107-119(1988)), 이때 융합 파트너로 쓰인 대장균단백질은 가끔 위양성반응(false positives)을 일으키는 단점이 있었다.

그후 융합된 형태의 항원을 절단하여 이런단점을 제거하려는 시도가 있었는데(Chang et al., Biotechnology 3, 985-990(1985); Ellinger et al., Virology 180, 811-813(1991)), 이런 방법들은 항원들을 분리하는 과정이 길고 단계가 많을 뿐 아니라 수율도 낮아 생산 원가가 높고, 대장균 단백질을 완전히 제거하지 못해 이로 인한 위양성 반응(false positives)이 계속 문제점이 되고 있다.

본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 HIV-1세포막(env) 단백질의 아미노 말단 부위(gp41)와, 코아 단백질인 p24와 p17단백질(p24-p17-p15)을 대장균 단백질, 예를 들면 베타 갈락토시다제 또는 트립 E 단백질과 융합된 형태로 대장균내에서 대량 생산하고 이것을 융합단백질인 베타 갈락토시다제 또는 트립 E단백질로부터 하이드록실아민으로 절단유리시킨 후 DEAE-세파로스 등의 이온 교환수지를 이용한 크로마토그래피법으로 순수분리하였다. gp41과 gag(p15-p24-p17)는 항원성이 높고 개체간 변이가 작아서 진단 목적에 적합하며 대장균에서 생산되었을 때에도 AIDS환자 혈액과 잘 반응하였다. gag중 gag3(gag아미노산 서열중 120-436)은 진단목적에 특히 바람직한 단백질이다. SDS-겔 전기영동결과 이들 단백질이 순수하게 분리되었고, 이들 분리된 단백질을 사용한 효소면역 측정법으로 HIV-1양성 및 음성혈장을 대상으로 조사해 본 결과 이들 단백질이 HIV-1 항체에 대하여 민감도와 특이성이 높음이 밝혀졌다. 또한, 이들 분리된 단백질의 수율도 높아(10mg/ℓ 내지 20mg/ℓ) 기존의 방법보다 진보된 것임을 알 수 있었다. 이처럼 민감도와 특이도가 높은 이유는 항원정제가 매우 간단하고 고순도이기 때문에 가능한 것으로 사료된다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예 1 : HIV-1 항원 gp41단백질의 제조

단계 1 HIV-1항원 gp41단백질 발현 플라스미드의 제조

gp41을 대장균내에서 대량 생산하는 발현 플라스미드를 제조하기 위하여 아래와 같은 유전자 조작을 하였다. 먼저 이미 클론된 pBH10(Ratner et al., Nature 313, 227-284(1985))으로부터 제한효소 HaeIII와 HindIII로 절단하여 gp41부위를 잘라낸후, 클레나우 절편으로 양 끝을 블런트로 만들고, 발현 벡터 pATH2(KIST, 유전공학연구소내 유향숙 박사)내의 Sam I위치에 삽입하여 트립 E의 카르복실 말단과 연결시켰다(제1도). 또 발현된 융합단백질로부터 gp41 을 쉽게 분리 정제할 수 있도록 트립E단백질과 gp41사이에 하이드록실아민 인지부위, 즉 아스파라진글라이신 잔기를 코딩하는 유전자(GGG AAT TCG AAC GGC)를 삽입하였다. 이렇게 만들어진 발현 플라스미드 pYJM-env2)로부터 gp41의 아미노말단에 해당하는 DNA절편을 Msp I과 Cla I으로 절단한 후, 이것을 발현용 벡터인 pCT10(Choi et al., Korean Biochem. J. 21, 102-109(1988))의 베타 갈락토시다제 유전자 내에 위치한 제한효소 Cla I위치에 삽입하여 전구-YCM-envv2를 제조하였다. 이렇게하여 조립된 전구-YCM-env2는 아미노말단에 207개의 아미노산을 코딩하는 베타-갈락토시다제 유전자가 있고, 그 뒤에 하이드록실아민에 의해 인지되어 절단되는 자리가 있으며, 이어서 102개의 아미노산을 코딩하는 gp41유전자가 있게 된다. 그 다음, gp41바로뒤에 종사종결 코돈을 넣기 위하여 Cla I으로 절단한후 대장균의 DNA폴리머라제 크레나우로 양끝을 메꾼뒤 다시 연결하여 gp41발현 플라스미드 pYCM-env2를 제조하였다(제1도). 본 출원인은 gp41 발현벡터 pYCM-env2를 대장균 JM109에 형질감염시켜 이를 1992년 4월 24일자로 유전자은행에 기탁번호 KCTC-8514P로 기탁하였다.

단계 2 : 대장균에서 gp41의 발현

gp41의 발현은, 발현벡터 pYCM-env2를 가진 대장균을 LB배지에서 하룻밤 배양하여 얻은 배양액 5㎖를 100㎍/㎖의 엠피실린이든 LB배지 100㎖에 접종하고, 37℃에서 3 내지 4시간 배양한후, IPTG9isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 최종 2mM로 넣어 12-16시간 배양하여 융합단백질의 생산을 유도(induction)하였고, 이를 SDS-겔 전기영동으로 확인하였다. 유도하기 전에 비하여 유도후 발현된 단백질은 대장균 전체단백질의 약 40%를 차지하며, 인크루전 바디(inclusion body)형태로 세포내에 존재함을 알았다. 44,000달톤의 유도된 단백질이 gp41을 포함한다는 것을 웨스턴 블로팅(western blotting)을 통해 확인했다.

단계 3 : gp41의 분리

pYCM-env2를 가진 대장균에서 만들어진 인크루전 바디를 4 내지 5M의 요소 완충용액으로 2번 정도 씻어주면 인크루전 바디는 용해되지 않으나 대부분의 대장균 세포 단백질은 용해되므로 비교적 순수한 융합단백질만을 얻을 수 있었다. 분리된 융합 단백질을 8M의 요소용액(50mM 트리스, 10mM DTT, 1mM EDTA, pH7.8)에 녹여 하이드록실아민과 45℃에서 4시간 반응시켜 베타갈락토시다제와 gp41사이에 있는 아스파라진-글라이신 잔기를 절단한 뒤 이 반응액을 SDS 젤전기영동한 결과 9,000달톤의 gp41밴드를 확인할 수 있었으며 그 절단 효율 또한 60% 이상으로 매우 높았다. 하이드록실아민 반응액의 pH를 2 내지 3으로 낮춘 후 증류수에 하룻밤동안 투석하여 gp41 및 베타갈락토시다제의 단편들을 침전시켰다. 이것을 원심분리하여 침전물만을 취하여 8몰의 요소용액(5mM 트리스, pH 7.8)에 녹인 후 0.4㎖/분의 유속으로 DEAE-세파로스(11×2.8)이온 교환수지 크로마토그래피를 실시한 결과 제2도의 (a)에서와 같이 비흡착 부분인 두개의 피이크 1, 2와 나머지 흡착부위로서 0.5몰 염분으로 융출되어 나오는 피이크 3을 얻었으며 gp41은 비흡착 부위의 앞 피이크, 즉 피이크 1에서 추출되었다. 또한 280nm에서 각 분획들의 흡광도를 조사하며 단백질 피이크 부분의 각 분획들을 15% SDS 젤 전기영동으로 확인한 결과 제2(b)도에서 보는 바와 같이 피이크1에 해당하는 분획들에서 순수한 gp41이 정제되었음을 확인하였다. 이 방법으로 정제된 gp41의 생산량은 평균 10 내지 20㎖/ℓ이었다.

실시예 2 : HIV-1항원 gag3단백질의 제조

단계 1 : HIV-1항원 gag2단백질 발현 플라스미드의 제조-

HIV-1 gag3단백질을 대장균에서 대량으로 얻기 위하여 발현벡터 pYEM-Gag/env2(KCTC 8516P)에서 Ban II-Cla I 제한효소로 잘라진 DNA절편을 제거시키고 나머지 부분을 접합시켜 pYHCM-gag3발현벡터를 제조하였다(제3도). 본 발명자들은 gag3 발현벡터 pYHCM-gag3를 대장균 HB101에 형질감염시켜 이를 1992년 4월 24일자로 유전자은행에 기탁번호 KCTC-8515P로 기탁하였다.

단계 2 : 대장균에서 gag3의 발현 및 분리

이 플라스미드 pYHCM-gag3은 트립 프로모터의 조절을 받아 trpE단백질과 p17의 카르복실 말단의 12개 아미노산과 주코아 단백질인 p24 및 p15의 아미노말단이 합쳐진 약 70킬로달톤의 trpE-gag3의 융합단백질이 만들어지도록 한다. 이 발현벡터 pYHCM-gag3을 가진 HB101대장균을 세포농도가 A₆₀₀=0.8-0.9되도록 기르고 인돌 아크릴릭산(3-Indole acrylic acid)을 최종농도 10mM이 되도록 첨가하여 트립 E융합 단백질의 발현을 유도하고 계속해서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하여 SDS젤 전기영동으로 확인한 결과 이 융합 단백질이 전체 대장균 세포 단백질의 40%까지 합성되었다. 인크루전 바디의 분리를 위해 1리터 M9배양액(리터당 6g Na₂HPO₄, 3g KH₂PO₄, 1g NH₄Cl, 0.5g NaCl)으로 부터 모은 대장균을 TE 용액(50mM Tris, 1mM EDTA pH 7.8)에 녹여 초음파 파쇄기로 30분간 파쇄한 후 이것을 5000x g에서 10분간 원심분리하여 모아진 침전물을 융합단백질의 불융성을 이용하여 1 내지 2M요소 완충용액으로 두번 정도 씻어준 다음 8M요소 완충용액에 녹여 이것을 12000 x g에서 30분간 원심분리하여 상등액만을 취하여 이들의 정제 정도를 10% SDS-젤 전기영동으로 확인한 결과 68,000달톤에서 거의 순수한 융합단백질제를 얻었다. 분리된 융합 단백질을 8M요소에 녹여 2M 하이드록실아민과 45℃에서 4시간 반응시켜 트립E와 gag3 사이에 있는 아스파라진-글라이신 잔기 사이를 절단한 뒤 증류수로 하룻밤동안 투석한 후 생긴 침전물을 12000x g에서 30분간 원심분리하여 모은후 이 침전물을 조사한 결과 31,000달톤의 gag3밴드를 확인할 수 있었으며 절단 효율 또한 60∼70%이상이었다. 8M 요소용액(50mM Tris-HCl, 10mM DTT, 1mM EDTA, pH 7.8)로 미리 씻은 DEAE-세파로스 컬럼(12×2.8)에 상기의 과정에서 모은 침전물을 동일 용액에 녹여 주입하여 통과시킨 후 흡착부분을 0.50 및 100mM염분이 포함된 8M 요소용액으로 용출시켰다. 280nm에서 각 분획들의 흡광도를 조사한 결과, 제4도의 (a)에서와 같이 50mM과 100mM에서 단백질 피이크가 나타났으며, 각 분획물들을 SDS-젤 전기영동으로 확인한결과, 제4도의 (b)에서 보는 바와 같이 피이크 1에서 해당되는 분획들에서 순수한 gag3가 정제되었음을 확인하였다. 이러한 방법으로 정제된 gag3의 생산량은 평균 10 내지 20㎖/ℓ이다.

실시예 3 : gp41 및 gag3 단백질을 이용한 HIV-1 항체의 진단

단계 1 : gp41과 gag3를 이용한 효소면역측정

정제된 gp41와 gag3를 각각 또는 혼합하여 HIV-1항원으로서의 높은 특이도와 민감도의 조건들을 결정하기 위해 기존의 효소면역측정법으로 실험을 수행하였다. 상기에서 얻은 항원을 8M요소에 10㎍/㎖ 의 농도로 녹이고 이 항원용액 100㎕를 96웰 폴리비닐 마이크로 타이퍼 플레이트에 코팅한 후 10% 우 태아 혈청 또는 3% 탈지 분유를 블로킹 용액으로, 스크립스(Scripps)사에서 구입한 불활성화시킨 고 타이터 HIC-1 양성 혈장 및 정상혈장을 시료로 사용하였다. 생리식염수로 3번 플레이트를 씻고 50㎕의 퍼옥시다제가 결합된 이차항체를 넣은 후 2시간동안 37℃에서 놔둔 다음 다시 식염수로 씻어내고 0.2mM ABTS[2,2'-azino-di(3-ethylbenzothiazoline sulfonate)] 100㎕와 과산화수소를 넣고 발색을 시킨 후 405nm에서 흡장도를 측정하였다. 그 결과를 제5도에 나타내었다. 결과를 살펴보면, gp41 과 gag3에 대해서 양성 혈장은 높은 흡광도를 보인 반면 정상인 경우 낮은 흡광도를 보였으며 gp41, gag3 모두 비슷한 흡광도 프로필를 보였다. 피검혈장의 최종 희석배율은 6,400이며 혈장의 최적 희석 배율은 400에서 1600범위내에 들어가는 것으로 나타나고 있다.

단계 2 : 분리된 gp41과 gag3항원의 특이도 민감도측정

정제된 gp41과 gag3의 HIV-1 항원으로서의 특이도와 민감도를 조사하기 위하여 여러 HIV-1 양성 혈장과 음성 혈장을 대상으로 상기 효소면역측정법과 동일한 방법으로 실험하였다. 그 결과를 제6도에 나타내었다. 그 결과를 살펴보면, 음성을 음성으로 잡아낼 수 있는 특이도(specificity)는 gp41, gag3 또는 gp41과 gag3를 합친 경우 모두 100%이었다. 양성을 양성으로 판정할 수 있는 민감도(sensitivity)는 gag3의 경우 95%이지만 gp41단독으로 또는 같이 합쳤을 때 100%이었다. 이 결과를 기존의 재조합 HIV-1항원과 비교하여 보면 다음의 표 1과 같다. 이들 실험에서 사용한 항원의 양은 대략 1㎕/웰으로서 대부분 효소면역 측정법에 의하여 수행되었다.

본 발명에서 제시된 방법으로 정제된 HIV-1항원은 특히 항체 형성 기간이 오래 경과하지 않아 항체의 양이 많지 않은 피검자의 경우에도 양성으로 판정할 수 있는 민감도를 지녔음이 밝혀졌다. 한 환자에서 시간적 간격을 두고 채취한 혈장을 가지고 기존의 효소면역 측정법을 이용한 진단킷과 정제된 gp41과 gag3 그리고 gp41+gag3와 비교하여 본 결과 다음과 표 2와 같았다.

상기의 표 2에서 보는 바와 같이 이 시료는 웨스턴 블로팅에 의해서 양성으로 판정된 날부터 기존의 효소면역측정법 제품들과 본 발명에서 정제된 gp41과 gag3를 항원으로 이용한 방법으로 검사되었는데, 기존제품은 처음 3개월 15일동안을 검사해낼 수 없었으나 본 발명의 항원들로는 이들을 검출 해낼 수 있었다.

이상에서 본 바와 같이 유전자 재조합 기술에 의해 발현된 gp41, gag3는 본 발명에 기술된 방법을 통해 이전보다 훨씬 손쉽고 신속하게 고순도로 정제할 수 있으며 이 단백질은 항체에 대한 그 민감도와 특이성이 높아 진단 시약의 좋은 재료로 사용될 것으로 기대된다.

Claims (10)

1. 탁(tac) 프로모터, 베타 갈락토시다제 유전자, 하이드록실아민 인식부위 및 HIV-1(사람면역결핍 바이러스 타입 1) gp41을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 베타 갈락토시다제와 gp41의 융합 단백질로 구성된 인크루전 바디를 생산한 다음, 이 인크루전 바디를 하이드록실아민으로 처리하여 gp41을 유리시키고, DEAE-세파로스 컬럼에서 비 gp41 단백질을 흡착시킴으로써 gp41 단백질을 순수하게 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 HIV-1 항원 gp41의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 대장균은 대장균 JM109/pYCM-env2(KCTC 8514P)인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 베타갈락토시다제와 gp41의 융합 단백질로 구성된 인크루전 바디를 5M 요소용액으로 씻어냄으로써 비 gp41 단백질을 제거시키는 단계를 포함하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 하이드록실아민에 의해 유리되어 나온 gp41을 50mM트리스, 8M 요소, pH 7.8의 용액에 녹이는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, gp41을 DEAE 세파로스 컬럼에서 50mM트리스, 8M 요소, pH 7.8용액으로 용출시킬 때 첫번째 비흡착 피이크에서 수확하는 방법.
6. 트립토판 프로모터, 트립 E 유전자, 하이드록실아민 인식부위 및 HIV-1 gag3을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 트립E 단백질과 gag3의 융합 단백질로 구성된 인크루전 바디를 생산한 다음, 이 인크루전 바디를 하이드록실아민으로 처리하여 gag3을 유리시키고, DEAE-세파로스 컬럼에서 비 gag3 단백질을 흡착시킴으로써 gag3 단백질을 순수하게 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 HIV-1 항원 gag3의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 혈질전환된 대장균은 대장균 HB101/pYHCM-gag3(KCTC 8515P)인 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 트립E단백질과 gag3의 융합 단백질로 구성된 인크루전 바디를 1M 요소용액으로 씻어냄으로써 비 gag3 단백질을 제거시키는 단계를 포함하는 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 하이드록실아민에 의해 유리되어 나온 gag3단백질을 50mM트리스, 8M요소, pH 7.8인 용액에 녹이는 것인 방법.
10. 제6항에 있어서, gag3 단백질을 DEAE-세파로스 컬럼으로부터 50mM 트리스, 8M 요소, pH 7.8인 용액으로 용출시킬 때 흡착된 상태에서 50mM염분이 포함된 요소 용액으로 용출시키는 것인 방법.