JP2887238B2 - ポリペプチド - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、HIV−２ウイルスのエンベロープタンパク
質（env）の少なくともひとつの抗原決定基および／ま
たは免疫原決定基からなる新規なポリペプチド、これら
のポリペプチドをコードするDNA配列、これらのDNA配列
を含有する組換えベクター、これらの組換えベクターで
形質転換された微生物、および組換えDNA技術によるそ
れらの製造方法に関する。本発明はまた、ヒト血清また
は他の生物学的体液中のHIV抗体（HIV−２抗体またはHI
V−１およびHIV−２抗体）またはHIVウイルス（HIV−２
ウイルスまたはHIV−１およびHIV−２ウイルス）の検出
方法に関する。
質（env）の少なくともひとつの抗原決定基および／ま
たは免疫原決定基からなる新規なポリペプチド、これら
のポリペプチドをコードするDNA配列、これらのDNA配列
を含有する組換えベクター、これらの組換えベクターで
形質転換された微生物、および組換えDNA技術によるそ
れらの製造方法に関する。本発明はまた、ヒト血清また
は他の生物学的体液中のHIV抗体（HIV−２抗体またはHI
V−１およびHIV−２抗体）またはHIVウイルス（HIV−２
ウイルスまたはHIV−１およびHIV−２ウイルス）の検出
方法に関する。
1986年に、HIV−２と命名された新しいウイルスが西
部アフリカのAIDS患者から単離された（Clavelら:Scien
ce,233:343〜346,1986;Clavelら:Nature,234:691〜695,
1986）。その形態、リンパ向性およびT4陽性細胞に対す
るin vitro細胞変性活性に基づいて、このウイルスはAI
DS原因HIV−１ウイルスと関連づけられた。しかしなが
ら、これらの類似性にもかかわらず、HIV−１とHIV−の
遺伝子の比較では、限られた配列ホモロジーを示すにす
ぎなかつた（Guyaderら:Nature,326:662〜669,1987）。
部アフリカのAIDS患者から単離された（Clavelら:Scien
ce,233:343〜346,1986;Clavelら:Nature,234:691〜695,
1986）。その形態、リンパ向性およびT4陽性細胞に対す
るin vitro細胞変性活性に基づいて、このウイルスはAI
DS原因HIV−１ウイルスと関連づけられた。しかしなが
ら、これらの類似性にもかかわらず、HIV−１とHIV−の
遺伝子の比較では、限られた配列ホモロジーを示すにす
ぎなかつた（Guyaderら:Nature,326:662〜669,1987）。
これまでに20種以上の異なるHIV−２ウイルスが、西
部アフリカのAIDS患者ならびにヨーロツパのAIDS患者か
ら単離されている（Guyaderら：前出;Brun−Vezinetら:
Lancet,I,128〜132,1987）。これらのAIDS患者の血清は
HIV−1 ELISAではすべて陰性であつた（Brun−Vezinet
ら：前出）。したがつて、ヒト血液および他の体液中の
HIV−２ウイルスを正確かつ迅速に診断する方法の必要
性はきわめて高い。
部アフリカのAIDS患者ならびにヨーロツパのAIDS患者か
ら単離されている（Guyaderら：前出;Brun−Vezinetら:
Lancet,I,128〜132,1987）。これらのAIDS患者の血清は
HIV−1 ELISAではすべて陰性であつた（Brun−Vezinet
ら：前出）。したがつて、ヒト血液および他の体液中の
HIV−２ウイルスを正確かつ迅速に診断する方法の必要
性はきわめて高い。
したがつて、HIV−２ウイルスのエンベロープタンパ
ク質（env）の少なくともひとつの抗原決定基および／
または免疫原決定基に相当するアミノ酸配列を有する新
規なポリペプチドを組換えDNA技術を用いて製造した。
これらのポリペプチドは、ヒト血清または他の生物学的
体液中のHIV−２抗体またはHIV−２ウイルスもしくはそ
のフラグメントの検出を可能にする。
ク質（env）の少なくともひとつの抗原決定基および／
または免疫原決定基に相当するアミノ酸配列を有する新
規なポリペプチドを組換えDNA技術を用いて製造した。
これらのポリペプチドは、ヒト血清または他の生物学的
体液中のHIV−２抗体またはHIV−２ウイルスもしくはそ
のフラグメントの検出を可能にする。
本発明はしたがつて、HIV−2envタンパク質の少なく
ともひとつの抗原決定基および／または免疫原決定基に
相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
ともひとつの抗原決定基および／または免疫原決定基に
相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
さらに詳しくは、本発明は、HIV−2envタンパク質の
少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫原性
決定基に相当する式 で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまた
はその機械的均等配列を有するポリペプチドに関する。
本発明はまた、さらにアフイニテイーペプチドおよび担
体ポリペプチドが共有結合している上に定義したポリペ
プチド、フラグメントおよび機能的均等配列に関する。
アフイニテイーペプチドと、アミノ酸配列がHIV−１エ
ンベロープタンパク質（env）および／またはHIV−１コ
アタンパク質（gag）の少なくともひとつの抗原決定基
および／または免疫原決定基に相当するポリペプチドが
さらに共有結合している上に定義したポリペプチドも包
含される。このような融合タンパク質はHIV−１ウイル
スのみでなくHIV−２ウイルスの抗原決定基および／ま
たは免疫原決定基を有するので、これらの融合ポリペプ
チドは、ヒト血清または他の生物学的体液中のHIV−１
およびHIV−２抗体またはHIV−１およびHIV−２ウイル
スもしくはそれらのフラグメントの有効な同時検出用ツ
ールを提供する。
少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫原性
決定基に相当する式 で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまた
はその機械的均等配列を有するポリペプチドに関する。
本発明はまた、さらにアフイニテイーペプチドおよび担
体ポリペプチドが共有結合している上に定義したポリペ
プチド、フラグメントおよび機能的均等配列に関する。
アフイニテイーペプチドと、アミノ酸配列がHIV−１エ
ンベロープタンパク質（env）および／またはHIV−１コ
アタンパク質（gag）の少なくともひとつの抗原決定基
および／または免疫原決定基に相当するポリペプチドが
さらに共有結合している上に定義したポリペプチドも包
含される。このような融合タンパク質はHIV−１ウイル
スのみでなくHIV−２ウイルスの抗原決定基および／ま
たは免疫原決定基を有するので、これらの融合ポリペプ
チドは、ヒト血清または他の生物学的体液中のHIV−１
およびHIV−２抗体またはHIV−１およびHIV−２ウイル
スもしくはそれらのフラグメントの有効な同時検出用ツ
ールを提供する。
本発明の好ましいポリペプチドは一般式 Ａ−Ｂ−Ｃ Ａ−Ｃ−Ｂ および Ｃ−Ｂ−Ａ （式中、Ａはアフイニテイーペプチドであり、Ｂは式Ｉ
のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、Ｃは担体
ポリペプチドまたはアミノ酸配列がHIV−１エンベロー
プタンパク質（env）および／またはHIV−１コアタンパ
ク質（gag）の少なくともひとつの抗原決定基および／
または免疫原決定基に相当するポリペプチドである）で
定義される。
のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、Ｃは担体
ポリペプチドまたはアミノ酸配列がHIV−１エンベロー
プタンパク質（env）および／またはHIV−１コアタンパ
ク質（gag）の少なくともひとつの抗原決定基および／
または免疫原決定基に相当するポリペプチドである）で
定義される。
本発明のとくに好ましいポリペプチドは、式 で示されるアミノ酸配列を有する。
本発明のポリペプチドに関連して用いられる「機能的
均等配列」の語は、上述のアミノ酸配列からヌクレオチ
ド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌ
クレオチド付加によつて誘導され、HIV−2envタンパク
質の少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫
原決定基に相当するアミノ酸配列のポリペプチドに関す
る。
均等配列」の語は、上述のアミノ酸配列からヌクレオチ
ド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌ
クレオチド付加によつて誘導され、HIV−2envタンパク
質の少なくともひとつの抗原決定基および／または免疫
原決定基に相当するアミノ酸配列のポリペプチドに関す
る。
ポリペプチドのアミノ酸配列中のある種の置換はポリ
ペプチドの生物学的活性に影響を与えない。このような
アミノ酸置換の例としては、Ala/Ser,Val/Ile/,Asp/Gl
u,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,
Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Al
a/Gluおよびその逆を挙げることができる（Doolittle:
“The Proteins",Neurath,H.＆ Hill,R.L.著,Academic
Press,New York,1979）。
ペプチドの生物学的活性に影響を与えない。このような
アミノ酸置換の例としては、Ala/Ser,Val/Ile/,Asp/Gl
u,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,
Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Al
a/Gluおよびその逆を挙げることができる（Doolittle:
“The Proteins",Neurath,H.＆ Hill,R.L.著,Academic
Press,New York,1979）。
アフイニテイーペプチドとは、アフイニテイークロマ
トグラフイー担体材料に好んで結合するアミノ酸配列を
含有するペプチドを意味する。このようなアフイニテイ
ーペプチドの例は、少なくとも２個のヒスチジン残基を
含有するペプチドである（これに関してはヨーロツパ特
許出願公告第282 042号参照）。このようなアフイニテ
イーペプチドはニトリロ三酢酸−ニツケルキレート樹脂
に選択的に結合する（Hochuli ＆ Dbeli:Biol,Chem.H
oppe−Seyler,368:748,1987;ヨーロツパ特許出願公告第
253 303号）。したがつて、このようなアフイニテイー
ペプチドを含有するポリペプチドは他のペプチドから選
択的に分離できる。このアフイニテイーペプチドは、式
Ｉのアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまたはその
機能的均等配列を有するポリペプチドのＣ末端またはＮ
末端のいずれかに結合させることができる。
トグラフイー担体材料に好んで結合するアミノ酸配列を
含有するペプチドを意味する。このようなアフイニテイ
ーペプチドの例は、少なくとも２個のヒスチジン残基を
含有するペプチドである（これに関してはヨーロツパ特
許出願公告第282 042号参照）。このようなアフイニテ
イーペプチドはニトリロ三酢酸−ニツケルキレート樹脂
に選択的に結合する（Hochuli ＆ Dbeli:Biol,Chem.H
oppe−Seyler,368:748,1987;ヨーロツパ特許出願公告第
253 303号）。したがつて、このようなアフイニテイー
ペプチドを含有するポリペプチドは他のペプチドから選
択的に分離できる。このアフイニテイーペプチドは、式
Ｉのアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまたはその
機能的均等配列を有するポリペプチドのＣ末端またはＮ
末端のいずれかに結合させることができる。
本発明のポリペプチドに関連して用いられる「担体ポ
リペプチド」の語は、それ自体はHIV−2envタンパク質
の抗原決定基および／または免疫原決定基を含まない
が、式Ｉのアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまた
はその機能的均等配列を有するポリペプチドの発現に必
要なポリペプチドに関する。担体ポリペプチドとして
は、好ましくは、大腸菌クラロラムフエニコールアセチ
ルトランスフエラーゼ（CAT）およびマウスジヒドロ葉
酸リダクターゼ（DHFR）が考えられる。
リペプチド」の語は、それ自体はHIV−2envタンパク質
の抗原決定基および／または免疫原決定基を含まない
が、式Ｉのアミノ酸配列もしくはそのフラグメントまた
はその機能的均等配列を有するポリペプチドの発現に必
要なポリペプチドに関する。担体ポリペプチドとして
は、好ましくは、大腸菌クラロラムフエニコールアセチ
ルトランスフエラーゼ（CAT）およびマウスジヒドロ葉
酸リダクターゼ（DHFR）が考えられる。
本発明のポリペプチドは、その製造方法のために、最
初のＮ末端アミノ酸としてメチオニン（ATGをコードす
る）を含有することがある。また微生物宿主が翻訳生成
物を部分的または完全にプロセツシングできる場合は、
Ｎ末端メチオニンは切断除去される。
初のＮ末端アミノ酸としてメチオニン（ATGをコードす
る）を含有することがある。また微生物宿主が翻訳生成
物を部分的または完全にプロセツシングできる場合は、
Ｎ末端メチオニンは切断除去される。
本発明のポリペプチドは、マルチマーの形で、たとえ
ばダイマー、トリマー、テトラマー等の形で存在するこ
ともできる。もちろん、本発明のポリペプチドは、さら
にアミノ酸配列がHIV−２コアタンパク質（gag）の少な
くともひとつの抗原決定基および／または免疫原決定基
に相当するポリペプチドを共有結合することもできる。
ばダイマー、トリマー、テトラマー等の形で存在するこ
ともできる。もちろん、本発明のポリペプチドは、さら
にアミノ酸配列がHIV−２コアタンパク質（gag）の少な
くともひとつの抗原決定基および／または免疫原決定基
に相当するポリペプチドを共有結合することもできる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするDN
A配列、これらのDNA配列を含有する組換えベクター、本
発明のポリペプチドを製造するための単細胞生物、なら
びにこのようなDNA配列、組換えベクターおよび単細胞
生物の製造方法を提供する。本発明のポリペプチドの発
現、単離および精製方法も包含される。このようにして
製造された本発明のポリペプチドは、本発明の方法を用
いる多くの重要な免疫学的操作に使用することができ
る。
A配列、これらのDNA配列を含有する組換えベクター、本
発明のポリペプチドを製造するための単細胞生物、なら
びにこのようなDNA配列、組換えベクターおよび単細胞
生物の製造方法を提供する。本発明のポリペプチドの発
現、単離および精製方法も包含される。このようにして
製造された本発明のポリペプチドは、本発明の方法を用
いる多くの重要な免疫学的操作に使用することができ
る。
本発明のポリペプチドは、ヒト血清中のHIV−２ウイ
ルスに対する抗体の検出、またはヒト血清中のHIV−１
およびHIV−ウイルスに対する抗体（以下、合わせてHIV
ウイルスに対する抗体という）の同時検出のための診断
剤として使用できる。これらは均一な形に製造できるの
で、比較的粗製のウイルスHIVタンパク質分解物に基づ
く診断剤の使用における従来の限界であつた非特異的反
応の問題は消失する。
ルスに対する抗体の検出、またはヒト血清中のHIV−１
およびHIV−ウイルスに対する抗体（以下、合わせてHIV
ウイルスに対する抗体という）の同時検出のための診断
剤として使用できる。これらは均一な形に製造できるの
で、比較的粗製のウイルスHIVタンパク質分解物に基づ
く診断剤の使用における従来の限界であつた非特異的反
応の問題は消失する。
免疫原として使用する場合、本発明のポリペプチド
は、これらのポリペプチドに含まれる抗原決定基に対す
る抗体を動物に産生させるために使用できる。一方、こ
のような抗体は、適当に標識した本発明のポリペプチド
と組合せて、ヒト血清または生物学的液体たとえば涙
液、精液、膣分泌液および唾液中におけるHIV−２ウイ
ルスまたはHIV−１およびHIV−２ウイルス（以下、合わ
せてHIVウイルスという）またはその粒子の存在を検出
するために、放射免疫検定（RIA）または酵素免疫検定
（ELISA）に使用できる。これらの方法を用いて検出で
きるHIVウイルスの粒子（またはフラグメント）にはも
ちろん、ウイルスのHIVエンベロープタンパク質（env）
の断片も包含される。
は、これらのポリペプチドに含まれる抗原決定基に対す
る抗体を動物に産生させるために使用できる。一方、こ
のような抗体は、適当に標識した本発明のポリペプチド
と組合せて、ヒト血清または生物学的液体たとえば涙
液、精液、膣分泌液および唾液中におけるHIV−２ウイ
ルスまたはHIV−１およびHIV−２ウイルス（以下、合わ
せてHIVウイルスという）またはその粒子の存在を検出
するために、放射免疫検定（RIA）または酵素免疫検定
（ELISA）に使用できる。これらの方法を用いて検出で
きるHIVウイルスの粒子（またはフラグメント）にはも
ちろん、ウイルスのHIVエンベロープタンパク質（env）
の断片も包含される。
本発明のポリペプチドは、ペプチド合成の慣用方法に
より、液相または好ましくは固相中で、たとえばMerrif
ieldの方法（J.Am.Chem.Soc.,85:2149〜2154,1963）ま
たは本技術状態の他の均等方法によつて製造できる。
より、液相または好ましくは固相中で、たとえばMerrif
ieldの方法（J.Am.Chem.Soc.,85:2149〜2154,1963）ま
たは本技術状態の他の均等方法によつて製造できる。
別法としては、本発明のポリペプチドはまた、DNA組
換え技術の方法を用いて製造することもできる（Maniat
isら：“Molecular Cloning−A Laboratory Mannual",C
old Spring Harbor Laboratory,1982）。たとえば、本
発明のポリペプチドをコードするDNA配列は慣用の化学
的方法、たとえばホスホトリエステル法（Narangら:Met
h,Enzymol.,68:90〜108,1979）またはホスホジエステル
法（Brownら:Meth.Enzymol.,68:109〜151,1979）によつ
て合成できる。DNAフラグメントのヌクレオチド配列は
天然のHIV−２またはHIV−１とHIV−２ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列と同一であつてもよい。一
方、遺伝暗号は退化するので、部分的にまたは完全に異
なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードす
る可能性がある。所望により、ポリペプチドの発現に際
し宿主微生物によつて好んで用いられるコドンのヌクレ
オチド配列を選択することもできる（Grosjeanら:Gene,
18:199〜209,1982）。しかしながら、このようにして得
られたDNA配列が発現ベクターの構築を困難にするよう
な部分配列を含まないように、たとえば望ましくない制
限酵素切断部位が導入されないように注意すべきであ
る。
換え技術の方法を用いて製造することもできる（Maniat
isら：“Molecular Cloning−A Laboratory Mannual",C
old Spring Harbor Laboratory,1982）。たとえば、本
発明のポリペプチドをコードするDNA配列は慣用の化学
的方法、たとえばホスホトリエステル法（Narangら:Met
h,Enzymol.,68:90〜108,1979）またはホスホジエステル
法（Brownら:Meth.Enzymol.,68:109〜151,1979）によつ
て合成できる。DNAフラグメントのヌクレオチド配列は
天然のHIV−２またはHIV−１とHIV−２ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列と同一であつてもよい。一
方、遺伝暗号は退化するので、部分的にまたは完全に異
なるヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードす
る可能性がある。所望により、ポリペプチドの発現に際
し宿主微生物によつて好んで用いられるコドンのヌクレ
オチド配列を選択することもできる（Grosjeanら:Gene,
18:199〜209,1982）。しかしながら、このようにして得
られたDNA配列が発現ベクターの構築を困難にするよう
な部分配列を含まないように、たとえば望ましくない制
限酵素切断部位が導入されないように注意すべきであ
る。
さらに、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列
は、単離プロウイルスHIV−2DNAから、またはプロウイ
ルスHIV−２ゲノムを組込みついでそのフラグメントを
一般式Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｃ−ＢおよびＣ−Ｂ−Ａの部分
配列ＡおよびＣをコードする適当なベクター中に導入し
た細胞のゲノムDNAから単離することによつても製造で
きる。
は、単離プロウイルスHIV−2DNAから、またはプロウイ
ルスHIV−２ゲノムを組込みついでそのフラグメントを
一般式Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｃ−ＢおよびＣ−Ｂ−Ａの部分
配列ＡおよびＣをコードする適当なベクター中に導入し
た細胞のゲノムDNAから単離することによつても製造で
きる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAの製造後、こ
れらを公知の方法により、必要な発現シグナルを生成す
る適当な任意の発現ベクター中に導入することができ
る。適当なベクターは、染色体性、非染色体性および合
成DNA配列のセグメント、たとえば各種の公知プラスミ
ドおよびフアージDNAから構築できる。この関係では、
前述のManiatisらの参考書が参考になる。とくに適当な
ベクターはpDS群のプラスミドである（Bujardら:Method
s in Enzymology,Wu ＆ Grossman編,Academic Press,In
c.,155巻,416〜433,1987）。
れらを公知の方法により、必要な発現シグナルを生成す
る適当な任意の発現ベクター中に導入することができ
る。適当なベクターは、染色体性、非染色体性および合
成DNA配列のセグメント、たとえば各種の公知プラスミ
ドおよびフアージDNAから構築できる。この関係では、
前述のManiatisらの参考書が参考になる。とくに適当な
ベクターはpDS群のプラスミドである（Bujardら:Method
s in Enzymology,Wu ＆ Grossman編,Academic Press,In
c.,155巻,416〜433,1987）。
本発明の好ましい態様においては、式Ｉのアミノ酸配
列（env（60）遺伝子）をコードする合成BamH Iフラグ
メントを、プラスミドpDS78/RBS II、6xHisのBamH Iも
しくはBgl II切断DNAおよびプラスミドpRBS II−env（8
0）−gag（419）−6xHisのBgl II切断DNAと融合させ
て、本発明の式II〜IVのとくに好ましいポリペプチドの
合成をコードする発現ベクターpenv（60）−DHFR,pDHFR
−env（60）およびpRBS II−env（80）−gag（419）−e
nv（60）−6xHisを単離する。合成env（60）遺伝子の合
成は例１に記載する。そのヌクレオチド配列およびそれ
から誘導されるアミノ酸配列（ENV（60））は第１図に
示す。プラスミドpDS78/RBS II,6xHis,penv（60）−DHF
R,pDHFR−env（60）,pRBS II−env（80）−gag（419）
−6xHisおよびpRBS II−env（80）−gag（419）−env
（60）−6xHisの構築については例２〜4,6および７に詳
細に記載する。
列（env（60）遺伝子）をコードする合成BamH Iフラグ
メントを、プラスミドpDS78/RBS II、6xHisのBamH Iも
しくはBgl II切断DNAおよびプラスミドpRBS II−env（8
0）−gag（419）−6xHisのBgl II切断DNAと融合させ
て、本発明の式II〜IVのとくに好ましいポリペプチドの
合成をコードする発現ベクターpenv（60）−DHFR,pDHFR
−env（60）およびpRBS II−env（80）−gag（419）−e
nv（60）−6xHisを単離する。合成env（60）遺伝子の合
成は例１に記載する。そのヌクレオチド配列およびそれ
から誘導されるアミノ酸配列（ENV（60））は第１図に
示す。プラスミドpDS78/RBS II,6xHis,penv（60）−DHF
R,pDHFR−env（60）,pRBS II−env（80）−gag（419）
−6xHisおよびpRBS II−env（80）−gag（419）−env
（60）−6xHisの構築については例２〜4,6および７に詳
細に記載する。
本発明のポリペプチドをコードするDNA配列が発現制
御配列と有効に結合している発現ベクターは、それ自体
公知の方法により、任意の適当な宿主生物中に導入する
ことができる。適当な宿主生物の選択は、本技術分野に
おける熟練者には知られている様々の因子によつて決定
される。すなわち、たとえば、選ばれたベクターとの適
合性、発現生成物の毒性、発現特性、必要な生物学的安
全性予防手段および経費が重要であり、これらの因子の
すべての間のバランスが見出されねばならない。
御配列と有効に結合している発現ベクターは、それ自体
公知の方法により、任意の適当な宿主生物中に導入する
ことができる。適当な宿主生物の選択は、本技術分野に
おける熟練者には知られている様々の因子によつて決定
される。すなわち、たとえば、選ばれたベクターとの適
合性、発現生成物の毒性、発現特性、必要な生物学的安
全性予防手段および経費が重要であり、これらの因子の
すべての間のバランスが見出されねばならない。
適当な宿主生物としては、グラム陰性菌およびグラム
陽性菌、たとえば大腸菌および枯草菌株が考慮される。
本発明のとくに好ましい宿主生物は、大腸菌M15株（Vil
larejoら:J.Bacteriol.,120:466〜474,1974により、OZ2
91として記載されている）および大腸菌W3110株（ATCC
No.27325）である。しかしながら、上述の大腸菌株に加
えて、他の一般に入手できる大腸菌株、たとえば、大腸
菌294（ATCC No.31446）および大腸菌RR1（ATCC No.313
43）も使用できる。
陽性菌、たとえば大腸菌および枯草菌株が考慮される。
本発明のとくに好ましい宿主生物は、大腸菌M15株（Vil
larejoら:J.Bacteriol.,120:466〜474,1974により、OZ2
91として記載されている）および大腸菌W3110株（ATCC
No.27325）である。しかしながら、上述の大腸菌株に加
えて、他の一般に入手できる大腸菌株、たとえば、大腸
菌294（ATCC No.31446）および大腸菌RR1（ATCC No.313
43）も使用できる。
本発明のポリペプチドの発現方法は、選ばれた発現ベ
クター／宿主細胞系に依存する。通常、所望の発現ベク
ターを含有する宿主生物は、その宿主生物の生育に至適
の条件下に生育させる。単位時間あたりの細胞数の増加
が低下する対数生育期の終わりに、所望のポリペプチド
の発現を誘導する。すなわち、所望のポリペプチドをコ
ードするDNAを転写させ、転写されたmRNAを翻訳させ
る。この誘導は生育メジウムにインデユーサーもしくは
デイプレツサーを添加するか、または物理的パラメータ
ーを変化させるたとえば温度を変化させることにより行
うことができる。本発明の好ましい態様において用いら
れる発現ベクターでは、発現はlacレプレツサーによつ
て制御される。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）の添加により、発現制御配列を抑制す
ると、所望のポペプチドの合成が誘導される。
クター／宿主細胞系に依存する。通常、所望の発現ベク
ターを含有する宿主生物は、その宿主生物の生育に至適
の条件下に生育させる。単位時間あたりの細胞数の増加
が低下する対数生育期の終わりに、所望のポリペプチド
の発現を誘導する。すなわち、所望のポリペプチドをコ
ードするDNAを転写させ、転写されたmRNAを翻訳させ
る。この誘導は生育メジウムにインデユーサーもしくは
デイプレツサーを添加するか、または物理的パラメータ
ーを変化させるたとえば温度を変化させることにより行
うことができる。本発明の好ましい態様において用いら
れる発現ベクターでは、発現はlacレプレツサーによつ
て制御される。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）の添加により、発現制御配列を抑制す
ると、所望のポペプチドの合成が誘導される。
分析の目的で本発明のポリペプチドの少量をたとえば
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単離するためには、
宿主生物を界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）で処理して破壊する。本発明のポリペプチドの
大量回収には、機械的方法（Charmら:Meth.Enzymol.,2
2:476〜556,1971）、酵素的方法（リゾチーム処理）も
しくは化学的方法（界面活性剤処理、尿素または塩化グ
アニジニウム処理等）またはこれらの方法の組合せが使
用できる。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単離するためには、
宿主生物を界面活性剤たとえばドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）で処理して破壊する。本発明のポリペプチドの
大量回収には、機械的方法（Charmら:Meth.Enzymol.,2
2:476〜556,1971）、酵素的方法（リゾチーム処理）も
しくは化学的方法（界面活性剤処理、尿素または塩化グ
アニジニウム処理等）またはこれらの方法の組合せが使
用できる。
本発明のポリペプチドは、宿主生物から除いたのち、
公知の方法により、たとえば様々な速度での遠心分離、
硫酸アンモニウムによる沈殿、透析（常圧または減圧
で）、プレパラテイブ等電点電気泳動、プレパラテイブ
ゲル電気泳動または各種クロマトグラフイー法たとえば
ゲル濾過、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）、イオ
ン交換クロマトグラフイー、逆相クラマトグラフイーお
よびアフイニテイークロマトグラフイー（たとえばSeph
arose Blue Cl−6B上または本発明のポリペプチドに対
するモノクローナル抗体結合担体上）によつて精製する
ことができる。しかしながら、本発明のポリペプチド
は、一般式 キヤリアーマトリツクス−スペーサー −NH−（CH2）ｘ−CH（COOH）−Ｎ（CH2COO-）2Ni2+ （式中、ｘは2,3または４である）で示されるニトリロ
三酢酸（NTA）樹脂上で精製するのが好ましい。キヤリ
アーマトリツクスとしては、アフイニテイーおよびゲル
クロマトグラフイーに使用される材料、たとえば架橋デ
キストラン、アガロース（とくに、Sepharose の商品
名で知られる形）またはポリアクリルアミドが考慮され
る。スペーサーとしては、アフイニテイークロマトグラ
フイーからすでに知られているスペーサー基が使用でき
る。基−Ｏ−CH2−CH（OH）−CH2−および−Ｏ−CO−が
好ましい。
公知の方法により、たとえば様々な速度での遠心分離、
硫酸アンモニウムによる沈殿、透析（常圧または減圧
で）、プレパラテイブ等電点電気泳動、プレパラテイブ
ゲル電気泳動または各種クロマトグラフイー法たとえば
ゲル濾過、高速液体クロマトグラフイー（HPLC）、イオ
ン交換クロマトグラフイー、逆相クラマトグラフイーお
よびアフイニテイークロマトグラフイー（たとえばSeph
arose Blue Cl−6B上または本発明のポリペプチドに対
するモノクローナル抗体結合担体上）によつて精製する
ことができる。しかしながら、本発明のポリペプチド
は、一般式 キヤリアーマトリツクス−スペーサー −NH−（CH2）ｘ−CH（COOH）−Ｎ（CH2COO-）2Ni2+ （式中、ｘは2,3または４である）で示されるニトリロ
三酢酸（NTA）樹脂上で精製するのが好ましい。キヤリ
アーマトリツクスとしては、アフイニテイーおよびゲル
クロマトグラフイーに使用される材料、たとえば架橋デ
キストラン、アガロース（とくに、Sepharose の商品
名で知られる形）またはポリアクリルアミドが考慮され
る。スペーサーとしては、アフイニテイークロマトグラ
フイーからすでに知られているスペーサー基が使用でき
る。基−Ｏ−CH2−CH（OH）−CH2−および−Ｏ−CO−が
好ましい。
本発明のポリペプチドの精製にとくに好ましいNTA樹
脂は、式 ［Sepharose Cl6B］−Ｏ−CH2− CH（OH）−CH2−NH− （CH2）4CH（COOH）− Ｎ（CH2COO-）2Ni2+ で示される樹脂である。
脂は、式 ［Sepharose Cl6B］−Ｏ−CH2− CH（OH）−CH2−NH− （CH2）4CH（COOH）− Ｎ（CH2COO-）2Ni2+ で示される樹脂である。
上述のように、上述の方法に従つて得られる本発明の
ポリペプチドは、ヒト血清中のHIVウイルスに対する抗
体を検出するための診断用ツールとして使用できる。こ
の目的で本発明のポリペプチドは、多数の公知検出方法
に使用できる。
ポリペプチドは、ヒト血清中のHIVウイルスに対する抗
体を検出するための診断用ツールとして使用できる。こ
の目的で本発明のポリペプチドは、多数の公知検出方法
に使用できる。
たとえば、本発明のポリペプチドは公知の方法に従つ
て標識することができ、これらの標識ポリペプチドはHI
Vウイルスに対する抗体を含むことが疑われるヒト血清
に添加して、標識ポリペプチド／抗体複合体を生成させ
ることができる。このようにして生成した複合体はつい
で、それ自体公知の方法で検出することができる。さら
に例を示せば、本発明のポリペプチドはまた、固体支持
体上に固定化させ、ついでヒト血清サンプルと接触させ
ることができる。サンプル中のHIVウイルスに対する抗
体はこの固定化ポリペプチドに結合し、非結合ポリペプ
チドと抗体を洗浄して除去したのち、このようにして生
成した複合体を、たとえばStaphylococcus aureusプロ
テインＡ（たとえば125−ヨウ素で標識）または第二の
抗−Ig抗体（たとえば放射性同位元素またはワサビパー
オキシダーゼで標識）のような試薬を用いて検出するこ
とができる。これらの上述の検出方法には多くの修飾お
よび可能が可能なことは、本技術の熟練者には自明のと
おりであるが、その一部を以下に示す。
て標識することができ、これらの標識ポリペプチドはHI
Vウイルスに対する抗体を含むことが疑われるヒト血清
に添加して、標識ポリペプチド／抗体複合体を生成させ
ることができる。このようにして生成した複合体はつい
で、それ自体公知の方法で検出することができる。さら
に例を示せば、本発明のポリペプチドはまた、固体支持
体上に固定化させ、ついでヒト血清サンプルと接触させ
ることができる。サンプル中のHIVウイルスに対する抗
体はこの固定化ポリペプチドに結合し、非結合ポリペプ
チドと抗体を洗浄して除去したのち、このようにして生
成した複合体を、たとえばStaphylococcus aureusプロ
テインＡ（たとえば125−ヨウ素で標識）または第二の
抗−Ig抗体（たとえば放射性同位元素またはワサビパー
オキシダーゼで標識）のような試薬を用いて検出するこ
とができる。これらの上述の検出方法には多くの修飾お
よび可能が可能なことは、本技術の熟練者には自明のと
おりであるが、その一部を以下に示す。
ヒト血清または他の生物学的液体中のHIVウイルスま
たはそのフラグメントを検出するための様々な診断試験
は、本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、抗−HI
V抗体という）を用いて発展させることができる。この
ような抗体は、本発明のポリペプチドおよび生理的に許
容される担体材料からなる免疫原組成物を哺乳類または
鳥類に注射することによつて製造できる。注射に必要な
タンパク質の量は本技術の熟練者にはよく知られている
し、また既知の方法に従つて決定することができる。本
発明に関連して用いられる「担体材料」の語は、ヒトへ
の投与に適している既知の組成物または動物への接種に
使用される既知のアジユバントを指す。ヒトおよび動物
に使用するのに適当なアジユバントは、本技術の熟練者
にはよく知られている（WHO Tech.Rep.Series,595:1〜4
00,1976;Jollisら:Chemical and biological basis of
adjuvants.Mol.Biochem.Biophy.,13:1〜148,1973,Sprin
g Verlag,Berlin）。しかしながら、本発明のポリペプ
チドはリポゾームまたは他の微小担体材料に導入したの
ち、または多糖、他のポリペプチドもしくは他のポリマ
ーにカツプリングさせたのち投与することもできる。
たはそのフラグメントを検出するための様々な診断試験
は、本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、抗−HI
V抗体という）を用いて発展させることができる。この
ような抗体は、本発明のポリペプチドおよび生理的に許
容される担体材料からなる免疫原組成物を哺乳類または
鳥類に注射することによつて製造できる。注射に必要な
タンパク質の量は本技術の熟練者にはよく知られている
し、また既知の方法に従つて決定することができる。本
発明に関連して用いられる「担体材料」の語は、ヒトへ
の投与に適している既知の組成物または動物への接種に
使用される既知のアジユバントを指す。ヒトおよび動物
に使用するのに適当なアジユバントは、本技術の熟練者
にはよく知られている（WHO Tech.Rep.Series,595:1〜4
00,1976;Jollisら:Chemical and biological basis of
adjuvants.Mol.Biochem.Biophy.,13:1〜148,1973,Sprin
g Verlag,Berlin）。しかしながら、本発明のポリペプ
チドはリポゾームまたは他の微小担体材料に導入したの
ち、または多糖、他のポリペプチドもしくは他のポリマ
ーにカツプリングさせたのち投与することもできる。
とくに代表的な例では、最初の接種から数週後に１回
または２回以上の付加免疫を行うと、高含量の抗−HIV
抗体が得られる。これらはそれ自体公知の方法によつて
単離できる。
または２回以上の付加免疫を行うと、高含量の抗−HIV
抗体が得られる。これらはそれ自体公知の方法によつて
単離できる。
上述の試験では、当然、モノクロナール抗体も使用で
きる。このような抗体の製造方法は本技術分野の熟練者
にはよく知られている（Ｋhlerら:Nature,256:495〜4
97,1975）。
きる。このような抗体の製造方法は本技術分野の熟練者
にはよく知られている（Ｋhlerら:Nature,256:495〜4
97,1975）。
先に説明したように、前述の方法に従つて得られる抗
−HIV抗体は、HIVウイルスまたはそのフラグメントの検
出のための各種診断試験に使用することができる。この
ような試験は、溶液中または固体支持体上において放射
線免疫検定の形で実施できる。また、酵素免疫検定で行
うこともできる。試験は直接または抗−HIV抗体に対す
る第二の抗体により間接的に実施できる。多数の酵素活
性、たとえばペルオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスフアター
ゼを抗体にカツプリングすることができ、基質溶液後に
着色を生じる。
−HIV抗体は、HIVウイルスまたはそのフラグメントの検
出のための各種診断試験に使用することができる。この
ような試験は、溶液中または固体支持体上において放射
線免疫検定の形で実施できる。また、酵素免疫検定で行
うこともできる。試験は直接または抗−HIV抗体に対す
る第二の抗体により間接的に実施できる。多数の酵素活
性、たとえばペルオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスフアター
ゼを抗体にカツプリングすることができ、基質溶液後に
着色を生じる。
これらの試験の多くの基盤になる原理は、HIVウイル
スまたはそのフラグメントの含有が疑われるヒト血清ま
たは他の生物学的液体が既知の力価の抗−HIV抗体と反
応して抗原／抗体複合体を生成することにある。このよ
うにして生成した複合体は、それ自体公知の方法で検出
される。
スまたはそのフラグメントの含有が疑われるヒト血清ま
たは他の生物学的液体が既知の力価の抗−HIV抗体と反
応して抗原／抗体複合体を生成することにある。このよ
うにして生成した複合体は、それ自体公知の方法で検出
される。
抗−HIV抗血清を使用できる多くの他の検出方法、た
とえば各種の凝集試験があることもまた、本技術分野の
熟練者には自明のとおりであろう。この場合、抗体とHI
Vウイルスまたはそのフラグメントとの間の相互作用
は、粒子が抗−HIV抗体で被覆されているシステムを用
いて検出される。このような粒子は、たとえばラテツク
スビーズ、リポゾーム、赤血球、ポリアクリルアミドビ
ーズまたは任意の多数の適当なポリマーである。
とえば各種の凝集試験があることもまた、本技術分野の
熟練者には自明のとおりであろう。この場合、抗体とHI
Vウイルスまたはそのフラグメントとの間の相互作用
は、粒子が抗−HIV抗体で被覆されているシステムを用
いて検出される。このような粒子は、たとえばラテツク
スビーズ、リポゾーム、赤血球、ポリアクリルアミドビ
ーズまたは任意の多数の適当なポリマーである。
HIVウイルスまたはHIVウイルスに対する抗体を検出す
るための前述の方法は、本発明のポリペプチドまたは本
発明の抗−HIV抗体を含有する容器からなる適当な試験
キツトで実施することができる。
るための前述の方法は、本発明のポリペプチドまたは本
発明の抗−HIV抗体を含有する容器からなる適当な試験
キツトで実施することができる。
本明細書に添付した図面および以下の実施例は、本発
明の理解を容易にするために示すものであつて、本発明
を限定するものではない。
明の理解を容易にするために示すものであつて、本発明
を限定するものではない。
例１ 合成HIV−2env（60）遺伝子の生成 Ａ）原理 合成HIV−2env（60）遺伝子は14オリゴヌクレオチド
フラグメントから構築した。その長さは17〜31ヌクレオ
チドであつた（第１図参照） Ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの合成 オリゴヌクレオチドフラグメント１〜14は固体担体
上、Bannwarth ＆ Iaizaの記載した方法（DNA,５:413〜
419,1986）に従つて同時に合成した。
フラグメントから構築した。その長さは17〜31ヌクレオ
チドであつた（第１図参照） Ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの合成 オリゴヌクレオチドフラグメント１〜14は固体担体
上、Bannwarth ＆ Iaizaの記載した方法（DNA,５:413〜
419,1986）に従つて同時に合成した。
Ｃ）オリゴヌクレオチドフラグメントの組合せ 各100pmolのオリゴヌクレオチドフラグメント2,3,8,
9,10、ならびに4,5,6,7,11,12,13を、100単位のポリヌ
クレオチドキナーゼおよび100μCiのγ−32P−ATP（5,0
00Ci/mmol）を含むキナーゼ緩衝液（Maniatisら:Molecu
lar Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,1982）10
0μ中、37℃で15分間リン酸化した。ついで、反応混
合物に10倍過剰の冷ATPを加えた。さらに90分間インキ
ユベーシヨンしたのち、ポリヌクレオチドキナーゼを熱
失活させ（２分間、90℃）、10μの5M酢酸リチウム
（LiOAc）および100μのイソプロパノールを添加した
のち、リン酸化されたオリゴヌクレオチドフラグメント
を30分間−78℃に置いて沈殿させた。沈殿したオリゴヌ
クレオチドフラグメントを次にエタノールで洗浄し、乾
燥させた。リン酸化されたオリゴヌクレオチドフラグメ
ント2,3,8,9,10および非リン酸化フラグメント、ならび
にリン酸化オリゴヌクレオチドフラグメント4,5,6,7,1
1,12,13および非リン酸化フラグメント14を、それぞ
れ、文献記載（Maniatisら：前出）の公知方法に従つて
ハイブリダイゼーシヨンし、ついで31単位のT4リガーゼ
含有のリガーゼ緩衝液（Maniatisら：前出）100μ中
でリゲーシヨンさせた。次に、得られた２種のサブフラ
グメントを前述のようにして沈殿させ、ついでエタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。２種のサブフラグメントを次
に６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、標準
方法によつて溶出し（Maniatisら：前出）、Sephadex G
−50カラムを用いて脱塩し、前述のようにT4リガーゼを
用いてたがいに結合させると所望のHIV−2env（60）が
得られた。HIV−2env（60）遺伝子を前述の操作（ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動および脱塩）によつて精製
したのち、前述のようにリン酸化した。
9,10、ならびに4,5,6,7,11,12,13を、100単位のポリヌ
クレオチドキナーゼおよび100μCiのγ−32P−ATP（5,0
00Ci/mmol）を含むキナーゼ緩衝液（Maniatisら:Molecu
lar Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,1982）10
0μ中、37℃で15分間リン酸化した。ついで、反応混
合物に10倍過剰の冷ATPを加えた。さらに90分間インキ
ユベーシヨンしたのち、ポリヌクレオチドキナーゼを熱
失活させ（２分間、90℃）、10μの5M酢酸リチウム
（LiOAc）および100μのイソプロパノールを添加した
のち、リン酸化されたオリゴヌクレオチドフラグメント
を30分間−78℃に置いて沈殿させた。沈殿したオリゴヌ
クレオチドフラグメントを次にエタノールで洗浄し、乾
燥させた。リン酸化されたオリゴヌクレオチドフラグメ
ント2,3,8,9,10および非リン酸化フラグメント、ならび
にリン酸化オリゴヌクレオチドフラグメント4,5,6,7,1
1,12,13および非リン酸化フラグメント14を、それぞ
れ、文献記載（Maniatisら：前出）の公知方法に従つて
ハイブリダイゼーシヨンし、ついで31単位のT4リガーゼ
含有のリガーゼ緩衝液（Maniatisら：前出）100μ中
でリゲーシヨンさせた。次に、得られた２種のサブフラ
グメントを前述のようにして沈殿させ、ついでエタノー
ルで洗浄し、乾燥させた。２種のサブフラグメントを次
に６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、標準
方法によつて溶出し（Maniatisら：前出）、Sephadex G
−50カラムを用いて脱塩し、前述のようにT4リガーゼを
用いてたがいに結合させると所望のHIV−2env（60）が
得られた。HIV−2env（60）遺伝子を前述の操作（ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動および脱塩）によつて精製
したのち、前述のようにリン酸化した。
例２ プラスミドpDS78/RBS II,6xHisの構築 Ａ）プラスミドpDS78/RBS IIおよびpDM I,1の説明 プラスミドpDS78/RBS II,6xHisの構築には、プラスミ
ドpDS78/RBS IIを選択した。このプラスミドならびにプ
ラスミドpDM I,1で形質転換した大腸菌細胞は、ブダペ
スト条約に基づきドイツ微生物寄託機関（Deutschen Sa
mmlung von Mikroorganismen,Gttingen）に1987年９
月３日に寄託されている［E.coli M15（pDS75/RBS II,p
DM I,1）、DSM No.4232］。
ドpDS78/RBS IIを選択した。このプラスミドならびにプ
ラスミドpDM I,1で形質転換した大腸菌細胞は、ブダペ
スト条約に基づきドイツ微生物寄託機関（Deutschen Sa
mmlung von Mikroorganismen,Gttingen）に1987年９
月３日に寄託されている［E.coli M15（pDS75/RBS II,p
DM I,1）、DSM No.4232］。
Xba IとXho Iの切断部位の間にあつて、複製領域と、
細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ
の遺伝子を含有するpDS78/RBS IIの部分（第２図および
第３図）は、最初、プラスミドpBR322から誘導する（Bo
livarら:Gene,2:95〜113,1977;Sutcliffe:Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.,43:77〜90,1979）。しかしな
がら、β−ラクタマーゼの遺伝子は一方、制限酵素Hinc
IIおよびPst Iの切断部位が除去されることで修飾され
る。DNA配列におけるこれらの変化は、しかし、β−ラ
クタマーゼのアミノ酸配列には影響しない。プラスミド
の残りの部分には、調節可能なプロモーター／オペレー
ター要素N25 OPSN25 OP 29およびリボソーム結合部位RB
S IIがある。このリボソーム結合部位は大腸菌フアージ
T5のプロモーターPG25のリボソーム結合部位から誘導さ
れて（Gentz,R.:ハイデルベルグ大学、BRD学位論文、19
84）、DNA合成によりEcoR I/BamH Iフラグメントとして
得られる。これに続いて、マウス細胞系AT−3000のジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子がある（Changら:Nature,2
75:617〜624,1978;Mastersら:Gene,21:59〜63,1983）。
これは一方、制限酵素Bgl IIの切断部位が翻訳の停止コ
ドンの直前に挿入されることによつて変化している。さ
らに、プラスミドpDS78/RBS IIは大腸菌フアージラムダ
のターミネーターt0（Schwarzら:Nature,272:410〜414,
1978）、プロモーターを含まないクロラムフエニコール
アセチルトランスフエラーゼの遺伝子（Marcoliら:FEBS
Lett.,110:11〜14,1980）および大腸菌rrnBオペロンの
ターミネーターT1（Brosiusら:J.Mol.Biol,148:107〜12
7,1981）を含有する。
細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラクタマーゼ
の遺伝子を含有するpDS78/RBS IIの部分（第２図および
第３図）は、最初、プラスミドpBR322から誘導する（Bo
livarら:Gene,2:95〜113,1977;Sutcliffe:Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.,43:77〜90,1979）。しかしな
がら、β−ラクタマーゼの遺伝子は一方、制限酵素Hinc
IIおよびPst Iの切断部位が除去されることで修飾され
る。DNA配列におけるこれらの変化は、しかし、β−ラ
クタマーゼのアミノ酸配列には影響しない。プラスミド
の残りの部分には、調節可能なプロモーター／オペレー
ター要素N25 OPSN25 OP 29およびリボソーム結合部位RB
S IIがある。このリボソーム結合部位は大腸菌フアージ
T5のプロモーターPG25のリボソーム結合部位から誘導さ
れて（Gentz,R.:ハイデルベルグ大学、BRD学位論文、19
84）、DNA合成によりEcoR I/BamH Iフラグメントとして
得られる。これに続いて、マウス細胞系AT−3000のジヒ
ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子がある（Changら:Nature,2
75:617〜624,1978;Mastersら:Gene,21:59〜63,1983）。
これは一方、制限酵素Bgl IIの切断部位が翻訳の停止コ
ドンの直前に挿入されることによつて変化している。さ
らに、プラスミドpDS78/RBS IIは大腸菌フアージラムダ
のターミネーターt0（Schwarzら:Nature,272:410〜414,
1978）、プロモーターを含まないクロラムフエニコール
アセチルトランスフエラーゼの遺伝子（Marcoliら:FEBS
Lett.,110:11〜14,1980）および大腸菌rrnBオペロンの
ターミネーターT1（Brosiusら:J.Mol.Biol,148:107〜12
7,1981）を含有する。
pDS78/RBS IIは調節可能なプロモーター／オペレータ
ー要素N25 OPSN25 OP 29ならびにリボソーム結合部位RB
S IIを含有する。この発現シグナルの高い効率のため
に、プラスミドpDS78/RBS IIおよびその誘導体たとえば
プラスミドpDS78/RBS II,6xHisは、プロモーター／オペ
レーター要素がオペレーターへのlacリプレツサーの結
合によって抑制されている場合にのみ、大腸菌内に安定
に維持される。lacリプレツサーはlac I遺伝子によつて
コードされる。N25 OPSN25 OP 29は、細胞内に十分な数
のリプレツサー分子が存在する場合にのみ効果的に抑制
される。したがつて、リプレツサー遺伝子の発現増加を
導くプロモーター変異体を含有するlac Iq対立遺伝子が
使用された。このlac Iq対立遺伝子はプラスミドpDM I,
1中に含有される（第４図および第５図）。このプラス
ミドはlac I遺伝子のほか、細菌にカナマイシン抵抗を
付与し、選択マーカーとして使用されるneo遺伝子もも
つている。pDM I,1は上述のプラスミド類と適合性を示
す。このような発現ベクターで形質転換される大腸菌細
胞は、発現ベクターが細胞内で安定に維持されることを
保証するためにはpDM I,1を含まねばならない。このシ
ステムの誘導は、所望の細胞濃度においてメジウムにIP
TGを添加することによつて達成される。
ー要素N25 OPSN25 OP 29ならびにリボソーム結合部位RB
S IIを含有する。この発現シグナルの高い効率のため
に、プラスミドpDS78/RBS IIおよびその誘導体たとえば
プラスミドpDS78/RBS II,6xHisは、プロモーター／オペ
レーター要素がオペレーターへのlacリプレツサーの結
合によって抑制されている場合にのみ、大腸菌内に安定
に維持される。lacリプレツサーはlac I遺伝子によつて
コードされる。N25 OPSN25 OP 29は、細胞内に十分な数
のリプレツサー分子が存在する場合にのみ効果的に抑制
される。したがつて、リプレツサー遺伝子の発現増加を
導くプロモーター変異体を含有するlac Iq対立遺伝子が
使用された。このlac Iq対立遺伝子はプラスミドpDM I,
1中に含有される（第４図および第５図）。このプラス
ミドはlac I遺伝子のほか、細菌にカナマイシン抵抗を
付与し、選択マーカーとして使用されるneo遺伝子もも
つている。pDM I,1は上述のプラスミド類と適合性を示
す。このような発現ベクターで形質転換される大腸菌細
胞は、発現ベクターが細胞内で安定に維持されることを
保証するためにはpDM I,1を含まねばならない。このシ
ステムの誘導は、所望の細胞濃度においてメジウムにIP
TGを添加することによつて達成される。
プラスミドpDM I,1（第４図および第５図）は、大腸
菌細胞にカナマイシン抵抗性を付与する、トランスポゾ
ンTn5からのネオマイシンホスホトランスフエラーゼのn
eo遺伝子（Backら:Gene,19:327〜336,1982）、およびプ
ロモーター変異体Iqを有し（Calos:Nature,274:762〜76
5,1978）、lacリプレツサーをコードするlac I遺伝子
（Farabough:Nature,274:765〜769,1978）をもつてい
る。しかもプラスミドpDM I,1は、複製と娘細胞への安
定な伝達に必要なすべての情報を含むプラスミドpACYC1
84の領域（Changら:J.Bacteriol.,134:1141〜1156,197
8）も含有する。
菌細胞にカナマイシン抵抗性を付与する、トランスポゾ
ンTn5からのネオマイシンホスホトランスフエラーゼのn
eo遺伝子（Backら:Gene,19:327〜336,1982）、およびプ
ロモーター変異体Iqを有し（Calos:Nature,274:762〜76
5,1978）、lacリプレツサーをコードするlac I遺伝子
（Farabough:Nature,274:765〜769,1978）をもつてい
る。しかもプラスミドpDM I,1は、複製と娘細胞への安
定な伝達に必要なすべての情報を含むプラスミドpACYC1
84の領域（Changら:J.Bacteriol.,134:1141〜1156,197
8）も含有する。
Ｂ）プラスミドpDS78/RBS II,6xHisの構築 プラスミドpDS78/RBS II,6xHis（第６図および第７
図）の構築には、リボソーム結合部位RBS IIからなるプ
ラスミドpDS78/RBS IIのEcoR I/BamH Iフラグメントを
６個のヒスチジンをコードする領域と合体させた。
図）の構築には、リボソーム結合部位RBS IIからなるプ
ラスミドpDS78/RBS IIのEcoR I/BamH Iフラグメントを
６個のヒスチジンをコードする領域と合体させた。
この目的には、まず、二本鎖DNA配列として第６図に
示したヌクレオチド配列の２種の相補性オリゴヌクレオ
チドを前述（例１のＢ）のようにして合成した。凍結乾
燥したオリゴヌクレオチドを水に取り、４℃で１時間を
要して溶解した。DNA濃度は100nmol/mlとした。リン酸
化のためには２種のオリゴヌクレオチド各150pmolを50m
M Tris/HCl（pH8.5）および10mM MgCl20μ中、2pmol
のγ−［32P］−ATP（5,000Ci/mmol）および１単位
（Ｕ）のT4ポリヌクレオチドキナーゼとともに、37℃で
20分間インキユベーシヨンした。ついで5nmolのATPを加
え、さらに37℃で20分間インキユベーシヨンしたのち、
65℃に加熱して反応を停止させた。
示したヌクレオチド配列の２種の相補性オリゴヌクレオ
チドを前述（例１のＢ）のようにして合成した。凍結乾
燥したオリゴヌクレオチドを水に取り、４℃で１時間を
要して溶解した。DNA濃度は100nmol/mlとした。リン酸
化のためには２種のオリゴヌクレオチド各150pmolを50m
M Tris/HCl（pH8.5）および10mM MgCl20μ中、2pmol
のγ−［32P］−ATP（5,000Ci/mmol）および１単位
（Ｕ）のT4ポリヌクレオチドキナーゼとともに、37℃で
20分間インキユベーシヨンした。ついで5nmolのATPを加
え、さらに37℃で20分間インキユベーシヨンしたのち、
65℃に加熱して反応を停止させた。
２種のリン酸化オリゴヌクレオチドとリゲーシヨンす
るためのプラスミドpDS78/RBS IIのDNAは、まず2pmolの
プラスミドDNAを制限酵素BamH Iで切断することにより
製造した。DNAをフエノールで抽出し、エーテルで洗浄
し、ついで前述したように酢酸リチウム／イソプロパノ
ールを用いて沈殿させた。沈殿物を乾燥し、20μのTE
緩衝液に取つた。リン酸化オリゴヌクレオリドとのリゲ
ーシヨンは、BamH Iで切断したプラスミドDNA1.5pmol
を、２単位のT4−DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝
液中、リン酸化オリゴヌクレオチド各60pmolと15℃で２
時間インキユベーシヨンすることにより行つた。65℃で
５分間インキユベーシヨンしたのち、連結したDNAを制
限酵素Xho IおよびBamH Iで切断した。ついで、調節可
能プロモーターN25 OPSN25 OP 29、リボソーム結合部位
RBS IIならびに６個のヒスチジンをコードする領域を含
有するXho I/BamH Iフラグメント（第６図）をアガロー
スゲル電気泳動によつて単離した。
るためのプラスミドpDS78/RBS IIのDNAは、まず2pmolの
プラスミドDNAを制限酵素BamH Iで切断することにより
製造した。DNAをフエノールで抽出し、エーテルで洗浄
し、ついで前述したように酢酸リチウム／イソプロパノ
ールを用いて沈殿させた。沈殿物を乾燥し、20μのTE
緩衝液に取つた。リン酸化オリゴヌクレオリドとのリゲ
ーシヨンは、BamH Iで切断したプラスミドDNA1.5pmol
を、２単位のT4−DNAリガーゼを含有するリガーゼ緩衝
液中、リン酸化オリゴヌクレオチド各60pmolと15℃で２
時間インキユベーシヨンすることにより行つた。65℃で
５分間インキユベーシヨンしたのち、連結したDNAを制
限酵素Xho IおよびBamH Iで切断した。ついで、調節可
能プロモーターN25 OPSN25 OP 29、リボソーム結合部位
RBS IIならびに６個のヒスチジンをコードする領域を含
有するXho I/BamH Iフラグメント（第６図）をアガロー
スゲル電気泳動によつて単離した。
プラスミドpDS78/RBS II,6xHisの構築には、上述のXh
o I/BamH Iフラグメントを、プラスミドpDS78/RBS II中
に組込み、このプラスミドの元のXho I/BamH Iフラグメ
ントを置換した（第７図）。この目的では、まず、プラ
スミドpDS78/RBS IIのDNA1pmolを制限酵素Xho IおよびB
amH Iで切断し、この大DNAフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によつて単離した。ついで、このフラグメン
ト0.05pmolを、２単位のT4−DNAリガーゼを含有するリ
ゲーシヨン緩衝液中、単離Xho I/BamH Iフラグメント0.
1pmolと15℃で２時間インキユベーシヨンした。プラス
ミドpDM I,1を含有する大腸菌M15細胞は、Morrisonの方
法（Methods Enzymol.,68:326〜331,1979）に従つて形
質転換を行い、調製した。65℃に７分間加熱したのち、
リゲーシヨン混合物をこれらのコンピーテント細胞200
μに加えた。サンプルを氷中に30分間保持したのち、
42℃で２分間インキユベーシヨンし、LBメジウム0.5ml
を加え、さらに37℃で90分間インキユベーシヨンした。
次に、細胞を100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/ml
のカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接種
し、プレートを37℃で一夜インキユベーシヨンした。各
コロニーを無菌のようじで採取し、100μg/mlのアンピ
シリンおよび25μg/mlのカナマイシン含有LBメジウム10
mlを含む試験管に移し、振盪インキユベーターで12時間
インキユベーシヨンした。次に細胞を沈降させ、プラス
ミドDNAをBirnboim ＆ Dolyの方法（Nucl.Acids Res.,
７:1515〜1523,1979）に従つて単離した。
o I/BamH Iフラグメントを、プラスミドpDS78/RBS II中
に組込み、このプラスミドの元のXho I/BamH Iフラグメ
ントを置換した（第７図）。この目的では、まず、プラ
スミドpDS78/RBS IIのDNA1pmolを制限酵素Xho IおよびB
amH Iで切断し、この大DNAフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によつて単離した。ついで、このフラグメン
ト0.05pmolを、２単位のT4−DNAリガーゼを含有するリ
ゲーシヨン緩衝液中、単離Xho I/BamH Iフラグメント0.
1pmolと15℃で２時間インキユベーシヨンした。プラス
ミドpDM I,1を含有する大腸菌M15細胞は、Morrisonの方
法（Methods Enzymol.,68:326〜331,1979）に従つて形
質転換を行い、調製した。65℃に７分間加熱したのち、
リゲーシヨン混合物をこれらのコンピーテント細胞200
μに加えた。サンプルを氷中に30分間保持したのち、
42℃で２分間インキユベーシヨンし、LBメジウム0.5ml
を加え、さらに37℃で90分間インキユベーシヨンした。
次に、細胞を100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/ml
のカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接種
し、プレートを37℃で一夜インキユベーシヨンした。各
コロニーを無菌のようじで採取し、100μg/mlのアンピ
シリンおよび25μg/mlのカナマイシン含有LBメジウム10
mlを含む試験管に移し、振盪インキユベーターで12時間
インキユベーシヨンした。次に細胞を沈降させ、プラス
ミドDNAをBirnboim ＆ Dolyの方法（Nucl.Acids Res.,
７:1515〜1523,1979）に従つて単離した。
単離プラスミド各0.2μｇを、制限酵素Xho IおよびBa
mH Iで切断して、調節可能オペレーター／レプレツサー
要素N250PSN25PO29,リボソーム結合部位RBS IIならびに
６個のヒスチジンをコードする領域を含有するフラグメ
ントがこれらのプラスミド中に存在するか否かを調べ
た。このフラグメントを含むプラスミドをpDS78/RBS I
I,6xHisと命名した（第７図）。
mH Iで切断して、調節可能オペレーター／レプレツサー
要素N250PSN25PO29,リボソーム結合部位RBS IIならびに
６個のヒスチジンをコードする領域を含有するフラグメ
ントがこれらのプラスミド中に存在するか否かを調べ
た。このフラグメントを含むプラスミドをpDS78/RBS I
I,6xHisと命名した（第７図）。
pDS78/RBS II,6xHis中に正しい配列が存在することを
明らかにするためには、γ−［32P］−ATP標識スタータ
ー配列（プライマー）を用いて、二本鎖環状プラスミド
DNAの配列決定を行つた。スターター配列は、プラスミ
ドpDS78/RBS IIの位置89〜108のヌクレオチドを含有す
る。この単離プラスミドDNA0.3pmolをアルコールで沈殿
させ、沈降物を80％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、
最後に1/4 TE緩衝液８μに溶解した。サンプルを95℃
で５分間インキユベーシヨンし、０℃に冷却し、遠心分
離した（エツペンドルフ・ベンチ・セントリフエージ、
２分、12,000rpm）。スターター配列1.5pmolを容量２μ
として加え、サンプルを最初95℃で２分間、ついで42
℃で５分間インキユベーシヨンした。ついで、DNAの配
列をSangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463〜656
7,1977）の方法に従つて決定した。放射性標識プライマ
ーを使用したために、反応はすべて非標識デオキシヌク
レオチド三リン酸を用いて実施した。DNA配列解析の結
果は、pDS78/RBS II,6xHisが第６図に掲げた配列を含有
することを示している。
明らかにするためには、γ−［32P］−ATP標識スタータ
ー配列（プライマー）を用いて、二本鎖環状プラスミド
DNAの配列決定を行つた。スターター配列は、プラスミ
ドpDS78/RBS IIの位置89〜108のヌクレオチドを含有す
る。この単離プラスミドDNA0.3pmolをアルコールで沈殿
させ、沈降物を80％エタノールで１回洗浄し、乾燥し、
最後に1/4 TE緩衝液８μに溶解した。サンプルを95℃
で５分間インキユベーシヨンし、０℃に冷却し、遠心分
離した（エツペンドルフ・ベンチ・セントリフエージ、
２分、12,000rpm）。スターター配列1.5pmolを容量２μ
として加え、サンプルを最初95℃で２分間、ついで42
℃で５分間インキユベーシヨンした。ついで、DNAの配
列をSangerら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463〜656
7,1977）の方法に従つて決定した。放射性標識プライマ
ーを使用したために、反応はすべて非標識デオキシヌク
レオチド三リン酸を用いて実施した。DNA配列解析の結
果は、pDS78/RBS II,6xHisが第６図に掲げた配列を含有
することを示している。
例３ プラスミドpenv（60）−DHFRの構築 Ａ）原理 プラスミドpenv（60）−DHFRの構築には、制限酵素Ba
mH Iで線状化したプラスミドpDS78/RBS II,6xHisを合成
的に製造したenv（60）遺伝子と連結させた（第８
図）。
mH Iで線状化したプラスミドpDS78/RBS II,6xHisを合成
的に製造したenv（60）遺伝子と連結させた（第８
図）。
Ｂ）BamH Iで線状化プラスミドpDS78/RBS II,6xHis（フ
ラグメント１）の調製 プラスミドpDS78/RBS II 4pmolを制限酵素BamH Iで切
断した。次に、このDNAをCIP（ウシ小腸ホスフアター
ゼ）で処理した。次に、酵素を熱失活させ、サンプル緩
衝液を添加したのち、DNAを１％低融点アガロースゲル
中で分離した。エチジウムブロミドで染色したのち、相
当するDNAバンドをUV光線（300nm）下に切り取り、標準
方法（Maniatisら：前出）に従つてDNAを抽出した。
ラグメント１）の調製 プラスミドpDS78/RBS II 4pmolを制限酵素BamH Iで切
断した。次に、このDNAをCIP（ウシ小腸ホスフアター
ゼ）で処理した。次に、酵素を熱失活させ、サンプル緩
衝液を添加したのち、DNAを１％低融点アガロースゲル
中で分離した。エチジウムブロミドで染色したのち、相
当するDNAバンドをUV光線（300nm）下に切り取り、標準
方法（Maniatisら：前出）に従つてDNAを抽出した。
Ｃ）HIV−2env（60）遺伝子（フラグメント２）の調製 この遺伝子の調製は例１に記載してある。
Ｄ）プラスミドpenv（60）−DHFRの製造 0.05pmolのフラグメント１および0.1pmolのフラグメ
ント２を1UのT4リガーゼとインキユベーシヨンした（15
℃、２時間）。酵素を熱失活させたのち、プラスミドpD
M I、１を含有する大腸菌株M15を、このDNAで形質転換
した。細胞を、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接
種した。このプレートを37℃で15時間インキユベーシヨ
ンした。リゲーシヨンで約500個のコロニーが得られ
た。各コロニーをそれぞれ、10mlのLBメジウムに移し、
37℃で一夜生育させ、ついでプラスミドDNAを標準方法
（Maniatisら：前出）に従つて単離した。
ント２を1UのT4リガーゼとインキユベーシヨンした（15
℃、２時間）。酵素を熱失活させたのち、プラスミドpD
M I、１を含有する大腸菌株M15を、このDNAで形質転換
した。細胞を、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接
種した。このプレートを37℃で15時間インキユベーシヨ
ンした。リゲーシヨンで約500個のコロニーが得られ
た。各コロニーをそれぞれ、10mlのLBメジウムに移し、
37℃で一夜生育させ、ついでプラスミドDNAを標準方法
（Maniatisら：前出）に従つて単離した。
Ｅ）プラスミドpDS78/RBS II,6xHis中に組込まれたHIV
−2env（60）遺伝子の配列解析 プラスミドpDS78/RBS II,6xHisのBamH I部位に正しい
HIV−2env（60）遺伝子配列が正しい方向性で存在する
ことを明らかにするため、二本鎖環状プラスミドDNAの
配列を、［γ−32P］−ATPで標識したスターター配列
（プライマー）を用いて決定した。
−2env（60）遺伝子の配列解析 プラスミドpDS78/RBS II,6xHisのBamH I部位に正しい
HIV−2env（60）遺伝子配列が正しい方向性で存在する
ことを明らかにするため、二本鎖環状プラスミドDNAの
配列を、［γ−32P］−ATPで標識したスターター配列
（プライマー）を用いて決定した。
単離プラスミドDNA0.3pmolをアルコールで沈殿させ、
沈降物を１回80％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後に
1/4 TE緩衝液８μに溶解した。放射性標識スターター
配列2pmolを加えたのち、サンプルを最初95℃で２分
間、ついで42℃で５分間インキユベーシヨンした。次に
DNAをSangerらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:546
3〜6567,1977）に従つて配列決定した。配列解析の結果
は、正しいHIV−2env（60）遺伝子配列が、プラスミドp
DS78/RBS II,6xHisのBamH I制限部位に組込まれたこと
を示している。
沈降物を１回80％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後に
1/4 TE緩衝液８μに溶解した。放射性標識スターター
配列2pmolを加えたのち、サンプルを最初95℃で２分
間、ついで42℃で５分間インキユベーシヨンした。次に
DNAをSangerらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:546
3〜6567,1977）に従つて配列決定した。配列解析の結果
は、正しいHIV−2env（60）遺伝子配列が、プラスミドp
DS78/RBS II,6xHisのBamH I制限部位に組込まれたこと
を示している。
例４ プラスミドpDHFR−env（60）の構築 Ａ）原理 プラスミドpDHFR−env（60）の構築には、制限酵素Bg
l IIで線状化したプラスミドpDS78/RBS II,6xHisを合成
的に製造したenv（60）遺伝子と連結させた（第９
図）。
l IIで線状化したプラスミドpDS78/RBS II,6xHisを合成
的に製造したenv（60）遺伝子と連結させた（第９
図）。
Ｂ）Bgl IIで線状化したプラスミドpDS78/RBS II,6xHis
（フラグメント１）の調製 プラスミドpDS78/RBS II,6xHis 4pmolを制限酵素Bgl
IIで切断した。次に、このDNAをCIP（ウシ小腸ホスフア
ターゼ）で処理した。次に、酵素を加熱失活させ、サン
プル緩衝液を添加したのち、DNAを１％低融点アガロー
スゲル中で分離した。エチジウムブロミドで染色したの
ち、相当するDNAバンドをUV光線（300nm）下に切り取
り、標準方法（Maniatisら：前出）に従つてDNAを抽出
した。
（フラグメント１）の調製 プラスミドpDS78/RBS II,6xHis 4pmolを制限酵素Bgl
IIで切断した。次に、このDNAをCIP（ウシ小腸ホスフア
ターゼ）で処理した。次に、酵素を加熱失活させ、サン
プル緩衝液を添加したのち、DNAを１％低融点アガロー
スゲル中で分離した。エチジウムブロミドで染色したの
ち、相当するDNAバンドをUV光線（300nm）下に切り取
り、標準方法（Maniatisら：前出）に従つてDNAを抽出
した。
Ｃ）HIV−2env（60）遺伝子（フラグメント２）の調製 この遺伝子の調製は例１に記載してある。
Ｄ）プラスミドpDHFR−env（60）の製造 0.05pmolのフラグメント１および0.1pmolのフラグメ
ント２を1UのT4リガーゼとともにインキユベーシヨンし
た（15℃、２時間）。酵素を熱失活させたのち、このDN
Aで、プラスミドpD I,1を含有する大腸菌株M15を形質転
換した。細胞を100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接
種した。プレートを37℃で15時間インキユベーシヨンし
た。リゲーシヨンにより約500個のコロニーが得られ
た。各コロニーをそれぞれLBメジウム10ml中、37℃で一
夜生育させ、ついでプラスミドDNAを標準方法（Maniati
sら：前出）に従つて単離した。
ント２を1UのT4リガーゼとともにインキユベーシヨンし
た（15℃、２時間）。酵素を熱失活させたのち、このDN
Aで、プラスミドpD I,1を含有する大腸菌株M15を形質転
換した。細胞を100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接
種した。プレートを37℃で15時間インキユベーシヨンし
た。リゲーシヨンにより約500個のコロニーが得られ
た。各コロニーをそれぞれLBメジウム10ml中、37℃で一
夜生育させ、ついでプラスミドDNAを標準方法（Maniati
sら：前出）に従つて単離した。
Ｅ）プラスミドpDS78/RBS II,6xHis中に組込んだHIV−2
env（60）遺伝子の配列解析 プラスミドpDS78/RBS II,6xHisのBgl II部位に正しい
HIV−2env（60）遺伝子配列が正しい方向性で存在する
ことを明らかにするため、二本鎖環状プラスミドDNAの
配列を、［γ−32P］−ATPで標識したスターター配列
（プライマー）を用いて決定した。
env（60）遺伝子の配列解析 プラスミドpDS78/RBS II,6xHisのBgl II部位に正しい
HIV−2env（60）遺伝子配列が正しい方向性で存在する
ことを明らかにするため、二本鎖環状プラスミドDNAの
配列を、［γ−32P］−ATPで標識したスターター配列
（プライマー）を用いて決定した。
単離プラスミドDNA0.3pmolをアルコールで沈殿させ、
沈降物を１回80％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後に
1/4 TE緩衝液８μに溶解した。放射性標識スターター
配列2pmolを加えたのち、サンプルを最初95℃で２分
間、ついで42℃で５分間インキユベーシヨンした。次に
DNAをSangerらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:546
3〜6567,1977）に従つて配列決定した。配列解析の結果
は、正しいHIV−2env（60）遺伝子配列が、プラスミドp
DS78/RBS II,6xHisのBgl II制限酵素部位に組込まれた
ことを示している。
沈降物を１回80％エタノールで洗浄し、乾燥し、最後に
1/4 TE緩衝液８μに溶解した。放射性標識スターター
配列2pmolを加えたのち、サンプルを最初95℃で２分
間、ついで42℃で５分間インキユベーシヨンした。次に
DNAをSangerらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:546
3〜6567,1977）に従つて配列決定した。配列解析の結果
は、正しいHIV−2env（60）遺伝子配列が、プラスミドp
DS78/RBS II,6xHisのBgl II制限酵素部位に組込まれた
ことを示している。
例５ ENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）ポリペプチドと
HIV陽性血清の反応性 Ａ）原理 HIV−２に感染した患者の血清中の抗体によつて認識
される抗原決定基がenv（60）遺伝子によりコードされ
ていることを明らかにするため、大腸菌内でポリペプチ
ドENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）を発現させ、
ついでニトロセルロースフイルターに遷移させ、適当な
血清とインキユベーシヨンした。HIV−1ENV（80）−DHF
Rポリペプチド（Certaら:EMBO J.,５:3051〜3056,198
6）を対照として用いた。
HIV陽性血清の反応性 Ａ）原理 HIV−２に感染した患者の血清中の抗体によつて認識
される抗原決定基がenv（60）遺伝子によりコードされ
ていることを明らかにするため、大腸菌内でポリペプチ
ドENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）を発現させ、
ついでニトロセルロースフイルターに遷移させ、適当な
血清とインキユベーシヨンした。HIV−1ENV（80）−DHF
Rポリペプチド（Certaら:EMBO J.,５:3051〜3056,198
6）を対照として用いた。
Ｂ）ENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）ポリペプチ
ドの大腸菌内での発現 プラスミドpDM I,1を含有する大腸菌M15細胞をプラス
ミドpenv（60）−DHFRまたはpDHFR−env（60）で形質転
換し、100μg/mlのアンピシリンおよび20μg/mlのカナ
マイシンを含有するLBメジウム（Maniatisら：前出）中
で生育させた。培養液を光学密度OD600＝0.7においてIP
TG（最終濃度2mM）で誘導し、さらに４時間生育させ
た。ついで遠心分離によつて細胞を収穫した。
ドの大腸菌内での発現 プラスミドpDM I,1を含有する大腸菌M15細胞をプラス
ミドpenv（60）−DHFRまたはpDHFR−env（60）で形質転
換し、100μg/mlのアンピシリンおよび20μg/mlのカナ
マイシンを含有するLBメジウム（Maniatisら：前出）中
で生育させた。培養液を光学密度OD600＝0.7においてIP
TG（最終濃度2mM）で誘導し、さらに４時間生育させ
た。ついで遠心分離によつて細胞を収穫した。
Ｃ）大腸菌中で発現したENV（60）−DHFRおよびDHFR−E
NV（60）ポリペプチドの解析 細胞培養液50μを、３％SDS、３％β−メルカプト
エタノールおよび20％グリセロール含有125mM Tris−HC
l,pH6.8に再懸濁した。このサンプルを５分間煮沸し、
ついで12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（U.K.La
emmli:Nature,227:680〜685,1970）を用いて分離した。
タンパク質バンドはクーマツシーブル−染色を用いて発
色させた（第10図、上図）。
NV（60）ポリペプチドの解析 細胞培養液50μを、３％SDS、３％β−メルカプト
エタノールおよび20％グリセロール含有125mM Tris−HC
l,pH6.8に再懸濁した。このサンプルを５分間煮沸し、
ついで12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（U.K.La
emmli:Nature,227:680〜685,1970）を用いて分離した。
タンパク質バンドはクーマツシーブル−染色を用いて発
色させた（第10図、上図）。
Ｄ）ENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）ポリペプチ
ドとHIV抗体の反応性 誘導細胞培養液（上記Ｂ参照）、大腸菌対照溶解物お
よび精製HIV−1ENV（80）−DHFRポリペプチド（各レー
ンに１μｇ）を上記Ｃに記載したようにして電気泳動で
（２ゲル）分離した。非染色ゲルをそれぞれニトロセル
ロース膜で被覆した。被覆ゲルそれぞれを次に２枚の濾
紙で覆い、遷移チャンバー内に移した。これを遷移緩衝
液（192mMグリシンおよび20％メタノール含有25mM Tri
s,pH8.3）で満たし、ポリペプチドの遷移は４℃、アン
ペア数100mAで12時間実施した。次に、ニトロセルロー
ス膜を、最初、５％乾燥スキムミルク含有PBS中室温で
４時間インキユベーシヨンした（Maniatisら：前出）。
ついで、ニトロセルロース膜の一方は５％乾燥スキムミ
ルクと1:1000希釈HIV−１陽性血清を含むPBS中、室温で
４時間インキユベーシヨンし、他方の膜は５％スキムミ
ルクと1:1000希釈HIV−２陽性血清を含むPBS中、室温で
４時間インキユベーシヨンした。次に、ニトロセルロー
ス膜を0.3％ Tween−20含有PBSでまず３回洗浄したの
ち、0.3％ Tween20、５％ヤギ血清および1:2000希釈ヤ
ギ抗ヒトIgG−ペルオキシダーゼ抱合体を含むPBS中、室
温で１時間インキユベーシヨンした。PBSで３回洗浄し
たのち、抗体と反応したニトロセルロース膜上のタンパ
ク質バンドを、４−クロロ−１−ナフトール５μｇと30
％過酸化水素５μを含むPBS25ml中でインキユベーシ
ヨンして発色させた。反応はPBSを加えて停止させた。
ドとHIV抗体の反応性 誘導細胞培養液（上記Ｂ参照）、大腸菌対照溶解物お
よび精製HIV−1ENV（80）−DHFRポリペプチド（各レー
ンに１μｇ）を上記Ｃに記載したようにして電気泳動で
（２ゲル）分離した。非染色ゲルをそれぞれニトロセル
ロース膜で被覆した。被覆ゲルそれぞれを次に２枚の濾
紙で覆い、遷移チャンバー内に移した。これを遷移緩衝
液（192mMグリシンおよび20％メタノール含有25mM Tri
s,pH8.3）で満たし、ポリペプチドの遷移は４℃、アン
ペア数100mAで12時間実施した。次に、ニトロセルロー
ス膜を、最初、５％乾燥スキムミルク含有PBS中室温で
４時間インキユベーシヨンした（Maniatisら：前出）。
ついで、ニトロセルロース膜の一方は５％乾燥スキムミ
ルクと1:1000希釈HIV−１陽性血清を含むPBS中、室温で
４時間インキユベーシヨンし、他方の膜は５％スキムミ
ルクと1:1000希釈HIV−２陽性血清を含むPBS中、室温で
４時間インキユベーシヨンした。次に、ニトロセルロー
ス膜を0.3％ Tween−20含有PBSでまず３回洗浄したの
ち、0.3％ Tween20、５％ヤギ血清および1:2000希釈ヤ
ギ抗ヒトIgG−ペルオキシダーゼ抱合体を含むPBS中、室
温で１時間インキユベーシヨンした。PBSで３回洗浄し
たのち、抗体と反応したニトロセルロース膜上のタンパ
ク質バンドを、４−クロロ−１−ナフトール５μｇと30
％過酸化水素５μを含むPBS25ml中でインキユベーシ
ヨンして発色させた。反応はPBSを加えて停止させた。
第10図から明らかなように、ENV（60）−DHFRおよびD
HFR−ENV（60）ポリペプチドはHIV−２に感染した患者
の血清中の抗体によつてのみ認識される。一方、ENV（8
0）−DHFRポリペプチドはHIV−１に感染した患者の血清
中の抗体によつてのみ認識される。
HFR−ENV（60）ポリペプチドはHIV−２に感染した患者
の血清中の抗体によつてのみ認識される。一方、ENV（8
0）−DHFRポリペプチドはHIV−１に感染した患者の血清
中の抗体によつてのみ認識される。
例６ プラスミドpRBS II−6xHisの構築 Ａ）プラスミドpDS56/RBS IIの説明 プラスミドpRBS II−6xHisの構築には、プラスミドpD
S56/RBS IIを使用した。このプラスミドおよびプラスミ
ドpDM I,1で形質転換した大腸菌細胞は、ブタペスト条
約に基づき、ドイツ微生物寄託機関（Deutsche Sammlun
gvon Mikroorganismen in Braunschweig）に1987年12月
23日付で寄託されている［大腸菌M15（pDS56/BS II;pDM
I,1）,DSM No.4330］。
S56/RBS IIを使用した。このプラスミドおよびプラスミ
ドpDM I,1で形質転換した大腸菌細胞は、ブタペスト条
約に基づき、ドイツ微生物寄託機関（Deutsche Sammlun
gvon Mikroorganismen in Braunschweig）に1987年12月
23日付で寄託されている［大腸菌M15（pDS56/BS II;pDM
I,1）,DSM No.4330］。
制限酵素Xba IとXho Iの切断部位の間にあつて複製領
域ならびに細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラ
クタマーゼをコードする遺伝子を含有するpDS56/RBS II
の部分（第11図及び第12図）は、はじめプラスミドpRB3
22（Boliverら：前出;Sutcliffe:前出）から誘導する。
しかしながら、β−ラクタマーゼの遺伝子は他方、制限
酵素Hinc IIおよびPst Iの切断部位が消失するように修
飾される。DNA配列におけるこの変化は、しかし、β−
ラクタマーゼのアミノ酸配列には影響しない。プラスミ
ドの残りの部分は、調節可能プロモーター／オペレータ
ー要素N25OPSN250P29とそれに続くリボソーム結合部位R
BS IIを有し、これはEcoR I/BamH Iフラグメントの部分
である。さらに続いて、大腸菌フアージラムダのターミ
ネーターt0（Schwarzら：前出）、プロモーターを含ま
ないクロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
（Marcoliら：前出）および大腸菌rrnBオペロンのター
ミネーターT1（Brosiusら：前出）がある。
域ならびに細胞にアンピシリン抵抗性を付与するβ−ラ
クタマーゼをコードする遺伝子を含有するpDS56/RBS II
の部分（第11図及び第12図）は、はじめプラスミドpRB3
22（Boliverら：前出;Sutcliffe:前出）から誘導する。
しかしながら、β−ラクタマーゼの遺伝子は他方、制限
酵素Hinc IIおよびPst Iの切断部位が消失するように修
飾される。DNA配列におけるこの変化は、しかし、β−
ラクタマーゼのアミノ酸配列には影響しない。プラスミ
ドの残りの部分は、調節可能プロモーター／オペレータ
ー要素N25OPSN250P29とそれに続くリボソーム結合部位R
BS IIを有し、これはEcoR I/BamH Iフラグメントの部分
である。さらに続いて、大腸菌フアージラムダのターミ
ネーターt0（Schwarzら：前出）、プロモーターを含ま
ないクロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ
（Marcoliら：前出）および大腸菌rrnBオペロンのター
ミネーターT1（Brosiusら：前出）がある。
発現シグナルN25OPSN250P29およびRBS IIの高い効率
のために、プラスミドpDS56/RBS IIおよびその誘導体た
とえばプラスミドpRBS II−6xHisは、プロモーター／オ
ペレーター要素がオペレーターへのlacリプレツサーの
結合によつて抑制されている場合にのみ、大腸菌細胞内
で安定に維持される（この点については、例２、Ａ参
照）。
のために、プラスミドpDS56/RBS IIおよびその誘導体た
とえばプラスミドpRBS II−6xHisは、プロモーター／オ
ペレーター要素がオペレーターへのlacリプレツサーの
結合によつて抑制されている場合にのみ、大腸菌細胞内
で安定に維持される（この点については、例２、Ａ参
照）。
Ｂ）プラスミドpRBS II−6xHisの構築 （１）プラスミドpDS56/RBS II 2pmolを制限酵素Hind I
IIで切断した。サンプルを後処理したのち、切断したプ
ラスミドDNAに50pmolのリン酸化アダプター（６個のヒ
スチジンをコードする）を加え、サンプルを前述のよう
にT4DNAリガーゼとインキユベーシヨンした。リゲーシ
ヨン混合物を後処理したのち、制限酵素BamH IとXba I
でDNAを切断し、６個のヒスチジン、ターミネーター
t0、cat遺伝子およびターミネーターT1をコードする領
域を含むBamH I/Xba Iフラグメントをアガロースゲル電
気泳動で単離した（第13図）。
IIで切断した。サンプルを後処理したのち、切断したプ
ラスミドDNAに50pmolのリン酸化アダプター（６個のヒ
スチジンをコードする）を加え、サンプルを前述のよう
にT4DNAリガーゼとインキユベーシヨンした。リゲーシ
ヨン混合物を後処理したのち、制限酵素BamH IとXba I
でDNAを切断し、６個のヒスチジン、ターミネーター
t0、cat遺伝子およびターミネーターT1をコードする領
域を含むBamH I/Xba Iフラグメントをアガロースゲル電
気泳動で単離した（第13図）。
（２）プラスミドpDS56/RBS II 2pmolを制限酵素Xba I
とBamH Iで切断し、複製領域、bla遺伝子、プロモータ
ーN25 OPSN25 OP 29とリボソーム結合部位RBS IIを含む
Xba I/BamH Iフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
単離した（第14図）。
とBamH Iで切断し、複製領域、bla遺伝子、プロモータ
ーN25 OPSN25 OP 29とリボソーム結合部位RBS IIを含む
Xba I/BamH Iフラグメントをアガロースゲル電気泳動で
単離した（第14図）。
（３）単離したフラグメント各0.1pmolをリゲーシヨン
させ、ついで、前述（例２）のようにして大腸菌株M15
（pDM I,1）の形質転換を行つた。プレート上に置いて
インキユベーシヨンしたのち（例２、Ｂ）、各コロニー
を前述のようにして10mlのメジウム中で生育させ、Birn
boim ＆ Dolyの方法（前出）に従つてプラスミドDNAを
単離した。酵素BamH IおよびXba Iによる制限解析の結
果、プラスミドは２つの所望のフラグメントを含むこと
が明らかにされた。これらのプラスミドをpRBS II−6xH
isと命名した（第14図）。
させ、ついで、前述（例２）のようにして大腸菌株M15
（pDM I,1）の形質転換を行つた。プレート上に置いて
インキユベーシヨンしたのち（例２、Ｂ）、各コロニー
を前述のようにして10mlのメジウム中で生育させ、Birn
boim ＆ Dolyの方法（前出）に従つてプラスミドDNAを
単離した。酵素BamH IおよびXba Iによる制限解析の結
果、プラスミドは２つの所望のフラグメントを含むこと
が明らかにされた。これらのプラスミドをpRBS II−6xH
isと命名した（第14図）。
例７ プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（6
0）−6xHisの構築 Ａ）原理 プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（6
0）−6xHisの構築には、HIV−２遺伝子env（60）ならび
にHIV−１遺伝子env（80）とgag（419）を、発現ベクタ
ーpRBS II−6xHisで連結した。
0）−6xHisの構築 Ａ）原理 プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（6
0）−6xHisの構築には、HIV−２遺伝子env（60）ならび
にHIV−１遺伝子env（80）とgag（419）を、発現ベクタ
ーpRBS II−6xHisで連結した。
Ｂ）プラスミドpRBS II−6xHisの制限酵素BamH Iおよび
Bgl IIによる切断での調製 プラスミドpRBS II−6xHis 2pmolを制限酵素BamH Iお
よびBgl II 10単位で切断した。サンプル緩衝液を加え
たのち、DNAを１％アガロースゲル上で分離した。エチ
ジウムブロミドで染色したのち、プラスミドDNAに相当
するバンドをUV光線（300nm）下に切り出し、電気溶出
により溶出した（Maniatisら：前出）。ついで、精製DN
Aの末端をホスフアターゼで脱リン酸化した。次に、DNA
をフエノール：クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノ
ールで沈殿させ、1/4 TE緩衝液に溶解した。
Bgl IIによる切断での調製 プラスミドpRBS II−6xHis 2pmolを制限酵素BamH Iお
よびBgl II 10単位で切断した。サンプル緩衝液を加え
たのち、DNAを１％アガロースゲル上で分離した。エチ
ジウムブロミドで染色したのち、プラスミドDNAに相当
するバンドをUV光線（300nm）下に切り出し、電気溶出
により溶出した（Maniatisら：前出）。ついで、精製DN
Aの末端をホスフアターゼで脱リン酸化した。次に、DNA
をフエノール：クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノ
ールで沈殿させ、1/4 TE緩衝液に溶解した。
Ｃ）HIV−1gag（419）遺伝子の調製 HIV−1gag遺伝子のSst I/Bgl IIフラグメント（その
ヌクレオチド配列は第16図に示す）を含有するプラスミ
ドpU−GAG2pmolを12単位の制限酵素Xmn Iで消化した。
次にDNAをフエノール：クロロホルム（1:1）で抽出し、
２容のエタノールにより−20℃で沈殿させた。DNAペレ
ツトを10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP、100pmolのリ
ン酸化10マーBamH I−リンカー（５′−CCGGATCCGG−
３′）を含む50mM Tris−HCl（pH7.6）50μ中に再懸
濁した。１単位のT4−DNAリガーゼを添加したのち、混
合物を14℃で一夜インキユベーシヨンした。ついで混合
物を65℃で10分間インキユベーシヨンし、制限酵素緩衝
液で容量を100μとした。100単位のBamH Iと10単位の
Hind IIIを加え、ついで混合物を37℃で３時間インキユ
ベーシヨンした。次にDNAをフエノールとクロロホルム
で抽出し、エタノールで沈殿させた。DNAのペレツトを
サンプル緩衝液に溶解し、６％ポリアクリルアミドゲル
上で分離した。エチジウムブロミドで染色したのち、25
0塩基対をもつバンドを切り出し、電気溶出で単離し
た。
ヌクレオチド配列は第16図に示す）を含有するプラスミ
ドpU−GAG2pmolを12単位の制限酵素Xmn Iで消化した。
次にDNAをフエノール：クロロホルム（1:1）で抽出し、
２容のエタノールにより−20℃で沈殿させた。DNAペレ
ツトを10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP、100pmolのリ
ン酸化10マーBamH I−リンカー（５′−CCGGATCCGG−
３′）を含む50mM Tris−HCl（pH7.6）50μ中に再懸
濁した。１単位のT4−DNAリガーゼを添加したのち、混
合物を14℃で一夜インキユベーシヨンした。ついで混合
物を65℃で10分間インキユベーシヨンし、制限酵素緩衝
液で容量を100μとした。100単位のBamH Iと10単位の
Hind IIIを加え、ついで混合物を37℃で３時間インキユ
ベーシヨンした。次にDNAをフエノールとクロロホルム
で抽出し、エタノールで沈殿させた。DNAのペレツトを
サンプル緩衝液に溶解し、６％ポリアクリルアミドゲル
上で分離した。エチジウムブロミドで染色したのち、25
0塩基対をもつバンドを切り出し、電気溶出で単離し
た。
HIV−1gag遺伝子のHind IIIフラグメント（そのヌク
レオチド配列は第17図に示す）を含有するプラスミドp2
−3U/Hind III 10の2pmolを11単位のBgl IIにより37℃
で１時間消化し、65℃に10分間加熱し、室温に冷却し、
大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントと45分
間インキユベーシヨンした。次に、DNAをフエノール：
クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノールで沈殿さ
せ、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP、100pmolのリン
酸化12マーBgl II−リンカー（５′−GGAAGATCTTCC−
３′）および１単位のT4−DNAリガーゼを含む50mM Tris
−HCl（pH7.6）50μ中に取り、14℃で一夜インキユベ
ーシヨンした。反応混合物をついで65℃に加熱し、制限
酵素緩衝液で容量を100μとした。Bag II 100単位を
加えたのち、混合物を37℃で３時間インキユベーシヨン
した。NaCl（最終濃度50mM）を加えたのち、Hind III 1
0単位を加え、混合物を37℃で１時間インキユベーシヨ
ンした。フエノール：クロロホルム（1:1）で抽出した
のち、DNAをエタノールで沈殿させ、ついで１％アガロ
ースゲル上で分離した。1020塩基対をもつフラグメント
を切り出し、電気溶出によつて単離精製した。
レオチド配列は第17図に示す）を含有するプラスミドp2
−3U/Hind III 10の2pmolを11単位のBgl IIにより37℃
で１時間消化し、65℃に10分間加熱し、室温に冷却し、
大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントと45分
間インキユベーシヨンした。次に、DNAをフエノール：
クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノールで沈殿さ
せ、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP、100pmolのリン
酸化12マーBgl II−リンカー（５′−GGAAGATCTTCC−
３′）および１単位のT4−DNAリガーゼを含む50mM Tris
−HCl（pH7.6）50μ中に取り、14℃で一夜インキユベ
ーシヨンした。反応混合物をついで65℃に加熱し、制限
酵素緩衝液で容量を100μとした。Bag II 100単位を
加えたのち、混合物を37℃で３時間インキユベーシヨン
した。NaCl（最終濃度50mM）を加えたのち、Hind III 1
0単位を加え、混合物を37℃で１時間インキユベーシヨ
ンした。フエノール：クロロホルム（1:1）で抽出した
のち、DNAをエタノールで沈殿させ、ついで１％アガロ
ースゲル上で分離した。1020塩基対をもつフラグメント
を切り出し、電気溶出によつて単離精製した。
BamH I−Hind IIIフラグメントおよびHind III−Bgl
IIフラグメント各1pmolを、１単位のT4−DNAリガーゼを
用いてたがいに連結した。リガーゼを熱失活させたの
ち、リゲーシヨンしたフラグメントをBamH IとBgl IIで
切断し、１％アガロースゲル上で分離した。HIVgag（41
9）遺伝子に相当するフラグメントを電気溶出によつて
単離精製した。
IIフラグメント各1pmolを、１単位のT4−DNAリガーゼを
用いてたがいに連結した。リガーゼを熱失活させたの
ち、リゲーシヨンしたフラグメントをBamH IとBgl IIで
切断し、１％アガロースゲル上で分離した。HIVgag（41
9）遺伝子に相当するフラグメントを電気溶出によつて
単離精製した。
Ｄ）HIV−1env（80）遺伝子の調製 HIV−1env（80）遺伝子の調製はCertaら記載（EMBO
J.,５:3051〜3056,1986）に従つて行つた。
J.,５:3051〜3056,1986）に従つて行つた。
Ｅ）HIV−2env（60）遺伝子の調製 HIV−2env（60）遺伝子の調製は例１に記載した。
Ｆ）プラスミドpRBS II−gag（419）−6xHisの構築 プラスミドpRBS II−gag（419）−6xHisの構築には、
BamH IとBgl IIで線状化したベクターpRBS II−6xHis
（上記Ｂ参照）0.1pmolをgag（419）遺伝子0.3pmolと、
１単位のT4−DNAリガーゼとともに14℃で一夜インキユ
ベーシヨンして連結させた。酵素を熱失活さＰたのち、
このDNAで、プラスミドpDM I,1含有大腸菌株W3110を形
質転換した。細胞を100μg/mlのアンピシリンと25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接
種した。プレートを37℃で一夜インキユベーシヨンし
た。各コロニーを37℃で一夜生育させ、それらのプラス
ミドDNAを標準方法（Maniatisら：前出）に従つて単離
した。
BamH IとBgl IIで線状化したベクターpRBS II−6xHis
（上記Ｂ参照）0.1pmolをgag（419）遺伝子0.3pmolと、
１単位のT4−DNAリガーゼとともに14℃で一夜インキユ
ベーシヨンして連結させた。酵素を熱失活さＰたのち、
このDNAで、プラスミドpDM I,1含有大腸菌株W3110を形
質転換した。細胞を100μg/mlのアンピシリンと25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBアガールプレート上に接
種した。プレートを37℃で一夜インキユベーシヨンし
た。各コロニーを37℃で一夜生育させ、それらのプラス
ミドDNAを標準方法（Maniatisら：前出）に従つて単離
した。
Ｇ）プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−6xHi
sの構築 プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−6xHis
の構築には、プラスミドpRBS II−gag（419）−6xHisを
BamH Iで切断し、CIPで処理した。DNAをフエノール：ク
ロロホルム（1:1）で抽出し、２容のエタノールで沈殿
させた。BamH Iで線状化されたpRBS II−gag（419）−6
xHisプラスミドDNAを0.3pmolのHIV−1env（80）遺伝子
および１単位のT4−DNAリガーゼとともに14℃で一夜イ
ンキユベーシヨンした。酵素を熱失活させたのち、この
DNAで、プラスミドpDM I,1を含有する大腸菌株W3110を
形質転換した。細胞を100μg/mlのアンピシリンおよび2
5μg/mlのカナマイシンを含むLBアガールプレート上に
接種した。プレートを37℃で一夜インキユベーシヨンし
た。各コロニーを37℃で一夜生育させ、ついでそれらの
プラスミドDNAを標識方法（Maniatisら：前出）に従つ
て単離した（第19図）。
sの構築 プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−6xHis
の構築には、プラスミドpRBS II−gag（419）−6xHisを
BamH Iで切断し、CIPで処理した。DNAをフエノール：ク
ロロホルム（1:1）で抽出し、２容のエタノールで沈殿
させた。BamH Iで線状化されたpRBS II−gag（419）−6
xHisプラスミドDNAを0.3pmolのHIV−1env（80）遺伝子
および１単位のT4−DNAリガーゼとともに14℃で一夜イ
ンキユベーシヨンした。酵素を熱失活させたのち、この
DNAで、プラスミドpDM I,1を含有する大腸菌株W3110を
形質転換した。細胞を100μg/mlのアンピシリンおよび2
5μg/mlのカナマイシンを含むLBアガールプレート上に
接種した。プレートを37℃で一夜インキユベーシヨンし
た。各コロニーを37℃で一夜生育させ、ついでそれらの
プラスミドDNAを標識方法（Maniatisら：前出）に従つ
て単離した（第19図）。
Ｈ）プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env
（60）−6xHisの構築 プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（6
0）−6xHisの構築には、プラスミドpRBS II−env（80）
−gag（419）−6xHisをBgl IIで切断し、CIPで処理し
た。ついでDNAをフエノール：クロロホルム（1:1）で抽
出し、２容のエタノールで沈殿させた。Bgl IIで線状化
したpRBS II−env（80）−gag（419）−6xHisプラスミ
ドDNAをついで、0.3pmolのHIV−2env（60）遺伝子およ
び１単位のT4−DNAリガーゼと一夜14℃でインキユベー
シヨンした。酵素を熱失活させたのち、このDNAで、プ
ラスミドpDM I,1含有大腸菌株W3110を形質転換した。細
胞を100μg/mlのアンピシリンと25μg/mlのカナマイシ
ンを含むLBアガールプレート上に接種した。プレートを
37℃で一夜インキユベーシヨンした。各コロニーを37℃
で一夜生育させ、それらのプラスミドDNAを標準方法（M
aniatisら：前出）に従つて単離した（第20図）。
（60）−6xHisの構築 プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（6
0）−6xHisの構築には、プラスミドpRBS II−env（80）
−gag（419）−6xHisをBgl IIで切断し、CIPで処理し
た。ついでDNAをフエノール：クロロホルム（1:1）で抽
出し、２容のエタノールで沈殿させた。Bgl IIで線状化
したpRBS II−env（80）−gag（419）−6xHisプラスミ
ドDNAをついで、0.3pmolのHIV−2env（60）遺伝子およ
び１単位のT4−DNAリガーゼと一夜14℃でインキユベー
シヨンした。酵素を熱失活させたのち、このDNAで、プ
ラスミドpDM I,1含有大腸菌株W3110を形質転換した。細
胞を100μg/mlのアンピシリンと25μg/mlのカナマイシ
ンを含むLBアガールプレート上に接種した。プレートを
37℃で一夜インキユベーシヨンした。各コロニーを37℃
で一夜生育させ、それらのプラスミドDNAを標準方法（M
aniatisら：前出）に従つて単離した（第20図）。
例８ ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチドとHIV
陽性血清との反応性 Ａ）原理 ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチドがHI
V−１およびHIV−２に感染した患者の血清と反応するこ
とを示すため、ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリ
ペプチドを大腸菌内で発現させ、ついで精製し、適当な
血清を用いて酵素免疫検定（EIA）で試験した。
陽性血清との反応性 Ａ）原理 ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチドがHI
V−１およびHIV−２に感染した患者の血清と反応するこ
とを示すため、ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリ
ペプチドを大腸菌内で発現させ、ついで精製し、適当な
血清を用いて酵素免疫検定（EIA）で試験した。
Ｂ）ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチドの
大腸菌内での発現 プラスミドDM I,1を含有する大腸菌W3110細胞をプラ
スミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（60）−6
xHisで形質転換し、100μg/mlのアンピシリンと25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBメジウム中で生育させた
（Maniatisら：前出）。培養液を光学密度OD600＝1.0に
おいてIPTG（最終濃度2mM）により誘導し、さらに２時
間生育させた。ついで細胞を遠心分離によつて収穫し
た。
大腸菌内での発現 プラスミドDM I,1を含有する大腸菌W3110細胞をプラ
スミドpRBS II−env（80）−gag（419）−env（60）−6
xHisで形質転換し、100μg/mlのアンピシリンと25μg/m
lのカナマイシンを含有するLBメジウム中で生育させた
（Maniatisら：前出）。培養液を光学密度OD600＝1.0に
おいてIPTG（最終濃度2mM）により誘導し、さらに２時
間生育させた。ついで細胞を遠心分離によつて収穫し
た。
Ｃ）大腸菌内で発現したENV（80）−GAG（419）−ENV
（60）ポリペプチドの精製 収穫した細胞をPBS緩衝液（0.2g/ KCl、8.0g/ Na
Cl、0.2g/ KH2PO4、1.144g/ Na2HPO4、pH7.0）に再
懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて破壊した。得られ
た細胞ホモジネートを遠心分離し、ペレツトを２回6Mグ
アニジン塩酸塩含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8.0
で抽出した。
（60）ポリペプチドの精製 収穫した細胞をPBS緩衝液（0.2g/ KCl、8.0g/ Na
Cl、0.2g/ KH2PO4、1.144g/ Na2HPO4、pH7.0）に再
懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて破壊した。得られ
た細胞ホモジネートを遠心分離し、ペレツトを２回6Mグ
アニジン塩酸塩含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH8.0
で抽出した。
不溶物質があれば遠心分離によつて除去し、濾過し
た。澄明な溶液をNTAカラム（その構造および調製法は
ヨーロツパ特許出願公告第253303号に記載されている）
に適用した。ついで、カラムを最初6Mグアニジン塩酸塩
含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）で、次に8M
尿素含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で洗浄
した。ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチド
の溶出は8M尿素含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH4.
0）で行つた。
た。澄明な溶液をNTAカラム（その構造および調製法は
ヨーロツパ特許出願公告第253303号に記載されている）
に適用した。ついで、カラムを最初6Mグアニジン塩酸塩
含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）で、次に8M
尿素含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で洗浄
した。ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチド
の溶出は8M尿素含有0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH4.
0）で行つた。
NTAカラムを用いて得られたENV（60）−GAG（419）−
ENV（60）ポリペプチドを次に、Sephacryl S−200カラ
ム（Pharmacia）上２回クロマトグラフイーに付した
（溶出緩衝液:5mM EDTAおよび１％ないし0.1％SDS含有5
0mM Tris−HCl、pH7.0）。得られたENV（80）−GAG（41
9）−ENV（60）ポリペプチドは、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動およびアミノ酸分析で純度89％を示し
た。
ENV（60）ポリペプチドを次に、Sephacryl S−200カラ
ム（Pharmacia）上２回クロマトグラフイーに付した
（溶出緩衝液:5mM EDTAおよび１％ないし0.1％SDS含有5
0mM Tris−HCl、pH7.0）。得られたENV（80）−GAG（41
9）−ENV（60）ポリペプチドは、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動およびアミノ酸分析で純度89％を示し
た。
Ｄ）精製ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチ
ドのHIV陽性血清との反応性 精製ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチド
のHIV−１およびHIV−２陽性血清との反応性を、ヨーロ
ツパ特許第270114号に記載された酵素免疫検定（EIA）
によつて試験した。精製ENV（80）−GAG（419）−ENV
（60）ポリペプチドおよび精製DHFR−ENV（60）ポリペ
プチド（陽性HIV−２対照）によつて得られたEIA値は次
表のとおりであつた。
ドのHIV陽性血清との反応性 精製ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペプチド
のHIV−１およびHIV−２陽性血清との反応性を、ヨーロ
ツパ特許第270114号に記載された酵素免疫検定（EIA）
によつて試験した。精製ENV（80）−GAG（419）−ENV
（60）ポリペプチドおよび精製DHFR−ENV（60）ポリペ
プチド（陽性HIV−２対照）によつて得られたEIA値は次
表のとおりであつた。
表から明らかなように、HIV−１およびHIV−２陽性血
清はすべて、ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペ
プチドによつて認識される。
清はすべて、ENV（80）−GAG（419）−ENV（60）ポリペ
プチドによつて認識される。
図面中には、以下の略号および記号を使用する。 B,Bg,E,H,Sa,XおよびXbはそれぞれ、制限酵素BamH I,Bg
l II,EcoR I,Hind III,Pst I,Sal I,Xho IおよびXba I
の切断部位を示す。 第１図は、合成env（60）遺伝子ヌクレオチド配列およ
びそれから誘導されるENV（60）ポリペプチドのアミノ
酸配列を示す模式図である。合成env（60）遺伝子が構
築される各オリゴヌクレオチドフラグメントは１〜14の
番号が付されている。 第２図は、プラスミドpDS78/RBS IIの構成図である。 第３図は、プラスミドpDS78/RBS IIのヌクレオチド配列
を示す模式図である。配列中、第２図に示した制限酵素
の認識部位には上線を付し、またβ−ラクタマーゼおよ
びジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする領域には下線
を付してある。 第４図は、プラスミドpDM I,1の構成図である。 第５図は、プラスミドpDM I,1のヌクレオチド配列を示
す模式図である。配列中、第４図に示した制限酵素の認
識部位には上線を付し、ネオマイシンホスホトランスフ
エラーゼおよびlacリプレツサーをコードする領域には
下線を付してある。 第６図は、調節可能プロモーター／オペレーター要素N2
5OPSN250P29、リボソーム結合部位RBS IIならびに６個
のヒスチジンをコードする領域を含有するXho I/BamH I
フラグメントの製造を示す工程図である。 第７図は、プラスミドpDS78/RBS IIと、調節可能プロモ
ーター／オペレーター要素N251OPSN25 OP 29、リボソー
ム結合部位RBS IIならびに６個のヒスチジンをコードす
る領域を含有するXho I/BamH Iフラグメントを用いるプ
ラスミドpDS78/RBS II,6xHisの構築を示す工程図であ
る。 第８図は、プラスミドpenv（60）−DHFRの構築を示す工
程図である。 第９図は、プラスミドpDHFR−env（60）の構築を示す工
程図である。 第10図は、ENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）ポリ
ペプチドの反応性を示す図である。上図は、プラスミド
pDS78/RSB II,6xHis（レーンＡ）、penv（60）−DHFR
（レーンｂ）およびpDHFR−env（60）（レーンＣ）を含
有する大腸菌M15分解物の電気泳動解析を示す。レーン
ｄは精製HIV−1 ENV（80）−DHFRを含有する。下図は、
HIV−２（左）およびHIV−１（右）陽性血清で生成した
相当するイムノブロツトを示す。レーンＭは予め染色し
た分子量標準を含有し、そのサイズはキロダルトンで与
えられている。 第11図は、プラスミドpDS56/RBS IIの構成図である。 第12図は、プラスミドpDS56/RBS IIのヌクレオチド配列
を示す模式図である。配列中、第11図に示した制限酵素
の認識部位には上線を、またRBS IIの制御下にある領域
には下線を付してある。 第13図は、６個のヒスチジンをコードする領域、ターミ
ネーターt0、cat遺伝子およびターミネーターT1を含むB
amH I/Xba Iフラグメントの構築および単離を示す工程
図であり、このフラグメントはプラスミドpRBS II−6xH
isの構築に用いられた。 第14図は、第13図に示したBamH I/Xba Iフラグメント
と、プラスミドpDS56/RBS IIの複製領域含有Xba I/BamH
Iフラグメントの結合によるプラスミドpRBS II−6xHis
の構築を示す工程図である。 第15図は、HIV−1 BamH I/Bgl II gag（419）遺伝子フ
ラグメントの製造を示す工程図である。 第16図は、プラスミドpU−GAG中に存在するHIV−1gag遺
伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。 第17図は、プラスミドp2−3U/Hind III 10中に存在する
HIV−1gag遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示
す模式図である。 第18図は、プラスミドpRBS II−gag（419）−6xHisの構
築を示す工程図である。 第19図は、プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）
−6xHisの構築を示す工程図である。 第20図は、プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）
−env（60）−6xHisの構築を示す工程図である。
l II,EcoR I,Hind III,Pst I,Sal I,Xho IおよびXba I
の切断部位を示す。 第１図は、合成env（60）遺伝子ヌクレオチド配列およ
びそれから誘導されるENV（60）ポリペプチドのアミノ
酸配列を示す模式図である。合成env（60）遺伝子が構
築される各オリゴヌクレオチドフラグメントは１〜14の
番号が付されている。 第２図は、プラスミドpDS78/RBS IIの構成図である。 第３図は、プラスミドpDS78/RBS IIのヌクレオチド配列
を示す模式図である。配列中、第２図に示した制限酵素
の認識部位には上線を付し、またβ−ラクタマーゼおよ
びジヒドロ葉酸リダクターゼをコードする領域には下線
を付してある。 第４図は、プラスミドpDM I,1の構成図である。 第５図は、プラスミドpDM I,1のヌクレオチド配列を示
す模式図である。配列中、第４図に示した制限酵素の認
識部位には上線を付し、ネオマイシンホスホトランスフ
エラーゼおよびlacリプレツサーをコードする領域には
下線を付してある。 第６図は、調節可能プロモーター／オペレーター要素N2
5OPSN250P29、リボソーム結合部位RBS IIならびに６個
のヒスチジンをコードする領域を含有するXho I/BamH I
フラグメントの製造を示す工程図である。 第７図は、プラスミドpDS78/RBS IIと、調節可能プロモ
ーター／オペレーター要素N251OPSN25 OP 29、リボソー
ム結合部位RBS IIならびに６個のヒスチジンをコードす
る領域を含有するXho I/BamH Iフラグメントを用いるプ
ラスミドpDS78/RBS II,6xHisの構築を示す工程図であ
る。 第８図は、プラスミドpenv（60）−DHFRの構築を示す工
程図である。 第９図は、プラスミドpDHFR−env（60）の構築を示す工
程図である。 第10図は、ENV（60）−DHFRおよびDHFR−ENV（60）ポリ
ペプチドの反応性を示す図である。上図は、プラスミド
pDS78/RSB II,6xHis（レーンＡ）、penv（60）−DHFR
（レーンｂ）およびpDHFR−env（60）（レーンＣ）を含
有する大腸菌M15分解物の電気泳動解析を示す。レーン
ｄは精製HIV−1 ENV（80）−DHFRを含有する。下図は、
HIV−２（左）およびHIV−１（右）陽性血清で生成した
相当するイムノブロツトを示す。レーンＭは予め染色し
た分子量標準を含有し、そのサイズはキロダルトンで与
えられている。 第11図は、プラスミドpDS56/RBS IIの構成図である。 第12図は、プラスミドpDS56/RBS IIのヌクレオチド配列
を示す模式図である。配列中、第11図に示した制限酵素
の認識部位には上線を、またRBS IIの制御下にある領域
には下線を付してある。 第13図は、６個のヒスチジンをコードする領域、ターミ
ネーターt0、cat遺伝子およびターミネーターT1を含むB
amH I/Xba Iフラグメントの構築および単離を示す工程
図であり、このフラグメントはプラスミドpRBS II−6xH
isの構築に用いられた。 第14図は、第13図に示したBamH I/Xba Iフラグメント
と、プラスミドpDS56/RBS IIの複製領域含有Xba I/BamH
Iフラグメントの結合によるプラスミドpRBS II−6xHis
の構築を示す工程図である。 第15図は、HIV−1 BamH I/Bgl II gag（419）遺伝子フ
ラグメントの製造を示す工程図である。 第16図は、プラスミドpU−GAG中に存在するHIV−1gag遺
伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示す模式図であ
る。 第17図は、プラスミドp2−3U/Hind III 10中に存在する
HIV−1gag遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列を示
す模式図である。 第18図は、プラスミドpRBS II−gag（419）−6xHisの構
築を示す工程図である。 第19図は、プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）
−6xHisの構築を示す工程図である。 第20図は、プラスミドpRBS II−env（80）−gag（419）
−env（60）−6xHisの構築を示す工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 スツァルト レ グリセ スイス国 バスレ，スパレンリング 63 (72)発明者 ヤン モウス スイス国 ギエベナッハ，フュリンスド ルフェルストラーセ 65 (56)参考文献 特開 昭62−244393（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502119（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／4459（ＷＯ，Ａ１) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．326（16 Ａ ｐｒｉｌ 1987）Ｐ．662−669
Claims (17)
- 【請求項１】式 で示されるアミノ酸配列を有するHIV2に対する抗原性ポ
リペプチド - 【請求項２】アフイニテイ−ペプチドと担体ポリペプチ
ドが共有結合している特許請求の範囲第１項のポリペプ
チド - 【請求項３】アフイニテイ−ペプチドと、アミノ酸配列
がHIV−１エンベロープタンパク質（env）および／また
はHIV−１コアタンパク質（gag）の少なくとも一つの抗
原決定基に相当するポリペプチドが共有結合している特
許請求の範囲第１項のポリペプチド - 【請求項４】以下の式 の一つを有する特許請求の範囲第１項から第２項までの
いずれか一つのポリペプチド - 【請求項５】以下の式 を有する特許請求の範囲第３項のポリペプチド
- 【請求項６】アミノ末端にさらにメチオニン残基を有す
る特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか一つ
のポリペプチド - 【請求項７】特許請求の範囲第１項から第６項までのい
ずれか一つのポリペプチドをコードするDNA - 【請求項８】式 で示されるヌクレオチド配列を包含する特許請求の範囲
第７項のDNA - 【請求項９】特許請求の範囲第７項または第８項のDNA
が発現制御配列と有効に結合している発現ベクター - 【請求項１０】大腸菌内で複製できる特許請求の範囲第
９項の発現ベクター - 【請求項１１】プラスミドpenv（60）−DHFR、pDHFR−e
nv（60）またはpRBS II−env（80）−gag（419）−env
（60）−6xHisである特許請求の範囲第10項の発現ベク
ター - 【請求項１２】特許請求の範囲第９項から第11項までの
いずれか一つの発現ベクターで形質転換されたバクテリ
ア - 【請求項１３】特許請求の範囲第９項から第11項までの
いずれか一つの発現ベクターで形質転換された大腸菌株 - 【請求項１４】特許請求の範囲第９項から第11項までの
いずれか一つの発現ベクターで形質転換された大腸菌M1
5株 - 【請求項１５】（ａ）特許請求の範囲第１項から第６項
までのいずれか一つのポリペプチドを標識し、（ｂ）こ
の標識ポリペプチドをヒト血清サンプルと反応させ、
（ｃ）反応混合物中の生成した標識ポリペプチド／抗体
複合体を検出することからなるヒト血清のHIVウイルス
に対する抗体の検出方法 - 【請求項１６】（ａ）特許請求の範囲第１項から第６項
までのいずれか一つのポリペプチドの固体担体材料上に
固定化し、（ｂ）ヒト血清サンプルをこの固定化タンパ
ク質と接触させ、（ｃ）非結合ポリペプチドと抗体を洗
浄によって除去し、（ｄ）洗浄固定化ポリペプチド／抗
体複合体を標識黄色ブドウ球菌プロテインＡの添加また
は標識ヒト抗−Ig抗体の添加によって検出することから
なるヒト血清中のHIVウイルスに対する抗体の検出方法 - 【請求項１７】特許請求の範囲第１項から第６項までの
いずれか一つのポリペプチドを含有する容器からなるHI
V抗体の定量用キット
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH445487 | 1987-11-16 | ||
| CH04454/87-3 | 1987-11-16 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH01160998A JPH01160998A (ja) | 1989-06-23 |
| JP2887238B2 true JP2887238B2 (ja) | 1999-04-26 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0316695B1 (ja) |
| JP (1) | JP2887238B2 (ja) |
| AT (1) | ATE87487T1 (ja) |
| AU (1) | AU630861B2 (ja) |
| DE (1) | DE3879881D1 (ja) |
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| ES (1) | ES2054769T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5976785A (en) * | 1986-01-22 | 1999-11-02 | Institut Pasteur | Competitive assays for determining the effectiveness of a human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) antiviral agent, employing peptides and proteins of HIV-2 |
| US5830641A (en) * | 1986-01-22 | 1998-11-03 | Institut Pasteur | In vitro diagnostic assays for the detection of HIV-1 or HIV-2 employing viral-specific antigens and antibodies |
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| US6514691B1 (en) | 1986-01-22 | 2003-02-04 | Institut Pasteur | Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2 |
| US5580739A (en) | 1986-01-22 | 1996-12-03 | Institut Pasteur | Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) and in vitro diagnostic methods and kits employing the peptides for the detection of HIV-2 |
| US4839288A (en) * | 1986-01-22 | 1989-06-13 | Institut Pasteur | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes |
| US6054565A (en) | 1986-03-03 | 2000-04-25 | Institut Pasteur | Nucleic Acids of HIV-2, Diagnostic Test Kit and Method using Nucleic Acid Probes of HIV-2 |
| EP0362927A3 (en) * | 1988-10-06 | 1990-11-14 | Akzo N.V. | Synthetic polypeptides immunochemically reactive with hiv antibodies |
| GB9005829D0 (en) * | 1990-03-15 | 1990-05-09 | Proteus Biotech Ltd | Synthetic polypeptides |
| US5439829A (en) * | 1991-01-30 | 1995-08-08 | Eli Lilly And Company | Immobilization of biologically active molecules by changing the Oxidation state of a chelated transition metal ion |
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| US9150605B2 (en) | 2002-11-05 | 2015-10-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation |
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Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4569794A (en) * | 1984-12-05 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proteins and compounds useful in such process |
| PT84182B (pt) * | 1986-01-22 | 1989-09-14 | Pasteur Institut | Novo retrovirus susceptivel de provocar o sida, meios e processos para a sua deteccao "in vitro" |
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| EP0283327B1 (fr) * | 1987-01-16 | 1997-06-25 | Institut Pasteur | Peptides ayant des propriétés immunologiques de HIV-2 |
| DE3850593T3 (de) * | 1987-03-25 | 2001-01-04 | Genetic Systems Corp., Seattle | Synthetische Antigene zur Bestimmung der AIDS-bezogenen, von LAV-2 verursachten Krankheiten. |
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1988
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- 1988-11-05 EP EP88118488A patent/EP0316695B1/de not_active Expired - Lifetime
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1994
- 1994-03-15 US US08/213,416 patent/US5874533A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２６（１６ Ａｐｒｉｌ １９８７）Ｐ．６６２−６６９ |
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