JPH01100200A - 抗マラリアワクチン - Google Patents

抗マラリアワクチン

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JPH01100200A
JPH01100200A JP63222595A JP22259588A JPH01100200A JP H01100200 A JPH01100200 A JP H01100200A JP 63222595 A JP63222595 A JP 63222595A JP 22259588 A JP22259588 A JP 22259588A JP H01100200 A JPH01100200 A JP H01100200A
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polypeptide
dna
amino acid
sequence
polypeptide according
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JP63222595A
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Ulrich Certa
ウルリッヒ　セルタ
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのマラリアはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍの４種、即ち、
Ｐ、Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍ、　Ｐ、ｖｉｖａｘ、Ｐ、ｏ
ｖａｌｅおよびＰ、　ｍａｌａ＋ｉａｅ、により起る。
世界保健機構（ＷＨＯ）の１９８６年の報告によると、
世界中でほぼ１億人のマラリア感染患者がいる。これら
の中のおよそ１００万人は大部分がＰ、　ｆａｌｃｉｐ
ａｒｕｍに感染した小さい子供達で、致命的な患者であ
る。薬剤耐性の寄生虫と殺虫剤に抵抗性の蚊媒体の出現
の結果、マラリアは蔓延している。インド保健省（Ｉｎ
ｄｉａｎＨｅａｌｔｈ　Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）によ
ると、１９６２年に１００．０００人のマラリア患者で
あったのが１９８０年には３００万人の、主としてＰ、
ｖｉｖａｘによる患者が報告されている（Ｂｒｕｃｅ−
Ｃｈｗａｔ＋。
Ｅｓ５ｅ＋ｕｉａｌ　ＭａｌａｒｉｏｌＢ７　、第２版
、Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、　ロンドン［１９８６年コ参照
）。
最近の技術の進歩により、マラリアの増殖体と反応性の
ある抗マラリアワクチンを生産することが出来るという
希望が出てきた。先ず、例えば遺伝子のクローニングと
それを微生物宿主中で発現する事、また抗原同定へのモ
ノクローン抗体の使用など、マラリアワクチンの開発に
新しい手法が利用できる。第二に、ヒト赤血球細胞中で
のＰ、　Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍの長期培養（Ｔｒａｇｅ
ｔら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９３巻、６７３−６７５頁［
１９７６年コ）によりマラリア寄生虫の研究のための材
料が提供できるようになった。さらに最近、この寄生虫
の生育サイクル中の全ての段階を実験室内で維持するこ
・とが可能となった（Ｐｏｎｎｕｄｕｒａｉら、Ｔｒａ
ｎｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ。
Ｔ＋ｏｐ、　Ｍｅｄ、　ｌ（ｙｇ、　　７６巻、８１２
−８１８頁［１９８２年コ　：　Ｍａｘｉｅ＋ら、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２２７巻、４４０−４４２頁［１９８５
年］）。
Ｐ、　ｔａｌｃｉｐａｒｕｍの自然の生育サイクルには
３つの段階がある。第一段階は蚊がスポロゾイトを食餌
摂取の際にを推動物の血管内に導入する。このスポロゾ
イトが血液を経て肝臓に移動し、宿主の肝細胞を侵食す
る。第二の段階は、これらのスポロゾイトから分裂小体
が形成されるものである。分裂小体は宿主の赤血球中で
何サイクルか増殖し、有性原虫細胞に生長する。有性原
虫細胞は寄生虫の有性段階であり、蚊が食餌を摂取する
際に取り込む。有性原虫細胞は蚊の胃の中で受精し、ス
ポロゾイトに生長し、唾液腺に移行する。ここから再び
サイクルが始まる。
スポロゾイト、分裂小体および有性原虫細胞は異なった
抗原を有する。理論的にはワクチンはマラリア寄生虫の
どの生育段階に対しても生成できるが、この寄生虫のポ
リペプチドの多くは遺伝的に多形性、即ち、ポリペプチ
ドが世代毎にわずかに変化することが知られている。こ
のため、そのようなポリペプチドを抗原として用いてマ
ラリアに対してを推動物を免疫処理しても、−度形成し
た抗体がそのうちに変化した抗原を認識できなくなるた
め有効でない。従って、理想的なワクチンは変化が起ら
ないアミノ酸配列を有する寄生虫のポリペプチドに対し
て、即ち、遺伝的に安定なポリペプチドに対して生成し
たものであろう。例えば酵素のように特有の機能を実施
するポリペプチドのアミノ酸配列（−次構造）は、少な
くともその機能に重要な一次構造の領域では一定である
ことが知られている。
Ｐ、　Ｉａｌｃｉｐａ＋ｕｍの遺伝的に安定なポリペプ
チドの例としては（Ｉ）式のアミノ酸配列を有する分裂
小体抗原がある。
但し、 −Ｗ−はＧＪｊｎまたは非存在； −Ｘ−はＭｅｔまたはＧｌｎ； −Ｙ−はＧｌｙまたはＣｙｓ； −Ｚ−はＧｌ！ｙまたはＣｙｓである。
本発明はアミノ酸配列（Ｉ）を有する Ｐｌａｓ＋ｕｏｄｉｕｍ　１ａｌｃｉｐａ＋ｕｍ分裂小
体抗原と少なくとも一つの特異エピトープで符合するポ
リペプチドに関する。特異エピトープはポリペプチド上
にあってそのポリペプチドの部分配列の特異分子構造に
より形成される免疫原決定因子である。本発明はまた、
上記の定義によるポリペプチドであってさらに、アフィ
ニティーペプチドと共有結合しているポリペプチドに関
する。
アフィニティーペプチドというのは、アフィニティーク
ロマトグラフィーの担体物質によりよく結合するアミノ
酸配列を含有するペプチド残基をいう。アフィニティー
ペプチド残基の例としては、少なくとも２個のヒスチジ
ン残基を含むペプチド残基がある。このようなアフィニ
ティーペプチド残基はニトリロトリ酢酸−ニッケルキレ
ート樹脂に選択的に結合する（欧州特許出願公開Ｎα２
５３゜３０３参照）。そのようなアフィニティーペプチ
ド残基を含有するボリペチドはこのような樹脂により他
のポリペプチドから選択的に分離する・ことが出来る。
アフィニティーペプチドは前述のポリペプチドのＣ末端
でもＮ末端でも結合できるが、Ｎ末端への結合の方が好
ましく、特に本発明によるポリペプチドの発現の際にマ
ラアリ抗原の天然の停止コドンを利用する場合にそれが
好ましい。
本発明による好ましいポリペプチドは一般式、−Ｂ で示される。
但し、 Ａはアフィニティーペプチドであるか存在しないかであ
り、 Ｂはアミノ酸配列（１）を有するＰ、　Ｉａｌｃｉｐａ
ｒｕｍ分裂小体抗原と少なくとも一つの特異エピトープ
で符合するポリペプチドである。
本発明による最も好ましいポリペプチドは以下のアミノ
酸配列を有する。
本発明はまた、ポリペプチドがマラリア寄生虫の分裂小
体期、好ましくはアミノ酸配列（Ｉ）を有するＰ、　ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍの分裂小体抗原に対して免疫応答を
誘発できるものであれば、付加、欠損、挿入またはアミ
ノ酸置換による上述のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列
を有し、一般式Ａ−Ｂで示すポリペプチドにも関するも
のである。本発明はまた、本発明によるポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列、およびそのようなりＮＡ配列を
含有する複製可能な微生物ベクター、特に発現ベクター
、即ち、本発明によるポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列が、そのＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチ
ドが発現されるように発現調節配列と結合している複製
可能な微生物ベクターに関する。さらに本発明は、その
ような複製可能なベクター或いは発現ベクターを含有す
る微生物、およびその生産方法に関する。さらにまた本
発明は、ポリペプチドの生産方法およびマラリアに対す
る哺乳動物の免疫処理へのその利用に関する。
ポリペプチドのアミノ酸配列である種の置換はそのポリ
ペプチドの立体構造成いは生物活性に影響しないので、
本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列も上記配列と
異なっていてもよい。そのようなアミノ酸置換の例とし
ては、 ＡＪａ／５ｅｒＳＶａｊｉ／Ｉｊｊｅ、Ａｓｐ／ＧＪｕ
ＳＴｈ　ｒ／Ｓｅ　ｒ、ＡＪａ／Ｇｆｌｙ。
Ａ１ａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｊ！ａ／ＶａＪ、
Ｓｅ　ｒ／ＧＪｙ、Ｔｙ　ｒ／Ｐｈｅ。
ＡＪａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌ
ｅｕ／ｌ１ｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｉ。
ＡＪｌａ／Ｇｆｌｕおよびこれらの逆がある（Ｄｏｏｌ
目ｔｌｅ、　”Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”　、Ｈ，Ｎ
ｅｕ＋ａｊｈおよびＲｌＬ、Ｈｉｌ１編集、＾ｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ニューヨーク［１９７９年］参
照）。
本発明によるポリペプチドは担体物質と共有結合してい
てもよく、或いは担体物質に吸着していてもよい。適当
な担体物質は例えば一種またはそれ以上のアミノ酸の共
重合体（例えばポリリジン）または糖類（例えば多糖類
）などのような天然または合成の重合化合物である。そ
の他の適当な担体化合物は、ヘモシアニン（例えばＫＬ
Ｈ＝スカシガイのヘモシアニン）のような天然ポリペプ
チド、血清たん白質（例えばガンマ−グロブリン、血清
アルブミン）およびトキソイド類（例えばジフテリアま
たは破傷風トキソイド）である。この他の適当な担体物
質は本技術の熟練者に公知のものである。
本発明によるポリペプチドの担体物質への共有結合は、
例えばポリペプチドの遊離力ルボギシル基、アミノ基ま
たは水酸基と担体物質の対応する基との間で直接ペプチ
ドまたはエステル結合を形成するか、ｍ−マレイミドベ
ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）またはスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフ
ェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）などの従来の二官能基
試薬を用いて間接的に行なうかの公知の方法で実施でき
る。上記およびその他の二官能基試薬は市販されており
、例えば米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎ７から入手できる。
さらに、グルタルアルデヒドなどのようなＣ２，−ジフ
ルｈ−ｊ−−ル類（＾ｖｒａｍｅａｓ。
Ｉｍｍｕｎｐｃｈｅｍ、６巻、４３−５２頁［１９６９
年］）も使用できる。
ポリペプチドを結合した担体物質は非結合ポリペプチド
と分離することが出来、必要なら過剰の試薬からも公知
の方法で分離できる（例えば透析或いはカラムクロマト
グラフィー）。
本発明によるポリペプチドは液相法、または好ましくは
ｍｅｒｒｉｌｉｅｌｄの方法（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓ
ｏｃ　、　　８°　５巻、２１４９−２１５４頁［１９
６３年］）などの固相法、或いはその他の公知の同等な
方法などの従来のペプチド合成法により生産できる。
固相合成法は合成しようとするペプチドのＣ末端アミノ
酸に始まり、保護した形で適当な樹脂にカプリングする
。出発原料はアミノ基を保護したアミノ酸をベンジルエ
ステル結合を介してクロロメチル化または水酸化メチル
化樹脂に、或いはアミド結合を介してベンズヒドリルア
ミン（ＢＨＡ）樹脂、メチルベンズヒドリルアミン（Ｍ
　Ｂ　ＨＡ）樹脂或いはベンジロキシベンジルアルコー
ル樹脂にカプリングして調製できる。これらの樹脂は市
販されており、その製造法および利用はよく知られてい
る。
本発明で使用できるアミノ酸の保護および保護基の除去
の一般的な方法は“Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、第２
巻（Ｅ、ＧｒｏｓｓおよびＪ、　ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｔ
編集、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ニューヨーク
、１−２８４頁［１９７９年］）に記載されている。保
護基として例えば、９−フルオレニルメチロキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）、第三級ブチロキシカルボニル（Ｂｏ
ｃ）、ベンジル（Ｂ　Ｚ　Ｊ）、ｔ−ブチル（Ｂｕｔ）
、２−クロロベンジロキシカルボニル（２ＣＪ−Ｚ）　
、ジメチルベンジル（Ｄｃｂ）および３，４−ジメチル
ベンジル（Ｄｍｂ）基などがある。
α−アミノ保護基を除去後、保護アミノ酸を希望する配
列に従って順番に、樹脂に結合したＣ末端アミノ酸にカ
ップルしていく。このようにして全ペプチドを合成する
。別法としては、小ペプチドを合成してから連結して目
的のペプチドを合成する。カプリング用試薬は本技術で
公知のものであるが、ジシクロへキシルカルボジイミド
（Ｄ　ＣＣ）が特に好ましい。
保護アミノ酸またはペプチドのそれぞれを過剰に固相合
成反応槽に入れて、カプリング反応はジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）または塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｊ！２　
）　、或いはその混合物中で実施する。カプリングが不
完全な場合には、次のアミノ酸のカプリングのためにＮ
末端のα−アミノ保護基を除去する前に反応をくり返す
。各カプリング反応の収量を、好ましくはニンヒドリン
法によって追跡する。カプリング反応および洗滌ステッ
プは自動的に行なうことが出来る。
担体物質からのペプチドの切断は、例えばｐ−クレゾー
ルおよびジメチルスルフィドの存在下で弗化水素（ＨＦ
）と０℃で１時間の反応後、ｐ−クレゾール存在下で０
℃にて２時間のＨＦとの第二回目の反応によるなど、ペ
プチド化学でよく知られる方法により達成できる。クロ
ロメチル化または水酸化メチル化担体からペプチドを切
断する遊離Ｃ末端を有するペプチドが得られ、ベンジル
ヒドリルアミンまたはメチルベンジルヒドリルアミン担
体からペプチドを切断するとアミド化されたＣ末端を有
するポリペプチドが得られる。
別法として、本発明のポリペプチドは組換えＤＮＡ技術
（ｍａｎｎｉｇ＋ｉｓら、“ｔｎｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｔａｊｏｔｙ　ｍａｎｕａｌ
　’　、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｊｏＢ　　［１９８２年１）の方法を使用して生
産することも出来る。例えば、そのようなポリペプチド
をコードするＤＮＡ断片は、例えばｍｅｊｈ、　Ｅｎｘ
７ｍｏ１．　６８巻、９０−１０８頁［１９７９年］に
ｎａｒａｎ、ｇらにより記載されているりん酸トリエス
テル法、或いはりん酸ジエステル法（Ｂｒｏｗｎ　　ら
、ｍｅｊｈ、　　ＥｎＢｍｏｌ、　６８巻、１０９−１
５１頁［１９７９年］）によるなど、公知の化学的方法
により合成できる。いずれの方法でも、先ず長いオリゴ
ヌクレオチドを合成し、それらを決まったように連結す
る。ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列はＰｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ寄生虫の天然のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列と同一でよい。遺伝子コードは変化するもので
あるから、部分的または完全に異なったヌクレオチド配
列が同じポリペプチドをコードする可能性も一方ではあ
る。使用するコドンは組換えポリペプチドの発現に使用
する宿主に望ましいコドン利用（Ｇｒｏｓ　ｊｅａｎら
、ｇｅｎｅ１８巻、１９９−２０９頁［１９８２年コ）
を採用するとよい。このようにして得られるＤ　Ｎ　Ａ
’断片が、例えば望ましくない制限酵素切断部位を導入
したり、ポリペプチドの発現を阻害したり、発現ベクタ
ーの構築を困難にすることがないように注意せねばなら
ない。
さらに、一般式Ａ−Ｂで示されるポリペプチドはＰＬ＋
ｓｍｏｄｉｕｍの分離体の遺伝子から部分配列Ｂをコー
ドするＤＮＡ断片を単離し、それを宿主生物中で発現す
ることにより生産することも出来る。
部分配列ＢをコードするＤＮＡ断片はＰｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ株の遺伝子ＤＮＡを一種またはそれ以上の適当な制
限エンドヌクレアーゼ、例えばＥｃｏＲＩで切断して得
られる。長さが１．５から８×１０３塩基対の断片を単
離して適当なベクター、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７
ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｔｅ　Ｃｏ１１ｃｃ目ｏｎ、１２３０
１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｔｉｖｅ、　　Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、　　Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡより入手可能な（
ＡＴＣＣＮα３７１９４）λファージベクターｇ　ｔ　
１１　　（Ｙｏｕｎｇ　ら、Ｐｔｏｃ、Ｎａｊｌ、　Ａ
ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０巻、１１９４−１１９８頁［１９
８３年コ）に挿入する。組換えファージＤＮＡは試験管
内でファージ内にパケジングできる。このようにして得
られるファージを適当な宿主細胞、例えばプラスミドｐ
ＭＣ９（ＡＴＣＣＮα３７１９５）を含有するＥ、ｃｏ
Ｊ！ｉ　　Ｙ１０８８株に導入する。およそ１００，０
００個の組換えファージの巾から適当なプローブとハイ
ブリダイズするファージを選択する。適当なプローブは
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子ＤＮＡの部分
配列に対応するオリゴヌクレオチドである。プローブの
選択およびその使用に関しては、本技術の熟練者には公
知である。目的のＤＮＡ断片を含むファージは増殖させ
、そのＤＮＡを単離する。続いて、そのＤＮＡ断片を適
当な複製可能な微生物ベクター、好ましくは必要な発現
シグナルを有し、本発明による一般式Ａ−Ｂなるポリペ
プチドの部分配列Ａをコードしている発現ベクターに挿
入する。ベクターｐＤｓ７８／ＲＢｓｎ、６×Ｈ１ｓは
好ましい発現ベクターである。本ベクターの構築および
生産は実施例に詳細に記載されている。
本発明のポリペプチドはヌクレオチドを対応して調整し
、他の適当な発現ベクターに入れても生産できる。その
ような発現ベクターの例は１９８６年７月２日公開の欧
州特許出願公開番号Ｎα１８６０６９に記載されている
。他の発現ベクターは本技術の熟練者にはよく知られて
いる。
本発明によるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有
するＤＮＡ断片を含有する発現ベクターは次に適当な宿
主生物に導入される。適当な宿主生物は例えば、発現ベ
クターによりコードされるポリペプチドを発現すること
が出来る酵母細胞または細菌細胞のような微生物である
。好ましい宿主生物はＥ、　　ｃｏＪ　ｉ　　Ｍ１５　
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　。
１２０巻、４６６−４７４　［１９７４年］でＶｉｌｌ
ａｒｅｊｏらによりＤＺ　　２９１として記載されてい
る）である。他の適当な宿主生物はＥ、ｃａｆ！ｉ　　
２９４　（ＡＴＣＣＮα３１４４６）、Ｅ、ｃｏｊ！ｉ
　　ＲＲＩ　（ＡＴＣＣＮ（１３１３４３）およびＥ、
ｃｏｊ！ｉ　　Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣＮα２７３２５
）である。
本発明によるポリペプチドを発現する手法は使用する発
現ベクターおよび宿主生物に依存する。
通常、発現ベクターを含有する宿主微生物をその微生物
の生育の至適条件下で培養する。単位時間当たりの細胞
数の増加が低下する対数増殖終期にかけて、本発明のポ
リペプチドの発現を誘導する。
即ち、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写し、転写
されたｍＲＮＡを翻訳する。誘導は誘導剤または抗レプ
レッサーを生育培地に添加し、或いは温度変化によるな
ど物理的パラメーター変化により行なう。本発明で使用
する発現ベクターでは発現は１ａｃレプレツサーにより
制御される。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現調節配列が抑制解
除され、その結果ポリペプチドの合成が誘導される。
宿主細胞中で生産したポリペプチドは特別の輸送機構に
より細胞から分泌させるか、或いは細胞を破砕して単離
する。細胞破砕は物理的（Ｃｈａｒｍら、ｍｅｔｈ、Ｅ
ｎｘ７ｍｏｌ、　　２２巻、４７６−５５６頁［１９７
１年］）、酵素的（リゾチーム処理）または化学的（界
面活性剤処理、尿素またはグアニジン塩酸処理等）方法
、或いはそれらの組合せにより実施できる。
真核細胞では、細胞から分泌されるポリペプチドは前駆
体分子として合成される。成熟ポリペプチドはいわゆる
シグナルペプチドの切断により生成する。原核宿主生物
は真核細胞の前駆体分子からシグナルペプチドを切断す
ることが出来ないから、真核細胞ポリペプチドは原核宿
主生物中では成熟型として直接発現されなければならな
い。
ＤＮＡの段階ではＡＴＧコドンに対応する翻訳開始シグ
ナルＡＵＧは原核宿主細胞で生産されるポリペプチド全
てのＮ末端にメチオニンを付加することになる。発現系
によってはこのＮ末端メチオニン残基は切断除去される
。しかし、Ｎ末端メチオニンの有無はポリペプチドの生
物活性に影響しない（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、　”Ｇｅｎ
ｅ　ａｎｄ　Ｋｌｏｎｅ”、２５５頁、Ｖｅ「ｌａｇ　
Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、　　ＢＲＤ　［１９
８５年］参照）。Ｎ末端メチオニンに問題がある場合に
は、Ｎ末端メチオニンに特異的なペプチダーゼを用いて
切断除去できる。Ｍｉｌｌｅｔら（ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　Ｌｌ、　Ｓ、　Ａ、　８４巻、２７１８−２
７２２頁［１９８７年］はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙ
ｐｈｉｍｕｔｉｕｍからのそのようなペプチダーゼの単
離を報告している。従って、本発明はＮ末端にメチオニ
ン残基を有するポリペプチドとメチオニン残基が存在し
ないポリペプチドに関する。
本発明によるポリペプチドは、例えば異なる速度での遠
心分離、硫酸アンモニウム沈澱、透析（常圧ま・たは減
圧下）、調製用等電点電気泳動、調製用ゲル電気泳動、
或いはゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー（例
えばブルーセファロースＣＬ−６Ｂ、りん酸セルロース
、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体結合担体、
或いは本発明に記載する金属キレート樹脂を用いて）な
どの各種クロマトグラフィー法などの公知の方法で精製
できる。
本発明において好ましい精製法はアフィニティークロマ
トグラフィー精製である。本発明によるポリペプチドを
金属キレート樹脂（Ｓｕｌｋｏｗｔｋ７゜Ｔｒｅｎｄｓ
　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、　　３巻、１−７頁［１９
８５年］）またはりん酸セルロース上で精製するのが特
に好ましい。隣接するヒスチジン残基のニトリロトリ酢
酸−ニッケルキレート樹脂（ＮＴＡ樹脂）への選択的な
結合、およびアルドラーゼのりん酸セルロースへの親和
性をそれぞれ利用するものである。これら二つの精製法
を組合せることもできる。
本発明のポリペプチドは多量体、例えば二量体、二量体
または四量体、として存在することもでき、また融合た
ん白質の一部分ともなる。多量体はポリペプチドが原核
宿主生物中で生産される際、例えばシスティン残基の間
のジスルフィド結合の形成の結果形成する。融合たん白
質は本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を他
の任意のポリペプチドをコードする一つまたはそれ以上
のＤＮＡ断片と結合することにより生産される。そのよ
うな融合ポリペプチドの例は、上に定義した一般式Ａ−
Ｂで示されるポリペプチドである。その他の例は一般弐
Ｂ−ＣまたはＡ−Ｂ−Ｃで示されるポリペプチドであり
、式中Ｃは任意のポリペプチドでＡおよびＢは上述のと
おりである。一般式Ａ−Ｂ−Ｃで示されるポリペプチド
の例としては、例えば一般式Ａ−ＢのＢ部分とβ−ガラ
クトシダーゼとの融合ポリペプチドがあり、これはＲｕ
ｔｈｅｒら、ＥＭＢＯＪ、２巻、１７９１−１７９４頁
［１９８３年］に従って生成できる。アフィニティーペ
プチドＡもポリペプチドＣも本発明のポリペプチドの抗
原として、またはマラリアに対するワクチンとしての機
能に有害であってはならない。
本発明はまた、本発明によるポリペプチドおよび適当な
アジュバントを含有する免疫原組成物にも関する。ヒト
および動物に使用する適当なアジュバントは本技術の熟
練者には公知である（ＷＨＯＴｅｃｈｎ、　Ｒｅｐ、５
ｅｒｉｅｓ　５９５巻、１−４０頁［１，９７６年］　
　ＨＪｏｌｌｉｓら、　”Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ１８ｕｉｓ　ｏｆ　Ａｄｊｕｖａｎ
（ｓ″、　＋ｎ０１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓ
ｆｒ７ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓｌ　３巻、１−１
４８頁［１９７３年］　、Ｓｐｔｉｎｇｅｒ　Ｖｅ＋ｌ
ａｇ　、　、ベルリン）。
本発明によるポリペプチドは滅菌水或いは塩溶液、好ま
しくは食塩溶液、で再構成できる凍結乾゛燥物としても
調製できる。本発明によるポリペプチドおよび免疫原組
成物を哺乳動物に投与すると免疫系が活性化され、ポリ
ペプチドに対する抗体が形成する。本発明はまたそのよ
うな抗体にも関する。本発明による抗体はマラリア寄生
虫に存在するポリペプチドの天然同等物を認識し、従っ
て受動免疫或いは診断目的に利用できる。
本発明によるポリペプチドに対する抗体はサル、ウサギ
、ウマ、ヤギ、モルモット、ラッチ、マウス、ウシ、ヒ
ツジ等で、またヒトで産生ずることが出来る。必要に応
じて抗血清でも精製抗体でも使用できる。抗体の精製は
、例えば硫酸アンモニウムによる沈澱などの公知の方法
で行なうことが出来る。本発明のポリペプチドに対する
モノクローナル抗体をＫＨｈ　ｌ　ｅ　ｒらか開発した
方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６巻、４９５−４９７頁［１９
７５年］）に従って生産することも可能である。ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体は本発明のポリペプ
チド或いはその天然同等物のアフィニティークロマトグ
ラフィー精製にも利用できる。
本発明によるポリペプチドおよび免疫原性組成物は哺乳
動物のマラリアに対する免疫処理に使用できる。投与方
式、投与量および投与回数は本技術の熟練者には公知の
方法により至適な条件を決めるこさが出来る。典型的に
は、マラリア抗原、即ち本発明のポリペプチド、に対す
る高力価の抗体を得るためには長期間に亘り何回かの投
与を行なう。
以下に示す図面および詳細な実施例は本発明をより良く
理解するのに役立つ。しかし、本発明は実施例或いは図
面に示されるものに限定されることはない。
Ｂ、　　Ｂｇ、　　Ｅ、　Ｈ，Ｓａ、　Ｘおよびｘｂは
それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｂｇｊ！ＩＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ。
Ｈｉｎｄｌｌｌ、５ａＩＩ、Ｘｈｏ　ＩおよびＸｂａＩ
を表わす。区は遺伝子ｂ１　ａｓ　１　ａ　ｃ　Ｉおよ
びｎｅｏのプロモーターを表わす、■は遺伝子ｔ）Ｉｌ
ａ、ｃａｔ、ｎｅｏおよび！ａｃＩのりボゾーム結合部
位を表わす；口はターミネータ−ｔｏおよびＴ１を示す
、［ｌは調節可能なプロモータ／オペレーター因子Ｎ２
５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９を表わす；「］はりボゾーム結
合部位ＲＢＳｎを表わす；→はこのりボゾーム結合部位
制御下のコード領域を表わす；＝＝コは６個のヒスチジ
ンをコードする領域を表わす；−複製（ｒｅｐｌ）に必
要な領域を表わす；［Ｉ）はジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ｄｈ［ｒ）　、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ｃａｔ）、１ａｃレプレツサー（１ａｃ
Ｉ）、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）およびネオマイシン
フオスフォトランスフェラーゼ（ｎ　ｅ　ｏ）をコード
する領域を表わす。
第１図　はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎを図示した
ものである。
第２図　はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩのヌクレ
オチド配列を示す。配列中に第 １図に示す制限酵素部位を上線で示し、β−ラクタマー
ゼおよびジヒドロ葉酸 レダクターゼのコード領域を下線で示 す。
第３図　はプラスミドｐＤＭＩ、１を図示したち、ので
ある。
第４図　はプラスミドｐＤＭ１．１のヌクレオチド配列
を示す。配列中に第３図に示 す制限酵素部を上線で示し、ネオマイ シンフォスホトランスフェラーゼおよ びＪａｃレプレツーサーのコード領域 は下線で示す。
第５図　は制御可能なプロモーター／オペレーター因子
Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９゜リボゾーム結合部位ＲＢ
ＳＩＩおよび６個のヒスチジンをコードする領域を有 するＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片の調製 を図示したものである。
第６図　はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩおよび制
御可能なプロモーター／オペレ ーター因子Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２ ９、リボゾーム結合部位ＲＢＳＩＩおよび６個のヒスチ
ジンをコードする領域 を有するＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片Ｆ を用いてのプラスミドｐＤＳ７８／ ＲＢＳｎ、６ｘＨｉｓの構築を図示し たものである。
第７図　はＰ、　ｆａｌｃｉｐａ＋ｕｍの１２種の株か
らの遺伝子ＤＮＡのサザントランスファー分 析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　ｍｏｔ、Ｂｉｏｌ、　
　９８巻、５０．３−５１７頁［１９７５年コ）である
。１２の全ての分離株に典型的な りｒａ　Ｉ断片がある。Ｋｌ−ＢからのＰ、Ｉａｌｃｉ
ｐｕｕｍ　　ＤＮＡ断片をプローブとした（実施例参照
）。
第８図　Ｐ、Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍ分裂小体抗原に対す
る抗体を有する１１分離株からの Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｔｕｍたん白質のウェスタントラ
ンスファー分析（ウェスタンプロッ ト、Ｔｏｗｂｉｎら；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｔ、＾ｃａ
ｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、７６巻、４３５０−４３５４ ［１９７９年］）を示す。
Ｅ、ｃｏｌｉの溶菌物を寄生虫抗原に 対する抗体でウェスタンプロット試験 した。ＭＷ−８Ｔと記したものは染色 前の分子量標準を含有する。大きさは キロダルトン（＝１，０００ダルトン）で示す。１列目
は形質転換細胞の非誘 導溶菌物である。２列目は誘導したプ ローブを含有する。３列目は非転換株 で対照である。４列目はＰ、　ＩａｌｃｉｐａｒｕｍＫ
ｌの溶菌物を含む。予想どおり抗体 は２列目の組換えたん白（２７ＫＤ） および４列目の寄生虫たん白質とのみ 反応する。
第１０図　組換えたん白質（４１ＫＤ）の精製組換えた
ん白質（４１ＫＤ）の精製に 於ける各種精製段階の分析用ポリアク リルアミドゲル電気泳動およびウェス タンプロット分析である。
（Ａ）　　クマツシーブルーで染色したポリアクリルア
ミドゲル。１タリ目：ｐ８／３で形質転換したＥ、ｃｏ
Ｊｉ細胞の 溶菌物。２列目：溶菌物の遠心分離 （１００，０００Ｘｇ）後の可溶性区 分。３列目：りん酸セルロースカラム に特異結合した溶出物。４列目：ＮＴ Ａ樹脂に特異的に結合した物質の溶出 液。５列目：　　Ｓｅｐｈａｃｒ７１ＴＭＳ　−２００
カラムでの限外濾過後の最終生成物。
以下の分子量マーカーたん白質を使用 した：３１＝カルボアンヒドラーゼ、 分子量（ＭＷ）＝３１．０００ダルト ン；４５＝卵アルブミン、ＭＷ＝４５゜０００ダルトン
；６６＝ウシ血清アル ブミン、ＭＷ＝６６．０００ダルトン：９２＝フォスフ
ォリラーゼＢ、ＭＷ＝ ９２．０００ダルトン。
ポリアクリルアミドゲル（Ａ）　　Ｅ。
ｃｏＪ　ｉ溶菌物に対するウサギ抗血清でのウェスタン
プロット。
ポリアクリルアミドゲル（Ａ）　Ｐ。
Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍの分裂小体抗原（Ｐｅｒｒｉｎら
、Ｊ、　Ｃ１１−ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７５巻、１７
１８−１７２１頁［１９８５年］）に対する抗 体を用いたウェスタンプロット。
第１１図　プラスミドｐ８／３のヌクレオチド配列 ポリペプチド（４１ＫＤ）をコードす る配列は１１５−１１７の位置（Ｓ） のＡＴＧで始まり、１２５５−１２５ ７の位置（Ｔ）の終止コドンで終る。
アファイニテーペプチドをコードする 配列は上述のＡＴＧで始まり、１６６ −１６８位のチロシンをコードするコ ドンＴＡＴで終る。ポリペプチド（４ ＩＫＤ）の部分配列Ｂをコードする配 列は１６９−１７１の位置のメチオニ ンをコードするＡＴＧコドンに始まり、同じ＜　１２５
５−１２５７位の終止コドンで終る。
第１２図　４１，０００ダルトンの分裂小体抗原をコー
ドするＰ、　Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍ　　Ｋ　１分離株の
遺伝子のヌクレオチド配列および それに由来するアミノ酸配列。Ｎ末端 メチオニンに下線を施しである。読み ワクは１０８７から１０８９位の終止 コドンＴＡＡで終る。本図はまた分裂 小体抗原のコード配列の前および後ろ の非コード配列一部も示している。他 の分離株（ＲＯ−３３，ガーナ）の遺 伝子ＤＮＡのヌクレオチド配列も大部 分かに１分離株からのヌクレオチド配 列と同一であった。Ｍ２５は Ｐ、　Ｉａｌｃｉｐａｒｕ＋からＭ２５分離株のｃＤＮ
Ａの対応する配列を示す。コー ド配列中でのヌクレオチド配列の差は ３つのコドンで、第１２図で囲ってい る。ヌクレオチド配列の差の結果、２ 個のアミノ酸に変化が生じている。Ｋ １分離株の分裂小体抗原のＭｅｔまた はＧｌｙがＭ２５分離株の分裂小体抗 原ではＧｌｎまたはＣｙｓに対応して 、　　いる。
使用する略号 ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三りん酸ｂｐ　　　　　
＝塩基対 ＢＳＡ　　　　　：ウシ血清アルブミンｃｐｍ　　　　
　ニー分間光たりのカウント数ｄＡＴＰ　　　　：デオ
キシアデノシン三りん酸ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシ
チジン三りん酸ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン
三りん酸ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三りん酸
ＤＴＴ　　　　　　ニジチオトレイトールＥＤＴＡ　　
　　：エチレンジアミン四酢酸ＩＰＴＧ　　　　：イソ
プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド ｋｂ　　　　　　：１，０００塩基対 ｋＤ　　　　　：キロダルトン Ｍ　　　　　　：モル ｍＭ　　　　　　：ミリモル ｍｌ　　　　　　　＝ミリリットル ｎｍ　　　　　　：ナノメーター ＰＦＵ　　　　　　　：プラーク形成単位ＲＰＭ　　　
　　　　ニー分間光たりの回転数ＳＤＳ　　　　　ニド
デシル硫酸ナトリウムＴＥＭＥＤ　　　：Ｎ、Ｎ、Ｎ’
、Ｎ’　　−テトラメチルエチレンジアミン Ｔｒｉｓ　　　　ニドリスヒドロキシメタンＸ−ＧａＪ
！：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニルβ−Ｄ−
ガラクトピ ラノシド 緩衝液および培地 ２ｇ　ポリビニルピロリドン ２ｇ　ファイコール ２ｇ　　Ｂ５Ａ １００ｍｇ　　ナトリウムアジド ＤＮＡゲルローディング緩衝液 １ｘＴＢＥ（成分は下記参照） ２０％　グリセロール ０．１％　ブロモフェノールブルー ０．１％　キシレンシアツール ホルムアミド混液 ８０％（ｗ／ｖ　）ホルムアミド ５０ｍＭ　　トリス／ホウ酸［ｐＨ８，３］１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ ０．１％　キシレンシアツール ０．１％　ブロモフェノールブルー ＨＩＮ緩衝液 １０ｍＭ）リス／Ｈ（、ｅ　［ｐ）１７．　４１１０ｍ
Ｍ　　塩化マグネシウム ５０ｍＭ　　塩化ナトリウム リガーゼ緩衝液 ５０ｍＭ　　）リス／ＨＣ１［ｐＨ７，８］１０ｍＭ　
　塩化マグネシウム ２０ｍＭ　　ＤＴＴ １０ｍＭ　　ｄＡＴＰ ＬＢ培地：１リツトル当たり： １０ｇ　　バクトドリプトン ５ｇ　酵母エキス Ｌｏｇ　　塩化ナトリウム ＳＤＳゲルローディング緩衝液： ５％　　ＳＤＳ ５ｍＭ　　　）リス／ＨＣｊ！　　［ｐＨ６，８］２０
０ｍＭ　　ＤＴＴ ２０％　　グリセロール ０．１％　ブロモフェノールブルー ２０ＸＳＳＣ：　１リツトル当たり： １７５．３ｇ　　塩化ナリトウム ８２．２ｇ　　クエン酸ナトリウム［ｐＨ７，，０］Ｓ
Ｍ緩衝液： ｌＱｍＭ　　塩化ナトリウム ｌＱｍＭ　　塩化マグネシウム １０ｍＭ　　）リス／ＨＣＩ　　［ｐＨ７，４］１０ｘ
Ｔ４　　ポリメラーゼ緩衝液： ０．３３Ｍ）リス／酢酸［ｐＨ７，９］０．６６Ｍ　　
酢酸カリウム ０、ＩＯＭ　　酢酸マグネシウム ５ｍＭ　　　　ＤＴＴ １ｍｇ／ｍｌ　　　Ｂ５Ａ １０ｘＴＢＥ： ０．８９Ｍ）リス／ホウ酸［ｐＨ８，０］０、８９Ｍ　
　ホウ酸 ２０ｍＭ　　　ＥＤＴＡ ＩＱｘＴＢＳ　： ０．５Ｍ）リス／ＨＣｊ！　　［ｐＨ７，４］１．５Ｍ
塩化ナトリウム １ＱＱｘＴＥ： １Ｍ　　）リス／ＨＣＩ　［ｐＨ８，０］１００ｍＭ　
　ＥＤＴＡ 以下の実施例中では、次の方法を何回か使用したのでま
とめて記載する。
方法１：　酢酸リチウムによるＤＭＡの沈澱ＤＮＡ溶液
を０．　１容量の５Ｍ酢酸リチウムおよび２倍容量のイ
ソプロパツールで処理し、よく攪拌してドライアイス上
に１０分間放置する。沈でんしたＤＮＡをエツペンドル
フ机上遠心分離機にて１２．００Ｏｒｐｍ　　（２０°
Ｃ）で１０分間遠心分離し、上澄液を注意深く除去する
。沈でん物を８０％（ｖ／ｖ）エタノールで一回洗滌し
た後、真空遠心分離機で５分間乾燥する。ＤＮＡは水に
溶解して以後の実験に使用する。
方法２：　　ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動　　−乾
燥ＤＮＡを１×のＤＮＡゲルローディング緩衝液に溶解
し、６５℃で５分間加熱する。１００ｍ１の１ｘＴＢＥ
緩衝液をアガロース（０，８％ゲルでは８００■、１．
２％ゲルでは１．２ｇ）と混合し、アガロースが完全に
溶解するまで沸とうさせる。冷却後２μｌの塩化エチジ
ウム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、ゲル溶液を水平
ゲル電気泳動装置（Ｉ　Ｂ　Ｉ、スイス、ジュネーブ、
ジエノフイツト）に流し込む。ゲルが固まったら試料を
ゲルにのせ、１５０ボルトの一定電圧で２時間ＤＮＡを
分離する。市販されている一定の長さのＤＮＡ断片混合
物（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ　ｓスイス、バーゼル）をサイ
ズマーカーとして使用する。ＤＮＡのバンドは３００　
ｎｍのＵＶ線下で検出する。
方法３：アガロースゲルからのＤＭＡの単離ＤＮＡをア
ガロースゲル上で分離する（方法２）。ニトロセルロー
ス膜Ｎ　Ａ　４５　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５
ｃｈｕｅｌｌ、西ドイツ、ダツセル）を−枚単離しよう
するバンドの前に置き、ＤＮＡを２００■で５分間メン
ブレン上に電気泳動する。メンブレンをピンセットで取
り除き、流水蒸溜水で洗う。メンブレンをエツペンドル
フ管に入れ、２００μ矛の１．５Ｍ酢酸リチウム、１０
ｍＭトリス／塩酸［ｐＨ８，０］　、０．１ｍＭＥＤＴ
Ａ中で６５℃、１０分間ＤＮＡを溶出する。溶出をもう
一回くり返す。上澄液をまとめて２倍容量のイソプ、ロ
バノール処理を行なう。沈でんしたＤＮＡ　（方法１）
を５０μｍの水に溶解する。
方法４ニラムダ−ファージのプラーク精製バクテリア培
養物（例えばＥ、ｃｏｌｉ　　Ｙ２Ｏ２Ｓ）を寒天平板
上でラムダファージに感染させる。その結果、バクテリ
ア培養の上に溶菌プラークが形成する。プラークを含む
寒天の円筒塊（直径５ｍｍ）を逆パスツールピペットで
切り出す。
寒天円筒を５００μｌの８Ｍ緩衝液を含むエツペンドル
フ管に入れ、５分間振とうする。ファージけん濁液を遠
心分離にかけ（２０℃にて１２．ＯＱＱ＋ｐｍ、５分間
）、上澄液を新しい管に移す、。
１μ（のファージ液を１ｍｌの８Ｍ緩衝液で希釈する。
この溶液の１．１０および１００μｌをＭｏｒｒｉｓｏ
ｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｘｙｍｏｌ、　　６８巻、３
２６−３３１頁［１９７９年］、に従ってＭｇ＋処理し
た、プラスミドｐＭＣ９（ＡＴＣＣ磁３７１９７）を含
有するＥ、ｃｏｌｔ　　Ｙ１０９０の細胞けん濁液５０
μｌに添加する。室温で３０分間インキュベート後、本
溶液をＬＢ培地の０．８％（ｗ／ｖ　）寒天添加物３ｍ
ｌに加えてＬＢ−アンピシリン寒天平板（Ｌ　、Ｂ培地
、４０μｇ　／　ｍｌアンピシリン）上に注ぐ。力価に
よっては（例えば１　：　１０００の希釈で）、抗体反
応或いはＤＮＡ／）イブリダイゼーションで陽性な場合
、個々のプラークを形成する平板もあり、それらプラー
クを単離できる。プラークからのファージを、例えばフ
ァージＤＮＡの単離法を用いて増殖させる。
方法５ニラムダフアージＤＮＡの単離 滅菌したつまようじを用いて個々のプラーグを寒天平板
から取り、つまようじを５００μｌの３Ｍ緩衝液中で３
７℃３０分間インキュベートする。つまようじを除去し
、ファージ液を遠心分離にかける（２０６Ｃ，１２，０
００ｒｐｍ、１０分間）。上澄液を新しい容器に移し、
５０μ（のクロロホルムで処理する。１００μ（のファ
ージ液を取り、Ｍｇ＋で処理したＥ、ｃｏｌｉ　　ＹＩ
Ｏ９０（ＡＴＣＣＮα３７１９７）の細胞けん濁液５０
μ（と混合する。室温で３０分間インキュベーション後
、けん濁液を０．８％（ｗ／ｖ）寒天含有のＬＢ培培地
３ｍ色混ぜてＬＢ−アンピシリン寒天平板上に注ぐ（方
法４参照）。３７℃で５時間インキュベーションの後に
ペトリ皿上に５ｍｌの８Ｍ緩衝液をかけ、室温にて一晩
振とうする。そうすることによりファージが寒天より溶
出する。
ファージ含有の８Ｍ緩衝液をとり、１２．００Ｏｒｐｍ
で１０分間遠心分離する（室温）。上澄液（＝ファージ
保存液）を１００μｍのクロロホルムで処理する。ファ
ージ保存液中のファーシカ価は通常、１０１０−１０　
”Ｐ　Ｆ　Ｕ／ｍｌである。５０ｍ１のＬＢ培地（４０
μｇ　／　ｍｌのアンピシリンおよび１０ｍＭの塩化マ
グネシウム含有）にプラスミドｐＭＣ９（ＡＴＣＣ！１
ｈ３７１９５）を含有するＥ、ｃｏＪｉ　　Ｙ２Ｏ２Ｓ
の飽和培養液２５０μｌおよびファージ保存液１ｍｌを
植菌し、３７℃で一晩振とう培養する。２ｍｌのクロロ
ホルムを添加後、細胞片を遠心分離除去する（２０６Ｃ
，１２゜００Ｏｒｐｍ、１０分間）。ＤＮａｓｅＩおよ
びＲＮａｓｅ溶液（それぞれ１０ｍｇ／ｍｌの水溶液）
の各５０μ（を上澄液に添加し、混合液を３７℃で３０
分間インキュベートする。１４ｍ１の３５％（ｗ／ｖ）
ポリエチレングリコール６０００（Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ、米
国、ミズリー州、セントルイス）、２．５Ｍ塩化ナトリ
ウムをファージ液（４５ｍｌ）中に加え、充分混合した
後、液を氷上に一時間放置する。ファージを遠心分離（
４℃、１２゜０００　ｔｐｍで２０分間）にて分離し、
１ｍｌの３Ｍ緩衝液に溶解する。１０μ（の２５％（ｗ
／ｖ）ドデシル硫酸リチウム溶液（Ｓｅｒｖａ、　Ｃｈ
ｅｍｉｅ口＋ｕｎｓｃｈｗｉｇ　ＡＧ　ｓスイス、バー
ゼル）、５１１Ｊの０．５ＭＥＤＴＡ　［ｐ）１８．０
］および少量のプロテナーゼＫ　（ｍｅｒｃｋ　、西ド
イツ、ダルムスタット）を添加した後、ファージ粒子を
６５℃で１０分間融解する。予めＬＭ）リス／塩酸［ｐ
Ｈ８，０］で飽和したフェノールの一容量を融解液に加
える。
十分混合してから遠心分離（６０００ｒｐｍで５分間）
で相分離を行なう。上澄液を除去し、抽出をくり返して
二回目の上澄液より方法１に従ってＤＮＡを沈でんする
。
方法６：ベクターの調製 １μｇのプラスミドまたはファージＤＮＡを１００μｍ
のＴ４ポリメラーゼ緩衝液中で１０単位の制限酵素を用
いて３７℃にて一時間消化する。
４００μｍの水と５単位のバクテリアフォスファターゼ
（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ　）を添加し、ＤＮＡを６５°Ｃ
にて一時間脱りん酸する。反応液をフェノールで二回抽
出し、沈でんする（方法１）。ベクター断片はアガロー
スゲル（方法２）で精製して単離しく方法３）、５０μ
（の水に溶解する。
方法７：Ｅ、ｃｏＪｉの形質転換 ３ｍｌのＬＢ培地にＥ、ｃｏｆ！ｉの細胞を植菌し、３
７℃で一晩振とうする。この飽和培養液の１ｍｌを用い
て５０ｍ１のＬＢ液体培地を植菌する。これを６００ｎ
ｍの吸光度（ＯＤ６ｏｏ）が０．２の値に達するまで振
とう培養する。細胞を集め（室温にて６００Ｏｒｐｍ５
分間）、水冷した５０ｍＭ塩化カルシウム５０ｍ１にけ
ん濁する。細胞を再び集め（上述）、１０ｍ１の５０ｍ
Ｍ塩化カルシウム、２０％グリセロールにけん濁する。
コンピーテントな細胞を５００μｌずつ一８０℃で凍結
する。
形質転換には一つを氷上でゆっくり（３０分間）融解す
る。１０μＪ（７）ＤＮＡ溶液（１−Ｌｏｎｇ）、８μ
ｍの３０％（Ｗ／マ）ポリエチレングリコール（Ｓ　Ｉ
ＧＭＡ）　、１０μＪの５００ｍＭ塩化マグネシウム、
１００ｍＭ塩化カルシウムおよび７２μオの水をよく混
合し、１００μｌのコンピーテントな細胞と氷上で２０
分間インキュベートする。続いて混合物を室温にてさら
に１０分間インキュベートする。
Ｍ１３タイプのベクター（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｔｏ
ｎら、ｇｅｎｅ３３巻、１０３−１１９頁［１９８５年
］）を用いる場合には、５０μ矛の１０％（Ｗ／Ｖ　）
Ｘ−Ｇａ　、ｌ　　（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ−ＢＲＬ）ジ
メチルホルムアミド溶液、１０μｍの１００ｍＭ　　Ｉ
ＰＴＧ（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ−ＢＲＬ）水溶液および５
０μ（のＴＧ−１（＾ｍｅｒｓｈａｍ、西ドイツ、ブラ
ウンシュバイク）飽和培養液を加える。十分に混合した
後、３ｍｌの０．８％（ｗ／ｖ　）加ＬＢ培地を添加し
、混合液をＬＢ寒天平板上に注ぐ。平板は３７℃で一晩
インキユベートする。
抗生物質耐性で選択可能なプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣ，
ｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩ、５！ｘ）（ｉｓ等）を用いる
場合には、形質転換液に１ｍｌのＬＢ培地を添加してイ
ンキュベーションを３７℃で一時間行なう。細胞を６０
０　Ｏｒｐｍで３分間（室温）遠心分離で集め、１００
μｌのＬＢ培地にけん濁する。この１００μ（を回転デ
ィスク（ＳｃｈｉｉＮ、西ドイツ、ゲッチンゲン）を用
い、選択に必要な抗生物質を含有するＬＢ寒天平板上に
均一にまき、３７℃にて一晩インキユベートする。
方法８：配列決定のためのＤＮＡの調製配列決定を行な
おうとするＤＮＡ断片を含有するＭ−１３タイプのベク
ターを有する細菌ＴＧ−１を上述のように形質転換し、
白色のプラークを得る。この白色プラークをつまようじ
で吊り、３ｍｌのＬＢ培地にけん濁する。これにさらに
１０μｍの飽和ＴＧ−１培養液を添加する。混合液を３
７℃で５時間振とうする。１．５ｍｌの培養液をエツペ
ンドルフ管に移し、遠心分離にかける（２０℃、１２．
ＯＯＯｒｐｍで５分間）、８００μ、（の上澄液を新し
い試験管に移し、２００μｌの２０％（ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール、２．５Ｍ塩化ナトリム溶液と混合し
て室温にて２０分間インキュベートする。培養液の残り
は４℃で保存するか、或いは「ミニ−溶菌Ｊ　ＤＮＡの
調製（方法１０）に用いる。ファージは遠心分離（２０
℃。
１２３）ＱＱＯｒｐｍにて１０分間）により集める。
沈でん物を１００μｌのＩＸＴＥ緩衝液に溶解し、１０
０μｍの飽和フェノールで抽出する。遠心分離（１２，
０００＋ｐｍで５分間）で相を分離する。
８０μｌの水層を新しい試料管にとり、ＤＮＡを沈でん
して１２μ（の水に溶解する（方法１）。
方法９：サンガー法によるＤＮＡ配列決定方法８に従っ
て調製したＤＮＡ３μ（を２μｌの水、１μ（のＨＩＮ
緩衝液、１．μｌの２５μＭｄＡＴＰ、２ｕｌ！（Ｄａ
　−［”２Ｐ］　−ＡＴＰ　（６０００Ｃｉ　／　ｍｍ
　ｏ　ｌ　、　Ａｍｅ＋ｓｈａｍ）および１μＪの配列
決定スターター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スイス、デュー
ベンドルフ）と混合し、５５℃に５分間加熱する。
その後、溶液を氷上に置く。一方、それぞれ３ｐｉの停
止液入〇、Ｇｏ、Ｔｏ、およびｃｏを含有する試験管４
本を準備する。停止液は次の組成である： Ａｏ　：３μＭ　　ｄｄＡＴＰ。
１１２μＭ　　ｄＣＴＰ。
１１２μＭ　　ｄＧＴＰ。
１１２μＭ　　ｄＴＴＰ Ｃ’：１００μＭ　　ｄｄＣＴＰ。
１１．５μＭ　　ｄＣＴＰ。
１１２μＭ　　ｄＧＴＰ １１２μＭ　　ｄＴＴＰ Ｇ’：１００μＭ　　ｄｄＧＴＰ。
１１２μＭ　　ｄＣＴＰ。
５．６μＭ　　ｄＧＴＰ。
１１２μＭ　　ｄＴＴＰ Ｔｏ　５００μＭ　　ｄｄＴＴＰ。
８５μＭ　　ｄＣＴＰ。
８５μＭ　　ｄＧＴＰ。
５．６μＭ　　ｄＴＴＰ ５単位のフレナラポリメラーゼ（Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ
　）をＤＮＡを含有する試験管に入れてよく混合する。
それぞれ３μ矛のこの溶液を各停止液と混ぜ、３７℃で
１０分間インキュベートする。４本の試験管のそれぞれ
に１μ矛の０．２５ｍＭｄＡＴＰを添加し、混合した後
再び１０分間インキュベートする。最後に２μ矛のホル
ムアミド混液を加えて９６℃に５分間加熱して反応を停
止する。ＤＮＡを次の組成の０．２ｍｍゲルにかける。
６ｍ１ｌＯＸＴＢＥ緩衝液 ２８．８ｇ　　尿素 ３．６ｇ　アクリルアミド（ｌｌｉｏ−ＲａｄＬａｂｏ
ｒａｌｏＢｅｓ　ＡＧ　、スイス、ブラッドブラッグ） １８０ｍｇ　　ビスアクリルアミド（！１ｉｏ−Ｒａｄ
　）　４００μｆ　　１０％過硫酸アンモニウ ム　　２０μＩ　　ＴＥＭＥＤ ＤＮＡは４０ワツトの一定電力で１から６時間分離する
。ガラス板をとり、ゲルを１０％（ｖ／ｖ）酢酸および
１０％（ｖ／ｖ）メタノール中で５分間固定する。次に
ゲルを１０％（ｖ／ｖ）メタノール中で５分間ずつ二回
洗滌し、Ｗｈａｆｍａｎ３Ｍ濾紙（Ｂｅｎｄｅｒ　ａｎ
ｄ　ｌ１ｏｂｅ：ｎ、、スイス、チューリッヒ）上に置
いてゲル乾燥器で乾燥する。乾燥したゲルをＫＯＤＡＫ
−ＸＡＲフィルム（Ｅａｇｌｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ
、、米国ニューヨーク州、ローチエスター）を用いて２
〜２０時間オートラジオグラフにかける。
方法１０：少量のＤＮＡ単離（「ミニ溶菌」）およそ１
−２ｍ１のバクテリア培養物（例えばＭ−１３タイプの
ベクターを含有するＥ、ｃｏｊ！１ＴＧ−１：方法８を
参照）を１２．ＱＱＯｒｐｍにて５分間（室温）遠心分
離する。上澄液を注意深く吸引除去する。集菌細胞を５
００μオの５０ｍＭトリス／塩酸［ｐ）１７．６］　、
５ｍＭ　　ＥＤＴＡにけん濁する。少量のリゾチーム（
Ｓ　ＩＧＭＡ）を添加後、室温で５分間インキュベート
する。次に１５μｍの２５％（ｖ／ｙ　）ドデシル硫酸
リチウム溶液（Ｓ　ＩＧＭＡ）および３０μｍの５Ｍ酢
酸カリを加えて注意深（混合する。氷上で１５分間イン
キュベーションした後、１２．０００ｒｐｍで１５分間
（４℃）遠心分離する。上澄液を傾斜により新しい試験
管に移し、５０μｍのＲＮａｓｅ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ
）で処理する。３７℃で５分間インキュベートの後、フ
ェノールで一回、クロロホルムで一回（それぞれ等量）
抽出する。水層中のＤＮＡを沈でんしく方法１）、１０
０μｍの水に溶解する。
方法１１　：　ＤＮＡの放射標識にツクトランスレーシ
ョン） ２０μｌのＤＮＡ溶液に次の試薬を加える。５μｌの旧
Ｎ緩衝液、１０μｍのα−［３２Ｐ］−ＡＴＰ　（６０
００Ｃｉ／ｍｍｏｊｉ、　Ａｍｃｒｓｈａｍ）、５ｕｌ
ｉ７）ＤＮａ　ｓ　ｅ　　Ｉ　（ｌｎｇ／ｍｌ）　、５
μｊ！の１ｍＭｄＣＴｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび５
μＪのＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｂｏｅｈｒｉｒｇｅｒ
ｍａｎｎｈｅｉｎ　　Ａ　Ｇ、　　スイス、ロットクロ
イン）。
５０μｌのバッチを１４℃で９０分間インキュベートし
、フェノールで一回抽出する（方法５を参照）。水層に
ＤＮＡプローブが含まれており、ハイブリダイゼーショ
ン実験に直接使用する。
方法１２：ＤＮＡのハイブリダイゼーションＤＮＡを含
有するフィルターをプレハイブリダイゼーション液（２
ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，０，１％（ｗ／ｖ　）ドデシル硫酸リ
チウム、１０μｇ　／　ｍｌｌ変性中シ胸腺ＤＮＡ、　
５ＸＤｅｎｂａｔｄｔ’ｓ、　　５ＸＴＥ緩衝液）と６
０℃にて一時間インキユベートする。ウシ胸腺ＤＮＡは
沸とうさせて予め熱変性する。プレハイブリダイゼーシ
ョン液を、さらに約１１０７ｃｐの放射活性試料を含有
するハイブリダイゼーション液と交換する。６０℃で一
晩インキユベートした後、フィルターを２ｘｓｓｃで３
０分間ずつ二回洗滌する。フィルターを乾燥し、Ｋｏｄ
ａｋ　ＸＡＲフィルムに露出する。
方法１３　：　Ｌａｅ＋＋＋ｍｌｉ　Ｎａｔｕ＋ｅ　　
２２７巻、６８〇−６８５頁［１９７０年］による１２
％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの調製 ６０ｍ１分離ゲル １５ｍ１１．５Ｍ）リス／塩酸［ｐＨ８，８］０．４％
（ｗ／ｖ　）ＳＤＳ、８ｍＭ　　ＥＤＴＡ２４ｍ１２９
％（ｗ／ｖ）アクリルアミド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ） １％（ｗ／ｖ　）ビスアクリルアミド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）水溶液 ２５ｍ１の水 ５００μｍ１０％（ｗ／ｖ　）過硫酸アンモニウム水溶
液 溶液を混合する。２枚のガラス板の間に流し込む直前に
１００μｌのＴＥＭＥＤを添加する。分離用ゲルが固化
した後に、次の組成を有する収集用ゲルを注ぐ。
２０ｍ１収集用ゲル ５ｍ１Ｏ，５Ｍ）リス／塩酸［ｐＨ６，８］０．４％（
ｗ／ｖ　）ＳＤＳ、８ｍＭ　　ＥＤＴＡ３　ｍｌ　２９
％（ｗ／ｖ　）　　アクリルアミド１％（Ｖ／Ｖ　）ビ
スアクリルアミド水溶液、１２ｍ１の水 ２５０μｍ１０％（Ｗ／Ｖ　）過硫酸アンモニウム水溶
液。
混合した後、３０μｍのＴＥＭＥＤを加え、固化する前
にコームを挿入する。１９０ｍＭグリシン、２５ｍＭ）
リス［ｐＨ７，６］　、１％（、ｖ／ｖ　）ＳＤＳを電
気泳動緩衝液として使用する。市販の分子量標準（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）を大きさのマーカーとしてのせる。
方法１４：イムノブロッティング（ウェスタンブロッテ
ィング） ４μｌのたん白質試料を１２％ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル上で２５ｍＡの一定電流で４５分間分離する。ゲ
ルを取り除いてトランスファー緩衝液中に置く。水で湿
めらせた一枚のニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉ’ｃｈ
ｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）をゲルの上にのせる。ゲル
とニトロセルロースをＷｈａｔｍａｎ　３ＭＭ濾紙でお
おい、スポンジをそれぞれの上に置く。このようにして
得られるサンドウィッチを電気泳動装置に入れ、ニトロ
セルロースを陽極電極につなぐ。たん白質の移行は４０
０ｍＡの一定電流で１５分間行なう。転移の後、ニトロ
セルロースを１×ＴＢＳ緩衝液中で１０分分間上うする
。つづいでＩＸＴＢｓ、５％（ｗ／ｖ　）脱脂ミルク粉
末中で３０分間前処理インキュベートする。病原体抗原
に対する抗体を１ｘＴＢＳ、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳で
１　：　１０００に希釈し、ニトロセルロースと−時間
インキュベートする。次にニトロセルロースを１ｘＴＢ
Ｓ中で３分間ずつ５回洗滌し、続いてＩＸＴＢＳ、５％
（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中のヤギの抗つザキーベルオキシダ
ーゼ血清（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１：１０００に希釈）と１
時間インキュベートする。ニトロセルロースをもう一度
上述のように洗滌し、５ｍｌの１ＸＴＢＳ中に入れる。
溶液を１０ｍ１の４−クロロナフトール溶液（Ｓ　ＩＧ
ＭＡ、メタノール中５０　ｍｇ／　ｍｌ　）で処理し、
よく混合する。５０μｍの過酸化水素を添加して呈色反
応を開始する。バンドが検出できるようになったら１．
ニトロセルロースを水の中に保存して過剰露光を防ぐ。
発色前のマーカーたん白質を製造元の指示に従って使用
し、分子量マーカーとする。
方法１５：ＤＮＡのナイロン膜へのサザントランスファ
ー 試料当たり約１０μｇのプラスミド或いは病原体ＤＮＡ
をアガロースゲル（方法２）で分離する。
溶出後にゲルを写真に撮影し、０．２Ｎの塩酸中で１５
分間ずつ２回洗滌する。ゲルを０．５Ｍ）リス／塩酸［
ｐＨ８，０１，１，５Ｍ塩化ナトリウム中で１５分間ず
つ２回中和し、２０ＸＳＳＣに浸したスポンジ上に置く
。ゲルの上にナイロン膜（Ｐａｌｌ、　　スイス、バー
ゲル）をのせる。その上に３枚のＷｈａｌｍａｎ　３Ｍ
Ｍ濾紙を約２０枚のペーパータオルをのせる。全体に上
から５００ｇの重量をかける。３時間後に膜をとり、先
ず室温で、続いて真空下で８０℃１時間乾燥する。膜は
さらに方法１２に従って処理してもよい。
〈実施例〉 プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎ、５ｘＨｉｓの構築 プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［を使用してプラスミ
ドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩ、６ＸＨｉｓを構築した。本
プラスミドおよびプラスミドｐＤＭ１゜１で形質転換し
たＥ、ｃｏｌｉ　　Ｍ１５細胞は１９８７年９月３日に
ゲッチンゲンのＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ　ｖ
ａｎ　Ｍｉｋｒｏｏ＋ｇａｎｉｓｍｅｎに寄託した［Ｅ
、ｃｏ　ｌ　ｉ　　Ｍ１５　　（ｐＤｓ７８／ＲＢＳＩ
Ｉ　：ｐＤＭｌ、１）　、ＤＭＳ　　Ｎα４２３２］。
ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ　（第１図および第２図）の制
限酵素ＸｂａＩとＸｈｏＩの切断部位の間、複製部位お
よび細胞にアンピシリン耐性を賦与するβ−ラクタマー
ゼの遺伝子は元来、プラスミド１）　Ｂ　Ｒ３２２（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ　　ら、Ｇｅｎｅ２巻、９５−１１３頁［
１９７７年コ　；　５ｕｊｃｌｉｆｆｅ、　Ｃｏ１ｄ　
ＳｐｒｉｎｇＨａｔｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂ
ｉｏｌ、　　４３巻、７７−９０頁［１９７９年］）。
しかし、β−ラクタマーゼの遺伝子は制限酵素Ｈｉｕｃ
ｎおよびＰｓｔＩの切断部位を除去しである。このよう
なりＮＡの修飾がβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列には
影響しないようになっている。プラスミドのその他の部
分には調節可能なプロモーター／オペレーター因子Ｎ２
５０ＰＳＮ２５０Ｐ２９　（Ｒ，Ｇｅｎ＋ｚ　、学位論
文、ハイデルベルグ大学、西ドイツ［１９８４年コ）お
よびリボゾーム結合部位ＲＢＳＩＩが存在する。このリ
ボゾーム結合部位はＥ、ｃｏｌｉファージＴ５のプロモ
ーターＰＧ２５のりボゾーム結合部位（Ｒ，Ｇｅｎｔｘ
　、上述）に由来し、ＤＮＡ合成によってＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨＩ断片として調製した。これに続いてマウス細
胞株ＡＴ−３０００のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５巻、６１７−６２
４頁［１９７８年］　　；　Ｍａｓｔｅｒｓら、Ｇｅｎ
ｅ２１巻、５９−６３頁［１９８３年］）があり、これ
は翻訳の終止コドンのすぐ前に制限酵素Ｂｇ１■の切断
部位を導入しである。さらに、プラスミドｐＤＳ７８／
ＲＢｓｎはＥ、ｃｏｌｉラムダファージのターミネータ
−ｔ　ｏ　（Ｓｃｈｗａｒｊｘら、Ｎａｔｕｒｅ２７２
巻、４１〇−４１４頁［１９７８年］）、プロモーター
なしのクロラムフェニコールアセチントランスフェラー
ゼ（Ｍａｒｃｏｌｉ　らＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｔｓ、
　　１１０巻、１１−１４頁［１９８０年］）およびＥ
。
ｃｏｌｔ　　ｒｒＢオペロン（Ｂｒｏｓｉｕｓ　ら、Ｊ
、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　　１４８巻、１０７−１２７頁［１９８１
年］）のターミネータ−Ｔ１を含有している。
ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［は調節可能なプロモータ−／オ
ペレーター因子Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ２５とりボゾー
ム結合部位ＲＢＳｎを保有している。
この発現シグナルの効率が高いことから、プラスミドｐ
ＤＳ７８／ＲＢＳＩＩおよびプラスミドｐＤＳ７８／Ｒ
ＢＳＩＩ、６ＸＨｉｓのような誘導体はＥ、ｃｏｌｉ細
胞中で、１ａｃレプレツサーがオペレーターに結合して
プロモーター／オペレーター因子が抑制されている時の
み安定に維持される。ｊ７ａｃレプレッサーはｊ！ａｃ
Ｉ遺伝子によりコードされる。Ｎ２５０ＰＳＮ２５０Ｐ
２５は細胞内に十分量のレプレッサー分子が存在する時
のみ有効に抑制を受ける。従ってレプレッサー遺伝子の
発現が増加するようになったプロモーター変異を有する
Ｊａｃｌｑ配列を使用した。このＪａｃＩｑ配列はプラ
スミドｐＤＭ１．１　（第３図および第４図）に含まれ
ている。このプラスミドは、ｊａｃＩ遺伝子の他にバク
テリアにカナマイシン耐性を賦与する遺伝子ｎｅｏ遺伝
子を有する。
カナマイシン耐性はマーカーとして使用できる。
ｐＤＭＩ、１は上記プラスミドとの適合性を有する。上
述の発現ベクターで形質転換されるＥ、ｃｏＩ量細胞は
発現ベクターを細胞中で安定に維持するためにはｐＤＭ
ｌ、１を保有していなければならない。この系の誘導は
目的の細胞濃度で培地中にＩ　ＰＴＧを添加することに
より達成できる。
プラスミドｐＤＭ１．１　（第３図および第４図）はＥ
、ｃｏｌｉ細胞にカナマイシン耐性を賦与するトランス
ボゾンＴｎ５　（Ｂｉｃｋら、Ｇｅｎｅ１９巻、３２７
−３３６頁［１９８２年］）からのネオマイシンホスフ
ォトランスフェラーゼのｎｅｏ遺伝子およびプロモータ
ー変異Ｉ　　（Ｃａｌｏｓ、　Ｎａ１ｕｒｅ２７４巻、
７６２−７６５頁［１９７８年］）Ｊａｃレプレッサー
をコードするｊ７ａｃＩ遺伝子（Ｆａｒａｂｏｕｇｈ、
　Ｎａ１ｕｒｅ２７４巻、７６５−７６９頁［１９７８
年］）を保有している。さらにプラスミドｐＤＭ１．１
はプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｃｈａｎｇ　ら、Ｊ、
Ｂａｃ！’ｅ＋ｉｏｌ　、　　１３４巻、１１４１−１
１５６頁［１９７８年］）の複製および娘細胞への移動
に必要な全ての情報を含む領域を保有している。
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎ、（３ｘ）（ｉｓ（第
５図および第６図）の構築のためｐＤＳ７８／ＲＢＳｎ
のリボゾーム結合部位ＲＢＳＩＩより成るＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨＩ断片に６個のヒスチジンをコードする断片を
結合した。
このために先ず、第５図に二重鎖ＤＮＡ配列として示す
二本の相補オリゴヌクレオチドをマルチ合成装置（１９
８５年５月２１日発行の欧州特許出願ＮｃＬ１８１．４
９１に記載）により一定孔径のガラス（ＣＩ’Ｇ）を担
体として使用（Ｋｉｅｆｅ＋ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅ
ｊｈ、　３巻、６９−８３頁［１９８５年］　　；　Ｓ
ｐ＋ｏａｔら、Ｔｅｆ＋ａｈｅｄ＋、　Ｌｅｆｔ、、　
　２４巻５７７１−５７７４頁［１９８３年］：Ａｄａ
ｍｓ　ら、Ｊ。
Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　　ｌ　Ｑ　５巻、６
６１−６６３頁［１９８５年］）シて同時に合成する。
凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを水に取り、４℃にて
１時間溶解する。ＤＮＡｆｉ度は１００１００ｎ！ｅ／
ｍ１となる。りん酸化反応にはそれぞれ１５０ｐＭｏｉ
ｅの２つのオリゴヌクレオチドを２０μｉの５０ｍＭ）
リス／塩酸［ｐＨ８，５］および［３２Ｐ］　−ＡＴＰ
　（５０００Ｃｉ／ｍＭｏＩ！Ａｍｅｒｓｈａｍ）およ
び１単位（Ｕ）のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇ
　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ−ＢＲＬ）と３７℃で２０分間インキ
ュベートする。続いて５ｎＭｏ　ｉｅのＡＴＰを添加し
、さらに３７℃で２０分間インキュベート後６５℃に加
熱して反応を停止する。
りん酸化オリゴヌクレオチドとのライゲーションのため
にプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩのＤＮＡ２ｐＭｏ
ｊ！ｅを先ず制限酵素ＢａｍＨＩを用いて製造元の指示
に従って切断した。ＤＮＡをフェノールで抽出し、エー
テルで洗滌後方法１に従って沈でんする。沈でん物を乾
燥して２０μｍのＴＥ緩衝液に取る。りん酸化オリゴヌ
クレオチドとのライゲーションのため、ＢａｍＨＩで切
断したプラスミドＤＮＡ　　１．５ｐＭｏｊ！ｅを２単
位のＴ４−ＤＮＡリガーゼを含有するりガーゼ緩衝液中
で、それぞれ６０μＭｏｊ！ｅのりん酸化オリゴヌクレ
オチドと１５℃で２時間インキュベートする。６５℃で
さらに５分間インキュベートした後、ＤＮＡを制限酵素
ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて製造元の説明に従っ
て切断し、調節可能なプロモーターＮ２５０ＰＳＮ２５
０Ｐ２９、リボゾーム結合部位ＲＢＳＩＩおよび６個の
ヒスチジンをコードする領域を含むＸｈｏ　Ｉ／Ｂａｍ
ＨＩ断片Ｆ（第５図）を単離した。
プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩ［，６ＸＨｉｓの構築
のために上述のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片Ｆとプラスミ
ドｐＤｓ７８／ＲＢＳＩＩに組込み、このプラスミドの
ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を置換した（第６図）。この
目的で先ず、プラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩのＤＮ
Ａ／ｐＭｏｊ！ｅを制限酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ
で切断し、方法３に従って長い方のＤＮＡを単離した。
０．０５μＭｏＪ　ｅの本断片を０．１μＭｏＪｅの単
離したＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩの断片Ｆと２単位Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼ含有のライゲーション緩衝液中で１５℃、
２時間インキュベートした。ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、
６ＸＨｉｓによる形質転換のために、プラスミドｐＤＭ
１．１で形質転換したＥ、ｃｏｊｉｉＭ１５細胞をＭｏ
ｔｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｘ７ｍｏ１
．６８巻、３２６−３３１頁［１９７９年］）に従って
調製した。６５℃で７分間加熱後に２００μｌのコンピ
ーテントな細胞にライゲーション反応液を添加した。氷
上に３０分間保持した後、４２℃で２分間インキュベー
トして０．５ｍｌのＬＢ培地を添加後に３７℃で９０分
間インキュベートした。次に細胞をアンピシリン１００
ｍｇ／ｍｌおよびカナマイシン２５　ｐ　ｇ　／　ｍｌ
含有のＬＢ寒天平板にまき、インキュベーター中で３７
℃−晩インキユベートした。各コロニーを滅菌つまよう
じで吊り上げて１００μｇ　／　ｍｌのアンピシリンお
よび２５μｇ　／　ｍｌのカナマイシン含有のＬＢ培地
１０ｍ１中で１２時間振とう機上でインキュベートした
。その後、細胞を集めてプラスミドＤＮＡをＢｉｒｎｂ
ｏｉｍらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、
　７巻、１５１５−１５２３頁［１９７９年コ）に従っ
て単離した。
それぞれ０．　２μｇの単離したプラスミドを制限酵素
ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、プラスミド内にＸ
ｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片Ｆが存在するかどうか試験した
。この断片を有するプラスミドをｐＤＳ７８／ＲＢＳｎ
、６ＸＨｉｓ（第６図）と命名した。
ｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、６×Ｈｉｓに正しい配列が存
在することを示すために、二重鎖の環状プラスミドＤＮ
Ａの配列をγ−［”２Ｐ］　−ＡＴＩ’の標識開始配列
（「プライマー」）を使用して配列決定した。この開始
配列はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳｎの８９−１０８
番目のヌクレオチドを含んである。０．３μＭｏｊ！ｅ
の単離プラスミドＤＮＡをアルコール沈でんし、沈でん
物を８０％（ｗ／ｖ　）エタノールで一回洗滌後乾燥し
、８μｍの１／４７Ｅ緩衝液に溶解した。サンプルを９
５℃に５分間インキュベートし、０℃に冷却後遠心分離
（１２，０００ｒｐｍ、２分間）する。
２μｍ容量の１．５μＭｏｊ！ｅの開始配列を添加し、
先ず９５℃に２分間、続いて４２℃に５分間インキュベ
ートする。次にＤＮＡをＳａｎｇｅｒらの方法（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　
７４巻、５４６３−６５６７頁［１９７７年］）に従っ
て配列決定した。放射標識のプライマーを使用したので
、反応は全て非標識ののデオキシヌクレオチド三りん酸
を用いて行なう。ＤＮＡ配列分析の結果、ｐＤＳ７８／
ＲＢＳＵ、６ｘＨｉｓは第５図に示す配列を有すること
がわかった。
Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａ＋ｕｍ細胞（Ｋｌ単離株）を１０
枚の培養皿を用いて常法（Ｔｒａｇｅｒら、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　１９３巻、６７３−６７５頁［１９７６年］）に
より培養し、０．１％のサポニン含有の培養培地で洗滌
した。
洗滌後２ｍｌのｔＯｍＭ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０゜０
．５％（Ｗ／Ｗ）ＳＤＳの再けん濁した。５０ｌＴｌｇ
のプロテナーゼＫ　（Ｍｅ＋ｃｋ　）を添加してから６
５℃に１０分間インキュベートし、続いて２ｍｌのフェ
ノール（トリス／塩酸［ｐＨ８，０］で飽和）で処理す
る。振とうして相を混合して遠心分離（２０℃、６．０
００＋ｐｍで１０分間）により分離する。フェノール抽
出は二回くり返えす（分離層はもう見えなくなる）。Ｄ
ＮＡを方法１に従って沈でんし、エタノールで洗滌後乾
燥する。
ＤＮＡは２ｍｌの水に溶かして、例えば０．５Ｘ１６ｍ
ｍの針を持つ注射器で８０回出し入れする等の物理的方
法で切断した。その後、０．２容量の５ｘＥｃｏＲＩメ
、チラーゼ緩衝液（５０ｍＭ）リス／塩酸［ｐ）１７．
５］　、０．２５Ｍ　　ＮａＣｊ！、５０ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、２５ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、０．４
ｍＭ５−アデノシルメチオニン）を添加する。１０Ｍｇ
のＤＮＡをＢ０単位のＥｃｏＲＩメチラーゼ（Ｎｅｗ　
Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　。
米国、マサチュセツツ州、バーバリー）を用いて３７℃
３０分間メチル化した。ＤＮＡを上述と同様にフェノー
ルで一回抽出し、方法１に従って沈でんした。ＤＮＡを
２００μｍのＴ４−ポリメラーゼ緩衝液に溶解し、５μ
ｌの５　ｍ　Ｍ　　ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ並びに１０単位のＴ
４ポリメラーゼ（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ−ＢＲＬ）を添加
後３７℃に３０分間インキュベートした。
ＤＮＡを再びフェノールで抽出して方法１のように沈で
んした。ＤＮＡを５０μｌの７４−ＤＮＡリガーゼ緩衝
液に溶解し、０Ｄ２６ｏ＝０．０１単位のりん酸化した
ＥｃｏＲＩオリゴヌクレオチドアダプター（Ｎｅｒ　Ｅ
ｕｇｌａｕｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）および２μｍの７４
−ＤＮＡリガーゼ（１２ワイス単位、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂ１１ｏａｂｓ　）を添加して１４℃で一晩ラ
イゲーションを行なった。ＤＮＡを方法１に従って沈で
んし、２０μｌの１ＸＤＮＡゲルローデイング緩衝液を
溶解して０．８％アガロースゲルで分離した（方法２）
。２−６Ｋｂ　（ＩＫｂ＝１゜０００ヌクレオチド）の
長さのＤＮＡ断片を〃抹３に従って単離した。得られた
ＤＮＡを５０μｌの水に溶解し、６μｌの１０×リガー
ゼ緩衝液、２μｌの脱りん酸ラムダアーム（Ｐｒｏｍｅ
ｇａＢｉｏｊｅｃｈ　、米国、ウィスコンシン州、メジ
ソン）および６ワイス単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼを添
加して１４℃にて一晩ライゲーションを行なう。
２０μｌの「パツケジングエキストラクト」（Ｇｅｎｏ
ｆｉｔ　Ｓ、Ａ、、　　スイス、ジュネーブ）を添加後
、ＤＮＡを２０℃にて２時間、製造元の指示に従ってフ
ァージ粒子にパツケジングする。５００μｌの３Ｍ緩衝
液と５０μオのクロロホルムを添加して遺伝子バンクを
抗体テストに使用できる。
遺伝子バンクの抗体テスト Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの分裂小体段階の表層たん
白に対する抗体をＰｅｒｒｉｎら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
Ｉｎｖｅｓｔ、　７５巻、１７１８−１７２１頁［１９
８４年］により記載されるようにしてウサギに生成させ
た。４１，０００の分子量を有するＰ、Ｉａｌｃｉｐａ
ｒｕｍ　　Ｋ　１２分裂率体表層抗原に特異的な抗血清
を選択して遺伝子バンクの抗体テストに用いた。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｙ１０９０を４０Ｍｇ／ｍｌのアンピ
シリン含有のＬＢ培地３ｍｌ中で３７℃にて一晩振とう
する。翌朝、細胞を集菌しく２０℃、７、ＯＯＯＸｇに
て１０分間）、１ｍｌの３Ｍ緩衝液にけん濁する。遺伝
子バンクの１０６個の感染ファージ粒子をこの細胞液に
加え、室温にて３０分間インキュベーションを行なう。
４２℃に加温した６０ｍ１の０．８％寒天加ＬＢ培地を
添加してよく混合する。感染細胞を含有する軟寒天を４
０Ｍｇ　／　ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ寒天平板（直
径１３５ｍｍ）６枚に分注して４２℃で５時間インキュ
ベートする。１００ｍＭのＩ　ＰＴＧ溶液に浸して乾燥
したニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃ）＋
ｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）を各平板にのせ、３７
℃で一晩インキュベーションを行なう。翌日、フィルタ
ーと平板の位置関係を記してからフィルターをＩＸＴＢ
Ｓ中で保存する。１００ｍＭのＩ　ＰＴＧ溶液で処理し
た新しいニトロセルロースフィルターを平板上にのせ、
印をつけて３７℃にて４時間平板上にでインキュベート
する。二組のフィルターをＩＸＴＢＳ中で振とうし、１
×ＴＢＳ、２０％ＦＣ８（ウシ胎児血清）中で２０分間
インキュベートする。ウサギ抗血清を１×Ｔ　Ｂ　Ｓ／
２０％ＦＣ３で１　：　１０００に希釈し、二組のフィ
ルターを振とう槽中、室温にて１時間インキュベートす
る。次にフィルターを１×ＴＢＳ、０．１％　Ｔｒｉｊ
ｏｎＸ　−１００（Ｂ　ｉ　ｏ　−Ｒａｄ）で振とうし
ながら３分間ずつ３回洗い、続いて１ｘＴＢＳ、ｏ、１
％　プロテアーゼ除去ウシ血清アルブミン（Ｓ　ＩＧＭ
Ａ）中で５μＣｉの［１２５１］−プロティンＡ（＾ｍ
ｅｒ山ｍ、カタログ番号ＬＭ、１４４）と−時間インキ
ュベートする。フィルターを再び上述のとおり洗滌し、
室温で乾燥する。フィルターとＫｏｄａｋ　ＸＡＲに対
して感光する。印の、助けを借りて両方の平板にあるプ
ラークを確認し、平板よりつり上げる。各試料を方法４
に従って種々の希釈で軟寒天により平板にまき、上述と
同様に固定する。陽性プラーク（Ｋ　１−Ａ）を選択し
、ラムダファージを方法５に従って増殖してＤＮＡを単
離する。
１０μｇのＫｌ−Ａ　　ＤＮＡを４９０μｌのＴ４ポリ
メタラーゼ緩衝液に溶解し、５０単位のＨｉｎｄｍで３
７℃、１時間消化する。ＤＮＡを沈でんしく方法１）、
０．８％アガロースゲル（方法２）で分析する。１０μ
ｇのｇｔｌｌＤＮＡをＨｉｎｄｎＩで消化し、対照とし
て分析する。Ｋｌ−Ａ　　ＤＮＡを有するバンドにＨｉ
ｎｄ■断片（２７０塩基対）が存在した。その断片を単
離（方法３）し、５０μｌの水に溶解して４℃に保存す
る。配列決定には、５０ｎｇのＨｉｎｄｍで切断した脱
りん酸化Ｍ１３　　ｍｐ１８ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ：方法６）を溶解したＫｌ−ＡからのＨｉｎｄｎ［断
片１０μｊ！と混合し、２μ（の１０×リガーゼ緩衝液
、６μｍの水および４ワイス単位のＴ４−ＤＮＡリガー
ゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）を添加
してＤＮＡを室温にて一時間ライゲーションする。コン
ピーテントな Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＴＧ−１細胞をライゲーションしたＤ
ＮＡで形質転換する（方法７）。白色プラークを単離し
、増殖させ、配列決定に十分量のＤＮＡを単離する（方
法８）。ＤＮＡの配列は方法９に従って決定した。使用
したＨｉｎｄｌＩ［断片を有するＭ２Ｓ　　ｍｐ１８ク
ローンはＫ１−１０−Ｍと命令した。
Ｋｌ−Ａ−Ｍ　　ＤＮＡのＨｉｎｄＩ［［断片を使用し
て、次に分裂小体の抗原をコードするより長いＤＮＡを
単離する。このために、Ｍ２ＳのＫｌ−Ａ−Ｍクローン
の二重鎖ＤＮＡを単離した（方法１０）、２０単位のＨ
ｉｎｄｌ［Ｉを添加してＤＮＡ５μｇを３７℃′にて１
時間消化する。溶液から沈でん化を行なう（方法１）。
ＤＮＡを１．２％のアガロースゲル（方法２）で分離す
る。２７０ｂｐのＨｉｎｄｌｌＩ断片を単離しく方法３
）、精製したＤＮＡを２０μｌの水に溶解する。ＤＮＡ
を「ニックトランスレーション」により標識する（方法
１１）　。Ｐ、　Ｉａｌｃｉｐａｔｕｍのラムダを用い
た遺伝子バンクを再び上述のように平板にまく　（２×
１０５個のファージ粒子を直径１３５ｍｍのシャーレ−
２枚に）。５時間後、プラークが見えたら、シャーレ−
を３７℃のインキュベーターから出し、冷蔵庫中で一晩
保存する。ＰＡＬＬ製ナイロンフィルター（Ｐ　Ａ　Ｌ
　Ｌ、スイス、バーゲル）を冷却した平板に置き、シャ
ーレ−とフィルターの位置関係をインクで記す。５分後
にフィルターを注意して平板からはがし、プラークのつ
いた面を上にして予めアルカリ溶液（０，５Ｍ水酸化ナ
トリウムおよび０．５Ｍ）リス）に浸したＷｈａｊｍａ
ｎ　３　ＭＭ濾紙に置く。数分後にフィルターをアルカ
リ溶液に浸した新しい３ＭＭ濾紙にのせる。その後、フ
ィルターを３ＭＭ濾紙上でざっと乾燥し、次に予め１．
５Ｍ　　ＮａＣＪ、０．５Ｍ）リス／塩酸［ｐＨ８，０
］に浸したＷｈａｔｍａｎ　３ＭＭ濾紙上に５分間ずつ
２回置く。フィルターを風乾してから８０℃にて９０−
分間、真空中で焼く。２７０ｂｐのＨｉｎｄＩ［断片（
ＩＸ１０７ｃｐｍ）をプローブとしたハイブリダイゼー
ションは方法１２に従って行なった。
陽性プラークを上述のよう比選択し、ハイブリダイゼー
ションの特異性を放射活性プローブを用いて方法４およ
び方法１２に従って試験した。プラークＫｌ−Ｂを方法
５に従って増殖させ、ＤＮＡを上述のようにＨｉｎｄｎ
［を用いて消化してアガロースゲル（方法２）により分
離する。べフタ−ＤＮＡには存在しないＨｉｎｄｌＩＩ
断片を単離し、Ｍ１３　　ｍｐ１８にクローニングし、
配列析 １μｇのＫｌ−ＢラムダＤＮＡを５０μｌのＴ４ポリメ
ラーゼ緩衝液中で５単位のＥｃｏＲＩで１時間消化する
。ＤＮＡを分析しく方法２）、１．３Ｋｂの断片を単離
した（方法３）。単離した断片ＤＮＡを２０μｍの水に
溶解する。１μｇのｐ　Ｕ　Ｃ１８Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　）を５単位のＥｃｏＲＩで消化し、方
法６に従ってさらに処理する。ゲルから分離（方法３）
した後、線状化したベクターを５０μオの水に溶解する
。１μｍのベクターを５μオの１．３ｋｂ断片、１μｌ
の１０×リガーゼ緩衝液および６ワイス単位のＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと室温で１時間インキュベートする。Ｅ、
ｃｏｌｉの細胞を方法７に従ってＤＮＡで形質転換し、
形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離する（方法１０
）。得られたプラスミドをｐＫｌ−Ｂと命令した。それ
ぞれ０．５μｇのｐＫｌ−ＢＤＮＡを制限酵素５ｐｈＩ
、ＸｍｎＩ。
ＨｐａＩで、またさらにＨｉ　ｎｄｌｌＩと二重消化に
より消化し、方法２に従ってアガロースゲルで分析した
。ｐＫｌ−Ｂ中のＰ、１ａｌｃｉｐａ＋ｕｍ全ＤＮＡの
全配列をこの制限酵素分析の助けで決定できる。
Ｅ、ｃｏｊｉｉでのＨｐａＩ／５ｐｈＩ断片の発現Ｐ、
Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍに特異なＨｐａＩ／５ｐｈＩ断片
をクローンｐＫ１−Ｂより方法１から３に従い単離する
。６μｇのｐＫｌ−Ｂ　　ＤＮＡを１００μｌの１×Ｔ
４ポリメラーゼ緩衝液中で１５単位のＨｐａＩおよび１
５単位の５ｐＨＩを用いて３７℃、１５分間消化した。
ＤＮＡを沈でんしく方法↓）、０．８％アガロースゲル
で分離（方法２）して７００ｂｐ断片を単離した（方法
３）。本断片を２０μｌの水にけん濁し、１０μＭｏ１
ｅのりん酸化ＢａｍＨＩオリゴ、ヌクレオチドアダプタ
ー（１２マー、ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧ　：ＮｅｗＥ
ｎｇｌ＋＋ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　、２．　５μ４
！の１０×リガーゼ緩衝液および６ワイス単位の’ｌ’
４　　ＤＮＡリガーゼを添加して１４℃にて一晩ライゲ
ーションを行なう。ＤＮＡを沈でんしく方法１）、５０
μｌの１×Ｔ４ポリメラーゼ緩衝液に溶解した後、４０
単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃にて１時間消化した。
ＤＮＡを沈でんしく方法１）、１．０パーセントのアガ
ロースゲル（方法２）で分離する。
７００ｂｐ断片を単離しく方法３）で１０μｌの水に溶
解した。ベクターの調製（方法６参照）のため、１μｇ
のｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、６ＸＨｉｓベクターＤＮＡ
を１０単位のＢａｍＨＩで３７℃にて１時間、Ｔ４ポリ
メラーゼ緩衝液中で消化した。ベクターＤＮＡを脱りん
酸（方法４）し、フェノールで一回抽出しく上記参照）
てから０．８％アガロースゲル（方法２）上で精製し、
方法３に従って単離した。単離したＤＮＡは５０μｍの
水に溶解した。
ＢａｍＨＩで消化して脱りん酸化した（方法６）線状ｐ
ＤＳ７８／ＲＢＳＩＩ、５ＸＨｉｓベクターＤＮＡの５
μｌを５μｍのクロロｂｐ断片、１．２μｌの１０×リ
ガーゼ緩衝液および６ワイス単位の７４−ＤＮＡリガー
ゼと室温にて１時間インキュベートした。次に１０μｍ
のＤＮＡを用いてコンピーテントなＭ１５　（ｐＤＭｌ
、１）細胞を形質転換しく方法７）、１００μｇ　／　
ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ　／　ｍｌのカナマ
イシン含有のＬＢ平板にまいた。各コロニーをつまよう
じで吊り、１００μｇ　／　ｍｌのアンピシリンおよび
２５μｇ　／　ｍｌのカナマイシン含有のＬＢ培地３ｍ
ｌに移植した。３７℃にて振とう機−上でインキュベー
トして６００ｎｍに於ける吸光度（ＯＤ６ｏｏ）が培地
に対して０．６となるまで続ける。培養物５００μｌを
非誘導培養対照として採取しておく。
ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を残りの培養物に添加し、
誘導培養をさらに３時間続ける。その後、５００μｌの
誘導培養物を採取して先きの非誘導サンプルと共に遠心
分離する（２０℃、１２．０００　ｒｐｍで３分間）。
上澄液を吸出し、細胞性でん物を１００μ（のＳＤＳ試
料緩衝液にけん濁する。試料を７分間煮沸してからたん
白質を電気泳動（５０ｍＡの一定電流で３時間）により
１２％ＳＤＳゲル（方法１３）で分離する。ゲルは３０
％（ｖ／ｖ）酢酸および１０％（ｖ／ｖ）メタノールに
溶解した０、１％クマシーブルーと振とうして３０分間
染色した。非誘導試料と比較して予想分子量２７ＫＤ　
（＝２７，０００ダルトン）を有する余分のバンドを示
すクローンは方法１４に従って分析した。新規たん白質
はたん白（２７ＫＤ）と命名した。発現したたん白のア
ミノ酸配列はアミノ酸配列（ｎ）に対応した。
病原体１１分離株の抗原に対する抗体による分析Ｐ、ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕ＋Ｉｌの次の分離１１株を試験した：
ＲＯ−３３、ガーナ、ＲＯ−５６、エチオピア；Ｇｅｖ
ｅｖａ　　Ｎａ１３、セネガルｌ−８３、ホンジュラス
、ＲＯ−５３、カメルーン、Ｒ−ＦＣＲ３、ガンビア、
ＭＡＤ−２０、パプアニューギニア；５４２３）ブラジ
ル、ＲＯ−５８、東アフリカ；ＦＣＨ−５−Ｃ２３）タ
ンザニア；に１、タイ。病原体はマラリア患者から分離
し、標準法により培養した。しかし、Ｐ、Ｉａｌｃｉｐ
ａｒｕｍの他の分離株からのマラリア病原体も使用でき
る。２枚の培養皿からの病原体を遠心分離しく４℃、　
、１．　５００ｒｐｍにて１０分間）、２００μｌの５
ＤＳ−ゲルローディング緩衝液に溶解する。７分間煮沸
した後、試料をＳＤＳゲルで分離する（方法１３）。試
料をニトロセルロースに移して抗原に対する抗体を用い
て試験する（方法ｉ４）。その結果（第７図）、全ての
分離株に抗原が存在し、それらの分子量は同じぐらいで
あった。
Ｋ１からの遺伝子プローブを用いた病原分離株の分析 Ｋｌ−ＢからのＥｃｏＲＩ断片を方法２および方法３に
従って単離し、「ニックトランスレーション」　（方法
１１）により標識した。標識プローブをハイブリダイゼ
ーションのプローブ（１０６ｃｐｍ）として使用した。
異なるＰ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ分離株より１０μｇ
のＤＮＡを単離しく上記参照）、Ｔ４ポリメラーゼ緩衝
液中で５０単位のＤｒａ　Ｉで消化し、１．２％のアガ
ロースゲル（方法２）で分離した。ＤＮＡをナイロンフ
ィルターに移しく方法１５）、続いてハイブリダイゼー
ションを行なった（方法１２）。その結果（第８図）、
試験した全ての分離株で−様なバンドパターンが見られ
、異なる分離株からのＤＮＡ配列と共に、本発明による
ポリペプチドに対応する抗原が維持されていることが証
明された。
１μｇのｐＫｌ−ＢＤＮＡ（濃度０．５μｇ／μ（）を
１００μ（の１×Ｔ４ポリメラーゼ緩衝液と混合する。
５単位のＥｃｏＲＩを添加後、混合液を３７℃で１時間
インキュベートする。試料をイソプロパツールで沈でん
しく方法１）、０．８％のアガロースゲル（方法２）で
分離する。
方法３に従って１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を単離する
。０．５ｐｇのＭｌ　３ｍｐ　１８ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）をＥｃｏＲＩおよびフォスファターゼとイ
ンキュベートする（方法６）。５μｌのベクターＤＮＡ
をｐＫ１７ＢからのＥｃｏＲＩ断片５μｌ、１０×リガ
一ゼ緩衝液２μｍ、水７μｍおよびＴ４−ＤＮＡリガー
ゼ（６ワイス単位、Ｐｂａｒｍａｃｉａ　）　１　μｌ
ｌと混合し、１４℃にて一晩ライゲーションを行なう。
得られたＤＮＡを使用して方法７に従って、Ｅ、ｃｏＪ
ｉＴＧ−１を形質転換した。白色プラークを採取しく方
法８）、ＴＧ−１の飽和培養２００μｍを植菌したＬＢ
培地２０ｍ１に移植する。培養を振とう下で３７℃５時
間行ない、続いて細胞を４℃、１２．００Ｏｒｐｍ　５
分間遠心分離して集める。細胞を水で一回洗滌して再び
遠心分離する。Ｍ１３ＤＮＡ（ＭＫｌ−Ｂ）を方法１０
に従って単離する。５０μｍのＤＮＡをそれぞれ５単位
のＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて３７℃、１時間消
化し、方法１に従って沈でんする。ＤＮＡ沈でん物を１
００μオのエキソヌクレアーゼ■緩衝液（６６ｍＭ）リ
ス／塩酸［ｐＨ８，０１６，６ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２　
）　ｌ、−溶解する。１０μｍのエキソヌクレアーゼ■
（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、　５０００単位／７７μｌ）を
添加後、室温で３０秒間インキュベートする≦１０μｌ
の０．５ＭＥＤＴＡを添加した後、６５°０１０分間加
熱して失活させ、方法１に従って沈でんさせる。
沈でん物を５０μｍの８１緩衝液（２ｍＭ酢酸力１ハ　
１ｍＭ硫酸鉛、５％（ｗ／ｖ　）グリセロール）に溶解
し、１０単位の８１ヌクレアーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ
　）を添加して室温にて３０分間インキュベートする。
試料をフェノールで２回抽出しく方法６）、ＤＮＡを沈
でんする（方法１）。ＤＮＡを１２μｍのＨＩＮ緩衝液
に溶解する。１μｌのフレナラポリメラーゼ（５単位、
Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ　）を添加後室温に２分間インキ
ュベートし、１μｌの２ｍＭ　　ｄＡＴＰＳｄＣＴＩ’
、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを添加して再び３７℃で２分間イ
ンキュベートする。３０μｌの水、５μｌの１０×リガ
ーゼ緩衝液および１μｌの７４−ＤＮＡリガーゼ（６ワ
イス単位、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を添加して１４℃に
て一晩ライゲーションを行なう。これをＥ、ｃｏｊｉｉ
ＴＧ−１に形質転換する（方法７）。４個の白色プラー
クを採取し、ＤＮＡを調製して（方法８）配列分析を行
なう（方法９）。発現に使用したＤＮＡ　（下記参照）
をＭ２／１３と命名した。５０μｌのＭ２／１３ＤＮＡ
を２０単位のＥｃｏＲＩで完全消化する。ＤＮＡを沈で
んし、５０μｌのＴ４ポリメラーゼ緩衝液に溶解する。
ＤＮＡを１単位のＨｉｎｄｌ［を用いて３７℃にて２分
間部分消化し、沈でんして（方法１）０．８％アガロー
スゲル（方法２）で分離する。１．３ＫｂのＥｃｏＲＩ
−Ｈｉｎｄｎｌ　　ＤＮＡ断片を単離する（方法３）。
５０μｍのＤＮＡ溶液、６０μ（の１ＱｘＨＩＮ緩衝液
、１μｌのフレナラポリメラーゼ（５単位、Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）および２ｔｔｌｌの５ｍＭ　　ｄＡＴＰＳ
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
ｄＴＴＴを混合し、３７℃で３０分間インキュベートす
る。ＤＮＡを沈でんしく方法１）、１０μｌの水に溶解
して１０μＭｏｊ！ｅのりん酸化ＢａｍＨＩオリゴヌク
レオチドアダプター（８マー：　ＣＧＧＡＴＣＣＧ　：
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、２．５μ
ｌの１０×リガーゼ緩衝液および６ワイス単位のＴ４−
ＤＮＡリガーゼを添加してから１４℃にて一晩ライゲー
ションを行なう。ＤＮＡを沈でんしく方法１）、１．０
％のアガロースゲルで分離する（方法２）。１．３ｋｂ
のＤＮＡ断片を単離して１ＭｇのｐＤｓ７８／ＲＢＳＩ
［，６ｘＨｉｓベクターと上述のようにライゲートする
。
得られた新しいプラスミドをｐ８／３と命名した。
このプラスミドのヌクレオチド配列を第１１図に示す。
プラスミドｐ８／３を含有するクローンを゛さらに上述
のようにＳＤＳたん白ゲル（方法１３）およびイムノプ
ロット（方法１４）により分析した。プラスミドｐ８／
３により発現したポリペプチドはおよそ４１，０００ダ
ルトンの分子量を有するたん白質である。（４１ＫＤ）
と命名した本たん白質は以下のようにして精製した。
２３）Ｅ、ｃｏＪｉからのたん白質（４１ＫＤ）の精製 ｐ８／３を含有する組換えＥ、ｃｏｊｉｉ細胞６０ｇを
二つに分け、それぞれ３０ｇを７０ｇのガラス粉砕ビー
ズ（直径０．１ｍｍ）と各１０ｍ１の緩衝液Ａ（５０ｍ
Ｍ）リス／塩酸［ｐ）１７．　０］　、５０ｍＭ　　Ｋ
ＣＩ）中で細胞ホモジナイザー（モデルＭＳＫ、　Ｂｒ
ａｕｎ　、西ドイツ、メルスンゲン）を用いて１分間ず
つ３回破砕する。細胞物質を１５０ｍ１の緩衝液Ａで希
釈し、遠心分離する（４℃、１０．０００ｘｇで３０分
間）。目的たん白質（４１ＫＤ）は上澄液（＝粗抽出物
）中に溶解して存在する。
２０ｇのＣｅ１ｌｅｘ　Ｐ　（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）
を緩衝液Ａに浸漬し、カラム（直径＝５ａｎ、長さ＝７
ｃｍ）に充填する。カラムを緩衝液Ａで平衡化した後、
ポンプを用いて（流速＝１７０ｍｌ／ｈｒ）抽出物をカ
ラムにのせる。吸着したたん白質（＝ＣｅｌｌｅｘＰＣ
ｅ１ｌｅｘＰ酸濃度を増加することにより（ＬＭりん酸
カリウム［ｐＨ７，０１でグラジェント）溶出した。
次に、Ｃｅ１ｌｅｘ　Ｐ溶出液をＨｏｃｈｕｌｉ　ら、
Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　　４１１巻、１７７−１
８４頁［１９８７年］の方法に従って調製したニッケル
ーニトリルトリ酢酸レジンに吸着させる。このために、
ＮＴＡ樹脂カラム（直径＝１．　６ｃｍ、長さ＝９ｃｍ
、流速＝１７０ｍｌ／ｈｒ、）を０．１Ｍトリス／塩酸
［ｐＨ７，５］　＋０．５Ｍ　　ＮａＣＩＴ：平衡化し
、吸着したたん白質は０から０．５Ｍイミダゾールのグ
ラジェントにより溶出した（＝ＮＴＡ溶出液）。
ＮＴＡ溶出液をＹＭＩＯメンブレン（Ａｍｉｃｏｎ、ｉ
Ｖ。
Ｒ，Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、、　　米国マサチュセツツ
州、ダンバース）を用いた限外濾過により濃縮し、Ｉ’
ＢＳ−緩衝液（８０ｇ　　ＮａＣｌ！、２ｇ　　ＫＣＩ
。
２　ｇ　　Ｋ　ＨＰ　Ｏ１２９ｇ　　Ｎ　ａ、　　ＨＰ
　Ｏ４・１２Ｈ２０を１０１の発熱物質除去水に溶解）
を用いた５ｅｐｈａｃ＋ｙｌ　Ｓ　−２００カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　。
直径＝２．６ｃｍ、長さ＝８３ｃｍ、流速＝１４．６ｍ
ｌ／ｈｒ、）のクロマトグラフィーにかける。精製たん
白質の収量は１９　ｍｇ　（Ｌｏｗｅｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ。
１９３巻、２６５−２７５頁［１９５１年コの方法によ
りＢＳＡを標準物質として測定）であった。
３、たん白質の免疫学的および生化学的分析上記のとお
りに精製したたん白質（４１，ＫＤ）をポリアクリルア
ミドゲル電気泳動およびウェスタンプロット（Ｔｏｗｂ
ｉｎら、前述）により分析した（第１０図）。第１．Ｏ
Ａ図の３列目から（４１ＫＤ）がＥ、ｃｏｆ！ｉ由来の
たん白質と比較して増加しているのがわかる。最終物質
（５列目）ではＥ、ｃｏｌｉたん白質がもう検出されな
い（第１０Ｂ図）。第１０Ｃ図は精製たん白質（４１Ｋ
Ｄ）が部分的に均質二量体として存在することを示す。
この均質二量体は自然に形成する。これはメルカプトエ
タノール処理により部分的にのみ単量体に分離できる。
プラスミドｐ８／３から発現するたん白質（４ＩＫＤ）
のアミノ酸配列はアミノ酸配列（ｍ　”’　）に対応す
る。
たん白質（４１ＫＤ）のアミノ酸配列を既知たん白質の
アミノ酸配列と比較すると、たん白質（４１ＫＤ）がア
ルドラーゼと強い相同性を有することがわかった。そこ
で精製たん白質がアルドラーゼ活性を有するかどうかの
試験を行なった。
そのためにアルドラーゼの発色試験を製造元（Ｓ　ＩＧ
ＭＡ）の指示に従って使用した。精製たん白質（４１Ｋ
Ｄ）は３７℃に於いて１分間当たり１ｍｇのたん白質に
つき１３ｇＭのフラクトース−１，６−ニりん酸の比活
性を示した。精製たん白質（４１ＫＤ）のエンドトキシ
ン含量をＬＡＬ試験（ＰＨｏｑｕａｎｌ　Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｋ　ＧｍｂＨ、西ドイツ）を製造元の指示に従っ
て用いて測定した。エンドトキシン含量はたん内当たり
３．　１．ＥＵ／ｍｇ以下と測定された（ＥＵ＝エンド
トキシン単位）。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩを図示した
ものである。 第２図はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＩＩのヌクレオ
チド配列を示す。 第３図はプラスミドｐＤＭ１．１、を図示したものであ
る。 第４図はプラスミドｐＤＭ１．１のヌクレオチド配列を
示す。 第５図はＸｈｏｌ／ＢａｍＨＩ断片の調製を図示したも
のである。 第６図はプラスミドｐＤＳ７８／ＲＢＳＨ１６ＸＨｉｓ
の構築を図示したものである。 第７図はＰ、　！ａｌｃｉｐａ＋ｕｍの１２種の株から
の遺伝子１）　Ｎ　Ａのサザントランスファー分析を示
す。 第８図はＰ、　Ｉａｌｃｉｐｍｒｕｍ蛋白質のウェスタ
ントランスファー分析を示す。 第９図はＥ、ｃｏｊ７ｉの溶菌物を寄生虫抗原に対する
抗体でウェスタンプロット試験した結果を示す。 第１０図は組換え蛋白質の精製に於ける各種精製段階の
分析用ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタ
ンプロット分析の結果を示す。 第１１図はプラスミドｐ８／３のヌクレオチド配列を示
す。 第１２図は４１．０００ダルトンの分裂小体抗原をコー
ドするＰ、　Ｉａｌｃｉｐａｒｕｍ　　Ｋ、分離株の遺
伝子のヌクレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸
配列を示す。

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 但し、 −Ｗ−はＧｌｎまたは非存在； −Ｘ−はＭｅｔまたはＧｌｎ； −Ｙ−はＧｌｙまたはＣｙｓ； −Ｚ−はＧｌｙまたはＣｙｓである を有するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
    分裂小体抗原に少なくとも一つの特異エピトープで符号
    するポリペプチド。
  2. （２）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有するＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ
    分裂小体抗原と少なくとも一つの特異エピトープで符号
    する特許請求の範囲第（１）項記載のポリペプチド。
  3. （３）アフイニテイ−ペプチドと共有結合した特許請求
    の範囲第１）項または第２）項記載のポリペプチド。
  4. （４）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  5. （５）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  6. （６）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  7. （７）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  8. （８）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  9. （９）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  10. （１０）アミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 を有する特許請求の範囲第（１）項〜（３）項のいずれ
    かに記載のポリペプチド。
  11. （１１）担体物質に吸着するか共有的に結合した特許請
    求の範囲第（１）項〜（１０）項のいずれかに記載のポ
    リペプチド。
  12. （１２）特許請求の範囲第（１）項〜（１０）項のいず
    れかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
  13. （１３）第１２図またはその断片の第１位から第１０８
    ６位までのヌクレオチド配列を含有する特許請求の範囲
    第１２）項記載のＤＮＡ配列。
  14. （１４）第１２図またはその断片の第３３７位から第１
    ０８６位までのヌクレオチド配列を含有する特許請求の
    範囲第（１２）項記載のＤＮＡ配列。
  15. （１５）特許請求の範囲第（１２）項〜（１４）項のい
    ずれかに記載のＤＮＡ配列を含有する複製可能な微生物
    ベクター。
  16. （１６）ＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドが
    発現できるようにＤＮＡ配列を発現調節配列と結合した
    特許請求の範囲第（１５）項記載の複製可能な微生物ベ
    クター。
  17. （１７）特許請求の範囲第（１５）項または（１６）項
    記載の複製可能なベクターを含有する微生物。
  18. （１８）特許請求の範囲第（１）項〜（１１）項のいず
    れかに記載のポリペプチドに対して生成した抗体。
  19. （１９）特許請求の範囲第（１）項〜（１１）項のいず
    れかに記載の、マラリアに対して哺乳動物を免疫処理す
    るためのポリペプチド。
  20. （２０）特許請求の範囲第（１６）項記載の複製可能な
    微生物ベクターで形質転換した微生物を、そのベクター
    によりコードされるポリペプチドが発現できる条件下で
    培養することから成る、特許請求の範囲第（１）項〜（
    １０）項のいずれかに記載のポリペプチドの生産方法。
  21. （２１）特許請求の範囲第（１５）項または（１６）項
    記載の複製可能な微生物ベクターで微生物を形質転換す
    ることより成る、特許請求の範囲第（１７）項記載の微
    生物の生産方法。
  22. （２２）特許請求の範囲第（１）項〜（１１）項のいず
    れかに記載のポリペプチドをそのポリペプチドに対して
    免疫反応を産生できる適当な宿主生物に注射し、形成す
    る抗体を公知の方法により単離することより成る、特許
    請求の範囲第（１８）項記載の抗体の生産方法。
  23. （２３）特許請求の範囲第（１）項〜（１１）項のいず
    れかに記載のポリペプチドおよび適当なアジユバントを
    含有する免疫原性成分。
  24. （２４）ワクチンとしての特許請求の範囲第（２３）項
    記載の免疫原性成分。
  25. （２５）特許請求の範囲第（１）項〜（１１）項のいず
    れかに記載のポリペプチド、或いは特許請求の範囲第（
    ２３）項または（２４）項記載の免疫原性成分のマラリ
    アに対する哺乳動物の免疫処理への使用。
  26. （２６）特許請求の範囲第（２０）項記載の方法により
    調製した特許請求の範囲第（１）項〜（１０）項のいず
    れかに記載のポリペプチド。
  27. （２７）特許請求の範囲第（２１）項記載の方法により
    調製した特許請求の範囲第（１７）項記載の微生物。
  28. （２８）特許請求の範囲第（２２）項記載の方法により
    調製した特許請求の範囲第（１８）項記載の抗体。
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AU2187788A (en) 1989-06-15
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DK492588D0 (da) 1988-09-05
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ZA886521B (en) 1989-04-26

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