EP0283327B1 - Peptides ayant des propriétés immunologiques de HIV-2 - Google Patents

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EP0283327B1
EP0283327B1 EP88400084A EP88400084A EP0283327B1 EP 0283327 B1 EP0283327 B1 EP 0283327B1 EP 88400084 A EP88400084 A EP 88400084A EP 88400084 A EP88400084 A EP 88400084A EP 0283327 B1 EP0283327 B1 EP 0283327B1
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EP
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peptide
hiv
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amino acid
peptides
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EP88400084A
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EP0283327A2 (fr
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Marc Alizon
Luc Montagnier
Denise Guetard
François Clavel
Pierre Sonigo
Mireille Guyader
Pierre Tiollais
Lisa Chakrabarti
Ronald Desrosiers
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to peptides having immunological properties, possibly immunogenic, in common with antigens capable of being obtained in a purified form, from viruses capable of causing lymphadenopathies capable of being then relayed by the Acquired immunodeficiency (AIDS) symptom in humans.
  • AIDS Acquired immunodeficiency
  • the invention relates in particular to antigenic peptides capable of being recognized by antibodies induced in humans by viruses designated by the abbreviation HIV, according to the nomenclature defined in NATURE. It also relates to peptides having immunogenic properties or capable of being made immunogenic in vivo , this immunogenicity being capable of being manifested by the induction in vivo of antibodies recognizing antigens characteristic of the HIV-2 viruses and even, at least in as regards some of these peptides, antigens derived from HIV-1.
  • the invention further relates to applications of these peptides to the manufacture of compositions for the in vitro diagnosis in humans of the potential of certain forms of AIDS and, with respect to some of them, to the production of immunogenic compositions and vaccine compositions against HIV retroviruses.
  • the invention relates to the applications for the same purposes of the antibodies capable of being induced. in vivo by immunogenic peptides or immunogenic and, for some of these antibodies, their applications to the production of active principles of drugs against these human AIDS.
  • the invention also relates to the use of some of these peptides in methods for the in vitro diagnosis in humans of certain forms of AIDS, as well as their application to the constitution of diagnostic kits or "kits”.
  • LAV-1 A first retrovirus called LAV-1 or HIV-1 has been isolated and described in patent application GB.83 / 24.800 and application EP.84 / 401.834 of 09/14/84. This virus has also been described by F. Barre Sinoussi et al. in Science, 220 n ° 45-99, 20 pages 868-871.
  • retroviruses belonging to a distinct class and having only a reduced immunological relationship with the preceding ones have been described in European patent application No. 87 / 400,151.4. These retroviruses, which have been grouped under the designation HIV-2, have been isolated from several African patients with symptoms of lymphadenopathy or AIDS.
  • HIV-2 type retroviruses like HIV-1 type retroviruses, are characterized by a tropism for human T4 lymphocytes and by a cytopathogenic effect with respect to these lymphocytes, when they multiply therein, thus causing either generalized and persistent polyadenopathies, or AIDS.
  • SIV-1 Another retrovirus called SIV-1, this name replacing the previously known name STLV III, was isolated from the rhesus macaque monkey. (MDDaniel et al. Science 228, 1201 (1985) NLLetwin et al, Science 230, 71 (1985) under the name "STLV-IIImac”).
  • STLV-III AGM Another retrovirus, designated "STLV-III AGM”
  • SIV AGM SIV AGM
  • SIV-1mac retrovirus A strain of the SIV-1mac retrovirus was deposited at the CNCM on February 7, 1986 under the number I-521. Studies have shown that the SIV-1 retrovirus contains certain proteins having a certain immunological relationship with structural proteins or glycoproteins capable of being obtained under analogous conditions, from HIV-2. This SIV-1 retrovirus, which was found to be infectious in monkeys, had been designated by STLVIII by the researchers who isolated it (cited Bibliographical references).
  • viruses will no longer be designated in what follows only by the expression SIV (the expression SIV is the English abbreviation for "Simian Immunodeficiency Virus") possibly followed by 'an abbreviation designating the species of monkey from which they come, for example, MAC (or mac) for the macaque or AGM for the green African monkey (abbreviation of "African Green Monkey”).
  • HIV-2 ROD complementary DNA sequences
  • HUT 78 cells infected with the SIV virus isolated STLV-III mac 142-83 described by Daniel et al. (1985) Science, 228 , p. 1201-1204, partially digested with the restriction enzyme Sau3A a was cloned at the BamHI site of the bacteriophage vector Lambda ELBL3 to constitute a genomic library.
  • the 2 million recombinant phages of the genomic library thus constituted were screened in situ under P3 security conditions, using sequences of the HIV2 virus originating from clones lambda-ROD4, lambda-ROD35 and E2 (Clavel et al. (1986-Nature, 324 , p.691.) and nick-translated.
  • Hybridization was carried out in 5xSSC at 50 ° C and washes in 2xSSC at 50 ° C. A single clone containing all the viral sequences were obtained. This clone is designated by lambda-SIV-1.
  • the lambda-SIV-1 phage insert measures 16.5 kb in total and includes an integrated provirus lacking only the first 250 bases of the left LTR, while the right LTR is complete.
  • the integrated provirus was sequenced by the dideoxynucleotide method after subcloning of random fragments in the phage M13mp8. 300 subclones were analyzed.
  • FIG. 1B represents the nucleotide sequence of the viral genome of SIV and the sequences deduced therefrom for the viral proteins corresponding to the products of the gag, pol, env, Q, X, R, tat, art, F genes.
  • FIGS. 3 to 11 and FIG. 1C represent the comparisons of the theoretical products of the viral genes and of the LTRs between HIV2 and SIVmac. ( ⁇ SIV-1).
  • cDNA fragments deduced from the cDNA derived from the whole genome of SIV-1 which contain one or more sequences derived from the complete cDNA sequence and which code for peptides of interest of the invention are also described herein. request. These sequences are indicated in FIG. 1B and, in FIG. 1C for the LTR sequence of the virus,
  • the nucleic sequences of the SIV cDNA were placed in correspondence with the nucleic sequences of the HIV-2 ROD virus as regards the LTR sequence (FIG. 1C). This presentation which we find for the whole genome by comparing Figure 1B Figures 3 to 11 can identify or deduce the nucleic acids having essential structural elements common to the two viruses.
  • the present application also describes the use of cDNAs derived from SIV or of their fragments (or of recombinants containing them) as probes, for the diagnosis of the presence or not of HIV-2 virus in samples of sera or of other biological fluids or tissues obtained from patients suspected of carrying the HIV-2 virus.
  • These probes are preferably also labeled (radioactive, enzymatic, fluorescent markers, etc.).
  • Probes which are particularly advantageous for implementing the method for diagnosing the HIV-2 virus or an HIV-2 variant can be characterized in that they comprise all or a fraction of the cDNA complementary to the genome of the virus SIV or even in particular the recombinant fragments contained in various clones.
  • the probes usable in this method of diagnosis of the HIV-2 virus and in the diagnostic kits are in no way reduced to the probes described above. On the contrary, they include all the nucleotide sequences originating from the genome of the SIV virus, of a variant of SIV or of a virus close by its structure, since they allow the detection in biological fluids of persons liable to develop AIDS. , antibodies to HIV-2, or a virus close to it.
  • the detection can be carried out in any manner known per se. It can include bringing these probes into contact with either the nucleic acids obtained from the cells contained in these sera or other biological media, for example cerebrospinal fluids, saliva, etc. It can also include contacting these probes with these media themselves once their nucleic acids have been made accessible for hybridization with these probes, and this under conditions allowing hybridization between these probes and these nucleic acids.
  • the final step of the in vitro diagnosis then includes the detection of the hybridization possibly produced.
  • the above diagnosis involving hybridization reactions can also be carried out using mixtures of probes respectively originating from an HIV-2 and from an SIV-1 or from an HIV-1, from an HIV -2 and an SIV, since it is not necessary to differentiate between the type of virus sought.
  • the abovementioned hybridization is carried out under non-stringent conditions and the washing of the membrane is carried out under conditions adapted to those of the hybridization.
  • the application also describes the nucleic acids corresponding to placed sequences into analogous regions of variants of SIV as well as all the nucleic acids whose modifications would result from taking advantage of the degeneration of the genetic code.
  • gag proteins core proteins
  • env proteins envelope proteins
  • the major envelope glycoprotein of HIV-2 has been shown to be closer immunologically to the major envelope glycoprotein of SIV than to the major envelope glycoprotein of HIV-1.
  • the major core protein of HIV-2 appears to have an average molecular weight (around 26,000) intermediate between that of p25 of HIV-1 and p27 of SIV.
  • the present invention also relates to diagnostic methods and compositions for the in vitro detection of antibodies directed against an HIV-2 virus or of its variants, more particularly in biological samples, in particular sera from patients having undergone a infection with the HIV-2 virus, some of these peptides allowing a particularly strong discrimination between the infections due to HIV-2 viruses and to HIV-1 viruses.
  • an amino acid When an amino acid can, by virtue of its position within the amino acid chain characteristic of a given peptide, take on several meanings, it can either be designated by a dash "-", if its meaning can be any, or by a lowercase letter when this amino acid may have a limited number of preferred meanings, this number being however always greater than 1. In the latter case, the possible meanings of this lowercase letter will always be specified in relation to the peptide to which it belongs.
  • these peptides will be designated by an abbreviation env or gag followed by a numerical index, by reference to amino acid sequences contained, as the case may be, either in the env proteins or in the gag proteins of certain HIV -1, HIV-2 or SIV. Reference will be made to this in the following.
  • peptides according to the invention which have in common immunological properties with antigens of HIV-2 and, for some of them also with antigens of HIV-1 or of its variants, are characterized in that they have also a peptide structure in common with SIV antigens.
  • these peptides normally comprise at most 40 amino acid residues.
  • gag 1 The structure of the antigenic peptide encoded by the gag gene and designated by gag 1 is also shown below: XDCKLVLKGLGaNPTLEEMLTAZ, in which the letter a denotes M or T.
  • amino acids having a unique meaning (therefore represented by a capital letter corresponding to the international nomenclature) which are involved in the preceding definitions of peptides according to the invention, happen to be the correspondence with identical amino acid placed in the same order in the corresponding env or gag sequences of the env or gag protein of at least one of HIV, or SIV-1.
  • the solid lines which appear in certain locations of these sequences are intended to underline that certain amino acids contained in these sequences have been deliberately deleted in terms of presentation, in order to allow alignment of respectively identical amino acids (then marked with an asterisk ) or two vertical points on the same vertical line in the sequences of the corresponding proteins of HIV-1 and HIV-2 on the one hand, of SIV and HIV-2 on the other hand.
  • the invention also relates to peptides modified by insertion and / or deletion and / or substitution of one or more amino acids, provided that the antigenic or immunogenic properties of said peptides are not modified, or that the properties of recognition of the antigen or of the antibody with said peptides are not substantially modified.
  • the invention relates to peptides having immunological properties in common with the peptide backbone of the envelope glycoprotein of viruses of the HIV-2 class, these peptides containing a number of acid residues amines not exceeding 40.
  • the peptides according to the invention can also advantageously be prepared by conventional techniques, in the field of peptide synthesis. This synthesis can be carried out in homogeneous solution or in solid phase.
  • This synthesis method consists in successively condensing two by two successive aminoacyles in the required order, or in condensing aminoacyles and fragments previously formed and already containing several aminoacyles in the appropriate order, or several fragments previously thus prepared. , it being understood that care will have been taken beforehand to protect all the reactive functions carried by these aminoacyles or fragments, with the exception of the amine functions of the one and carboxyls of the other or vice versa, which must normally intervene in the formation of peptide bonds, in particular after activation of the carboxyl function, according to methods well known in the synthesis of peptides.
  • the synthesis preferably begins with the condensation of the C-terminal amino acid with the amino acid which corresponds to the neighboring aminoacyl in the desired sequence and so on, step by step, up to the N-terminal amino acid.
  • RD MERRIFIELD in the article entitled “Solid phase peptide synthesis” (J. Am. Soc., 45 , 2149-2154).
  • a peptide chain according to the MERRIFIELD method, use is made of a very porous polymer resin, on which the first C-terminal amino acid of the chain is fixed. This amino acid is attached to the resin via its carboxylic group and its amine function is protected, for example by the t-butyloxycarbonyl group.
  • the protective group of the amine function is removed by washing the resin with an acid.
  • the protecting group for the amine function is the t-butyloxycarbonyl group, it can be removed by treatment of the resin with trifluoroacetic acid.
  • the second amino acid which provides the second amino-acyl of the desired sequence is then coupled, from the C-terminal amino-acyl residue to the deprotected amine function of the first C-terminal amino acid attached to the chain.
  • the carboxyl function of this second amino acid is activated, for example by dicyclohexylcarbodiimide, and the amine function is protected, for example by t-butyloxycarbonyl.
  • the first part of the sought-after peptide chain is thus obtained, which comprises two amino acids, and the terminal amine function of which is protected.
  • the amine function is deprotected and the third aminoacyl can then be fixed, under conditions analogous to those of the addition of the second C-terminal amino acid.
  • the protective groups of the various amino acids constituting the peptide chain are removed and the peptide is detached from the resin, for example using fluororydric acid.
  • the invention also relates to the water-soluble oligomers of the above-mentioned monomeric peptides. Oligomerization can cause an increase in the immunogenicity of the monomeric peptides according to the invention. Without such a quantitative indication being able to be considered as limiting, it will nevertheless be mentioned that these oligomers can, for example, contain from 2 to 10 monomer units.
  • the monomer units entering this oligomer are either all constituted by the polypeptide of sequence 1 or by the polypeptide of sequence 2, or by both of these polypeptides.
  • Any polymerization technique commonly used in the field of peptides can be used to carry out the oligomerization, this polymerization being carried out until an oligomer or polymer is obtained containing the number of monomer units required for the oligomerization. acquisition of the desired immunogenicity.
  • a method of oligomerization or polymerization of the monomer consists in the reaction of the latter with a crosslinking agent such as glutaraldehyde.
  • the corresponding nucleic acids of the SIV virus described contain one or more sequences derived from the cDNA of the SIV-1 virus. These sequences coding for the peptides env1 to env11 and gag1 can be identified in FIG. 3 by comparison with the corresponding sequences described for HIV-2.
  • the application also describes the nucleic acids corresponding to sequences placed in analogous regions of the cDNAs derived from variants of HIV-2 ROD or of SIV, as well as all the nucleic acids whose modifications with respect to the preceding would result from the use degeneration of the genetic code.
  • the invention also relates to the conjugates obtained by covalent coupling of the peptides according to the invention (or the above oligomers) to carrier molecules (natural or synthetic), physiologically acceptable and non-toxic, by means of complementary reactive groups carried respectively by the carrier molecule and the peptide.
  • suitable groupings are illustrated in the following:
  • carrier molecules or macromolecular supports entering into the constitution of the conjugates according to the invention, mention will be made of natural proteins, such as tetanus toxoid, ovalbulmine, serum albumin, hemocyamines, etc.
  • polylysines or poly (D-L-alanine) -poly (L-lysine).
  • the following compounds will advantageously be used as coupling agent: glutaric aldehyde, ethyl chloroformate, water-soluble carbodiimides [N-ethyl-N '(3-dimethylamino-propyl) carbodiimide, HCl], diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- and trichloro-s-triazines, cyanogen bromides, as well as the coupling agents mentioned in Scand. J. Immunol., (1978), vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).
  • any coupling process can be used which involves, on the one hand, one or more reactive functions of the peptide and, on the other hand, one or more reactive functions of support molecules.
  • these are the carboxyl and amine functions, which can give rise to a coupling reaction in the presence of a coupling agent of the type of those used in the synthesis of proteins, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, N-hydroxybenzotriazole, etc.
  • a coupling agent of the type of those used in the synthesis of proteins, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, N-hydroxybenzotriazole, etc.
  • glutaraldehyde in particular when it is a question of linking together amino groups respectively carried by the peptide and the support molecule.
  • the peptides according to the invention have antigenic properties. They can therefore be used in diagnostic methods for the detection of infection with the HIV-2 virus.
  • a first group (I) comprises the gag 1 peptides. These peptides recognize anti-HIV-2 antibodies and are therefore capable of detecting HIV-2 infection. They also recognize anti-HIV-1 antibodies to some extent.
  • a second group (II) comprises peptides which correspond more particularly to those which are located in the transmembrane part and in the end of the external part of the envelope protein. These peptides are those previously designated by env1 , env2 and env3 . They allow specific recognition of the presence of antibodies against HIV-2 and therefore make it possible to discriminate in a person the past or present infections due to an HIV, more particularly between those which were caused by an HIV-2 and those which 'were by HIV-1.
  • the invention also relates to a composition containing at least one of the above-mentioned peptides or at least one oligomer of this peptide, characterized in that it has the capacity to be recognized by sera of human origin containing antibodies against HIV-2 virus.
  • the invention relates to a method for in vitro diagnosis of one or more peptides according to the invention for the detection of antibodies against HIV-2 in biological fluids, in particular in human sera.
  • the detection of the antigen-antibody complex is carried out using immunoenzymatic tests (of the type ELISA), immunofluorescent (IFA type), radioimmunological (RIA type) or radioimmunoprecipitation tests (RIPA type).
  • immunoenzymatic tests of the type ELISA
  • RIA type radioimmunological
  • RIPA type radioimmunoprecipitation tests
  • the invention also relates to any peptide according to the invention labeled with the aid of an adequate marker of the enzymatic, fluorescent, radioactive type, etc.
  • the invention relates to the antibodies themselves formed against the peptides of the invention.
  • the invention also relates to immunogenic compositions for the production of vaccines, the active principle of which consists of at least one peptide according to the invention, or an oligomer of this peptide, or a peptide in form conjugated with a carrier molecule, characterized in that that they induce the production of antibodies against the abovementioned peptides in a sufficient amount to also inhibit the proteins of the HIV-2 retrovirus, or even the HIV-2 retrovirus coming into association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the immunogenic compositions for the production of vaccines advantageously comprise more particularly at least one of the peptides previously designated by env4 , env5 , env6 , env7 , env8 , env9 , env10 , env11 see mixtures of these.
  • peptides capable of constituting active principles of vaccines some are particularly preferred because they have a basic structure of amino acids corresponding to regions of the envelope glycoproteins which exhibit a high degree of conservation, not only in HIV-2, and in SIV, but also in HIV-1.
  • peptides designated by env4 certain peptides env5 , env6 and env10 .
  • the immunogenic peptides (or fragments of these peptides) capable of constituting active principles of vaccines are chosen from those whose formulas correspond to sequences which, in the envelope glycoproteins of HIV- 2, SIV and HIV-1 having an amino acid homology greater than 50%, which belong to the external part of the envelope of the virus, which have almost no deletions, and which contain cysteine residues favorable to stabilization connections and the creation of anchor loops.
  • compositions consist of solutions, suspensions or injectable liposomes containing an effective dose of at least one product according to the invention.
  • these solutions, suspensions or liposomes are produced in an isotonic sterile aqueous phase, preferably saline or glucose.
  • the invention relates more particularly to such suspensions, solutions or liposome form which are capable of being administered by intradermal, intramuscular or subcutaneous injections, or even by scarification.
  • compositions which can be administered by other routes, in particular by the oral route.
  • compositions according to the invention which can be used as vaccines to be effective in the production of antibodies against the HIV-2 virus, can, for example, be administered in doses between 10 and 500 ⁇ g / kg, peptides according to the invention, preferably from 50 to 100 ⁇ g / kg.
  • peptides according to the invention can also be defined by the following formulas (in which X, Z and the dashes "-" have the meanings indicated above):
  • the invention also relates, in addition to the SIV peptides already described, the proteins encoded by the cDNA of the SIV virus. It also relates to the proteins of any virus immunologically closely related to SIV-1mac, in particular any virus whose proteins and envelope glycoproteins cross immunologically and whose cDNAs have a homology percentage of at least 95% and preferably at least 98%.
  • amino acids of the above-mentioned SIV proteins have been shown in alignment with the amino acid sequences of the corresponding proteins of the HIV-2 virus; the vertical points appearing between the two sequences correspond to the amino acids common between the proteins of the two viruses.
  • the cDNA sequences encoding the above proteins appear in Figure 1B.
  • the abovementioned nucleic acid sequences can be modified as soon as the modified nucleic acid sequence also codes for the proteins of the retrovirus SIV or of a variant.
  • the invention therefore naturally relates to the proteins described above, when they are obtained from the SIV virus or when they are prepared by a method of synthesis, in particular by one of the methods already mentioned in connection with the synthesis of the peptides of smaller size.
  • the invention also relates to the use of the preceding proteins for the diagnosis of the possible presence of antibodies directed against the proteins of HIV-2, or even against HIV-2 in whole, or for some of them the use for the purposes for diagnosing an infection due to one of the HIV viruses.
  • the GAG peptide encoded by the corresponding gene can be used to identify the possible presence of anti-HIV-1 or anti-HIV-2 antibodies.
  • the ENV proteins are preferably used for the specific diagnosis of an infection due to HIV-2 or one of its variants, sometimes for the diagnosis of an infection by HIV-2 or HIV-1.
  • the invention therefore also relates to an in vitro diagnostic method for detecting antibodies against HIV-2 and optionally against HIV-1 in biological fluids and in particular in human sera.
  • Such methods applicable for the use of the preceding proteins of SIV as diagnostic proteins, have already been described in the present invention.
  • the invention also relates to boxes or "kits" for the in vitro diagnosis of the presence of antibodies to the HIV-2 virus and in certain cases against HIV-1 in a biological medium.
  • kits for the in vitro diagnosis of the presence of antibodies to the HIV-2 virus and in certain cases against HIV-1 in a biological medium.
  • kits using the preceding peptides have also been described in the present invention.
  • the invention also relates to immunogenic compositions for the production of vaccines, the active principle of which advantageously consists of at least the portion of the ENV protein of the SIV virus, this protein possibly being in conjugated form with a carrier molecule.
  • immunogenic compositions induce the production of antibodies against the abovementioned peptide in an amount sufficient to inhibit the proteins of the HIV-2 retrovirus, or even the HIV-2 retrovirus itself.
  • SIV proteins are in no way limited to that of only ENV or GAG proteins.
  • Other proteins among those described can be envisaged to prepare diagnostic or even vaccine compositions.

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Description

  • La présente invention est relative à des peptides ayant des propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, en commun avec des antigènes susceptibles d'être obtenus sous une forme purifiée, à partir de virus capables de provoquer des lymphadénopathies susceptibles d'être relayées ensuite par le symdrôme d'immunodéficience acquise (SIDA) chez l'homme.
  • L'invention concerne en particulier des peptides antigéniques susceptibles d'être reconnus par des anticorps induits chez l'homme par des virus désignés par l'abréviation HIV, selon la nomenclature définie dans NATURE. Elle concerne également des peptides ayant des propriétés immunogènes ou susceptibles d'être rendus immunogènes in vivo, cette immunogénicité étant susceptible de se manifester par l'induction in vivo d'anticorps reconnaissant des antigènes caractéristiques des virus HIV-2 et même, au moins en ce qui concerne certains de ces peptides, des antigènes issus de HIV-1.
  • L'invention concerne en outre des applications de ces peptides à la fabrication de compositions pour le diagnostic in vitro chez l'homme de potentialité de certaines formes du SIDA et, en ce qui concerne certains d'entre eux, à la production de compositions immunogènes et de compositions vaccinantes contre les rétrovirus HIV.
  • De même l'invention concerne les applications aux mêmes fins des anticorps susceptibles d'être induits in vivo par les peptides immunogènes ou rendus immunogènes et, pour certains de ces anticorps, leurs applications à la production de principes actifs de médicaments contre ces SIDAS humains.
  • L'invention concerne également la mise en oeuvre de certains de ces peptides dans des procédés pour le diagnostic in vitro chez l'homme de certaines formes du SIDA, ainsi que leur application à la constitution de trousses ou "kits" de diagnostic.
  • Un premier rétrovirus dénommé LAV-1 ou HIV-1 a été isolé et décrit dans la demande de brevet GB.83/24.800 et une demande EP.84/401.834 du 14/09/84. Ce virus a également été décrit par F.Barre Sinoussi et al. dans Science, 220 n° 45-99, 20 pages 868-871.
  • Des variants de ce virus HIV-1 désignés par LAV ELI et LAV MAL, ont également été isolés, caractérisés et décrits dans la demande de brevet EP.84/401.834.
  • Les virus HIV-1 et leurs variants possèdent les propriétés suivantes :
    • ils ont pour cibles préférencielles les cellules Leu3 (ou lymphocytes T4) humaines et leurs cellules dérivées "immortalisées".
    • ils ont une activité transcriptase inverse nécessitant la présence d'ions Mg2+ et présentent une forte activité pour le poly(adenylate-oligo-deoxythymidylase) poly(A)-oligo(dT)12-18)
    • ils ont une densité de 1,16 à 1,17 sur gradient de sucrose,
    • ils ont un diamètre moyen de 139 nanomètres et un noyau de diamètre moyen de 41 nanomètres,
    • les lysats de ces virus contiennent une protéine p25 (protéine du noyau) qui ne croise pas immunologiquement avec la protéine p24 de HTLV-1,
    • ils contiennent une protéine p42 appartenant à leur enveloppe,
    • ils contiennent également une glycoprotéine d'enveloppe gp110 d'un poids moléculaire de 110.000.
  • L'isolement et la caractérisation de rétrovirus appartenant à une classe distincte et n'ayant qu'une parenté immunologique réduite avec les précédents, ont été décrits dans la demande de brevet européen n° 87/400.151.4. Ces rétrovirus qui ont été regroupés sous la désignation HIV-2, ont été isolés chez plusieurs malades africains présentant des symptômes d'une lymphadénopathie ou d'un SIDA.
  • Les rétrovirus du type HIV-2 comme les rétrovirus du type HIV-1, se caractérisent par un tropisme pour les lymphocytes T4 humains et par un effet cytopathogène à l'égard de ces lymphocytes, lorsqu'ils s'y multiplient, pour alors causer soit des poly-adénopathies généralisées et persistantes, soit un SIDA.
  • Plus généralement les rétrovirus purifiés par HIV-2 possèdent en général les propriétés suivantes :
    • la cible préférentielle des rétrovirus HIV-2 est constituée par les cellules Leu3 (ou lymphocytes T4) humaines et pour des cellules "immortalisées" dérivées de ces lymphocytes T4 ;
    • ils sont cytotoxiques pour les lymphocytes T4 humains
    • ils ont une activité de transcriptase inverse nécessitant la présence d'ions Mg2+ et présentant une forte activité pour le poly(adénylate-oligodéoxythylmidylase) (poly(A)-oligo(dT) 12-18) ;
    • ils ont une densité de 1,16 dans un gradient de sucrose ;
    • ils ont un diamètre moyen de 140 nanomètres et un noyau ayant un diamètre moyen de 41 nanomètres ;
    • ils peuvent être cultivés dans des lignées permanentes du type HUT ou exprimant la protéine T4 ;
    • ils ne sont pas infectieux pour les lymphocytes T8 ;
    • les lysats de ces virus contiennent une protéine p26 qui ne croise pas immunologiquement avec la protéine p24 du virus HTLV-I ou du virus HTLV-II ;
    • ces lysats contiennent en outre une protéine p16 qui n'est pas reconnue immunologiquement par la protéine p19 de HTLV-I ou de HTLV-II dans des essais de radioimmunoprécipitation ;
    • ils contiennent en outre une glycoprotéine d'enveloppe ayant un poids moléculaire de l'ordre de 130.000-140.000 qui ne croise pas immunologiquement avec la gp110 des HIV-1, mais qui en revanche croise immunologiquement avec la glycoprotéine d'enveloppe gp140 de STLV-III (virus isolé chez le singe) ;
    • ces lysats contiennent encore des antigènes marquables par la 35S-cystéine, dont les poids moléculaires s'étagent entre 32.000 et 42.000-45.000 : ils comprennent notamment un antigène ayant un poids moléculaire de l'ordre de 36.000 et un antigène ayant un poids moléculaire de l'ordre de 42.000, l'un de ces antigènes (p36 et p42) constituant vraisemblablement une glycoprotéine transmembranaire du virus HIV-2 ;
    • l'ARN génomique des HIV-2 n'hybride pas avec l'ARN génomique de HIV-1 dans des conditions stringentes ;
    • dans des conditions non stringentes, l'ARN génomique de HIV-2 n'hybride, ni avec le gène env et le LTR qui le jouxte, de HIV-1, ni avec des séquences de la région pol du génome de HIV-1 ;
    • dans des conditions non stringentes, il hybride faiblement avec des séquences de nucléotides de la région de HIV-1.
  • Un autre rétrovirus dénommé SIV-1, cette dénomination remplaçant la dénomination antérieurement connue STLV III, a été isolé chez le singe macaque rhésus. (M.D.Daniel et al. Science 228, 1201 (1985) N.L.Letwin et al, Science 230, 71 (1985) sous l'appellation "STLV-IIImac").
  • Un autre rétrovirus, désigné "STLV-IIIAGM", (ou SIVAGM) a été isolé chez des singes verts sauvages. Mais, contrairement au virus présent chez le singe macaque rhésus, la présence de "STLV-IIIAGM" ne semble pas induire une maladie du type SIDA chez le singe vert d'Afrique.
  • Une souche du rétrovirus SIV-1mac a été déposée à la CNCM le 7 Février 1986 sous le n° I-521. Des études ont montré que le rétrovirus SIV-1 comporte certaines protéines possédant une certaine parenté immunologique avec des protéines ou glycoprotéines structurales susceptibles d'être obtenues dans des conditions analogues, à partir de HIV-2. Ce rétrovirus SIV-1, dont on a constaté le caractère infectieux chez les singes, avait été désigné par STLVIII par les chercheurs qui l'ont isolé (références bibliographiques précitées).
  • Pour la commodité du langage, ces virus ne seront plus désignés dans ce qui suit que par l'expression SIV (l'expression SIV est l'abréviation anglaise de "Simian Immunodeficiency Virus" (virus d'immunodéficience du singe)) éventuellement suivi d'une abréviation désignant l'espèce de singe dont ils sont issus, par exemple, MAC (ou mac) pour le macaque ou AGM pour le singe vert d'Afrique (abréviation de "African Green Monkey").
  • En mettant en oeuvre les mêmes techniques que celles rappelées plus haut, il a été constaté que l'on pouvait également obtenir à partir de SIV-1mac :
    • une protéine principale du noyau p27, ayant un poids moléculaire de l'ordre de 27 kilodaltons,
    • une glycoprotéine majeure d'enveloppe, gp140,
    • une protéine vraisemblablement transmembranaire p32, qui n'est guère observée en RIPA lorsque le virus a au préalable été marqué par la 35S-cystéine, mais qui peut être observée dans les essais d'immunoempreintes (Western blots), sous forme de bandes larges.
  • Des études plus précises ont été réalisées en ce qui concerne les précédents virus HIV-2 et SIV. La poursuite de l'étude des rétrovirus HIV-2 a également conduit à l'obtention de séquences d'ADN complémentaires (ADNc) des ARNs de leurs génomes. La séquence nucléotidique complète de l'ADNc d'un rétrovirus représentatif de la classe HIV-2 (HIV-2 ROD) a été déposée le 21/02/1986 à la CNCM sous le n° I-522, sous le nom de référence LAV-II ROD).
  • Cette séquence nucléotidique et les phases de lecture ouverte qu'elle contient sont indiqués à la figure 1 A.
  • En outre, la poursuite de l'étude d'autres rétrovirus a également permis d'aboutir à l'obtention de leurs séquences nucléotidiques complètes. Il en est en particulier ainsi de l'ADNc dérivé de l'ARN génomique de SIV.
  • Le clonage et le séquençage du virus SIV-1mac qui ont permis l'obtention de sa séquence nucléotidique ont été réalisés dans les conditions suivantes :
  • L'ADN de cellules HUT 78 infectées par le virus SIV (isolat STLV-III mac 142-83 décrit par Daniel et al.(1985) Science, 228, p. 1201-1204, digéré partiellement par l'enzyme de restriction Sau3A a été cloné au site BamHI du bactériophage vecteur Lambda ELBL3 pour constituer une banque génomique. Les 2 millions de phages recombinants de la banque génomique ainsi constituée ont été criblés in situ en conditions de sécurité P3, à l'aide de séquences du virus HIV2 provenant des clones lambda-ROD4, lambda-ROD35 et E2 (Clavel et al. (1986-Nature, 324, p.691.) et nick-translatées.
  • L'hybridation a été réalisée en 5xSSC à 50°C et les lavages en 2xSSC à 50°C. Un seul clone contenant l'ensemble des séquences virales a été obtenu. Ce clone est désigné par lambda-SIV-1. L'insérat du phage lambda-SIV-1 mesure 16,5 kb au total et comprend un provirus intégré auquel manquent seulement les 250 premières bases du LTR gauche, alors que le LTR droit est complet.
  • Le provirus intégré a été séquencé par la méthode des didéoxynucléotides après sous-clonage de fragments aléatoires dans le phage M13mp8. 300 sous-clones ont été analysés.
  • Des fragments d'ADNc provenant du clone Lambda SIV-1 insérés dans des plasmides pSIV-1.1 et pSIV-1.2 ont été déposés à la CNCM le 15 Avril 1987, sous les numéros I-658 (pSIV-1.1) et I-659 (pSIV-1.2).
  • Les résultats ont été mentionnés dans les figures décrites ci-après.
  • La figure 1B représente la séquence nucléotidique du génome viral de SIV et les séquences qui en sont déduites pour les protéines virales correspondant aux produits des gènes gag, pol, env, Q, X, R, tat, art, F.
  • Les figures 3 à 11 et la figure 1C représentent les comparaisons des produits théoriques des gènes viraux et des LTR entre HIV2 et SIVmac. (λSIV-1).
  • Les fragments d'ADNc déduits de l'ADNc issu du génome entier de SIV-1, qui contiennent une ou plusieurs séquences issues de la séquence complète d'ADNc et qui codent pour des peptides intéressants de l'invention sont également dècrits dans la présente demande. Ces sequences sont indiquées à la figure 1B et, à la figure 1C pour ce qui a trait à la séquence LTR du virus,
  • Les séquences nucléiques de l'ADNc de SIV ont été placées en correspondance avec les séquences nucléiques du virus HIV-2 ROD pour ce qui concerne la séquence LTR (figure 1C). Cette présentation que l'on retrouve pour le génome entier en rapprochant la figure 1B des figures 3 à 11 permet de repérer ou de déduire les acides nucléiques ayant des éléments de structure essentiels communs aux deux virus.
  • La présente demande dècrit aussi l'utilisation des cADNs issus de SIV ou de leurs fragments (ou de recombinants les contenant) en tant que sondes, pour le diagnostic de la présence ou non de virus HIV-2 dans des échantillons de sérums ou d'autres liquides ou tissus biologiques obtenus à partir de patients suspectés d'être porteurs du virus HIV-2. Ces sondes sont de préférence marquées également (marqueurs radio-actifs, enzymatiques, fluorescents, etc.). Des sondes particulièrement intéressantes pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic du virus HIV-2 ou d'un variant de HIV-2 peuvent être caractérisées en ce qu'elles comprennent la totalité ou une fraction de l'ADNc complémentaire du génome du virus SIV ou encore notamment les fragments recombinants contenus dans divers clones.
  • Les sondes utilisables dans ce procédé de diagnostic du virus HIV-2 et dans les kits de diagnostic ne sont en aucune façon réduites aux sondes décrites précédemment. Elles comprennent au contraire toutes les séquences nucléotidiques issues du génome du virus SIV, d'un variant de SIV ou d'un virus proche par sa structure, dès lors qu'elles permettent la détection dans des fluides biologiques de personnes susceptibles de développer un SIDA, d'anticorps dirigés contre un HIV-2 ou d'un virus qui en est proche.
  • La détection peut être réalisée de toutes façons en soi connues. Elle peut comprendre une mise en contact de ces sondes soit avec les acides nucléiques obtenus à partir des cellules contenues dans ces sérums ou autres milieux biologiques, par exemple liquides céphalo-rachidiens, salives, etc... Elle peut aussi comprendre une mise en contact de ces sondes avec ces milieux eux-mêmes dès lors que leurs acides nucléiques ont été rendus accessibles à l'hybridation avec ces sondes, et ce dans des conditions permettant l'hybridation entre ces sondes et ces acides nucléiques. L'étape finale du diagnostic in vitro comprend alors la détection de l'hybridation éventuellement produite. Le susdit diagnostic mettant en jeu des réactions d'hybridation peut également être réalisé à l'aide de mélanges de sondes respectivement originaires d'un HIV-2 et d'un SIV-1 ou d'un HIV-1, d'un HIV-2 et d'un SIV, dès lors qu'il n'est pas nécessaire de faire une différence entre le type de virus recherché.
  • D'une façon générale, le procédé de diagnostic de la présence ou non du virus HIV-2 ou d'un variant dans des échantillons de sérums ou d'autres liquides ou tissus obtenus à partir de patients suspectés d'être porteurs du virus HIV-2 comprend les étapes suivantes :
    • 1/ au moins une étape d'hybridation conduite dans des conditions stringentes, par mise en contact de l'ADN de cellules de l'échantillon du patient suspect avec l'une des susdites sondes marquées sur une membrane appropriée,
    • 2/ le lavage de ladite membrane avec une solution assurant la conservation de ces conditions stringentes de l'hybridation,
    • 3/ la détection de la présence ou non du virus HIV-2 par une méthode d'immunodétection.
  • Alternativement, l'hybridation précitée est conduite dans des conditions non stringentes et le lavage de la membrane est réalisé dans des conditions adaptées à celles de l'hybridation.
  • La demande décrit aussi les acides nucléiques correspondant à des séquences placées en des régions analogues de variants de SIV ainsi que tous les acides nucléiques dont les modifications résulteraient de la mise à profit de la dégénérescence du code génétique.
  • Les études comparatives qui ont aussi permis d'aboutir à des résultats relatifs aux protéines de noyau (core), ci-après dénommées "protéines gag" et aux protéines d'enveloppes, ci-après dénommées "protéines env", ont également été rapportés dans la demande de brevet européen n° 87/400.151.4, déjà citée. Ces résultats montrent que les protéines du noyau (protéines gag) dans HIV-2 présentent des différences moins accentuées par rapport à celles des virus HIV-1, que les protéines d'enveloppe (protéines env). Globalement les protéines env dans HIV-2 se sont révélées présenter des parentés immunologiques extrêmement faibles, sinon inexistentes, avec les protéines env correspondantes des virus HIV-1.
  • Au contraire des études comparatives effectuées entre les structures des séquences d'ADNc des virus HIV-2 et SIV permettent de mettre en évidence certaines caractéristiques communes qui apparaissent au niveau des protéines.
  • Globalement, les protéines de HIV-2 et de SIV-1 montrent des parentés immunologiques importantes.
  • La glycoprotéine majeure d'enveloppe de HIV-2 s'est révélée être plus proche immunologiquement de la glycoprotéine majeure d'enveloppe de SIV que de la glycoprotéine majeure d'enveloppe de HIV-1.
  • Ces constatations s'imposent non seulement au niveau des poids moléculaires : 130-140 kilodaltons pour les glycoprotéines majeures de HIV-2 et de SIV contre environ 110 pour la glycoprotéine majeure d'enveloppe de HIV-1, mais aussi au niveau des propriétés immunologiques, puisque des sérums prélevés à partir de malades infectés par HIV-2, et plus particulièrement des anticorps formés contre la gp140 de HIV-2 reconnaissent la gp140 de SIV-1mac, alors que dans des essais semblables les mêmes sérums et les mêmes anticorps de HIV-2 ne reconnaissent pas la gp110 de HIV-1. Mais les sérums anti-HIV-1 qui n'ont jamais réagi avec la gp140 de HIV-2 précipitent une protéine de 26 Kdal marquée par la 35S-cystéine, contenue dans les extraits de HIV-2.
  • La protéine majeure du noyau (core) de HIV-2 semble présenter un poids moléculaire moyen (environ 26.000) intermédiaire entre celui de la p25 de HIV-1 et la p27 de SIV.
  • Ces observations résultent des essais réalisés avec des extraits viraux obtenus à partir du HIV-2 isolé à partir de l'un des patients susmentionnés. Des résultats similaires ont été obtenus avec des extraits viraux du HIV-2 isolé à partir du second patient.
  • Des études plus poussées ont conduit les inventeurs à reconnaître une première classe de peptides ayant des séquences d'aminoacides soit identiques, soit proches de séquences contenues à l'intérieur des structures des protéines gag et env de HIV-2 ou de SIV voire de HIV-1. Ces peptides sont notamment applicables au diagnostic d'une infection chez l'homme par le virus HIV-2 ou de l'un de ses variants.
  • L'invention a pour objet un peptide caractérisé par les propriétés suivantes :
    • il est reconnu par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-2, lesdit anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-2,
    • il contient un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40.
  • L'invention concerne également un peptide caractérisé par les propriétés suivantes :
    • il est reconnu par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-2, lesdits anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-2,
    • il n'est pas reconnu par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-1, lesdit anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-1,
    • il contient un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40.
  • A cet égard la présente invention concerne également des procédés et des compositions de diagnostic pour la détection in vitro d'anticorps dirigés contre un virus HIV-2 ou de ses variants, plus particulièrement dans des échantillons biologiques, notamment des sérums de patients ayant subi une infection par le virus HIV-2, certains de ces peptides permettant une discrimination particulièrement poussée entre les infections dues à des virus HIV-2 et à des virus HIV-1.
  • Ces études poussées ont également conduit à la possibilité de synthétiser des peptides immunogènes ou susceptibles d'être rendus immunogènes, présentant des caractéristiques de structures leur permettant d'induire in vivo la production d'anticorps susceptibles de reconnaître des protéines env à la fois dans HIV-1 et dans HIV-2 et, au moins pour certains de ces peptides, de se fixer tant sur des virus HIV-1 que sur des virus HIV-2, plus particulièrement aux fins de les neutraliser. L'utilisation de ces derniers types de peptides est donc particulièrement indiquée pour la production de principes actifs de vaccins contre les virus HIV, donc contre le SIDA.
  • Pour désigner ci-après les résidus d'aminoacides entrant dans la constitution des peptides selon l'invention, on aura recours, pour ceux des acides aminés ayant une signification univoque à la nomenclature internationale désignant chaque acide aminé naturel par une lettre unique (lettre majuscule) selon le tableau des correspondances qui suit :
    • M
    Méthionine
    L
    Leucine
    I
    Isoleucine
    V
    Valine
    F
    Phenylalanine
    S
    Sérine
    P
    Proline
    T
    Thréonine
    A
    Alanine
    Y
    Tyrosine
    H
    Histidine
    Q
    Glutamine
    N
    Asparagine
    K
    Lysine
    D
    Acide Aspartique
    E
    Acide glutaminique
    C
    Cystéine
    W
    Tryptophane
    R
    Arginine
    G
    Glycine
  • Lorsqu'un acide aminé pourra, en raison de sa position au sein de la chaîne d'aminoacides caractéristique d'un peptide déterminé, prendre plusieurs significations, il pourra soit être désigné par un tiret "-", si sa signification peut être quelconque, soit par une lettre minuscule lorsque cet aminoacide pourra présenter un nombre limité de significations préférées, ce nombre étant cependant toujours supérieur à 1. Dans ce dernier cas, les significations possibles de cette lettre minuscule seront toujours précisées en rapport avec le peptide auquel il appartient.
  • Afin de faciliter la lecture, ces peptides seront désignés par une abréviation env ou gag suivie d'un indice numérique, par référence à des séquences d'aminoacides contenues, selon le cas, soit dans les protéines env soit dans les protéines gag de certains HIV-1, HIV-2 ou SIV. Il y sera encore fait référence dans ce qui suit.
  • Enfin dans les définitions qui suivent
    • les groupes X représentent soit un groupe NH2 libre ou amidé, notamment par un ou deux groupes alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone, soit un groupe peptidique comprenant de 1 à 5 aminoacides, dont l'aminoacide N-terminal présente lui-même un groupe NH2 libre ou amidé comme précédemment indiqué, et
    • les groupes Z représentent, soit un groupe -OH libre ou alcoxyle et contenant alors un groupe alcoyle comprenant de 1 à 5 atomes de carbone, soit un groupe peptidique comprenant de 1 à 5 aminoacides, dont l'aminoacide C- terminal présente lui-même un groupe -OH libre ou alcoxyle, comme précédemment indiqué, les groupes de 1 à 5 acides aminés le cas échéant contenus dans X ou Z ou dans les deux à la fois étant tels, que leur présence n'est pas incompatible avec la préservation pour l'essentiel des propriétés immunologiques, le cas échéant immunogènes, des peptides qui en sont dépourvus.
  • Les peptides selon l'invention, qui ont en commun des propriétés immunologiques avec des antigènes de HIV-2 et, pour certains d'entre eux également avec des antigènes de HIV-1 ou de ses variants, sont caractérisés en ce qu'ils ont égaement une structure peptidique en commun avec les antigènes de SIV. De façon avantageuse, ces peptides comprennent normalement au plus 40 résidus d'acides aminés.
  • Des peptides préférés sont les suivants :
    • env1
      XRV-AIEKYL-DQA-LN-WGCAFRQVCZ
    • env2
      X-LE-AQI-QQEKNMYELQKLNZ
    • env3
      XELGDYKLVEITPIG-APT--KR-----Z
    • env4
      X----VTV-YGVP-WK-AT--LFCA-Z
    • env5
      X---QE--L-NVTE-F--W-NZ
    • env6
      XL---S-KPCVKLTPLCV--Z
    • env7
      X---N-S-IT--C-K----Z
    • env8
      X-I---YC-P-G-A-L-C-N-TZ
    • env9
      X------A-C------W--Z
    • env10
      X-G-DPE------NC-GEF-YCN-----NZ
    • env11
      X-----C-IKQ-I------G---YZ
  • Plus particulièrement l'invention concerne les peptides suivants :
    • env1
      XRV-AIEKYL-DQA-LN-WGCAFRQVCZ
    • env2
      X-LE-AQIQQEKNMYELQKLNZ
    • env3
      XELGDYKLVEITPIG-APT--KR-----Z
    • env4
      X----VTV-YGVP-W--AT--LFCA-Z
    • env5
      X----E--L-NVTE-F--W-NZ
    • env6
      XL---S-KPCVKL-PLC---Z
    • env7
      X---N-S-I---C-K----Z
    • env8
      X-I---YC-P-G-A-L-C-N-TZ
    • env9
      X------A-C------W--Z
    • env10
      X-G-DPE------NC-GEF-YC------NZ
    • env11
      X-----C-I-Q-I------G---YZ
  • Des peptides avantageux correspondant aux précédents, présentent les formules qui suivent :
    • env1
      XRVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCZ, ou
      XRVTAIEKYLKDQAQLNAWGCAFRQVCZ
    • env2
      XSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWZ, ou
      XLLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWZ
    • env3
      XELGDYKLVEITPIGFAPTKEKRYSSAHZ, ou
      XELGDYKLVEITPIGLAPTNVKRYTTG-Z
      (On remarquera que les peptides env1, env2, env3 attestent de la très grande parenté entre HIV-2 et SIV-1. En effet le premier peptide est inclu dans le génome de HIV-2 et le second, dans celui de SIV-1).
    • env4
      XabcdVTVeYGVPfWogAThiLFCAjZ,
      dans lesquels les lettres de a à j peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est C, E ou D
      • b est T, K, D, N ou I
      • c est Q ou L
      • d est Y ou W
      • e est F ou Y
      • f est T, V ou A
      • g est N ou E
      • h est I ou T
      • i est P ou T
      • j est T ou S
      • o est K ou R
    • env5
      XabcoEdeLfNVTEgFhiWjNZ,
      dans lequel les lettres de a à j peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est D ou P
      • b est D ou N
      • c est Y ou P
      • d est I, V, I ou L
      • e est T, V, E ou A
      • f est V, G ou E ou -
      • g est A, N, G ou S
      • h est D ou N
      • i est A ou M
      • j est N, K ou E
      • o est Q ou S
    • env6
      XLabcSdKPCVKLoPLCuefKZ,
      dans lequel les lettres de a à f peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est F ou W
      • b est E ou D
      • c est T ou Q
      • d est I ou L
      • e est A, S ou T
      • f est M ou L
      • o est T ou S
      • u est V ou I
    • env7
      XabCNxSyIocdCeKfghiZ,
      dans lequel les lettres de a à i et x et y peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est N ou T ou I
      • b est H ou S ou N
      • c est E ou Q
      • d est S, A ou C
      • e est D ou P
      • f est H, V ou D
      • g est Y ou S
      • h est W ou F
      • i est D ou E
      • x est T ou R
      • y est V ou A
      • o est T ou Q
    • env8
      XaIbcdYCxPeGfAgLhCiNjTZ,
      dans lequel les lettres de a à k et x peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est A ou P
      • b est R ou P
      • c est F, I ou C
      • d est R ou H
      • e est P ou A
      • f est Y ou F
      • g est L ou I
      • h est R ou K
      • i est - ou N
      • j est D ou K
      • x est A ou T
    • env9
      XwabcxyAdCefghizWjkZ,
      dans lequel les lettres de a à k et x à z peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est K ou - ou E
      • b est R ou -
      • c est P ou M ou I
      • d est W ou H ou Y
      • e est W ou N ou T ou R
      • f est F ou I
      • g est K ou S ou N ou G
      • h est G ou R ou E
      • i est - ou A ou T
      • j est K ou N ou D ou S
      • k est D ou A ou N ou K ou E
      • w est N, D ou I
      • x est R ou G ou K
      • y est Q ou K ou R
      • z est K ou E ou Q ou N
    • env10
      XaGbDPEcdefghNCiGEFjYCokxlmnNZ,
      dans lequel les lettres de a à n et x peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est K ou - ou G
      • b est S ou G ou -
      • c est V ou I
      • d est A ou V ou T
      • e est Y ou T ou M ou F
      • f est M ou H
      • g est W ou S
      • h est T ou F
      • i est R ou G
      • j est L ou F
      • o est N ou K
      • k est M ou S
      • l est W ou Q ou K ou G
      • m est F ou L
      • n est L ou F
      • x est T ou S ou N
    • env11
      XabcdwCeIoQfIxgyhizGjklYZ,
      dans lequel les lettres de a à l et w à z peuvent avoir les significations suivantes :
      • a est R ou T ou S ou N
      • b est N ou I
      • c est Y ou T
      • d est A ou L ou V
      • e est H ou R
      • f est I ou F
      • g est T ou M
      • h est H ou Q ou A
      • i est K ou E
      • j est R ou K
      • k est N ou A
      • l est V ou M
      • w est P ou Q
      • x est N ou K
      • y est W ou V
      • z est V ou T ou K
      • o est K ou R
  • La structure du peptide antigénique codé par le gène gag et désigné par gag1 est également représentée ci-après :
    XDCKLVLKGLGaNPTLEEMLTAZ,
    dans lequel la lettre a désigne M ou T.
  • Il sera remarqué que, d'une façon générale, les aminoacides ayant une signification univoque (donc représentés par une lettre majuscule correspondant à la nomenclature internationale) qui interviennent dans les définitions qui précèdent des peptides selon l'invention, se trouvent être la correspondance avec des aminoacides identiques placés dans le même ordre dans les séquences env ou gag correspondantes de la protéine env ou gag d'au moins l'un des HIV, ou de SIV-1.
  • Les positions de ces séquences sont soulignées et repérées au sein des séquences d'aminoacides des protéines env respectivement de HIV-2 ROD (CNCM n° I-532) et HIV-1 BRU (CNCM n° I-232) représentées à la figure 2. Par ailleurs, les alignements des acides aminés des protéines env et gag respectivement de SIV-1mac (CNCM n° I.521) et de HIV-2 ROD sont présentées à la figure 3 et à la figure 4.
  • Les traits pleins qui apparaissent en certaines localisations de ces séquences visent à souligner que certains aminoacides contenus dans ces séquences ont été volontairement délétés au plan de la présentation, afin de permettre la mise en alignement d'aminoacides respectivement identiques (alors marqués d'un astérisque) ou de deux points verticaux sur une même ligne verticale dans les séquences des protéines correspondantes de HIV-1 et de HIV-2 d'une part, de SIV et de HIV-2 d'autre part.
  • Outre les peptides précités, l'invention concerne également les peptides modifiés par insertion et/ou délétion et/ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, pour autant que les propriétés antigéniques ou immunogènes desdits peptides ne sont pas modifiées, ou que les propriétés de reconnaissance de l'antigène ou de l'anticorps avec lesdits peptides ne sont pas substantiellement modifiées.
  • Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention concerne des peptides ayant des propriétés immunologiques en commun avec l'ossature peptidique de la glycoprotéine d'enveloppe des virus de la classe HIV-2, ces peptides contenant un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40.
  • Ces peptides préférés selon l'invention ont les séquences suivantes :
    Figure imgb0001
    Figure imgb0002
    Figure imgb0003
  • Les peptides selon l'invention peuvent encore avantageusement être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.
  • Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrit par HOUBENWEYL dans l'ouvrage intitulé "Méthode der Organischen Chemie" (Méthode de la Chimie Organique) édité par E. Wunsch, vol. 15-I et II., THIEME, Stuttgart 1974.
  • Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides. En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique, du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-(3-diméthyl-amino-propyl)-carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront par exemple protégées, par des groupes t-bustylester.
  • Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a recours à celle décrite par R.D. MERRIFIELD dans l'article intitulé "Solid phase peptide synthesis" (J. Am. Soc., 45, 2149-2154).
  • Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de MERRIFIELD, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et sa fonction amine est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.
  • Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction amine en lavant la résine avec un acide.
  • Dans le cas où le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe t-butyloxycarbonyle, il peut être éliminé par traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique.
  • On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second amino-acyle de la séquence recherché, à partir du résidu amino-acyle C-terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C-terminal fixé sur la chaîne. De péférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la fonction amine est protégée, par exemple par le t-butyloxycarbonyle.
  • On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acide aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans les conditions analogues à celles de l'addition du deuxième acide aminé C-terminal.
  • On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.
  • Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acide aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine par exemple à l'aide d'acide fluorydrique.
  • L'invention concerne également les oligomères hydrosolubles des peptides monomères sus-indiqués. L'oligomérisation peut provoquer un accroissement de l'immunogénicité des peptides monomères selon l'invention. Sans qu'une telle indication chiffrée puise être considérée comme limitative, on mentionnera néanmoins que ces oligomères peuvent, par exemple, contenir de 2 à 10 unités monomères.
  • Les unités monomères entrant dans cet oligomère sont soit toutes constituées par le polypeptide de séquence 1 ou par le polypeptide de séquence 2, soit par l'un et l'autre de ces polypeptides.
  • On peut avoir recours, pour réaliser l'oligomérisation, à toute technique de polymérisation couramment utilisée dans le domaine des peptides, cette polymérisation étant conduite jusqu'à l'obtention d'un oligomère ou polymère contenant le nombre de motifs monomères requis pour l'acquisition de l'immunogénicité désirée.
  • Une méthode d'oligomérisation ou de polymérisation du monomère consiste dans la réaction de celui-ci avec un agent de réticulation tel que le glutaraldéhyde.
  • On peut également avoir recours à d'autres méthodes d'oligomérisation ou de couplage, par exemple à celle mettant en jeu des couplages successifs d'unités monomères, par l'intermédiaire de leurs fonctions terminales carboxyle et amine en présence d'agents de couplage homo- ou hétéro- bifonctionnels.
  • On peut également pour la production de molécules comportant un ou plusieurs motifs de 17 acides aminés tels que définis ci-dessus, avoir recours à des techniques du génie génétique mettant en oeuvre des micro-organismes transformés par un acide nucléique déterminé comprenant des séquences nucléotidiques appropriées correspondantes.
  • Les acides nucléiques dècrits dans la demande contiennent une ou plusieurs séquences issues de la séquence de l'ADNc du virus HIV-2 ROD. Ces séquences repérées par la numérotation figurant sur la séquence précédemment décrite, codent pour certains peptides intéressants de l'invention.
    • Séquence codant pour env1 nucléotides 7850 à 7927
    • Séquence codant pour env2 nucléotides 8030 à 8095
    • Séquence codant pour env3 nucléotides 7601 à 7636
    • Séquence codant pour env4 nucléotides 6170 à 6247
    • Séquence codant pour env5 nucléotides 6294 à 6349
    • Séquence codant pour env6 nucléotides 6392 à 6445
    • Séquence codant pour env7 nucléotides 6724 à 6763
    • Séquence codant pour env8 nucléotides 6794 à 6838
    • Séquence codant pour env9 nucléotides 7112 à 7162
    • Séquence codant pour env10 nucléotides 7253 à 7336
    • Séquence codant pour env11 nucléotides 7358 à 7426
    • Séquence codant pour gag1 nucléotides 1535 à 1597
  • les acides nucléiques correspondants du virus SIV décrits contiennent, une ou plusieurs séquences issues de l'ADNc du virus SIV-1. Ces séquences codant pour les peptides env1 à env11 et gag1 peuvent être repérés sur la figure 3 par comparaison avec les séquences correspondantes décrites pour HIV-2.
  • La demande dècrit aussi les acides nucléiques correspondant à des séquences placées en des régions analogues des ADNc dérivés de variants de HIV-2 ROD ou de SIV, ainsi que tous les acides nucléiques dont les modifications vis à vis des précédents résulteraient de la mise à profit de la dégénérescence du code génétique.
  • L'invention concerne encore les conjugués obtenus par couplage covalent des peptides selon l'invention (ou des susdits oligomères) à des molécules porteuses (naturelles ou synthétiques), physiologiquement acceptables et non toxiques, par l'intermédiaire de groupements réactifs complémentaires respectivement portés par la molécule porteuse et le peptide. Des exemples de groupements appropriés sont illustrés dans ce qui suit :
  • A titre d'exemple de molécules porteuses ou supports macromoléculaires entrant dans la constitution des conjugués selon l'invention, on mentionnera des protéines naturelles, telles que l'anatoxine tétanique, l'ovalbulmine, des sérums albumines, des hémocyamines, etc...
  • A titre de support macromoléculaires synthétiques, on mentionnera par exemple des polylysines ou des poly(D-L-alanine)-poly(L-lysine).
  • La littérature mentionne d'autres types de supports macromoléculaires susceptibles d'être utilisés, lesquels présentent en général un poids moléculaire supérieur à 20 000.
  • Pour synthétiser les conjugués selon l'invention, on peut avoir recours à des procédés connus en soi, tels que celui décrit par FRANTZ et ROBERTSON dans Infect. and Immunity, 33, 193-198 (1981), ou celui décrit dans Applied and Environmental Microbiology, (octobre 1981), vol. 42, n° 4, 611-614 par P.E. KAUFFMAN en utilisant le peptide et la molécule porteuse appropriée.
  • Dans la pratique, on utilisera avantageusement comme agent de couplage les composés suivants, cités à titre non limitatif : aldéhyde glutarique, chloroformiate d'éthyle, carbodiimides hydrosolubles [N-éthyl-N'(3-diméthylamino-propyl) carbodiimide, HCl], diisocyanates, bis-diazobenzidine, di- et trichloro-s-triazines, bromures de cyanogène, ainsi que les agents de couplage mentionnés dans Scand. J. Immunol., (1978), vol. 8, p. 7-23 (AVRAMEAS, TERNYNCK, GUESDON).
  • On peut avoir recours à tout procédé de couplage faisant intervenir d'une part une ou plusieurs fonctions réactives du peptide et d'autre part, une ou plusieurs fonctions réactives de molécules supports. Avantageusement, il s'agit des fonctions carboxyle et amine, lesquelles peuvent donner lieu à une réaction de couplage en présence d'un agent de couplage du genre de ceux utilisés dans la synthèse des protéines, par exemple, le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide, le N-hydroxybenzotriazole, etc... On peut encore avoir recours à la glutaraldéhyde, notamment lorsqu'il s'agit de relier entre eux des groupes aminés respectivement portés par le peptide et la molécule support.
  • Les peptides selon l'invention possèdent des propriétés antigéniques. Ils peuvent donc être utilisés dans des procédés de diagnostic pour la détection d'une infection par le virus HIV-2.
  • Comme on l'a déjà mentionné, des études ont permis de distinguer deux groupes de peptides pouvant être mis en oeuvre dans des procédés de détection d'anticorps contre le virus HIV-2 dans un fluide biologique humain, notamment un sérum ou un liquide céphalo-rachidien.
  • Un premier groupe (I) comprend les peptides gag 1. Ces peptides reconnaissent des anticorps anti-HIV-2 et sont donc capables de détecter une infection par HIV-2. Ils reconnaissent également dans une certaine mesure des anticorps anti-HIV-1.
  • Un second groupe (II) comprend des peptides qui correspondent plus particulièrement à ceux qui sont situés dans la partie transmembranaire et dans la fin de la partie externe de la protéine d'enveloppe. Ces peptides sont ceux précédemment désignés par env1, env2 et env3. Ils permettent la reconnaissance spécifique de la présence d'anticorps contre HIV-2 et permettent donc de discriminer chez une personne les infections passées ou présentes dues à un HIV, plus particulièrement entre celles qui ont été provoquées par un HIV-2 et celles qui l'ont été par un HIV-1.
  • L'invention concerne également une composition contenant au moins l'un des susdits peptides ou au moins un oligomère de ce peptide, caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'être reconnue par des sérums d'origine humaine contenant des anticorps contre le virus HIV-2.
  • L'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro un ou des peptides selon l'invention pour la détection d'anticorps contre HIV-2 dans des fluides biologiques, en particulier dans des sérums humains.
  • D'une façon générale le procédé de diagnostic in vitro ci-dessus comprend les étapes suivantes :
    • la mise en contact de ce liquide biologique avec lesdits peptides,
    • la détection de la présence éventuelle d'un complexe peptide-anticorps par des méthodes physiques ou chimiques, dans ledit liquide biologique.
  • Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la détection du complexe antigène-anticorps est réalisée grâce à des tests immunoenzymatiques (du type ELISA), immunofluorescents (du type IFA), radioimmunologiques (du type RIA) ou des tests de radioimmunoprécipitation (du type RIPA).
    Ainsi l'invention concerne également tout peptide selon l'invention marqué à l'aide d'un marqueur adéquat du type enzymatique, fluorescent, radioactif, etc...
  • De telles méthodes comprennent par exemple les étapes suivantes :
    • dépôt de quantités déterminées d'une composition peptidique selon l'invention dans les puits d'une microplaque de titration,
    • introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être diagnostiqué,
    • incubation de la microplaque,
    • rinçages répétés de la microplaque,
    • introduction dans les puits de la microplaque d'anticorps marqués contre des immunoglobulines du sang, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée,
    • détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolysé.
  • L'invention concerne également des coffrets ou kits pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps contre les virus HIV-2 et, dans certains cas, HIV-1 dans un milieu biologique qui comprennent :
    • une composition peptidique selon l'invention,
    • les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique,
    • les réactifs permettant la détection du complexe antigènes-anticorps produit par la réaction immunologique. De tels réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué. Plus particulièrement dans le cas où la composition polypeptidique sus-mentionnée n'est pas marquée.
    • un tissu fluide biologique de référence dépourvu d'anticorps reconnus par la composition polypeptidique sus-mentionnée,
  • L'invention concerne les anticorps eux-mêmes formés contre les peptides de l'invention.
  • Il va de soi que cette production n'est pas limitée aux anticorps polyclonaux.
  • Elle s'applique encore à tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé, par des méthodes classiques, à partir des cellules spléniques d'un animal, notamment de souris ou de rat, immunisés contre l'un des peptides de l'invention, d'une part et des cellules d'une lignée de cellule myélome approprié d'autre part, et d'être sélectionné, par sa capacité à produire des anticorps monoclonaux reconnaissant le peptide initialement mis en oeuvre pour l'immunisation des animaux.
  • L'invention concerne également des compositions immunogènes pour la production de vaccins dont le principe actif est constitué par au moins un peptide selon l'invention, ou un oligomère de ce peptide, ou un peptide sous forme conjuguée avec une molécule porteuse, caractérisées en ce qu'elles induisent la production d'anticorps contre les susdits peptides en quantité suffisante pour aussi inhiber les protéines du rétrovirus HIV-2, voire même le rétrovirus HIV-2 entrant en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
  • Les compositions immunogènes pour la production de vaccins comprennent de façon avantageuse plus particulièrement au moins l'un des peptides précédemment désignés par env4, env5, env6, env7, env8, env9, env10, env11 voir des mélanges de ceux-ci.
  • Parmi ces peptides aptes à constituer des principes actifs de vaccins certains sont particulièrement préférés car ils possèdent une structure de base en acides aminés correspondant à des régions des glycoprotéines d'enveloppe qui présentent un important degré de conservation, non seulement dans les HIV-2, et dans les SIV, mais également dans les HIV-1. Ces peptides particulièrement préférés sont les peptides désignés par env4, certains peptides env5, env6 et env10.
  • Dans un mode de réalisation préféré de l'invention les peptides immunogènes (ou fragments de ces peptides) aptes à constituer des principes actifs de vaccins sont choisis parmi ceux dont les formules correspondent à des séquences qui, dans les glycoprotéines d'enveloppe de HIV-2, SIV et HIV-1 présentant une homologie en acides aminés supérieure à 50%, qui appartiennent à la partie externe de l'enveloppe du virus, qui sont dépourvus ou presque de délétions, et qui renferment des résidus de cystéine favorables à la stabilisation des liaisons et à la constitution de boucles d'ancrage.
  • Les peptides suivants appartiennent à cette catégorie de peptides préférés.
    • env4
      XVTV-YGVP-W--ATZ
    • env5
      XL-NVTE-FZ
    • env6
      XKPCVKL-PLC-Z
    • env7
      XN-S-I-Z
    • env10
      XNC-GEF-YC-Z
    • env11
      XC-I-Q-IZ
  • Des compositions pharmaceutiques avantageuses sont constituées par des solutions, suspensions ou liposomes injectables contenant une dose efficace d'au moins un produit selon l'invention. De préférence, ces solutions, suspensions ou liposomes sont réalisés dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence saline ou glucosée.
  • L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions, solutions ou forme liposome qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarifications.
  • Elle concerne également des compositions pharmaceutiques administrables par d'autres voies, notamment par voie orale.
  • Les compositions pharmaceutiques selon l'invention, utilisables en tant que vaccins pour être efficaces dans la production d'anticorps contre le virus HIV-2, peuvent à titre d'exemple être administrées à des doses situées entre 10 et 500 µg/kg, de peptides selon l'invention, de préférence de 50 à 100 µg/kg.
  • Ces doses sont citées à titre d'exemple et ne possèdent en aucun cas un caractère limitatif.
  • Comme on l'a déjà indiqué plus haut les différents peptides qui ont été définis peuvent comprendre des modifications qui n'ont pas pour effet de modifier de façon fondamentale leurs propriétés immunologiques. Les peptides équivalents qui en résultent entrent dans le champ des revendications qui suivent. A titre d'exemples de peptides équivalents on mentionnera ceux dont les structures en correspondance avec des régions des ADNc d'autres variants de HIV-2 de SIV ou de HIV-1, lorsque ces régions ont été mises en alignement dans des conditions semblables à celles qui ont été évoquées ci-dessus, à propos de HIV-2 ROD, SIV et HIV-1 BRU. A titre d'autres de ces peptides, on mentionnera ceux dont les structures sont en correspondance avec de telles régions dans les ADNc qui ont fait l'objet de dépôts à la CNCM, notamment sous les numéros I-502, I-642 (HIV-2 IRMO), I-643 (HIV-2 EHO) ainsi que, dans les cas appropriés, des variants de HIV-1 qui ont fait l'objet de dépôts à la CNCM sous les numéros I-232, I-240, I-241 I-550, I-551.
  • Les peptides selon l'invention peuvent encore être définis par les formules suivantes (dans lesquels X, Z et les tirets "-" ont les significations sus-indiquées) :
    Figure imgb0004
  • L'invention concerne également outre les peptides de SIV déjà décrits, les protéines codées par l'ADNc du virus SIV. Elle concerne également les protéines de tout virus immunologiquement étroitement apparenté à SIV-1mac, en particulier tout virus dont les protéines et les glycoprotéines d'enveloppe croisent immunologiquement et dont les ADNc présentent un pourcentage d'homologie d'au moins 95% et de préférence d'au moins 98%.
  • En particulier l'invention concerne :
    • 1/ les protéines et glycoprotéines de l'enveloppe codées par le gène env et représentées à la figure 3,
    • 2/ la protéine GAG représentée à la figure 4,
    • 3/ la protéine POL représentée à la figure 5,
    • 4/ la protéine Q représentée à la figure 6,
    • 5/ la protéine R représentée à la figure 7,
    • 6/ la protéine X représentée à la figure 8,
    • 7/ la protéine F représentée à la figure 9,
    • 8/ la protéine TAT représentée à la figure 10,
  • L'invention concerne notamment un peptide reconnaissant des anticorps dirigés contre des protéines de HIV-2 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie des séquences d'acides aminés choisies parmi les séquences suivantes :
    • POLROD ou POLmac représenté à la figure 5
    • QROD ou Qmac représenté à la figure 6
    • RROD ou Rmac représenté à la figure 7
    • XROD ou Xmac représenté à la figure 8
    • FROD ou Fmac représenté à la figure 9
    • TATROD ou TATmac représenté à la figure 10
    • ARTROD ou ARTmac représenté à la figure 11.
  • Les acides aminés des protéines précitées de SIV, ont été représentés en alignement avec les séquences d'acides aminés des protéines correspondantes du virus HIV-2 ; les points verticaux figurant entre les deux séquences correspondent aux acides aminés communs entre les protéines des deux virus.
  • Les séquences d'ADNc codant pour les protéines précitées apparaissent sur la figure 1B. Les séquences nucléiques précitées peuvent être modifièes dès lors que la séquence nucléique modifiée, code également pour les protéines du rétrovirus SIV ou d'un variant.
  • Ces séquences d'ADNc repérées par la numérotation figurant sur les séquences décrites précédemment (figure 1B) sont les suivantes :
    • séquence codant pour GAG, nucléotides 551 à 2068
    • séquence codant pour POL, nucléotides 1726 à 4893
    • séquence codant pour Q, nucléotides 4826 à 5467
    • séquence codant pour X, nucléotides 5298 à 5633
    • séquence codant pour R, nucléotides 5637 à 5939
    • séquence codant pour F, nucléotides 8569 à 9354
    • séquence codant pour TAT-1 nucléotides 5788 à 6084
    • séquence codant pour ART-1 nucléotides 6014 à 6130
    • séquence codant pour TAT-2 nucléotides 8296 à 8391
    • séquence codant pour ART-2 nucléotides 8294 à 8548
    • séquence codant pour ENV nucléotides 6090 à 8732
  • L'invention concerne donc naturellement les protéines précédemment décrites, lorsqu'elles sont obtenues à partir du virus SIV ou lorsqu'elles sont préparées par une méthode de synthèse, notamment par l'une des méthodes déjà citées en rapport avec la synthèse des peptides de plus petite taille.
  • L'invention concerne également l'utilisation des protéines précédentes pour le diagnostic de la présence éventuelle d'anticorps dirigés contre les protéines de HIV-2, voire contre HIV-2 en entier, ou pour certaines d'entre elles l'utilisation aux fins de diagnostic d'une infection due à l'un des virus HIV. Ainsi le peptide GAG codé par le gène correspondant peut être utilisé pour repérer la présence éventuelle d'anticorps anti-HIV-1 ou anti-HIV-2. Les protéines ENV sont utilisées de préférence pour le diagnostic spécifique d'une infection due à HIV-2 ou un de ses variants, parfois pour le diagnostic d'une infection par HIV-2 ou HIV-1.
  • L'invention concerne donc également un procédé de diagnostic in vitro de détection d'anticorps contre HIV-2 et éventuellement contre HIV-1 dans des fluides biologiques et en particulier dans des sérums humains. De tels procédés applicables pour l'utilisation des protéines précédentes de SIV comme protéines de diagnostic, ont déjà été décrits dans la présente invention.
  • L'invention concerne aussi des coffrets ou "kits" pour le diagnostic in vitro de la présence d'anticorps le virus HIV-2 et dans certains cas contre HIV-1 dans un milieu biologique. De tels kits mettant en oeuvre les peptides précédents ont également été décrits dans la présente invention.
  • L'invention concerne également des compositions immunogènes pour la production de vaccins, dont le principe actif est constitué de façon avantageuse par au moins la partie de la protéine ENV du virus SIV, cette protéine pouvant être sous forme conjuguée avec une molécule porteuse. Ces compositions immunogènes induisent la production d'anticorps contre le susdit peptide en quantité suffisante pour inhiber les protéines du rétrovirus HIV-2, voire le rétrovirus HIV-2 lui-même.
  • Toutefois l'utilisation aux fins de diagnostic des protéines de SIV n'est en rien limitée à celle des seuls protéines ENV ou GAG. D'autres protéines parmi celles décrites peuvent être envisagées, pour préparer des compositions de diagnostic voire de vaccin.

Claims (37)

  1. Peptide caractérisé par les propriétés suivantes :
    - il est reconnu par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-2, lesdits anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-2,
    - il contient un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40.
  2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé par les propriétés suivantes :
    - il est reconnu par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-2, lesdits anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-2,
    - il n'est pas reconnu par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-1, lesdits anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-1,
    - il contient un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40.
  3. Peptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0005
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0006
  4. Peptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0007
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0008
  5. Peptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0009
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0010
  6. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0011
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure ou les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0012
  7. Peptide selon la revendication 6 caractérisé par
    Figure imgb0013
  8. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0014
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0015
  9. Peptide selon la revendication 8 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0016
  10. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules :
    Figure imgb0017
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0018
  11. Peptide selon la revendication 10 caractérisé par l'une des structures suivantes :
    Figure imgb0019
  12. Peptide selon la revendication 1 caractérise en ce qu'il contient la structure de base :
    Figure imgb0020
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0021
  13. Peptide selon la revendication 12 caractérisé par l'une des formules suivantes :
    Figure imgb0022
  14. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules suivantes :
    XYC-P-G-A-L-C-N-TZ
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    YCAPPGYALLRC-NDT
    YCAPAGFAILKCNNKT.
  15. Peptide selon la revendication 14 caractérisé par l'une des formules :
    YCAPPGYALLRC-NDT
    YCAPAGFAILKCNNKT
    YCAPAGFAILKCNDKK
    YCAPAGFAILKCRDKK.
  16. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par la formule :
    X------A-C------W--Z
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    NKRPRQAWCWFKG-KWKD
    NERPKQAWCRFGG-NWKE
    N--MRQAHCNISRAKWNA.
  17. Peptide selon la revendication 16 caractérisé par la formule suivante :
    NKRPRQAWCWFKG-KWKD
    NERPKQAWCRFGG-KWKE
    N--MRQAHCNISRAKWNA
    D--IRRAYCTINETEWDK
    I--IGQAHCNISRAQWSK.
  18. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par la formule suivante :
    Figure imgb0023
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0024
  19. Peptide selon la revendication 18 caractérisé par l'une des structures suivantes :
    Figure imgb0025
  20. Peptide selon la revendication 1 caractérisé par l'une des formules suivantes :
    Figure imgb0026
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    Figure imgb0027
  21. Peptide selon la revendication 20 caractérisé par l'une des structures suivantes :
    Figure imgb0028
    Figure imgb0029
  22. Peptide antigénique gag1, caractérisé par l'une des structures de base :
    XDCKLVLKGLGMNPTLEEMLTAZ
    XDCKLVLKGLGTNPTLEEMLTAZ
    dans laquelle X et Z sont des groupements OH ou NH2 ou, dans la mesure où les propriétés immunologiques du peptide dépourvu de ces groupes ne s'en trouvent pas essentiellement modifiées, des groupes comportant de 1 à 5 résidus d'acides aminés, et chacun des tirets correspond à un résidu aminoacyle choisi parmi ceux qui permettent de conserver au peptide sus-défini les propriétés immunologiques de l'une des séquences suivantes :
    DCKLVLKGLGMNPTLEEMLTA
    DCKLVLKGLGTNPTLEEMLTA.
  23. Peptide reconnu par des anticorps dirigés contre des protéines de HIV-2, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie des séquences d'acides aminés choisies parmi les séquences suivantes :
    POLROD ou POLmac représenté à la figure 5
    QROD ou Qmac représenté à la figure 6
    RROD ou Rmac représenté à la figure 7
    XROD ou Xmac représenté à la figure 8
    FROD ou Fmac représenté à la figure 9
    TATROD ou TATmac représenté à la figure 10
    ARTROD ou ARTmac représenté à la figure 11.
  24. Peptide reconnu par des anticorps reconnaissant la glycoprotéine d'enveloppe des virus de la classe HIV-2 caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence d'acides aminés ENV de SIV-1 représentée à la figure 3.
  25. Peptide reconnu par des anticorps reconnaissant la protéine du noyau des virus de la classe HIV-2, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence d'acides aminés GAG de SIV-1 représentée à la figure 4.
  26. Utilisation de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 25 pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, d'une infection par un rétrovirus HIV-2, ou par un rétrovirus HIV-1.
  27. Utilisation de peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans des compositions immunogènes capables d'induire la production d'anticorps contre un rétrovirus HIV-2 ou contre un rétrovirus HIV-1.
  28. Utilisation selon la revendication 26 ou la revendication 27, caractérisée en ce que les peptides répondent à la définition de l'une quelconque des revendications 1 à 25.
  29. Utilisation pour la détection in vitro dans un échantillon biologique, d'une infection par un rétrovirus HIV-2, de peptides ayant les propriétés suivantes :
    - il sont reconnus par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-2, lesdits anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-2,
    - il ne sont pas reconnus par des anticorps présents dans le sérum d'un patient infecté par un rétrovirus humain HIV-1, lesdits anticorps reconnaissant la glycoprotéine majeure d'enveloppe d'un rétrovirus HIV-1,
    - ils contiennent un nombre de résidus d'acides aminés n'excédant pas 40.
  30. Utilisation selon la revendication 29, caractérisée en ce que les peptides répondent à la définition de l'une quelconque des revendications 3 à 5.
  31. Composition antigénique contenant au moins un peptide gag selon la revendication 25 ou gag1 selon la revendication 22 ou au moins un oligomère de ce peptide, caractérisée en ce qu'elle a la capacité d'être reconnue par des fluides biologiques d'origine humaine, notamment des sérums contenant des anticorps anti-HIV-2 et dans une certaine mesure des anticorps anti-HIV-1.
  32. Composition antigénique contenant un peptide env selon la revendication 24 ou au moins un peptide selon les revendications 2, 3, 4 ou 5 ou au moins un oligomère de ce peptide, caractérisée en ce qu'elle reconnait spécifiquement la présence d'anticorps contre HIV-2.
  33. Composition immunogène contenant tout ou partie du peptide env selon la revendication 24 ou au moins un peptide selon les revendications 1, 6 à 21 ou au moins un oligomère de ce peptide ou ce peptide sous forme conjuguée avec une molécule porteuse, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable pour la production de vaccins, caractérisée en ce qu'elle induit la production d'anticorps contre les susdits peptides en quantité suffisante pour inhiber efficacement les protéines du rétrovirus HIV-2, voire même le rétrovirus HIV-2 entier.
  34. Composition immunogène selon la revendication 33, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un peptide ou au moins un oligomère de ce peptide ou ce peptide sous forme conjuguée avec une molécule porteuse, choisi parmi env4, env5, env6 et env10.
  35. Procédé de diagnostic in vitro de l'infection par HIV-2 dans un liquide biologique comprenant :
    - la mise en contact de ce liquide biologique avec au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 5 ou 22 ou un conjugué de ces peptides avec une molécule porteuse, ou des peptides env ou gag selon les revendications 24 ou 25,
    - la détection de la présence éventuelle d'un complexe antigène-anticorps par des méthodes physiques ou chimiques, dans ledit liquide biologique.
  36. Procédé de diagnostic in vitro de l'infection par HIV-2 dans un liquide biologique selon la revendication 35, caractérisé en ce que la détection du complexe antigène-anticorps éventuellement formé est réalisée grâce à des tests immunoenzymatiques (du type ELISA) immunofluorescents (du type IFA) radioimmunologiques (du type RIA) ou des tests de radioimmunoprécipitation (du type RIPA).
  37. Kit pour le diagnostic in vitro de l'infection par HIV-2 dans un liquide biologique caractérisé en ce qu'il comprend :
    - une composition peptidique contenant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou 22 ou un mélange de ces peptides, ou un conjugué de ces peptides avec une molécule porteuse, ou des peptides env ou gag selon la revendication 24 ou 25,
    - un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation d'une réaction immunologique,
    - un ou plusieurs réactifs éventuellement marqué pour la détection du complexe antigène-anticorps formé par la réaction immunologique,
    - un liquide biologique de référence dépourvu d'anticorps reconnus par la susdite composition peptidique.
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