JPH02464A - 酵母ａｒｇ３調節域含有ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は組換型ＤＮＡ技法を用いることによる酵１ａｒ
ｇ３１節域を含有するベクターおよびその製法に関する
。

発明の背景 肝炎Ｂ型ウィルス（）！ＢＶ）による感染症は重く、広
ｆ２囲にわたる健康上の問題である。感染症は急性また
は慢性の様相で発現する。米国における急性肝炎の症例
敢は少なくとも１年につき１０万件であり、致死率が１
〜２％と見積られている。米国においては、健常成人中
の慢性保菌者の蔓延率は年令、社会的階級により、０，
１〜１％の間で変化している。南アメリカでは、慢性保
菌者の蔓延率は約１〜３％、ソ連および南ヨーロッパで
は、約３〜６％、アジアおよびアフリカでは１０５以上
である。

発達１．た国々では、血液を取扱う医療部署のｗ名′お
よび要［１、軍要員、慢性保菌δ′の配偶台、高１−（
Ｉ３　Ｖ風土地域への旅行者、慢性保菌前の新生児、ホ
モセノクスの人、売存婦および麻薬常用者のようなウィ
ルス接触の高い危険性のある人々のためのワクチンの要
求がｒｔ在する。第三世界の国々においては大衆免疫付
与のための安価なワクチンの要求が存在する。大衆免疫
付与計画は急性肝炎の発生や慢性保菌前が留ることに究
極的に影響するばかりでなく、慢性活性肝炎および肝細
胞癌の罹単離できるゾーン（Ｄａｎｅ）粒子は約４２ｎ
ａの径を何する。古々、肝炎Ｂ型表面抗原（Ｉ（Ｂｓ、
Ａｇ）からなる外皮、キャプシド（ＨＢｃＡｇ）、内生
ポリメラーゼおよびＩ）　Ｎ　Ａゲノムから構成されて
いる。該ゲノムは環状で、約２００の塩基からなる１本
鎖域をａする２本鎖である。該１本鎖域はｉｎ　ｖｉｔ
ｒ。

て該内生ポリメラーゼの作用によって詰込み（ｆｉｌｌ
　　ｉｎ）を行なうことができろ。より長い鎖は約：（
２００の塩基を含ａする。

組織培養中でＨＢ　Ｖを増殖させるのが困難であること
が示されており、また、唯一公知の宿主がヒトであるた
め、従来、Ｉ−１１１３Ｖワクチンを製造することは困
難であった６感染したヒトから少量のＩｆ　ｎ　Ｖ抗原
標品が単離されている。エフ・デイ・シイ・レボーツ（
Ｆ−Ｄ−ＣＲｅｐｏｒｔｓ、ｐｐ、３〜４Ｊｕｌｙｌ　
９．　　Ｉ　９８２）には最近開発されたＢ型肝炎ワク
チンの臨床研究の報文が掲載されている。

バレンツエラら［Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅＬ　ａｔ、
、　ＮａＬｕｒｅ。

Ｖｏｌ、２９８，３４７〜３５０（＋　９８２）］は表
現ベクターを用いた酵母におけるＨｒ３ｓＡｇの合成を
報告しており、それでは該１（ＢｓＡ４コード付け配列
か８３５ｂｐのＴ　ａｑｌ　−ｔｌ　ｐａｌフラグメン
トで、プロモーターが該酵母アルコール・デヒドロゲナ
ーゼｌ　プロモーターである。この文献より以前にいく
つかの簡単な研究報文がある。これらは、酵ｌ（アルコ
ール・デヒドロゲナーゼ・プロモーター域に結紮されて
いるＨＢｓＡｇに類似した蛋白をフードする配列を含む
ＤＮＡフラグメントの酵母にお（ｔろ表現を報告（７て
いるバレンツェラらの報文１Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　　
ｅｔ　　ａｔ、、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ。

Ｅｘｐ、　（Ｃｈｉｌｅ）、　Ｖｏｌ、　　ｌ　４（１
）、　２１〜２２（１９８１）］、ビイ・バレンツェラ
およびダブリユウ・ノエイ・ル、ツタ−（Ｐ、　Ｖ　ａ
ｌｅｎｚｕｅｌａ　　ａｎｄ　　ＷＪ　、　Ｒｕｔｔｅ
ｒ）を含む米国の研究チームが酵母における［゛蛋白−
彼膜周囲叶炎Ｂ型ウィルス」の産生を発表したと報じて
いるスフリップ中の報告［Ｓ　ｃｒｉＰ　　Ｎｏ、Ｇ　
ｌ　６．　ｐ、Ｉ４（Ａｕｇ、　　ｌ　２．　１９８１
）］およびダブリユウ・ジェイ・ルブター（Ｗ、Ｊ。

１１ｕｔｔｅｒ）が酵母細胞におけるグリコツル化Ｈ１
ｓｓＡｇの表現を報告したと報じているツカ−マンの報
文［Ｚｕｃｋｅｒｍｑｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、　
２９５．９８〜９９（１９８２月である。

Ｉｉ　ＩＩ　ｓ　Ａ　ｇのようなＨＪ３Ｖの抗原性成分
は該抗原をコード４°る遺伝子を含む組換型１）　Ｎ　
Ａ分子を挿入した細菌中で製造さｆｌてさた。バーレル
ら［Ｒｕｒｒｅｌｌ　　ｅＬ　　ａｔ、、　　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　　Ｖｏｌ、　　２７９．　　Ｎｏ。

５７０８．４３〜＝ｉ　７（１９７９）］はプラスミド
ｐＢＲ３２２中でクローンしたＨ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　
Ａ配列のイー・クリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＨＲＩ　０１株
における表現を報告している。

ヨーロッパ特許出願第１３８２８号において、マレ−ら
（Ｍｕｒｒａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、）は、イー・コリｆ
（Ｂ１０１株において、ＨＢｓＡｇを含めて、ＨＵＶ抗
京をコードできる組換型ベクターの製造を開示している
。このベクターはゾーン粒子ＤＮＡおよびプラスミドｐ
Ｂｒｔ３２２から製造される。マレ−らは、ａ用な宿主
には他の細菌宿主、酵母および他の真菌、動物または植
物細胞およびその他の宿主が包含されうろと述べている
が、示されている唯一の宿主はイー・コリである。

ヂャーネイら［Ｃｈａｒｎｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
Ｎａｔｕｒｅ。

Ｖｏｌ、　　　２８６．　８９３〜８９５（１９８０）
コはβガラクトシダーゼ遺伝子と該ＨＪ３ｓＡｇ構造遺
伝子の融合物を１丁するバクチリオフ７−ノの構造を報
告している。該バクチリオフ７−ノはＨＩ３ｓＡｇおよ
びβ−ガラクトシダーゼ両方の抗原性決定子からなる融
合蛋白の合成を命令する。

英国特許出願第２０３４３２３号において、チオライス
ら（Ｔ　１ｏｌｌａｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ）はＨＢＶ　
　ＤＮＡを含有するコリファージの製造を開示している
。

融合ファージ−ＨＢＶ　　ＤＮＡがイー・コリＣ６００
株中に形質転換されている。

最初にＰＣＴ出願ＷＯ３１１００５７７号として公開さ
れた英国特許出願第２０７０６２１号には、ＨＢｓＡｇ
遺伝子の一部、プロモーターおよびラクトース・オペロ
ンのＺ遺伝子からなり、イー・コリ中でクローンできる
プラスミドが開示されている。

ヨーロッパ特許出願第２０２５１号においてルッターら
（Ｒｕｔｔｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ）はプラスミドｐＢ１
１３２２およびＩ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡのＢａｍ
ＨＩフラグメントからなり、イー・コリの形質転換に使
用できる組換型ベクターを包含する組換型ベクターを開
示している。ＨＢＶ　　ＤＮＡのＢａｍＨｒフラグメン
トおよびトリプトファン・オペロンの一部からなる他の
ベクターがイー・コリＨＩ３１０１株における表現を得
るために使用された。

エドマンら［Ｅｄｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　Ｖｏｌ。

２９１、Ｎｏ、５８１５．５０３〜５０６（＋　９８１
）１はトリプトファン・オペロン調節域の調節の下、イ
ー・コリにおいてＨＢｃＡｇおよびβ−ラクタマーゼＩ
（Ｂｓ八へ融合蛋白の合成を命令するプラスミドの構造
を記載している。

１−１１’３　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａの細菌中への挿入を開
示した他の文献にはチャーネイらの文献［Ｃｈａｒｎａ
ｙ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｐｒｏｇ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、、　Ｖｏｌ、　２
７　、８８〜９２（＋９８１）］、？ッケイらの文献［
Ｍａｃｋａｙ　ｅＬ　ａｔ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
　Ｓ、、　Ｖｏｌ、　　７８、Ｎｏ、７，４５１（１−
４５１４（１９８１月、フリッチェら［Ｆｒ１ｔｓｃｈ
　　ｅＬ　　ａｌ、、　Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、２８７．Ｎｏ、１６，１４５３（１
９７８）］、英国特許明細書第２０３４３２３号（Ｄｅ
ｒｗｅｎｔ　　Ｎｏ、４６８７４　Ｃ）およびパセクら
の文献［Ｐａ５ｅｋ　　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ
、　Ｖｏｌ、２８２．Ｎｏ。

６．５７５（１９７９月が包含される。

ＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａは哺乳動物細胞中でらクローン
されている。これらには、ヒト、マウスおよびヒト肝癌
細胞系が包含される。例えば、デュボイスら［Ｄｕｂｏ
ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、、　Ｖｏｌ、　７７．　Ｎｏ、８．４５４９−
４５５３（１９８０）］はマウス細胞のＨＢＶゲノム含
有プラスミドによる形質転換お上びＨＢｓＡｇの表現を
報告している。ヒルシュマンら［Ｈｉｒｓｃｈａａｎｅ
ｔ　　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、。

Ｖｏｌ、７７、Ｎｏ、９．５５０７〜５５１１（１９８
０）］はＩＩ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａで形質転換させた
Ｉ−１ｅ　Ｌ　ａ細胞によるＨ　Ｂ　Ｖ　＋、１１粒子
の産生を報告している。

ヒト血液からのＨＢｓＡｇを用いるＩ（Ｂ　Ｖワクチン
の製造法がフナコシら［Ｆｕｎａｋａｓｈｊ　　ｅｔ　
　ａｌ、。

Ｐｒｏｇ、　Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、、　Ｖｏｌ、２７
　、　１６３〜１６７（１９８１）］およびママウスら
［Ｍａｕｐａｓ　　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｇ、　Ｍｅｄ
、　Ｖｉｒｏｌ、、　Ｖｏｌ、２７　、　１８５〜２０
１（１９８１）］により報告されている。フナコシらに
よって製造されたワクチンは４０μ２の精製したホルマ
リン処理ＨＢｓＡｇ、リン酸塩、塩化ナトリウム、２０
ｆｆ９のマンニトールおよびアジュバントとして０．１
％の水酸化アルミニウムを含Ｈする後者の報文において
、マウパスらはワクチンの！投与１が２〜１０μｇ／Ｒ
ρの蛋白［（７−リー（Ｌ　ｏｗｒｙ）法］および０．
１％の水酸化アルミニウムを含有する精製したホルマリ
ン処理１（ＢｓＡｇｌｘ９であると報告している。マウ
バスらによって報告された研究で用いた方法では１ケ月
間隔で３回注射し、１年後に１回ブースターを要求して
おり、マウパスらは３ケ月間隔で２回Ｑ　Ｅ（Ｂ　ｓ　
Ａ　ｇの注射を提案している。

ＩＩ　Ｂ　Ｖワクチン製造についての他の文献にはヘパ
ヂティスＢワクチンＩＮＳＥｒｔＭシンポジウム（Ｈｃ
ｐａＬｉｔｉｓ　　Ｂ　　Ｖａｃｃｉｎｅ　　ＩＮＳＥ
ＲＭＳ　ｙｍｐｏａｉｕｍ　　Ｎｏ、　ｌ　８、ｅｄｉ
ｔ、　ｂｙ　　Ｍａｕｐａｓ　　ａｎｄＧ　ｕｅｓｒｙ
、　１９８１　、　Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ／　Ｎｏｒｔｈ
　−Ｈｏ１ｌａｎｄＢ　ｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｐ　ｒ
ｅｓｓ、）の、各々、３．３７および５７頁のマウパス
ら、アダモビッツら（Ａｄａｔａｏｗｒｃｚ　　ｅＬ　
　ａｌ）およびフナコンらのものが包含される。

酵１（上は他のある種のＤ　Ｎ　Ａ配ツリの宿主生物と
１゜て使用されている。例えば、英国特許出願第２０６
８９６９号において、フレーザーら（ＰｒａｓｅｒｅＬ
　　ａｌ）は酵母におけるニワトリ・オバルブミンの製
造を開示している。スフ９１１６４０号Ｆ！＞ｃｒｉｐ
　　　Ｎｏ、６４　０．　　ｐｉ　　Ｉ（Ｎｏｖ、　　
　４．　　１　９　８　１）コはあるタイプのインター
フェロンが酵［；上申で製造される旨の報告を包含して
いる。ヨーロッパ特許第１１５６２号（Ｄｅｒｗｅｎｔ
　　Ｈａ、３８７６２Ｃ）では、２μプラスミド中にｕ
ｒａ　３″″酵１ｉ）遺伝子を含有する・１イブリブド
酵母プラスミドが報告されている。

発明の概要 本発明は、ＨＢｓＡｇ配列のようなコード付け配ηり挿
入のたｙ）のａｒｇ３ｉ１１節域およびそれに隣接する
制限部位を有し、該コード付け配ダリの表現によって合
成された蛋白が異質アミノ酸残基を欠くようになるベク
ターおよびその製法に関する。

本発明のベクターは、ＨＢｓＡｇをコードするヌクレオ
チド配列を含有する組換型ＤＮＡ分子により酵母を杉質
転換するのにＩｉ用である。該酵母により産生されるＩ
ｌｒ３ｓＡｇはワクチンの製造にｆｉ−用であり、ヒト
におけろ１目３Ｖ感染に対する保護惹起に用いられる。

図面の概要 ｒも付図菌中、第１図はｐＲＩＴ１０６０１の制限」−
ンドヌクレアーゼ開裂地図である。

第２図はｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６０６の制限エンドヌクレ
アーゼ開裂地図である。

第３図はｐＭＣ２００の制限エンドヌクレアーセ開裂地
図である。

第・１図はｐＭＣ２００におけろ３３００　ｂｐＨ１ｎ
ｄ１■酵ｆ’ｌ　ｌ）　Ｎ　Ａ挿入物の一部分のヌクレ
オチド配列で、この部分にはＩＩ　ｉｎｃ　１１１１３
ｇ１１１およびＥｃｏｌｊ１部位が含まれている。

第５図はｐＲＩ’ｌ’＋０６７１およびｐＲＩＴ１０６
７３の製造を示すフローシートである。

第６図はｐＲＩＴＩ０７４９の製造を示すフローシート
である。

第７図ｉ、ｔｐＲＩＴＩ０７６１およびｐＨ！Ｔｌ０７
６４の製造を示すフローシートである。

魚吸例耗帆 本発明のベクターによる組換型ＤＮＡ分子は、１−ｌＢ
ｓＡｇ用の構造遺伝子を含むヌクレオチド配列を酸１号
において該ＨＢｓＡｇ配列の転写を命令でき、それによ
り、その表現が行なうことのできる酵母ａｒｇ３！１１
節域と融合させることにより製造される。

本明細書において、［組換型ＤＮＡ分子１なる語は該Ｊ
（ＢｓＡｇコード付け配クリおよび該調節域を含ａする
Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントならびにプラスミドまたは−７
７−〕・ベクターのような該フラグメントを含む他のＤ
ＮＡ分子をき味する。

［調節域−１なる語はプロモーター域および転写に必要
な他の配列を含む配９すを色味する。該酵ＩＱａｒｇ３
凋節域は、それがＨＢｓＡｇコード付け配列表現用の強
力なプロモーターとなることができるので、特に（Ｋ　
１１１である。

ｒＨＢｓＡｇＪなろ語は構造的にＨＢｓＡｇ標品と同し
であるか、ＨｎｓＡｇ漂品と実質的に同じ抗原性決定子
をａする蛋白、士なわら、ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇｔ？’、品
を特異的に認識し、それと反応する抗体の生成を惹起オ
ることかでさろか、抗ＨＢｓＡｇ抗体によって特異的に
認識される蛋白をき味する。

該１［３ｓＡｇコード付け配クリは、感染したヒト血清
中のゾーン粒子より抽出しノーＤ　Ｎ　Ａから、Ｉ）Ｎ
Ａポリメラーゼ、好ましくは、内生ポリメラーゼで１本
鎖域に詰込み、ついで、制限エンドヌクレアーゼで消化
オることにより単離できる。エンドヌクレアーゼの選択
は、部分的に、実際に用いるゾーン粒子に依σする。例
えば、後記の実施例で示１゛ように、ａｄｓ抗原型のあ
る種のゾーン粒子のＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡのＨＢｓＡ
ｇコード付け配列は午−のＩ’３ａｍ）ｉ　ｌフラグメ
ント上で単離でさ、ａｙＷ抗原型のある種のゾーン粒子
のＨｒ３　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡのＨＩ３ｓＡｇコード付け
配列はＬｌｈａｌフラグメントｌ−で単離で、きる。同
じ抗原型のゾーン粒子のＨＩ３ＶＤＮＡが制限部位の−
がなったパターンを示すことらある。

１）　Ｎ　Ａ　−ｙ−ｙグメントを製造するためのＩ）
　ｉＮ　ＡＯ制）恨、組換型Ｄ　Ｎ　Ａ分子製造のため
のかかるフラグメントの結紮および微生物への挿入は前
記の、また、後記する文献に開示されている技法のよう
な、公知の技法によって行なわれる。条件はＤＮＡおよ
び酵素の変性をさけるように選択する。例えば、ｐＨは
約７．０〜１１．０に保持するように緩衝され、温度は
約６０℃以下に保つ。好ましくは、制限は約３０〜４０
℃で行ない、結紮は約０〜１０℃で行なう。本発明の実
施に用いる制限酵素およびリガーゼは商業的に人手でき
、それに付されている指示に従って使用すべきである。

Ｔ４ＤＮＡリガーゼが好ましいりガーゼである。

調節域へのＨＢｓＡｇ配列の融合は後記の実施例に示す
ような中間ベクターの使用によって行なうことができる
。別法として、ＨＢｓＡｇ配列は、調節域を含むベクタ
ー中に直接挿入することができる。ベクターは本発明の
ＤＮＡフラグメントを担持し、保持できるＤＮＡで、例
えば、ファージやプラスミドを包含する。、ファージ中
でＤＮＡフラグメントをクローンする技法は、例えば、
チャーネーら［Ｃｈａｒｎａｙ　　ｅｔ　　ａｌ、、　
Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏ１２８６．８９３〜８９５（１９８
０月および英国特許出願第２０３４３２３号（Ｔ　ｉｏ
ｌ　Ｉａｉｓ）によって開示されている。好ましくは、
ＨＢｓＡｇ配列は調節域に対して、ＨＢｓＡｇ配列の表
現によって合成された［−１ＢｓＡｇか異質アミノ酸残
基を持たないように位置させる。

特に有用であることが判明している調節域は、オルニチ
ン・カルバモイルトランスフェラーゼ（Ｏｃ　’ｒ　）
をコードする酵母ａｒｇ３遺伝子から由来する乙のであ
る。このａｒｇ３ｉ節域の使用は、その作用が特異的お
よび一般的調節機構の両方に支配されるので有利である
。クラビールら［Ｃｒａｂｅｅｌ　ｅｔａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、
Ａ、。

Ｖｏｌ、７８．５０２６（Ｉ　９８１月によって報告さ
れているように、これはプラスミドｐＹｅｕｒａ３ａｒ
ｇ３にで、イー・コリ中でクローンされている。

好ましい宿主は、アルギニン生合成経路が抑制解除され
たサツカロミセス・セレビシアエ株、例えば、Ｉｃ１６
９７ｄ株である。かかる菌株の使用は、実施例で用いた
他の菌株、ＤＣ５株と比較して、ａｒｇ３プロモーター
からの表現増加をらたら仕る。

融合ＤＮＡフラグメントを酵母中にクローンするための
好ましいベクターはプラスミドＹＥｐ１３で、これはイ
ー・コリおよびサツカロミセス・セレビシアエの両方に
おいて復製、維持することができ、それ故、シャトル・
ベクターとして知られている。数種の他の酵母ベクター
が知られており、利用できる。ＨＢｓＡｇおよび調節域
は、順次あるいは、後記の実施例に示すように同時に酵
母中に挿入できる。プラスミド・ベクターによる形質転
換は、通常、ＤＮＡ分子をプラスミドとして取込むこと
となる。しかし、組換現象のような池の反応では該ＤＮ
Ａ分子の染色体ＤＮＡ中への取込みとすることらできる
。

得られた酵母によって製造されたＨＢｓＡｇと、適当な
担体からなるヒトにおけるＨ　Ｂ　Ｖ感染に対する保護
を惹起するワクチンは公知の技法によって製造すること
ができる。水酸化アルミニウムのようなアジュバントを
使用することが望ましい。

また、得られたＩ−ＩＢｓＡ＋４を他の免疫原と組合せ
て複合ワクチンを製造することもできる。該ＨＢＶまた
は複合ワクチンは、例えば、皮下、静脈内または筋肉的
経路で投与できる。得られたＤＮＡフラグメントおよび
それによって製造された）［Ｂ　ｓＡｇはまた、ＤＮＡ
ハイブリッド形成技法および種々のイムノアツセイによ
る生物試料中のＨＢ　Ｖ検出用の探針としても用いるこ
とができる。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例中、％は、特に断らない限り重量％を意味する。

実施例Ｉ ＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡをＰＩ３Ｒ３２２と組合わせる
ことによる中間プラスミドｐＨＴｌ０６０１の調製 ａｙｗ抗原型のＨＢｓＡｇ陽性血清に、０．２８％の最
終濃度になるようにＣａ　Ｃｌ　ｔを加えて脱繊維化し
、５Ｗ２７０−ター中、１０１Ｍトロメタミン１１　Ｃ
Ｉ、ＩＭＮａＣｌおよびＩｍＭ　　ＥＤＴＡを含む緩衝
液（ｐＨ７、５）中で調製Ｉ、たｌＯ〜２０％シヨ糖ダ
レノエント上、２７００　Ｏｒ、ｐ、ｍで２時間で遠心
分離する。ゾーン粒子を含む透明１１ベレツトを同じ緩
衝液中に再懸濁させ、６５％ノヨ糖クツションに用層さ
せた緩衝２０％ンタ糖上で遠心分離する。該ケッション
界面での乳白光バンドを回収し、同様な２０〜６５％ダ
レジエント上、２０００００ＸＧで４時間遠心分＃ｉ１
２、ゾーン粒子をペレツト化する。

Ａ、該ゾーン粒子を、５０ｍＭ）ロメタミン１（Ｃ１、
Ｉ　ＯｓＭ　ＭｇＣ１，，５００ｍＭ　Ｎａ１ｌ、０５
ｍＭジ千オドライトール、３５ｔ）＋ＭのｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰならびに８μＭ”Ｐ−ｄＴＴ　
Ｐ　（３５０Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を含存する反応混合液
（ｐＨ８，０）に再＠渇させ、該再＠濁粒子を３７℃で
５時間インキュベートすることにより内生［）ＮＡポリ
メラーゼを用いてゾーン粒子内のＩ目３Ｖゲノムの１本
鎖域を修復する。該再懸濁液を１０偽Ｍトロメタミンー
ＨＣｌ、Ｉ　（ｌａＭ　ＥＤＴＡ、１００ａＭ１００ａ
のおよび０．０２％ドデンル硫酸ナトリウムを歯付する
緩衝液（ｐＨ７，５）で希釈してｐｔｉ　７　、５とし
、３７℃にて１時間プロナーゼ０２５５ｇ／ａｆ！とｊ
（Ｈ（こ（／キコベー１・乙、ついで、フェノール抽出
およびエフノール沈澱を行なう。

１（ａａ＋ＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる該１）
ＮＡの消化は、アガロースゲル電気泳動および該ゲルの
オートラノオグラフィーによって判定されるように、約
１４５０ｂｐおよび１６００ｂｐのサイズを（ｒ−４−
る放射活性フラグメントを産生ずる。

ＩＩ　　ゾーン粒子ＤＮＡ的３０ｎｇを、標識していな
いｄＴ１’Ｐの存在下、内生１）　Ｎ　Ａポリメラーゼ
を用いて修復し、前記と同様にして抽出、回収−４゛る
。該１）　Ｎ　Ａを、あらかしめＩ３ａｍＨＩ３ａエン
ドヌクレアーゼてｌｌ’ｉ化し、アルカリ性ホスファタ
ーゼで処理したｌｏＯｎｇのプラスミドｐ［（３２２と
混合する。プラスミド１１１８１３２２は組換型ＤＮＡ
法に通常用いられるしので、入手の制限なしにアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　　　Ｔｙｐｅ　　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託番号３７０１７として寄託され
ている。該混合液をフェノールで抽出し、エタノールで
沈澱させ、遠心分離し、乾燥させて、５０！１Ｍトロメ
タミンーＨＣｌ、ｌ　ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　　１０　
ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、１０ｍＭジチオ：・ライトール、５
０μｙ／ｗＱゼラチンおよび２単位／ｘ（！Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを含存する混合液１２ｕ１２（ｐＨ７，５）に
再懸濁させる。該懸濁液を１０℃で４時間インキュベー
トし、ついで水上で１８時間保持する。

結紮したＤＮＡ混合物は、ニーヘンら［Ｃｏｈｅｎｅｔ
　　ａｌ、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ｔＪ、５Ｖｏ１．６９．２１１０．（１９７
２月の方法に従ってａｔｔしたイー・コリに１２株Ｃ６
００のコンピテント細胞を１５貫転換するのに用いられ
る。形質転換体をアンピシリン２００μｇ／ｘＱを含打
する固体培地上で選択する。単離したフロニーについて
、ｐＢＲ３２２のＨａｔａｌ１１部位への５’！Ｆｒｊ
ＤＮＡ７ラグメント挿入を示すテトラサイクリン耐性の
欠失をスクリーニングする。このような形質転換体クロ
ーンの１つがプラスミドｐＲＩＴＩ０６０１を含ａオる
ことが判明Ｉ７、これはＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ
による消化によ・・て４３６０ｂｐのｐＢＲ３２２フラ
グメントならびに１６０ｆ）ｂｐおよびｌ　４５０ｂｐ
のｉ（Ｌ３Ｖ　　ＤＮＡ７ラゲメントを与えることが判
明した。イー・コリＫ１２昧Ｃ６００（ｐＲＩｒ１０６
０１）培滲物は欧州特許条約（Ｅ１’Ｃ）Ｊ’；よびブ
グベスト条約に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（アメリカ会衆【刈メリイランド州、ロ
ックビル）に１９８２Ｓ１ミロ月２１１付で寄託番号Ａ
ＴＣＣ３９１３２として寄託されている。プラスミドｐ
ＲＩ　Ｔ　ｌ　ＯＧ　Ｏ！のｉ、Ｉ＋限上エンドヌクレ
アーゼ開裂地図第１図に示す。

０　種々の制限酵素によるゾーン粒子１）　Ｎ　Ａおよ
びｐＴＮ　Ｉ　’ｌ”　ｌ　０６０１の消化によって生
じるフラグメントのサイズをつぎのとおり比較した。デ
ー〉粒子・ＤＮＡ、４−なわち、Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ
　Ｎ　Ａを前記の内生ポリメラーゼ反応Ｊ、二より、ま
たは精製ＤＮＡをイー・コリ由来のｌ）　Ｎ　Ａポリメ
ラーゼｌで処理−４゛ることによって３２１）で標識す
る。標識されたＩＩ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡをｐＲＩＴ
Ｉ０６０１と混合し、該１’ｉＬ合物を制限エツトヌク
レアーゼで処理し、アカ（ノースゲル１−て、Ｕ気泳動
にかける。該ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線光
下で写真撮影してＤＮＡフラグメントの位置づけをし、
ついで、乾燥してオートラジオグラフィーにかけ、放射
活性１−Ｉ　ＢＶ　　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントの位置づ
けをする。

つぎの標識されたＨＢＶフラグメントがｐｒＬＩＴ＋０
６０１フラグメントのサイズに正確に一致することが判
明した：Ｉ４５０および＋６００ｂｐＢａｍＨＩフラグ
メント；　　Ｉ　３３０ｂｐ　Ｉ（ｐａｌフラグメント
：およびＩ　Ｉ　３０ｂｐ　　Ｂａ＋ａｌ−Ｉ　Ｉ　−
Ｘｈｏｌフラグメント。標識されたゾーン粒子ＤＮＡは
また、サザーン［５ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｊ　、　Ｍｏ
ｌ、　Ｂｉｏｌ、。

Ｖｏｌ、　　９８．　５０３（１９７５）］の技法によ
り、アガロースゲルからニトロセルロース・フィルター
上に移した後、ｐＲＩＴＩ０６０１の［３ａｉＨＩ消化
によって遊離される＋４５０および１６００ｂｐの両方
のフラグメントと特異的にハイブリッド形成する。

これらの結果は、ｐＲＩＴ１０６０１上のクローンされ
たＤＮＡ挿入物がＨＢＶゲノムに相当し、ｐＲＩＴ＋０
６０１上での２つのＢａｌｌｌ１（Ｉフラグメントの相
対的な方向が該ピリオンにおけると同しであることを示
している。ｐＲｆＴ１０６０１は後記の実施例１０にお
いてｐＲＩＴ１０６７１をユリ製するのに使われる。

実施例２ ＋１ｒ３Ｖ　　ＤＮＡをｐＡｃＹｃ１８４と組合わせる
ことによる中間プラスミド、ｐＲＩ７１０６１６の調製 ゾーン粒子を前記と同様にａｄｗ抗原型のＨＢｓＡｇ陽
性血清から単離する。２１ｐで標識されたＨＢＶ　　Ｄ
ＮＡの制限エンドヌクレアーゼ分析は該ＤＮΔカ月つの
ＥｃｏＲ１部位を含んでいることを示した。

標識されていないヌクレオチドと用いる内生ポリメラー
ゼ反応によって詰込んだＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃ
ｏＲｌで消化する。この制限ＤＮＡを、あらかじめＥｃ
ｏＲＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した
プラスミドｐＡｃＹｃ１８４と混合する。プラスミドｐ
ＡｃＹｃ１８４は、人手の制限なしにアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションに寄託番号３７０３３と
して寄託されている。該混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで
結紮する。

この結紮ＤＮＡ混合物をイー・コリＫ１２株Ｃ６００の
コンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形質転換
体をテトラサイクリン（１５μ９／Ｘａ）寒天培地上で
選択し、ｐＡｃＹｃ１８４のＥｃ。

Ｒ１部位における挿入を示すクロラムフェニコール耐性
の欠失についてスクリーニングする。形質転換コロニー
は、該ＨＢＶ　　ＤＮＡからなる３２ｏｏｂｐ挿入物を
ＥｃｏＲ１部位に存するｌ）Ａ　ＣＹ　Ｃ１８４からな
るプラスミドｐＲＩＴ１０６１６を含ｎすることが判明
した。ｐＲＩＴ１０６１６の制限地図を第２図に示す。

イー・コリＫ１２株Ｃ６００（ｐＲ［Ｔｌ０６１６）は
ヨーロッパ特許条約およびブタベスト条約に従いアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９８２年
６月２日付で寄託番号ＡＴＣＣ３９１３１として寄託さ
れている。

実施例３ ｐｌｔｌＴ１０６１６をｐＢＲ３１３と組合わせること
による、ＨＢｓ　Ａ　ｇをコードするヌクレオチド配列
を自存する中間プラスミド、ｐＲＩＴ１０６４０の調製 ｐｆｌｌＴ＋０６１６をカーノら［Ｋａｈｎ　　ｅｔ、
　ａｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｎｏｌｏｇｙ、　
　Ｖｏｌ、　６８．２６８、（１９７９）］の記載に実
質的に従いＣｓＣｌ−臭化エヂジウム密度グレジエント
遠心分離法により精製ケる。

該ＤＮＡをＢａ＋ｓＨＩａｌドヌクレアーゼで消化し、
プラスミドｐ［３Ｒ３１３のＢａ１Ｈ［消化、アルカリ
性ホスファターゼ処理ＤＮＡと混合し、欠字し、実施例
１の記載と実質的に同様にしてイー・コリＫ１２株Ｃ６
００のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。プ
ラスミドｐＢＲ３１３は、人手の制限なしにアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクツタンに寄託番号３７０
１８として寄託されている。

形質転換体をアンピシリン含仔寒天培地上で選択し、ｐ
ＢＲ３１３のＢａｎＨ１部位における挿入を示すテトラ
サイクリン耐性の欠失についてスクリーニングする。杉
質転ｔａコロニーは、Ｅａｍｌ目部位１こ１３５０ｂｐ
挿入物を白゛するｐＢ［？３１３からなるプラスミド、
ｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　Ｏ６４０を含むことが判明した。該挿
入物は、ｔｌ　ＲｌｉＡ　ｇをコードでΔるヌク「・オ
チト配列である。該挿入物は推定的）ｉ１１ｓＡｇ前駆
体蛋白部分および完全表面抗原をコードし、また、５６
５１）Ｐの３′非コード付１１配ダ１１を含ａする。

実施例４ 酵母ａｒｇ３遺伝子をＰＢＲ３２２と組合わ仕ろことに
よる、ａｒｇ：ＥｌＡｌｆｌ域を含ｉ′４゛る中間プラ
スミド、ｐＭＣ２００の調製 ａｒｇ　３遺伝子を特定ずろ３３００ｂｐ酵１［ｆ）　
Ｎ　Ａフラグメントを、ｐＹ　ｅｕｒａ　３　ａｒｇ３
をｌｌ１ｎｄｌＩｌで消化することにより得る。プラス
ミドｐ　Ｙ　ｅｕｒａ　３　ａｒｇ３については、クラ
ビールら［Ｃｒａｂｅｅｌ　　ｅｔ　　ａｌ　、　。

Ｄｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
　Ｓ、、　Ｖｏｌ、７８゜５０２６、（１９８１）］に
よって１己載されている。

該３３００ｂｐフラグメントをｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ
１１１部位中ｊこクローンし、実質的に１１１ｊ記と同
様にしてイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４中に形質転換さ
せる１、形質転換体をアンビンリン培地ｋｌで選択（７
、テトラサイクリン耐性についてスクリーニングする１
、Ｉｆニ質転換コロニーは、ｌ１ｉｎｄ川部ｆぴに挿入
物を（「−・［るｐＢｆｉ：３２２からなるプラスミド
ｐＭＣ２００を丁（（丁オろことが？ＪＩ明した。この
プラスミドは、以下の実施例に記載するように酵母細胞
においてｌｌｒ３ｓＡｇヌクレオチド配列の転写を行な
うことのできろａｒｇ　３回節域を含んでいる。イー・
り１Ｋ１２　を朱凡ＩＭ２　９　４　　（ＰＭＣ２００
）はヨー〔Ｊ　ツバ特、；Ｔ条約およびブダペスト条約
に従いアメリカン・タイプ・カルチャー卆コレクノヨン
に１９８２（１′−６月２［１イ・１で寄託番号Ａ′ｒ
ＣＣ３９１３０として寄≦ヒさねている。

オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣｌ”
）のためのＮ−末端コート付け配クリ部分および５゛−
非翻訳先端域の部分を含め、ａｒｇ３逍伝子の−ｉｌの
ヌクレオチド配列は、ヒュイゲンら（１１ｕｙｇｈｅｎ
　　ｅｔ　　ａｔ、、　Ａｒｃｈ、　　Ｉｎｔｌ、　Ｐ
ｈｙｓｉｃａｌＢｉｏｃｈｅ＠、、　　Ｖｏｌ、　　８
９．　　Ｂ　ｌ　７２．（１９８１）］によって決定さ
れている。第・１図にこの公知の配ｌりの２１０　Ｉｌ
りフラグメントを示す。該２１０ｂｐフラゲメントは９
ＭＣ２００中の３３００ｂｐ　Ｈｉｎｄ■酵１４ＤＮＡ
挿入物上に独特ｔ　Ｈｉ　ｎｃ　ＩＩ、）３ｇｌｌｌお
よびＥｃｏＲ１部位を歯付し、該ＯＣＴ蛋白コード付け
配列のための開始コードンは第１図中の四角で囲んだｔ
＼’ｒ　Ｇコードンと考゛えられろ、Ｉ−（Ｉ−１ｓＡ
ｇ午独１たはＩ−４Ｉｌ　ｓ　Ａ　ｙ、前駆体と々（フ
ーンしたＩＩＢＶ　　ＤＮＡ由来のＨＢｓＡｇをコード
４゛る配列の酵Ｂ）ＤＮＡ１７）ｌｉｎｅｌｌ、Ｂｇｌ
ＩＩまたはＥｃｏＲｌ　；’ｌ＜位−・の導入は遺伝子
融合をもたらし、該遺伝子融合が融合部位を越えて翻訳
を継続させるための正しい方向にある場合？こは、該ａ
ｒｇ３調節域から転写、翻訳されたハイブリッド蛋白を
産生１゛る６のと考えられる。

実施例５ ｐＲＩＴ１０６４０をｐＭＣ２００と組合わせることに
よる、Ｉ（Ｂｓ、Ａｇおよび調節域を含む中間プラスミ
ド、ｐＲＩＴ１０６７１おヨヒｐｌＬ　Ｉ　Ｔ　ｌ　０
６７２の調製 ｐＭＣ２００　５）ｔｇをＢｇｌｌｌ　　６．４単位で
３７℃にて２５時間消化し、０　、１−Ｍグリノン、０
゜０１　ＭＭｇＣＩ、・６１（＊０および０　、０１．
　ａ＋Ｍ　ＺｎＣｌｚを１”Ｒ＋’する等容量の緩衝液
（ｐＨ１０，５）で希釈し、ウソ１ｉｆｅアルカリ性ボ
スフ７ターゼ０．５単位と共１−３７℃にて３０分間イ
ンキュベートシ、５′末喘奪；ン酸塩残仄を除去する。

該混合液を緩衝液飽和フェノールで２回、エーテルで３
回抽出４−る３゜ｌ）さｌＡをエタノールで沈澱させ、
０．ＯＩＭＩ−［７メ７ミノ緩衝液（ｐＨ７、５）に溶
解する。

ｐｌｉｌＴ１０６４０　２５℃１ｇを１）ａｌｌＨＩて
消化ｊ１．１ＩＩ３Ｖ　　ＤＮＡ１）′）ｌ　３５０ｂ
ｐ　Ｉ（ａｍｆｌ　ｌフラグメントを切除する。該１３
５０ｂｐフラグメントを調製アガロースゲル電気泳動お
よび電気溶出にＪ：　ｊ、、、）精製する。溶出Ｄ　Ｎ
　Ａをエタノール沈澱によｊ）回収、濃縮し、０．０１
＆１トロメタミン緩ｉＪｉ液（ｐｌ＋７．０）２ｏμρ
中に溶解オる。夏１夏３　ｓ　Ａ　ｇコード付ｉ１配、
７１１を含む１１ａｉＨｌフラグメント０　、．３　Ｂ
　９をＢｇｌｌ１７１ｉ化ｐＭＣ２００　０．５μ２と
混合し、該混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュ
ベーションして結紮する。

該結紮ＤＮＡをイー・コリに１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞を形質転換するのに用いる。

形質転換体を２００μ９７ＩＮ（ｌアンピシリン含存寒
天平板上で選択する。アンピシリン寒天培地上で連続継
代して１２個の耐性コロニーを単離し、ビルンボイムら
［Ｂｉｒｎｂｏｉａ　　ｅＬ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄ。

Ｒｃｓ、、Ｖｏｌ、７．１５１３（１９７９月により記
載された方法によってプラスミドを単離する。アガロー
スゲル電気泳動による分析は、すべてのプラスミドがＨ
ｐａｌによって制限され、ＢａｎＨＩフラグメントの挿
入を示し、また、挿入フラグメントの両方の方向が１２
ｇの抽質転換コロニー中にあることを示している。該プ
ラスミドはＣｓＣ１臭化工チジウム密度グレジエント遠
心分離法によって単離される。１つのプラスミド、ｐＲ
ＩＴＩＯ６７！は、ＨＢｓＡｇコード付け配列の転写の
ための正しい方向でＢａ１１１部位に融合されたＢａｍ
ＨＩフラグメントを含み、ＯＣＴの１８１１１ＳのＮ−
末端アミノ酸、推定的ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ萌駆体蛋白の４
２個のアミノ酸およびＩ［３ｓＡｇの２２６個のアミノ
酸からなる２８６ｐｌのアミノ酸融合蛋白を生じる。該
融合蛋白は以下の実施例８で示されるＩ−ＩＢ８Ａｇで
ある。ｐｒｔ　Ｉ　’ｌ’　ｌ　０６７１を含有する形
質転換体を、イー・コリに１２株ＭＭ２９４（ｐＲＩＴ
Ｉ０６７１）と命名する。ｐＲＩＴ１０６７１を第５図
に示す。

中間プラスミドとしてのｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６４０の使
用は必須ではない。例えば、該ＢａｍＨＩフラグメント
はｐＲＩＴＩ０６１６から切り出すことができろ。

もう１つのプラスミド、ｐＲＩＴＩ０６７２は、１１［
３ｓＡｇコード付け配列の転写のための正しくない方向
にあるＢａＩＩＨ［フラグメントを含んでいる。

このプラスミドを含む形質転換体をイー・コリＫ１２株
ＭＭ２９４（ＰＲＩＴＩ０６４２）と命名する。

実施例６ ｐＲＩＴＩ０６７１およびｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０６７２を
シャトルベクターＹＥｐ１３と組合わせることによるプ
ラスミド、ｐＲ［Ｔ１０６７３およびｐＲｔＴＩ０６７
４シャトルベクターの調製 ベクターＹＥｐｌ　３はイー・コリ・サカロミセス・セ
レビシアエ・シャトルベクターである。ベクターＹＥｐ
ｌ　３はブローチら［Ｂｒｏａｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ、
。

Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ、　８　、　Ｉ　２１　、（１９７９
）］に記載されており、ジエイ・ヒツクス（Ｊ　、　Ｈ
１ｃｋｓ、　Ｃｏ１ｄ。

Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ。

Ｕ、Ｓ、Ａ）によって供給された。小さいＨｉｎｄ［フ
ラグメントを、ＨｉｎｄＩ［ｌによる消化でプラスミド
から切除し、該プラスミドを再結紮して、単一の１−Ｉ
ｉｎｄＩ［１部位を含む誘導プラスミド、ＹＥｐ１３Ｈ
ｉｎｄｌｎを調製する。精製ＹＥＩ）Ｉ　３　Ｈｉｎｄ
ｌＩｌをＨｉｎｄ■で消化し、アルカリ性ホスファター
ゼで処理して再結紮を抑制する。該ＤＮＡをフェノール
抽出およびエタノール沈澱によって回収する。

精製ｐＲＩＴ１０６７１およびｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　Ｏ６７
２をＢａ１Ｈ１で消化し、アルカリ性ホスファターゼで
処理してｐＢＲ３２２部分の再形成を抑制する。該処理
ＤＮＡをさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して調節域−ｆ−
Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子融合を含む４６５０ｂｐ　Ｈ
ｉｎｄｌｌｌフラグメントを遊離させ、ついで、その試
料をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させる。

ｐＲＩＴ１０６７１およびｐＲＩ　Ｔ　１０６７２から
誘導したＤ　Ｎ　Ａ　：Ｊ！４製物各０．４μ９を別々
に、ｌ−１ｉｎｄｌｌｌ消化ＹＥｐＩ　３ＨｉｎｄｆＩ
ｌＯ，４μ９と混合し、該混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼ
と共にインキュベートする。

谷結紮混合物の一部分をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４
のコンピテント細胞を形質転換するのに用いる。形質転
換体をアンピンリン寒天培地上で選択する。形質転換体
コロニーを単離し、ビルンボイムら［Ｂ　ｉｒｎｂｏｉ
ｍ　　ｅｔ　　ａｌ、　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄＲｅ
ｓ、、Ｖｏｌ、７．＋５１３（１９７９）］によって５
己滅された方法により、それらのプラスミドの内容を調
べた。形質転換体コロニーのＩっ、イー・コリに１２株
ＭＭ２９４（ｐＲｒＴ１０６７３）は第５図に示すよう
な正しい方向で、ＹＥｐ１３Ｈｉｎｄｌ１１．ｈに挿入
されたｐＲＩＴＩ０７６１からのＨｉｎｄｌｌｌフラグ
メントを含むプラスミド、ｐＲＩ　Ｔ　１０６７３を含
ｕ　４−る。らう１つの形質転換体コロニー、イー・コ
リＫ　Ｉ　２　味ＭＭ　２９４　（ｐＲＩ　′ｌ”　１
０６７４）は、ＹＥｐｌ　３　Ｈｉｎｄ［ｌｌ上に正（
、＜ない方向で挿入されたｐＲＩ　Ｔ　ｌ　０６７２か
らの＋（ｉｎｄ■フラゲメントを含むプラスミド、ｐＲ
Ｉ’ｒｌ。

６７４を自存している。

実施例７ ｐＨｌＴ１０６７３およびｐＨｌＴ１０６７４１：よる
酵母の形質転換 プラスミドｐＲＩ　Ｔ　１０６７３およびｐＨｌＴ１０
６７４を、イー・コリＫ１２株ＭＭ２９４（ｐＨｌＴ１
０６７３）およびＭＭ２９４（ｐＨｌＴ１０６７４）の
清澄な溶解質よりＣｓＣｌ−臭化エチジウム密度グレジ
エント遠心分離法によって単離する。

Ａ、サツカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５ブローチら
［Ｂｒｏａｃｈ　　ｅｔ　　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、　Ｖ
ｏｌ。

８．１２１　、（１９７９）］によって記載されている
サツカロミセス・セレビンアエ株Ｄ　Ｃ５（ｌｅｕ２〜
：３．１ｅｕ２〜Ｉ　ｌ　３、ｈｉｓ３、ｅａｎｌ〜Ｉ
Ｉ）は、ジエイ・ヒフ１クス（，１，１１ｉｃｋｓ、　
Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ　ｒ［ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
Ｌｏｒｉｅｓ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、Ａ）
から得らイ１、ヨーロッパ特許条約およびブダペスト条
約に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（アメカリ合衆国メリイランド州、ロックヒル）に
１９８２年６月２日に寄託番号２０６３０として寄託さ
れている。プロトプラスト化をβ−グルコウ【１ニダー
ゼ（０，２４単位ＩＲＱ最終濃度）およびアリールスル
フＹターゼ（１，２単位／ｌ最終濃度）の混合物を用い
て０．８Ｍソルビトール、０．０３Ｍβ−メルカプトエ
タノールおよび０．１Ｍリン酸力ルンウム緩衝液（ｐＨ
７，５）中で行なう以外は、ハイネンら［１１１ｎｎｅ
ｎ　　ｅｔ　　ａｌ、。

１’ｒｏｃ、　　Ｎａ１１．　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ
、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　　Ｖｏｌ。

７５．１９２９（１９７８）］によって記載された方法
によってＤＣ５株の細胞を増殖させ、形質転換用に調製
する。酵母プロトプラストを、別々に、ｐＲ［Ｔ１０６
７３　１０Ｉｚｉ＋およヒｐＲＩ　Ｔ　Ｉ　０６７４　
　１０μ７と共にインキュベートし、形質転換体をロイ
シン欠損再生寒天培地中で選択する。

再生寒天培地中で増殖したコロニーを回収し、０６７５
％アミノ酸欠損酵母窒素基本培地、２％グルコース２％
寒天および８０μ９／ｘ（ｌヒスデシンを含ａする固体
培地上に画線塗抹し、３０°Ｃで増殖させる。ＤＣ５株
の１コロニーはｐＨｌＴ１０６７３で形質転換され、こ
れをサツカロミセス・セレビシアエ株ＤＣ５（ｐＨｌＴ
１０６７３）と命名する。らう１つのコロニーはｐＲＩ
　Ｔ　Ｉ　０６７４で形質転換され、これをサツカロミ
セス・セレビシアエ株ＤＣ５（ｐＨｌＴ１０６７４）と
命名する。。

ＤＣ５（ｐＨｌＴ１０６７３）株およびＩ）　Ｃ５（ｐ
ＨｌＴ１０６７３）株の培養物を８０　ｐｇ／ｚｃヒス
チノン加酵母窒素基本培地中で、６２０μｍにおいて０
．３３〜１．０の光学密度が得られるまで増殖させる。

ＤＣ５（ｐＨｌＴ１０６７４）株は調節域に対して正し
くない方向で融合されたＨＢｓＡｇコード付け配列を含
んでいるので陰性対照としてＲ用である。細胞を遠心分
離により回収し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗滌
し、１ｍＭフーＪ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳ
Ｆ）加ＰＢＳ　５ｘＱ中に２０〜１６０倍濃度で再＠濁
させる。細胞を、フレンチ・プレッ／ヤーセル（Ｆ　ｒ
ｅｎｃｈ［’　ｒｃｓｓｕｒｃ　　Ｃａ１ｌ）に１２０
００ｐｓｉ（８３ＭＰａ）で２回通過させて破壊し、溶
解質を７７００ＸＧで１５分間、ついで３００００ｘＧ
で３０分間遠心分離する。−上澄液を回収し、マイレッ
クス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶメンプラン上で濾過する。

」−澄液における特異杭用（ＲｓＡｇｂｔ体と反応する
蛋白の存在を、Ａｕ５ｒｉａＣＤラジオイムノアツセイ
法によりテストする。このようにして調製されたサツカ
ロミセス・セレビンアエ株ＤＣ５（ｐＲＩ′ｌ’　ｌ　
Ｏ６７３）ノｉ’ｉ’ｉ’ｔＦａ細胞抽出物！、ｔＰＢ
９７’１６〜２５６倍に希釈してテストした場合でら陽
性反応を与え、一方、Ｄ　Ｃ５（ｐｒロＴｌ０６７４）
株抽出物は、抗−ＨＢｓＡｇ抗体と反応する蛋白のγＩ
在に関４−るこの９叶ては陰性であった。

Ｂ　サツカロミセス・セレビンアエ株１ｃｌ　６サツカ
ロミセス・セレビシアエ味１ｃ１６９７ｄはヨーロッパ
特許条約およびブダペスト条約に従ってアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに１９８２年６月２日
に寄託番号ＡＴＣＣ２０６３１として寄託されている。

前記の方法を用い、アルギニン栄ｆ１緩徐株１ｃｌ　６
９７ｄ（ａｒｇＪ　　、Ｉｅｕ２〜ｌ）をｐＲＩＴ１０
６７３およびｐＲＩＴＩ０６７４で形質転換さ仕る。該
栄箋緩徐株のロイシン非依存性コロニーの１つをｐＨＴ
１０６７３で形質転換させ、サツカロミセス・セレビン
アエ株１ｃ１６９７ｄ（ｐＨＴ１０６７３）と命名する
。

らう１つのロイシン非依存性コロニーを、ｐＲＩＴＩ０
６７４で形質転換させサツカロミセス・セレビシアエ株
１ｃ１６９７ｄ（ＰＲＩＴ１０６７４）と命名する。

Ｉｃ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７３）株およびｌｃｌ
　６９７ｄ（ｐｒ（ＩＴＩ　０６７４）株の培養物を２
０μ９／ＲＱアルギニン補足酵母窒素基本培地中で増殖
させる。細胞を回収し、細胞抽出物を前記と同様にして
調製する。Ｉｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７３）株
のｔｌ′７澄細胞抽出物は、Ｉ／２０４８まで希釈して
もΔｕｓｒｉａ”ラジオイムノアッセイにおいて陽性の
結果を示すが、Ｉｃｌ　６９７ｄ（ｐＨＩ　Ｔ１０６７
３）株の抽出物では、この分計において一様に陰性であ
った。

これらの結果から、ＤＣ５株およびｐＲＩＴＩ。

６７３で形質転換されたＩｃ１６９７ｄ株の酵母細胞は
、ｌｌＢｓＡｇ決定子を存する融合蛋白の形態で１１１
３ｓＡｇを特異的に合成すると結論づけられる。

実施例８ サツカロミセス・セレビシアエ株１ｃ１６９７ｄ（ｐＨ
Ｔ１０６７３）からのｌ（ＢｓＡｇによるウサギの免疫
法 サツカロミセス・セレビンアエ株１ｃ１６９７ｄ（ｐＲ
ＩＴ１０６７３）を６２０μｍにおける光学密度が０６
０となるまで増殖させ、遠心分離によって採集する。細
胞をＩｍＭ　　ＰＭＳＦ加ＰＢＳ中に４０倍濃度で再懸
濁する。清澄細胞抽出物を実施例７に記載の方法に従っ
て調製する。同様にして、ｌｃｌ　６９７ｄ（ｐＨＴ１
０６７３）株の清澄細胞抽出物を調製する。これらの抽
出物をウサギの免疫付与に用いる。６匹のウサギからな
る第１群には、フロインド完全アジュバント１好と混合
したＩｅｌ　６９７ｄ（ｐＨＴ１０６７３）ｌ’！抽出
物ＩｘＱを非経口的注入で第０．９．１５．３０および
３７日目に与える。３匹のウサギからなる第２群には、
フロイント完全アジュバントＩｘＱと混合したｌｃｌ　
６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）株抽出物ＩｘＱを非経
口的注入で同じ日に与える。両群から第Ｏ（免疫付与前
）、２３．５Ｉ、および６５日目に、また、第１鮮から
は第４４８目にも血清を採取し、Ａ　ｕｓａｂ’ラジオ
イムノアッセイを用いて抗−ＨＢｓＡｇ抗体の存在をテ
ストした。これらの結果を第１表に示す。これらの結果
は、Ｉｃｌ　６９７ｄ（ｐＲ［Ｔ１０６７３）株からの
抽出物の注入を受けた６匹のウサギのうち４匹がＨＢｓ
Ａｇに対する抗体を生じたことを示している。１ｃ１６
９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７４）株からの抽出物の注入を
受けた３匹の対照のウサギはいずれら抗−ＨＢｓＡｇ抗
体産生の形跡を示していない。、これらの結果から、Ｉ
ｃｌ　６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０６７３）株抽出物はｌｌ
ＢｓＡｇを含み、重篤な副作用なしにヒトにおけろＨＢ
　Ｖ感染に対する保護を惹起するためのワクチンに用い
ることができると結論される。

実施例９ ａｒｇ３調節域を含有するｐＭＣ２００からのプラスミ
ド、ｐＨｒ１０７４９の調製 績１ｐＭ　Ｃ２００を）ｌｉｎｅｎでｌｉ化し、１０％
アクリルアミドゲルにで電気泳動にかける。ａｒｇ　３
調節域を含有する１９４０ｂｐフラグメントを電気溶出
およびエタノール沈澱によって該ゲルより回収する。該
フラグメント約４μ７を１２．５ｍＭＭｇＣ＋ｔ、ｌ　
２　、５　ｔａＭ　ＣａＣＩｔ、２０　ｆ）ｍＭ　Ｎａ
Ｃ１、ＩｍＭＥＤＴＡおよび２００ｍＭ）ロメタミン１
−Ｉ　ＣＩを含有する緩衝液（ｐｆ−（８，０）Ｉ　Ｏ
ＯμＱ中でＩ）ａ１３１エキソヌクレアーゼ０２１＃位
と共に３０℃にて１〜３秒間インキュベートする。該処
理Ｄ　Ｎ　、Ａをフェノールで抽出し、エタノールで沈
澱さ（ｌる。その１μ？をデオキシヌクレオチド三リン
酸塩の存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュ
ベートしていずれらの１本噴端部を修復し、ついで、Ｅ
ｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで消化する。この方法で、
Ｂａ１３１による切除により種々の長さのＤＮＡフラグ
メントが産生される。各フラグメントは一端に固定した
ＥｃｏＲＩ延長部をＨし、らう一つの端部は元のＨｉｎ
ｃｕ部位およびＯＣＴ蛋白開始コードンからいくらかの
距離を置いて位置した鈍化端（ｂｌｕｎｔ　　ｅｎｄ）
となっている。

ａｒｇ、’３Ｆ４節域を含Ｈする約１４８０ｂｐのフラ
グメンＩ・を７５％アクリルアミドゲル上で１気泳動、
−９いで、電気溶出およびエタノール沈澱に付して単離
する。このカットバック調節域は、以下の実施例１０に
記載されるように、ＯＣＴアミノ酸配列配列く蛋白合成
に先立つ転写をプロモートすることができるので好まし
い。

第２の一連の反応では、ｐＭＣ２００をＸｂａ（で消化
し、５’−１ｔ：！’Ｉ瑞部をＴ４ＤＮＡポリ、メラー
ゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸塩と川にインキ
ュベートして詰込むか、鈍化端とする。

このＩ）　Ｎ　ＡをＥｃｏＲ［で消化し、３゛からＸｂ
ａｌ部位までに位置する酵母ＤＮＡ配列と、ｐＢＲ３２
２を含む約５７００ｂｐの大きなＥｃｏＲ［−Ｔ　４／
’　Ｘ　ｈａ　Ｉフラグメントを電気泳動、電気溶出お
よびエタノール沈澱によって精製する。このフラグメツ
１−を該１４８０ｂｐプロモーター含有フラグメントと
混合し、これに結紮する。

該結紮混合物をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞を形質転換するのに用いる。

形質転換体をアンビンリン寒天培地上で選択する。

プラスミドｌ）　Ｎ　Ａをビルンボイムら［Ｂ　ｉｒｎ
ｂｏｉｍｅｔ　　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　
Ｒｅｓ、、　Ｖｏｌ、　　７．１５１３、（＋９７９）
ｌの記載した方法によって形質転換体コロニーより単離
し％Ｘ　ｂａ　Ｉでの消化によってＸ　ｂａ　１部位の
存在についてスクリーニングする。

Ｘｂａｌ部位は、第２の一連の反応からのフラグメン）
ｉの詰込まれたＸｌ）ａ１部位が、Ｘｂａｌ認識配列で
ある’ｒ　ｃ　′ｒ　Ａ　Ｇ　Ａを新しい位置で復元さ
せるように、３’Ｔ残基で終わる第１の一連の反応から
のらう１つのフラグメントに結紮しているプラスミドに
のみ存在している。ＸｂａＩ部位をａｌ−るプラスミド
をｐＲ［Ｔ　　１０７４９と命名した。これらの操作を
示すフローノートを第６図に示す。

イー　−：］　リに、　１２株ＭＭ　２９４　（、ＰＲ
Ｉ　Ｔ　　Ｉ　Ｏ７・１９）は、ヨーロッパ特許条約お
よびブダベスト条約に従ってアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（アメリカ合衆国メリイランド州
、ロックビル）に、１９８２年６月２日付で寄託番号Ａ
ＴＣＣ３９１３３として寄託されている。

ｐＲＩＴ　　１０７４９の試料をＢｓｔＥＩ［およびＸ
ｂａｔの組合せで消化する。切除されたａｒｇ３Ｑ節域
のサイズは、ＢｓｔＥ■およびＸｂａｌで同様に消化さ
れたｐＭＣ２００との比較により、また、フックら［Ｆ
ｕｃｈｓ　　ｅｔ　　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ、
　４．　１（１９７８）］によって記載されているファ
ージφｘｉ７４ＤＮＡフラグメントの公知の分子量を参
照することにより約２１０ｂｐと算定された。、ｐＲＩ
Ｔ　　１０７４９のＢｓｔＥＩＩ−Ｘｂａｌフラグメン
トのＤＮＡ配列を決定するため、プラスミドＤＮＡをＢ
ｓＬＥＩｌで消化し、交換キネ−ジョンによってγ−３
″Ｐ−ＡＴＰで標識し、ついで、Ｂａｌ１１（＋エンド
ヌクレアーゼで消化して２０００ｂｐフラグメントを遊
離させ、電気溶出およびエタノール沈澱によって精製す
る。標識フラグメントのＤＮＡ配列化はマキサムら［Ｍ
ａｘａｍ　　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　
　Ｖｏｌ、　　６５，４９９゜（１９８０）］によって
記載された化学的修飾法に従って行なわれろ。この配列
の１部分は、ＣＣＣＡ　’Ｉ’　ＣＡ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　
Ｇ　Ｔ　Ａ　ＣＡ　ＣＴ　ＣＧ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｇ八と
決定された。アンダーラインを施したヌクレオチドは、
５７００ｂｐ　ＥｃｏＲ［−Ｔ４／Ｘｂａ［フラグメン
トから誘導される。第４図に示すＤＮＡ配列の相当区域
と比較すると、修復されたＸｂａｌ部位が、ｐＭＣ２０
０酵母ＤＮＡ挿入物における元の１−１ｉｎｃ１１部位
のヌクレオチド９個上流の５′非翻訳先端域中に位置す
ることがわかる。

実施例ｌ０ ｐＲＩＴ　　１０７４９をｐＲＩＴ１０６０１と組合わ
せることによる、ＨＢｓＡｇおよび調節域を含有するプ
ラスミド、ｐＲ［Ｔ　　Ｉ　Ｏ７５９にヨＵｐＲ１’ｒ
　　１０７６１の調１１Ｊ ｐＲＩＴ　　１０６０１をＨｈａｌエンドヌクレアーゼ
で消化し、７．５％アクリルアミドゲル上で電気泳動に
付す。ｌ１００ｂｐフラグメントを電気溶出およびエタ
ノール沈澱によって回収する。このフラグメントの一部
のＤＮＡ配列は、ビーターソンら（ＰｅＬｅｒｓｏｎ　
　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｖｉｒａｌ　　Ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓＧ、Ｎ、Ｖｙａｓ、　Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ　　ａｎｄ
　　Ｒ，５ｃｈｎ＋ｉｄ。

Ｅｄｓ、、　Ｆｒａｎｋｌｉｎ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ　　Ｐｒｅｓｓ。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９７８
、ｐ５６９）によって記載されているような、ａｙｖ抗
原型ＨＢｓＡｇの公知のＮ−末端アミノ酸配列に対応す
る配列を含有する。該フラグメントは、５’−ＨＢｓＡ
ｇ開始コードンに位置する６個のヌクレオチド、完全な
ＨＢｓＡｇコード付け配列および約３９０個の３゛非翻
訳ヌクレオチドを含有する。

プラスミドｐＲＩＴ　　１０７４９のＤＮＡをＸｂａｌ
で消化し、該ＤＮＡ約４００ｎ９を精製Ｈｈａｌフラグ
メント約２８０ｎ９と混合する。該混合物を２０１ＩＩ
ＭトロメタミンーＨＣｌ、Ｉ　ＯｍＭ　ＭｇＣｌ。

１ｏＭジチオトレイトールならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ各３３ｍＭを含有する緩衝液
（ｐＨ７，５）２０μσ中で３７℃にて３０分９Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ０．５単位と共にインキュベートする
。該反応混合液に１ｍＭΔＴＰ２．５μ＆、Ｉ　ＯｓＭ
　　ＥＤＴＡ２．５μ（ｌおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ２
μｌ２（２単位）を加え、該混合液を１５℃にて１６時
間インキュベートする。

該結紮混合物をイー・コリＫ１２株ＭＭ２９４のコンピ
テント細胞を形質転換するのに用い、アンピシリン耐性
形質転換体を選択する。プラスミド調製物をいくつかの
これらの形質転換体より作り、制限エンドヌクレアーゼ
消化およびゲル電気泳動により分析した。その結果は鈍
化端ＨＢＶフラグメントがＸｂａｌ消化ｐＲＩＴ　　＋
０７４９中に両方の可能な方向で挿入されていることを
示している。このようなプラスミドの１つ、ｐＲＩＴＩ
０７６１はａｒｇ３プロモーターからＨＢｓＡｇ配列を
転写するための正しい方向のｌ１００ｂｐ挿入物を含み
、ＢｓｔＥ［およびＸｂａｌによる連続的消化により２
７１ｂｐフラグメントを生ずる。このｐＲＩＴ　　１０
７６３を第７図に示す。第２のプラスミド、ｐｌ”ＬＩ
Ｔ　　１０７５９は正しくない方向で挿入物を包含し、
ＢｓｔＥ［ＩおよびＸｂａｌエンドヌクレアーゼの組合
せで消化すると、１１７５ｂｐと算定されるフラグメン
トを生ずる。ｐｌ？ＩＴ　１０７６１について、ａｒｇ
３Ｊ３１製域−ＨＢｓＡｇ挿入接合部におけるヌクレオ
チドの配列を、γ−３１ｐ　　ｐ。

ＴＰによるＸｂａｌ末端の交換キネ−ジョンｔｆｉ識付
けの後、マキサムら［Ｍａｘａｍ　　ｅｔ　　ａｉ、、
　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖ
ｏｌ、　　６５．４９９（１９８０）］の化学的修飾法
を用いて２７１ｂｐ　ＢｓＬＥＩｌ−ＸｂＡｌフラグメ
ントを配列化４゛ることにより決定する。ａｒｇ３凋節
域−ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ接合部に対して決定さ！また配列
はＴ　Ａ　Ｃ、Ａ　ＣＴ　ＣＧ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　ＣＴ　
に　ＡＡ　ＣＡ　’ｒ　Ｇ　テある。Ｘｂａｌ制限品位
が’ｒ　４１）　Ｎ　Ａポリメラーゼによ−）で完全に
は修復されず、グアニン＆ＵＶ５１つを欠失しているこ
とかわかる。該ａ　ｒｇ３非翻訳先端部にはｔ（Ｂ　Ｖ
起源の６個のヌクレオチド、ＣＴＧＡＡＣが直接続き、
さらにｌｌＩ３ｓＡｇ開始コードン、Ａ　Ｔ　Ｇおよび
Ｈ［’（ｓ　Ａ　ｇ構造遺伝子のコード付け配クリが続
いている。ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ開始コードンはａｒｇ３ブ
【１モーターの下流（こある最初の開始コードンである
。そのため、該ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡの翻訳は
そのコードンで開始され、合成されたＩＮ）ｓΔｇは５
１ＩＳ質アミノ１１５．ｉＪを欠失４”ることになる。

合成され＃二ｌ（ＢｓＡｇは融合蛋白ではなく、１Ｉｔ
３ｓＡｐ；標品と構造的に本質的に同しらのである。

実施例ＩＩ ｐｌｔｌＴＩ０７６１をＹ　Ｅｐｌ　３　ｊｌｉｎｄ［
ＩＩと組合わＵることによるプラスミドｐＲＩＴ　　１
０７６４お９１、びｐＲＩＴ　　１０７６５の調製ｐｒ
（ＩＴ＋０７６１およびｐＲＩＴ　　１０７５９を別々
にＰｓｔｌおよびＢａｍ１−ＩＩで消化してｐｔ（ｒｔ
３２２レプリコン部分を破壊し、ついでＨｉｎｄｌｌｌ
で消化して挿入されたＨ　［（Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａおよび
調節域を担持するＤＮＡフラグメントを遊離させる。

３　Ｄ　Ｎ　Ａをフェノールで抽出し、エタノールで沈
澱させ、０　、０１　Ｍ　＋−ロメタミンーＨＣｌおよ
び０゜００１ＭＥＤＴＡを含有中る緩衝液（ｐＨ７，５
）に溶解する。２！ｒＤ　Ｎ　Ａ’Ｑ製物の０，６μｔ
を前記と同様な方法で調製されるＹＥｐ１３Ｈｉｎｄｌ
ｌｌのＨｉｎｄｌＩＩ消化、アルカリ性ホスファターゼ
処理ＤＮＡ０３μ７と混合し、該、ＩＬ合物を結紮する
。

該結紮混合物をイー・コリに１２株ＭＭ　２９４のコン
ピテント細胞の形質転換に用い、アンビンリン耐性形質
転換体を選択する。１つの形質転換体は、ｐＲＩＴ１０
７６１由来のｆ（ｉｎｄｌｌｌフラグメントをＹ　Ｅｐ
　ｌ　３　Ｈ１ｎｄｌｌ［−ヒに挿入してなるプラスミ
ドｐＲＩ′１″　＋０７６４を含ａすることが示された
。また、別の形質転換体はｐＲＩＴＩ０７５９山来Ｈｉ
ｎｄｌｌｌフラグメントをＹ　ＥＰ　ｌ　３　Ｈ１ｎｄ
ｌＩｌ上に挿入（７てなるプラスミドｐＲＩＴ　　１０
７５９を含有することが・Ｒされた。ｐｌえＩＴ　　１
０７６１およびｐＲＩＴ！０７６．１のｙＡ製マフロー
シート第７図に示す。

実施例１２ ｐＲＩＴ１０７６１１およびｐＲＩＴＩ０７６５による
酵母の形質転換 ｐＲＩＴ　　１０７６４およびｐＲＩＴ１０７６５を″
Ｍ施例１１で調製された形質転換体の培滲物より（：　
ｓ　Ｃｌ−臭化エチジＣ７ム密度プレノエント遠心分離
法によ、〕て単離し、各ｌθμ９を実施例７に記載の方
法により酵母株１ｃ１６９７ｄの細【を形質転換オろの
に用い、再生寒天培地」二でロイノン非依仔性形質転換
体を選択電る。、これらの形質転換から生ずるロイシン
−非依存性コロニーを菌株１ｃｌ　６９７ｄ（１）ＲＩ
Ｔ　　１０７６４）と命名する。らう１つの形質転換体
をサツカロミセス・セレビンアエ株１ｃｌ　６９７ｄ（
ｐｎｌＴ　　＋０７６５）と命名する。これらの菌株の
培養物を、２％グルコースおよび２０μ９／ＭＱアルギ
ニン補足酵母窒素基本培地中で６２０１１Ｉ１１におけ
ろ光学密度が０゜８０〜０，８８となるまで増殖させる
。細胞を集め、（４１１胞不含抽出液を調製し、実施例
７に記載されるようにＡｕ５ｒｉａＣＤラジオイムノア
ツセイによりｌｌＩ３ｓＡｇについて分析する。Ｉｃｌ
　６９７ｄ（ｐＲ１’ｌ’＋０７６４）の抽出物は、Ｐ
　Ｂ　Ｓによる希釈度かｌ／＋０２４まででしこの分析
において陽性の結果を示ずが、１ｃ１６９７ｄ（ＰＩＩ
Ｔ　　１０７６５）株は非希釈抽出物でしこの分析にお
いて−（狛；陰性であった。心伝学およびラノオイムノ
アッセイの結果より、サツカロミセス・セレビンアエ株
１ｅ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ　　１０６７４）の細胞は、
ヒトにおけるＨ　Ｂ　Ｖ感染に対する保護を重篤な副作
用なしで惹起するためのワクチンに使用できるＨ［３ｓ
Ａｇを合成すると結論される。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＲＩＴＩ０６０１の制限エンドヌクレアーゼ
開裂地図、第２図はｐＲＩ　Ｔ　　１０６０６の制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂地図、第３図は９ＭＣ２００の制
限エンドヌクレアーゼ開裂地図、第４図はｐＭＣ２００
における３　３００ｂｐ　Ｈｉｎｄ■酵母ＤＮＡ挿入物
の一部分のヌクレオチド配列、第５図１１ｐＲＩＴ　　
１０６７１およびｐＲＩ’ｒ１０６７３の製造を示すフ
ローシート、第６図はｐＨＩＴ　　１０７４９の製造を
示すフローシート、第７図はｐＲＩＴＩ０７６１および
ｐＲＩＴ１０７６４の製造を示すフローシートである。 特許出願人　スミス・クライン−アール・アイ・ティ 代　理　人　弁理士　青白　葆　ほか２名図面〜　・・
・ ′Ｍ２５！Ｊ ｅｏＲ 震Ｉ■■ｐＡｃＹｃ１８４ ０：＝］ＨＢＶＯＨＡ 図面の、筆書 Ｍ１図 ｃｏＲ１ 口＝＝コＨＢＶ　ＯＮＡ 凹面の、筆書 第３図 ■■■■ｐ１３Ｆ１３２２ ０＝：コ」３ ＠４■ ＴＣＴＡＡＡＧＧＣＡ ＧＴＴＴＡＴＴＣＣＴ ＴＧＴＡＴＧＴＣＣＴ ＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧ 丁ＡＣＡＡＡＧＡＧＣ ＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母ａｒｇ３調節域およびこれに隣接する制限部
   位からなり、該制限部位に挿入されたコード付け配列の
   表現によって合成蛋白が異質アミノ酸残基を欠くように
   なるベクター。
2. （２）１端にＥｃｏＲ I 延長部を有し、鈍化端である
   他端で３’Ｔ残基で終るｐＭＣ２００の１４８０ｂｐフ
   ラグメントである調節域が、ｐＭＣ２００の５７００ｂ
   ｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲ I フラグメントのＸｂａｌ部位
   のポリメラーゼ修復後にこれと融合してなるプラスミド
   である前記第（１）項のベクター。
3. （３）ｐＲＩＴ１０７４９である前記第（１）項のベク
   ター。
4. （４）一端にＥｃｏＲ I 延長部を有し、鈍化端である
   他端で３’Ｔ残基で終るｐＭＣ２００の１４８０ｂｐフ
   ラグメントである調節域を、ｐＭＣ２００のｐＭＣ５７
   ００ｂｐＸｂａｌ−ＥｃｏＲ I フラグメントのＸｂａ
   ｌ部位のポリメラーゼ修復後にこのフラグメントと融合
   させることを特徴とする酵母ａｒｇ３調節域およびこれ
   に隣接する制限部位からなり該制限部位に挿入されたコ
   ード付け配列の表現によって合成蛋白が異質アミノ酸残
   基を欠くようになるベクターの製法。