JPS62181785A - 融合蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） この発明は、エシェリヒア・コリ（Ｅ　、ｃｏ１５　大
腸菌）のＴｒｐＬＥ遺伝子を用いた融合蛋白質の新規生
産方法、得られた融合蛋白質およびその用途、並びに上
記蛋白質を得るのに用いられた修飾プラスミドに関する
ものである。

この発明はまた、天然ポリペプチドおよび異種ポリペプ
チドに加水分解され得る新規で酸に不安定な融合蛋白質
、前記融合蛋白質の製造方法および前記融合蛋白質を加
水分解して異種ポリペプチドを放出させる方法に関する
しのである。

（関連文献） 組換えＤＮＡ方法を用いて実質的に大腸菌のような別の
有機体における供給源から有用な蛋白質およびポリペプ
チドを生産する際の技術的および経済的利益は現在充分
に確立している。一般に、この方法は、強力なプロモー
ター−オペレーターが所望の異種遺伝子の発現を制御す
る、宿主細胞内で多数のコピーをもたらし得る自己複製
ベクターの作成を含む。次に続いてベクターによる宿主
（例、大腸菌）の形質転換、宿主培養物の高密度に達す
るまでの生長およびプロモーターの誘導により異種ポリ
ペプチドが生産される。所望のポリペプチドを高収量で
得るためには当然均質の生成物を生産する精製を少なく
しなければならないが、一般に各特異的ポリペプチドご
とに物理化学特性が異なるため各ポリペプチドに対して
個別の精製計画が必要である。

宿主細胞が生長している間の最適な時点で異種ポリペプ
チドの過剰生産を制御し得る強誘導性プロモーター−オ
ペレーター系の特性が非常に重視されてきた。特に深く
研究された例はＴｒｐプロモーター−オペレーターの例
である。クローフォードおよびストーブァ、［アニュア
ル・レビュー・オブ・バイオケミストリーＪ（Ａｎｎ、
Ｒｅｖ、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

）、４９巻、１６３〜１９５頁（１９８０年）参照。

大腸菌におけるトリプトファンの生合成は、ＴｒｐＡＳ
ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ，ＴｒｐＤおよびＴｒｐＥと称され
る一連の５個の酵素により触媒される。これらの酵素を
コードする遺伝子は隣接しており、Ｔｒｐプロモーター
−オペレーターにより制御され、Ｔｒｐリーダーのごく
近くにＴｒｐＥ遺伝子を伴なう。

Ｔｒｐリーダーペプチドのアミノ末端をＴｒｐＥ蛋白質
のカルボキシ部分に融合することにより様々なリーダー
−ＴｒｐＥｆ［ＬＥＪ）蛋白質が生産される、一連の欠
失突然変異体が単離された。パートランド等、［ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ（Ｊ　、Ｍ
ｏ１．Ｂ　ｉｏｌ、）、１０３巻、３１９−３３７頁（
１９７６年）、ミオツアーりおよびヤノフスキー、「ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジーＪ（Ｊ、Ｂａｃｔ、
）、１３３巻、１４５７−１４６６頁（１９７８年）参
照。これらのＬＥ蛋白質は野生型配置のＴｒｐＥ蛋白質
より８−１０倍高いレベルで生産され得るため、これら
の改変されたＴｒｐ遺伝子を用いて多くの異種ポリペプ
チドが生産されてきた。フレイド等、イギリス国特許第
２０７３２０３号、ニコルスおよびヤノフスキー、［メ
ソッズ・イン・エンザイモロジーＪ（Ｍｅｔｈ、　Ｅ　
ｎｚｙｍｏｌ、）、１０１巻、１５５−１６４頁（１９
８３年）参照。

発現に適した宿主遺伝子に融合した興味ある異種遺伝子
の発現による融合蛋白質の細胞内合成は、異種蛋白質の
高レベルの発現を達成する好都合な手段である。大腸菌
において小さなポリペプチドホルモンを生産するために
、このアプローチは非融合ホルモンと比べて融合蛋白質
の発現レベルおよび安定性の両方の増加をもたらした。

イタクラ等、［サイエンスｊ（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、１
９８巻、１０５６−１０６３頁、（１９７７年）、ゲー
デル等、「ネイｆ　ヤＪ（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２８１巻
、５４４−５４８頁、（１９７９年）、シャイン等［ネ
イチ−？　−Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）、２８５巻、４５６−
４６１頁、（１９８０年）参照。ロ蹄疫ウィルスキャッ
プジッド蛋白質ＶＰ３（フレイド等、［サイエンスＪ（
Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２１４巻、１１２５−１１２９頁
（１９８１年）〕またはインフルエンザウィルス赤血球
凝集素蛋白質ＨＡ（ディビス等、［ジーンＪ（Ｇ　ｅｎ
ｅ）、］のどちらかとのＴｒｐＬＥ蛋白質の融合ポリペ
プチドが発現に適していることが報告された。またこれ
らの融合蛋白質は極度の不溶性である。これらの２種の
ウィルス蛋白質は普通容易にアグリゲート（集合）する
ため、ＴｒｐＬＥ融合蛋白質のアグリゲーンヨンは異種
蛋白質の物理化学特性によるものであると考えられた。

〔発明の記載〕

この発明者は、高レベルの発現に加えて、ＴｒｐＬＥ蛋
白質は融合蛋白質に対して異種ポリペプチドの精製に有
用な特性を付与し得ることを発見した。特に、ＬＥカル
ボキシ末端領域の可変部分を異種ポリペプチドと置き換
えろと、これが小さな可溶性ポリペプチドであってら自
己集合性融合蛋白質をもたらす。アグリゲート（集合体
）は細胞リゼイト（溶解物）の分画的遠心分離により得
られた沈澱物において容易にふ富化および濃縮されるた
め融合蛋白質の精製は非常に簡単なものとなった。

したがって、この有用な精製工程は様々な異種遺伝子に
ついて用いることができる。融合蛋白質部位は、望まし
い自己集合特性を失うことなくＴｒｐＬＥ遺伝子内で変
えられ得るため、Ｔ　ｒｐＬ　Ｅ遺伝子内の好都合な制
限部位を用いて所望のプラスミドベクターの作成を簡易
化することができる。融合部位の選択には融通性がある
ため、ＴｒｐＬＥ蛋白質に他の改変を行なう（この明細
書に記載）ことにより異種ポリペプチドの精製を向上さ
せることができる。

さらに、ＴｒｐＬＥ遺伝子に結合した「３−フレームリ
ンカ−」を用いることにより、そのトリプレットリーデ
ィングフレーム（および２個のアウト・オブ・フレーム
「ナンセンス」ポリペプチド）にかかわらず所望の異種
ポリペプチドを得ることができる。３−フレームリンカ
−が無ければ、正しいリーディングフレーム方向をもた
らす融合部位を選択するかまたは複雑なりローニング戦
略を用いなければならないため、可能な融合部位の数が
制限されることになる。３−フレームリンカ−を用いる
と、正しい（「センス」）リーディングフレームが未知
の場合でさえ容易に所望のポリペプチドを得ることがで
きる。

この発明の蛋白質とは異なるある種の融合蛋白質が、明
らかに異なる方法によりＴｒｐＬＥ遺伝子を用いて製造
された。ヨーロッパ特許出願３６７７６および１１４５
０６号参照。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の根本原理解明にお
ける重大な進歩は、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連徴候（
ＡＲＣ）の患者から新しい種類のレトロウィルスを単離
したことである。この群のウィルスは、リンパ節症ウィ
ルス（ＬＡＶ）（ワインーホブソン等、［セルＪ（Ｃｅ
ｌｌ）、４０巻、９−１７頁（１９８５年）〕、ヒトＴ
リンパ球白血病ウィルスｎ１（ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｒ［［
）　［ラトナー等、「ネイチャー」（Ｎａｔｕｒｅ）、
３１３巻、２７７−８４頁（１９８５年）〕およびＡＩ
ＤＳ関連レトロウィルス（ＡＲＶ）〔サンチェスーペス
カドール等、［サイエンスＪ（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２
７巻、４８４−９２頁（１９８５年）〕と様々に呼ばれ
ている。形態学および生物学的見地から見ると、この群
のウィルスはレンチウィルス科と非常に密接な関係にあ
る。これまで１００を越える単離体が異なる研究グルー
プにより得られた。プロウィルスＤＮＡの制限酵素分析
によると様々な単離体の間におけるかなりの程度の配列
多形性が示唆されている。限られた数のクローン単離体
の間でヌクレオチド配列を比較すると、配列可変性がエ
ンベロープ遺伝子内で特に明白であると思われる。

我々は８５名のＡＩＤＳ患者におけるこれらの構造上の
相異の意義をウィルス感染に対する個々の免疫応答を比
較することにより評価を試みた。

健康な者並びにＡＲＣおよびＡＩＤＳ弘者から而清試料
を採取し、ウェスタンプロット分析を用いてクローンさ
れたＡｔＤＳウィルス蛋白質との免疫反応性についてス
クリーンした。以前の研究者らはアッセイにおいて感染
したＡＩＤＳウィルス粒子由来の蛋白質を使用してきた
。例えば、サーンガドハラーン等、サイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）、２２４巻、５０６−０８頁（１９８０年）
、シュプバッハ等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２
２４巻、５０３−０５頁（１９８４年）参照。我々のア
プローチはまず前記ＴｒｐＬＥベクターを用いて大腸菌
においてＡＩＤＳウィルスのサブゲノムセグメントをク
ローンおよび発現することにより、後の血清試験の抗原
として用いる特異的組換え蛋白質または蛋白質フラグメ
ントをらたらすことであった。こうして生産された試薬
は、ウィルス感染診断の際に有用であることに加えてワ
クチン成分としても貴重なものであり得る。他の研究者
らはＡＩＤＳウィルスゲノムのクローン部分に対して（
我々の方法より）利益の劣るクローニングベクターおよ
び方法を用いてきた。例えば、ガロ等、「サイエンス」
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２８巻、９３−９６頁（１９８
５年）、ガロ等、「ネイチャー　Ｊ（Ｎ　ａｔｕｒｅ）
、３１５巻、１５１−１５４頁（１９８５年）、ウォン
グースタ、−ル等、「セルＪ（Ｃｅ１１）、４１巻、９
７９−９８６頁（１９８５年）参照。

この明細書に我々は、大部分のＡＩＤＳウィルスゲノム
に及ぶ７種の組み換えクローンの作成について記載する
。誘導後、ＡＩＤＳ患者から得られた血清と免疫反応す
る新規融合蛋白質が生産された。我々はまた、組換え蛋
白質を用いて１５２個の血清をスクリーンすることによ
り７種のクローンの中からＡＩＤＳウィルスに対する抗
体を検出するのに最も有用なものを確立する実験を開示
する。

［定義］ 特許請求の範囲を含むこの明細書中に登場する語は次の
ように定義される。

ｒＧＲＦＪの語は、成長ホルモン放出因子を表わす。Ｈ
ｕＧＲＦ　がヒト成長ホルモン放出因子を意味するのに
対し、ＰＧＲＦおよびＢＧＲＦはそれぞれブタおよびウ
シ種の場合を意味する。

この明細書で用いられているｒＡＩＤＳウィルス」の語
は、ＮＡ−２、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＡＲＶ。

ＬＡＶおよび類縁ウィルスを指すが、これらはＡＩＤＳ
、ＡＲＣ，ＬＡＤおよび類縁疾患の原因または原因であ
る疑のあることが知られている。

ｒＨＢＶＪの語は、Ｂ型肝炎ウィルスを指す。

ＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に用いられている「
配列」の語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸モノマーが
特定の順序で配置されたＤＮＡ分子またはポリペプチド
分子を指す。

ｒＴｒｐＬＥ・（制限酵素）」形の語は、５′末端から
対応する制限酵素認識部位までのＴｒｐＬＥ欠失変異Ｄ
ＮＡ配列を指す。すなわちｒＴｒｐＬＥ−Ｓｓ（■」の
語は、最初の５ｓｔＩＩ制限部位までのＴｒｐプロモー
ターおよびＬＥ蛋白質をコードするエシェリヒア・コリ
（Ｅ−ｃｏｌｉ、大腸菌）ＤＮＡ配列を指す。同様に、
ｒＴｒｌ）ＬＥ　＃　Ｂｓ５ＨＩ［Ｊの語は、最初のＢ
ｓ５ＨＩＩ制限部位までのＴｒｐＬＥ蛋白質をコードす
るエシェリヒア・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）ＤＮＡ配列を指
す。

ｒＴｒｐＬＥ・（制限酵素）−（異種配列）」形の語は
、５′から３′へ向かって、指定された最初の対応する
制限酵素認識部位までのＴｒｐプロモーターおよびＴｒ
ｐＬＥ蛋白質をコードするＴｒｐＬＥ欠失変異ＤＮＡ配
列であって、所望により続いて３−フレームリンカーセ
グメント、開裂可能なリンカ−配列または両方を伴い、
３−フレームリンカ−（存在する場合のみ）の制限部位
、開裂可能なリンカ−配列（存在する場合のみ）の３′
末端またはＴｒｐＬＥ配列の３′末端に挿入された所望
の異種蛋白質をコードする異種ＤＮＡを有する場合を指
す。

例えば、ｒＴｒｐＬＥ−ＳｓｔＩ［−ＨｕＧＲＦＪの語
は、切頭されたＬＥ蛋白質、所望により３−フレームリ
ンカーセグメントおよび／または開裂可能なリンカ−配
列およびヒト成長ホルモン放出因子をコードするＤＮＡ
配列を指す。

ｒＬＥ−（異種ポリペプチド）」の形の語は、ＤＮＡ配
列ＴｒｐＬＥ・（制限酵素）−（異種配列）を発現させ
ることにより産生された融合蛋白質を指す。

例えば、ＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７は、ＴｒｐＬ
Ｅ−ＳｓｔＩ［−１−１ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（Ｓｓ
ｔｌＩ部位までのＬＥポリペプチドを含む）またはＴｒ
ｐＬＥ・Ｂｓ５Ｈｆｆ−Ｉ−（ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７
（Ｂｓ５Ｈｆｆ部位までのＬＥポリペプチドを含む）、
所望により開裂可能なリンカ−または３−フレームリン
カ−によりコードされたオリゴペプチドおよび２７位の
アミノ酸をロイシンと置き換えることにより修飾された
ヒト成長ホルモン放出因子を発現させることにより得ら
れた融合蛋白質を指す。

「開裂可能なリンカ−配列」の語は、当業界で公知の方
法により容易に開裂し得るペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列を指す。例えば、メチオニン含有ポリペ
プチドは、臭化シアン（ＣＮＢｒ）を用いて容易に開裂
され、Ａｓｐ−Ｐｒｏペプチド配列は酸加水分解により
開裂され、そしてＡｓｐ−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ
　−Ｌｙｓ配列はエンドペプチダーゼエンテロキナーゼ
により開裂される。例えば、ライト等、「アナリティカ
ル・バイオケミストリーＪ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋、　）１０６巻１９９−２０６頁（１９８０年）参
照。異種ポリペプチドの変性を避けるためには、異種ポ
リペプチドにも存在する開裂可能なペプチド配列をコー
ドする開裂可能なリンカ−配列を用いるべきではない。

例えば、異種蛋白質がＡｓｐ−Ｐｒｏ結合を内部に含む
場合、Ａｓｐ−Ｐｒｏをコードしない開裂可能なリンカ
−配列を用いるのが好ましい。

「３−フレームリンカ−」または「３−フレームリンカ
−配列」の語は、プラスミドベクターのＴｒｐＬＥコー
ドセグメントに挿入された後、３つのリーディングフレ
ームのいずれか１つにおいて異種配列の挿入および発現
を可能にかる１個またはそれ以上のＤＮＡ配列のセット
を指す。「３−フレームリンカーセグメント」の語は、
異種配列が挿入された後ＴｒｐＬＥ遺伝子および異種配
列間に残存する３−フレームリンカ−の部分を指す。後
記実施例では、各々が特定の制限酵素の認識部位を含む
８．１０および１２塩基ＤＮＡ配列をＴｒｐＬＥ配列に
挿入した。次いで異種配列を３−フレームリンカ−の酵
素認識部位に挿入すると、ＴｒｐＬＥ−（１塩基）−（
制限部位）−異種配列、ＴｒｐＬｔ−（２塩基）−（制
限部位）−異種配列およびＴｒｐＬＥ−（３塩基）−（
制限部位）−異種配列を有するプラスミドが得られた。

すなわち、異種配列は３つのリーディングフレーム、す
なわち１つの「センス」フレーム（所望のポリペプチド
をコードする）および２つの「ナンセンス」フレームの
各々においてこのプラスミドから発現され得る。発現後
、免疫試薬を用いてセンスポリペプチドは容易に同定さ
れる。

「異種配列」の語は、発現ベクターに本来みられない蛋
白質または蛋白質セグメントをコードするＤＮＡ分子を
指す。具体的な′異種配列は、ヒト、ウシまたはブタ成
長ホルモン放出因子、成長因子、ウシ成長ホルモンおよ
び抗原ライスルまたは細菌性蛋白質、とくにＡＩＤＳＩ
ＤＳライスル質（これらに制限されない）を含むポリペ
プチド類をコードする。

開裂されたｄｓＤＮＡ断片に用いる、「３′末端」の語
は、「センス（有意な）」または解読銀から転写される
ｍＲＮＡの３′末端に対応するｄｓＤＮＡ断片の末端を
指す。

［発明の要約］ この発明の一態様は、ＴｒｐＬＥＤＮＡ遺伝子フラグメ
ント、所望による３−フレームリンカ−１所望による開
裂可能なリンカ−および異種ＤＮＡ配列を含む、融合蛋
白質の発現全目的とする細菌性発現ベクターである。３
−フレームリンカ−および開裂可能なリンカ−の両方を
用いる場合、どちらが先でもよい。

この発明の別の態様は、融合蛋白質の発現を目的とする
細菌性発現ベクターの製造方法であって、ＴｒｐＬＥ　
　ＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドを用意し、ＴｒｐＬＥ
　　ＤＮＡ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼにより開裂
し、そして異種ＤＮＡ配列を挿入することからなる方法
である。所望による開裂可能なリンカ−の前後に所望に
よる３−フレームリンカ−を挿入することができる。所
望による開裂可能なリンカ−配列の挿入はこの方法のど
の時点でもよい。

この発明の別の態様は、ＴｒｐＬＥボリペブヂドフラグ
メント、所望により３−フレームリンカ−フラグメント
および異種ポリペプチドまたはそのフラグメントもしく
は誘導体を含む融合蛋白質である。３−フレームリンカ
−および開裂可能なリンカ−の両方を用いる場合、どち
らが先でもよい。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質の有効量
を投与することによる哺乳類における抗体産性の誘導方
法である。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル
のどちらでもよく、異種ポリペプチドの存在を検出する
かまたはウィルス、細菌もしくは菌類感染に対する免疫
性を与える場合に用いられ得る。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質の有効量
を投与することによる、細胞ウィルス受容体にけつ拮抗
結合することに上り哺乳類のウィルス感染を低減または
予防する方法である。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質であって
、ウィルス、細胞または菌類に暴露された哺乳類からの
抗体結合に用いられるイムノアッセイ試薬である。

この発明の別の態様は、感染に対して動物を免疫化する
ワクチンであって、この発明の融合蛋白質またはその一
部分および医薬的に許容される賦形剤、好ましくはアジ
ュバントを成分とするワクチンである。

この発明は、適当な天然細菌ポリペプチド、Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏジペプチドリンクおよび異種ポリペプチドを含む、
細菌宿主における生産に適した融合蛋白質に関するもの
である。

この発明はまた、適当な天然ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドリンクをコード
するＤＮＡ配列および異種ＤＮＡ配列を順に含む、融合
蛋白質生産を目的とするプラスミド発現ベクターに関す
るものである。

この発明はまた、適当な天然ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を含むプラスミドを準備し、ＡＳｐ　Ｐｒｏ
ジペプチドリンクをコードするＤＮＡ配列を挿入し、そ
して異種ＤＮＡ配列を挿入することからなる組換え方法
による融合蛋白質の生産方法に関するものである。

°この発明はまた、酸性条件下Ａｓｐ−Ｐｒｏ連鎖を加
水分解することによりＡｓｐ−Ｐｒｏリンクおよび異種
ポリペプチドを有する融合蛋白質から異種ポリペプチド
を放出させる方法に関するものである。

し図面の記載］ この発明の様々な対象および利益が得られる方法は次の
詳細な記載および添付図面から一層明確なものとなるで
あろう。

第１図は、中間体ベクタープラスミドｐＴｒｐＥ−＃２
２の構造を示す。

第２図は、発現ベクターｐＴｒｐＬＥ−＃　１４の構造
を示す。

第３ＡおよびＢ図は、プラスミドｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ・５
ｓｔＩ［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７−Ａおよびプラス
ミ　ド　ｐＴｒｐＬＥ　　−５ｓｔｌｌ−ＨｕＧＲＦ　
　　Ｌｅｕ２　７−Ｂから産生されたｍＲＮＡをコード
すると予測されるＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。末
端配列は文献から入手できる情報に基づいている。Ｈｕ
ＧＲＰセグメントのアミノ酸は頭文字で示す。

第４図は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞
からＨｕＧＲＦを産生するのに用いられる精製機序のフ
ローチャートを示す。

第５図は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞
からＴｒｐＬＥＳＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲ
ＦＬｅｕ２７およびＴｒＰＬＥ−９ｓｔＩＩ−ＨｕＧＲ
ＦＬｅｕ２７蛋白質を高率で産生ずることを示すＳＤＳ
蛋白質ゲルを描いたものである。

第６図は、ＣＮＢｒ開裂前の細胞溶解および遠心分離に
よるエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からのＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩ［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の精
製を示すＳＤＳ蛋白質ゲルを描いたものである。

第７Ａ、７Ｂおよび０図は、ＴｒｐＬＥ−Ｓｓｔｆｆ−
ＨｕＧ　ＲＦ　　Ｌｅｕ２７　（７Ａ）およびＴ　ｒｐ
Ｌ　Ｅ　−ＢｓｓＨＩＩＩ−ＩｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７
（７Ｂ）のＣＮＢｒ処理により放出されたペプチドのＨ
ＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）プロフィールを
描いたものである。第７Ｂ図のＨＰＬＣフラクションに
ついてアデニル酸シクラーゼ活性化によるＧＲＦ活性ア
ッセイを行ない、そして結果を第７Ｃ図に示した。第７
Ａ図の矢印は、ピーク活性を有するフラクションを示す
。

第８Ａおよび８Ｂ図は、融合蛋白質のＣＮＢｒ開裂およ
びＨＰＬＣ分画後分画−ＨｕＧＲＦ抗血清を用いたＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩｌ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（８
Ａ）およびＴｒｐＬＥ−ＳｓｔｌＩ−ＨｕＧＲＦ’Ｌｅ
ｕ２７　（８Ｂ）のウェスタンプロットを描いたもので
ある。

第９Ａおよび９Ｂ図は、クーマシ−（（Ｃｏｏｍａｇｓ
ｉｅ）・ブリリアント・ブルー・スティン（Ａ）による
幾つかのＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７製剤の純度、および
抗−ＨｕＧＲＦ抗血清を用いたウェスタンブロッティン
グを描いたものである。標品のＨｕＧＲＰ（Ｓ）をＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７（レ
ーン１１２）およびＴｒｐＬＥ−ＳｓｔＩＩ−ＨｕＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７（レーン３）の２種のロー）トから精
製されたＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７と比較する。マーク
の無いレーンは分子量標準値を含む。

第１０図は、第９Ａ１９Ｂ図記載のロット１．２および
３のＨＰＬＣプロフィールを描いたものである。

第１１図は、ウィルスの主なオープンリーディングフレ
ームに関連して記載した特異的クーロンの位置を説明す
るＡＩＤＳウィルスゲノムの地図（ＧＡＧ、ＰＯＬ、Ｅ
ＮＶ、ＡおよびＢ）である。

第１２図は、３名のＡＩＤＳ患者から得た血清のプール
を用いたウェスタンブロッティング法により可視化され
たＴｒｐＬＢ−Ａ　Ｉ　ＤＳ融合蛋白質およびＡＩＤＳ
ウィルス感染細胞（ＢＡＧ）の基準パターンを示す。

第１３図は、１９個のヒト血清試料のウェスタンブロッ
ティング分析から得られた結果を図示したものである。

各血清試料を用いて様々なＴｒｐＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋
白質（ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＥＮＶ）、インサートの無イＴ
　ｒｐＬ　Ｅベクター（ＶＥＣＴＯＲ）およびＡｔＤＳ
ウィルス感染細胞（Ａ　Ｉ　ＤＳ）をプローブした。各
パネル上の数は、積極的に反応する血清試料の数を示す
。

［詳細な記載および好ましい具体例］ この発明の一態様は、ＴｒｐＬＥ　　ＤＮＡ遺伝子フラ
グメントおよび異種ＤＮＡ配列を含み、融合蛋白質の発
現を目的とする細菌性発現ベクターである。好ましい亜
属はさらに上記ＴｒｐＬＥフラグメントおよび上記異種
ＤＮＡ配列間に３−フレームリンカーセグメントを有す
るベクターである。

この発明の好ましい綱は、さらに上記ＴｒｐＬＥフラグ
メントおよび上記異種ＤＮＡ配列間に開裂可能なリンカ
−配列を有し、特に前記の開裂可能なリンカ−がＭｅｔ
、　Ａｓｐ−ＰｒｏまたはＡｓｐ−Ａｓｐ　−Ａ　ｓｐ
　−Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｙｓをコードするベクターである
。

好ましい亜綱は、上記異種ＤＮλ配列がひと、うしもし
くはぶた成長ホルモン放出因子またはその生物活性誘導
体もしくはフラグメント、抗原ウィルス蛋白質またはそ
の生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメント、また
は成長因子もしくはホルモンまたはその生物学的に活性
な誘導体もしくはフラグメントをコードするベクターで
ある。好ましい種は、抗原ウィルス蛋白質がＡＴＤＳ蛋
白質、特にＥＮＶポリペプチドおよび特にポリペプチド
ＫＡＬ−１０である、抗原ウィルス蛋白質をコードする
ベクターである。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋白
質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の表面抗原の前Ｓ配列
であるものである。別の好ましい種は、成長ホルモン放
出因子誘導体をコードし、特に前記誘導体がＨｕＧＲＦ
　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　　Ｌ　ｅｕ２７またはＰ　Ｇ
　ＲＦ　　Ｌ　ｅｕ２７であるベクターである。別の好
ましい種は、成長ホルモンをコードするベクターであっ
て、特に成長ホルモンがうし成長ホルモンである場合で
ある。

この発明の別の態様は、融合蛋白質の発現を目的とする
細菌発現ベクターの生産方法であって、ＴｒｐＬＥ　　
ＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドを準備し、 ＴｒｐＬＥ　　ＤＮＡ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ
により開裂し、そして、 異種ＤＮＡ配列を挿入する ことからなる方法である。好ましい亜属は、さらに異種
配列を挿入する前後に開裂可能なリンカ−配列を挿入す
ることを含む方法である。この発明の好ましい綱は、開
裂可能なリンカ−配列がＭｅｔ、Ａｓｐ−Ｐｒｏまたは
Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ｌ
　ｙｓ。

特にＭｅｔまたはＡｓｐ　　ｐｒｏをコードする方法で
ある。好ましい亜調は、上記異種ＤＮＡ配列がひと、う
しもしくはぶた成長ホルモン放出因子またはその生物活
性誘導体もしくはフラグメント、抗原ウィルス蛋白質ま
たはその生物活性誘導体もしくはフラグメント、または
成長因子もしくはホルモンまたはその生物活性誘導体を
コードする方法である。

好ましい種は、異種配列が抗原ウィルス蛋白質をコード
し、その抗原ウィルス蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥ
ＮＶポリペプチドおよび特にポリペプチドＫＡＬ−１０
である方法である。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋
白質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の前−８配列である
場合である。別の好ましい種は、異種配列が成長ホルモ
ン放出因子誘導体をコードし、特にその誘導体がＨｕＣ
ＲＦ　Ｌｅｕ２７、Ｂ　Ｇ　ＲＰ　Ｌ　ｅｕ２７または
ＰＧＲＦＬ　ｅｕ２７である方法である。別の好ましい
種は、異種配列が成長ホルモンをコードし、特にその成
長ホルモンがうし成長ホルモンである方法である。

別の好ましい亜属は、融合蛋白質の発現を目的とする細
菌性発現ベクターの生産方法であって、ＴｒｐＬＥ　　
ＤＮＡ遺伝子を有するプラスミドを選択し、 ＴｒｐＬＥ　　ＤＮＡ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼ
により開裂し、 ３−フレー１３リンカ−を挿入し、そして３−フレーム
リンカ−内に異種ＤＮＡ配列を挿入する ことからなる方法である。好ましい亜綱は、上記異種Ｄ
ＮＡ配列がひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出因
子またはその生物活性誘導体もしくはフラグメント、抗
原ウィルス蛋白質またはその生物活性誘導体もしくはフ
ラグメント、または成長因子もしくはホルモンまたはそ
の生物活性誘導体もしくはフラグメントをコードする方
法である。

好ましい種は、異種配列が抗原ウィルス蛋白質をコード
し、その抗原ウィルス蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥ
ＮＶポリペプチドおよび特にポリペプチドＫＡＬ−１ｏ
である方法である。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋
白質がＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウィルス）の前−６配列である
方法である。別の好ましい種は、異種配列が成長ホルモ
ン放出因子誘導体をコードし、特に前記誘導体がＨｕＣ
ＲＦ　　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７またはＰ
ＧＲＦ　Ｌｅｕ２７である方法である。別の好ましい種
は、異種配列が成長ホルモンをコードし、特に前記成長
ホルモンがうし成長ホルモンである方法である。

この発明の態様は、ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメン
トおよび異種ポリペプチド、またはそのフラグメントも
しくは誘導体を含む融合蛋白質である。この発明の好ま
しい亜属は、さらにＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメン
トおよび異種ポリペプチド間に３−フレームリンカーオ
リゴペプチドセグメントを含む融合蛋白質である。好ま
しい亜綱は、異種ポリペプチドがひと、うしもしくはぶ
た成長ホルモン放出因子またはその生物活性誘導体もし
くはフラグメント、抗原ウィルス蛋白質またはその生物
活性誘導体もしくはフラグメント、または成長因子もし
くはホルモンまたはその生物活性誘導体もしくはフラグ
メントである融合蛋白質である。好ましい種は、異種ポ
リペプチドが抗原ウィルス蛋白質であり、前記抗原ウィ
ルス蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥＮＶポリペプチド
および特にポリペプチドＫＡＬ−１０である融合蛋白質
である。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋白質がＨＢ
　Ｖ　（Ｂ型肝炎ウィルス）の前−８配列である場合で
ある。別の好ましい種は、異種ポリペプチドが成長ホル
モン放出因子誘導体であり、特に前記誘導体がＨｕＧＲ
Ｆ　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦ　Ｌｅｕ２７またはＰ　Ｇ　
ＲＦ　Ｌ　ｅｕ２７である融合蛋白質である。

別の好ましい種は、異種ポリペプチドが成長ホルモンで
あり、特にその成長ホルモンがうし成長ホルモンである
融合蛋白質である。

この発明の好ましい亜属は、さらにＴｒｐＬＥポリペプ
チドフラグメントおよび異種ポリペプチド間に開裂可能
なリンカ−オリゴペプチドを含む融合蛋白質である。こ
の発明の好ましい綱は、開裂可能なリンカ−オリゴペプ
チドがＭｅｔ、　Ａｓｐ−ＰｒｏまたはＡ　ｓｐ　−Ａ
　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｙｓ、特にＭ
ｅｔまたはＡｓｐ　　Ｐｒｏである方法である。好まし
い亜−は、異種ポリペプチドがひと、うしまたはぶた成
長ホルモン放出因子またはその生物活性誘導体もしくは
フラグメント、抗原ウィルス蛋白質またはその生物活性
誘導体もしくはフラグメント、または成長因子もしくは
ホルモンまたはその生物活性誘導体もしくはフラグメン
トである融合蛋白質である。好ましい種は、異種ポリペ
プチドが抗原ウィルス蛋白質であり、前記抗原ウィルス
蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質、特にＥＮＶポリペプチドおよ
び特にポリペプチドＫＡＬ−ｔ　Ｏである融合蛋白質で
ある。別の好ましい種は、抗原ウィルス蛋白質がＨＢＶ
（Ｂ型肝炎）の前−８配列である場合である。別の好ま
しい種は、異種ポリペプチドが成長ホルモン放出因子誘
導体であり、特に前記誘導体がＨｕＧ　ＲＦ　Ｌｅｕ２
７、Ｂ　Ｇ　ＲＦ　Ｌ　ｅｕ２７またはＰ　Ｇ　ＲＦ　
Ｌ　ｅｕ２７である融合蛋白質である。別の好ましい種
は、異種ポリペプチドが成長ホルモンであり、特に前記
成長ホルモンがうし成長ホルモンであり融合蛋白質であ
る。

この発明の別の態様は、この発明の融合蛋白質の有効量
を投与することによる哺乳類における抗体形成誘導方法
である。好ましい亜属は、前記抗体がポリクローナルま
たはモノクローナルであり、異種ポリペプチドの存在を
検出するのに有用なものである方法である。この発明の
好ましい綱は、検出されるべき異種ポリペプチドがウィ
ルスである方法である。好ましい種は、前記ウィルスが
ＡＩＤＳウィルスまたはＨＢＶである方法である。

別の好ましい亜属は、前記抗体かウィルス、細菌もしく
は菌類感染に対する免疫を与えるのに有用な抗体を中和
する方法である。好ましい種は、抗体がＡＩＤＳに対す
る免疫を与える方法である。

別の好ましい種は、抗体がＨＢＶに対する免疫を与える
方法である。

この発明の別の態様は、融合蛋白質の有効量を投与する
ことにより、細胞のウィルス受容体に拮抗結合すること
による哺乳類のウィルス感染を低減または予防する方法
であって、前記融合蛋白質がＴｒｐＬＥポリペプチドフ
ラグメントおよび哺乳類細胞ウィルス受容体により認識
されるウィルスポリペプチドを含んでいる方法である。

好ましい種は、ウィルスポリペプチドがＡＩＤＳウィル
スポリペプチドである方法である。

この発明の別の態様は、ウィルス、細菌または菌類に暴
露された哺乳類からの抗体結合用イムノアッセイ試薬で
あって、ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントおよび抗
原ウィルス、細菌または菌類ポリペプチドを含む融合蛋
白質である試薬である。

好ましい綱は、上記ポリペプチドがウィルスポリペプチ
ドであるイムノアッセイ試薬である。好ましい玉網は、
ウィルスポリペプチドがＥＮＶまたは表面蛋白質または
そのフラグメントである試薬である。好ましい種は、Ｅ
ＮＶ蛋白質がＡＩＤＳ蛋白質フラグメント、特にＫＡＬ
−１０である試薬である。別の好ましい種は、表面蛋白
質がＨ８７表面抗原の前−５配列である試薬である。

この発明の別の態様は、適当な天然細菌ポリペプチド、
Ａｓｐ−Ｐｒｏ（アスパルチル−プロリル）ジペプチド
リンクおよび異種ポリペプチドを含む、細菌宿主におけ
る発現に適した融合蛋白質である。

この発明の好ましい綱は、天然ポリペプチドがＴｒｐＬ
Ｅである融合蛋白質である。好ましい玉網は、異種ポリ
ペプチドが成長ホルモン、特にうし成長ホルモンである
融合蛋白質である。別の好ましい玉網は、異種ポリペプ
チドが成長ホルモン放出因子、特にひと膵臓成長ホルモ
ン放出因子である融合蛋白質である。

この発明の別の態様は、融合蛋白質生産を目的とするプ
ラスミド発現ベクターであって、順次適当な天然ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、ジペプチドＡＳｐ−Ｐ
ｒｏをコードするＤＮＡ配列および異種ＤＮＡ配列を含
むベクターである。好ましい綱は、天然ＤＮＡ配列がＴ
ｒｐＬＥをコード化するベクターである。好ましい玉網
は、異種ＤＮＡ配列が成長ホルモン、特にうし成長ホル
モンをコードするベクターである。別の好ましい玉網は
、異種ＤＮＡ配列が成長ホルモン放出因子、特にひと膵
臓成長ホルモン放出因子をコードするベクターである。

この発明の別の態様は、組換え方法による融合蛋白質生
産方法であって、適当な天然ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を含むプラスミドを準備し、ジペプチドＡｓ
ｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡ配列を挿入し、そして異
種ＤＮＡ配列を挿入することからなる方法である。好ま
しい亜属は、天然ＤＮＡ配列がＴｒｐＬＥをコードする
方法である。

好ましい玉網は、異種ＤＮＡ配列がうし成長ホルモンを
コードする方法である。

この発明の別の態様は、Ａｓｐ−Ｐｒｏリンクおよび異
種ポリペプチドを有する融合蛋白質から異種ポリペプチ
ドを放出させる方法であって、酸性条件下にＡｓｐ−Ｐ
ｒｏ連鎖を加水分解することを含む方法である。好まし
い亜属は、酸加水分解をｐＨ２〜４で行なう方法である
。好ましい綱は、約３５〜４５℃で６０〜７５％蟻酸を
用いて酸加水分解を行なう方法である。好ましい玉網は
、４０℃で７０％蟻酸を用いる方法である。好ましい具
体例は、前記融合蛋白質がＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧ
Ｈである方法である。別の好ましい綱は、特に約１０５
℃ないし約１１５℃の温度で約０．５〜２％のドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて前記加水分解を行な
う方法である。好ましい玉網は、１１０℃で２％ＳＤＳ
を用いる方法である。好ましい具体例は、前記融合蛋白
質がＬＥ−ＡＳｐ−Ｐｒｏ　−Ｂ　Ｇ　Ｈである方法で
ある。

（ＴｒｐＬＥ） ＬＥＥ白質をコードするＤＮＡ配列および異種ポリペプ
チド間の融合は、同じ翻訳リーディングフレーム内にお
いてＬＥＥ白質の種々の末端部分（ｄｉｓｔａｌ　ｐｏ
ｒｔｉｏｎ）が異種ポリペプチドと置換されるようによ
り行なわれる。さらに、ＬＥＥ白質における他のアミノ
酸挿入、欠失および置換が所望の生成物の精製を容易に
するように行なわれ得る。

細胞は、この発明の発現媒体を加えることにより形質転
換され、外生プロモーター・オペレーターが抑制された
条件下で成長する。例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ））リプトフアンプロモーター・オペレータ
ー（Ｔｒｐプロモーター）の場合、細胞は加えられたト
リプトファンの存在下で成長する。これがＴｒｐプロモ
ーターを抑制することにより、融合蛋白質の過剰発現に
よる欠失作用をともなわずに細胞成長を正常に進めるこ
とができるのである。組み換え培養物がポリペプチドの
工業生産に適した細胞密度に達したとき、抑制の外的原
因（例、トリプトファン）を除去するか、または別法と
して外部誘導物質（例、インドールアクリル酸）を加え
る。こうして外生プロモーター・オペレーター（例、Ｔ
ｒｐプロモーター）を抑制解除し、異種インサートの高
い効率の発現がもたらされる。

この発明は、ＬＥＥ白質部分により付与された自己集合
特性により細菌蛋白質の残りから容易に分離され得る異
種ポリペプチド−含有融合蛋白質を含む、様々な有用な
中間体および最終生成物を提供する。次に融合蛋白質は
特異的に開裂されて所望の異種ポリペプチドを放出し得
るが、これの精製はＬＥ蛋蛋白円内融合部位を選択する
ことにより容易になる。別法として融合蛋白質を開裂せ
ずに用いて例えばワクチンまたはイムノアッセイのモノ
クロナール抗体を製造し得る。

ＴｒｐＬＥ蛋白質クローニング領域の最初の単離。

はエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ））リプトフア
ンプロモーター・オペレーターの遺伝子操作の結果であ
った。パートランド、スカイアーズおよびヤノフスキー
、［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジーＪ
（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ）、１０３巻、３１９−３
３７頁（１９７６年）、ミオツアーリおよびヤノフスキ
ー、［ジャーナル・オブ・バクテリオロジーＪ（Ｊ、　
Ｂａｃｔ）、１３３巻、１４５７−１４６６頁（１９７
８年）参照。これらの最初の欠失（変異）の１例、Ｔｒ
ｐＬＥ　１４１３はプラスミドｐＶＶ１について得られ
、［ニコルスおよびヤノフスキー、「メソッズ・イン・
エンザイモロジーＪ（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
）、１０１巻、１５５−１６４頁（１９８３年）］、そ
してこの明細書中の実施例で用いられるＬＥＥ白質ベク
ターを構成するのに使用された。この発明のための有効
なＬＥＥ白質ベクターを生成するのに必要なりＮＡ欠失
の本質的な特徴は、Ｔｒｐプロモーター・オぺレータ−
と関係があり、［ヤノフスキー等、「ニュクレイック・
アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ
ｓ、）’ＣＪ、６６４７−６６６８頁（１９８１年）］
、 ＴｒｐＬペプチドのアミノ酸＃１０をコードする塩基に
近い５′末端ブレークポイント、ＴｒｐＥコード領域全
体の約３分の２、好ましくはアミノ酸＃３３９に近い３
′末端ブレークポイントである。

このような欠失によりＴｒｐプロモーター・オペレータ
ーアテニュエイター域が除去され、高レベルの遺伝子発
現が可能となり、そしてほぼアミノ酸＃３３９からカル
ボキシ末端アミノ酸のＴｒｐＥ蛋白質領域が保たれるが
、これは異種蛋白質がカルボキシコード領域の一部分と
置き換えられた場合でも自己集合能力に対、し好ましい
ことである。

この発明の好ましい具体例はＬＥベクタープラスミドｐ
ＴｒｐＬＥ−＃１４である。これはエシェリヒア・コリ
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｔｒｐプロモーター・オペレータ
ーおよびｐｖｖｔからの１９１個のアミノ酸のＬＥコー
ト領域に続いて順次’Ｌ’ｒｐＤ遺伝子の一部分および
エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＲＡ　Ｎポリメ
ラーゼ−βザブユニット遺伝子からの転写ターミネータ
−フラグメントを含ｊｒｐＢｒｔ３２２ベースのプラス
ミドである［ＲｐｏＣ：スカイアー等、［ニュクレイッ
ク、アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、　）、９巻、６８２７〜６８４０頁（１９
８１年）参照］。ターミネータ−が、ｍＲＮＡ合成の終
結をもたらすことにより、プラスミドの複製または安定
性を妨げ得ろ興味の対象である遺伝子以外の転写を防ぐ
ことになる。またターミネータ−領域の写しは減成に対
してｍＲＮＡの３′末端を安定化する構造を形成する。

単独または異種遺伝子と融合したＬＥ蛋白質の発現は、
この明細書に記載されたプラスミドｐＴｒｐＬＥ−＃１
４のトリプトファンプロモーターおよびその誘導体によ
り、好都合にもたらされる。

しかしながら、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
における遺伝子発現を調節し得ることが知られている類
似の優れた特性を有するプロモーター・オペレーターＤ
ＮＡ領域をこれらの具体例で使用されたＴｒｐプロモー
ターと置き換えることができるものとする。Ｔｒｐプロ
モーター・オペレーターのプロモーター領域の方が、優
れた特性を有するためこの使用目的に適しており［クロ
ウフォードおよびスト−ファー、「アニュアル・レビュ
ー・オブーバイオケミストリーＪ（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

）４９巻、１６３−１９５頁（１９８０年）］、容易に
高レベルのｍ　ＲＮ　Ａ　ｓおよびトリプトファンを欠
いているかまたは誘導化合物インドールアクリル酸（Ｉ
ＡＡ）を含む媒地で成長させることによる蛋白質生成物
の産生を誘導することができる。

他の適当な制御成分にはＬａｃプロモーター、Ｔａｃプ
ロモーター、アラビノース、ガラクトースもしくはアル
カリホスファターゼオペロン、またはバクテリオファー
ジラムダからのプロモーター−オペレーター、またはこ
れらの選択された領域が含まれ得る。

同様に、ＲｐｏＣＤＮＡ断片による転写終結機能の供給
およびｐＴｒｐＬＥ−＃　１４で用いられたアンピシリ
ン耐性の選択可能なマーカーは一例として用いられたの
であり、この発明の範囲を限定するものではない。

（ＧＲＦ） 成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）は、哺乳類における成
長ホルモン放出を刺激する下垂体により分泌される小さ
な（４４個のアミノ酸）ポリペプチドである。ＧＲＦは
、動物の体重を増加させたり、また泌乳する哺乳類の乳
汁生産量を増加させるのに有用である。異なる種由来の
ＧＲＦは一般に下に示すように組成物中にわずかなアミ
ノ酸により相異している。

ヒト成長ホルモン放出因子（ＨｕＧｒｊＦ）のエシェリ
ヒア・コリ（Ｅ、’　ｃｏｌｉ）における産生は、Ｈｕ
ＧＲＦ　　ＤＮＡ配列をＴｒｐＬＥ配列に融合すること
により行なわれた。好ましい具体例において、ＨｕＧＲ
ＦおよびＬＥ蛋白質コード領域間の融合はメチオニンに
対するコドン（ＡＴＧ）によるものであるため、ＣＮＢ
ｒを用いたＭｅｔにおける特異的開裂によりＨｕＧＲＦ
を放出させることとなった。

ＨｕＧＲＦの２７位のメチオニンにおける開裂を防ぐた
めに、２７位を合成りＮＡにおいてロイシンに変え、こ
れをＬＥ蛋白質ベクターにクローンした。

ロイシンは自然発生の突然変異において最も頻繁にメチ
オニンと置き換えられるため選ばれたが、他の天然産生
アミノ酸と置き換えてＣＮＢｒ開裂を妨げることもでき
る。計算から予測されることは、ＭｅｔをＬｅｕと置き
換えると最少の２次構造における変化および疎水性がも
たらされることである［チョウおよびファスマン、「ア
ンドパンシーズ・イン・エンザイモロジーＪ（Ａｄｖ、
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、４７巻、４５−１４８
頁（１９７８年）コ。しかしながら、他の天然産アミノ
酸を代わりに用いてＣＮＢｒ開裂を妨げることができる
。合成りＮＡはまた、高度に発現されたエシェリヒア・
コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）蛋白質に好都合なアミノ酸コド
ンの使用を最大限にし［グランサム等、［ニュクレイッ
ク・アシッズ・リサーチ］（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓＲｅｓ、　）、９巻、ｒ４３−ｒ７４頁（１９８１年
）］、生成したｍＲＡＮにおける可能な２次構造を最小
にし、そして所望のクローンをスクリーンし、ＤＮＡ配
列における将来の選択を容易にするのに有用な都合のよ
い制限部位をもたらすことを目的とするものであった。

ＨｕＧ　ＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコードする合成りＮＡを
ＬＥ遺伝子の５ａｃＩＩ部位にライゲートしてＬＥ蛋白
質のカルボキシ末端の７３個のアミノ酸を置き換えるか
、またはＢｓ５Ｈ１１部位にライゲートして１１個のア
ミノ酸を置き換えた。

引用例はメチオニンをＬＥ蛋白質および異種ポリペプチ
ド間に挿入するが、この接合は２０個の天然産アミノ酸
の組み合わせを含み得るか、または−切含まず、化学的
または酸素的手段により特異的に開裂できる必要は無く
、かつこの発明の範囲内に帰するものとする。

ＬＥ遺伝子のＢｓ５Ｈｎまたは５ａｃＩＩ部位に融合し
たＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコードするプラスミドの
Ｔｒｐプロモーター・オペレーターからの発現の良好な
誘導は容易に達成された（第５図）。合成の反応速度お
よびＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の蓄積程度は培地の組成
物により異なる。インドールアクリル酸（ＩＡＡ）は、
比較的豊かな培地、Ｌブロスにおける合成を最大限に誘
発するのに必要であった。反対に、最小の培地、Ｍ−９
にＩＡＡを包含させると、ＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７の最終レベルではなく蓄積の速度だけが変わった。

Ｍ−９で成長後のＬＥ−ＨｕＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７は全
蛋白質ま３５％はどであるのに比べて、Ｌブロスおよび
ＩＡＡの場合は１５〜２　’Ｃ％であった。プラスミド
の最大安定性は、発現が望まれるまで２Ｏ−１ＯＯμｇ
／ｍＱのトリプトファンを含有する培地で成長させるこ
とにより得られる。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の精製は、低速遠心分離によ
り溶解された細胞からＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７
蛋白質の不溶性アグリゲートを回収することにより開始
されたく第６図）。この物質を７０％蟻酸中ＣＮＢｒに
より処理した。蟻酸は沈澱物におけるＬＥ融融合蛋白質
アクリゲート溶解させることにより次の工程に用いる均
質溶液をもたらすのに好まし溶媒として有用である。融
合蛋白質自体が所望の生成物である場合、ＳＤＳまたは
尿素のような溶媒が後続工程の前にＬＥ融融合蛋白質ア
クリゲート溶解させるのに用いられ得る。過剰のＣＮＢ
ｒおよび蟻酸を除去後、１Ｎ酢酸により不溶性物質から
ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７ペプチドを抽出した。次いで
逆相ＨＰＬＣによる分画前に抽出物を希緩衝液に透析し
た。

逆相ＨＰＬＣまたはカルボキシメチルセルロースおよび
）ＩＰＬＣの組み合わせを用いてＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７を充分に分割した（第７図および８図）。後者の方
が、）ＩＰＬＣのみで分離され得ない汚染物質をカルボ
キシメチルセルロースが除去するためＴｒｐＬＥ−５ａ
ｃＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７クローンから単離さ
れた物質に対して好ましかった。ＨＰＬＣによりＴｒｐ
ＬＥ−ＢｓｓＨＩｌ−トｒｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７クロ
ーン（第７Ｂ図）またはＴｒｐＬＥＳａｃＩＩ−ＨｕＧ
ＲＦ　　Ｌｅｕ２７クローン（第７Ａ図）から製造され
た透析物を分画するとほとんど等しい全蛋白質のＨＰＬ
Ｃプロフィールが得られた。反対に、感受性ウェスタン
ブロッティング技術を用いて分析すると（第８Ｂ図）、
５ａｃｌＩクローン由来のＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７が
ＨＰＬＣから高分子量の免疫反応物質により溶離するこ
とがわかった。５ａｃＩ［クローンＨｕＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７からの透析物をまずカルボキシメチルセルロース
で分別すると、ＨＰＬＣ精製物質が実質的にこれらの汚
染物質から遊離した（第９Ｂ図）。最高純度のＨｕＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７がカルボキシメチルセルロース段階を
経ずにＢｓ５Ｈクローンから単離されたが、これは免疫
反応性汚染物質がＨＰＬＣにより充分能されたためであ
る（第８Ａ図）。これらの免疫反応性生成物の同一性は
、限定量のＣＮＢｒによりみられる免疫反応性生成物と
の同時泳動、インビトロＧＲＦアッセイにおけるアデニ
ル酸シクラーゼ刺激能力および抗−ＨｕＧＲＦ血清との
反応性に基づくものであった。

プレパラティブＨＰＬＣにより単離された物質のアミノ
酸配列は、２７位のＭｅＬＧＬｅｕと置き換えたことを
含めて正しいことがわかった。９５％より高い純度の試
料（第９および１０図）は、ウシ下垂体細胞抽出物を用
いたインビトロアッセイにおけるアデニル酸シクラーゼ
および培養の下垂体細胞からの成長ホルモン放出の両方
を刺激することがわかった。

例えばブタ視床下部から単離されたＨｕＧＲＦのブタ類
縁体（ＰＧＲＦ）は、アミノ酸配列においてカルボキシ
末端方向の３つの位置がＨｕＧＲＦとは異なる。すなわ
ちＳｅｔ　−３４−＋Ａｒｇ、　Ａｒｇ　−３８−ｅＧ
Ｉｎ、　Ａｌａ−４２−＋Ｖａｌ［ボーレン等、「バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズＪ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｌ１１．　）、１１６巻、７
２６−７３４頁（１９８３年）］。したがって、Ｔｒｐ
ＬＥ蛋白質との融合としてのＰＧＲＦのＰＧＲＦ　　Ｌ
ｅｕ２７類縁体の発現は、制限エンドヌクレアーゼを用
いてＬＥ−ＢｓｓＨＩ［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２’７
：＋−ド領域の後半部分を特異的に欠失し、その位置に
ＰＧＲＦのカルボキシ末端をコードする合成りＮＡ断片
を挿入することにより行なわれた。ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７ホルモンの場合のように、誘導細胞からＬＥ−Ｂ
ｓｓＨｎ−ＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７融合蛋白質が高収率
で生産され、多量に沈降し、そしてＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７が、ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７に対して用いたのと
同じ方法により容易に精製された。プレバラテイブＨＰ
ＬＣにより単離された物質は、アミノ酸組成物の分析に
より純粋であることおよび前記ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２
７に適用したのと同じ基準により生物学的に活性である
ことがわかった。

ウシ視床下部から単離された、ＨｕＧＲＦのウシ類縁体
（ＢＧＲＦ）は、ＨｕＧＲＦとはカルボキン末端方向の
５つの位置で異なる。すなわち、Ｓｅｔ　−２８−ｅＡ
ｓｎ、　Ｓｅｔ　−３４−＋ＡｒｇＳＡｒｇ　−３８−
＋ＧｌｎＳＡｒｇ　−４１→Ｌｙｓ、　Ａｌａ　−４２
−ｅＶａｌｏＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の構成および発現
と同様に、ＬＥ−Ｂｓｓｆ−ＩＩＩ−ＢＧＲＦ　　Ｌｅ
ｕ２７ポリベプチドをコードするクローンが構成され、
発現され、そしてＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７が好都合に精
製され、純粋で生物学的に活性であることがわかった。

これと同じ手順がＬＥ−ＢｓｓＨＩ［−ＰＧＲＦＬｅｕ
２７融合ポリペプチドの発現並びに３種の異なる共給源
、ヒト、ブタおよびウシから得られるＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７の精製に好便に適用された。

ＩＤＳ 幾つかの動物由来成長ホルモン放出因子を高収率で生産
するためのエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌυ（大腸菌
）発現ベクターの作成および用途について既に記載して
きた。このベクター、すなわちｐＴｒｐＬＥとして示す
ものはトリプトファンプロモーター・オペレーター由来
のの強力な細菌プロモーターを用いてＬＥとして知られ
ている新規蛋白質を発現する。各々の成長ホルモン放出
因子の発現は、正しい翻訳リーディングフレームにおい
てそれぞれの成長ホルモン放出因子遺伝子をＬＥ遺伝子
のカルボキシ末端に融合させることにより達成された。

ＬＥ担体蛋白質はそれ自体ＴｒｐＬＥ蛋白質のアミノ末
端およびＴｒｐリーダーのセグメント間の融合蛋白質で
ある。フレーム内およびＬＥ蛋白質から下流に外来遺伝
子配列を接合させることにより、本発明者はこのベクタ
ーおよび類縁ベクターを用いて幾つかの異種ポリペプチ
ドを高収率で発現させることに成功した。

ｐＴ　ｒｐＬ　Ｅの単−Ｂｓ５ＨＩＩ部位に様々な長さ
く例、８、１０および１２個のヌクレオチド）の合成り
ａｍＨＩリンカ−を挿入することにより、融和性の制限
酵素末端の側面のいかなる翻訳オープンリーディングフ
レームの発現でも可能にする発現ベクターの新しいセッ
トを本発明者は作成した。例えば、細菌またはウィルス
ＤＮＡは、５ａｕ３Ａ（ＧＡＴＣ認識）により（完全ま
たは部分的に）開裂され、予めＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣ
Ｃを認識）により開裂し、アルカリホスファターゼによ
り処理しておい°た３種のベクターにライゲートされ得
る。ＬＥ担体または異種ペプチドに対する抗体を用いて
、組換え免疫反応性蛋白質を産生ずる形質転換体を同定
することができる。

ＡＩＤＳウィルスゲノムについての発現ライブラリーを
生成するために、ｐＢｅｎｎ＃２０由来のＤＮＡフラグ
メントを制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａにより部分
的に開裂し、３種のオープンリーディングフレームベク
ター、ｐＳＢ８、ｐｓＢｌｏおよびｐｓＢ１２に挿入し
た。プラスミドｐＢ　ｅｎｎ＃２０は、プロウィルスＤ
ＮＡの８Ｋｂセグメントおよび９Ｋｂのフランキング（
側面を向ける）細胞ＤＮＡを含む組換えプラスミドとし
て而に作成されたものであった。

ｐＢｅｎｎ＃　２０由来の放射能標識したＤＮＡフラグ
メントを用いたコロニーハイブリダイゼーションにより
ＡＩＤＳウィルスインサートの存在について形質転換体
をスクリーンした。その結果８０％を越える形質転換体
がインサートを含むことがわかった。したがってさらに
、形質転換体を、インサートの由来するＡＩＤＳウィル
スゲノム領域に基づくサブグループに分割することがで
きた。

次にこれらのサブグループから選択されたクローンを、
その抗ＡＩＤＳウィルス血清と免疫反応性のある蛋白質
粒子の産生能力について試験した。

誘導された組換え細菌培養から製造された蛋白質抽出物
を、各々以訂に抗ＡＩＤＳウィルス抗体を産生ずること
が確認された３名の患者からプールした血清を用いてウ
ェスタンプロット分析に付した。

次いでプラスミドＤＮＡを陽性反応コロニーから製造し
、それらのヌクレオチド配列を測定した。

ＡＩＤＳプロウィルス内の各々のインサートの位置を、
インサートの境界におけるＤＮＡ配列をＡＩＤＳウィル
スゲノムの公表されたヌクレオチド配列と比較すること
により測定した（第１表）。その結果、各抗体反応性ク
ローンがＬＥ担体蛋白質の転写および翻訳に関して正し
い方向および正しいリーディングフレームにおいて挿入
されたＡｔＤＳウィルスＤＮＡフラグメントを含むこと
が確認された。第１ｔ図は、５個の５ａｕａＡ組換えク
ローンのゲノムにおける位置を要約したものであり、第
１２図は、ウェスタンプロット分析により示されたそれ
らの蛋白質プロフィールを示す。

ＡＩＤＳウィルス由来のゲノムライブラリー（これは３
種のオープンリーディングフレームベクターへの任意の
５ａｕ３Ａフラグメントのインサージョンに基づいたも
のであった）に加えてさらに、特異的ＡＩＤＳウィルス
ＤＮＡフラグメントを含む２種のクローンを作成した（
第１１図）。

１番目の特異的クローン作成ではＬＥ由来のベクター（
ｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬと称す）を用いたが、そのベクタ
ーにおいて単一のＢｓ５ＨＩＩ部位に対して遠位にある
ヌクレオチド配列を、ＫｐｎｌおよびＢａｍＨｌの両方
により開裂可能な部位を含み、またペンタペプチドＡｓ
ｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓ＋ｐ　−Ｌｙｓをコー
ドするように修飾した。このペプチジル連鎖は、エンド
ペプチダーゼエンテロキナーゼによる開裂に対する特異
的認識部位としての役割を果たし得る。

プラスミドｐＢｅｎｎ＃　２０からのＡＩＤＳウィルス
ＤＮＡの　２．１　５Ｋｂ　　Ｋｐｎｌ−Ｂａｍｌ−Ｉ
　　Ｉ　　ＤＮ、へフラグメントをｐＴｒｐＬＥ−ＫＡ
Ｌに挿入した。

このフラグメントはＥＮＶ遺伝子の主たる部分に及ぶ。

誘導後、生成したプラスミド、通称ｐＴ　ｒｐＬＥ−Ｋ
ＡＬ−ＥＮＶ−＃　１０は、ＳＤＳゲル上で蛋白質性生
成物の再現可能なパターンをもたら、マ し、それらは抗ＡＩＤＳ血清とインキュベートしたウェ
スタンプロットにおいて強い免疫反応性を示した（第１
２図）。このことはＡＩＤＳウィルス遺伝子が正しい翻
訳リーディングフレームおよびＬＥ遺伝子から下流に挿
入されたことを示すものであった。　ｐＳＢ−Ｇａｇ−
＃２５と称する２番目の特異的クローンは、正しいリー
ディングフレームおよびＬＥ遺伝子から下流に挿入され
たＡＩＤＳウィルスＧＡＧ遺伝子（第２図）からの０゜
９５　Ｋｂ　Ｐｖｕ［Ｉ　〜Ｂｇ１２Ｉ［Ｄ　Ｎ　Ａフ
ラグメントを用いて作成された。誘導後直ちにこの形質
転換体は抗ＡＩＤＳ血清と免疫反応性のある多重ポリペ
プチドを産生じた（第１２図、レーンＧ）。゛ＡＩＤＳ
またはその関連疾患の患者から得た血清によるウスタン
ブロッティングを用いてウィルス標的抗原を確認した。

この明細書に記載された発現ベクターを用いて、ウェス
タンプロットにおける抗原として用いられるＡＩＤＳ蛋
白質を生産した。エンベロープ由来蛋白質は、リンパ節
症、ＡＲＣおよびＡＩＤＳを患う患者から得た抗体によ
り非常に明白で確実に認識された（第１３図、第２表）
。しかしながら、危険性の高いグループの多勢を占める
者（例、同性愛者および静注麻薬常用者）もまたＥＮＶ
蛋白質に対する抗体を伴っていた。

ＧＡＧおよびＰＯＬ蛋白質に対する抗体はＡＩＤＳウィ
ルス感染の有用な指標であると報告されたが、我々の得
た結果は各々ＢＮＶに対する抗体を有する者の部分集合
的なもののみがまたＧＡＧまたはＰＯＬ蛋白質に対する
抗体を有することを示している。逆に、ＧＡＧまたはＰ
ＯＬに対する抗体を有しなからＥＮＶに対する抗体をも
たない者は確認されなかった。すなわち、ＥＮＶクロー
ンｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　１０により生産
された組換えＡＩＤＳ　ＥＮＶ蛋白質は、ＧＡＧまたは
ＰＯＬのようなウィルスゲノムの他の領域由来の蛋白質
よりＡＩＤＳウィルス感染診断用試薬に適している。ｐ
Ｔ　ｒｐＬ　Ｅ　−Ｋ　Ａ　Ｌ　−Ｅ　Ｎ　Ｖ−＃１０
により生産された多重ＥＮＶ関連蛋白質種は、ウェスタ
ンプロットにおいて再現可能な認識パターンをもたらす
ため、イムノアッセイ結果についての明白な解釈が容易
になる。エシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ、大腸菌）
におけるこれらのＥＮＶ関連蛋白質試薬の生産は、ＡＩ
ＤＳ感染した動物細胞培養を用いた生産より安全で経済
的である。

ＡＩＤＳプロウィルスＤＮＡ、特に一般に行なわれてい
るＥＮＶ遺伝子における配列可変性の原因および機能は
まだ知られていない。この明細書中でクローン化および
配列されたウィルスは初めはパスツール研究所のグルー
プからＬＡＶウィルスストックとして入手したものであ
った。細菌において生産されたＬＥ−ＥＮＶ蛋白質は、
普通存在する糖蛋白質化が起こらず、ＥＮＶオープンリ
ーディングフレーム全体の一部分だけした含まないが、
あらゆるＡＩＤＳおよびＡＲＣＳ患者から得た抗体はＬ
Ｅ−ＥＮＶ融合蛋白質と強く反応した。すなわち、ＡＩ
ＤＳプロウィルスＤＮＡの配列可変性がＥＮＶオープン
リーディングフレームの部分を用いた診断において問題
をもたらすとは考えられない。すなわちＡＩＤＳＥＮＶ
ポリペプチドは診断用試薬として有用性がある。

ＡＳＰ−ＰＲＯ連鎖を有する融合蛋白質２個の蛋白質配
列を架橋する酸に不安定なＡｓｐ−Ｐｒｏジペプチドを
コードする大腸菌発現ベクターを作成し、２種の異なる
うし成長ホルモン（ＢＧＨ）融合蛋白質の合成に用いた
。Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするコドンＧＡＴ−ＣＣＸは
、制限酵素ＢａｍＨＩのＧＧＡＴＣＣ認識部位によりも
たらされる。プラスミドｐ’ｒ　ＥＢ　Ｇ　Ｈは分子量
２２０００ダルトン（２２Ｋｂ）を有するＬＥ−ＢＧＭ
融合蛋白質をコードし、またプラスミドｐＳＢＢＧＨは
４０ＫｂのＬＥ−ＢＧＨ融合蛋白質をコードする。

両方のベクター共、予想通りのサイズの融合蛋白質の発
現を導き、またこれらの蛋白質は抗−ＢＧＨ抗体と特異
的に反応する。グアニジン塩酸塩の存在下低１）ＨでＢ
ＧＨ融合蛋白質を処理すると、特異的抗−ＢＧＨ免疫反
応性を保有するＢ　Ｇ　Ｈサイズの蛋白質が放出される
。融合蛋白質からＢＧＨを放出させるためにはＢＧＭ配
列を融合蛋白質に接合するＡｓｐ−ｐｒｏジペプチドリ
ンクが必要である。ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＨ蛋白
質は細胞蛋白質全体の５％より多くなるまでエシェリヒ
ア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ、大腸菌）において増大する
。ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＨ融合蛋白質から放出さ
′れたＢＧＨは、インビトロで成長ホルモン受容体に結
合する能力を保有している。

ＢＧＭ融合蛋白質を得るために我々が用いた発現ベクタ
ーは、ＢＧＨが酸に不安定なジペプチド架橋体、Ａｓｐ
−Ｐｒｏジペプチドにより２番目のペプチドに接合され
ているポリペプチドの発現に必要なりＮＡヌクレオチド
配列を有するように作成された新規なプラスミド、ｐＳ
ＢＢＧＭ由来のものであった。

ｐｓ　Ｂ　Ｂ　Ｇ　Ｍプラスミドは、トリプトファン（
Ｔｒｐ）プロモーターおよびオペレーターおよびＬＥ蛋
白質ヌクレオチド配列を含むプラスミドｐＴ　ｒｐＬＥ
１４１３のＥｃｏＲＩ　−ＢｓｓＨＩＩのフラグメント
並びにプラスミドｐＶＶ２０２ｔのＢａｍＨ１部位が側
面に位置した転写ターミネータ−から作成された。プラ
スミドｐＢＲ３２２が、複製のもとの供給源として用い
られた。この後のプラスミドはまた、アンピシリン耐性
遺伝子に対するヌクレオチド配列を含む。これらの配列
は、成長を確実にし、所望のプラスミドを含む細菌の選
択に用いるために選ばれた。前記のプラスミドｐＳＢＢ
ＧＨに存在するＤＮＡ配列はすべてプラスミドｐＰＳ−
＃８由来であった。

ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＨ蛋白質発現方策（実施例
１４参照）は、正しい翻訳リーディングフレームを維持
しながらｐＰ　Ｓ　−＃　８のＬＥ配列のＢｓ５ＨＩＩ
制限部位の隣にＢａａ＋ＨＩ制限部位を加えることであ
った。このプラスミドをＩ）ＳＢと呼ぶこととした。次
にシグナルペプチドを除いた成熟ホルモンをコードし、
またＢａｍＨＩ末端を有するＢＧ　ＨｃＤ　Ｎ　Ａ配列
をプラスミドｐｔｅＬＢ　Ｇ　ＨからｐｓＢのＢａｍＨ
１部位にクローンした。生成したプラスミドｐＳＢＧＧ
）［は、Ｔｒｐプロモーターの転写制御下にＬＥ−Ａｓ
ｌ）−Ｐｒｏ−ＢＧＨ融合蛋白質遺伝子をコードする。

この明細書特記しない限り、エシェリヒア・コリ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ、大腸菌）は標準的方法を用いて形質転換さ
れたものとする。特記しない限り製造者の指示に従い、
全部の酵素反応を１時間３７℃でインキュベートした。

特記しない限りすべてのライゲーション（結合）反応で
はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いた。プラスミドｐＰｓ−＃
８として明細書中で認めた、ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−８
０Ｍ蛋白質の発現に用いられるプラスミドは、下記実施
例に記載の工程により作成された。まずｐｐ　Ｓ　＃　
３と称するプラスミドおよび２番目のｐＬＥｈｐＧＲＦ
（ＢｓｓＨｎ）＃５と称するプラスミドを作成した後、
プラスミド＃３のフラグメントをプラスミドＩ）ＬＥｈ
ｐＧＲＦ（ＢｓｓＨ［１）＃５のフラグメントと混合し
、Ｈｂｌ　０１に形質転換してｐＰＳ−＃８と称するプ
ラスミドを得た。このプラスミドにＢａｍＨＩ制限部位
を加えてｐｐ　Ｓ　Ｂと称するプラスミドを得た。

次いでＢＧＨヌクレオチド配列を加えてＬＥ−Ａｓｐ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｂ　Ｇ　Ｈ蛋白質を発現するプラスミド
、ｐＳＢＢＧＭを作成した。

［実施例および製造例］ 以下の実施例および製造例の記載は、分子生物学または
生化学専門技術者には明らかなものである。核酸操作の
常用技術、例えばＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼまた
はＤＮＡリガーゼによる処理、電気泳動による分離、エ
タノール沈殿、電気溶出、および他の方法についての更
に詳しい記載は常用テキストで見い出すことができる。

例えばマニアラス等、「モレキュラー・クローニング、
ア・ラボラトリ−・マニュアルＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａ
ｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−（１９８２年）参照。

制限酵素消化によるＤＮＡ開裂は、化学製品市販者の一
般的勧告にしたがい行なわれた。

製造例１ 親プラスミド プラスミドｐＢＲ３２２の長さは約４４００個のヌクレ
オチ塩基（４，４ｋｂ（キロベース））であり、抗生物
質アンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔ
　ｅｔ）の耐性遺伝子を有する。この由来および特性に
ついては既に記載されている［ポリバー等、［ジーンＪ
（Ｇｅｎｅ）、２巻、９５−１１３頁（１９７７年）、
座ｐＢＲ３２２、シーンバンク、ＤＮＡデータベース、
リリース３４（１９８５年）コ。プラスミドｐＵｃ８お
よびｐＵｃ９はそれぞれ酵素β−ガラクトシダーゼをコ
ードする遺伝子のＬａｃプロモーターおよびアミノ末端
の１コピーを含む。この遺伝子のアミノ末端領域に幾つ
かの有用な制限酵素により認識されたＤＮＡ配列を含む
「カセット」を挿入する。プラスミドｐＵＣ８およびｐ
Ｕｃ９はこの「カセット」の方向のみで異なっているた
め、クローニング中のＤＮＡ断片の操作が容易なものと
なる。ｐＵＣプラスミドの構成および特性についての記
載は既に公表されている［ビエイラおよびスプリング、
「ジーンＪ（Ｇｅｎｅ）、１９巻、２５９−２６８頁（
１９８２年）］。

エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｔｒｐプロモ
ーター−オペレーターは、その完全なヌクレオチ配列に
ついてはすでに測定および分析されたが［ヤノフスキー
等、「ニュクレイック・アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、９巻、６６
４７−６６６８頁（１９８１年）、座ＥＣ０ＴＲＰ１シ
ーンバンク、ＤＮＡデータベース、リリース３４（１９
８５年）］、使用されたＴｒｐプロモーター・オペレー
ターＤＮＡ断片の供給源であった。

用いられた特定のプラスミドは、Ｔ　ｒｐＥ遺伝子に位
置する、Ｔｒｐプロモーターの上流の最も近いＰｖｕ１
１部位から最初のＨｉｎｆ　１部位までの０，４５ｋｂ
フラグメントのエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｔ
ｒｐオペロンＤＮＡを含むｐＮＯ３４２であった。ｐＮ
Ｏ３４２を構成するためには、ＴｒｐＤＮＡ上のＨｉｎ
ｆ　ｒ部位を充填し、そして次に修飾ＤＮＡ断片をｐＢ
Ｒ３２２のＨｉｎｄｌｌＩ部位に挿入する前に、両末端
（Ｐｖｕｌｌ末端および充填されたＨｉｎｆＩ）をＨｉ
ｎｄｕｌ１０塩基対長のリンカ−にライトゲートした。

次いでｐＢＲ３２２母体のＴｒｐプロモーターに続＜Ｅ
ｃｏＲ１部位に最も近いＨｉｎｄｌ１１部位をＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉにより切断し、末端を充填し、再びライトゲート
することにより破壊した。すなわちＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩ［［で消化することにより生成したプラスミド
からＴｒｐオペロンＤＮＡを除去することが可能となっ
た。この最終構築物、ｐＮＯ３４２は、ネイル・オシエ
ロフ博士（スタンフォード大学、生化学科、カリフォル
ニア９４３０５、パロ・アルド）から得られた。

この明細書に記載された構成に用いられた転写終結配列
を含むＤＮＡはプラスミドｐＶＶ２０２Ｌ（カリフォル
ニア９４３０５、パロ・アルド、スタンフォード大学、
生物化学科、ヤノフスキー研究所から購入）から得られ
た。ｐＶＶ２０２ｔから得られた０、３７ＫｂのＢａｍ
ＨＩフラグメントはエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌ
ｉ）　ｒｐｏＣ遺伝子の転写終結領域からの３２５塩基
対を含む［スカイアーズ等、「ニュクレイック・アシッ
ズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ
ｓ、　）、９巻、６８１７〜６８４０頁（１９８１年）
、座ＥＣ０ＲＰＬＲＰ、塩基＃１１２２６−１１５５１
シーンバンク・データベース（１９８４年ＩＯ月）］。

ＴｒｐＬＥ遺伝子はプラスミドｐＶＶｌから得られたが
（これについては前に記述済み［ニコルスおよびヤノフ
スキー、［メソッズ・イン・エンサイモロジーＪ（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１巻
、１５５−１６４頁（１９８３年）コ）ヤノフスキー研
究所から購入された。

プラスミドｐＢｅｎｎ＃　２０　ＤＮＡを、様々なプラ
スミド作成に用いるＡＩＤＳウィルスＤＮＡの供給源と
して用いた。ｐＢｅｎｎ＃２０は次のようにして作成さ
れる。すなわち、Ｔリンパ球培養（Ａ３０１）［フォー
クス等、「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８２巻、４５３９
−４３頁（１９８５年）］をＡＩＤＳウィルスＮＡ−２
（マーチン等５、原稿′Ｉ！Ａ備中）により感染させた
。感染９日後、全部の細胞ＤＮＡを感染した細胞から単
離した。高分子量の細胞ＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素
Ｂａｍ１−１１により開裂した。開裂された細胞ＤＮＡ
５μ９をＢａｍＨｌ−開裂ラムダＪＩＤＮＡ［ｒネイヂ
＋　−ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）、３０８巻、８５６−８５８
頁、（１９８４年）］１μ９にライゲートした。次いで
試験管内封入したライゲートされたＤＮＡを用いてエシ
ェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞を感染させた。

ＡＩＤＳプロウィルスＤＮＡを含む組換えファージを、
ハイブリダイゼーシジンプローブとして放射能標識した
ＡＩＤＳウィルスｃＤＮＡを用い、その場でプラークハ
イブリダイゼーションにより確認した。

陽性ファージプラークが確認された。組換えファージ粒
子から精製されたＤＮＡの分析により８Ｋｂのウィルス
ゲノム（左末端の長い繰り返し配列、ＧＡＧ遺伝子、ポ
リメラーゼ遺伝子およびエンベロープ遺伝子の４分の３
）および９Ｋｂの細胞側面配列を含む１７Ｋｂのインサ
ートが明らかになった。続いて１７にインサートを単−
ＢａｍＨ１部位によりプラスミドｐＢＲ３２２に転位さ
せた。新しく形成された（孫）プラスミドをｐＢｅｎｎ
＃２０と命名した。

製造例２ オリゴヌクレオチ合成 ティ等の［ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティー　Ｊ（Ｊ　、　Ａｍ、　ＣｈｅＩｌ。

Ｓｏｃ、）１０４巻１３１６頁（１９８２年）記載にし
たがい保護デオキンリボヌクレオキシドを製造した。固
相亜燐酸トリエステルアプローチによりすべてのオリゴ
ヌクレオチを合成した［カルザース等、［ジーン、アン
プリフィケーション・アンド・アナリシスＪ（Ｇｅｎｅ
　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄＡ　ｎａＬｙｓ
ｉｓ）、ババス、ローゼンバーグ、チリキャン編、エル
スピア、ニューヨーク、１−２６頁（１９８３年）］。

それぞれの鎖は、テトラゾールにより活性化された２０
モル当量の５’　−〇−Ｎ保護デオキシヌクレオシドー
３′−〇−メチルーＮ−モルホリノホスホルアミダイト
を用いて［ドーパ−およびウイネーカー、「ニュクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１
ｄｓ　　Ｒｅｓ、　）、１１巻、２５７５頁（１９８３
年）］脱保護および宿合し、酸化し、そして未反応部位
をブロックすることから連続サイクルを用いて構成され
た。合成完了後、メトキシおよびＮ−保護基を除去し［
カルザース（１９８３年）前記引用］、粗ジメトキシト
リチルオリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣによって精製
した。８０％酢酸による処理後、充分に脱保護された生
成物を、７Ｍ尿素を含む調製用２０％ポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動によりさらに精製した。［γ−
”Ｐ］ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて
精製されたオリゴヌクレオチドをラベルした。次いで２
０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルを用いた電気泳
動により大きさおよび純度を確かめた。

実施例１ ＴｒｐＬＥプラスミドの製造 プラスミドクローニングベクターｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ　−
＃１４の構築は多段階方法によるものであった（第１お
よび第２図）。第１段階において、ＴｒｐＥおよびＤ遺
伝子の両方およびＴｒｐＣ遺伝子の１部分を含むプラス
ミドｐＶＶ２０２ｔを処理して単一のＨｉｎｄＩＩ［部
位をつくった。Ｈｉｎｄ［［により１゜０μｇのｐｖｖ
　２０２ｔ　ＤＮＡを消化し、フェノール−〇ＨＣρ３
で抽出し、エタノール（ＥｔＯＨ）沈澱後、４０ｎＨの
再溶解ＤＮＡをＴ４　　ＤＮＡリガーゼによりセルフラ
イゲートし、生成物をエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ）　Ｈｂ　１０１に形質転換した。アンピシリン耐
性コロニーをＴｒｐＤ遺伝子の出発点およびターミネー
タ−間の単−ＨｉｎｄＩＩ［部位の存在についてスクリ
ーンした。ｐＶＶ−△ＨｉｎｄＩＩ［−＃３は所望の部
位を有していた。

後のクローニングのためにＴｒｐＥ遺伝子に単一のＢｓ
５ＨＩＩ制限部位を有するプラスミドを得ることが望ま
しかった。プラスミドｐＶＶ−ΔＨｉｎｄ■−＃３は、
ＴｒｐＥ遺伝子のＢｓ５Ｈ部位以外にさらにＴｒｐプロ
モーターの上流に１個またはされ以上のＢｓ５ＨＩＩ制
限部位を有することがわかった。

したがってＴｒｐプロモータ一部分を含むｐＶＶ−△Ｈ
ｉｎｄＩＩ［−＃３の約２．５ｋｂ断片（ＥｃｏＲ■〜
ＨｐａＩ　　）を機能的に類似したプラスミドルＮ０３
４２由来の２８２　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　〜Ｈｐａ　Ｉ断
片と置き換えた。ｐＮ０３４２由来の０．２８ｋｂＥｃ
ｏＲＩ　〜Ｈｐａ　Ｉ断片を５μｇのＤＮＡＮ化消化後
ポリアクリルアミドゲルから電気溶離することにより単
離した。次いでこのＤＮＡ断片１０ｎｇを予めＥｃｏＲ
ＩおよびＨｐａＩにより開裂されたｐＶＶ−△Ｈｉｎｄ
Ｉ［Ｉ−＃３．８０ｎｇとライゲート（結合）した。生
成物をエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｈｂ　１
０１細胞に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーをＢ
ｓ５ＨＩＩで消化することによりスクリーンして所望の
クローン、　　ｐＴｒｐＥ−＃２２を確認した。

ｐＴｒｐＥ−＃２２のＴｒｐプロモーター−リーダー−
Ｅ遺伝子領域とｐＶＶｌの類似部分との置換は第３番目
で最終段階であった。ｐＶＶ１由来のＤＮＡ（１００μ
ｇ　）をＢｓ５ＨＩＩおよびＨｐａｌで消化し、電気溶
離することにより約６．０．４．０．１．８．０，６．
０．５７および０．５４ｋｂの断片を得た。ＴｒｐＬＥ
遺伝子を含む０．５７ｋｂ断片を、消化生成物の分離に
使用された４％ポリアクリルアミドゲルから電気溶離に
より回収した。

フェノール−〇ＨＣｌ２３抽出およびＥｔＯＨ沈澱後、
再溶解した０、５７　ｋｂ　ＤＮＡ断片０．２μｇを、
Ｂｓ５ＨＩＩおよびＨｐａＩを用いた消化により得られ
たｐＴｒｐＥ−＃２２の５．ｌ　　ｋｂ　ＤＮＡ断片０
゜２５μｇとライゲートした。ライゲーション生成物を
ＢｓｔＸＩにより消化したが、これはこの認識部位がｐ
ＶＶＩのＴｒｐプロモーター・オペレーターから欠失さ
れたＤＮＡ部分に存するからである。

アンピシン耐性コロニーの中で、正しい構造を有するも
のとしてｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ　−＃　１４を確認した。

実施例２ ＴｒｐＬＥ−Ｓｓｔｌｌ−ＨｕＧＲＦをコードするクロ
ーンの製造。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコードする合成遺伝子は、
高度に発現されたエシェリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ
）蛋白質において好都合なアミノ酸コドンを最大部に用
い、生成したｍＲＮＡにおける可能な２次構造を最小に
し、所望のクローンをスクリーンするのに用いる好都合
な制限部位を提供し、そしてＤＮＡ配列における将来の
代替を容易にするように設計したものであった。合成遺
伝子配列および合成遺伝子配列を含む１８個の別々のオ
リゴデオキシヌクレオチドを下記に示すのが、以下のさ
らに詳細な記載と関連づけて参照されたい。

クローニングを容易にするために、ＨｕＧＲＦＬｅｕ２
７遺伝子を２つの部分、すなわちＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７のアミノ末端部分をコードする１０個のオリゴデオ
キシヌクレオチド（ＡＩ−ＡｔＯ）からなるＡセグメン
トおよびペプチドのカルボキシ末端部分をコードする８
個のオリゴデオキシヌクレオチドからなるＢセグメント
に分けて（下記に示す）クローンを行なうことにした。

Ａセグメントを会合させるために、１０個のオリゴデオ
キシヌクレオチド（Ａｔ−Ａｌ０）の各々を個別に燐酸
化した。次いで１０個の燐酸化されたオリゴデオキシヌ
クレオチドの各々５０ピコモルを１個のデユープに合わ
せた。１０分の１容量（２０μ１２）の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ＮａＯＡｃ）溶液および４倍容量（８００μＱ）
の無水ＥｔＯＨ（エタノール）溶液を混合しながら加え
た。溶液を１５分間−７０℃に冷却し、次に４℃で１５
分間１２０００ＸＧで遠心分離した。上清を除去し、沈
澱物を真空乾燥した。次いで乾燥した沈澱物を６６ミリ
モルのトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）、６゜６ミリモ
ルのＭｇＣ（ｈ、１０ミリモルのジチオトレイトールお
よび０．１ミリモルのＡＴＰ４８μＱに再けん濁した。

オリゴヌクレオチドをアニールするために溶液を４０℃
に加熱し、次に４時間にわたってゆっくりと２０℃に放
冷した。次いで５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、溶
液を２０℃で１２時間インキエベートした。アニーリン
グおよびライゲーション反応を繰り返し、そして結合（
ライゲート）した混合物をフェノールで抽出し、ＥｔＯ
Ｈ−沈澱を行なった。乾燥したＤＮＡを５０μＱの滅菌
水に再けん濁し、そして結合したオリゴデオキシヌクレ
オチド３５μＱをＨｉｎｄｌｌ［および５ｓｔｌ［の各
々１００単位により開裂した。反応混合物を４時間３７
℃でインキユベートし、ＥｔＯＨ−沈澱を行なった。５
ＳｔＩ［／Ｈｉｎｄ　ｍ−ＨｕＧ　ＲＦ　Ａ遺伝子やセ
グメントを６．７％ポリアクリルアミドゲルを用いたプ
レパラティブ電気泳動により未反応及び部分的に結合し
たＤＮＡ断片からゲル精製した。回収したＤＮＡをこの
明細書中では５ｓｔＩ［、Ｈｉｎｄ　ＩＩ−ＨｕＧＲＦ
−Ａ遺伝子セグメントと命名する。

前にＢｓ５ＨＩＩ、Ｈｉｎｄｌｎおよび５ｓｔＩＩによ
り開裂されたプラスミドｐＴｒｐＥ−＃２２ＤＮＡ６２
ｎｇを１２℃で１６時間、６６ミリモルのトリス−ＨＣ
ｌ２　（ｐＨ７，５）、６．６ミリモルまＭ　ｇ　ＣＱ
ｌ、１０ミリモルのジチオトレイトール、０．１ミリモ
ルのＡＴＰ中に１．０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む
最終容量２０μσ中約６．７ｎｇ（０，１４ピコモル）
の５ｓｔｌＩ−ＨｕＧＲＦ−Ａ遺伝子セグメントとライ
ゲートした。ライゲートされたＤＮＡ混合物をエシェリ
ヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株Ｈｂ１０１の形質転換
に用いた。形質転換体を５０μｇ／ｍＱのアンピシリン
を含むしブロスプレート上アンピシリン耐性について選
択した。２４個の個別に単離されたコロニーをスクリー
ニングした後、その中の８個が予想通りの約７６ｂｐの
５ｓｔｌＩ〜Ｈｉｎｄｎ［インサートおよびさらにイン
サートの由来のＮｄｅ１部位を有するプラスミドを含む
ことがわかった。マクサム−ギルバート法による塩基配
列分析ではこれらのうちの１個が予想通りの配列を有し
ていることが証明された。このプラスミドをｐＴｒｐＥ
−Ｓｓｔｎ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７−と命名した。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７遺伝子の残りを会合させるた
めに、Ｂセグメント（Ｂ２〜Ｂ７）を含む８個のオリゴ
デオキシヌクレオチ９６個を個別に燐酸化した。１０分
間７０℃に加熱することにより燐酸化を終結させた。オ
リゴデオキシヌクレオチドＢ１およびＢ８については末
端のセルフライゲーションを防ぐために初めから燐酸化
しなかった各々の燐酸化オリゴデオキシヌクレオチド（
Ｂ２−８７）２００ピコモルを燐酸化させていないＢｌ
およびＢ８の各々２００ピコモルと合わせた。

オリゴマーを沈澱させ、アニールし、そして前記と同様
にライゲートした。ＨｕＧＲＦ−Ｂ遺伝子セグメントを
７．５％のポリアクリルアミドゲル上プレパラティブ電
気泳動により未反応および部分的にライゲートしたＤＮ
Ａ断片から精製した。

回収されたＤＮＡの５′末端が燐酸化されていた。

続いて回収されたＤＮＡを５′燐酸化した。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のＡおよびＢ遺伝子セグメン
トを集合させるために、５マイクログラムのプラスミド
ｐＴｒｐＥ−ＳｓｔＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７−
Ａを５単位の制限エンドヌクレアーゼＢａａＨＩにより
部分的に消化した。フェノール抽出およびＤＮＡ−Ｅｔ
ＯＨ沈澱により反応を終結した。

回収されたＤＮＡをＩＯ単位の制限エンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄｌＩＩにより完全に消化した。部分開裂生成物
を分離するために０．７％アガロースゲルを用いて電気
泳動させた。最大（６，２１６ｋｂ）断片を切除し、電
気溶離を行なった。回収されたＤＮＡをフェノールで２
回抽出し、ＥｔＯＨ沈澱に付した。

６０ｎＨの６．２　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＢａ
ｍＨＩ−開裂ｐＴｒｐＥ−ｓｓｔＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　
Ｌｅｕ２７−ＡベクターＤＮＡをおよそ５倍モル過剰量
の７２　ｂｐ　ＨｕＧＲＰ−Ｂ遺伝子セグメントとライ
ゲートした。ライゲートされたＤＮＡ混合物をエシェリ
ヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌株Ｈｂｔｏｔの形質転
換に用いた。形質転換体を５０μｇ／ｍＱアンピシリン
含有しブロスプレート上アンピシリン耐性により選択し
た。幾つかの形質転換体が約０，５ｋｂの５ｓｔＩ［〜
ＢａｍＨＩインサートを有するプラスミドＤＮＡを含む
ことがわかった（インサート／ターミネータ−接合はＢ
ａｍＨＩ部位を再構成していない）。マキサムおよびギ
ルバートによる塩基配列分析［［プロシーディングズ・
オブ・ザ・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒ
。

ｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）７
４巻、５６０頁（１９７７年）］は、ｐＴｒｐＥ−Ｓｓ
ｔＩ［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７と命名されたプラス
ミドの１種が所望のＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７コード配
列を有することを示した。

ｐＴｒｐＬＥ−＃　Ｉ　４へのＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７
）の転写 ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の会合したＡおよびＢ遺伝子
セグメントおよび転写ターミネータ−を含む０．５ｋｂ
の５ｓｔｌ［〜ＢａｍＨＩインサートを５％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いたプレバラティブ電気泳動によりｐ
ＴｒｐＥ　＃　５ｓｔＵ−ＨｕＧＲＦＬｅｕ２７ＤＮＡ
から精製した。

６０ｎｇのＢｓ５ＨＩＩ、ＢａｍＨＩおよび５ｓｔＩ［
−開裂ｐＴｒｐＬＥ−＃　ｌ　４プラスミドＤＮＡを約
５倍モル過剰の０　、　５　ｋｂ　５ｓｔＩＩ〜Ｂａｍ
ＨＩ断片とライゲートした。ライゲートされた混合物を
エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）菌株Ｈｂ１０１
の形質転換に用いた。５０μｇ／ｍ（ｌのアンピシリン
を含むＬ−プロスプレート上アンピシリン耐性により形
質転換体を選択した。１２個の個別に単離されたコロニ
ーをスクリーニング後、２個が正しいＳａｔ■〜Ｂａｍ
ＨＩ断片を有するプラスミドＤＮＡを含むことがわかっ
た。マキサムおよびギルバートによる塩基配列分析［「
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・
ステーブ・オブ・アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ）７４巻、５６０頁（１９７７年）］は、プラス
ミドｐＴｒｐＬＥ−９ｓｔｌｌ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７が所望の配列（第３Ａ図）を有していることを示し
た。

実施例３ ｐＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨ■−ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）
の構成 同様にしてＴｒｐＬＥ遺伝子におけるＳｇｔＩＩ部位以
外の単−Ｂｓ５Ｈ１１部位を用いてＴｒｐＬＥ−ＨｕＧ
ＲＦ　　Ｌｅｕ２７を発現する遺伝子を構成することが
できる。

ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のＡセグメントを含む１０個
のオリゴデオキシヌクレオチドのうち８個（Ａ２〜Ａ９
）を個別に燐酸化した。１０分間７０℃に加熱すること
により反応を終結した。末端におけるセルフライゲーシ
ョンを防ぐためにオリゴデオキシヌクレオチドＡ１およ
びＡＩＯについては初めに燐酸化しなかった。燐酸化さ
れたオリゴデオキシヌクレオチド（Ａ２−Ａ９）の各々
２００ピコモル（ｐＭ）をＡＩおよびＡＩＯの各々２０
０′　ｐＭと合わせた。オリゴマーをＥｔＯＨ沈澱に付
し、アニールし、そしてライゲートした。ＨｕＧＲＦ−
Ａ遺伝子セグメントを７．５％ポリアクリルアミドゲル
を用いたプレパラティブ電気泳動法により未反応および
部分的にライゲートしたＤＮＡ断片から精製した。次い
で回収されたＨｕＧＲＦ−Ａセグメントの５′末端を燐
酸化し、予めＢｓ５ＨＩＩおよびＨｉｎｄＩＩ［で開裂
されたプラスミドｐＴｒｐＥ−＃２２とライゲートした
。ライゲーション混合物をエシェリヒア・コリ（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）　Ｈｂｌｏｌの形質転換に用いた。形質転換
体をさらにＮｄｅｌ制限部位の存在についてスクリーン
した。

所望のクローンはｐＴ　ｒｐＥ−［３ｓｓｒ−Ｉ　ＩＩ
　−ｔｒｕＧ　ｎＦ−Ａ命名した。

ＨｕＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７遺伝子配列を完全にするため
に、ＨｕＧＲＦ’−Ｂ遺伝子やセグメントおよび転写タ
ーミネータ−をｐＴｒｐＥ−９ｓＬＩＩ−ＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７から利用した。プラスミドｐＴｒｐＥ−９
ｓｔ［［−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を単一のＢａｍＨ
ｒおよびＨｉｎｄＩ［［部位のところで開裂した。

０．４ｋｂのＨｉｎｄ　ＩＩＩ〜ＢａｍＨＩ断片をゲル
電気泳動法により精製した。プラスミドｐＴｒｐＥ　−
Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ−ＡをＢａｍＨ’ｌおよびＨ
ｉｎｄ■により開裂し、最大断片を電気泳動後０．７％
アガロースゲルから精製した。これら２つの精製された
ＨｉｎｄＩｎ〜ＢａｍＨＩ断片をライゲートし、Ｅ、　
ｃｏｌｉ　　Ｈｂ　１０１に形質転換した。形質転換体
中のプラスミドＤＮＡを３箇所のＰｓＬＩ部位（１つの
Ｐｓｉ（部位はインサートにより付与された）の存在に
ついてスクリーンした。この技術によりプラスミドｐＴ
ｒｐＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦＬｅｕ２７を確認し
た。塩基配列分Ｆｆｒ（マキサムおよびギルバート法）
は、Ｂｓ５ＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ−Ａ遺伝子セグメントの
出発点に予想外の１個の塩基対欠失があることを示した
。すなわち、配列ＧＣＧ　　ＣＧＡ　　ＴＧ・・・は予
想していた配列ＧＣＧ　　ＣＧＧ　　ＡＴＧ・・・とは
別のものであることがわかった。これはＨｕＧＲＦ　　
Ｌｅｕ２７の残りに対するトリプレットリーディングフ
レームの変化をもたらすが、これを次の段階で修復した
。

ＴｒｐＬＥＤＮＡセグメントによるプラスミドｐＴｒｐ
Ｅ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のＴｒｐ
ＥＤＮＡセグメントの置換は、合成オリゴヌクレオチド
により２種の既述したプラスミドの結合部分により達成
された。このオリゴヌクレオチドは、Ｂｓ５Ｈ（Ｉおよ
びＮｄｅＩ部位間でＨｕＧＲＦ−ＡＤＮＡ配列を置換す
ることによりＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７合成のための正
しい翻訳リーディングフレームを修復することを目的と
して設計したものであった。異種ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７コード遺伝子をもたらすために、１２．５ｕｇのｐ
ＴｒｐＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７Ｄ
ＮＡをＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩにより開裂し、所望の
０．５ｋｂ断片をアガロースゲルから単離した。次に、
自己相補性合成オリゴヌクレオチドＴＡＧＣＧＣＧＣを
Ｔ４キナーゼで処理し、そして３０ＱｎＨの単離した断
片にライゲートした。次にこの反応混合物を１５分間６
０℃に加熱してキナーゼを不活性化し、次いでＢｓ５Ｈ
ＩＩにより開裂して０．５ｋｂのＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ
断片のＮｄｅｌ末端を１３ｓｓＨＵ部位に変換した（こ
れらを下式に示す）。

ＴｒｐＬＥコート逍伝子は、プラスミドｐＴｒｐＬＥ−
＃　ｌ　４をｌ３ｓｓｌ！■およびＢａｍ１−１１で消
化すること１こよりも７二’ｒされた。ｌｏｏｎｇの０
．５　ｋｂ　Ｂ　５ｓｌ−Ｉ　ＩＩ　−Ｂ　ａｍｌ（ｒ
断片および１１００ｎの二重消化されたｐＴｒｐＬＥ−
＃　Ｉ　４　ＤＮＡ間のライゲーションが行なわれた。

ライゲーション生成物を受容能力のあるエシェリヒア・
コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）１（ｂｌｏ１細胞に形質転換し
、アンピシリンプレート上に置いた。Ｂｓ５Ｈ口＋Ｂａ
ｍＨＩまたはＰｓｔＩを用いた消化により生成したコロ
ニーからのＤＮＡの制限醇素スクリーニングにより予想
された構造を有するものとして２４９中７個の候補が確
認された。プラスミドＰＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−Ｈ
ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７−＃１５のＤＮＡ配列をＤＮＡ
配列分析により確かめた（第３Ｂ図）。

実施例４ ＬＥ−ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の発現および精製ここ
に記載する方法を用いて、ＴｒｐＬＥ蛋白質とのＢｓ５
ＨＩＩまたは５ａｃＩＩ融合部位を用いたＬＥ−ＨＰ　
Ｇ　ＲＰ　　Ｌ　ｅｕ２７クローンからＩ−［ｕＧＲＦ
を精製することができる。開始萌に、誘導範囲を染色し
たＳＤＳゲルで洗浄した細胞ペレットｌアリコートを分
析することによりモニターすることができる。どちらか
のクローンを用いた透析点まで発現レベルまたは精製段
階における違いは無い（第４図）。透析中、Ｂｓ５ＨＩ
［クローンは大きな沈澱をおこすが、５ａｃＵクローン
の方はこれより小さい沈澱を形成する。すなわちＢｓ５
ＨＩｒ透析物を遠心分離するとさらに大きい沈澱物をも
たらすが、これを徹底的に洗浄して充分にＬＥ−ＨＰＧ
ＲＦＬｅｕ２７を回収しなければならない。

ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦの誘導 この場合、５０μｇ／ｍＱのアンピシリンおよび１００
μｇ／ｍ１２のトリプトファンを含むＬＢｒ培養培地［
この明細書に記載されたＬＢｒおよびＭ９培地の製造に
ついてはミラー、（１９７２年）［エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネテイツクスＪ（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）、４３１頁参照３５０ｍ１２のスターター培養
をプラスミドすなわち、ｐＴｒｐＬＥ　−Ｂｓ５ＨＩＩ
　−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を含むエシェリヒア・コ
リ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞と接種し、激しく振盪しなが
ら一夜３７℃で約６の最終Ａｓｓ。になるまで成長させ
る。

４リツトルの生産用Ｍ９培養培地を３７℃に予熱し、４
０−のＬＢｒスターター培養物を播種して約０．６の最
終Ａ。。を得る。次いで培養物を激しく振盪しながら約
０．２〜０．５のＡ３５０まで成長させ、そこにＥｔＯ
）を中インドールアクリル酸（、ＩＡＡ）のｌ０Ｒ９／
ｍ１２溶液４ｍＱを加えてＩＡＡの最終濃度１０μｇ／
ｍＱ溶液を得ろ。次ル）で良好なエアシーションを保ち
ながら約１６時間約５（一般には約５〜１０）の最終Ａ
３５（１になるまで成育を続ける。Ｍ９培地で成長中に
ＩＡＡを加えても最終収量ではなく生成物の蓄積速度を
増すだけであるからどちらでもよい。別の同程度に効果
的な細胞成長方法はＭ９の代わりにＬ［３ｒを用いろが
、この場合適当な産生量を得るためにはＩＡＡを加える
ことが必要である。細胞を遠心分離により濃縮し、５０
ミリモルのトリス−［ＩＣ１２（ｐＨ７１）５００ｎ＋
４２（一般的には初めの培養容量の１／１０〜Ｉ／２０
）に再けん濁し、そして再沈澱させた。洗浄された細胞
はこの段階で一２０℃で好都合に貯蔵され得る。

（超）音波処理 洗浄した細胞を音波破壊により溶解する。細胞を５０ミ
リモルノドリスーＨ０ｆｆ　（ｐｌ−１７，５）、０．
１ミリモルのＥＤＴＡｌ　１ミリモルのフェニルメチル
スルホニルぶつ化物（ＰＭＳＦＸこの緩衝液をｒＴＥ−
ＰＭＳＦＪと省略する）９００ｍ１２にけん濁し、４℃
に冷却し、数滴のオクタツールを加え、Ｎ、ガスを溶液
中でに吹き込む。これらの段階により音波処理中の試料
の加熱およびメチオニン残基の酸化を最少にすることが
できる。製造者の勧告にしたがいモデルＷ２２０Ｆヒー
ト・システムズ・ウルトラソニックス社製ソニケータ−
（３／４″ホーンを備えている）を用いてけん濁液を超
音波処理する。ソニケーターは一般に過熱を避けるため
全工程時間の５０％のみ作動する。

遠心分離 細胞リゼートを約３６００　ＸｇＩＩｌａｘで１５分間
遠心分離してｐＴｒｐＬＥ−ＨｕＧｒｔＦ　　Ｌｅｕ２
７を沈澱させ、上清を棄てる。沈澱物を４５０ｍ１２の
ＴＥ　−Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　（一般的には４０　８０　Ａ
　ｓｓｏ／　ｍ（りに再けん濁し、そして前と同様に遠
心分離により沈澱物を集めた。

実施例５ ＨｕＧ　ＲＦ　（Ｌｅｕ２７　）の精製ＴｒｐＬＥ−Ｈ
ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７融合蛋白質のメチオニン残基を
ＣＮＢｒにより開裂すると所望の異ＦＩＩＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７蛋白質が−ＯＨ形で放出されるがこれを下
記のように精製することができる。

沈澱物のＣＮＢｒ処理 ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の洗浄した沈澱
を穏やかに撹拌するかまたは渦を巻かせることにより６
０ｍ１２の７０％ぎ酸（約２０１９／ｍ１２の総蛋白質
、一般的には１０００Ａ５Ｓ。単位の細胞からの物質を
３ｔａ（ｌに溶解する）に再けん濁した。数滴のオクタ
ツールを加え、５．５ＨのＣＮＢｒを加える前に２０分
間Ｎ、を溶液中でに吹き込んだ。

この反応を２５℃で６時間進行させた後、続く濃縮階段
を容易にするために等容量の５’０：５０ＭｅＯＨ：Ｈ
ｔＯを加える。体積が半分に減少するまで揮発性の過剰
のＣＮＢｒ　ｓ水および有機溶媒を回転蒸発により除去
した。さらに５０：５０ＭｅＯＨ：Ｈ１０を試料と混合
し、続いて回転蒸発により除去した。この工程を２〜４
回繰り返すと大半のぎ酸およびＣＮＢｒは除去されてし
った。次いで試料を濃縮乾固し、２００−の水に再溶解
させて凍結乾燥した。

酢酸抽出 凍結乾燥した試料を８０ｍ１２のＩＮ酢酸に溶かし、少
なくとも３０分間２５℃で抽出した。１２００ＱＸｇｍ
ａｘで１０分間遠心分離後、上清を回収し、沈澱物を前
と同様に７０ｍＱのＩＮ酢酸により再抽出した。沈澱物
のフラクションを棄て、ＨｕＧＲＦＬｅｕ２７°を含む
上清を合わせた。

透析 次にＩＮ酢酸抽出物を３５００の分子量カットオフを有
する透析チュービングに入れ、全体で１８時間１０ミリ
モルの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ５，０、各
々４Ｌ）を４回取りかえて透析した。透析の前半は２５
℃、後半は４℃で行なった。

生成する沈澱を１０分間１０００１００００Ｘで遠心分
離により除去した。正当には沈澱物を緩衝液で洗浄する
ことにより可溶性フラクションにおけるＨｕＧＲＦの回
収を最大にした。

カルボキシメチルセルロースクロマトグラフィ次に清澄
した透析物を冷室（０〜４℃）中１．５ｔａ（１／分の
速さで５０ｍ１２のベッド容積のオルトカルボキシメチ
ルセルロースカラム（２，５ｘ　１０ｃｍ）に通した５
０ミリモルのＮａ０Ａｃ（ｐＨ５）で洗浄後５０〜５０
０ミリモルのＮａＯＡｃ（ｐＨ５）から勾配を用いてＨ
ｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を溶離した。

カラムフラクションの免疫プロッティング（ウェスタン
分析）によりＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７のピークを測定
することができた。

ＰＬＣ カルボキシメチルセルロースカラムからプールされたフ
ラクションをマイレックス（ｍｉ　１ｅｘ）　−ＧＶＯ
，２２μｍフィルター（ミリボア）に通して濾過し、４
　ｍ０１分の速さで直接、溶媒「Ａ」（水中０゜１％ト
リフルオロ酢酸）中で平衡に達しているバイデック（Ｖ
ｙｄｅｃＸＣ１８ＴＰ　２０１　　Ｎ−キャップ（１０
μｍ　）３００人孔ビーズでパックされた０、８Ｘ２５
ｃＩＩ＋ＨＰＬＣカラム上に適用した。次いで基線がゼ
ロに戻るまで７５：２５　の溶媒Ａ：溶媒Ｂ（アセトリ
ドニル中０，１％トリフルオロ酢酸）により洗浄した。

次いでＨｕＲＦ　　Ｌｅｕ２７を３０分の間にわたって
２５〜３５％の溶媒Ｂから流れる勾配により溶離した。

ＨｕＣ；ＲＰを含むクロマトグラムの主要ピークが約２
６分後に溶離し、集められた。溶媒を３〜４サイクルの
回転蒸留により水から除去した。

ゲル濾過 最終精製段階として、残存する痕跡量のＣＦ３ＣＯ１−
をＣＱ−と置き換えるために、乾燥した試料を４ｍＱの
２５ミリモルＨＣｆｆに溶かし、溶媒中平衡に達してい
るセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ＝５０の
２５ｍ１２カラム（２，５Ｘ５ｃｍ）に適用する溶離液
を２８Ｏｎ；の吸光度によりモニターし、ＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７を含むボイドボリュームビークをプールし
た。溶液のｐＨが５を越えるまでこの物質を数回水から
凍結乾燥した。白色のけば状物質が得られた。

実施例６ ＨｕＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の特性および生物活性最終の
ＨｕＧＲＦ　Ｌｅｕ２７生成物について９５％を越える
純度が、全蛋白質に対して染色または抗−ＧＲＦ抗血清
を用いたウェスタンブロッティングにより可視化された
ＳＤＳゲル［プルおよびプル、「メソッズ・イン・エン
サイモロジーＪ　（Ｍ　ｅ　ｔ　ｈ、Ｅｎｔ、）、９６
巻、２３９−２４４頁（１９８３年）コにより立証され
た（第９図）。さらに、ＨＰＬＣプロフィールが得られ
た（第１θ図）。測定された最終生成物の乾燥重量およ
び全アミノ酸含有量から計算された理論上の重量は５％
以内の差異でほぼ一致した。さらに、アミノ酸組成およ
び配列は予想された結果と一致していた。

４４−アミノ酸ペプチドＧＲＰは、下垂体前葉からの成
長ホルモン分泌を誘発した。作用機序にはアデニル酸シ
クラーゼの受容体−媒介活性化および細胞内の環状ＡＭ
Ｐの上昇がともなう［ラブリー、ガグネおよびレフエベ
レ、「ライフ・サイエンシーズＪ（Ｌ　ｉｒｅ　　Ｓ　
ｃｉｅｎｃｅｓ）、３３巻、２２２９〜２２２３頁（１
９８３年）コシたがってＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の生
物学的有効性は、アデニル酸シクラーゼの活性化能力、
下垂体細胞との特異的結合および下垂体細胞からのＧＲ
Ｆ放出刺激能力により示された。

アデニル酸シクラーゼ酵素活性化アッセイＧＲＦによる
アデニル酸シクラーゼ活性化をアッセイするために、ウ
シの下垂体を選んだ。下垂体膜を凍結乾燥し、確立した
方法［アルパレスおよびブルーノ、「プロシーディング
ズ・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オブ・
アメリカＪ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　）、７４巻、９２−９５頁（１９７７年
）］にしたがい酵素活性のアッセイを行なった。ＨｕＧ
ＲＦ　Ｌｅｕ２７のＥ　Ｃｓ。は２マイクロモルであっ
た。応答曲線の形およびモルホテンシーは本来のＨｕＧ
ＲＦ−Ｎ　Ｈｔの場合と同様であった。組換えＤＮＡ技
術により生産されたペプチドは明確な生物活性を宵して
いるという結論に達した。

結合アッセイ 下垂体細胞にたいするＧＲＦの特異的結合を次のように
して測定した。

ＧＨ３ラット下垂体腫瘍細胞、成長セルライン［ゴスボ
ダロビッシ博士（カルフォルニア大学、サンフランシス
コ）から人手］をダルベツコ（ＤｕＩｂｅｃｃｏ）の最
少必須培地（ＤＭＥＭ）中において成長させた。合成Ｈ
ｕ　Ｇ　ＲＦ　　Ｎ　Ｈｔをペニンスラ・ラボラトリー
ズ（サンカルロス、カルフォルニア）から購入し、エン
ザイモビーズ（Ｅ　ｎｚｙｍｏｂｅａｄｓ。

バイオラド社）を用いてＮａ　［”’Ｉ］により放射能
標識を２００００ｃｐｍ／ｎｇ蛋白質の特異的活性に対
して行なった。０．１％のウシ血清アルブミンを含有し
、２０ミリモルのヘベス（１−１ｃｐｅｓ）を用いたＤ
ＭＥＭ緩衝液（ｐｔ−ｔ’ｙ、４ＸＤＭＥＭ−ＢＳＡ）
により洗浄した２４ウエルのコスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）
　トレイにおいて細胞を全面成長させた。細胞を・１℃
で１時間最終審ｆａ２５０　μＱ　ノＤＭＥＭ　−ＢＳ
ＡＳ槽中する濃度の組み換えＧＲＦ類縁体の非存在下ま
たは存在下に２Ｘ１０−”モル［”’　Ｉ　］−ＨｕＧ
ＲＰ（＋　−４４）とインキュベートした。

細胞をＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　−Ｂ　Ｓ　Ａにより３回洗浄し
、０゜ｌＮ−ＮａＯＨにより溶解させ、細胞と結合した
放射能をガンマカウンターで測定した。非特異結合を１
Ｏ−７モルの合成ＨｕＣ；ＲＦＮＨｔの存在下測定した
が特異的結合の１５％を越えていなかった。

独立した実験において、Ｇ　ｌ−１３細胞がＨｕＧＲＦ
−ＮＨ，に対する特異的受容体を有することが確認され
た。結合は飽和可能であり、可逆的であった。このデー
タのスカッチャード（Ｓ　ｃａｔｃｈａｒｄ）分析は、
約１゜ＯＸ　１０”Ｍ−’（７）Ｃ；ＲＦ−（１−４４
）に対する明白なＫｄを示す細胞１個当たり約２０００
０個の結合部位の存在を示した。

組換えひとおよびぶたＧＲＦは、その受容体結合能力に
関して合成ひとＧＲＦ（２〜３倍低い親和力）とほとん
ど同等であった。

成長ホルモン分泌アッセイ ＧｒｔＦの下垂体細胞からの成長ホルモン放出の刺激能
力についてもアッセイを行なった。正常なラットの萌部
下垂体細胞を次のように１次培養物中に確立させた。雄
の成体スプラーグ・ドーリ−（Ｓ　ｐｒａｑｇｕｅ　−
Ｄ　ａｗｌｅｙ）ラットを断頭により殺した。

下垂体前葉を切開し。１％ＢＳＡ含有Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍに
置き、１ｍｍ片に切り刻んだ。ＤＭＥＭ−ＢＳＡにより
数回洗浄後、組織を３７℃で３５分間穏やかに振盪しな
がら０．２単位のトリプシン／ｍ（ｌおよびＩ　１９／
　ｍ１２（Ｄ　Ｎ　Ａ　ａｓｅ、デオキシリボヌク１／
７−ゼ）／ｒａＱとインキュベートした。次いで組織片
をさらにパスツールピペットを用いて物理的シャーリン
グにより分散させた。大きな断片を沈澱させて除去した
。次いで上滑中の細胞を沈澱させ、洗浄し、実験前に４
日間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で組織培養にかけた。生
存能力のある細胞の平均収量はｌ下垂体当たり約２ｘ１
０”細胞であった。

細胞を２４ウ工ル皿に置き、３７℃で３時間ＧＲＦまた
はアナログ類とインキュベートした。

培地中のＧＨ濃度をエヌアイエッチ・ピチュイタリー・
エージエンンーから得た試薬を用いて固相Ｒ［Ａにより
測定した。９６ウエルのポリビニルクロリドプレートを
一夜４℃で燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０　、　１　
ｘ９／ｍＱの濃度でウサギ抗−モンキー１ｇ抗体［ベル
・フリーズ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ）　］により被覆し
た。プレートに少なくとも１時間３７℃でＰＢＳ中３％
ＢＳＡ溶液によりカウンターコーティングを行なった。

プレートを洗浄し、２時間またはそれ以上の間３７℃で
モンキー抗ラットＣＩ−１抗血清（１／１００００の最
終希釈率）とインキュベートした。ＰＢＳ−０，１％Ｂ
ＳＡにより数回洗浄後、非標識ＧＨまたは細胞調整培地
の希釈液の存在または非存在下にプレートを２０　ｎｇ
／ｍＱの［”５ｒ　］−Ｇ　Ｉ−１と３７℃で２時間イ
ンキュベートした。数回洗浄後、プレートを乾燥し、個
々のウェルを切断し、ガンマカウンターで数えた。

組換えひとおよびぶたＧＲＦは、ＧＨ放出誘導について
合成ひとＧＲＦと等力で等しい効果を示すと思われた。

実施例７ ｐＴｒｐＬＥ−ＰＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の構成および用
途 実施例２〜３に記載のものと類似のアプローチおよび方
法を用いて、ｐＴｒｐＬＥ−＃　１４ベクターの単−Ｂ
ｓ５ＨＩ［部位または単一５ｓｔ１１部位がＴｒｐＬＥ
蛋白質およびＰＧＲＦのＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７類縁体
間の融合蛋白質をコードするのに用いられているプラス
ミドを組み立てた。これはＨｕＧＲＦＤＮＡセグメント
内の５ａｉ１部位およびターミネータ−ＤＮＡセグメン
トの近位末端のＢａｍＨ１部位間に位置するＨｕＧＲＦ
をコードする合成りＮＡのその部分をＰＧｒｔＦをコー
ドする合成りＮＡと置き換えることにより行なわれた。

ＨｕＧＲＦ合成りＮＡのＰＧＲＦ合成りＮＡとの置換は
初めにｌ−１ｕＧＲＦ遺伝子内の５ａｉ１部位およびそ
の末端をちょうど越えたところのＢａｌ１０１部位が共
に単一であるプラスミドｐＰ　Ｓ　；＃　８をつくるこ
とにより容易となりｆこ。

ベクタープラスミドｐｐ　Ｓ　＃　ｓの作成プラスミド
ｐＴｒｐＥ−＃２２のＢａｍＨ１部位はＴｒｐＬＥ遺伝
子から最も離れたところに位置しているが、これをまず
Ｂａｍｔｌｌおよび５ａｉｌによりプラスミドを消化し
、ＤＮＡをＥｔＯＨ沈澱に付し、そして混合物をＴ４リ
ガーゼで処理することにより除去した。（ＢａｍＨＩは
ターミネータ−ＤＮＡセグメントの各末端で切断し、そ
して５ａｉｌはｐＢＲ３２２ＤＮＡ領域内およびターミ
ネータ−内でＨｉｎｄＩ［１部位に非常に近いところを
切断する。′）ライゲーション生成物をＳ　ｐｈ　ｒ　
（これはｐＢＲ３２２ＤＮＡ領域内て切断する）で処理
し、受容力のあるＨｂ１０１細胞に形質転換した。生成
したプラスミドの１つであるｐＶＶδＨ４ｎδＳａｌ＃
１５は単一のＢａｎ＋ＨＩおよびＳａｌ［部位が両側に
位置したｐＴｒｐＥ−＃２２の転写ターミネータ−領域
由来の０．３３ｋｂのＢａｍＨＩ〜５ａｌＩ断片を含む
ことが示された。この断片はｐＴｒｐＥ−＃２２と比へ
ｌ二場合ｐＶＶδＨｉｎδＳａｌ＃１５において反対の
方向であったが、両方向にａ効に機能する。

次にｐＶＶδＨｉｎδＳａｌ＃Ｉ５の５ａｌｌｆ１位を
、ベクターのｐ１３Ｒ３２２部分の５ａｉｌおよびＰｖ
ｕ部位間のＤＮＡを欠失することにより除去した。

これはＳａｌ［およびＰｖｕ■によりｐＶＶδＭｉｎδ
Ｓａｌ＃１５を消化し、Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩクレ
ノウ断片とインキュベーションして５ａｌＩ末端を充填
することにより達成された。次いで生成したＤＮＡを５
ａｉｌにより開裂し、Ｉ（ｂｌｏｔ細胞に形質転換した
。生成したプラスミド、ｐｐ　Ｓ　＃　３は予想通りの
欠失を含み、Ｓａｌ１部位を欠いていた。記載された手
順によりＳａｌ１部泣の再生か予測されるため、ｐＰ　
Ｓ　＃　３において５ａｉｌ部位が欠けた場合、５ａｉ
ｌ−開裂線状ＤＮＡと比較してＳａｌ１部位を欠く環状
ＤＮＡの形質転換効率が高くなるものと思われる。

次に、ＴｒｐＬＥ−ＨｕＣ；ＲＦ　　Ｌｅｕ２７をコー
ドする１、３５ｋｂのＥｃｏＲｒ　−Ｂ　ａｍＨＩ　　
断片をｐＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨ［−ＨｕＧＲＦ＃５から
切除し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより開裂された
ｐＰＳ＃３ＤＮＡとライゲートした。ライゲーション混
合物をＢｓｔＸ［（これは最終構造において所望されて
いないｐＰｓ＃３ＤＮＡ断片のみを開裂する）により処
理し、受容力のあるＨｂ１０１細胞に形質転換した。生
成したプラスミド、ｐＰＳ＃８は、ＴｒｐＬＥ−ＨｕＧ
ＲＦ蛋白質をコードする遺伝子、そのＳａｌ１部位、次
に転写ターミネータ−ＤＮＡセグメント、再びＳａｌ１
部位、続いて単一のＢａｍＨＩ部位、次いでＳａｌ１部
位をもたない転写ターミネータ−ＤＮＡセグメントを含
む。

ＰＧＲＦをコードする合成りＮＡの挿入ＰＧＲＦとＨｕ
ＧＲＦに相違をもたらす３箇所のアミノ酸置換部分はす
べてｐＰＳ＃８（７）ＨｕＧｎＦ　　Ｌｅｕ２７遺伝子
配列の５ａｉｌ部位を越えたところにある。ｐｐ　Ｓ　
＃　８のＢａｍＨ［部位の上方の配列は機能的転写ター
ミネータ−を含むため、ＰＧＲＦをコードする合成りＮ
Ａはｐｐ　Ｓ　＃　８のこれら２つの部位間のＤＮＡと
置換するために用いられた。６個のオリゴヌクレオチド
を合成し、ライゲートし、５ａｌｒおよびＢａｎ＋Ｉ−
ＩＩにより開裂し、そして下記に示す５４　ｂｐのオリ
ゴヌクレオチドを５％ポリアクリルアミドゲルから単離
した。

この５４ｂｐ断片を予め５ａｌｌおよびＢａｍＨＩによ
り開裂されたｐＰ　Ｓ　＃　８とライゲートし、生成し
たクローンを合成ＰＧｒｔＦ　　ＤＮＡに組み入れられ
るべき単一のＸｂａ１部位の存在についてスクリーンし
た。こうしてプラスミドｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ・Ｂｓ５ＨＩ
［−ＰＧＲＦ＃　Ｉ　Ｏを同定し、ＤＮＡ配列の実験的
確認を行なった。

ｐｐ　Ｓ　＃　８と類似のベクター（ただしＴｒｐＬＥ
の５ａｃＵ部位に融合したＨｕＧＲＦ遺伝子を含む）に
よる同様のアプローチにより、プラスミドｐＴｒｐＬＥ
−ＳａｃＩｒ−ＰＧＲＦを作成した。

ＰＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）の精製および生物学的活性実施
例４−６に記載した手順を用いて、ＴｒｐＬＥ−ＰＧＲ
Ｆ　　Ｌｅｕ２７融合蛋白質をコードするプラスミドを
含むエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞（菌株
Ｗ３　ｔ　ｔ　ｏ原栄養株、ＡＴＣＣ第２７３２５号）
を成長させ、融合蛋白質の発現を誘導し、ＰＧＲＦ　　
Ｌｅｕ２７をＣＮＢｒ処理により放出させて精製した。

最終生成物の純度および生物学的活性はＢＧＲＦ　　Ｌ
ｅｕ２７について記載したものに匹敵し得るものであっ
た。

実施例８ ｐＴｒｐＬＥ−ＢＧＲＦ（Ｌｅｕ２７）ベクターの作成
および用途 既に概略を示したアプローチにしたがい、プラスミドｐ
Ｐ　Ｓ　＃　８のＨｕＧＲＦ部分のカルボキシ末端コー
ド領域をＢＧＲＦのＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７類縁体をコ
ードするように部分改変した。ＢＧＲＦとＨｕＧＲＦ　
　Ｌｅｕ２７に相違をもたらす５個のアミノ酸相違部分
がすべてプラスミドｐＰＳ＃８のＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ
２７コード領域のＨｉｎｄＩＩ［部位の上方に存在する
ため、８個のオリゴヌクレオチドはＢＧＲＦ’アミノ酸
配列をコードし、Ｈｉｎｄ［ＩｌおよびＢａｍ８１間の
Ｄ−Ａ断片を置換するために用いられた。これらのオリ
ゴヌクレオチドを合成し、ライゲートし、そしてｐｕｃ
ｓにクローンした後、ＨｉｎｄｌＩＩおよびＢａｍＨｌ
により開裂すると下記７５ｂｐＤ　Ｎ　Ａフラグメント
が産生された。

次にこのフラグメントをＨｉｎｄ［［およびＢａｍＩ−
ＩＩで開裂したプラスミドｐｐ　Ｓ　＃　８にライゲー
トすると、所望のプラスミドｐＴｒｐＬＥ　＋　Ｂｓ５
ＨＩｆ　−ＢＧＲＦ　Ｌｅｕ２７　＃　ｌ　５が生成さ
れた。

実施例４〜６に記載した方法を用いてプラスミドｐＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＢＧＲＰ　　Ｌｅｕ２７　　＃
　１５を含むエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）大
腸菌細胞（菌株Ｗ３１１０原栄養体、ＡＴＣＣ第２７３
２５号）を成長させ、融合蛋白質を発現させ、ＣＮＢｒ
開裂により放出されたＢＧＲＦ　Ｌｅｕ２７を精製し、
そして生物活性を試験した。結果はＨｕＧＲＦ　Ｌｅｕ
２７およびＰ　Ｇ　ＲＦ　　Ｌｅｕ２７に匹敵し得る活
性を示していた。

実施例９ 処方 約１〜５μｇ／ｄの濃度でＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７、
ＢＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７またはＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７
を生理食塩水に溶解またはけん濁する。所望により他の
医薬上許容される賦形剤を加え得る。生成した溶液２ｍ
ｅを１日１〜４回筋肉内または皮下注射により投与する
、一般的な哺乳類に対する用量は１日に体重ＩＫｇ当た
り約０．１〜０．５μｇである。

別法として、ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７、ＢＧＲＦＬｅ
ｕ２７またはＰＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７を生理食塩水に溶
解またはけん濁し、溶液またはけん濁液を連続投与用制
御放出装置に設置し得る。一般的な連続放出速度は１時
間に体重ＩＫｇ当たり約１〜約５μｇである。

実施例１０ ３種のオープンリーディングフレームベクターの作成 ＴｒｐＬＥ蛋白質との融合として任意めオープンリーデ
ィングフレームの発現に適した３種のベクターからなる
セットを作成するために、ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴ
ＣＣをコードするオリゴヌクレオチドをＴｒｐＬＥコー
ド遺伝子に関連した３個の可能な翻訳リーディングフレ
ームの各々においてＴｒｐＬＥ遺伝子の単−Ｂｓ５ＨＨ
部位の近くに挿入した。

これらのオリゴヌクレオチドのライゲーションに必要な
基質をもたらすために、プラスミドｐｐＳ＃８ＤＮＡ（
２μ９）（実施例７参照）を５０℃で１時間４単位の制
限エンドヌクレアーゼＢｓ５Ｈｎに工す開裂した。フェ
ノールで抽出し、ＤＮＡエタノール沈澱に付すことによ
り反応を終結させた。

Ｂｓ５ＨＩＩ−生成５′突出部分を満たすためにＤＮＡ
を４０ミリモルのＫＨＰＯ，（ｐＨ７，５）、６．６ミ
リモルのＭｇＣｌ２ｔ１１．０ミリモルの２−メルカプ
トエタノール、４個のデオキシヌクレオチドの各々２５
０マイクロモルを含む２０μＱの緩衝液に再懸濁した。

１単位のフレノウフラグメント（大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼ大フラグメント）を加え、混合物を１５分間室温で
インキュベートした。

３種のリーディングフレームベクターを作成するために
、平滑末端ｌ３ｓｓＨＩ［−開裂ｐｐ　Ｓ　＃　８　Ｄ
ＮＡを３反応に分割した。各反応は、０．５μ２のライ
ゲーション緩衝液［５０ミリモルのトリス■（Ｃ（ｌｃ
ｐＨ７、８）、１０ミリモルノＭｇＣｌ２２．２０ミリ
モルのジチオトレイトールコ中ＤＮＡ、１００マイクロ
モルのＡＴＰ、２単位のＴ４リガーゼおよび１００倍過
剰の３つの合成りａｍＨＩリンカ−（ＣＧＧＡＹＣＣＧ
、ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧまたはＣＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧ
）のうち１つを含むものであった。１２℃で一夜インキ
ュベート後、反応、混合物を１５０ミリモルのＮａＣＱ
、６ミリモル（７）ト’Ｊス＋（Ｃ＆（ｐｌ＋７．９）
および６ミリモルノＭｇＧＱｔと合わせ、１単位のＢａ
ｍＨＩて処理した。３７℃て１時間インキュベートした
後、フェノール抽出により反応を終結した。エタノール
沈澱により各反応からＤＮＡを回収した。沈澱したＤＮ
Ａの各々を１０μａのライゲーション緩衝液に再懸濁し
、１単位のＴ４リガーゼで処理した。次いでライゲーシ
ョン混合物を用いて受容能力のある大腸菌１−（ｂ１０
１細胞を形質転換した。ＢａｍＨｒ部位がＴｒｐＬＥの
Ｂｓ５Ｈ１１部位（ＧＣＧＣＧＣ）およびターミネータ
−ＤＮＡセグメント間に存在する新しく生成した（子孫
）クローンをｐＳＢ８、ｐＳＢｌｏおよびｐｓＢ１２と
命名した。ヌクレオチド配列からこれら３種のベクター
は下式により適当なりａｍＨｌリンカ−を含むことが立
証された。

Ｂａｍ１ｌ　Ｉ ｐＳＢ８　　−−−−ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＧ　ＧＡＴ　
ＣＣＧ　ＴＣＧ　−−−−−−−−−−Ｌｅｕ　　Ａｒ
ｇ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　−一
−−−−ａｍＨＥ ｐｓＢｌｏ　　−−−−ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＣＧＧＡ　
ＴＣＣＧＴＣ−−−−−−−−−−Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　　−−−−−−ａｍＨ
１ ｐｓＢ１２　−−−−ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＣＣＧＧ　Ａ
ＴＣＣＧＴ　−−−−−−−−−−Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ
ｌａ　Ａｒｇ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　−−一−−−実施例１
１ ＡＩＤＳについてのゲノムライブラリーの作成ＴｒｐＬ
Ｅ蛋白質と融合したＡＩＤＳウィルスのオープンリーデ
ィングフレームを発現することができるクローンのライ
ブラリーの作成は、３つのオープンリーディングフレー
ムベクター、ｐＳＢ８、ｐＳＢＩＯおよびｐＳＢＩ２の
ＢａｍＨ１部位にＡＩＤＳ　　ＤＮＡの部分的５ａｕ３
Ａ消化物をライゲーションすることにより達成された。

ＡＩＤＳＤＮＡの部分的５ａｕ３Ａ消化物を用いること
により、１個またはそれ以上の５ａｕ３Ａ部位により中
断され得る大きなオープンリーディングフレームが（中
断されず）そのままの状態を呈する機会が増す。

プラスミドｐ１３ｅｎｎ＃　２０　（１０ｕ９）を、３
７℃で９０分間Ｉ３ａｍＨｒに適した緩衝条件を用いて
制限酵素［３ａｍＨＩおよび５ｓｔｌ（各々ＩＯ単位）
により二重消化した。生成したＤＮＡフラグメントを０
．７％調製用アガロースゲル上で分離させた。

ＡＩＤＳウィルスゲノムの５分の４を含む８Ｋｂフラグ
メントがアガロースゲルから溶離し、これをエタノール
沈澱により濃縮した。再懸濁したＤＮＡ［５０ミリモル
のＮａＣｌ２．６ミリモルのトリフ、　ＨＣ＆（ｐＨ７
、５）および５　ミ！Ｊ　モ）Ｌｔｆ）ＭｇＣ（ｂを含
む緩衝液中］を３反応に分割し、各々室温で１５分間０
１または０．０１単位の５ａｕ３Ａで消化した。フェノ
ール抽出により反応を終結した後、５ａｕ３Ａの消化程
度をアガロースゲル上の開裂生成物を分析することによ
りモニターした。０．１単位の５ａｕ３Ａで処理したＤ
ＮＡ試料は適度の部分消化状態を示し、後続の３種のオ
ープンリーディングフレームベクターとのライゲーショ
ンのために選ばれた。約２００ｎＨの部分的５ａｕ３Ａ
消化ＤＮＡは、予め３０μＱのライゲーション緩衝液中
ＢａｍＨ［およびアルカリホスファターゼで処理してお
いた３種のベクター各々１１００ｎと混合した。

反応の各々にｌ単位のＴ４リガーゼを加え、混合物を６
時間１２℃でインキュベートした。次いで３つのライゲ
ーション反応の各々からライゲートされたＤＮＡを別々
に受容能力のあるエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
））Ｈｂｌ　０１細胞に形質転換させた。

最初の形質転換から全部で約４００のクローンが得られ
た。これらのクローンの８０％以上が、ｐＢｅｎｎ＃２
０のフラグメントに対する陽性ハイブリダイゼーション
により明らかなように、ＡＩＤＳウィルスＤＮＡインサ
ートを含んでいた。さらにＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　患者から得
られた抗ＡＩＤＳウィルス血清と免疫反応性のある新規
蛋白質分子を産生ずる能力について新しく生成した（子
孫）クローンをスクリーンした（第１２図）。幾つかの
クローンについてヌクレオチド配列決定を行ない、各々
のベクター・インサート接合における配列を測定した。

その結果から（第１表、第１１図）、陽性クローンがＬ
Ｅ担体蛋白質の転写および翻訳に関して正しい方法およ
び正しいリーディングフレームに挿入されたＡＩＤＳウ
ィルスフラグメントを含むことが立証された。さらに、
基準として公表されたＡＩＤＳウィルスＤＮＡ配列を用
いて、ＡＩＤＳウィルスゲノム内のインサートの起点お
よび境界を明らかにした。［ウニイン・ホブソン等、［
セルＪ（Ｃｅｌｌ）、４０巻、９−１７頁（１９８５年
）、サンチェ・ペスカドール等、「サイエンスＪ（Ｓ　
ｃｉｅｎｃｅ）、２２７巻、４８４−４９２頁（１９８
５年）、ラトナー等、「ネイチャー　Ｊ（Ｎ　ａｔｕｒ
ｅ）、３１３巻、２７７−２８４頁（１９８５年）、ミ
ューシング等、［ネイチャー　Ｊ（Ｎａｔｕｒｅ）、３
１３巻、４５０−４５８頁（１９８５年）］。

実施例１２ 他の特異的ＡＩＤＳウィルスクローンの作成任意の５ａ
ｕ３Ａフラグメントを３つのオープンリーディングフレ
ームベクターに挿入することに基づく前記のＡＩＤＳゲ
ノムライブラリー以外にさらに特異的ＤＮＡフラグメン
トを含む２種のクローンを作成した（第１表、第１１図
）。

■つめの特異的クローンは、単一のＢｓ５Ｈ１１部位（
ＧＣＧＣＧＣ）に対して遠位のヌクレオチド配列が下記
のようにオリゴヌクレオチドを導入することにより修飾
されたｐＬＥ由来のベクター（ｐＬＥＫＡＬと称す）を
用いて作成された。

（以前からの） Ｂｓｓｌｌ　ＩＩ　　　　　　　　　　　Ｋｐｎ　Ｉ　
　ＢａｍＦＩ　ＩＣＴＧ　ＣＧＣＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡ
Ｔ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＧ
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ導入されたア
ダプターは、ＫｐｎｌおよびＢａｍＨＩの両方に対する
開裂部位を含み、またペンタペプチドＡ　ｓｐ　−Ａ　
ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｐ　−Ｌ　ｙｓ、エンドペ
プチダーゼエンテロキナーゼにより特異的に認識される
ペプチジル連鎖をコードするものである。

標準的実験方法を用いて、プラスミドｐＢｅｎｎ＃２０
の２　、１５　Ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ　〜ＢａｍＨフラグメ
ントでＥＮＶ遺伝子の大部分に及ぶフラグメントを同じ
２種の制限部位によりプラスミドｐＬＥＫＡＬへ転移さ
せた。生成したプラスミド（ｐＴ　ｒｐＬ　Ｅ　−ＫＡ
Ｌ−ＥＮＶ−＃　ｌ　Ｏ）は導入後直ちに抗ＡＩＤＳ血
清と強反応性のＳＤＳゲル上に再生可能な蛋白質生成物
のパターンをもたらした（第１２図）。

もう１つの特異的クローンは、ＡＩＤＳウィルスのＧＡ
Ｇ遺伝子内でＰｖｕｌＩおよびＦ３ｇ（ＩＭ部部門間９
５０塩基対のフラグメントを含むように作成された。こ
のクローンを作成するために、ＧＡＧオープンリーディ
ングフレームの中央領域のコード遺伝子を含む１．ＩＫ
ｂＳａｕ３Ａフラグメントを精製し、ｐＳＢ８の単一の
ＢａｍＨ１部位にクローンした。我々はＬＥ蛋白質に関
して「誤った」翻訳リーディングフレームに５ａｕ３Ａ
フラグメントを挿入するためにこの特定のベクターを選
んで用いることにした。我々の以面の経験では、このフ
ラグメントの「正しい」リーディングフレームでの挿入
を試みても正しい翻訳はされないことが示されていた。

ｐＳＢの「誤った」リーディングフレームを用いること
により、所望のインサージョンを含む多くの形質転換体
が得られた。これらをｐＳＢ８−ＧＡＧｌ、１と命名し
た。正しい翻訳リーディングフレームを再生するために
、ｐＳ　Ｂ　８−ＧＡＧ　１．ｌＤＮＡをＳ　ｓｔ　Ｉ
ｆ　（Ｌ　Ｅ内）およびＰｖｕ（Ｓａｕ３Ａフラグメン
ト中約１３０　ｂｐ）により開裂した。次いで前記ＤＮ
ＡポリメラーゼＩを用いてＳｓｔ［［部位の３′突出部
を除去し、モしてＴ４リガーゼを用いて２つの平滑末端
を再環状化した。導入後直ちに、新しく生成した形質転
換体の１つ、ｐＳＢ−Ｇａｇ−＃２５は抗ＡＩＤＳ血清
と免疫反応性のある多重ポリペプチドを産生じた（第１
２図）。

実施例１３ ＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋白質によるＡＩＤＳＧ者血清の分
析 ウェスタンプロブティング分析を用いてＡＩＤＳ患者の
血清の抗体検出に大腸菌で生産された種々の組換えウィ
ルス蛋白質が有用であることを立証した。血清試料は、
任免の健康な血液提供者、ＡＩＤＳにかかる危険性の高
い人およびリンパ節症ＡｆｌＣ９またはＡＩＤＳの患者
を含む１５２名から得られた。陰性対照としてのエシェ
リヒア・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）ｐＳ　Ｂ　８ベクタ
ーのみの抽出物および陽性対照としてのＡＩＤＳ感染ひ
と白血球の抽出物を電気泳動させ、各血清のアッセイに
含ませた。第１３図は１９個の血清試料から得られた代
表的データを示し、第２表は全結果を要約したものであ
る。

要約すれば、１５２個の試料中７５個は任意の健康な血
液提供者から得られたものであり、エシェリヒア・コリ
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＥＮＶクローンｐＴｒｐＬＥ−ＫＡ
Ｌ−ＥＮＶ−＃　ｌ　Ｏと陽性反応を示した１個以外は
すべてあらゆるＡＩＤＳ蛋白質試料に対して陰性であっ
た。危険性の高い者から得られた２２個の血清中１５個
がＥＮＶクローンｐＴｒｐＬＥ−ＫＡＬ−ＥＮＶ−＃　
１０と陽性反応した。

４名のＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者からのもの全部および
５１名のＬＡＤＳ患者からのもののうち４２個は同基準
で陽性を示した。エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）ＥＮＶクローンと陽性反応した６２個あ血清試料中４
８個もまたＡＩＤＳ感染細胞リゼイトと明らかに反応し
た。ただ６２９！の陽性血清（ＡＩＤＳウィルスおよび
／またはＥ　Ｎ　Ｖクローンに対する抗体について）の
うち−サブセットのみがＧＡＧクローン（ｐＳ、Ｂ８−
＃４５、ｐｓＢ−Ｇａｇ−＃２５およびｐＳＢ　１２−
＃３１）またはＰＯＬクローン（ｐｓＢ１２−＃６７、
ｐＳＢ１２−＃６８およびｐｓＢ１２−＃３３）と反応
した（第２表）。　ウェスタンプロット分析は、次のよ
うにして行なわれた。大腸菌抽出物またはＡＩＤＳウィ
ルス感染細胞抽出物（ｏ　、　４１１Ｆ）をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル（幅２０ｃｚｘ高さ１４ｃｉＸＯ。

１５ｃｍ）に適用し、ラエメリの方法「「ネイチャー」
（Ｎａｔｕｒｅ）、２７７巻、６８０頁（１９７０年）
］にしたがい電気泳動した。プルネット記載の方法［「
アナリティカル・バイオケミストリーＪ（Ａ　ｎａｌ、
　Ｂ　ｉ。

ａｈ、）、１１２巻、１９５−２０３頁（１９８１年）
］によりウェスタンプロットトランスファーを行なった
。ついでプロットされたニトロセルロース（シュライヒ
エルおよびシュエル、ＢＡ８３．０．２μｌ孔サイズ）
フィルターを、初めは５％脂肪粉乳を含むＴＮ緩衝液（
１０ミリモルのトリ、スＨＣｌ２５ＰＨ７，４、および
１５５ミリモルのＮａＣＱ）により４２℃で３０分間、
続いて１％ＢＳＡを含むＴＮ−ＴＮ緩衝液（１０ミリモ
ルのトリス−ＨＣＱ、ｐＨ７，４，１５５ミリモルのＮ
ａＣＱ、０．３％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２０，
０，０５％のノニテット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ　−４０
）により室温で１０分間ブロー）りした。次いでニトロ
セルロースフィルターを幅ｌ／４インチのストリップに
縦に薄く切った。血清試料は、健康な血液提供者、「危
険性の高い」グループの者またはリンパ節症ＡＲＣもし
は＜ＡＩＤＳ患者のいずれかから得られた。各提供者か
らの血清をＴＮ−ＴＮ−３％ＢＳＡ中１００中音０００
し、８ｘＱを多槽式プラスチックインキュベージジント
レイのそれぞれ別のチャンバに加えた。様々なエシェリ
ヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）クローンまたはＡＩＤＳ
ウィルス感染細胞から得られた蛋白質抽出物を含むニト
ロセルロースストリップのセットを各チャンバに入れた
。絶えず振りながら４℃で一夜インキュベーションを行
なった。血清を除去後直ちに、ストリップを２５ｘＱＴ
Ｎ−ＴＮ緩衝液で２回（それぞれ５分間）および２５ｘ
ＱＴＮ−ＴＮ緩衝液（ＮＰ−４０を除＜ＴＮ−ＴＮ）で
２回洗浄した。次いでフィルターを８３１１２の希釈し
た放射能標識された蛋白質（ＴＧＮ−Ｔ−３％Ｂ５Ａ２
０００００　ｄｐｉ／ｘ１２の［目’Ｉ］蛋白質Ａ）と
インキユベートした。絶えず振盪しながら少なくとも４
５分間室温でインキュベーションを行なった、次いでス
トリップを２５Ｊ１１２のＴＮ−ＴＮおよび１０ミリモ
ルのＥＤＴＡ緩衝液で３回、続いて２５１１ＱのＴＮ緩
衝液で１回洗浄（それぞれ５分洗浄）した。

次いで洗浄されたニトロセルロースストリップを風乾し
、Ｘ線フィルムにさらした。

実施例１４ プラスミドｐｐ　Ｓ　＃　３の作成 第【工程 このプラスミドの転写終結配列は、ヤノフスキーの研究
所（カリフォルニア、バロ・アルド、スタンフォード大
学、生物科学科）から購入されたプラスミドｐＶＶ２０
２ｔから得られたものであった。この転写ターミネータ
−は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ｒｐｏ
Ｃ転写ターミネータ−の配列を有する［スカイアーズ等
、［ニュクレイツク・アシッズ・リサーチＪ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９巻、６８
１７−６８４０頁（１９８１年）］。このプラスミド（
ｐＶＶ２０２ｔ）をＨｉｎｄｌＩ［および５０ミリモル
のトリス−ＨＣＱ（＋）Ｈ８）、１０ミリモルのＭ　ｇ
　ＣＱ　ｔ、５０ミリモルのＮ　ａ　Ｃ１２（ｒコア緩
衝液」）で消化し、次いで２２℃で１８時間５０ミリモ
ルのトリス−ＨＣｌ２（１）Ｈ７，５）、１０ミリモル
のＭｇＣＱｔ、１ミリモルのＤＴＴ、５ミリモルのＡＴ
Ｐ中Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりセルフライゲートさせた
。次いでリガーゼ生成物をエシェリヒア・コリ（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）株Ｈｂｌ　Ｏ１（遺伝子ｈｓｄＲ−１ｈｓｄ
Ｍ’、　ｒｅｃＡ　１３．５ｕｐＥ４４．１ａｃＺ４．
１ｅｕＥ６、ｐｒｏＡ　２、ｔｈｉ　−１１Ｓｆｆｌｒ
）に形質転換し、アンピシリンプレートに置いた。生成
したコロニーから得られるプラスミドＤＮＡを標準的方
法により単離し、ＨｉｎｄｌＩ［で消化することにより
単一のＨｉｎｄＩＩ［部位を有するプラスミドを確認し
、これをプラスミドｐＶＶδＨｉｎｄｌｎ＃２２と命名
した。

第■工程 ｐＶＶδＨｉｎｄＩ［［＃　２２プラスミドを２０ミリ
モルのトリス−ＨＣＱ（ｐ［（８）、７ミリモルのＭｇ
ＣＱ７．２ミリモルのβ−メルカプトエタノール、１０
０ミリモルのＮａＣＱ中ＢａＩＩＩＨ■により、また８
ミリモルのトリスートｔｃｃ（ｐｔｒ　７　、６　）、
６ミリモルのＭ　ｇ　ＣＱ　ｔ、１５０ミリモルのＮａ
Ｃｌ２および０゜２ミリモルのＥＤＴＡ中５ａ１２［に
より消化した。

この最初の消化段階後、プラスミドをＴ４ＤＮＡリガー
ゼにより処理し、次に５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ２
（＋）Ｈ７，５）、６ミリモルのＭ　ｇ　ＣＱ　ｔ、６
ミリモルのβ−メルカプトエタノール、５０ミリモルの
ＮａＣＱ中５ｐｈｌにより消化し、次いでＨｂｌｏｌに
形質転換させた。生成したプラスミドをｐＶＶδＨｉｎ
ｄδ５ａ１２＃１５と命名した。

第■工程 単離されたｐＶＶδＨｉｎｄδＳａ＋２＃１５を６ミリ
モルのトリス−ＨＣ（２（ｐＨ７，５）、６ミリモルの
ＭｇＯム、６ミリモルのβ−メルカプトエタノール、６
０ミリモルのＮａＣｌ２中まずＳ　ａＱ　Ｉ　、次いで
ＰｖｕｌＩにより消化した。生成した物質を１５分間５
０ミリモルのトリス−ＨＣｅ（ｐＨ７，５）、１０ミリ
モルのＭｇＣＱｔ、ｔミリモルのβ−メルカプトエタノ
ール、ｄＡＴＰ％ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰの各
々８０ミリモル中標準的方法にしたがい大フラグメント
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにより処理した。この物質を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりライゲートし、５ａ１２Ｉに
より消化し、次いで）Ｉｂ１０ｌに形質転換した。生成
したプラスミドをｐｐ　Ｓ　＃　８と命名した。

実施例１５ プラスミドｐＬＥｈｐＧＲＦ（ＢｓｓＨＩ［）＃５の作
成 実施例１４で作成されたプラスミド、ｐＶＶδＨｉｎｄ
Ｉ［Ｉ＃２２をまず標準方法に従いＨｉｎｄｌｎにより
消化し、次いでＢｓ５ｌ−１［１により消化した（６ミ
リモルのトリス−ＨＣＱ、ｐＨ７，４，６ミリモルのＭ
ｇＣｌ２ｆｆ１、１０ミリモルのβ−メルカプトエタノ
ール、２５ミリモルのＮａＣＱ中５０℃で１時間）。次
いで得られた生成物をＴ４ＤＮＡリガーゼによりひと膵
臓成長ホルモン放出因子［ボーレン等、［バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズＪ（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ
、Ｒｅｓ、ｃｏＩＩｌｍ、）、１６巻、７２６−７３４
頁（１９８３年）記載］のＮ末端半分をコードするヌク
レオチド配列にライゲートした。得られた生成物をＨｂ
ｌ　Ｏ１に形質転換してプラスミド、ｐＶＶＡＢを得た
。

アンピシリンプレート上で生長したコロニーから得たプ
ラスミドｐＶＶＡを標準的方法を用いてＨｉｎｄＩＩＩ
およびＢａｍＨ［より消化し、次いでひと膵臓成長ホル
モン放出因子（ボーレン等、前出）のＣ末端半分をコー
ドするヌクレオチド配列（ｈｐＧｒ（Ｆ−Ｂフラグメン
ト）とライゲートし、Ｈｂ１０ｌに形質転換することに
よりプラスミド、ｐＶＶＡＢ＃５２を作成した。

ＬＥ配列は、カリフォルニア、パロ・アルド、スタンフ
ォード大学生物科学科のヤノフスキーの研究所から購入
されたプラスミドｐＶＶｌから得られた［ニコルスおよ
びヤノフスキー、Ｆメソッズ・イン・エンサイモロノー
ｊ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、
１０１巻、＋５５−１６４頁（１９８３年）、編集者コ
ロウィンクおよびキャブラン、アカデミツクプレス］。

このプラスミドを、２０ミリモルのトリス−ＨＣｌ２、
ｐＨ７，４，１０ミリモルのＭ　ｇ　ＣＱ　ｔ、１ミリ
モルのβ−メルカプトエタノール、２０ミリモルの塩化
カリウム中Ｂｓ５ＨＩＩおよびｌ−１ｐａｌにより連続
して消化した。これはＬＥ配列を有する５７０ｂｐフラ
グメントを含む６０００．４０００Ｓ　１８００．６０
０．５７０および５４０塩基対（ｂｐ）のＤ　Ｎ　Ａフ
ラグメントを生産した。ＬＥ配列を含むＤＮＡフラグメ
ントをマニアティス等の方法［「モレキュラー・クロー
ニング」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ）、コ
ールドスプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１（１９８
２年月６４−１６７頁］にしたがいポリアクリルアミド
ゲルから電気泳動により単離した。

前記の実施例で製造されたプラスミドｐＶＶδＨｉｎｄ
Ｉ［［＃２２を１−１ｐａｌおよびＢｓ５Ｈ［Ｉにより
消化した。これは５１０２および１６９４ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを産生じた。大きいＤＮＡフラグメントを
電気泳動よりアガロースゲルから単離した。プラスミド
ｐＶＶ１から単離されたＬＥ配列およびプラスミドｐＶ
ＶδＨｉｎｄＩ［［＃２２から単離された大きいＤＮＡ
フラグメントを一緒にライゲートし、Ｈｂｌ　０１に形
質転換することによりｐＴｒｐＬＥ＃Ｉ４と同定される
プラスミドを作成した。

アンピシリンプレート上で成育されたコロニーから得ら
れたこのプラスミドを標準的方法を用いてＨｐａＩによ
り消化し、次に「コア緩衝液」中で５ｓｔｌＩにより消
化した。これは５４４４および５０ＩｂｐのＤＮＡフラ
グメントを産生じた。ＬＥ配列を含む５０１ｂｐフラグ
メントを電気溶離により単離した。

ｐＴｒｐＬＥ＃１４のＬＥフラグメントおよびｐＶＶＡ
Ｂ＃５２の大きいＤＮＡフラグメントを一緒にライゲー
トし、Ｈｂｌ　Ｏ１に形質転換した。生成したプラスミ
ドをコア緩衝液中Ｎｄｅｌにより消化し、配列ＣＡＴＡ
ＧＣＧＣＧＣを有するオリゴヌクレオチドと混合し、Ｂ
ｓ５ＨＩＩおよびＢａｍＨＩにより消化し、そして５０
１ｂｐＤＮＡフラグメントを電気溶離により単離した。

５０１ｂｐＤＮＡフラグメントを、Ｂｓ５Ｈ［ｌおよび
ＲａｍＨＩにより消化しておいたプラスミド１）Ｔｒｉ
）ＬＥ＃　１４にライゲートし、次いでＨｂｌｏｌに形
質転換した。これはｐＬ　ＥｈｐＧ　ＲＰ　（ＢｓｓＨ
Ｕ　）＃　５と同定されるプラスミドを産生じた。

実施例１６ プラスミドｐｐ　Ｓ　＃　８の作成 プラスミドｐｐ　Ｓ　＃　３を５０ミリモルのトリス−
ＨＣＣ（ｐＨ７，５）、１０ミリモルのＭｇｃρ７．１
ミリモルのβ−メルカプトエタノール、５０ミリモルの
ＮａＣ（７中ＢａｍＨ［およびＥｃｏＲ［により消化し
た。この溶液にＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ［によるン肖
化によりプラスミドｐＬＥｐｈＧＲＦ（ＢｓｓＨ［１）
＃５から得られた１、３５Ｋｂ対ＤＮＡフラグメントを
加えた。このＤＮＡ混合物をライゲートし、６ミリモル
のトリス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、６ミリモルのＭｇ
Ｃｌ２２．６ミリモルのβ−メルカプトエタノール、１
５０ミリモルのＮａＣＱ中ＢＳ■ＸＩにより消化し、Ｈ
ｂｌ　０１に形質転換した。生成したプラスミドをｐｐ
ｓ−＃ｓと命名した。

実施例１７ プラスミドＩ）ＳＲの製造 プラスミドｐｐ　Ｓ　−＃　８を５０℃で１時間６ミリ
モルのトリス−ＨＣＱＣｐＨ７，４）、６ミリモルのＭ
　ｇ　ＣＱ　ｔ、２５ミリモルのＮａＣＱ、１０ミリモ
ルのβ−メルカプトエタノール中制限酵素Ｂｓ５Ｈ■に
より消化し、次いでフェノールで抽出し、エタノール沈
澱に付し、そして１０ミリモルのトリス−ＨＣＣ（ｐＨ
７，６）、０．１ミｌＪモルのＥＤＴＡに再＠濁した。

ｐＳ　Ｂ　＃　８のＢｓ５ＨＩＩ付着末端を３７℃で１
５分間５ミリモルのトリス−ＨＣｌ２（＋）Ｈ７、４）
、１０ミリモルのＭ　ｇ　ＣＱ　ｔ、０．１ミリモルの
ジチオトレイトール並びにｄＡＴＰＳｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰおよびＴＴＩ）各々８０ミリモル中大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ１のフレノウフラグメントで処理するこ
とにより平滑化し、次いで７０℃で加熱処理することに
よりポリメラーゼを不活性化した。配列ＣＧ　Ｇ　Ａ　
Ｔ　ＣＣＧを有するＢａｍ１−１１オリゴヌクレオヂド
リン力−を２２℃で１８時間５０ミリモルのトリス−Ｈ
ｃＱ（ｐｉ−ｔ　７　、５　）、１０ミリモルのＭ　ｇ
　ＣＱ　ｘ、１ミリモルのＤＴＴ、０．１ミリモルのＡ
ＴＰ中Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＳＢ＃８の平滑Ｂ
ｓ５ＨＩＩ末端にライゲートし、次いで３７℃で１時間
２０ミリモルのトリス−１−（Ｃ１２（ｐ）［８、Ｏ）
、７　ミＩＪ　モルｆ）ＭｇＣＬ、１００ミリモルのＮ
ａＣｌ２．２ミリモルのβ−メルカプトエタノール中Ｂ
ａｍＨＩにより消化した。

次いでＤＮＡをフェノール抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと再びインキュベートした。２
番目のライゲーション反応を６５℃で１０分間加熱した
後、５０ミリモルの濃度になるまでＮａＣｌ２を加え、
そしてＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩ［［により消化する
ことにより不変のｐＰ　ｓ　−＃８分子を線状化し、望
ましくない最初のベクターのクローニング頻度を低減さ
せた。

こうして処理したＤＮＡをＨｂｌｏｌに形質転換した。

生成しｆこコロニーからのプラスミドＤＮＡを製造し、
Ｂａｍ１（Ｉで消化するとプラスミドｐＳＢが生成され
た。

実施例１８ プラスミドｐＳＢＢＧＨの作成 プラスミドｐＳＢＢＧＨは次のようにして作成された。

すなわち、プラスミドｐＳＢのＤＮＡをＢａｍＨＩによ
り消化し、フェノール抽出し、エタノールで沈澱さけ、
そして０．１　ミリモルのＥＤＴＡに再懸濁した。次に
、５′燐酸基を４５℃で１０分間３０ミリモルのトリス
−Ｔ−ＩＯＣ（ｐＨ８，０）中子中アルカリホスファタ
ーゼとインキュベーションすることによりＤＮＡの末端
から除去し、７０℃で５分間加熱し、次にフェノール抽
出し、エタノール沈澱させ、蒸留水に再懸濁した。

ｐＳＨにクローニングするためのＢ　Ｇ　ＨｃＤ　Ｎ　
Ａを製造するため、シグナルペプチドを除く成熟ホルモ
ンをコードし、ＢａｍＨＩ末端を有するＢＧＨｃＤＮＡ
配列を含むプラスミド（ｐｔｅｔＢ　Ｇ　Ｈを３７℃で
１時間２０ミリモルのトリスートＩＣ（！（ｐＨ８゜０
）、７ミリモルのＭｇＣ（ｂ、１００ミリモルのＮａＣ
Ｑ、２ミリモルのβ−メルカプトエタノール中ＢａｍＨ
ＩおよびＥｃｏＲｒにより消化し、次いでフェノール抽
出し、エタノール沈澱さ仕、０．１　ミリモルのＥＤＴ
Ａに再懸濁した。

プラスミドｐＳＢＢＧＨを作成するために、製造された
ｐｓＢおよびｐｔｅｔＢＧＩ−Ｉ　ＤＮＡを２２℃で１
８時間６．６ミリモルのトリス−ＨＣ（ｌｃｐＨ７。

５）、６．６ミリモルのＭｇＣＱｔ、　　１ミリモルの
β−メルカプトエタノール、５ミリモルのＡＴＰ中Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲートし、そしてラ
イゲートされたＤＮＡを大腸菌株１−１ｂ１０１に形質
転換した。その場でのイムノアッセイで抗−ＢＧＨ抗体
との特異的反応についてコロニーの蛋白質を試験し、ま
たＬＥおよびＩ３　Ｇ　ｒ−Ｉ配列をマークする制限部
位についてコロニーから製造されたＤＮＡを制限酵素分
析することによりｐｓＢＢＧＨを含むコロニーを確認し
た。プラスミドｐＳＢＢＧＭがＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
ＢＧＨ融合蛋白質配列をコードすることを確かめるため
に、ＢａｍＨＩ部位の側面のプラスミドｐＳＢＢＧＨの
ヌクレオチド配列をマクサム−ギルバート法［［メソッ
ズ・インーエンサイモロジーＪ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５巻、４９９−５６０頁
（１９８０年）］により測定した。この配列は次の通り
である。

ＬＥ−Ｍａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｅ
ｕ ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＣＧＣＧＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＣＴＴＣ
ＣＣＡ　ＧＣＣＡＴＧＴＴＧ−ＢＧＩＩ 実施例１９ ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−うし成長ホルモン融合蛋白質の
合成 大腸菌株Ｈｂｌ　Ｏｌを、ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧ
Ｍ融合蛋白質をコードするプラスミドベクターｐＳＢＢ
ＧＨの宿主として用いた。ｐＳＢＩ３ＧＨを含むＨｂｌ
　Ｏｌを３７℃て１％トリプトン、０５％酵母抽出物お
よび１％ＮａＣσを含むしブロスにおいて一夜生長させ
た。細胞を、２％グルコース、０．２５％カサミン酸、
０．１ミリモルＣａ　ＣＱ　２、１ミリモルＭｇ５Ｏａ
−７ＨｔＯＳ　Ｏ，６％ＮａｚＨＰｏ４．０．３％ＫＨ
，ＰＯ，，０，５％ＮａＣｌ２および０．１％ＮＨ＋Ｃ
（！を４０μｇ／Ｒ１２のチアミン塩酸塩で捕ったもの
を含むＭ９培地中１００倍に希釈した。３７℃で３０分
間インキュベーション後、１００％エタノールに溶かし
たインドールアクリル酸を培養に加えて最終濃度１０μ
９／ＭＱとした。

３７℃でのインキュベーションを３時間続けた時点で培
養１　ｘρ当たりのＡ３５６を分光光度計で読み取った
。次いで細胞を遠心分離により集め、５０ミリモルのト
リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，６）、０．１ミリモルのＥＤＴ
Ａおよび１ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオ
リド（ＴＥＰ）を含む緩衝液中１０Ａｓｉ。／ｄに再懸
濁し、超音波処理により溶解した。４℃で１０分間６５
００〜１１００００ｒｐで遠心分離後、ＬＥ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−８０Ｍ蛋白質をペレットの溶解した細胞から集
めた。

実施例２０ ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＭ融合蛋白質からのうし成
長ホルモンの放出 ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−８０Ｍ蛋白質からＢＧＨを放出
させるために２方法を用いた。１番目の方法は、低ｐ）
［値および低温での融合蛋白質のインキュベーションを
含む。２番目の方法は、高温でドデシル硫酸ナトリウム
中中性に近いｐＨ値における融合蛋白質のインキュベー
ションを含む。

１番目の方法の場合、ＬＥ−Ａｓｌ）−Ｐｒｏ−ＢＧＨ
融合蛋白質を溶解したエシェリヒア・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）から沈澱させ、６モルのグアニジン塩酸塩を
含む７０％蟻酸に０．２〜０　、５　ｍｇ（蛋白質）／
３１１２の濃度で再懸濁し、４２℃で７２時間以下、好
ましくは４８時間インキエベートした。次に試料を少な
くとも１０００倍容量のＴＥＰに対し４℃で透析した。

この緩衝液を２回換えた。遊離したＢＧＨ蛋白質は不溶
性となったが、これを４℃で１０分間１３０００　ｒｐ
ｍで遠心分離することにより濃縮した。蛋白質沈澱物を
５０ミリモルのトリズマ（Ｔ　ｒｉｚＩＩｌａ）塩基、
１０ミリモルの水酸化ナトリウムに再懸濁することによ
り沈澱したＢＧＨ蛋白質を溶解させ、次に４００μＱの
トリズマ＋水酸化ナトリウム溶液対ｌμσの酢酸溶液の
比率で４゜２５Ｎ酢酸により試料のｐ）（を９にした。

この方法を用いたＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＨ蛋白質
からのＢＧＨの時間従属性放出をラエミリの方法［［ネ
イチャー　Ｊ（Ｍａｔｕｒｅ）、２２７巻、６６０−６
８５頁（１９７０年）によるＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および蛋白質染色に
より明らかにした。

ＢＧＨサイズ蛋白質がＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＨ蛋
白質から放出された。このＢＧＨサイズ蛋白質は抗ＢＧ
Ｈ抗体と特異的に反応したが、ＬＥ蛋白質はしなかった
。このことをプルネットの方法［「アナリテイカル・バ
イオケミストリーＪ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ　１ｏ
ｃｈｅＩＩＩｉｓｔｒｙ）、１１２巻、１９５−２０３
頁（１９８１年）コを用いた蛋白質／抗体ウェスタンブ
ロッティングにより明らかにした。

２番目の方法の場合、沈澱したＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
ＢＧＨ融合蛋白質を、ロアミリモルのトリス−ＨＣｆ２
．６７ミリモルノイミダゾールＨＣ１２（ｐＨ７）、２
％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、３゜３ミリモルの
ＥＤＴＡおよび３．３％のβ−メルカプトエタノールを
含む緩衝液に０．２〜５ｍ９（蛋白質）／ｘ（ｌの濃度
で再懸濁した。約１０５〜１１５℃のどの温度でも加水
分解は行なわれ得るが、蛋白質を１１０℃で３〜５時間
加熱した。この結果融合蛋白質からＢＧＨが放出された
。ＳＤＳ／加熱方法を用いた融合蛋白質からのＢＧＨの
時間従属性放出を、前記のラエミリの方法による電気泳
動および蛋白質染色により、また前記の蛋白質／抗体ウ
ェスタンプロット分析により確認した。

実施例１４〜１９記載の方法はまた、うし成長ホルモン
のｃＤＮＡの代わりに適当な成長ホルモンｃＤＮＡを用
いることによりぶた成長ホルモン、ひと成長ホルモンお
よび他の成長ホルモンの生産に用いられ得る。

実施例２１ うし成長ホルモンの結合 ラット成長ホルモン受容体との結合能力について実施例
１７に記載した低ＰＨ法により製造された８０Ｍ蛋白質
を試験し、そして未処理のＢ　Ｇ　Ｈ蛋白質、Ｂ　Ｇ　
Ｈペプチドを欠く酸処理されたＬＥ蛋白質および未処理
で元のままのＬＥ−Ａｓｐ−ＰｒＯ−Ｂ　Ｇ　Ｈ融合蛋
白質と比較した。

成長ホルモン受容体結合アッセイにおいて、ラット肝が
ん細胞（ＨＴＣ）を、１０％のうし胎児血清を含むダル
ベツコのミニマル・エッセンシャル・ミーディアム（最
少必須培地）（ＤＭＥＭ、カリフォルニア９５０５０、
サンタクララ、アルド・アベニュー５１９、ジブコ・ラ
ボラトリーズ）中２４ウエルのクラスター皿で全面成長
させた。細胞をｌｉ９／ＲＱのうし血清アルブミン（Ｂ
　Ｓ　Ａ）、５０ミリモルのＨＥＰＥＳ（ＰＨ７，４）
を含むＤＭＥＭで２回洗浄し、次に高い濃度の冷ＢＧＨ
または等蛋白質量の未処理もしくは酸処理されたＬＥ−
ＢＧＨ融合ましくはＬＥ蛋白質の非存在または存在下に
３７℃で１時間２０　ｎｇ／ＩＩＱ　Ｉ　”’−Ｂ　Ｇ
　Ｈとインキュベートした。このインキュベーション後
、細胞を３回冷ＤＭＥＭ−ＢＳＡで洗浄し、０．ｌＮ−
ＮａＯＨで溶解させ、細胞会合放射能をガンマカウンタ
ーで測定した。

融合蛋白質から放出されたＢＧＭを含有する試料ｉよラ
ット成長ホルモン受容体と結合することが判ったが、酸
処理したＬＥ試料はほとんど反応しなかった。未処理の
ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−８０Ｍ蛋白質もまた成長ホルモ
ン受容体とほとんど結合しなかった。さらに、酸中での
インキュベーションの間ＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧＭ
蛋白質からのＢＧＨの放出およびもとのままのＬ　Ｅ　
−Ａｓｐ　−Ｐ　ｒｏ　−ＢＧＨ融合蛋白質の消失と相
関する成長ホルモン受容体結合活性における時間従属性
増加が見られた。すなわち、融合蛋白質自体ではなく融
合蛋白質から放出されたＢ　Ｇ　Ｈ蛋白質が受容体結合
に関係があり、またもとのままの融合蛋白質製品は受容
体結合活性をほとんど示さなかった。

脚　　注 コード＃１の７５個の試料（任意の健康な提供者）全部
をアッセイすると、＃１４９のみがＡＩＤＳ蛋白質と陽
性反応を示した。

＊不十分な試料であるため標準より低いｌ／１０００の
希釈率でアッセイされた血清。

状態コード＃は患者の状態を示す。

１−任意の健康な血液提供者 ２−徴候はないが危険性は高い。

３−ＬＡＤＳ。

４−ＡＲＣ，３またはそれ以上の徴候／症状５−ＡＩＤ
Ｓおよびカボシ内腫および／または条件的感染の診断

【図面の簡単な説明】

第１図は、中間体ベクタープラスミドＰＴ　ｒｐＥ−＃
２２の構造を示す。 第２図は、発現ベクターｐＴｒｐＬＥ−＃　１４の構造
を示す。 第３Ａおよび３Ｂ図は、それぞれプラスミドｐ’ｒｒｐ
−５ｓｔＩ［−ＨｕＧＲＦから産生されたｍＲＮＡをコ
ードすると予測されるＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す
。 第４図は、ＴｒｐＬＥ−ＨＧＲＦ融合蛋白質を産生ずる
エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞からＨＧＲ
ＦＬｅｕ２７の精製を示す。 第５図は、エシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞
からＴｒｐＬＥＳＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲ
ＦＬｅｕ２７およびＴｒｐＬＥ−ＳｓｔＩ［−ＨｕＧＲ
Ｆ”　Ｌｅｕ２７蛋白質を高率で産生ずることを示すＳ
ＤＳ蛋白質ゲルを描いたものである。 第６図は、ＣＮＢｒ開裂前の細胞溶解および遠心分離に
よるエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）からのＴｒ
ｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩ−ＨｕＧＲＦ　　Ｌｅｕ２７の精
製を示すＳＤＳ蛋白質ゲルを描いたものである。 第７ＡおよびＢ図は、それぞれＴｒｐＬＥ−Ｓｓｔｎ−
ＧＲＦおよびＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＩＩＧＲＦのＣＮＢ
ｒ処理により放出されたペプチドのＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）プロフィールを描いたものである
。第７Ｃ図は、第７Ｂ図のＨＰＬＣフラクションのアデ
ニル酸シクラーゼ活性を示す。 第８Ａおよび８Ｂ図は、それぞれ融合蛋白質のＣＮＢｒ
開裂およびＨＰＬＣ分画後の抗−ＨｕＧＲＦ抗血清を用
いたＴｒｐＬＥ−ＢｓｓＨＵ−ＧＲＦおよびＴｒｐＬＥ
−ＳａｔＩＩ−ＧＲＦのウェスタンプロットを描いたも
のである。 第９Ａおよび９Ｂ図は、それぞれクーマシ−（（Ｃｏｏ
ＩＩｌａｓｓ　ｉｅ）・ブリリアント・ブルー・スティ
ンによる染色ゲル、および抗−ＨｕＧＲＦ抗血清を用い
たウェスタンブロッティングを描いたしのである。 第１０Ａ、ＩＯＢおよび１００図は、それぞれ第９Ａ図
記載のロットｌ、２および３のＨＰＬＣのプロフィール
を描いたものである。。 第１１図は、ウィルスの主なオープンリーディングフレ
ームに関連して記載した特異的クローンの位置を説明す
るＡＩＤＳウィルスゲノムの地図（ＧＡＧＳＰＯＬ、Ｅ
ＮＶ、ＡおよびＢ）である。 第１２図は、３名のＡＩＤＳ患者から得た血清のプール
を用いたウェスタンブロッティング法により可視化され
たＴｒＰＬＥ−ＡＩＤＳ融合蛋白質およびＡＩＤＳウィ
ルス感染細胞（ＢＡＧ）の基準パターンを示す。 第１３Ａ−１３１図は、１９個のヒト血清試料のウェス
タンブロッティング分析から得られた結果を図示したも
のであり、そのうち第１３Ａ、１３Ｂ、１００図はＴｒ
ｐＬＥ−Ａ［）Ｓ融合蛋白質ＧＡＧ、第１３Ｄ、　　■
３Ｂ、１３Ｆ図は同じくＰＯＬ、第１３Ｇ図は同じ＜Ｅ
ＮＶ、第１３Ｈ図はインサートのないＴ　ｒｐＬ　Ｅベ
クター、第１３Ｉ図はＡＩＤＳウィルス感染細胞をプロ
ーブしたものである。各パネル上の数字は、積極的に反
応する血清試料の数を示す。 なお、第５．６．８Ａ、８Ｂ、９Ａ１９Ｂ、１２、！３
Ａ−１３１図は写真の模写図である。 特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド 代理人弁理士青　山　葆　ほか１名 第４図 図面の浄の（内容に変更なし） ＾へＧｒ工Ｃ＾ＣＧＴ　　＾＾＾＾＾ＧＧＧＴＡ　　Ｔ
ＣＧＡＣ八　８丁Ｇ　＾＾＾第３第３御 ＾ＧＡ　　ＧＡＴ　　ＣＴＣ　　ＧＡＣ　　ＡＧＣ　　
ＣＧＴ　　ＡＴＴ　　Ｇ＾＾　ＣＴＧ　　Ｇ＾＾＾？Ｑ
　Ａｓｏ　Ｌｅｕ　ＡＳＯ　Ｓｅｒ＾ｌ−Ｑ　ｆｌｅ　
Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＣＡＴ　　ＣＴＧ　　Ａｒ６　
ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　にＡｒ　　ＣＴＣ　　ＧＣＣ　　
ＣＧＴ　　八＾ＴＨｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ｍｅｌ　　Ｌａ
ｕ　　Ｕａｌ　　Ａｓｏ　　Ｌｅｕ　　＾！ｄ　＾「９
　＾ツｎ１６Ｇ ＣＧＣ　　ＴＡＣ　ＧＴＣ　ＧＣＣ　Ｇ＾ｒ　ＣＴＣ　
ＡＣＣ　＾＾＾ＧＴＴ　ＧＡＣ＾ｒｇ　　Ｔｙｒ　　Ｉ
Ｊａｌ　　＾凰ａ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　ｒｈｒ　　
Ｌｙｓ　　ＩＪａｌ　　＾５ｐＣＧＣ　　ＧＴＡ　　６
ＴＣ　　ＧＧＣ　　６＾＾　ＣＴＧ　　ＣＧＴ　　ＣＡ
Ｃ　　ＧＡＴ　　ＣＴＴ＾ｒ９　リａｌ　　ＩＪａｌ　
　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｌａｕ　　＾ｒｇ　　Ｈｉｓ　
　＾ｓｏ　　Ｌｅｕ＾＾丁　６ＴＣ　　ＧＧＧ　　ＡＣ
Ｇ　　ｒＴ＾　＾ＧＣ　　ＧＧＴ　　ＧＣＧ　　ＣＣＧ
　　＾＾＾＾ｓｎ　Ｍａｔ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ａｕ　　Ｓａｒ　　Ｇｌｙ　　＾１４　　Ｐｒｏ　　Ｌ
ｙｓ５Ｇ５ ＩＪｃ　　ＧＡＣ　　ＡＣＣ　　ｒＧｃ　　ＡｒＴ　　
ＧＴＧ　　ＡｒＣ　　ＣＧＣ　　ｒＣＧ　　ＧＣＧｅｅ 硬 ｉＡｒ　　ＣＴＧ　　ＧＣＡ　　ＣＧＣ　　ＡＦＴ　　
ｒＧＣ　　ＡＣＣ　　ＣＣＣ　　ＧＧＣ　　八６ＣＳｓ
ｏ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｒｇ　　ｌｌｅ　　Ｃｙ
ｓ　　ｒｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ：ＧＴ　
　ｒＡｒ　　ＴＣＣ　　ＦＡＴ　　ＧＴＧ　　ＡｒＧ　
　ＣＡＣ　　ＣＴＣ　　ＧＴＣ　　ＴＣＴ’＋ｒｒ２　
　ｒｙｒ　　Ｓａｒ　　Ｔｙｒ　　リａ１　門ｅｔ　　
Ｈｌｓ　　Ｌａｕ　　リａｌ　　５ｅｒ３９θ ３ＡＣ　　ＧＣＣ　　ＣＴＧ　　ＣＡＣ　　ＧＣＴ　　
ｒＡｒ　　ＣＧＣ　　ＧＣＣ　　ｒＧｒ　　ＡＴＧへ叩
　ハ１δ　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　＾Ｉａ　　ｒｙｒ　＾
ｒｑ　Ａｌａ　　Ｃｙｓ　　Ｍｅｔ３５の ＧＴＡ　　ＣＧＣ　　ＧＣＴ　　ＡＴＧ　　ＣＡＧ　　
ＴＴ八　＾ｒＴ　　ＧＣＣ　　Ｇ＾Ｇ　　ＧＣＧすｄｌ
　＾「９　＾１ａ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　
Ｉｌａ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　ＡｌａＣＴＧ　　ＧＴ
Ｇ　　ＧへＡ　　ＡＡＣ　　ＧＧｒ　　ＡｒＣ　　ＧＣ
Ｃ　　ＡＣＣ　　ＧＴＧ　　ＣＡＡ図面のｌ’Ｔｈ１’
Ｈ！内ｌ′ｊに：４：更なし）第５０ ＰＴｒＰルε−ＨｕＧＲＦ 、」Ｌｌ ＝ 図面の浄（１：（内′３；に変更なし）第７Ａ図 時間（労） 第７Ｂ図 ＋０　　２０　　３０　４０゜債（り）第７Ｃ図 図面の浄書（内′？：；に変更なし） チ ２３９１０１１１２１３１牛１５１６１７１８ＨＵ−Ｇ
ｌ？Ｆ 図面の浄書（１生；°；ｌこ変更なし１第８Ｂ図 １１１２１３１４１５１６１７１８１９２０　　　フラ
クション１３図面の浄書（内容に変更なし） 第９Ａ目 １２３５　１２３．５　１２３５ ２５　　５　　１　μ９ 図面の浄？；（内、°メに変更なし） 第９Ｂ図 １２３Ｓ１２３Ｓｆ２３Ｓ 図面の浄書（内容１と変更なし） 第ＪυＡ＠Ｊ 図面の浄書（内容に変更なし） 第Ｊ□Ｈ図 第１０Ｃ図 図面の：争、１：（内３に変更なし） ′＄１２図 図＋Ｍｉの浄書（内容に変更なし） 第１３八図　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第
１３β図＃１３Ｃ図 図面の浄シ：（内゛ご、：：（１（：更なし）第１３Ｄ
図　　　　　　　　謔ｊ３Ｅ口％１３Ｆ図 手続補正書く方式） ３．　補正をする者 ８　事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国カリ７オルニ７９４３０４、パー
口・アルド、ヒルビュー・アベニュー３４０１８名称　
　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコーホレイテ
ッド ４、代理人 ５、　補正命令の口付　：　昭和６１年１０月２８日（
発送日）７、補正の内容　：　別紙の通り。（第５．６
．８．９およ１１２図については、原図に基づいてでき
るだけ正確に手書きした図面を提出致します、）

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. （１）融合蛋白質の発現を目的とする細菌性発現ベクタ
   ーであって、 ＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子断片、 異種ＤＮＡ配列、 所望により上記ＴｒｐＬＥ断片および上記異種ＤＮＡ配
   列間に３−フレームリンカーセグメント、および、 所望により上記ＴｒｐＬＥ断片および上記異種ＤＮＡ配
   列間に開裂可能なリンカー配列を含むベクター。
2. （２）上記開裂可能なリンカーがＭｅｔ、Ａｓｐ−Ｐｒ
   ｏ、またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを
   コードする特許請求の範囲第１項記載のベクター。
3. （３）上記異種ＤＮＡ配列が、 ひと、うしまたはぶた成長ホルモン放出因子、またはそ
   の生物活性誘導体もしくはフラグメント、抗原ウィルス
   蛋白質、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメン
   ト、 生長因子、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメ
   ント をコードする特許請求の範囲第１項記載のベクター。
4. （４）上記抗原ウィルス蛋白質がＨＢＶの前−Ｓ配列で
   ある特許請求の範囲第３項記載のベクター。
5. （５）上記のひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出
   因子、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメント
   がＨｕＧＲＦ＿Ｌ＿ｅ＿ｕ＿＿２＿＿７、ＢＧＲＦ＿Ｌ
   ＿ｅ＿ｕ＿＿２＿＿７またはＰＧＲＦ＿Ｌ＿ｅ＿ｕ＿＿
   ２＿＿７である特許請求の範囲第３項記載のベクター。
6. （６）上記異種遺伝子部分がうし成長ホルモンをコード
   する特許請求の範囲第５項記載のベクター。
7. （７）融合蛋白質の発現を目的とする細菌性発現ベクタ
   ーの製造方法であって、 ＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドを選択し、 制限エンドヌクレアーゼによりＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝
   子を開裂し、 異種ＤＮＡ配列を挿入し、そして 所望により、上記異種配列を挿入する前後に開裂可能な
   リンカー配列を挿入する ことからなる方法。
8. （８）上記開裂可能なリンカー配列がＭｅｔ、Ａｓｐ−
   Ｐｒｏ、またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙ
   ｓをコードする特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）融合蛋白質の発現を目的とする細菌性発現ベクタ
   ーの製造方法であって、 ＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝子を含むプラスミドを選択し、 制限エンドヌクレアーゼによりＴｒｐＬＥ　ＤＮＡ遺伝
   子を開裂し、 ３フレームリンカーを挿入し、 ３フレームリンカー内に異種ＤＮＡ配列を挿入し、そし
   て 所望により開裂可能なリンカー配列を挿入することから
   なる方法。
10. （１０）上記開裂可能なリンカー配列がＭｅｔ、Ａｓｐ
    −Ｐｒｏ、またはＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌ
    ｙｓをコードする特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）上記異種ＤＮＡ配列が、 ひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出因子、または
    その生物活性誘導体もしくはフラグメント、抗原ウィル
    ス蛋白質、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメ
    ント、 生長因子、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメ
    ント をコードする特許請求の範囲第９項記載の方法。
12. （１２）上記抗原ウィルス蛋白質がＨＢＶの前−Ｓ配列
    である特許請求の範囲第１１項記載の方法。
13. （１３）上記ひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出
    因子またはその生物活性誘導体もしくはフラグメントが
    ＨｕＧＲＦ＿Ｌ＿ｅ＿ｕ＿＿２＿＿７、ＢＧＲＦ＿Ｌ＿
    ｅ＿ｕ＿＿２＿＿７またはＰＧＲＦ＿Ｌ＿ｅ＿ｕ＿＿２
    ＿＿７である特許請求の範囲第１１項記載の方法。
14. （１４）上記異種遺伝子部分がうし成長ホルモンをコー
    ドする特許請求の範囲第１３項記載の方法。
15. （１５）ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、異種ポ
    リペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体、 所望により上記ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントお
    よび上記異種ポリペプチド間に開裂可能なリンカーオリ
    ゴペプチド、および 所望により上記ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントお
    よび上記異種ポリペプチド間に３−フレームリンカーオ
    リゴペプチドセグメント を含む融合蛋白質。
16. （１６）上記異種ポリペプチドが、 ひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出因子またはそ
    の生物活性誘導体もしくはフラグメント、抗原ウィルス
    蛋白質、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメン
    ト、 生長因子、またはその生物活性誘導体もしくはフラグメ
    ント、 である特許請求の範囲第１５項記載の融合蛋白質。
17. （１７）上記抗原ウィルス蛋白質がＨＢＶの前−Ｓ配列
    である特許請求の範囲第１６項記載の融合蛋白質。
18. （１８）上記ひと、うしもしくはぶた成長ホルモン放出
    因子またはその生物活性誘導体もしくはフラグメントが
    ＨｕＧＲＦ＿Ｌ＿ｅ＿ｕ＿＿２＿＿７、ＢＧＲＦ＿Ｌ＿
    ｅ＿ｕ＿＿２＿＿７またははＰＧＲＦ＿Ｌ＿ｅ＿ｕ＿＿
    ２＿＿７である特許請求の範囲第１６項記載の融合蛋白
    質。
19. （１９）上記異種ポリペプチドがうし成長ホルモンであ
    る特許請求の範囲第１６項記載の融合蛋白質。
20. （２０）上記開裂可能なリンカーオリゴペプチドがＭｅ
    ｔ、Ａｓｐ−Ｐｒｏ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ
    −Ｌｙｓである特許請求の範囲第１５項記載の融合蛋白
    質。
21. （２１）抗原ウィルス蛋白質またはその生物活性誘導体
    もしくはフラグメントに暴露された哺乳類から産生され
    る抗体結合用イムノアッセイ試薬であって、 ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、 抗原ウィルス蛋白質、またはその生物活性誘導体もしく
    はフラグメント、および 所望により上記ＴｒｐＬＥオリゴペプチドフラグメント
    および上記抗原ウィルス蛋白質間に３−フレームリンカ
    ーオリゴペプチドセグメント を含む融合蛋白質である試薬。
22. （２２）ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、異種ポ
    リペプチド、 所望により上記ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントお
    よび上記異種ポリペプチド間に開裂可能なリンカーオリ
    ゴペプチド、および 所望により上記ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメントお
    よび上記異種ポリペプチド間に３−フレームリンカーオ
    リゴペプチドセグメント を含む融合蛋白質の有効量を投与することにより哺乳類
    における抗体形成を誘発する方法。
23. （２３）上記抗体がポリクローナルまたはモノクローナ
    ルであり、異種ポリペプチドの存在の検出に有用なもの
    である特許請求の範囲第２２項記載の方法。
24. （２４）上記異種ポリペプチドが抗原ウィルス蛋白質で
    ある特許請求の範囲第２３項記載の方法。
25. （２５）上記抗原ウィルス蛋白質がエンベロープポリペ
    プチドである特許請求の範囲第２４項記載の方法。
26. （２６）上記抗体がウィルス感染に対する免疫性を与え
    るのに有用な抗体を中和する特許請求の範囲第２２項記
    載の方法。
27. （２７）ＴｒｐＬＥポリペプチドフラグメント、および
    、 哺乳類細胞ウィルス受容体により認識される異種ポリペ
    プチド を含む融合蛋白質の有効量を投与することにより、細胞
    ウィルス受容体に拮抗結合させることによる哺乳類にお
    けるウィルス感染の低減または予防方法。
28. （２８）細菌宿主による発現に適し、 適当な天然細菌ポリペプチド、好ましくはＴｒｐＬＥ、 Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチドリンク、および 異種ポリペプチド を含む融合蛋白質。
29. （２９）異種ポリペプチドが成長ホルモン、好ましくは
    うし成長ホルモンである特許請求の範囲第２８項記載の
    融合蛋白質。
30. （３０）異種ポリペプチドが成長ホルモン放出因子、好
    ましくはひと膵臓成長ホルモン放出因子である特許請求
    の範囲第２８項記載の融合蛋白質。
31. （３１）融合蛋白質を生産するためのプラスミド発現ベ
    クターであって、順次、 適当な天然ポリペプチド、好ましくはＴｒｐＬＥをコー
    ドするＤＮＡ配列、 ジペプチドＡｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡ配列およ
    び 異種ＤＮＡ配列 を含むベクター。
32. （３２）異種ＤＮＡ配列が成長ホルモン、好ましくはう
    し成長ホルモンをコードする特許請求の範囲第３１項記
    載のベクター。
33. （３３）異種ＤＮＡ配列が成長ホルモン放出因子、好ま
    しくはひと膵臓成長ホルモン放出因子をコードする特許
    請求の範囲第３１項記載のベクター。
34. （３４）組換え技術による融合蛋白質の生産方法であっ
    て、 適当な天然ポリペプチド、好ましくはＴｒｐＬＥをコー
    ドするＤＮＡ配列を含むプラスミドを用意し、 ジペプチドＡｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡ配列を挿
    入し、そして 異種ＤＮＡ配列を挿入する ことからなる方法。
35. （３５）異種ＤＮＡ配列がうし成長ホルモンをコードす
    る特許請求の範囲第３４項記載の方法。
36. （３６）Ａｓｐ−Ｐｒｏリンクおよび異種ポリペプチド
    を有する融合蛋白質から異種ポリペプチドを放出させる
    方法であって、酸性条件下、好ましくはｐＨ２−４でＡ
    ｓｐ−Ｐｒｏ連鎖を加水分解することからなる方法。
37. （３７）酸加水分解が、約３５℃ないし４５℃の温度で
    、約６５％ないし７５％の濃度の蟻酸を用いて行なわれ
    る特許請求の範囲第３６項記載の方法。
38. （３８）蟻酸濃度が約７０％および温度が約４０℃であ
    る特許請求の範囲第３７項記載の方法。
39. （３９）上記融合蛋白質がＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧ
    Ｈ（うし成長ホルモン）である特許請求の範囲第３８項
    記載の方法。
40. （４０）上記加水分解が約１０５℃ないし約１１５℃の
    温度で約０．５％ないし２％の濃度のドデシル硫酸ナト
    リウムを用いて行なわれる特許請求の範囲第３６項記載
    の方法。
41. （４１）ドデシル硫酸ナトリウム濃度が約２％で温度が
    約１１０℃である特許請求の範囲第４０項記載の方法。
42. （４２）上記融合蛋白質がＬＥ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＢＧ
    Ｈである特許請求の範囲第４１項記載の方法。