JPS6212799A - 後天性免疫不全症候群ウイルスのエンベロ−プ蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、後天性免疫不全症候群の病因ウィルスのエン
ベロープ蛋白質である、ｅｎｖＡＩＤＳと命名された蛋
白質、ｅｎＶＡＩＤｓをコードする発現ベクター、組換
えＤＮＡ技術を用いたｅｎｖＡＴＤｓの製造、ならびに
ヒト血液中におけるＡＩＤＳ抗体の存在の検出方法に関
する。 発明の背景 １９８１年から今日までに、８０００名以上のヒトが後
天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と診断されているにュ
ーヨーク・タイムズ、Ａ−１１、１１９８５年１月１１
日）。ＡＩＤＳは重篤な日和見感染の発現を特徴とし、
二次的に生体の免疫系　　　　Ｉに影響’ｌ：％Ｕ６　
（：ｒッ、、−７（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、　ＨｏＩＳ、）
はか：ニューモサイステイス・カリニ−・ニューモニア
・アンド・ムコザル・カンジダイアシス・イン・プレビ
アスリー・ヘルシー・ホモセクシャル・メン：エビデン
ス・オプ・ア・ニュー・アクアイアート・セルラー・イ
ミュノデフィシ　　　　ｊＸ　、’）　−（Ｐｎ１３Ｌ
ｌｌＯＣ１ｔｉＳ　Ｃａｒｉｎｉｉ　Ｅ）ｎｌｌｉｕｌ
ｌＯｎｉａ　ａｎｄ　　　！１ｔｌｃＯｓａｌ　ｃａｎ
ｄｉｄｉａｓｉｓ　ｉｎ　ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ　ｈｅ
ａｌｔｈｙ　　　１ｈｏｉｏｓｅｘｕａｌ　ｍｅｎ：ｅ
ｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｒ　ａ　ｎｅｗ　ａｃｑｕｉｒｅｄ
　　　壮■ ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｇａａｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ）　、ニュ−−インク　　　　・１５＞Ｆ°’）ｖ−
ｔ）Ｌｔ−２７°″″″４″［、（Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ
、　Ｈｅｄ、　）、　３０５．１４２６〜１４　　　　
　　’□ ド ３１　（１９８１））。この疾患は男性同性愛者、　　
　　　ｌ。 血液製品を投与されている患者・麻薬静脈注射常　　　
　　１：用者、ハイチおよび中央アフリカ出身者にみら
れ　　　　１・る（パイオツド（Ｐｉｏｔ、　Ｐ、　）
はか：アクアイアー　　　　　１ド・イミュノデフイシ
エンシー・シンドローム・　　　　　１イン、ア、ヘテ
０セクシャル・ボプレーション・イン°ザイール（Ａｃ
ｑｕｉｒｅｄ　ｉ＋＋＋＋ｉｕｎｏ−ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ　　ｉｎ　　ａ　　ｈｅｔｅｒｏ
ｓｅｘｕａ＋　　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　　１ｎＺａｉ
ｒｅ　）　、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　、　Ｉｌ、
　６５〜６９（１９８４））。ＡＩＤＳの免疫学的パタ
ーンは伝染性疾患の場合と一致することから、この疾患
の病因はウィルス起源のものと考えられた。少なくとも
３種のレトロウィルスが数名のＡＩＤＳ患者の培ＩＴ細
胞またはＡＩＤＳの可能性がある患者の白血球から単離
されている。リンパアゾツバシー関連ウィルス（ＬＡＶ
）と呼ばれる新規なヒトレトロウィルスが発見され、そ
の性質はＡＩＤＳにおけるその病因的役割と一致した。 このウィルスはリンパ腺症患者から単離されたので、そ
の名称が与えられた（モンタニエル （Ｈｏｎｔａｇｎｉｅｒ、　Ｌ、　）はかニア・ニュー
・ヒユーマン・テイー−リンホトロビック・レトロバイ
ラス：キャラクタリゼーション・アンド・ポジプル・〇
−ル・イン・リンフアゾツバシー・アンド・アクアイア
ート・イミュンデフイシエンシー俸ジンドロームズ（Ａ
　ｎｅｗ　ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｉｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ
ｒｅｔｒＯＶｉｒｌｊｓ：ＣｈａｒａＣｔｅｒｉＺａｔ
ｉＯｎ　ａｎｄ　ｐｏｓｓｉｂ１８ｒｏｌｅ　ｉｎ　＋
ｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ　ａｎｄ　ａｃｑｕｉｒ
ｅｄ−ｉｍｍｕｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒ
ｏｍｅｓ）　、ガロはが（Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ。 Ｈ，Ｅｓ５ｅｘ　＆　Ｌ、Ｇｒｏｓｓ）編、ヒユーマン
・ティー−セル・リューケミア／リンフオーマ・ウィル
ス（Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　／
Ｌｙｍｐｈｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ）、コールド・フプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　５Ｅｌｒｉｎ
ｌ）　Ｈａｒｂｏｒ　ｔａｂｏｒａｔｏｒｙ　）刊、３
６３〜３７０頁〕。ほかにヒトレトロウィルス、とくに
ヒトＴ細胞白血病／リンパＷ／向リンパウィルスの亜型
２種、１型およびｍ型が単離されている（ＨＴＬＶ−Ｉ
型：ボイーズ（Ｐｏｉｅｓｚ、　Ｂ、　Ｊ、　）ほか：
デイテクション・アンド・アイソレーション°オブ°り
４プ°２−°′ヒトパイラバパー　　　　　：ティクル
ズ・フラム・フレッシュ・アンド・カルチむド°す＊＋
ｔ″”ｔ−オプ°７ベイ′−′１′１ト・ウィズ・キュ
ーテナス・ティー−セル・リンホーマ（Ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ　ａｎｄ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　
Ｃ。 ｒｅｔｒＯＶｉｒＬｌｓ　１）ａｒｔｉｃＩ１３ｓ　ｆ
ｒｏｌＩ　ｒｒｅｓｈ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｄＩｙ
ｌｐｈＯｃｙｔｅｓ　ｏｆ　ａ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉ
ｔｈ　ｃｕｔａｎｅｏｕｓＴ−ｃｅｌｌ　Ｉｙｍｐｈｏ
ｍａ　）　、ビーーＩヌΦエイ・ニス（ＰＮＡＳ）、７
７．７４１５〜７４１９（１９８０）：ＨＴＬＶ−１１
Ｉ型：ボボビック（Ｐｏｔ）ＯＶｉＣ。 Ｈ，）ばか：ディテクション、アイソレーション・アン
ド会コンティニュアス・プロダクション・オプ・サイド
パシック・レトロパイラス・フラム・ペイシエント・ウ
ィズ・エイズ・アンド・プレエイズ（Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ、　　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕ
ｏｕｓｐｒｏｄｕｃｔｔｏｎ　ｏｒ　ｃｙｔｏｐａｔｈ
＋ｃ　ｒｊｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ　−ｍ　）
　ｆｒｏｉ＋　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ
　ａｎｄ　ｐｒｅ−ＡＩＤＳ）　、サイエンス（５ｃｉ
ｅｎｃｅ）、２２４．４９７〜５００　（１９８４））
。さらに他のもうひとつのウィルス、ＡＩＤＳＩＩｌ連
レトロウィルス（ＡＲＶ）が病原として提唱された（レ
ビー（Ｌｅｖｙ、　Ｊ、　Ａ、　）はか：アイソレーシ
ョン・オプ・リンホサイトパシック・レトロパイラスズ
・プラム舎すンフランシスコ・ペイシェンッ・ウィズ・
エイズ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２２５　
、８４０〜８４２　（１９８４））、ＨＴＬＶ−１およ
びＡＲＶレトロウィルスはいずれもＬＡＶに類似の生物
学的性質と血清疫学的性質を示す〔レビー（Ｌｅｖｙ、
　Ｊ、　Ａ、　）ほか：前出、およびボポビック（Ｐｏ
ｐｏｖｉｃ、Ｈ，）ほか：前出〕。上述のように、少な
くとも３種のレトロウィルス、ＬＡＶ、ＡＲＶならＣＦ
　ニ１４　Ｔ　Ｌ　Ｖ亜型Ｉ　、１５ＪｔＦＩＩＩが、
ＡＩＤＳ１７）病原として考えられてきた。 ＬＡＶ、ＨＴＬＶ−ＩｔおよびＡＲＶ−ＩＩのゲノムは
分子的にクローン化された〔シュツブバッハ（Ｓｃｈｊ
ｐｂａｃｈ、　Ｊ、　）　ホが：セｏｏシカ／Ｌ／　−
７すＩＪシス・オブ・ア・サブグループ・オプ・ヒユー
マン・テイー−リンホトロビック・レトロパイラス・ア
ソシエイテツド・ウィズ・エイズ （Ｓｅｒｏｌｏａｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　
ａ　ｓｕｂｇｒｏｕｐ　ｏｆｈｕｍａｎ　Ｔ−ＩＶＩＤ
ｈＯｔｒＯＤｉＣｒｆ！ｔｒＯＶｉｒｔｌｓｅｓ　（Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩ　）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　
ＡＩＤＳ）　、サイＩ　ラス（５ｃｉｅｎｃｅ）、２２
４．５０３〜５０５　（１９８４）ニアリシン（Ａｌｉ
ｚｏｎ、　Ｈ、）ほか：モルキュシー・クローニング・
オプ・リンファデノバシー−アソシエイテツド・パイラ
ス（Ｈｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｏ　ｏｆＩｙｍ
ｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ　−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　
ｖｉｒｕｓ）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１
２．　７５７〜７６０　（１９８４））、ＬＡＶ、ＡＲ
ＶａにびＨＴＬＶ−ｍのプロ１クイルスゲツムの完全ヌ
クレオチド配列も決定サレタ〔ラットナ−（Ｒａｔｎｅ
ｒ、　Ｌ、）はが：コンブリート・ヌクレオチド・シク
エラス・オブ・ザ・エイズ・パイラス、　ＨＴＬＶ−Ｉ
ｎ　（Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｌｌｃｌｅｏｔｉｄｅ　　５
ｅｑｌｌｅｎＣｅ　　Ｏｆ　　ｔｈｅ　　ＡＩＤＳ　　
ｖｉｒｕｓ、旧ＬＶ−■）、ネイチャー（ＨａｔＵｒｅ
）　、　３１３．２７７〜２８４　（１９８５）：サン
チェーベスカドール（５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏ
ｒ、　Ｒ，）ほか：ヌクレオチド・シクエラス・アンド
・エクスプレッション・オプ・アン・エイズーアソシエ
イテツド・レトロパイラス（Ｎｕｃｌｏｔｉｄｅ　５ｅ
ｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆａ
ｎ　ＡＩＤＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｒｅｔｒｏｖｉ
ｒｕｓ、　ＡＲＶ−２）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
　＞、　２２７．４８４〜４９２（１９８５）：ウエイ
ンーホブソン（％４ａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、　Ｓ、）ほ
か、ヌクレオチド・シクエラス・オブ・ザ・エイズ・パ
イラスＬ　Ａ　Ｖ　（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄθ５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ　ｏｒ　ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　ｖｉｒｕｓ　ＬＡＶ
　）　、セル（Ｃｅｌｌ）　　、　　９〜１７　　（１
９８５）　　）　。 ＡＩＤＳの病原を決定するのが難しかったひとつの理由
は、ＡＩＤＳ患者の血清サンプルが様々のレトロウィル
ス抗原と反応性を示すことである。 たとえば、ＡＩＤＳ患者からの血清サンプルはＨＴＬＶ
−１およびＨＴＬＶ−１の抗原と反応することが明らか
にされた（１−ＩＴＬＶ−Ｉ　：エセックス（Ｅｓｓｅ
ｘ、　Ｈ，）はか：アンテイボデイズ・トウー・セル・
メンプラン・アンテイゲンズ・アソシエイテツド・ウィ
ズ・ヒユーマン・ティー−セル・リューケミア・パイラ
ス・イン・ペイシエンツ・ウィズ・エイズ（Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ　　ａｎ
ｔｉｇｅｎｓ　　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　　ｗｉｔｈ　
　ｈｕｍａｎ　　　Ｔ−ｃｅｌｌ　Ｉｅｕｋｅ＋ｓｉａ
　ｖｉｒｕｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ａ
ＩＤＳ　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、　２
２０．８５９〜８６２　（１９８３）：ＨＴＬＶ−ＩＩ
　：サーンガツドハラン（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、
　Ｈ，Ｇ、　）　はか：アンテイボデイズ・リアクティ
ブ・ウィズ・ヒユーマン・テイー−リンホトロピツク・
レトロパイラス（ＨＴＬＶ−Ｉｆｆ）・イン・ザ・シラ
ム・オブ・ペイシエンツ・ウィズ・エイズ（Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎ　
Ｔ−１ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｒｅｔｒ（ｌＶｉｒ（ｌ
ｓｅｓ　ＨＴＬＶ−１１１）　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｅｒｔ
ｌｌ　０ｆｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ）　
、　サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　。 ２２４．５０６〜５０８　（１９８４））。 ＨＴＬＶのエンベロープ遺伝子生成物は、成人下細胞白
血病患者の血清中の抗体と交差反応性の免疫原性を示す
ことが明らかにされている〔キョカワ（にｉｙｏｋａｗ
ａ、　Ｔ、）　はか：エンベローブ・プロテインズ・オ
ブ・ヒユーマン・ティー−セル・リューケミア慟パイラ
ス：エクスプレッション・イン・ニジエリシア・コリ・
アンド・イツツ・アプリケーション・トウー・スタディ
ズ・オブ・エンベロープ・ジーン・ファンクション（Ｅ
ｎｖｅｌｏｐｅｐｒｏｔｅｉｎｓ　　ｏｆ　　ｈｕｍａ
ｎ　　Ｔ−ｃｅｌｌ　　ｌｅｕｋｅｍｉａ　　ｖｉｒｕ
ｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　１ｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｔｏ　５ｔＵｄｉｅＳ　ｏｒ　ｅｎｖ　ｇｅｎｅｒ
ｕｎｃｔｔｏｎｓ）　、ビーエヌエイエス、ニーニスエ
イ（ＰＮＡＳ、ＵＡＳ）、８１．６２０２〜６２０６　
（１９８４））。成人下細胞白血病（ＡＴＬ）は、ＨＴ
ＬＶ−ＩがＴｉ胞の悪性化、すなわちＴ細胞の無制御な
生育を生じる点で後天性免疫不全　　　　　：症候群（
ＡＩＤＳ）とは異なっている。ＡＩＤＳ　　　　　　：
ではａｍの生育ではなく死が起こる。実際、ＨＴＬＶ−
ＩＩＩのこの細胞変性特性は、特異的なレトロウィルス
起源の疾患を最終的に確定するのに重要であった。すな
わち、ＡＩＤＳの病原は、ＡＩＤＳ感染患者から単離さ
れたＡＩＤＳに特徴的な細胞変性効果を示すレトロウィ
ルスで感染させ、永続化したヒト悪性Ｔｉ１ｌ胞（ＨＴ
）を用いて単離された。このウィルスを用いた血清疫学
的検定により、ＡＩＤＳとＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原に対す
る　　　　□抗体の存在との間には完全な相関が認めら
れた（サーンカツドハラン（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ
、　Ｈ，Ｇ、　）ほか：前出、シュツブバッハ（５ｃｈ
ｊｉｐｂａｃｈ、　Ｊ、　）は　　　　１か：前出〕。 さらに、リンパ腺症症候群患者のはぼ８５％およびＡＩ
ＤＳの多い地域の無症候性同性愛男性の有意な比率が、
ＨＴＬＶ−１に対する循環抗体のキャリアーであること
も明らかにされ　　　　ゞだ。これらのデータすべてを
考え合わせると　　　　　　・ＨＴＬＶ−ｎ［がＡＩＤ
Ｓの病原であることを示している。 Ｈ−９１１１胞系を用いてＡＩＤＳウィルスの培養に成
功するまで（ＰＣＴ出願、公告番号ＷＯ３５１０４８９
７号）、ＡＩＤＳウィルスのｅｎｖＡＩＤＳ蛋白質は単
離も、特性づけも、合成もされなかった。これは主とし
て、このウィルスが細胞変性効果を有し、したがってウ
ィルスの単離が不可能であったことによる〔ボボビツク
（Ｐｏｐｏｖｉｃ。 Ｈ，）ほか：前出）。この・ウィルスの細胞変性効果に
抵抗性を示すヒトＴＲＩ胞系が発見されて、はじめてプ
ロウィルスＤＮＡの分子クローニングが達成できた。 ヒト血液でＡＩＤＳを診断するための高感度かつ迅速な
方法および予防免疫接種によるその予防に対する要求は
きわめて大きい。実際、現在用いられている検定／試験
はすべて、誤りが多い。事実、疾病コントロールセンタ
ー（Ｃｅｎｔｅｒ　ｒｏｒＤｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒ
ｏ＋、　ＣＤＣ）は現在利用できる試験法を）ＩＴＬＶ
−ＩＩＩに対する抗体についての血液単位のスクリーニ
ングにのみ使用すべきであるとしてきた。さらに、ＣＤ
Ｃは、現在利用できるＥＬＩＳＡ試験はＡＩＤＳに感染
している可能性が高い集団のスクリーニングやその診断
試験としては使用できないとも述べている（フエデラル
・レジスター（Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ）　
５０　（４８）　。 ９９０９．１９８５年３月１２日号）。この誤りが、Ａ
ＩＤＳの病原の特異的抗原性蛋白質を用い機能不全者に
ついて追跡された。以前に用いられた蛋白質はウィルス
の溶解物に由来するものであった。溶解物はウィルスに
感染したヒト細胞、すなわちウィルスの生育に使用して
細胞から作られたので、この溶解物はウィルス蛋白質の
ほかにヒト蛋白質も含んでいたものと思われる。ウィル
ス蛋白質の純粋な抗原の調製はきわめて難しい。使用さ
れた抗原では偏性の陽性、陰性いずれの結果も生じた〔
バディアンスキー（Ｂｕｄｉａｎｓｋｙ、　Ｓ、　）　
：エイズ・スクリーニング、フォールス・テスト・リザ
ルツ・レイズ・ダウツ（ＡＩＤＳ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
。 ｆａｌｓｅ　ｔｅｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｒａｉｓｅ　
ｄｏｕｂｔｓ）　、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　　
、３１’２．５８３　　（１９８４））　。 このような溶解物、蛋白質／ペプチドの使用によって生
じた誤りは、ＡＩＤＳ非特異的蛋白質を含まない、ＡＩ
ＤＳ抗体結合性組成物を用いることによって回避できる
。純粋なＡＩＤＳエンベＯ−プ蛋白質である組成物が抗
原として使用可能である。 本発明のＡＩＤＳエンベロープ蛋白質は、ＡＩＤＳウィ
ルスによる感染のスクリーニング、診断および／または
予防免疫接種による予防に使用できる一定に保持された
エピトープを有することが確立された。本発明は、この
エピトープをもつエンベロープ蛋白質が従来単独の病原
と主張されてきたすべての変異体を包含することを明ら
かにするものである。 本発明のエンベロープＡＩＤＳ蛋白質は慣用法として知
られている方法によって製造することができる。この新
規蛋白質を製造できる方法は次の３つに分類することが
可能である。すなわち、（１）化学的合成、（２）化学
的合成によってｍ製された遺伝子を宿主に挿入し蛋白質
を宿主１よ″）１産生　　　　　１させる方法、および
（３）バイオテクノロジーで得られた相当する遺伝子を
宿主に挿入し、蛋白質を宿　　　　　１１′″！″″＞
　’Ｃ１ｌＪ−’４Ｅ　３　ｔ　’；ｒ　Ｒｒ’ｌｉ・
１“６・　　　　　　　　　　　ｉ本発明の一態様にお
いては、組換えＤＮＡ技術が用いられ、天然起源のｅｎ
ｖＡＩＤｓ　　ＤＮＡ　　　　　　、’を細胞に導入し
てｅｎｖＡＩＤｓ蛋白質を産生さ　　　　　１せる。ｅ
ｎｖＡＩＤｓをコードするＤＮＡを得る１５＠ＩＣ，３
１ｍ’ｌａ＠＠’ｉＡｃｍｈＮ’）　、　ｅ　ｎ　Ｖ　
　　　　　。 ＡＩＤＳ７″″／　１１１ｉｉｄ　′Ｊ′Ｊ　ｆ　Ｄ　
−１−’　ｔ　８７１−“Ｊ　：ｒ　’）　７’　Ｊ−
。 キシヌク′オチドを合成する方法がある・ｅｎｖ　　　
　　　ｊ蛋白質はまだ単離されていないし、性質も明ら
か　　　　　１［ にされていないので、このアプローチを実行する　　　
　　：・ことはできない。 別法として、合成りＮＡに代えて天然材料からＩＸ　１
１ｔ　２″ｎｔ″ＤＮＡｅＪＴ１°゛４″・０２０８１
１１　　　！を用いて遺伝子−発現を得ることができる
。 発明の要約 本発明は、ＨＴＬＶ−１［１ｅｎｖ遺伝子を適当な発現
ベクターに処理し、このような発現ベクターで宿主生物
を形質転換し、この形質転換細胞。培養ニよってエンベ
ロープＡＩＤＳ蛋白質（ｅｎｖＡＩＤＳ）を製造するこ
とを目的とする。本発明の他の態様は、得られた組換え
ｅｎｖＡＩＤｓ蛋白質の単離および使用に関する。 本発明の他の態様はプロウィルスＤＮＡ配列の同定およ
び決定にある。さらに詳しくは、本発明のこの態様は、
ＡＩＤＳの病原と考えられているリンパ腹痛関連ウィル
ス（ＬＡＶＡ、ＡＩＤＳ関連レトロウィルス（ＡＲＶ）
およびヒトＴ［１Ｉ１１白血病／リンパ腫／向リンパウ
イルス■型（ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ）のエンベロープ遺伝子
のプロウィルスヌクレオチド配列の決定および比較に関
する。 本発明のさらに他の態様は、ｅｎｖＡＩＤｓ蛋白質に対
する抗体の存在をヒト血液で試験するこ、とによる診断
方法に関する。本発明のこの態様は、従来用いられてい
たＡＩＤＳの血液検査の問題点を解消するものである。 ひとつの問題は、ＡＩＤＳの病原のみから誘導されたの
ではない蛋白質またはペプチドを含む組成物をＡＩＤＳ
抗体との結合に使用していたことである。本発明の均一
なエンベロープＡＩＤＳ蛋白質を用いた組成物により、
従来の試験または検定における非特異性は消失する。さ
らに本発明の他の態様は、ヒト血液中の抗原の存在を検
出および／または定量する診断方法を提供する。 本発明のさらに他の態様は、本発明の ｅｎｖＡＩＤｓ蛋白質を抗原として使用し、ワクチンと
して投与することにより、ＡＩＤＳに対する保護免疫を
付与することである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＴＬＶ−ｍプロウィルスゲノム（ＨＸＢ−
３）のエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列である。 第２図は、ＡＩＤＳの予想される５種の病原のｅｎｖ蛋
白質のアミノ酸配列の比較である。アミノ酸配列はホモ
Ｏジーが最大になるように並べである。　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　−第３図は、ＤＥ
Ｖ／ｅｎｖ４４−６４０発現プラスミドの構築を示して
いる。左上部のパネルはｅｎｖコード領域（斜線矢印）
を含むＨＴＬＶ−■ゲノムの３．１５にｂ　　ＥｃｏＲ
Ｉ−ＸｈｏＩセグメントの単純化した制限部位地図を示
す。右上部のパネルはｐＥＶ−Ｖｒｆプラスミドの構造
と関連配列を示す。黒くぬりつぶした領域はＡＴＧ間始
コドン（上線）の上流の合成リポソーム結合部位配列を
示す。ｅｎｖ発現プラスミドの構築については、例２に
詳細に記載する。 第４図は、大腸菌内で産生じたｅｎｖコード抗原のウェ
スタン法による解析結果である。全ｌｌｌ菌蛋白質は５
Ｏ８−ＰＡＧＥにより分解し、ニトロセルロースフィル
ター上に電気吸着させ、ｅｎｖコード蛋白質を例５に記
載したようにヒト血清と反応させて検出した。ａ）陰性
コントロール、４２℃で２時間誘導したｐＪＣＬ−Ｅ３
０　（ｐ２１Ｔ）含有細胞；ｂ）非誘導コントロール、
３０℃に保持されたｐＥ、Ｖ３／ｅｎｖ４４−６４０含
有細胞：ｃ）Ｄ　Ｅ　Ｖ　３　／　ｅ　ｎ　ｖ　４４−
６４０　：　ｄ）ｐＥ　Ｖ　１　／ｅｎｖ４４−６４０
　；およびｅ）４２℃で２時間誘導したｐＥＶ３／ｅｎ
ｖ２０５−６４０゜第５図は、細菌合成ＨＴＬＶ−１［
１ｅｎｖ遺伝子産生物のＡＩＤＳ患者血清中抗体による
認識を例示する。組換えｅｎｖ蛋白質を含む細菌溶解物
を　　　　　゛例５に記載したようにウェスタン吸着解
析法に付　　　　にした。ついで、各ストリップを１０
００倍希釈各　　　　１血清とインキュベートし、続い
て　　Ｉ−標識プロチインＡで処理した。上図二血清サ
ンプルは以下の対象から採取した。レーン１；正常、健
康者、レーン２〜１８：米国西海岸で収集したＡＩＤＳ
　　　　　：患者血清。下図：［Ｉｈ清サンプルは以下
の対象から採取した。レーン１：破壊ウィルスを用いた
ＥＬＩＳＡでＨＴＬＶ−１（＋）とされた対象、レーン
４．５．１１および１５：健康、正常者、レーン２．３
．６．８．１０．１２．１３，１４．　　　　　′１６
．１７および１８；米国東海岸で収集したＡＩＤＳ患者
血清。 第６Ａ図は、ＡＩＤＳエンベロープ蛋白質のアミノ酸配
列である。 第６Ｂ図は、ＡＩＤＳエンベロープ蛋白質のアノ酸分布
である。 第７図は、発現ベクターｐＲＣ２３の構築を示す。シャ
インーダルガルノ配列（ＳＤ）には上に線を付し、プラ
スミド内の合成リポソーム結合部位配列の位置は黒くぬ
りつぶしたセグメントとして表示した。このプラスミド
はｐＢＲ３２２の全配列を含有し、したがってアンピシ
リン（ａｍｐ　　）およびテトラサイクリン（ｔｅｔ■
）の両者に対し抵抗性を示す。 第８図は、ｐＥＶ−ｖｒｆベクターの構築を示す。ｐＲ
Ｃ２３中ＳＤ配列の下流に位置させた各プラスミドにつ
いての合成オリゴヌクレオチドは制限酵素部位の位置で
示す。ＡＴＧｒＭ始コドンには上線で、付加的Ａ−Ｔ塩
基対の位置は長方形によって示した。このプラスミドは
アンピシリンにのみ抵抗性を示す。 １里ぷｌＩＬ螢呈Ａ 本明細書に用いられる語について以下に説明する。 ヌクレオチド：糖残基（ペントース）、リン酸および、
プリンもしくはピリミジン塩基（窒素異項環）のいずれ
かからなるＤＮＡの単ｍ体単位。 塩基はグリコシド炭素（ペントースの１！炭素）を介し
て糖残基と結合する。この塩基と糖の結合物はヌクレオ
シドと呼ばれる。各ヌクレオチドの性質はその塩基によ
って決まる。４種のＤＮＡ塩基、アデニン（Ａ）、グア
ニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）よびチミン（Ｔ）がある。 ＤＮＡ配列：ＩＩｊｌ接するペントースの３′および５
′炭素の間のホスホジエステル結合によって互いに結合
したヌクレオチドの直線行列。 ”Ｅ２：　３個のヌクレオチドのＤＮＡ配列（トリプレ
ット）で、ｍＲＮＡを介して、アミノ酸、翻訳開始シグ
ナルまたは翻訳停止シグナルをコードする。たとえば、
ヌクレオチドトリブレットＴＴＡ　、　ＴＴＧ　、　Ｃ
ＴＴ　、　ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸のロ
イシン（Ｌｅｕ）をコードする。ＴＡＧ　。 ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止シグナル、ＡＴＧ　’は
翻訳開始シグナルである。 Ｉ九１旦丑：ｍＲＮＡのアミノ酸配列への翻訳時のコド
ンのグループ化。翻訳時は正しい読み取り枠が維持され
なければならない。たとえば、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴ
ＡＡＧは３種の読み取り枠または相で翻訳されることが
できて、それぞれ次のアミノ酸配列が得られる。 ＧＣＴ　　ＧＴＧ　　ＴＧＴ　　但匹−＝　Ａｌａ−Ｇ
ｌｖ−ＧＩＶ−ＬｖｓＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　ＧＴ
Ａ　　ＡＧ＝Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａｌＧＣＴＧＴ　　Ｔ
ＴＧ　　ＴＡＡ　　Ｇ　＝　ＴｒＤ−Ｌｅｕ−（停止）
Ｍ　！Ｊ　Ｋ　７　ｆ上：隣接したアミノ酸のα−アミ
ン基とカルボキシ基の間のベブヂド結合により互いに結
合したアミノ酸の直線行列 ２：細胞またはウィルスの全ＤＮＡ、オペレーター、ブ
ロモーターおよびリポソーム結合、相互作用配列、たと
えばシャインーダルガルノ配列のほか、とくにその物質
のポリペプチドをコードする構造遺伝子を包含する。 構造遺伝子：鋳型またはメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）を介して、特異的なポリペプチドのアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ配列 監亙：構造遺伝子からもｍＲＮＡを産生ずろ過Ｗｉｌｌ
：ｍＲＮＡからポリペプチドを産生ずる過程 発現：構造遺伝子によって行われるポリペプチド産生過
程。転写と翻訳の粗合せである。 プラスミド：宿主染色体の一部ではなく、特定の抗生物
質に対する抵抗性を運ぶ遺伝子を含む環状二重！１ＤＮ
Ａ分子。プラスミドを単細胞生物内に置くと、そのプラ
スミドのＤＮＡの結果として、生物体の特徴が変化また
は形質転換される。たとえば、テトラサイクリン抵抗性
（ＴｅｔＲ）遺伝子をもつプラスミドは、テトラサイク
リン感受性であった細胞を抵抗性に形質転換する。プラ
スミドによって形質転換された細胞を形質転換体という
。 クローン化ビークル：宿主細胞内で複製可能なプラスミ
ド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって、１
個ないし少数個のエンドヌクレアーゼ認識部位によって
特徴づけられる。このようなりＮＡ配列はこの認識部位
で、そのＤＮＡの必須な生物学的機能、たとえば複製、
被覆蛋白質の生成またはブロモーターもしくは結合部位
の喪失等を伴わない、確定可能な様式で切断できる。そ
して、形質転換細胞の同定に使用するのに適当なマーカ
ーたとえばテトラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性
を含有する。クローン化ビークルはベクターと呼ばれる
ことが多い。 クローン化：１種の生物体またはＤＮＡ配列から無性再
生によって生物体またはＤＮＡ配列の集団を得る過程 組換えＤＮＡ分子またはハイグリコ°ＤＮＡ　：別個の
ゲノムからのＤＮＡセグメントを生細胞外でその末端と
末端を結合させてなる分子で、ある宿主細胞に感染し、
維持される能力を有する。 ペプチドまたは蛋白質を定義するのに用いられた表現法
は慣用の、Ｎ末端のアミノ基を左に、Ｃ末端のカルボキ
シ基を右に示す方法である。天然アミノ酸の語は、天然
蛋白質中に通常存在するアミノ酸、ｃｒｙ　、＾Ｉａ　
、　Ｖａｌ　、　Ｌｅｕ　、　Ｉｌｅ　、　Ｓｅｒ　。 Ｔｈｒ　、　Ｌｙｓ　、　Ａｒｇ　、　Ａｓｐ　、　Ａ
ｓｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｇｌｎ　。 Ｃｙｓ　、　Ｎｅｔ　、　Ｐｈｅ　、　Ｔｙｒ　、　Ｐ
ｒｏ　、　Ｔｒｐおよび旧Ｓのうちの１種である。Ｎｌ
ｅはノルロイシンを、Ｎｖａはノルバリンを意味する。 Ｌ型とＤ型が可能であるが、他にとくに指示がないとき
はＬ型のアミノ酸を示す。また、アミノ酸は特定のアル
ファベット１文字で表した場合もある。すなわち、Ａ＝
アラニン、Ｂ＝アスパラギン酸もしくはアスパラギン、
Ｃ＝システィン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン
酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝ニブリシンＨ＝ヒスチ
ジン、１＝イソロイシン、Ｋ−リジン、し＝ロイシン、
Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝ブＯリン、Ｑ
＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、■＝スレ
オニン、■＝バリン、Ｗ＝ニトリブトファンＹ＝チＯシ
ン、Ｚ＝グルタミンもしくはグルタミン酸である。 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のエンベ
ロープ蛋白質の研究により、ＡＩＤＳウィルスのプロウ
ィルス遺伝子の単一および配列決定が行われたものであ
る・すなわち・本発明は・　　　　　１ＡＩＤＳの病原
と考えられてきたリンパ腹痛関連ウィルス（ＬＡＶ）　
、Ａ　ＩＤＳ関連レトしウィルス（ＡＲＶ＞およびヒト
Ｔｉ１ｌ胞白血病／リンパ腫／向リンパ性ウイルス（Ｈ
ＴＬＶ−１）が同じウィルスの変異株であることをはじ
めて明らかにした。本発明の目的において本明細書中で
は、ＡＩＤＳを起こすウィルスをＡＩＤＳウィルスと呼
ぶ。ＡＩＤＳウィルスとは、ＡＩＤＳの病原として考え
られてきた変異株、すなわちＬＡＶ。 ＡＲＶおよびＨＴＬＶ−ＩＩを包含するものである。 ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質（ｅｎＶＡＩＤ
Ｓ）は９７．２００ダルトンの蛋白質で、Ｎ−グリコジ
ル化部位の可能性が考えられる３２個の部位を有する。 ＡＩＤＳの病原としての可能性が考えられるＡＩＤＳエ
ンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列解析により、この
すべてのウィルスは同じウィルスの変異株であることが
明らかに。 された。これは、ＨＴＬＶ−１のエンベロープ遺伝子の
配列と、他のウィルスＬＡＶおよびＡＲＶ−２のエンベ
ロープ遺伝子の配列との間には約１〜２０％の分岐また
は変異がみられることを意味する。ｅｎｖＡＩＤｓのア
ミノ酸配列を第６Ａ図に示す。アミノ酸分布を第６Ｂ図
に示す。 エンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列を第１図に示す
。プロウィルスＤＮＡ配列は、本技術分野の通常の熟練
者によく知られた方法たとえばマキサムとギルバート（
Ｈａｘａｍ　＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ　）の化学的分解方法
まはたサンガー（５ａｎｏｅｒ）のジデオキシヌクレオ
チド鎖末端分析法を改良したメシング（Ｈｅｓｓｉｎｏ
　）のＭ１３配列決定システムを用いて　　　　”解析
し、エンベロープ蛋白質をコードする領域の位置を決定
した。エンベロープ遺伝子の読み取り枠の位置は、翻訳
停止コドンによって中断されずトリプレットコドンが長
く続く位置によって決定した。ｅｎｖ遺伝子をコードす
る読み取り枠は８６３個のアミノ酸に相当し、その読み
取り枠の５′末端から８０番目の位置にＡＴＧコドンが
含有される。ＡＴＧコドンは共通の翻訳開始コドンとし
て知られている。 組込まれたＨＴＬＶ−ＩＩＩプロウィルス遺伝子を、Ｈ
ＴＬＶ−ＩＩＩ感染Ｈ９細胞のゲノムＤＮＡからクロー
ン化した（シＥ　−（Ｓｈａｗ、　Ｇ、Ｈ，）　ホか：
モルキュラー・キャラクタリゼーション・オブ・ヒユー
マン・ティー−セル・ロイケミア（リンホトロビック）
ウィルス・タイプ・スリー・イン・ジ・アクアイアート
・イミューン・デフイシエンシイー〇シンドローム（Ｈ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｈｕｍａｎ　■−ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｉｍｉａ　
（Ｉｖｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）Ｖｉｒｕｓ　ｔｌ／Ｄｅ
ｌｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ
　ｄｅ−ｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　）　、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）、２２６．１１６５〜
１１７１．（１９８４））。 ＨＴＬＶ−Ｉ［１７０ウイルスはＸｂａＩ制限部位を欠
くことが明らかにされているので、ゲノムライブラリー
はＸｂａＩ消化Ｈ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩＤＮＡを用いて
構築した。ＡＩＤＳｅｎＶ蛋白質ｃＤＮＡを含有する細
菌クローンのスクリーニングには、本技術分野の通常の
熟練者に利用可能な数種の方法がある。たとえば、ＲＮ
Ａ選択ハイブリダイゼーション、合成プローブとの分別
ハイブリダイゼーションまたは所望の蛋白質を産生ずる
クローンの免疫学的もしくは生物学的検定によるスクリ
ーニングがある。ゲノムライブラリーから、ＨＴＬＶ−
［［［配列を含むＤＮＡで形質転換された細胞のコロニ
ーを、このライブラリーとＨＴＬＶ−ｍ　　ｃＤＮＡと
のハイブリダイゼーションスクリーニングによって選択
した。ハイブリダイゼーション陽性クローンのＤＮＡ挿
入体、ＨＸＢ−３をプラスミドＤＮＡから切り取り、配
列を決定した。 ｅｎｖ遺伝子の予期された生成物は、多くの特徴で、他
のレトロウィルスのエンベロープ遺伝子生成物と共通し
ていた。たとえば、疎水性領域は、プレカーサー蛋白質
を切断し外部の膜透過蛋白質に処理する部位を含む蛋白
質の中央（アミノ酸５１９〜５３４）に認められる。同
様に、アミノ末端は短い一連の疎水性アミノ酸（アミノ
ｗｉ１７〜３７）を含み、これはシグナル配列を構成す
ると考えられる。ＨＴＬＶ−１エンベローププレカーサ
ーは、カルボキシ末端にさらに１８０個のアミノ酸から
なるストレッチを有する点で、他のレトロウィルスエン
ベロープ蛋白質のプレカーサーと異なっている。 ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ領域内での多形現象 ＬＡＶ、ＡＲＶ−２およびトＩＴＬＶ−ｎｌのヌクレオ
チド配列についての最近の報告（ラットナ−（Ｒａｔｎ
ｅｒ、　Ｌ、）ほか、前出；サンチェーベスカドン（５
ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｎ、　Ｒ，）ほか、前出
；ウエインーホブソン（Ｍａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　、　
Ｓ、）ほか：前出〕により、世界の様々な地域からのＡ
ＩＤＳ患者から得られた各種単離物の詳細な比較が可能
になった。ＨＴＬＶ−ＩＩＩクローンは、米国東海岸で
得られたＡＩＤＳ患者リンパ球から単離され、一方ＬＡ
Ｖはフランス人から、ＡＲＶはカリホルニア州の患者か
ら単離された。配列データの比較で、以前の制限酵素部
位解析を用いて明らかにされた観察、約１０％の変異が
確認される。この解析により、各種単離体は最大の保持
をＣ］ａＱおよびｐｏｔ領域に示し、最大の分岐はｅｎ
ｖＷ４域で起こることが示される。５種のｅｎｖ配列の
比較を第２図に示した。エンベローブ遺伝子に関しては
、ＨＴＬＶ−Ｉ［［としＡＶは互いに、ＡＲＶクローン
とよりもよく類似している。ｌ−Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ
［［（ＨＸＢ−３）とＬＡＶ配列の間の分岐は約１．６
％であった。ＨＴＬＶ配列中、分岐は約１．６％であっ
た。しかしながら、ＨＴＬＶ−ＩｌｌとＡＲＶ−２の間
には約１７％の分岐が観察され、　　　　□これはエン
ベロープ遺伝子生成物の細胞外領域においてより顕著で
あった（第２図）。この高い分岐率は、２種の単離体の
由来する地域や、これら　　　　　：の変異株の単離時
期によるものとも思われる。 ＡＲＶ−２は米国西海岸で最近単離されたが、ヌクレオ
チド配列が決定されたＨＴＬＶ−１［１単離体はすべて
米国東海岸から１年前に得られたもので　　　　　：あ
る。ＬＡＶはほぼ同じころ、ニューヨークでこのウィル
スに感染したと思われるフランス人患者から得られた。 配列中に認められた差は、ある時期ある場所で分離され
た株の分岐進化を反映する可能性もある。ｅｎｖ領域内
では、蛋白質の細胞外部分に高レベルの分岐が存在する
。 発現ベクター 二重鎖ＤＮＡのクローニングには、様々の宿主／クロー
ニングビークルの組合せが採用できる。 たとえば・有用なりローニングビークルは染色体性、非
染色体性および合成りＮＡ配列であって、その例として
は、大腸菌からのプラスミドｐＢＲ３２２のような各種
の公知の細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、ファージ
ＤＮＡの使用を改良したプラスミドのようなプラスミド
とファージＤＮＡの組合せに由来するベクターもしくは
他の発現制御配列、または酵母プラスミドがある。有用
な宿主としては、微生物、哺乳類動物細胞、植物細胞等
が挙げられる。とくに、微生物と哺乳類動物細胞の使用
が好ましい。好ましい微生物には、酵母、細菌たとえば
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）　、バチル
ス・ステアロテルモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔ
ｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐｈ＋ｕｓ　＞および放線菌（
ＡＣｔｉｎＯｍＶＣｅＳ　）がある。上述のベクターお
よび宿主は、本発明におけるような、生物学的に得られ
た遺伝子からの蛋白質の製造にも使用することができる
。もちろん、すべての宿主／ベクターの組合せが同等に
有効とは限らない。特定の宿主／クローニングビークル
の組合せの選択は、本技術分野の熟練者により本発明の
節回から逸脱することなく、提示された原理を考慮して
行われるものである。 さらに、特定のクローニングビークルそれぞれについて
、二重鎖ＤＮＡ挿入部位は多数の部位の中から選択でき
る。これらの部位は通常、それを切断する制限エンドヌ
クレアーゼによって命名される。たとえば、ｐＢＲ３２
２中のＥＣｏＲｌ部位はアンビ′シリン抵抗性をコード
する遺伝子のすぐ外側に存在する。各種の部位がその組
換え合成計画に応じて利用される。数種の部位は本技術
分野の熟練者によってとくによく認識されている。 もちろん、本発明に有用なりローニングビークルは、選
択されたＤＮＡフラグメントを挿入する制限エンドヌク
レアーゼ部位をもっている必要はない。別法により、ビ
ークルをフラグメントに結合させることも可能である。 ベクターもしくはクローニングビークル、および選択さ
れたＤＮＡフラグメントを結合させ組換えＤＮＡ分子を
形成させるためにとくにビークル中に選ばれる部位は、
様々な因子、たとえば特定の制限酵素で切断される可能
性がある部位の数、発現される蛋白質の大きさ、宿主細
胞酵素による蛋白分解に対する所望の蛋白質の安定性、
精製過程での分離が困難な宿主細胞発現蛋白質の夾雑、
発現特性たとえばベクター配列に対する開始および停止
コドンの位置、その池水技術分野の熟練者によってよく
知られている因子によって決定される。特定の遺伝子に
ついてのベクターおよび挿入部位の選択は、すべての選
択条件が特定の場合に同等に有効とは限らないので、上
述の因子のバランスによって決定される。 ＤＮＡをクローニングビークルに挿入して組換えＤＮＡ
分子を形成させる方法としては数種の方法が公知であり
、これらはいずれも同様に本発明に有用である。これら
の方法としては、たとえば、直接リゲーション、合成リ
ンカ−、エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼ−結合
修復反応ついでリゲーション、またはＤＮＡポリメラー
ゼと適当な一重鎖詩型でのＤＮＡ鎖の延長ついでリゲー
ションがある。 もちろん、クローニングビークルの選ばれた位置に挿入
されたＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列が、所望
のポリペプチド／蛋白質の実際の　　　　□構造遺伝子
の部分ではないヌクレオチドを包含しでもよいし、また
所望の蛋白質の完全な構造遺伝子のフラグメントのみを
包含してもよいことは当然である。必要なことは、どの
ようなりＮＡ配列が挿入されたとしても、形質転換され
た宿主がＡＩＤＳｅｎｖ蛋白質に対して免疫学的活性を
有する蛋白質／ペプチドを産生ずるか、あるいはＤＮＡ
配列自体がＡＩＤＳｅｎｖ蛋白質に対して免疫学的活性
を有するポリペプチド／蛋白質の産生に有用なりＮＡ配
列を含有するクローンを選択するためのハイブリダイゼ
ーションプローブとし　　　　６て使用できることであ
る。　　　　　　　　　　　　　　−′５″“％”ｌ１
ｍＰ’ｅ：＊＠ｔ６’ｙＤ−＝＞’ｊｅ”ｙ）Ｉｔ　　
　。 も′−＜′″Ｌ″−″ター４用０゛１宿主を形質転換５
・宿　　　　［主にそのハイブリッドＤＮＡがコードす
る蛋白質　　　　！；− またはその一部を発現させる。適当な宿主の選択は、本
技術分野で知られている多くの因子によっても制御され
る。たとえば、選ばれたベクターとの適合性、ハイブリ
ッドプラスミドによってコードされる蛋白質の毒性、所
望の蛋白質の回収の難易、発現特性、生物学的安全性、
経済性等である。 特定の組換えＤＮＡ分子の発現についてすべての宿主が
同等に有効ではないことを理解し、これらの因子のバラ
ンスを考慮する必要がある。 本発明の好ましい態様においては、可転性のｐｔ＝ｖ−
ｖｒｔ’　（可変読み取り枠）発現プラスミド（構築の
詳細は例２参照）にクローン化されたブＯウィルスゲノ
ムから単離された制限フラグメントを挿入することによ
り、ＡＩＤＳｅｎｖ蛋白質のセグメントを大腸菌に発現
させる。これらの可転性ｐＥＶ−ｖｒｆプラスミドはｐ
ＢＲ３２２の誘導体で、ラムダＰ、ブ０モーター、合成
的に誘導されたリポソーム結合部位、および開始コドン
のすぐ下流に便利なりローニング部位（ＥｃｏＲ１，Ｂ
ａｍＨＩ、Ｃｌ　ａ　Ｉおよび１−１ｉｎｄｌｌ［＞を
含有する（第８図）。３種のプラスミドのセットは、す
べての３種の翻訓誌み取り枠を収容するように構築され
た。Ｐ、ブロモーターは、適合性プラスミドｐＲＫ２４
Ｂｃ　Ｉ　ｔｓ上にコードされた温度感受性ＣＩリプレ
ッサーによって調節される〔＾ＴＣＣ３３７６６：ベル
ナルドほか（Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｈ，ｔｌ、　＆　Ｈｅ１
ｉｎｓｋｉ　、　［１，Ｒ，）　；ザ・ユース・オプ・
ザ・ラムダ・ファージ・プロモータ、−Ｐ　　・トウー
・プロモート・ジーン・エクスプし レツション・イン・ハイブリッド・プラスミド・クロー
ニングψビークルズ（Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　
　λｐｈａｏｅ　Ｉ）ｒｏＩｌｏｔｏｒ　ＰＬｔｏ　Ｉ
）ｒｏｌｏｔｅ　ＱｅｎＱ　ｅＸＤｒｅｓｓｉｏｎｉｎ
　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖ
ｅｈｉｃｌｅｓ　）　、メソツズ・オブ・エンザイモ０
ジー（Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）６８．４８２
〜４９２　（１９７９））。これらの発現プラスミドは
ｖ−ｂａｓｐ２１（レイカル（Ｌａｃａｌ、　Ｊ、Ｃ，
）ほか：エクスプレツション・オブ・ノーマルφアンド
・トランスホーミング・Ｈ−ラス・ジーンズ・イン・イ
ー・コリ・アンド・ピュアリフイケーション・オブ・ゼ
ア・エンコープイツト・ビー２トプロテインズ（Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｎｏｆ’１ｌｌａｌ　ａｎｄ　ｔ
ｒａｎｓｆｏｒｌｌｉｎＱ　１ｔ−ｒａｓ　ｑｅｔｔｅ
ｓ　ｉｎＥ、　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｅｎｃｏｄｅｄ＋）２１　
ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）　、ビーエヌエーエ、ス（ＰＮＡ
Ｓ）、８１．５３０５〜５３０９（１９８４））やネズ
ミ・インターロイキン−１（Ｏメゾイー１　（Ｌｏｍｅ
ｄｉｃｏ、　Ｐ、Ｔ、）はか；り〇−ニング・アンド・
エクスプレッション・オブ・ミュリン・インターロイキ
ン−１ｃＤＮＡφイン・イー−Ｄす（Ｃｌｏｎｉｎｇ　
ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｌｕｒｉｎｅ　１
ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｃｌ）ｔ４Ａ　ｉｎ　Ｅ、　
ｃｏｌｉ）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１２
．４５８〜４６２　（１９８４））を含めて数種の異種
蛋白質の大腸菌内産生に使用されてきた。 本合成において好ましい初期クローニングビークルは細
菌性プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴｃｃ３７０１７）で
あり、その好ましい初期制限エンドヌクレアーゼ部位は
ＥＣ０ＲＩおよびＨｉｎｄ■部位である（第３図）。Ｈ
９細胞のゲノム内に含まれるプロウィルスＤＮＡのこれ
らの部位への挿入は、それぞれＨ９［１胞のゲノム中に
存在するプロウィルスＤＮＡまたはそのフラグメントの
ひとつを含む多数の細菌クローンを与える。これらのク
ローンのごくわずかがｅｎｖＡＩＤｓまたはそのフラグ
メントに対する遺伝子を含有する。 本発明におけるｅｎＶＡＩＤｓ遺伝子の初期クローニン
グおよび発現に好ましい宿主は、大腸菌ＭＧ１０６１で
ある〔カサダバンほか（Ｃａ５ａ−ｄａｂａｎ、Ｈ，Ｊ
、　＆　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｈ，）　：アナリシス・オブ
・ジーン・コントロール・シグナルズ・パイ・ディーエ
ヌエー・フュージョン・アンド・クローニングΦインφ
ニー−］す（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｃｏｎ
ｔｒｏｌ　ｓｉｇｎａｌｓ　　ｂｙ　ＤＮＡ　ｆｕｓｉ
ｏｎ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇＥ、　ｃｏｌｉ　）　、
ジャーナル・オブ・メディカル・バイオロジー（Ｊ、　
Ｈｅｄ、　Ｂｉｏｌ、　）　、１３８．１７９〜２０７
　（１９８０））。 ｅｎｖ蛋白質のアミノ酸残基＃４４〜６４０をコードす
る配列は、第３図に示すように、ＫＤｎ　ＩおよびＨｉ
　ｎｃｉｍ部位の間、Ｐ、７ｏ−Ｅ−ターの下流に位置
する。これらの便利な制限部位の存在のほかに、これら
の配列はカルボキシル末端に疎水性膜透過セグメントを
含まないのみでなく、アミノ末端シグナルペプチドも含
まないため、細菌での発現実験に選択された。これらの
配列は、細菌細胞内に疎水性蛋白質が過剰産生されたと
きに起こる可能性がある毒性の問題を回避するために除
外された。本発明の好ましい態様においては、発現プラ
スミドは、ｅｎｖ遺伝子生成物のこのセグメント（ｐＥ
■／ｅｎ■４４〜６４０）の合成に向けられるように構
築された。中間構築ではまず、ｐＥＶ−ｖｒ　ｆプラス
ミドのＥｃｏＲＩおよび１（ｉｎｄｌ１１部位の間に２
４００ｂＤのＥｃｏＲＩ　−Ｈｉ　ｎｄｎ［フラグメン
トを挿入することによって行われた。次に、ＥＣＯＲＩ
とＫｐｎ１部位の間のＨＴＬＶ−ＩＩ配列（６００，ｂ
ｐ）を第３図に示すように中面構築から除去した。これ
らのプラスミド構築は３種のずべてのｐＥＶ−ｖｒｆプ
ラスミドについて行い、次に欠失を行い、正しい読み取
り枠を維持できるようにした。さらに、正しくない読み
取り枠で行われた構築が、以下に述べる発現実現に重要
なコントロールとして役立った。 本発明の他の態様においては、第２のセットの発現プラ
スミドを、ｅｎｖ遺伝子の４８３　ｂＤ上下流あるｌ：
ｃｏＲｌとＳｔｕ　１部位の間の配列を欠失させること
により同様に構築した。この場合も、欠失（ｐＥＶ／ｅ
ｎｖ２０５〜６４０）は３種のすべての読み取り枠で実
施した。すべてのｅｎｖ発現プラスミドで用いられた翻
訳停止コドンは、プラスミド中のＨｉｎｄｌｌ［部位の
２３ｂｐ下流に位置するインフレームＴＡＡと思われる
。したがっで、カルボキシル末端における８個のアミノ
酸残基は、Ｅ）ＥＶ−ｖｒｆ発現プラスミド内に含まれ
るｐＢＲ３２２配列によってコードされる。 ｅｎｖＡＩＤｓの発現 ｅｎｖＡＩＤｓ　　ｃＤＮＡを含む細菌のスクリーニン
グには数種のアプローチがある。たとえば、ＲＮＡ選択
ハイブリダイゼーション、分別ハイブリダイゼーション
、合成プローブとのハイブリダイゼーション、および免
疫学的または生物学的検定による所望蛋白質産生りＯ−
ンのスクリーニングがある。免疫学的検定を用いるスク
リーニング法としては次の２種、すなわち、細菌コロニ
ーについて抗体を用い蛋白質の存在をスクリーニングす
る方法と、好ましくは、細菌溶解物を電気泳動に付し、
ニドＯセルＯ−スろ紙上に吸着させついで抗体で調べる
方法がある。 本発明の好ましい態様においては、ｐＲＫ２４Ｂ−ｃＩ
ｔｓおよびｃ）ＥＶｌ、２または３／ｅｎｖ４４〜６４
０　（またはｐＥＶｌ、２または３／ｅｎｖ２０５〜６
４０）で形質転換した大腸菌株ＭＣ１０６１をＭ９メジ
ウム中、３０℃で、対数期中期まで培養、生育させ、つ
いで２時間４２℃に移して誘導した。細菌培養液のサン
プルを取り、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に付し、ついでウェスタン法によってｅｎｖ蛋白質を検
出した。吸着蛋白質を、免疫処置ウサギま、　　　　　
たは以前にＡＩＤＳ抗原に対する高力価抗体を含有する
ことが示されたＡＩＤＳ患者のいずれかから単離された
ｅｎｖＡＩＤｓ蛋白質に対する抗血清で処理した。これ
をついで　　ｌ−標識黄色ブ　　　　　□１ドウ球菌（
５ｔａＤｔｌＶＩＯＣＯＣＣＯｔｌＳ　ａｔｌｒｅｔｌ
ｓ）プロティン　　　　　□Ａとインキュベートし、洗
浄し、オートラジオグラフィーに付した。同様の結果が
いずれの血清についても得られたが、ヒト血清は抗ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩ　　　　　　：抗体のはるかに高い力価を
示し、大腸菌蛋白質とのすべてのバックグラウンド反応
を欠くことが明　　　　　言らかにされた。この理由か
ら、以下のすべての特　　　　　′性検討にはヒト抗体
を使用した。 第４図は、細菌内で合成されたｅｎｖＡＩＤｓ　　　　
　・蛋白質（組換え蛋白質）と抗ＨＴＬＶ−１１抗体と
　　　　　′の反応性のパターンを示す。ｐＥＶ３／ｅ
ｎＶ４４〜６４０中の読み取り枠は、ゲル上６８　Ｋｄ
パン　　　　−ドとして移動するはずの蛋白質をコード
する。事実、ｐＥＶ３／ｅｎｖ４４〜６４０を含む誘導
＄１：胞に相当するレーンに６８にｄバンドが観察され
る（レーンＣ）。しかしながら、６８にｄバンドに加え
て、これらのｌ１ｌｌｌｌは特異的に抗ＨＴＬＶ−ＤＩ
抗　　　　□体と交差反応する３５にｄ、２５にｄおよ
び１７にｄの　　　　゛蛋白質を合成した。非誘導コン
トロール（レーンｂ）またはｖ　−ｂ　ａ　ｓ　　ｐ２
１　Ｉｆ！瘍遺伝子生成物の合成を指示するプラスミド
を含む誘導細胞（ラヵ／Ｌ／　（Ｌａｃａｌ、Ｊ、Ｃ，
）ほか、前出〕の第２（７）対１”１ンプル（レーンａ
）にはＨＴＬＶ−ＩＩＩと交差反応するバンドは認めら
れない、ｅｎｖ３ｇ伝子配列から合成される多数のバン
ドの出現は予期されない結果であった。もうひとつ予期
されない結果、Ｐ、ブロモーターのすぐ下流の開始コド
ンに関し誤った読み取り枠で挿入体が置かれたプラスミ
ド（ｐＥＶ１／ｅｎｖ４４〜６４０）からのｅｎｖ遺伝
子生成物の合成であった（レーンｄ）。この場合、プラ
スミドＤＥＶ１／ｅｎＶ４４〜４６０を含む大腸菌細胞
は、３５Ｋｄ、２５にｄおよび１７Ｋｄ蛋白質に加えて
６３Ｋｄ蛋白質を合成した。これらの結果はエンベロー
プ遺伝子のヌクレオチド配列（第１図）を検討すると容
易に説明できた。 ＫＥ）ｎ　Ｉ部位の下流の約１５５の塩基はＡＴＧコド
ンで、発現プラスミドＤＥＶ１／ｅｎｖ４４〜６４０に
よりｅｎｖ遺伝子生成物の合成に用いられると考えられ
た。内部翻訳開始も３５Ｋｄ、２５にｄおよび１７Ｋｄ
蛋白質の出現について可能性の高い説明である。いわゆ
るシャインーダルガルノ配列（ＡＧＧＡ　）が先行する
開始コドンはｅ　ｎ　ｖコード領域内の観察された蛋白
質生成物の部位に一致する位置に認められる。 上述の解釈を確認し、小さな蛋白質が早期停止の結果と
してまたは大きな蛋白質の蛋白分解により形成されたも
のである可能性を排除するために、Ｋｐｎｌと３ｔｕ　
１部位の間の配列が欠失した他の欠失変異株を構築した
。この発現プラスミドは４（ｌｄの蛋白質をコードでき
るアミノ酸位置２０５〜６４０からのコード配列を含有
する。このプラスミドを含む大腸菌から誘導された蛋白
質の分析により、実際、これらの細胞が３５Ｋｄ。 ２５にｄおよび１７にｄ蛋白質のほかに４９にｄ蛋白質
を合成することが確証された（レーンｅ、第４図）。こ
れらの結果から、ｐＥＶ３／ｅｎｖ４４〜６４０発現プ
ラスミドは、ｅｎｖ遺伝子内の内部翻訳開始から生じる
すべてのｅｎｖ発現プラスミドより産生ずる数種の付加
的小ポリペプチド（すなわち、３５にｄ１２５にｄおよ
び１７Ｋｄ）に加えて６８にｄ蛋白質の合成を指示する
ものと結論された。 ＩＤＳ血°のスフ１−ニン 抗ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体は９０％以上のＡＩＤＳ患者に
認められることから、細菌で合成されたｅｎｖ遺伝子生
成物が、これらの抗体の検出に診断的ツールとして使用
できるかどうかに興味がもたれた。この解析のために、
誘導細菌培養物からの全細胞蛋白質をＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ
　Ａ　、Ｇ　Ｅによって分別し、ウェスタン法でニトロ
セルロースろ紙に移した。移動蛋白質を含むろ紙のスト
リップを１０００倍希釈ヒト而清と反応させ、生成した
抗原−抗体複合物を　　Ｉ−標識黄色ブドウ球菌プロテ
ィンへとのストリップのインキュベーション、ついでオ
ートラジオグラフィーにより検出した。使用した血清が
ＡＩＤＳ症候群患者からのものの場合には、６８にｄ１
３５にｄ、２５Ｋｄおよび１７にｄ蛋白質に対する抗体
の反応に相当する顕著なバンドが常に観察された。異な
るヒト血清についてのこのような検定の結果を第５表に
示す。使用した陰性対照は正常なヒト血清および）−Ｉ
ＴＬＶ−１感染患者からの血清であった。健康人または
ＨＴＬＶ−■感染患者からの血清では反応は認められな
かった。患者の血清はカリフォルニアを含めた米国の全
領域から収集したが、試験した限りの全ＡＩＤＳ患者の
血清は陽性であった。この結果は、これらの抗体が主と
て、分子の蛋白質骨格に対して向けられていることを示
唆している。 したがって、ｅｎｖ遺伝子生成物は、ＡＩＤＳ関連抗体
の検出にｍ善の診断試薬を構成すると考えられる。本発
明のｅｎｖ遺伝子生成物はその蛋白質の大部分を包含し
、分子の保持、分岐画部分を含有する。ＨＴＬＶ−１と
ＡＲＶ−２配列の間に認められる分岐にもかかわらず、
細菌によって合成された本発明の組換えｅｎｖ蛋白質は
米国のいずれの地域からの患者の血清とも反応する。試
験したＡＩＤＳ患者の血清（５０例のザンブル、米国東
海岸から２５例とカリフォルニアから２５例）の１００
％が高い反応性を示した。これは、免疫系が抗体反応を
準備できる保持エピトープが分子内に存在することを強
く支持する。すなわち、ヒト免疫系は、ＡＩＤＳ患者血
清の反応性によって示唆されるように、エンベロー１分
子の保持エピトープに対する免疫応答を装備しているも
のと考えられる。ＨＴＬＶ−ＩＩＩの各種単離体の間に
認められた分岐は、組換え蛋白質のワクチンとしての使
用に問題を提起することはない。６８にｄ蛋白質は、遺
伝子生成物の大部分を包含し、細胞外疎水性領域とｓｎ
ｔ＋連疎水連鎖水性領域を含む独特の構造的特徴をもつ
ことから、このような目的には理想的である。この構造
的特徴により、これは、他のウィルスエンベロープ蛋白
質に対する予防免疫処置のためにビークルとして使用さ
れてきたリポソームへの封入に適する。 これらの発見に基づき、ＡＩＤＳに関する血液のスクリ
ーニングの実行に、ＡＩＤＳエンベロープ蛋白質または
この蛋白質の変異株のみを使用することを提唱する。本
発明のｅｎＶＡＩＤｓ蛋白質を利用して、ヒト血液につ
いてＡＩＤＳウィルスに対する抗体の存在をスクリーニ
ングすることができる。本発明ではじめて教示されたよ
うに、エンベロープＡＩＤＳ蛋白質がＡＩＤＳの病原の
エンベロープ蛋白質として認識されたので、上述のまた
他の方法が容易に決定される。本発明の前述のおよび他
の目的、特徴および利点は、本発明の好ましい態様につ
いて述べる以下の実施例により、さらに明白であろう。 ＨＴＬＶ−ＩＩＩの統合プロウィルスゲノムは、最近、
ＨＴＬＶ−１［［感染Ｈ９細胞のゲノムＤＮＡからクロ
ーン化された（シ：３−　（Ｓｈａｗ、Ｇ、Ｈ，）ほか
：前出）、Ｘｂａｌ消化Ｈ９／ＨＴＬＶ−１［［ＤＮＡ
を用いて得られたプロウィルスゲノムは、ウィルスゲノ
ム内に２個の内部ＥｃｏＲ１部位とさらにクローニング
ベクターλＪ１内に２個の部位を含んでいた。これらの
部位を用いてさらに、３個の５．５Ｋｂ、４．５にｂお
よび１．ＩＫｂのＤＮＡフラグメントをｐＢＲ３２２（
ＡＴＣＣＮｎ３７０１７）内にサブクローニングした。 プロウィルスゲノムのヌクレオチド配列はマキサムらの
化学分解法によって決定した〔マキサムはか（Ｈａｘａ
ｍ、Ａ、Ｈ，＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ、％４．）：シクエン
シング・エンドーラベルド・ディーエヌエー・ウィズ・
ペイスースペシフイツク・ケミカル・クリーベイジズ（
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｏ　ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｄ
ＮＡ　ｗｉｔｈｂａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ　）　、メソツズ・イン
・エンザイモＯジー（ｊｌｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
）　。 ６５．４９９〜５６０　（１９８０））。配列解析には
、３個のサブクローンからのＤＮＡ挿入体を電気溶出で
単離し、適当な制限酵素でさらに切断した。ＤＮＡフラ
グメントは５′末端をγ−３２Ｐ−ＡＴＰでポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて標識するか、または３′末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント）を用い
て充填してα−３２Ｐ−ＮＴＰで標識した。両末端を標
識したＤＮＡフラグメントを第二のＭＩＡで切断し、一
方の末端が標識されたフラグメントを５％アクリルアミ
ドゲル上で精製して、配列解析に使用した。　　　□ｅ
ｎｖ遺伝子の配列解析にはショットガン法を用い、４．
５ＥｃｏＲＩフラグメントを次の酵素：ＢＱＩＩＩ、Ｈ
ｉｎｄｌｌ［、ＸｈｏＩ、Ａｖａｌ［、ＨｉｎｆＩおよ
び５ａｕ３Ａのひとつで切断し、ｉｌｌ限フラグメント
を上述のように標識し、配列を決定した。本発明に用い
るエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列を第１図に示
す。 鳳ユ ｐＥＶ／ｅｎｖ４４〜６４０の構築 ｐＲＣ２は、ｐＢＲ３２２のＥＣｏＲｌ部位に隣接して
（ａｍｐＲ側）１個のＢＩＭ部位を有するｐＢＲ３２２
の誘導体である。このプラスミドは次の方法で構築され
た。ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ２０μ９をＥｃｏＲ
Ｉで消化し、２つに分割した。一方については、突出し
た５′−重　　　　・□鎖末端を８１ヌクレアーゼで除
去し、他方は　　　　　　□ＤＮＡポリメラーゼエのフ
レノウフラグメントで　　・　′デオヤ、８ウツォチド
ヶ導入し工充填した。両反　　　　）・応ともフェノー
ル抽出ついでエタノール沈殿に、よ　　　　□つて終結
させた。各反応からのＤＮＡ約１μグをホスホリル化Ｂ
ＱＩＩＩリンカ−（ＣＡＧＡＴＣＴＧ　、コラボレイテ
イプ・リサーチ＜　ｃｏｔｔａｂｏｒａｔｔｖｅＲ１３
ＳｅａｒＣｈ）から購入）９０ｐｍｏｌと混合し、１５
℃で１８時間、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼとインキュベー
トした。リゲ＝ジョン生成物をついでＢＱＩＩおよびＰ
ｓｔＩで消化し、１％アガロース中ゲル電気泳動に付し
た。両反応液からの３６００　ｂｐおよび７６０ｂｐの
フラグメントをゲルより回収した。 ｐＲＣ２の構築にはフレノウ反応からの３６００ｂｐを
Ｓ１反応からの７６０ｂｐフラグメントにリゲートさせ
た。Ｂｑ　ｌ　ＩＦ部位のＥＣ０ＲＩの逆側（ｔｅｔＲ
側）にもつ、ＤＲＣｌと呼ばれるプラスミドの構築には
、Ｓ１反応からの３６００　ｂｐフラグメントをフレノ
ウ反応からの７６０ｂｐフラグメントにリゲートさせた
。大腸菌ＲＲ１（＾ＴＣＣＮｎ３１３４３）をリゲーシ
ョン混合物で形質転換し、形質転換体を５０μＳＦ／ｄ
のアンピシリンを含むＬＢアガール板上で選択した。期
待されたプラスミド構築体を含む形質転換体を単離され
たプラスミドＤＮＡの制限解析によって同定した。 ＤＮＡ配列解析により、Ｓ１ヌクレアーゼ処理が５′−
重鎖末端を正確に除去したことが確認された。 ｐＲｃ２３　（第７図参照）は、ｐＲＣ２に、モデルリ
ポソーム結合部位（Ｒ８Ｓ）からなる１対の相補的合成
オリゴヌクレオチドに接合したλＰ、ブロモーターを含
む２５０ｂｌ）Ｂｏｌｌ−Ｈａｅｌｌ［フラグメントを
挿入することによって構築された。）−１ａｅｌｎ部位
はＰ、転写開始部位の１１５ｂＤＴ流、λＮ遺伝子の５
′非暗号領域内に存在する。ファージλＤＮＡから単離
された４５０ｂｐ　　ＢｃｕＩＩ−ＨｐａＩフラグメン
ト約１μ３をＨａｅｌｌｌで消化した。得られた消化生
成物２００ｎｇを、モデルＲＢＳ含有ホスホリル化合成
オリゴヌクレオチド各６０　ｐｍｏｌと混合した。リゲ
ートされた分子をＢｇｌ　ＩＩおよｔＦＥｃｏＲＩで消
化し、５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。２７
０ｂｐリゲーシヨン生成物をゲルから回収し、これを、
ＢＩＩＩおよびＥＣ０ＲＩで消化してゲル精製したｐＲ
ｃ２ベクターと混合し、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼと１５
℃で１５時間インキュベートした。 リゲーション混合物を用いてＲＲＩ株（ｐＲＫ２４８ｃ
　Ｉ　ｔｓ）を形質転換した。アンピシリン含有メジウ
ム上で選択された形質転換体を単離プラスミドＤＮＡの
制限解析によってスクリーニングした。ＩＩ持されたプ
ラスミド構築体、Ｅ）ＲＣ２３は、さらに制限酵素消化
、ＥｃｏＲＩ接合部の逆のＤＮＡ配列解析によって確認
された（第７図）。 ＤＥＶ−ｖｒｆセットのプラスミドの構築には（第８図
参照）、プラスミドｐＲｃ２３を１：ｃｏＲ［およびＨ
ｉ　ｎｄｌ［［ｔ’消化し、ｐＲＣ２３／ＥｃｏＲ１−
Ｈｉ　ｎｄｌｌベクターをプレバラティブーアガロース
ゲル電気泳動によって単離した。合成オリゴヌクレオチ
ド（３２，３３および３４ヌクレオチド）の混合物を相
補的配列の混合物と合し、１５０ｉＨＮａＣｌ中５８℃
に５分間加熱し、徐々に冷却してアニーリングを行った
。 合成二重ｔ１１０．１ｐｉｏｌをｐＲＣ２３／ＥｃｏＲ
１−Ｈｉ　ｎｄｕ［ベクター０．０７９ｍｏｌｋ−７１
１工、■４ＤＮＡリガーゼと１５℃で１５時間インキュ
ベートした。ＲＲＩ株（λｃ１８５７）をリゲーション
生成物で形質転換した。６個のアンピシリン抵抗性形質
転換体を選びＤＮＡ配列解析を行った。 ６個中、２個が期待されたＤＥＶ−ｖｒｆ１配列を、１
個がｐｔ：ｖ−Ｖｒｆ２配列を、３個がＤＥＶ−ｖｒｆ
３配列を含有した（第３図）。 ＡＩＤＳｅｎｖ遺伝子の発現には、クローン化ＨＴＬＶ
−ＩＩプロウィルスゲノムからプレバラティブーアガロ
ースゲル電気泳動で単離した２４００ｂＤ　　ＥｃｏＲ
Ｉ−Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ　　ＤＮＡフラグメント１”μ９
を、ＥＣＯＲＩ　−Ｈｉ　ｎｄｌｌ［消化ベクターＤＮ
Ａ　（１）ＥＶ−ｖｒｆｌ、−２または−３）０．１μ
グと混合した。、６５℃に３分間加熱したのち、混合物
を氷上で冷却し、５０ｍＨトリス塩酸塩（ａｌ１７．４
）、１０ｍＨＭＱＣ！２．１０ａＨＤＴＶ、０．３ＩＩ
１８　　ＡＴＰおよび２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を含む２０μｌのリゲーション反応液をｉ１１！Ｊシた
。１５℃で４時間インキュベートしたのち、１５℃で４
１Ｍ間加熱して反応を終結させた。このリゲーション生
成物を用いて、プラスミドｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ含む大
腸菌株ＭＣ１０６１を形質転換した。形質転換体は５０
μシ／ｒｄのアンピシリンを含むルリア肉汁アガール上
で、１８時間３０℃において選択した。各培養液１１ｄ
ｌから・プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析に付した
。１２個の命中離体がｍｗされたプラスミド構築体を含
有した。次に、これらの中間構築体を用い、以下に述べ
るようにＥＣＯＲＩとＫｐｎ　１部位の間の６００　ｂ
ｐを欠失させることにより、Ｅ）ＥＶｌ、−２および一
３／ｅｎｖ４４〜６４０を：１４製した。 プラスミドＤＮＡ約０．５１１９をＫｐｎ　ＩおよびＥ
ｃｏＲＩで消化し、た。生成した末端を、４種の全デオ
シリボヌクレオチド（１００μＭ）の存在下にＤＮＡポ
リメラーゼ１のフレノウフラグメントにより、３７℃で
３０分間処理した。この工程で、ＥｃｏＲＩ末端の５′
突出部の充填とＫＯｎｌ末端の３′突出部の除去が行わ
れる。１状プラスミドの再環化とこれらの末端の平滑端
リゲーションにより、ＥｃｏＲ［部位が再生される。 期待される欠失をもつプラスミドを含む形質転換体は制
限解析によって同定された。 ｐＥＶ／ｅｎｖ２０５〜６４０と命名された第二のセッ
トの欠失誘導体は同様にして構築された。 上述のようにしてＥＣＯＲＩとＫｐｎ　Ｉで消化し、フ
レノウで処理した線状プラスミドの一部をざらにＳｔｕ
　Ｉで消化した。この場合も、再環化および平滑端リゲ
ーションでＥＣＯＲ１部位が再生したが、ｅｎｖコード
配列のさらに４８３　ｂｐが除去された。 例３ 細菌の生育およびｅｎｖ遺伝子　現の誘導プラスミドｐ
ＲＫ２４８ｃ　ＩｔｓおよびｐＥＶｌ、−２または一３
／ｅｎｖプラスミドで形質転換された大腸菌株ＭＣ１０
６１を０．５％グルコースおよび０．５％カサミノ酸含
有Ｍ９メジウム中３０℃で対数期中期まで生育させ、つ
いで４２℃に２１１閤シフトして誘導した。Ｉｌｌ胞を
遠心分離によって収集し、例４および５に記載したよう
に処理した。 １Ｍ４ ｅｎｖＡＩＤｓの　　および　・ 均一な組換えウィルスｅｎＶＡＩＤｓを以下の操作にし
たがって精製した。細菌によって発現されたｅｎｖＡＩ
Ｄｓ蛋白質は、宿主細菌の膜分画、主として細菌の内膜
と会合しやすい。この所見に対処して以下の精製方法を
立案した。すなわち、（６）組換えｅｎＶＡＩＤｓ蛋白
質を産生する形質転換微生物細胞の溶解 ＠　　ｅｎｖＡＩＤｓ会合細胞膜の他の細胞成分からの
分離 （へ）会合した膜からのｅｎＶＡＩＤｓの抽出＠　　ｅ
ｎｖＡＩＤＳを含有する得られた抽出溶液のクロマトグ
ラフィーによる精製、純粋な組換えウィルスｅｎＶ？Ｊ
白質の生成 である。 さらに詳しくは、純粋な組換えウィルスｅｎｖ蛋白質の
製造のための好ましい精製方法は、（２）　ウィルスｅ
ｎｖ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有する形質転換
生物体の培養 ０　工程（２）の形質転換生物体の培養によるｅｎｖ蛋
白質の蓄積 （へ）工程（ハ）での培養形質転換生物体の溶解による
細胞溶解混合物の形成 ゆ　工程（へ）の細胞溶解混合物の細胞膜成分の単　　
　　□離 （ロ）　単離細胞膜成分の抽出溶液による洗浄、ｅｎｖ
蛋白質含有洗浄液の生成、および（０工程０の洗浄液の
クロマトグラフィーによる精製、純粋なｅｎｖＡＩＤｓ
蛋白質の生成であ　　　　トる。 この方法の実施にあたっては、細胞は超音波処　　−１
理によって溶解させるのが好ましいが、他の方法　　　
　トたとえば酵素による溶解または機械的溶解も使用　
　　　ト許 できることは当然である。細胞膜成分、とくに内　　　
　１゛膜および外膜は、他の細胞成分からたとえば遠心
　　　　□分離によって単離するのが好ましい。形質転
換微生物によって発現されたｅｎＶＡＩＤｓは細胞膜と
会合しやすいことが明らかにされた。したがつて、精製
過程でのこれらの膜の単離は、精製操作終了時の高精製
レベル、高純度のｅｎＶＡＩＤｓを保証する。 細胞膜を溶解混合物から単離したのち、抽出溶液、好ま
しくは塩溶液および界面活性剤で洗浄し、約５０％のｅ
ｎＶＡＩＤｓ蛋白質を含有する第二の溶液を得る。細胞
膜は４回の工程に分けて塩溶液および界面活性剤で洗浄
するのが好ましいが、これらの工程のどれかを一緒にし
ても、順序をかえてもまた省略してもよいことは当然で
ある。細胞膜の洗浄の第一工程は塩溶液、好ましくは１
ＭＮａＣｊ！で行う。第二工程では、細胞膜を界面活性
剤溶液、好ましくは１％トリトンＸ−１００で洗浄する
。第三工程では、細胞膜を他の塩溶液、１．７５Ｍ〜３
．５Ｍグアニジン塩酸塩で洗浄する。最後の洗浄も塩溶
液好ましくは約７Ｍグアニジン塩酸塩で行う。第四の最
終洗浄で得られた洗浄溶液は約５０％のｅｎＶＡＩＤｓ
からなる。 最終の５０％ｅｎｖＡＩＤｓ洗浄液をついでクロマ１−
グラフィ一工程、好ましくは逆相高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製する。ＨＰＬＣ工
程で、ｅｎｖＡＩＤｓはほぼ１００％の純粋な形で得ら
れる。ＨＰＬＣにかえて、ｅｎｖＡＩＤｓのポリクロナ
ールまたはモノクロナール抗体を用いたモノクロナール
抗体アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いる
ことも、もちろん可能である。 匠支 ポリアクリルアミド電気泳動および　ニスタン吸着解析 細胞は細胞ベレット（細胞約１０８個）をＴＧ緩衝液（
１０ＩＩＩＨトリス、ｐＨ７，４，１０％グリセロール
）中に再懸濁して溶解し、等容の２×サンプル緩衝液と
混合し〔レムリ（Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉ　、　Ｕ、に、）
：クリーベイジ・オブ・ストラクチュラル・ブ日テイン
ズ・デユアリング・ザ・アッセンブリー・オブ・ザ・ヘ
ッド・オブ・バクテリオファージ・ティｍ−フォア（Ｃ
ｌｅａｖａｇｅ　ｏｆ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｓｓｅｎ＋ｂｌｙ
　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆｂａｃｔｅｒｔｏｐｈ
ａｇｅ　　Ｔ４）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　。 ２２７．６８０〜６８５　　（１９７０））、９５℃で
５分間インキュベートした。細胞残層を遠心分離によっ
てベレット化し、澄明な溶解液を５ＤＳ−ＰＡＧＥ解析
に付した〔レム’Ｊ　（Ｌａｅｍｍｌｉ　、　Ｕ。 Ｋ、）、前出〕。ウェスタン吸着解析に際しては、アク
リルアミドゲルからの蛋白質を０．１μｍのニトロセル
ロース膜〔シュライヘル・アンド・ジュール（Ｓｃｈｌ
ｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）上に、１２．
５ｎ＋Ｈトリス、９６＋＋＋Ｈグリシン、２０％メタノ
ール、０．０１％ＳＤＳ、Ｅｌ１１７．５中、５０Ｖで
１６時間、電気吸着させた。プロットの処理はトウビン
（Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，）らの記載の方法を用いて実施し
た（エレクトロフオレテイツク・トランスファー・オブ
・プロテインズ・フラム・ポリアクリルアミド・ゲルズ
・トウー・ニトロセルロース・シーツ・プロセデュア・
アンド・サム・アプリケーションズ（ＥｌｅＣｔｒＯｐ
ｈＯｒｅｔｉＣｔｒ’ａｎｓｔｅｒ　ｏｆｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅ
ｔｓ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅ
ｅｔｓ：　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａ
ｐｐｌｉ　−ｃａｔｉｏｎｓ　）　、ピーエヌエーエス
（ＰＮＡＳ）　、７□ ６・　４３５０〜４３５４　（１９７９））・３ト血　
　　　　　［清の処理には、プロットを抗体緩衝液（２
Ｏｎ＋Ｈリ　　　　　１ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７
，５，０，５Ｍ　　　　　　　　１ゝａｃｔ、　１％Ｂ
ＳＡａ′″ｉ［７０，０５％″／（−＞。 ２０１ゝ＄１０００４８１０ｆｉ′″２〜６１“　　　
１ンキユベートした。ついでプロットを０．０５％　　
　　　：ツイーン２０含有リン酸塩緩衝食塩液で２回洗
浄″パ　　”−′″ａｆｆｉ！７１”７″′″１７０ｙ
（”ｙ　　　　。 Ａとさらに１時間インキュベートした。プロット　　　
　　：ン をＰＢＳ−ツイーン２０緩衝液中で２回洗浄し、乾燥し
、オートラジオグラフィーに付した。 ＬＩ ＡＩＤＳウィルスのｅｎｖ蛋白質による免疫処　　　　
　］ン 胃　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１ＨＴＬＶ−１とＡＲＶ−２配列の間に認められ　
　　　　）る分岐ｉ、＝ｂカ、ヵ、ゎらア、細菌、よつ
１合成さゎた　　　　　［組換え蛋白質は、米国のいず
れの地域からのＡＩＤＳ患者血清ともよく反応すること
が明らかである。試験したＡＩＤＳ患者血清の１００％
が高い反応性を示したく米国東海岸から２５例、米国西
海岸から２５例の計５０例について）。すなわち、スべ
てのｅｎｖ蛋白質は少なくとも１個の保持エピトープを
含んでいる。試験したＡＩＤＳ患者からの全血清は、本
発明のｅｎｖ蛋白質に対する抗体を含んでいた。これは
、保持エピトープをもつこれらのｅｎｖ蛋白質がヒトに
免疫原性があることを強く示唆するものである。 本発明のｅｎｖ蛋白質が、ＡＩＤＳウィルスに対する保
護免疫性を誘導できるワクチンに導入可能なことは容易
に理解される。本技術分野において公知の方法により、
ｅｎｖ蛋白質のエピトープを構成する特異的アミノ酸が
決定できる。モしてｅｎｖＡＩＤｓ蛋白質のエピトープ
に相当するアミノ酸配列からなるペプチドが単量体また
は会合体のいずれの型で合成できると思われる。これら
の合成ペプチドは、ＡＩＤＳウィルスに対する保護免疫
性を誘導できるワクチンに導入可能である。 このようなペプチドの抗原性を増強する方法としては、
会合体構造への合体、高度に免疫原性な蛋白質担体たと
えばキーホルトリンペットのへモジアニンまたはジフテ
リアトキソイドへの結合、アジュバントもしくは他の免
疫応答増強剤との併用投与がある。さらに、ワクチン組
成物には／１０８のほかに他の疾患に対する免疫性を付
与する抗原を加えることもできる。 ｅｎｖ蛋白質のエピトープに相当するアミノ酸配列は単
量体、会合体型（ペプチド）のいずれでも、化学的合成
法によりまたは遺伝子的に改変した微生物もしくはその
培養メジウムを含む生物学的材料からの精製により得る
ことができる。このペプチドは、たとえば融合蛋白質と
してＩＩＪ造された場合または合成もしくは生物学的起
源の他の抗原性もしくは非抗原性ペプチドに結合された
場合のように、他の蛋白質のフラグメントを含めた他の
ペプチドと結合しであるアミノ酸配列を形成しでいても
よい。［ｅｎｖ蛋白質のエピトープに相当する」の語は
、ある場合に天然のペプチドのアミノ酸配列の変異が抗
原性を示し、ＡＩＤＳ感染に対して保護免疫性を付与す
ることがあり得ると　　　　　１□ いう現実０可能性を包含するも０と理解す６きで　　　
　　Ｉある・可能な配列変異にはアミノ酸置換、延長、
欠失、挿入、それらの組合せが包含されるが、これらに
限定されるものではない。このような変異は、それを含
むペプチドが抗原性を示し、このようなペプチドによっ
て誘発された抗体が天然のｅｎｖ蛋゛白貿またはｅｎｖ
蛋白質の非変異反復ペプチドと交差反応を示し、ワクチ
ンとして投与した場合に十分な保護免疫性を付与する限
り、本発明の範囲内に包含される。このようなワクチン
組成物は、生理的に許容されるメジウムと配合される。 炭水化物抗原に認められるエピトープの大きさおよび形
状については広範に研究されてきたが、蛋白質分子から
のエピトープの構造についてはそれ程わかっていない。 蛋白質抗原のいくつかのエピトープはその三次構造のレ
ベルで明らかにされてきた。いずれの場合も、エピトー
プは一次構造のみによって形成されるものではなく、母
体分子のペプチド鎖の折りたたみで互いに並置される残
基によるものである。また、本発明の６８にｄｅｎｖ蛋
白質の構造はそれのワクチンとしての使用をとくに適当
にしている。６８にｄ　　ｅｎＶ蛋白　　　　　、ｉ質
は（２）試験したＡＩＤＳ血清のすべてと反応性を　　
　　　１１５１．１［１１１１％１ｆｌｆ［ｉｈｉ！　
＆１１１ｉ：ａｊ３１ｉ＊ａｌｌ。　　　１両者を含む
独特な構造特徴を有する遺伝子生成物　　　　　１の大
部分からなる。後者の構造的￥１徴は、投与用ビークル
としてリポソームへの封入を用いたワクチンとしての使
用にとくに適している。　　　　　　　　　ｉ廿 投与経路、抗原用量、注射の回数および頻度は、　　　
　；本技術分野の通常の熟練者により、とくに他のウィ
ルス感染症に免疫性を付与するために他の関係抗原の注
射で保護免疫性を付与した本技術分野における経験に基
づいて、すべて適宜選択できる事項である。ＡＩＤＳ感
染に対する免疫性を付与する主たる価値は、ＡＩＤＳと
これまで接触する機会はなかった人、たとえば危険が高
い集団内にある人、同性愛者、麻薬常用者、ハイチや中
央アメリカ出身者、輸血を受けている患者等に対するも
のであると予想される。また、小児に対する暫定的、な
免疫性は、妊娠中の母体の免疫処置によって付与できる
ものと考えられる。 例７ ＡＩＤＳの 本発明のｅｎｖ遺伝子蛋白質がＡＩＤＳ関連抗体の検出
のための診断試薬として使用できることは明白である。 本発明のＡＩＤＳｅｎｖ蛋白質に対するポリクロナール
またはモノクロナール抗体を用いるＡＩＤＳの診断的検
定がヒ１〜血液中のＡＩＤＳウィルスの存在の検出に使
用できることも通常の熟練者には明らかなとおりである
。−態様においては、抗原性物質、この場合は血液サン
プル中のＡＩＤＳウィルスを限られた量の抗体結合部位
に対して、既知量の標識抗原、この場合は標識ＡＩＤＳ
ｅｎｖ蛋白質と競合させる競合免疫検定法が使用される
。すなわち、抗体に結合する標識抗原の量はサンプル中
の抗原量に逆比例する。 別の態様においては、標識ＡＩＤＳｅｎｖ抗体を用いる
免疫検定法が採用できる。この検定法では、□抗原結合
抗体と複合体を形成する標識抗体の量は血液サンプル中
の抗原（ＡＩＤＳウィルス）の量に比例する。ＡＩＤＳ
ウィルスが血液中に存在するか否かを決定する単純な陽
性陰性の検定では、標識抗体の存在を検出するために固
体支持体を試験する。他の態様においては、ＡＩＤＳｅ
ｎｖ蛋白質に対するモノクロナール抗体を免疫検定法に
使用できる。このようなモノクロナール抗体は、本技術
分野でよく知られた方法、とくにミルスタインらの方法
によって得ることができる　〔ミルスタインはか（Ｈｉ
　ｌ５ｔｅｉｎ　＆にｏｈｌｅｒ　）　、ネイチャー　
（Ｎａｔｕｒｅ）　、　２５６．４９５〜４９７　（１
９７５）〕。 免疫検定法は次のとおりである。二重にサンプルを用意
し、アガロース粒子上に固定化した抗体の懸濁液１００
μｌを血清１００μｌおよび可溶性　　Ｉ−標識抗体１
００μｍと混合する。この混合物を特定時間、１５分〜
２４時間インキュベートする。インキュベーション後、
アガロース粒子を緩衝液の添加により洗浄し、ついで遠
心分離する。洗浄液を吸収して除去したのち、得られた
アガロース粒子のベレットについて結合　　Ｉ−標識抗
体をカウントする。各複合体について得られたカウント
数を対照と比較する・ 以上、本発明を好ましい態様に関して説明したが、本技
術分野の通常の熟練者には、本発明の範囲から逸脱する
ことなく改変が可能なことは自明であろう。たとえば、
本明細書に述べたｅｎｖＡＩＤＳ、ＤＮＡは２種の天然
に生じる遺伝子セグメントの正確な構造のみである。わ
ずかに改変された対立遺伝子が類似の機能をもつ蛋白質
をコードすることが発見され、このような遺伝子セグメ
ントおよび蛋白質が本発明の目的において均等と考えら
れることは十分期待される。本明細書に記載した以外の
他の変異株が発見され、その変異株のエンベロープ蛋白
質がわずかに異なっている可能性も考えられる。これら
の変異株のエンベロープ蛋白質も同様に本発明の範囲内
に包含されるものである。均等なコドンを有するＤＮＡ
は本発明の範囲内に包含されるものであり、またウィル
スエンベロープの相同性蛋白質をコードする合成遺伝子
セグメントについても同様である。 本発明の各種態様を特許請求の範囲に提示する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＴＬＶ−１プロウイルスゲノム（ＨＸＢ−
３＞のエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列である。 第２図は５種のＡＩＤＳ病原のｅｎｖ蛋白質のアミノ酸
配列をホモロジーが最大になるように並べて比較したも
のである。 第３図は、ｐＥＶ／ｅｎｖ４４〜６４０発現プラスミド
の構築を示す図である。 第４図は大腸菌内で産生したｅｎｖがコー＋５する抗原
のウェスタン法による解析結果である。 第５図は、細菌合成ＨＴＬＶ−１［１ｅｎｖ３１１伝子
生成物のＡＩＤＳ患者血清中抗体による認識を例示した
ものである。 第６Ａ図はＡＩＤＳエンベ０−ブ蛋白質のアミノ酸配列
である。 第６Ｂ図はＡＩＤＳエンベロープ蛋白質のアミノ酸分布
である。 第７図は、発現ベクターｐＲＣ２３の構築を示す図であ
る。 第８図は、ｐＥＶ−ｖｒｆベクターの構築を示す図であ
る。

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. （１）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 またはそのフラグメントを有する後天性免疫不全症候群
   （ＡＩＤＳ）ウィルスのエンベロープ蛋白質
2. （２）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のＡＩＤＳウィルス
   のエンベロープ蛋白質
3. （３）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のＡＩＤＳウィルス
   のエンベロープ蛋白質
4. （４）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のＡＩＤＳウィルス
   のエンベロープ蛋白質
5. （５）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のＡＩＤＳウィルス
   のエンベロープ蛋白質
6. （６）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のＡＩＤＳウィルス
   のエンベロープ蛋白質
7. （７）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有する特許請求の範囲第１項記載のＡＩＤＳウィルス
   のエンベロープ蛋白質
8. （８）他のＡＩＤＳウィルス蛋白質を含まない均一蛋白
   質である特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
   かに記載のエンベロープ蛋白質
9. （９）転写、翻訳とその結果宿主内でのＡＩＤＳウィル
   スのエンベロープ蛋白質の発現を可能にするブロモータ
   ー配列とその下流にＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋
   白質をコードする遺伝子を有する発現ベクター
10. （１０）ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質をコー
    ドする遺伝子は、ヌクレオチド配列： 【アミノ酸配列があります】 またはその等価配列からなる遺伝子である特許請求の範
    囲第９項記載の発現ベクター
11. （１１）ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質をコー
    ドする遺伝子はヌクレオチド配列： 【アミノ酸配列があります】 またはその等価配列からなる遺伝子である特許請求の範
    囲第９項記載の発現ベクター
12. （１２）ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質をコー
    ドする遺伝子はヌクレオチド配列： 【アミノ酸配列があります】 またはその等価配列からなる遺伝子である特許請求の範
    囲第９項記載の発現ベクター
13. （１３）ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質をコー
    ドする遺伝子はヌクレオチド配列： 【アミノ酸配列があります】 またはその等価配列からなる遺伝子である特許請求の範
    囲第９項記載の発現ベクター
14. （１４）ＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質をコー
    ドする遺伝子はヌクレオチド配列： 【アミノ酸配列があります】 からなる遺伝子である特許請求の範囲第９項記載の発現
    ベクター
15. （１５）発現ベクターはグラム陰性菌および／またはグ
    ラム陽性菌内で複製可能なプラスミドである特許請求の
    範囲第９項から第１４項までのいずれかに記載の発現ベ
    クター
16. （１６）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株内で複製可能である
    特許請求の範囲第１５項記載の発現ベクター
17. （１７）枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株内で複製可
    能である特許請求の範囲第１５項記載の発現ベクター
18. （１８）ｐＥＶ／ｅｎｖに属する１種である特許請求の
    範囲第１５項または第１６項のいずれかに記載の発現ベ
    クター
19. （１９）ｐＥＶ１、−２、または−３／ｅｎｖ４４−６
    ４０である特許請求の範囲第１８項記載の発現ベクター
20. （２０）ｐＥＶ１、−２、または−３／ｅｎｖ２０５−
    ６４０ある特許請求の範囲第１８項記載の発現ベクター
21. （２１）特許請求の範囲第９項から第２０項までのいず
    れかに記載の発現ベクターをもつ形質転換細胞
22. （２２）大腸菌株である特許請求の範囲第２１項記載の
    形質転換細胞
23. （２３）大腸菌ＭＣ１０６１株である特許請求の範囲第
    ２２項記載の形質転換細胞
24. （２４）枯草菌株である特許請求の範囲第２１項記載の
    形質転換細胞
25. （２５）真核生物細胞である特許請求の範囲第２１項記
    載の形質転換細胞
26. （２６）特許請求の範囲第９項から第２０項までのいず
    れかに記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、こ
    の宿主細胞を培養してＡＩＤＳｅｎｖ蛋白質を発現させ
    、ついでＡＩＤＳｅｎｖ蛋白質を抽出、精製することを
    特徴とする後天性免疫不全症候群ウィルスのエンベロー
    プ蛋白質の製造方法
27. （２７）発現ベクターはＰＥＶ１、−２または−３／ｅ
    ｎｖ４４−６４０である特許請求の範囲第２６項記載の
    製造方法
28. （２８）発現ベクターはｐＥＶ１、−２または−３／ｅ
    ｎｖ２０５−６４０である特許請求の範囲第２６項記載
    の製造方法
29. （２９）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載のＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質を含
    有する組成物をヒト血液サンプルと混合し、このＡＩＤ
    Ｓエンベロープ蛋白質が血液中に存在するＡＩＤＳ抗体
    と結合するかどうかを調べることを特徴とするＡＩＤＳ
    ウィルス病原に対する抗体の存在に関しヒト血液を試験
    する方法
30. （３０）ウェスターン法を使用する特許請求の範囲第２
    ９項記載の試験方法
31. （３１）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載のＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質を固
    相上にコーティングし、サンプルと接触させ、洗浄した
    のち酵素標識非ヒトＩｇＧと接触させるＥＬＩＳＡ法に
    よる特許請求の範囲第２９項記載の試験方法
32. （３２）二抗体法を用いる特許請求の範囲第２９項記載
    の試験方法
33. （３３）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載のＡＩＤＳウィルスのエンベロープ蛋白質に対
    する抗体を使用するＡＩＤＳウィルスの定量方法
34. （３４）サンプル中の抗原と特許請求の範囲第１項から
    第８項までのいずれかに記載の蛋白質の標識型を、特許
    請求の範囲１項から第８項までのいずれかに記載の蛋白
    質に対する抗体と競合させる特許請求の範囲第３３項記
    載の定量方法
35. （３５）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載の蛋白質に対する２種の抗体を用いてサンドウ
    ィッチ法を行う特許請求の範囲第３３項記載の定量方法
36. （３６）一方の抗体は固相上に結合させ、他方の抗体は
    標識する特許請求の範囲第３５項記載の定量方法
37. （３７）２種の別個のモノクロナール抗体を用いる特許
    請求の範囲第３５項記載の定量方法
38. （３８）活性成分として特許請求の範囲第１項から第８
    項までのいずれかに記載の蛋白質を含有するＡＩＤＳに
    対する免疫を誘発するワクチン
39. （３９）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載の蛋白質に対して産生される抗体
40. （４０）モノクロナール抗体である特許請求の範囲第３
    ９項記載の抗体
41. （４１）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載の蛋白質の防御免疫感作への使用
42. （４２）特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれ
    かに記載の蛋白質のＡＩＤＳウィルスの存在に関するヒ
    ト血液の試験への使用
43. （４３）本明細書に、とくに実施例に関連して記載した
    発明