JPH03505039A - 可溶性ｃｄ４を発現するレトロウイルスベクター、エイズの遺伝子治療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 可溶性ＣＤ４を発現するレトロウィルスベクター、エイズの遺伝子治療法 ここで開示される発明は、分泌ＣＤ４　（ｓＣＤ４）分子タンパク質及びＣＤ４ タンパク質アナログのインビボ産生によるヒト細胞のレトロウィルス感染阻止手 段を提供する。これらのタンパク質は細胞上のＣＤ４レセプターとウィルス、ウ ィルス粒子さもなくばＣＤ４レセプターと結合してしまうウィルス産物との相互 作用を阻止する。

発明の背景 ＣＤ４レセプターを有する細胞に感染してそれを破壊しうるヒト免疫不全ウィル ス（ＨＩ　Ｖ）の能力により、ＣＤ４タンパク質を発現するＴ４細胞の欠乏が引 き起こサレル。ＨＩＶのエンベロープタンパク質はＣＤ４分子と結合することが 、数人の研究者により明らかにされた（例えば、Ｄａｌｇｌｉｓｈ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１２ニア［１３（１９８５）　；ＭｃＤｏ ｕｇａｌ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３１：３８２（１９８Ｂ）参照） 。ＨＩＶ感染力は組換え可溶性ＣＤ４レセプタータンパク質によりインビトロで 阻止しうろことも明らかにされた（Ｆｉｓｈｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ 、３＄１ニア１１ｉ（１９８ｇ）　）　ａ完全ＣＤ４レセプターのアフィニティ に匹敵するアフィニティで　ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ　１２０と結合 する可溶性ＣＤ４タンパク質は、ＨＩＶ感染力を阻止することが示された（Ｓｍ ｉｔｈ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：１７０４（１９８７）　　） 。ＣＤ４の細胞内領域のアミノ末端からの約１８０アミノ酸残基フラグメントを 含む可溶性組換えポリペプチドは、Ｂｅｒｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８５：２３５７（１９１１ｇ）によりワクシニア組換え体中で発現ベク ターから産生された。ＨＩＶに感染した患者への治療剤としてＣＤ４タンパク質 又はその断片を産生させる試みが行われている。

発明の概要 遺伝子導入法を用いてエイズ感染個体の細胞を生物工学処理することにより、継 続的に維持されたレベルの５ＣＤ４を提供することが本発明の目的である。

ヘルパー／インデューサー子細胞抗原ＣＤ４は許容細胞内へのＨＩＶ侵入に必須 の成分であって、可溶形のＣＤ４抗原はＣＤ４陽性細胞と結合してそのＨＩ　Ｖ ＠染を阻止しうるとの研究結果に基づけば、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）の投与に よるエイズ治療は有用のように思われる。インビボでｓ　ＣＤ４を継続的に産生 させるためエイズ患者細胞に生物工学処理を行うことは、外来投与されるＣＤ４ の投与に代わる方法である。

現在利用される遺伝子移入の最も有効な手段は、レトロウィルスベクターの使用 による。様々な遺伝子の発現を促進しうるレトロウィルスベクターが製造された が、これらの遺伝子は遺伝子移入後にインビボで発現させることができる。標的 細胞中に導入された場合に５ＣＤ４遺伝子産物を産生ずるレトロウィルスベクタ ーの組立て方が本明細書に開示されている。こうして産生される５ＣＤ４は、Ｃ Ｄ４陽性標的細胞のＨＩＶ感染を阻止する。そのベクターはヒト細胞（好ましく は、患者自身の細胞）中に導入される。次いでこれらの細胞は、細胞上のＣＤ４ 結合部位でリガンド結合を阻止するため５ＣＤ４の必要な患者に投与される。本 発明の組成物及び方法は、ＣＤ４レセプタータンパク質の欠乏に起因した他の病 状を有する患者を治療するためにも用いることができる。

本発明の最も直接的な価値はＨＩＶウィルス、粒子又はタンパク質と結合するＣ Ｄ４レセプタータンパク質の産生であるが、本発明はここで開示された特定の実 施例及び応用例に限定されない。本発明の方法で導入される細胞としては、例え ばヒト骨髄細胞又は繊維芽細胞がある。骨髄細胞はＸａｎｔｏｆｆ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１８Ｂ：２１９−３４（１９８７）で記載された操 作により形質転換してもよい。

寄託 プラスミドＳＳＣ及び５ｃｓｘは、特許手続上の微生物の寄託に関するブダペス ト条約に従い、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（ＡｒＡｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ）にキャリアとして大腸菌ＤＨ５αを用いて寄託された。寄託物はＡＴ ＣＣ受託番号Ｎｏ、：ＳＳＣＡＣＣＮｏ、６７７６０及び５ＣＳＸ　　ＡＣＣＮ ｏ、６７７６１とされた。特許発行時に、寄託された生物は要求に応じて入手し うる。生存寄託物は適用法の規定に従い少なくとも３０年間保持される。

図面の説明 ｕ２．：可溶性ＣＤ４産生レトロウイルスベクターの図。

レトロウィルスベクター５ｃｓｘ及びＳＳＣは、Ｎ２（１５）レトロウィルスベ クターにＳＶ４０促進５ＣＤ４カセツトを挿入することで産生された。ウィルス プロモーター（ＬＴＲ）、パッケージングシグナル（ψ）、ネオマイシン耐性遺 伝子（ＮＥＯＲ）　、端部切除ＣＤ４遺伝子（ｓＣＤ４）及びＳＶ４０ウィルス プロモーター（ＳＶ４０）は示されるとおりである。矢印はＳＶ４０プロモータ ーの転写方向を示す。制限酵素部位は下記のように規定される：Ｘ＝ＸｂｇＩ、 ＢｍＢｓｔＮＩ、ＥｗＥｃｏＲＩ、ＮｓｍＮｒｕｌ及びＸｈ−Ｘｈｏｌ。

」ｌ：ウィルス産生細胞及び形質導入細胞による可溶性ＣＤ４産生。（方法の項 目で記載されるように１２％アクリルアミドゲル５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分割 された）レトロウィルスベクター形質導入細胞系から免疫沈降された５ＣＤ４に 関して得られたオートラジオグラム（列１〜４及び５．６は各々３日間及び７日 間露出された）が示されている。サンプルは下記のほぼ集密的な１００＋ａｍ組 織培養皿の約１／２からのならし培地であった：１．ＰＡ３１７；２．ｓｓｃ形 質導入ＰＡ３１７；３．５Ｖ−Ｔ２；４，５ｃｓｘ形質導入５Ｖ−Ｔ２；５゜Ｈ ｅＬａ　；及び６．５ＣＳＸ形質導入Ｈｅ１ａ、同時電気泳動マーカータンパク 質のサイズ（キロドルトン）を示した矢印は可溶性ＣＤ４遺伝子産物を示す。

麗ユニレトロウィルスベクターで産生される可溶性ＣＤ４は適正な抗原決定基を 含んでいる。Ｓｓｃ及び５Ｃ５Ｘ　　ＰＡ３］、７産生細胞系のプールからの放 射能標識細胞培地（アッセイ当たり１００１１１皿の約１／２）は、図２で記載 されるように抗ＣＤ４モノクローナル抗体で免疫沈降された。５ＣＤ４はＨＩＶ 感染を目止するモノクロナール抗体により免疫沈降する：　ＯＫ　Ｔ　４　ａ　 ｓ例１　；Ｌｅｕ３ａ、例３．ＭＴ１５１．例４゜しかし感染を阻１１ニジない 抗体では沈降し、なかった：　０ＫＴ４．例２゜３０ｋｄ及び１７ｋｄのサイズ マーカーが示されている。

矢印は５ＣＤ４遺伝子産物を示す。　図４：ベクター産生５ＣＤ４とＨＩＶ　　 ｇｐ１２０との同時沈降。放射能標識細胞培地（図２で記載されるようにＳＳＣ 形質導入導入３１７から調製）は、モノクローナル抗体０Ｋ７４ａとの免疫沈降 （列１）又は ＨＩＶ　　ｇｐ１２０なしく列２）、部分精製ＨＩＶ　　ｇｐ１２０　０．２μ ｇ（列３）もしくは部分精製ＨＩＶ　　ｇｐ１２０　２．０μｇ（列４）との同 時沈降に付された。同時沈降アッセイの場合には、記載量の部分精製ＨＩＶ　　 ｇｐ１２０が加えられ、４時間インキュベートされ、しかる後ＨＩＶ　　ｇｐ１ ２０に対するヤギ抗血清（５μｇ）＋プロティンＡセファｏ−ス０．１１が添加 され、次いで一夜インキユベートされた。

３０ｋｄ及び１７ｋｄのサイズマーカーが示されている。矢印は５ＣＤ４遺伝子 産物を示す。

可溶形のＣＤ４遺伝子は、ｐＣＤＷを得るため、まずＥｃｏＲｆ＋ＢａｍＨＩ断 片として原Ｔ４Ｂ　　ｃＤＮＡクローン（１４）をブルースクリプト（Ｂｌｕｅ ｓｃｒｆｐｔ）ベクター（Ｓｔ　ｒａｔａｇｅｎｅ）に移入することで組立てら れた。

ＣＤ４遺伝子は、ｐＳＶＣＤＷを得るため、Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ　＋Ｘｂａ　Ｉで 切出され、Ｈｉ　ｎ　ｄｌｌ＋Ｘｂ　ａ　Ｉ切断ベクターｐＳＶＰＬＸに挿入さ れた。発現プラスミドｐＳＶＰＬＸは、ＸｈｏＩリンカ−をＰνｕ１１部位に挿 入しかつｐＵｃ１３からのポリリンカー配列によりｎｅｏＲ遺伝子を除去／置換 えて、ｐｓＶ２ｎｅｏから誘導された。可溶形のＣＤ４は、合成アダプター分子 （ＣＴＡＧＣＴＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴ　＋　ＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧ）をｃＤ ＮＡのＮｈｅ１部位に挿入することでｐＳＶＣＤＷから産生された。この操作で はＮｈｅ１部位を再生し、直ちにアミノ酸２０２の後に停止コドンを導入し、停 止コドンに隣接してＨｐａ１部位を生じる。

結合された分子はＨｐａｌで開裂され、Ｘｈｏｌリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄＢｉｏｌａｂｓ）が結合され、５Ｖ４０−ｓＣＤ４断片がＸｈｏｌ切断によ り除去された。次いでこの断片は、５ｃｓｘベクターを得るため、Ｎ２レトロウ ィルスベクター（１５）のＸｈｏ１部位に挿入された。ＳＳＣベクターは、最初 ＢｓｔＮＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで補充し、しかる後Ｘｈｏｌで切断して ５Ｖ４０−ｓＣＤ４断片を放出させ、次いでこれをＮｒｕＩ＋Ｘｈｏｌで切断さ れたＮ２に直接組込んでクローニングすることにより、５ｃｓｘベクターがら産 複製欠陥の両開的にパッケージ化されたレトロウィルスベクター粒子が形質感染 操作により得られた。簡単に言エバ、ＳＳＣ又ハｓ　ｃ　ｓ　ｘベクターＤＮＡ ５０ｔｔｇが外向的パッケージ化細胞系２（１６）を（リン酸カルシウム同時沈 降で）トランスフェクションするために用いられ、トランスフェクションの４８ 時間後にウィルス含有細胞培地が取出され、両開的パッケージ化細胞系ＰＡ３１ ７　（１７）に感染させるために用いられた。形質導入されたＰＡ３１７細胞は 、ネオマイシンアナログＧ４１８（５００μｇｅｍ　Ｉ　＞存在下における増殖 によって選択された。選択後、組換えウィルスは新鮮培地（１０％牛脂児血清含 有ダルベツコ修正イーグル培地）１０口１中で２４時間インキュベート後に集密 １００ＩＩ１１組織培養皿から回収された。無細胞上澄は０．２２μｌフイルタ ーユニツトでの濾過により集め、使用時まで＝７０℃で貯蔵された。マウス５Ｖ −Ｔ２及びヒトＨｅＬａ細胞系の形質導入は、８μｇ／ｌポリブｌ／ン含有組換 えウィルス上澄との３７℃で２時間のインキュベート、しかる後ウィルス含有培 地の除去及び新鮮培地との交換により行った。形質導入された細胞群は、Ｇ４１ ８（３００μｇ／ｌ）中で１４日間の増殖により選択された。

免疫沈降 細胞は１００＋ｕ組織培養皿上で約７５％の集密度まで増殖させ、放射能標識前 に２％透析牛脂児血清含有無シスナインＭＥＭ標識培地（ＧＩＢＣの中で１〜２ 時間時間インキ−ベートた。標識化は（３５Ｓ）システィン（約１０００　Ｃ１ ／５Ｉｏｌ　、＾ｍｅｒｓｈａｍ）との標識培地の除去／交換によって開始され た。ならし培地は１４〜１６時間後に集められ、細胞砕片は遠心（１０００Ｘｇ 、１０分間）により除去された。免疫沈降が行われる前に、ならし培地が］０× 緩衝液（ｐＨ−７，５の２００＋ａＭトリスＨＣＩ、１．２Ｍ　　ＮａＣ！、５ ％ＮＰ４０．２％デオキシコール酸ナトリウム、２ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＮａＦ 。

５０μｇ／ｍｌアプロチニン、２１１）ＩＩフェニルメチルスルホニルフルオリ ド）の１／１０容量＋プロテインＡセフアロース（Ｐｈａｒａａｃｉａ）　０． 　２ｍｌを加え、４℃で４時間インキュベートし、しかる後低速遠心でプロティ ンＡセフ、７０−スを除去することにより前清澄化された。次いでモノクローナ ル抗体（０ＫＴ４　ａ、　０ｒｔｈｏ　；　Ｌ　ｅ　ｕ　３　ａ。

Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｊｃｋｌｎｓｏｎ　；又はＭ　Ｔ　１５１　、　Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）　ｌ　ｐ　ｇ＋プロティンＡセファロースＯ，１ｍ ｌが加えられ、サンプルは回転輪上４℃で一夜インキユベートされた。吸着され た免疫複合体は低速遠心でペレット化され、１×緩衝液で３回洗浄され、サンプ ル添加緩衝液（ｐＨ−８，０の１０ｍＭ）リスＨＣｌ。

２％５ＤＳ５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）５０μｇに再 懸濁された。サンプルは１２％ＳＤ、Ｓ　−ＰＡＧＥで電気泳動前に７０℃で３ ０分間加熱された（１８）。

ＨＩＶ−１滴定 用いられるウィルス株（２０，２３）はＨＴＬＶ−ＩＩ！ＭＮ（名称ＨＩＶ−１ ／Ｎ１）ｌ／ｕｓＡ／１９８４／ＭＮ）及ヒＨＴ　Ｌ　Ｖ−ＩＩＩＲＦ（名称旧 Ｖ−１／ＮＩＨ／ＵＳＡ／１９８４／ＲＦ）であった。

ＨＴ　Ｌ　Ｖ−１１１ＲＦはハイチ人エイズ患者の末梢血リンパ球及びＨ４細胞 から１９８３年に単離され、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＭ、はエイズの子供（その母 親は静脈内薬物使用者であった）の末梢血リンパ球及びＪＭ細胞から１９８４年 に単離された。用いられるウィルス調製物は１０００倍濃縮物であって、感染Ｈ ９培養上澄から直接遠心により調製され、２．２〜３．ｌＸｌ０”粒子／１を含 有していた。ウィルス調製物は、５０％感染終点（ＴＣＩＤ５ｏ）を測定するた めＨＩＶ−１ｐ２４に関する免疫ケイ光Ｈ微鏡検査での感染細胞検出法を用いて ２週間アッセイ（２４）でＨ９細胞にて前滴定された。

用いられるＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−１１１ＲＦ及びＨＴＬＶ−ＩｌｌＭＮの調製物は、 Ｈ９アッセイにおいて各々１．６Ｘ１０４及び４、　　ＯＸ　１０３ＴＣＩＤ５ ｏ／ＩＩであった。

形質導入細胞系との同時培養の抗ウイルス効果を調べるため、異なる培養系が必 要とされた。マウスＮＩＨ／３Ｔ３由来繊維芽細胞（Ｎ２又はＳＳＣ形質導入導 入３１７細胞）が２４ウエル培養プレートに接種され（２Ｘ１０５／ウエル）、 −夜培養された。翌日、１×１０６Ｓｕｐ　　ＴＩ　　ＣＤ４＋細胞が同プレー トの各ウェルに加えられた。−夜同時培養後、ＨＩＶ−１ウイルス調製物（ＲＦ 又はＭＮ）の連続２倍希釈が別の９６ウ工ルＵ底微量滴定プレートにおいて２０ μｍ培地で４回行われ、２４ウエルプレートの対応ウェルに加えられた。

１週間のインキュベート後、各ウェルからの細胞は沈澱化され、スライド上にド ツトされ、風乾され、１：１アセトン−メタノールで固定された。ＨＩＶ−１ｐ ２４に関する間接的免疫ケイ光染色を、ＢＴ３ネズミモノクローナル抗体及びヒ ツジ抗マウスＦＩＴＣ複合体を用いて行った。ウェル（及びこのためそのウィル ス希釈液）を、少なくとも２つの特徴的ケイ光細胞がみられるとき陽性と判定し た。ＴＣＩＤｓｏ値の計算はＲｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（２６）の方法で行われ た。

発明の詳細な説明 後に例で記載されるように、５ＣＤ４は組換え手段で産生される。分泌形のＣＤ ４を産生ずるレトロウィルスベクターが開発された。両回的パッケージ化ベクタ ーは、分泌ＣＤ４　（ｓＣＤ４）遺伝子産物を発現することが示された細胞を形 質導入するために用いられた。ウィルスベクターで産生された５ＣＤ４は、ＣＤ ４に対するモノクローナル抗体で免疫沈降される。ベクター産生５ＣＤ４及びＨ ＩＶ−１ｇｐ１２０の物理的相互作用は、ＨＩＶ　　ｇｐ１２０に対する抗血清 との５ＣＤ４／ｇｐ１２０の同時沈降により証明された。

本発明の好ましい態様では、細胞に分泌ＣＤ４タンパク質を産生させうるレトロ ウィルスベクターでヒト細胞（好ましくは、患者自身の細胞）を形質導入する手 段を提供する。５ＣＤ４を産生ずる病的個体のかかる生物工学処理細胞の使用は 、５ＣＤ４の外来投与による効果よりも優れた効果を発揮すると考えられる。

可溶形のヘルパーＴ細胞抗原Ｃｄ４を発現する２種のレトロウィルスベクターは 、Ｃｄ４遺伝子をＮｈｅ１部位で端部切除し、この断片をＳＶ４０ベース発現プ ラスミドに挿入し、しかる後５Ｖ４０−ｓＣＤ４をＮ２レトロウィルスベクター に移入することで組立てられた。産生された２種のベクターは、ベクターＬＴＲ の場合と比較してＳＶ４０促進５ＣＤ４転写ユニツトの方向が主に異なっている （ＳＳＣはＬＴＲと同じ転写方向であるが、５ｃｓｘは反対方向である）（図１ ）。

ＳＳＣ及び５ｃｓｘはｙＩｉ　ｌ　ｌｅｒらの方法［Ｍｏｌ　、Ｃｅ１１．Ｂｌ ｏｌ、、６：２１１１９５−２９０２（１９８Ｂ））で両開的バ・ソケージ化細 胞系ＰＡ３１７中に導入され、ネオマイシンアナログ０４１８耐性について選択 後、５ＣＤ４産生に関して調べられた。適切にサイズ分割された分泌タンパク質 は、形質導入される細胞ではなく、形質導入されたＰＡ３１７細胞群の抗ＣＤ４ モノクローナル抗体０ＫＴ４ａと特異的に免疫沈降した（図２の列１）。

５ｃｓｘ形質導入ＰＡ３１７細胞も同様の分泌タンパク質を産生ずる。５ＣＤ４ 表現型を他の細胞に移入しうる我々の５ＣＤ４レトロウイルスベクターの能力を 明らかにするため、ＰＡ３１７ＳＣＳＩ産生細胞からのウィルス上澄がマウス繊 維芽細胞系（ＳＶ−７２）及びヒト上皮細胞系（ＨｅＬａ）を双方とも感染させ るために用いられた。Ｇ４１８で選択後、双方の系が免疫沈降にょる５ＣＤ４産 主に関して調べられた（図２の列３〜６）。

データは、これら形質導入系の双方が細胞培地に端部切除ＣＤ４遺伝子産物を分 泌することを証明し、た。形質導入ＨｅＬａ系は５Ｖ−Ｔ２系よりも一貫して高 いオートラジオグラフィーシグナルを示しまた（列４及び６を比較）。双方の系 は３かｎ以内にわたりインビトロで５ＣＤ４を産生じ続けたが、これは５ｃｓｘ ベクターの安定的組込み及び発現を示ｌ、ている。

おそら＜ＨＩＶ結合を阻害することでＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＩ　Ｖ感染を阻止し うるＣＤ４に対する数種のモノクローナル抗体か存在する。実験データ（図３） では、レトロウィルスベクターで産生される５ＣＤ４が、非阻止コントロール抗 体ではなく３種の阻止抗体によって認識されることを証明した。分泌された５Ｃ Ｄ４は、ＨＩＶ感染を妨げないモノクローナル抗体０ＫＴ４（列２）ではなく阻 止抗体０ＫＴ４ａ　（列１）、Ｌｅｕ３ａ　（列３）及びＭＴ１５１（列４）に よって特異的に免疫沈降される。そのデータは、レトロウィルスベクターで産生 される５ＣＤ４がＨＩＶ　　ｇｐ１２０エンベロープとの相互作用に関して適正 な抗原決定基を保持することを証明している。

５ＣＤ４ベクターで産生される５ＣＤ４がＨＩＶエンベロープと直接相互作用す るか否かを調べるため、標識細胞培地が部分精製ＨＩＶ　　ｇｐ１２０と共にイ ンキュベートされた（図４）。次いでＨＩＶ　　ｇｐ］、２０はｇｐ１２０に対 するヤギ抗血清と免疫沈降され、免疫複合体はｓＤｓ　−ＰＡＧＥで分割された 。ｇｐ１２０がなければ、５ＣＤ４は免疫沈降しながった（図４の列２）。

しかしながら、ｇｐ１２０のふ加で５ＣＤ４が観察された（列３及び４　）　ｏ 　コノため、ＨＩＶ　　ｇｐｉ２０ｊ：５ＣＤ４が結合したことを証明している 。

有効な治療効果であるためには、５ＣＤ４はＣＤ４陽性細胞のＩ（ＩＶ感染を阻 害しなければならない。この可能性は、ＨＪＶ感受性５ｕｐ−ＴＩ細胞（懸濁状 態で増殖する）が５ＣＤ４遺伝子産物を産生ずる付着細胞の皿に加えられた実験 で試験された。５ＣＤＪ源として、ＳＳＣ形質導入導入３１７産生細胞系は、そ の系が今回用いられた免疫沈降アッセイでほとんどの５ＣＤ４を一貫して産生じ たという観察に基づき選択された。これらの細胞は画商的パッケージ化ＳＳＣウ ィルスも産生することから、親Ｎ２ベクターを産生するＰＡ３１７細胞系がコン トロ゛−ルとして用いられる。−夜の同時培養期間後、双方の細胞混合物が２種 の独立したＪ（ＩＶ−１単離物で侵襲され、培養は１週間にわたり続けられた。

５ｕｐ−ＴＩ細胞はＩ）２１産生について評価することでウィルス複製に関して 調べられた（表１参照）。

ｓ　ＣＤ４産生細胞系と接触された細胞はコントロール形質導入細胞系と比較し た場合にＨＩＶ−１感染から有意に保護されており、これは試験されたＨＩＶ− １調製物のより低い感染性の証拠を示している（　ｐ＝０．０２６゜ＭａＩＤＩ Ｉ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｒａｎｋ　５ｕＩＩｌ）。

形質導入細胞の表面上における５ＣＤ４の一時的存在がこれらの細胞にＨＩＶ感 染の可能性を与える場合には、この抗ＨＩＶ系の使用の可能性をかなり制限して １２まうであろう。この潜在的な複雑さを処理するため、ＳＳＣ及び５ｃｓｘベ クターの双方がヒ）Ｋ５６２系（骨髄源のａＣＤ４陰性系）に形質導入するため 用いられた。これらの形質導入細胞群はＨＩＶで侵襲された。いずれのケースで も、ＨＩＶ感染は形質導入に５６２細胞では（ｐ２４産生で評価されるように） みられなかった。

骨髄形質導入及び移植の代わりに、細胞移植物がＴｈｏｍｐｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ 、、５ｃｉｅｎｃｅ。２４１　：５１！−６２（１９８ｇ）の開示に従Ｌ）ｓＣ Ｄ４の継続的産生に関しインビボ生産工場として用いることができる。このよう な移植物は血管形成誘導因子て処理されたコラーゲンスポンジの新面管形成後に ・インビボでうまく維持される。細胞移植物による５ＣＤ４のトランス産生はＨ ＩＶ感受性細胞を保護すると予想されるばかりでな・り、可溶性Ｈ！Ｖ　　ｇｐ １２０の細胞毒性作用も緩和する。この目的のため、５ＣＤ４ベクターは一次鎌 維芽細胞及び上皮細胞の双方に形質導入する上でうまく用いられた。

その操作はＣＤ４タンパク質の２０２ｔ）ｐ断片に関して記載されていたが、Ｃ Ｄ４レセプター領域を含んだ他の断片も用いてよいことが理解される。適切な断 片の選択は、その開示に関して当業者の技術的範囲内に属すると思われる。可溶 性ＣＤ４断片に直接関係し、た参考文献は、５ｉｉｔｈ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉ ｅｎｃｅ、２３８：１７０４−４０及びＮａｔｕｒｅ、３３１　ニアＢ−８６（ １９８８年１月１７日）でみられる論文である。

ＣＤ４レセプタ一部位領域に関した情報を提供するＴｅｆｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、 、５ｃｊｅｎｃｅ、２４１ニア１２−１８（１９８８）も参考にされる。（上記 で引用された参考文献のすべてが参考のため本明細書に組込まれる。） 当業者であれば予想できるように、発現ビヒクルに含まれるＤＮＡ又はＲＮＡ配 列はＣＤ４タンパク質に関するＤＮＡ又はＲＮＡ配列の全部分又はいずれか特定 の部分と同一である必要はないが、但し発現ビヒクル中に含まれる配列はＣＤ４ レセプターとして機能するタンパク質をコードしていなければならない。

好ましい態様によると発現ビヒクルはレトロウィルスベクターを含んでいるが（ 即ち、レトロウィルスベクターはしトロウィルス粒子内でパッケージ化されてい る）、本発明はこのような発現ビヒクルに限定されない。しかしながら、二の特 定の発現ビヒクルは当業界で公知の操作により動物細胞、特にヒト細胞をトラン スフェクトする上で非常に有効である（Ｋａｎｔｏｆ’ｆら、前掲参照）。

表１：ＨＩＶ−１感染力に関する感受性ＣＤ４’リンパ芽球細胞と５Ｃｆ）４産 生及びコントロール形質導入細胞系との同時培養効果。ＲＦ又はＭＮ　　ＨＩＶ −１ウイルスの２調製物の感染力は、平均Ｔ　ＣＩ　Ｄ　５ｏ　／ｌｔｒ　ｌ及 び幾何平均の標準誤差として以下で示されている。Ｓｕｐ　−Ｔ１細胞はＮ２形 質導入ＰＡ３１７細胞（ベクターコント凸−ル）又はＳＳＣ形質導入導入３１７ 　（ｓＣＤ４産生）のいずれかと同時培養された。独立した測定は記載のように ４回行われた。

ＨＩＶ　　　　　　同時培養　　　　　感染力ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　　　　Ｎ２形 質導入　　　１９７９±２８３１？Ｆ ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　　　　ＳＳＣ形質導入　　２００±　ＯＦ ＨＴＬＶ−ＩＩＩ　　　　Ｎ２形質導入　　　２８２８±５６６Ｎ ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ　　　　ＳＳＣ形質導入　　７０７±１４１−　　　　　ＭＮ 骨髄細胞は有効量の前記のような発現ビヒクルにより１０〜２０の感染多重度（ Ｍｏｌ）でトランスフェクションされ、塩水溶液のような生理学的に許容される キャリアで静脈内投与される。適切なキャリアの選択は当業者の範囲内に属する 考えられる。好ましい投与量範囲は患者体重ｋｇ当たり１０Ｂ−１０処理細胞で ある。前記のようにレトロウィルスベクターで処理された細胞の一部だけがＣＤ ４レセプターとして機能するタンパク質の機能性遺伝子で形質導入されるが、形 質導入細胞は望ましいＣＤ４レセプタータンパク質レベルを示すほど十分多い。

同様に、患者の繊維芽細胞はＰａｌｍｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ、８４：１ ０５５−５９（１９８７）；Ｇｒａｖｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡＳ、８４：１ ０５０−５４（１９８７）：及びＧｒａｖｅｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ｔｒａｎｓ、Ａ ｓ５ｏｃ、Ａｍ、Ｐｈｙｓ、、Ｖｏｌ、Ｃ，１０−２０で記載される操作により 形質導入及び投与してもよい。

可溶形のヒトＣＤ４タンパク質を発現するしｌ・ロウイルスベクターの組立てを 開始するためには、入手しろるＣＤ４遺伝子含有プラスミド及び普通ＳＶ４０ウ ィルスベース発現ベクターの双方が修正されねばならない。

−ヨークのコロンビア大学内外科医学部リチャード・アクセル（Ｒｌｃｈａｒｄ 　Ａｘｅｉ）の提供品〕を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｌ　 （７サチユーセツツ州ベバリーの二ニーイングランド・バイオ研究所）で切断し てＣＤ４遺伝子を放出させ、これをアガロースゲル電気泳動しかる後ガラスピー ズ〔製造業者により勧められる方法でカリフォルニア州うジョラ、ＢＩＯＩＯＩ のシーンクリーン（ＧｅｎｅＣＩ　ｅａｎ）製品を用いる〕結合／溶出での精製 により単離した。ＣＤ４断片をＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩ切断ブルースクリプトク ローニングベクター（カリフォルニア州うジョラのストラタジーン社）に（供給 業者ニューイングランド・バイオ研究所で勧められるようにＴ４　　ＤＮＡリガ ーゼを用いて）結合させた。

次いで結合生成物をコンピテントＤＨ５α細菌［メリーランド州ゲイザースバー グのベセスダ・リサーチ研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ ｓ））に組込んで形質転換させ、白色コロニーを単離し、適正なインサートサイ ズに関してスクリーニングして、プラスミドｐＣＤＷを得た。

ＣＤ４遺伝子に関して適切なプラスミドベース発現ベクターを産生ずるため、プ ラスミドＳＶ］、ｎｅｏ（メリーランド州ロックビルのアメリカンφタイプ・カ ルチャー・コレクションから得られる）をＨｉｎｄｌｌｌ＋Ｈｐａｌで切断し、 ｐＵｃ１３ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からの合成ポリリンカー配列をｌ） 　Ｓ　Ｖ　２　ｎ　ｅ　ｏのｎｅｏＲ遺伝子に代えて（Ｔ４ＤＮＡリガーゼによ り）挿入した。この新ベクターｐＳＶＰＬをＤＨ５α細菌（ベセスダ・リサーチ 研究所）に組込んで形質転換させ、コロニーをポリリンカーに独特な制限酵素部 位の存在に関してスクリーニングした。

ｐＳＶＰＬ発現ベクターをＳＶ４０初期領域プロモーターの５′側のＰｖｕ１１ 部位へのＸｈｏｌリンカ−にューイングランド・バイオ研究所から供給される試 薬及び条件）の挿入によって更に修正し、ｐｓＶＰＬＸを得た。

ここで引用されたすべての参考文献は参考のため本明細書に組込まれる。例中に おいて、他に指摘のないかぎり、制限酵素切断、結合、形質転換等はＭａｎｉａ ｔｉＳ、ｅｔａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌで記載されるように行われる。

例２： ｐＣＤＷ及びＩ）ＳＶＰＬＸプラスミドを例えば酵素Ｈｉ　ｎ　ｄｌｌｌ　＋Ｘ ｂ　ａ　Ｉ　　（二、−イングランド・バイオ研°究所）で切断【５、それらの ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で（シーンクリーン製品を用いて）単離した。

ｐＳＶＰＬＸベクターへのＣＤ４０断片の結合はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行 い、コロニーは色でスクリーニングし、例１のようにサイズに関し分析してｐＳ ＶＣＤＷを得たが、そのＳＶ４０ウィルス初期領域プロモーターは完全ＣＤ４０ 遺伝子産物を発現させるために用いられる。

例３： 可溶形のＣＤ４の産生を特別にデザインされたオリゴヌクレオチドアダプターの 使用により行い、変異形のＣＤ４遺伝子を得た。このアダプターは、ＣＤ４遺伝 子のＮｈｅ１部位に挿入された場合に、ＣＤ４タンパク質アミノ酸配列の正確な 未成熟終結を行うと共にＮｈｅ１部位を再生しかつ新規Ｈｐａ１部位も作成する 独特な性質を有している。用いられるオリゴヌクレオチドアダプター（（Ｍｉｄ ｌａｎｄ　ＣｅｒｔｉＮｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏ、）で合成）は、２種のリ ン酸化オリゴヌクレオチド：１）５’　ＣＴＡＧＣＴＴＡＧＡＧＴＧＡＧＴＴ　 ３°、２）　ＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧをアニーリングすることで産生じた。次 いでこの生成物はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＳＶＣＤＷのＮｈｅ１部位に結 合させた。次いで結合反応物をＨｐａｌで開裂させ、しかる後Ｘｈｏｌリンカ− （二ニーイングランド・バイオ研究所）を加えた。リンカ−反応を６５℃で１５ 分間加熱することにより終結させ、しかる後Ｘｈｏｌ制限エンドヌクレアーゼ（ 二ニーイングランド・バイオ研究所）による切断に付した。次いでこの反応生成 物をアガロースゲル電気泳動に付し、５Ｖ４０−ＣＤ４アダプタ一含有断片を単 離した（Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎ）。レトロウィルスベクターＮ２は、ＸｈｏＩで の切断及び子牛腸ホスファターゼ（インジアナ州インジアナポリスのベーリンガ ー・マンハイム）での処理により５Ｖ４０−ＣＤ４アダプタ一断片を受は入れる ように調製した。ＣＤ４発現カセットの結合は５：１のインサート断片対ベクタ ー比率で行った。次いでＣＤ４カセツトをＤＨ５αコンピテント細胞（ベセスダ ・リサーチ研究所）に組込んで形質転換させた。゛組立て物を方向についてスク リーニングするため制限エンドヌクレアーゼ切断で分析し、しかる後大規模に増 幅させた。ＳＶ４０ウィルスプロモーターがウィルスＬＴＲプロモーターと同方 向である組立て物はＳＳＣとされ、一方逆方向の組立て物は５ｃｓｘと呼ぶ。

例４： ＳＳＣベクターをＰＡ３１７細胞系（その細胞系はＭｌ　Ｉ　ｌｅｒら、前掲で 記載されている）中にパッケージ化して、可溶性ＣＤ４タンパク質を産生しうる ＰＡ３１７細胞を得る。

ベクター産生細胞系を、それがＳＳＣベクター含有レトロウィルス粒子及び最終 産物自体、即ち可溶性ＣＤ４を双方とも産生じているかどうか確認するために試 験した。トランスフェクションされたＰＡ３１７ベクター含有産生細胞系を１２ 時間３５−システィンで放射能標識し、しかる後細胞培地を集め、抗ＣＤ４モノ クローナル抗体（ＯＫＴ４ａ）との免疫沈降に付した。免疫複合体を（プロティ ンＡセファロースビーズで）単離し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付 した。図５はタンパク質ＭＷサイズマーカーが付記されたオートラジオグラムで ある。ＳＳＣ細胞系は大量の可溶性ＣＤ４タンパク質（ＣＤ４Ｓ）を産生じてい る。

ＰＡ３１７細胞は、前掲のＫａｎｔｏｆ’ｒらで記載された操作によりす゛ル骨 髄細胞を形質転換するために用いられる。

このような骨髄細胞はＣＤ４タンパク質を産生ずることができる。同操作はヒト 骨髄細胞を形質転換するために用いてもよい。

例５： 前記のように５ｃｓｘで形質転換されたＰＡ３１７細胞は、Ｅｇｌｉｔｉｓ、ｅ ｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０：１３９５−９８（１９８５）で記載され るようにマウス繊維芽細胞（ＳＶ−７２系）をトランスフェクトするために用い られる。その際Ｇ４１８で増殖しうる（したがって、機能性ｎｅｏＲ遺伝子を含 有する）細胞を放射能標識し、細胞培地を前記ベクター含有ＰＡ３１７細胞の試 験（例４）に関して記載されたように機能可溶性ＣＤ４遺伝子の存在に関して試 験するため免疫沈降に付した。図６はこのアッセイから得られたオートラジオグ ラムである（ｕｎｉｎｒ、　：非感染５Ｖ−Ｔ２細胞；！ｎｆ、：５ＣＳＸ感染 した選択感染５Ｖ−Ｔ２細胞）。感染繊維芽細胞は培地中に可溶性ＣＤ４タンパ ク質（ＣＤ４Ｓ）を分泌している。

ヒト繊維芽細胞を皮膚バイオプシーから得て、公知手段により５ｃｓｘベクター でトランスフェクトする。トランスフェクション後に細胞を外科的に皮下挿入さ れたセルロースパッドから放出させる［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、印刷中、１９８８年〕。繊維芽細胞１０６／ｋｇ患者体重の、 投与量が、この方法で投与される場合に適する。

↓ ↑ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）遵 平成　３　年　２　月　２１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．可溶性ＣＤ４レセプタータンパク質、その断片又はＣＤ４レセプタータンパ ク質アナログをコードして、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合にその 細胞で可溶性ＣＤ４レセプタータンパク質、その断片又はＣＤ４レセプタータン パク質アナログを発現させるＤＮＡ（ＲＮＡ）配列挿入物と、プロモーター配列 とを含むことを特徴とする、発現ベクター。 ２．ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列挿入物が可溶性ＣＤ４レセプタータンパク質又はその 断片をコードする、請求項１に記載の発現ベクター。 ３．ＳＳＣと命名される、請求項１に記載のベクタ４．ＳＣＳＸと命名される、 請求項１に記載のベクター。 ５．哺乳動物細胞内に請求項１記載のベクターを含むことを特徴とする、組成物 。 ６．キャリア生物内に請求項１記載のベクターを含むことを特徴とする、組成物 。 ７．キャリア生物が大腸菌である、請求項６に記載の組成物。 ８．リガンドが細胞上のＣＤ４レセプターと結合しないようにする方法であって 、 １）哺乳動物細胞内に請求項１記載のベクターをトランスフェクションし； ２）（トランスフェクションされた）細胞が得られたのと同種の哺乳動物に、ス テップ１で得られたトランスフェクション哺乳動物細胞を宿主細胞上のＣＤ４レ セプター部位へのリガンドの結合を阻止するために適した可溶性ＣＤ４を産生す る上で十分な量投与する；ステップからなることを特徴とする方法。 ９．請求項５に記載の細胞及び薬学上許容されるキャリアを含むことを特徴とす る、組成物。 １０．キャリアが固体担体である、請求項９に記載の組成物。 １１．担体が皮下挿入に適したパッドである、請求項１０に記載の組成物。 １２．キャリアが皮膚繊維芽細胞のバッチである、請求項９に記載の組成物。 １３．哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項８に記載の方法。 １４．リガンドがＨＩＶウイルス、ウイルス粒子又はウイルス産物である、請求 項１２に記載の方法。 １５．ステップ１で用いられるドナー細胞がトランスフェクション細胞の受容体 から得られた、請求項８に記載の方法。