JPH03504234A - 可溶性ヒトｃｄ４断片及びその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 可溶性ヒ１−ＣＤ４断片及びその使用 Ｔリンパ球のサプセッ）（１４９７３球と呼ばれる）の表面糖タンパク質である ＣＤ４（Ｔ４）分子は、クラスｎ（Ｉａ）ＭＨＣ認識に関与しており、クラスＩ ＩＭＨＣの１つ又はそれより多くの単形層性Ｃｒｎｏｎｏｍｏｒｐｈｉｃ）領域 に対する生理学的受容体であると思われる。ムール・ニス・（Ｍａｕｒ。

９８２）；ピディソン・ダブリュ（Ｂｉｄｄｉｓｏｎ、Ｗ）等、、ジャーナル− オブ。

エクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ）、　、　ｌ　５６　： 　ｌ　０６５−１０７６（１９８２）；ゲイ・ディ（Ｇａｙ、Ｄ）等、、ネイチ ａｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ）、　３２８：６２６−６２９（１９８７）。

ヒトＣＤ４は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）のｇｐ１２０エンベロープ糖 タンパク質に対する受容体でもあり、そして宿主細胞へのウィルスの侵入及び膜 融合のために必須であり、これらのことはウィルスの細胞間移動（ｃｅｌｌ−ｔ ｏ−ｃｅＨｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）及びウィルスの細胞変性効果に寄与して いる。クラララマン・ディ（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ、Ｄ）等、、サイエンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）、２２５＝５９−６３（１９８４）；ダルグレイシュｌｊ−イ・ジ ー（ＤａｌｇＩｅｉｓｈ、Ａ、Ｇ、）等２．ネイチヤー、１上２＝７６３−７６ ６（１９８４）；サラテントウ・キュー（Ｓａｔｔｅｎｔａｕ、Ｏ）等、、サイ エンス、２３４＝１１２０−］　１２３（１９８６）；マクドウガル・ジェイ・ ニス（ＭｃＤｏｕｇａｌ　、　Ｊ　、Ｓ）等、。

ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、、１３７：２９３７ −２９４４（１９８６）；マクドウガル・ジェイ・ニス等、、サイエンス、２３ １３８２−３８５（１９８６）；マトン・ビー・ジェイＣＭａｄｄｏｎ、　Ｐ、 Ｊ）等１．セル（Ｃｅｌ＋）、±１．３３８−３４８（１９８６）；ソドロスキ ー・ジェイ（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ　、　Ｊ　）等、、ネイチャー、３２２：４７０ −４７４（１９８６）；す７サンージエイ（Ｌｉｆｓｏｎ、Ｊ）等、、ネイチャ ー、３２３＝７２５−７２８（１９８６）。ＣＤ４の配列分析は、４つの免疫グ ロブリン関連ドメインを持った構造からの進化的起源を示唆した。クラークス・ ニス（Ｃｉａｒｋｓ。

Ｓ）等、、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンス、　、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ）、　、　８４　：　 １６４９−１６５３（１９８７）；リットマン・ディ・アール（Ｌｉ　ｔｔｍａ ｎ、Ｄ、Ｒ，）等、、ネイチャー、主ス互：４５３−４５５（１９８７）。ＨＩ Ｖｇｐ１２０の結合を媒介するのに２つのＮＨ，末端ドメインのみが必要である 。トララネツカ−・ニー（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ、Ａ）等、、ネイチャー、３３ 土：８４−８６（１９８８）；バーガー・イー・ニー（Ｂｅｒｇｅｒ、Ｅ、Ａ、 ）等、、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンス、ニー・ニス・ニー、８５：２３５７−２３６１（１９８８）；リチャー ドソン・エヌ・イー（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｎ、Ｅ、）等、、プロシーデイン ダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ニー・ニス・ニ ー、印刷中（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。

ＣＤ４−ｇｐ１２０相互作用の研究及びその相互作用を妨害又は抑制しようとす ること、又は生命を脅かすＨＩＶ感染の作用を遅くするか又は逆転させることが できる手段を提供しようとすることに、相当な努力が払われてきた。いくつかの グループは、可溶性ＣＤ４（Ｔ４）タンパク質の持つＨＩＶによる細胞の感染及 びその後の作用を妨害する能力について集中的に研究した。ハッセイ・アール・ イー（Ｈｕｓｓｅｙ、Ｒ，Ｅ、）等０．ネイ二ヱユ、ユニ土ニアｇ−８１（１９ ８８）；フィッシャー・アール・ニー（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒ，Ａ、）等１．ネイチ ヤー、３３土ニア６−７８（１９８８）；ディーシーケイ・シー（ＤｅｅｎＪ、 Ｃ−）等１．ネイチヤー、主１上：８２−８４（１９８８）；トララネツカ−・ ニー等、、ネイチャー、ユニ土：８４−８６（１９８８）。全循環１９７３球個 体数の６０−８０％を構成する１４９７３球（即ち、ヘルパー及びインデューサ ーＴりンパ球）のＨＩＶ惑染を防止する手段は、特にこのような細胞のＨＩＶ感 染によって免疫系が完全に崩壊するという事実に照らして見れば非常に価値があ るであろう。カラン・ジエイ（Ｃｕｒｒａｎ　、　Ｊ　）等、、サイエンス、２ ２旦：１３５２−１３５７（１９８５）；ワイス・アール（Ｗｅｉｓｓ、Ｒ，） 等、、ネイチャー、３２４：５７２−５７５（１９８６）。

本発明の開示 本発明は、ＨＩ　Ｖｇｐｌ　２　Ｑ工７ベロープタンパク質（ＨＩ　Ｖｇｐｌ　 ２０）に結合する可溶性ヒトＣＤ４（Ｔ４）断片、ＨＩＶｇｐ１２０．エンベロ ープタンパク質に結合する能力が改変されている（ａｌ　ｔｅｒｅｄ）可溶性ヒ トＣＤ４断片、このようなタイプのヒトＣＤ４断片をコードしているＤＮＡ。

ＨＩＶによる細胞の感染を妨害するのに可溶性ヒトＣＤ４断片を使用する方法、 可溶性ヒトＣＤ４断片のアミノ酸配列を修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）方法、及び可 溶性ヒトＣＤ４断片のＨＩＶｇｐ１２０に結合する能力を修飾又は改変する方法 に関する。（ＣＤ４とＴ４とは本明細書では相互に交換可能に使用される）。

可溶性ヒトＣＤ４断片は、ＣＤ４の疎水性トランスメンプラン領域を全然含んで いないか、又はこの断片の可溶化を妨害しない疎水性領域の一部（一般に６個の アミノ酸又はそれより少ないアミノ酸）しか含んでぃない。一般的分類又は区分 けとして、ＨＩＶｇｐ１２０と結合する能力のある可溶性ヒトＣＤ４断片は、生 物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片と呼ぶ。下記に説明するように、生物学的 に活性な可溶性ヒ）ＣＤ４断片は、アミノ酸配列が天然に存在するＣＤ４の対応 する部分とは幾分異なるように修飾することができる。ＨＩＶｇｐ１２０に結合 する能力のあるすべてのこのような断片（即ち、天然に存在するＣＤ４とアミノ 酸配列が対応している断片及び修飾されている（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）断片）は、 本明細書で使用した用語、生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片の範囲内に含 まれる。しかしながら、説明を分かりやすくするために、アミノ酸配列に関して 幾分修飾されている可溶性ＣＤ４断片は、生物学的に活性な修飾された可溶性Ｃ Ｄ４断片（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＣＤ４　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）と呼ぶ。ＨＩＶｇ ｐ１２０結合能力が変化したこれらの断片は改変された（ａｌｔｅｒｅｄ）ＨＩ Ｖｇｌ）１２０結合能力を持った修飾された可溶性ＣＤ４断片と呼ぶ。ＨＩＶｇ 結合能力が増加又は高められたこれらの場合に、このような断片は、高められた ＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持った生物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断 片と呼ぶことができる。反対に、結合能力が減少したこれらは、減少したＨＩＶ ｇｐ１２０結合能力を持った修飾された可溶性ＣＤ４断片と呼ぶことができる。

生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片は、幾つかの異なる方法で修飾すること ができる。可溶性ヒトＣＤ４のアミノ酸配列は、１）ｌ−ランケーションされる （けｕｎｃａｔｅｄ）か、２）アミノ酸配列の置換、アミノ酸配列からの欠失（ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）及び／又はアミノ酸配列への付加により改変されるか、又は トランケージ１ン及び改変の両方を受けることができる。

これらの３つのタイプ又は種類の断片は、それぞれ、トランケーションされてい る、改変されている及びトランケーション／改変されている、と呼ぶことができ る。

本発明の生物学的に活性な可溶性ＣＤ４断片は、ＨＩＶに結合する能力を有する 。故にそれらは、ＨＩＶによるヒトＴリンパ球の感染ヲ防止する能力及び、細胞 から細胞へとＨＩＶが移動する際に重要な役割を演じると考えられているヒトＴ リンパ球の融合細胞の形成を防止する能力も有している。

このような生物学的に活性な可溶性ＣＤ４断片は、診断、治療及び予防の目的に 使用することができる。例えば、そられは、生物学的試料（例えば血液、泳、唾 液、精液）中のＨＩ　ｖｇの存在又は不存在を決定するのに使用することができ 、従ってＨＩＶが試料中に存在しているがいないかを決定するのに使用すること ができる。更に、それらは、ＨＩＶ惑染個体を生体内で（例えば感染した個体に 投与することにより）処理することができる。それらは、予防に使用することも できる。即ち、それらは、ＨＩＶ感染の危険がある個体に投与することができる 。更に、それらは、例えば、ウィルスの導入に対するバリヤーとして使用される 材料（例えば、コンドーム、殺精子剤、下着、血液を採集、処理又は貯蔵するだ めの容器等）にコーティングすることにより、ＨＩＶによる感染を防止するのに 使用することができる。

改変されたＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持った修飾された可溶性ＣＤ４断片は、 診断、治療及び予防の目的に使用することができる。それらは、生物学的に活性 な可溶性ヒトＣＤ４断片の使用について上記した方法と同様にして使用すること ができる。

図面の簡単な説明 第１図は、可溶性ＣＤ４タンパク質の３７０個のアミノ酸配列（Ｔ４や、没呼ぶ ）をコードするＴ４　５ＥＣ１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｔ　４　、、、配 列と呼ぶ）である、ｃＤＮＡ及びコードされたＣＤ４タンパク質の修飾は、箱形 に囲った区域により示される。容箱は修飾がなされた位置のヌクレオチド三塩基 連鎖及びコードされたアミノ酸を表している。

第２図は、本発明の発現ベクターの構築の概略図である。

第３図は、本発明の生物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断片を製造する方 法の概略図である。

第４図は、ウィルスタンパク質複製に対する本発明の可溶性ＣＤ４断片の効果及 び対照タンパク質の効果を示すグラフである。

Ｍ５図は、本発明の可溶性ＣＤ４断片にょるＣＴＬエフェクター機能の抑制がな いことを示すグラフである。

第６図は、本発明の可溶性ＣＤ４断片による正常なヘルパー下リンパ球の増殖の 抑制がないことを示すグラフである。

第７図は、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＣＤ　４タンパク質及び組換えＣＤ４タンパ ク質の構造を示す略図である。

第７Ａ図は、第１図のｃＤＮＡ配列から導かれた天然のＣＤ４タンパク質構造の 表示である。括弧内の数字は４つの推定されている細胞外ドメインを示し、１６ ．８４．１３０．１５９．３０３及び３４５のＳｌｋシスティン残基の位置を示 す。Ｔｍはトランスメンプランヲ表シ、Ｃｔｙは細胞質領域を示す。８７８図は Ｔ４−、ｒタンパク質の略図である。第７Ｃ図は、Ｔ４．、ｓタンパク質の完全 なアミノ酸配列を表す。

第８図は、４つの免疫グロブリン状ドメイン、３つのジスルフィド結合及び２つ の潜在的グリコジル化部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ 　５ｉｔｅｓ）を示しているＣＤ４タンパク質Ｔ４−、Ｉの略図である。アミノ 酸の番号付けはハッセイ等、、ネイチャー、ｌｌ土ニア８−８１（１９８８）、 に従う。１６の突然変異の位置（表参照）は、線の下に示されている。三角形は 、最初の１８２個のアミノ酸のみを含むタンパク質を造り出すために特定部位突 然変異誘発（ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により導 入された停止コドンを示す。

第９図は、Ｔ４−＋及び、ＣＤ４構成物（ＣＤ４　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）’ｔ ’　トランス７エクシタンされた３″Ｓ−システィン標識Ｃｏ５−ＩＪＩ胞の上 澄液からのＣＤ４のトランケーションされた１８２アミノ酸バージヨンの抗ＣＤ ４免疫沈でん（ａｎｔｉ−ＣＤ４　ｉｎ＋＋ｎｕｎｏｐｒｅｄｉｐｉｔａｔｉｏ ｎ）及び抗ｇｐ１２０共沈の結果を示す。レーンｌは、Ｔ４□、含有プラスミド でトランスフェクションされモして抗Ｔ８（２１Ｔｈｙ２Ｄ３Ｘ対照）と免疫性 でんされたＣｏ５−１細胞からの上澄液の免疫性でんを表し、レーン２は、対照 抗Ｔ８抗体を使用した１８２アミノ酸トランケーシヨンによりトランスフェクシ ョンされたＣｏ５−１細胞からの上澄液の免疫性でんを表し、レーン３は、抗Ｃ Ｄ４抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）とのＴ４□１の免疫性でんを表し、レーン４は、 抗ＣＤ４とＴ４ｅ−１の１８２アミノ酸トランスフエクシヨンの免疫性でんを表 し、レーン５は、ｇｐ１２０の存在下に抗ｇｐ１２０（デュポン）と７４−１の 共沈を表し、レーン６は、ｇｐ１２０の不存在下に抗ｇｐ１２０とＴ４−＋の共 沈を表し、レーン７は、ｇｐ１２０の存在下に抗ｇｐ１２０とＴ４−、＋の１８ ２アミノ酸トランケーシヨンの共沈を表す。すべての試料は非還元的に実験され た。分子量マーカーは、ホスホリラーゼＢ（９７，４ＷＤ）、ウシ血清アルブミ ン（６９ＫＤ）、オバルブミン（４６ＫＤ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３ ０ＫＤ）、ラクトグロブリンＡ（１８，４ＫＤ）である。

第１（ｌは、Ｔ４−ｒ、Ｍ５、ＭＩＯ，Ｍ？及びＭ３でトランスフェクションさ れたＣｏ５−１細胞からの３１５−システィン標識上澄液の抗ＣＤ４免疫沈でん の結果を示す。沈でんはｇｐ１２０の存在下（＋）又は不存在下（−）に行なわ れた。

本発明の詳細な説明 本発明は、ＨＩＶｇｐ１２０に結合する可溶性ヒトＣＤ４断片、及び改変された ｇｐ１２０結合能力を持つ可溶性ヒトＣＤ４断片、可溶性ヒトｃＤ４断片をコー ドしているＤＮＡ、可溶性ヒトＣＤ４断片を製造する方法、及び細胞のＨＩＶ感 染を妨害するために本発明の可溶性ヒトｃＤ４断片を使用する方法に関する。特 に本発明は、アミノ酸配列が天然に存在するヒトＣＤ４の対応する領域の配列と 同じである可溶性ヒトＣＤ４断片、アミノ酸配列が天然に存在するヒトＣＤ４の 対応する領域の配列とは下記する如く異なるようにアミノ酸配列が修飾されてい る可溶性ヒトＣＤ４断片、結合能力が天然に存在するヒトＣＤ４又は対応するヒ トＣＤ４断片の結合能力とは異なる可溶性ヒトＣＤ４断片、及びこのような可溶 性ヒトＣＤ４断片をコードしているＤＮＡに関する。

本発明の可溶性ヒトＣＤ４断片は、天然に存在するＣＤ４の疎水性トランスメン プラン領域を全然含まないか又は断片の可溶化を妨げない程度に十分に短い（即 ち、一般に６個のアミノ酸又はそれより少ないアミノ酸）疏水性領域の一部を含 む。ＨＩＶｇｐ１２０に結合する能力のある可溶性ヒｌ−ＣＤ４断片は、本明細 書では、生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片と呼ぶ。生物学的に活性な可溶 性ヒトＣＤ４断片は、ＨＩＶｇｐ１２０に有効に結合することができる程度に十 分に長い（例えば１０個のアミノ酸又はそれより長いアミノ酸）。これらの断片 はヒトＣＤ４の対応する領域と完全な相同性を示す必要はない。むしろ、それら はＨＩＶｇｐ１２０に結合するのに十分な相同性を有するべきである。

更に本発明の生物学的に活性な可溶性ヒ）ＣＤ４断片は、ＨＩＶに感染していな いヒトＴリンパ球の機能又は増殖を妨げることなく　ＨＩ　ｖｇｐ１２０に結合 する結果として、抗ＨＩＶ作用を及ぼすことができる。即ち、本発明の生物学的 に活性な可溶性ヒ）ＣＤ４断片は、下記するとおり、高濃度ですらクラスＩＩＭ ＭＣ認識行為（即ち、ＣＴＬエフェクター機能）を抑制しないで且つクラス■指 向生理学的子細胞応答（Ｃ１ａｓｓ−Ｕ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏ ｇｉｃ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）に対して認められる程の影響を与 えないで、ＨＩＶによるヒトＴリンパ球の感染を防止しそしてＨＩＶエンベロー プで誘発される融合細胞形成（ＨＩＶ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓ ｙｎｃｔｉｕｍ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及びＨＩＶ複製を抑制することが示され た。

本明細書で使用した、用語、可溶性ヒトＣＤ４断片は、ＨＩＶｇｐ１２０に結合 することができる総ての可溶性ヒトＣＤ４断片（即ち、アミノ酸配列が天然に存 在するヒトＣＤ４の配列に対応している可溶性ヒトＣＤ４断片及びアミノ酸配列 の修飾がなされている可溶性ヒトＣＤ４断片）を包含する。アミノ酸配列が修飾 されている生物学的に活性な可溶性ヒ）ＣＤ４断片は、生物学的に活性な修飾さ れた可溶性ヒ）ＣＤ４断片と呼ぶ。ＨＩＶｇｐ１２０結合能力が変化した断片（ 結合能力が天然に存在するＣＤ４の対応する又は同等な部分の結合能力と異なる という結果を伴って）は、改変されたＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持つ修飾され た可溶性ヒトＣＤ４断片と呼ぶ。

本発明の生物学的に活性な修飾された可溶性ヒ１−ＣＤ４断片は、アミノ酸配列 が１）トランケーションされている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）か、２）ヒトＣＤ４ のアミノ酸配列からの欠失、ヒトＣＤ４のアミノ酸配列中の置換及び／又はアミ ノ酸配列への付加の結果として改変されているか、又はアミノ酸配列がトランケ ーションされており、且つトランケーションされた形態又は部分が、対応する部 分又はセグメント中に存在するアミノ酸配列からの欠失、アミノ酸配列中の置換 及び／又はアミノ酸配列への付加を伴っている、という点で、可溶性ヒトＣＤ４ の断片とは（例えば第１図又は第７Ｃ図に示された配列とは）異なる。

改変されたＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持つ修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片は 、得られるＣＤ４断片が、対応する（改変されていない）可溶性ヒ）ＣＤ４断片 のＨＩＶｇｐ１２０結合能力又は親和性より小さいＨＩＶｇｐ１２０結合能力又 は親和性を有するか又は対応する（改変されていない）ヒトＣＤ４断片のＨＩＶ ｇｐ１２０結合能力又は親和性より大きいＨＩＶｇｐ１２０結合能力又は親和性 を有するように、可溶性ヒトＣＤ４のアミノ酸配列が選ばれた部位（１つ又は複 数の）で改変されている修飾された可溶性ヒ）ＣＤ４断片である。このような断 片は、それぞれ、減少したＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持った修飾された可溶性 ヒ１−ＣＤ４断片及び高められたＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持った修飾された 可溶性ヒトＣＤ４断片と呼ぶ。

特に、改変されたＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持ったＣＤ４断片は、改変された ｇｐ１２０結合能力を持ったＣＤ４断片のアミノ酸配列が、ｇｐ１２０結合のた めに重要であることが見出だされた部位（１つ又は複数）で可溶性ＣＤ４タンパ ク質のアミノ酸配列と異なっているという点で可溶性ヒトＣＤ４断片とは異なっ ている。現在までのところ、ａｐ１２０結合のだめに重要な部位が同定されてい なかったので、可溶性ＣＤ４断片のｇｐ１２０結合能力を選択的に改変すること は可能ではなかった。このような重要な部位は、オリゴヌクレオチド指向突然変 異誘発（ｏｌ　ｉｇｏｎｕｃｌｅ。

ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕＬａｇｅｎｅｓｉｓ）により同定され、そし てヒトＣＤ４タンノくり質のドメインＩ及びドメイン■に存在することが見出だ された。このことは、ＨＩＶｇｐ１２０結合部位が複雑でありそして両方のＮＨ ，末端ドメイン（ＮＨ，−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ）に関与している ことを示唆する。

第１図に示されているように、Ｔ４ｃＤＮＡの修飾を行いそしてコードされたＣ Ｄ４断片を発現させた。得られるＣＤ４断片は、試験管内で改変されたａｐ１２ ０結合能力を持つことが示された。これらの場合に、ａｐ１２０結合能力は阻害 された（ａｂｒｏｇａｔｅｄ）。これらの同じ部位及びまだ同定されていない他 の部位での修飾を同様にして行ってｇｐ１２０結合能力を高め及びｇｐ１２０結 合能力を減少又は小さくする゛ことができる（しかしなくはならない）。

以下は、本発明の可溶性ヒ）ＣＤ４断片を製造する方法の簡単な説明であり、こ れらは後に実施例で詳細に説明する。

生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片の製造可溶性ヒ１−ＣＤ４断片を製造す るのに使用されるグラスミドの構築は第２図を参照して最も良く説明することが できる。第２図に示されているように、トランケーションされたＣＤ４遺伝子を 含むプラスミドベクターＰＡｃ３７３／Ｔ４．、、をプラスミドｐＡｃ３７３と ｐＳＰ６５−Ｔ４とから構築した。実施例１に詳細に説明されているように、分 泌された形態のＣＤ４分子は、ｐＳＰ６５−７４に含まれているＣＤ４ｃＤＮＡ インサートを放出することにより生産された。ＣＤ４ｃＤＮＡインサートをＮｃ ｉ　Ｉで消化してｔ、１７ｋｂの断片を生成させる。この断片はＡＴＧ開始コド ンが欠如しておりそしてトランスメンプラン領域の直ぐ前で終わる。この１．１ ７ｋｂ断片を合成リンカ−に連結して、成熟細胞外セグメントの３７１残基（Ｔ ４　、、＋）又は３７０残基（’ｒ　４、．１）が保存されるであろうという結 果を得た。

組換えプラスミドを生成させ、２つ（ｐＡｃ３７３／Ｔ４．３．及びｐＡｃ３７ ３／Ｔ　４　、、、と名付ける）を詳細に特徴付けた。トランケーションされた ＣＤ４ｃＤＮＡ構築物を公知の方法を使用して、相同性組換えにより、スミス（ Ｓｍｉｔｈ）等、、グロシーデインダス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイ１７７、、、：Ｌ　−−！ス−ニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ　、。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）、、８２：８４０４−８４０８（１９８５）。バキュロウィルス （Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）のストックを使用して、公に入手可能なスポドプテ ラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ＦｒｕｇｉｐｅｒｄａＸ　Ｓ　Ｆ　 ９　）細胞に感染させた。次いで、Ｔ４．、ｃＤＮＡ又は野性哉ＡｃＮＰＶを含 む組換えバキュロウィルスで感染させたＳＦ９細胞をＪＩＳ−メチオニン中で培 養しそして５ＤＳ−ＰＡＧＥ、統いてオートラジオグラフィーにより検査した。

Ｔ４−−＋ポリペプチドは、ＴＡａｗ１組換えバキュロウィルスで感染させたＳ Ｆ９細胞の主な分泌生成物であることが示された。Ｔ４−＝を組換えバキュロウ ィルス感染から５４時間後に得られたＳＦ９細胞からの上澄液の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析での主たる３１１５標識タンノくり質ノ（ンドは、還°元条件下に５０Ｋ Ｄバンドであった。ＣＤ４物質は、野性ｆｉＡｃＮＰＶ感染細胞の上澄液から沈 でんせず、全上澄液中に検出されなかった。

２つの代表的なＴ４．ヨ、調製物の各々から、５１ＫＤの分子量を持つ還元条件 下に移動するタンパク質が得られた・異なる移動度（Ｔ４・・１タンパク質につ いて観察された移動度とは異なる）は予想されなかつことであり、Ｔ４．１は、 ポリヘトリン遺伝子（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ）との融合から導かれた １７の追加のカルボキシ末端アミノ酸を含有していることを示した。

実施例１に記載の如く、５０ＫＤＴ４．ヨ、及び５１ＫＤＴ４．、□タンパク質 はＣＤ４遺伝子の生産物であることが更に分析により証明された。

バキュロウィルス系で生産された可溶性ＣＤ４タンパク質は、実施例１に記載の 如く２つの相互共沈実験（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔ ｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）を用いて、ＨＩＶｇｐ１２０外側糖タンパク 質に結合することが示された。Ｔ４．、＋タンパク質によるＣＤ４＋８４リンパ 球へのＨＩ　Ｖｇｐ１２０結合の抑制も又、”ｒ　４　、、、及びＴ４．、！タ ンパク質（実施例１）によるＨＩＶ複製の抑制及びＨＩＶエンベロープ誘発融合 細胞の抑制と同じく証明された。前記しそして実施例１で詳細に説明したように 、これらの効果は、高濃度ですらクラスＩ［ＭＭＣ認識行為に対して認められる 程の影響を与えないで（即ち、それらはＣＴＬエフェクター機能を抑制しない） ＣＤ４断片により生じることが示された。更に、可溶性ＣＤ４断片は、クラス■ 指向性生理学的Ｔ細胞応答に対して認められる程の影響を及ぼさないことが示さ れた。それらは、Ｔ４＋テタヌストキソイド特異的クラスＩ［ＭＭＣ拘束ヘルパ ーＴ細胞クロりンＣＴＴ７（実施例１）の増殖に対して影響を及ぼさないことが 示された。

Ｔ４．、タンパク質又は他のそれらの誘導ペプチド断片とＨＩＶｇｐ１２０との 特異的な物理的相互作用を更に分析するために他の方法を使用した。この方法は 実施例２に詳細に説明されている。簡単に言うと、この方法は、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅの寸法分別（ｓｉｚｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、続いてポリビニリデ ンジフルオライド膜へのＴ４−、ｚタンパク質のエレクトロブロッティング（ｅ ｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を使用した。この研究の結果（実施例２参照） は、非還元下に電気泳動させる場合の、５０ＫＤＭＷにおける単一バンドのＴ４ −２タンパク質は、ＨＩＶｇｐ１２０に強く結合することができることを示した 。反対に、還元又は還元及びアミドメチル化した場合には同じ量のＴ４−２’は ＨＩＶｇｐ１２０に結合しなかった。Ｔ４　、、。

タンパク質について同じ結果が得られた。

精製したＴ　４、．５ンバク質の酵素による断片への切断（ｆｒａｇｍｅｎｔａ ｔｉｏｎ）も行った。パパイン消化の結果は、ＨＩＶｇｐ１２０に結合する２８ ＫＤの移動度を持つ断片の存在を示した。それは元のＴ４．ヨ、タンパク質と同 じ有効性でＨ’ｌ　Ｖｇｐｌ　２０に結合すること及びＴ４．、＋タンパク質の アミノ末端領域から誘導されたそのままの（ｉｎｔａｃｔ）ポリペプチド鎖であ ることが示された。実施例２に記載の如＜、ＨＩＶｇｐ１２０結合断片の性質を 更に明確にするために、トリプシンを使用して７４−２の断片に切断する同様な 実験も行った。

生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片の修飾成熟ＣＤ４タンパク質（Ｔ４ＳＥ Ｃ１ｃＤＮＡ）の３７０のアミノ酸をコードするｃＤＮＡ配列を第１図に示し、 コードされたＣＤ４タンパク質の推論されたアミノ酸配列も示す。第１図に示さ れたようにＴ４ｃＤＮＡを修飾し、コードされた可溶性ＣＤ４断片を発現させた 。得られるＣＤ４断片は、溶液中のＨＩＶｇｐ１２０と可溶性ＣＤ４タンパク質 との複合体を検出することができることにより証明されるとおり、試験管内でＨ ＩＶｇｐ１２０に結合することが示された。

前記しそして実施例１に説明したように１第１図のヌクレオチド配列によりフー ドされた生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片は、ＨＩＶｇｐ１２Ｑに結合し 、そしてＨＩＶに感染していないとトＴリンノく球の機能又は増殖を妨げないで Ｔ細胞のＨＩＶ感染を妨げる。

簡単に言うと、生物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断片は、下記のパラグ ラフに記載されそして第３図に概略図で示されている如くして製造される。この ような断片の製造の詳細な説明は実施例３で行う。

可溶性ＣＤ４断片をコードするＤＮＡは、このような断片をコードしているｃＤ ＮＡを含むベクターからそれを切り出すなどの組換えＤＮＡ法を使用すること、 又は可溶性ＣＤ４断片をコードしているＤＮＡを公知の方法を使用して機械的及 び／又は化学的に合成することにより製造される。

いずれの場合も、得られるＤＮＡは、試験管内でＨＩＶのａｐ１２０エンベロー プタンパク質に結合する能力のある可溶性ＣＤ４断片をコードしており、この可 溶性ＣＤ４断片は、ＣＤ４の疎水性トランスメンプラン領域を全然含んでいない か、又はこの断片の可溶化を妨げない程度に十分に小さいその領域の一部（一般 に６個のアミノ酸又はそれより少ない）を含む。更に、ＣＤ４断片は、ＨＩＶｇ ｐ１２０エンベロープタンパク質に有効に結合するのに十分に長い（例えば、１ ０個又はそれより多くのアミノ酸）。

ＣＤ４断片をコードしているｃＤＮＡ又はＤＮＡを使用して、その後の突然変異 誘発のためのテンプレートを製造する。下記するとおり、これは、Ｍ１３などの 一本鎖バタテリオファージクローニングベヒクルを使用して行うことができる。

これにより、可溶性ＣＤ４断片をコードしているＤＮＡの二本鎖の１つのみに対 して相同な一本鎖ＤＮＡが生成される。得られる一本鎖ＤＮＡは、下記の如く、 生物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断片を生成させるためのテンプレート として使用される。

オリゴヌクレオチドを、それらの配列が可溶性ＣＤ４断片の生産のために後に使 用されるＤＮＡのヌクレオチド配列に組み込まれるとき、コードされたＣＤ４タ ンパク質の変化をもたらす（第１図のヌクレオチド配列によりコードされたＣＤ ４タンパク質とは異なる）塩基変更部（１つ又は複数）を含むように、製造され る。このようなオリゴヌクレオチドは、標準的方法により製造される。塩基変更 部（１つ又は複数）を有するオリゴヌクレオチドは、突然変異誘発オリゴヌクレ オチド又は突然変異体オリゴヌクレオチド（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ　ｏｒ　ｍ ｕｔａｎｔ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）と呼ぶ。

このようにして製造された突然変異体オリゴヌクレオチドを、前述の如くして製 造されたテンプレートにハイブリダイズさせて（例えばキナーゼ処理することに より）テンプレート−突然変異体オリゴヌクレオチド複合体を生成させる。この 複合体は突然変異体プライマー／テンプレート（ｍｕｔａｎｔ　ｐｒｉｍｅｒ／ ｌｅｍｐｌａｔｅ）と呼ぶ。この突然変異体プライマー／テンプレートは、周知 の方法を使用して、ＤＮＡの第２の鎖の製造に使用される。例えば、第２ＤＮＡ 鎖の合成は、ｄｃＴＰ−３の存在下にＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片により 行なわれる。ティラー・ジエイ・ダブリュ（Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ、Ｗ、）等、、ヌ クレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ）、上３：８７４９−８７６４Ｃ１９８５）；ティラー・ジェイ・ダブリュ 等９．ヌクレイツクアシッド・リサーチ、１３：９７６４−８７８５（１９８５ ）；ナカヤマ、ケイ及びエフ・エクスタイン（Ｎａｋａｙａｍａ、に、　ａｎｄ 　Ｆ、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、ヌクレイツクアシッド・リサーチ、上Ａ：９６７ ９−９６９８（１９８６）。得られるＤＮＡの鎖は、Ｔ４ｃＤＮＡのヌクレオチ ド配列中に修飾（１つ又は複数）を含んでおり（即ち、第１図に示されたヌクレ オチド配列と異なる）、突然変異体調と呼ぶことにする。

復製されなかった一本鎖ＤＮＡを除去し、二本鎖ＤＮＡを選ばれた制限酵素（例 えばホスホロチオニー１４）ＮＡを切断せず、従ってｄＣＴＰ−３又は突然変異 体調を含む新規なりＮＡ鎖を切断しないＮｅ１Ｉ）でニックする。ニックされた 修飾されていないＤＮＡを、エキソヌクレアーゼｍなどの他の酵素による消化に より除去する。得られるギャップのあるＤＮＡを再重合して、そして突然変異体 調は再重合のためのテングレートとして働くので、突然変異又は修飾が画調にフ ビーされる。

一度生成されると、画調が可溶性ＣＤ４断片のアミノ酸配列中の対応する修飾を コードしている突然変異又は修飾を含んでいるところの二本鎖ＤＮＡは、コンピ テントバクテリア宿主などのコンピテント宿主細胞に導入される（形質転換によ り）。得られるプラークを生育させ、それらの中に含まれているＤＮＡを公知の 方法を用いて単離し、配列を決定して、突然変異の存在を確認する。

このようにして製造された突然変異されたＤＮＡは、それを含むＭ１３ベクター から切り出され、ＣＤＭ３などの適当な発現ベクターに導入され、Ｃｏｓ細胞な どの適当な宿主細胞中にトランスフェクションされ、この細胞中で発現される。

アルファオ・エイ・及びビー・シード（Ａｌｕｆｆ。、Ａ、　ａｎｄ　Ｂ、５ｅ ｅｄ）、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−、オブ・サイ エンシズ、ニー・ニス・ニー、８４：３３６５−３３６９（１９８７）。結果と して、突然変異体ＣＤ４タンパク質を公知の方法を使用してアッセイすることが できる。ベクター−インサート連結混合物を公に入手可能なＥ、ｃｏｌｉ　　Ｍ Ｃ１０６１Ｐ３などのコンピテント宿主バクテリアに導入し、放射標識されたＴ ４ＤＮＡをしようして突然変異体Ｔ４ｃＤＮＡｓを含むＣＤＭ８を同定する。

突然変異体Ｔ４ｃＤＮＡを含むベクターによりトランスフェクションされたＣｏ ｓ細胞における、ＨＩＶ結合能力のある修飾された可溶性ＣＤ４断片（即ち、生 物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断片）の生産は、下記する公知の方法を 使用してアッセイされる。

この方法の結果として、生物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断片をコード している二本ｇＤＮＡが生成され、コードされたＣＤ４断片は発現され、ＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合するその能力は評価される。

本発明の生物学的に活性な修飾された可溶性ＣＤ４断片を製造するための別の方 法は、ペプチド合成を用いてこのようなアミノ酸配列を持ったペプチド又はポリ ペプチドを製造することである。

本発明のこの点は、ここでは特定の修飾について説明する。これは実施例３に詳 細に述べられており、その製造は第３図に示されている。しかしながら、これは 限定することを意味するものではなく、公知の方法と本発明の方法を使用して他 の修飾がなされうろことは理解されるべきである。

Ｔ４ｃＤＮＡ及び突然変異誘発のためのテンプレート第１図に示されたように、 制限酵素ＢａｍＨＩを使用して、プラスミドベクターｐＡｃ３７３／Ｔ４．−ｒ からＴ４．、ｃＤＮＡを切り出した。断片の末端をＤＮＡポリメラーゼＩでプラ ント末端とし、断片をＸｂａＩリンカ−に連結させた。連結された断片をＸｂａ Ｉで切断し、過剰のりンカーを除去し、リンカ−の結合した断片をＸｂａ切断Ｍ １３（複製形）に連結した。Ｍｌ３は、サイズが約６．５ｋｂの閉じた環状ＤＮ Ａゲノムを有する一本鎖バクテリオファージクローニングベヒクルである。メッ シング、ジエイ・及びジエイ・ビエラ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｊ、　 Ｖｉｅｒａ）、グｚ　不（Ｇｅｎｅ）、１旦：２６９−２７６（１９８２）。こ のベヒクルはこのような情況において有用なりローニックベヒクルである。何故 ならば、これに感染した細胞はクローニングされたＤＮＡの二本鎖の１つのみに 対して相同なそしてテンプレートとして使用することができる一本鎖ＤＮＡを含 むファージ粒子を放出するからである。得られる連結混合物をコンピテントＴＧ Ｉ宿主バクテリア中に形質転換し、宿主バクテリアを平板培養した。Ｔ４オリゴ ヌクレオチドを使用してプラークをスクリーニングした。

センスオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションするプラークを選び、生育 させて突然変異誘発のための一本鎖ＭＩ３テンプレートを生成突然変異誘発は、 アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により市販されておりそしてエクスタイン（ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）の方法に基づいている（実施例３）プロトコルにより行った 。

組み込まれたとき、コードされているＣＤ４タンパク質中にアミノ酸の変更を生 じさせる（第１図のｃＤＮＡタンパク質によりコードされたＣＤ４タンパク質と は異なる）塩基変更部を配列の中に含んでいるオリゴヌクレオチドを標準的方法 を使用して生成させた。この場合に、ＣＤ４分子のトランケーションがアミノ酸 ＃■８３の位置に導入された。普通のＴ４ｃＤＮＡ配列は、Ｇ−ＡＡＧ−ＧＣＣ −工且且−ＡＧＣ−ＡＴＡ−Ｇ（第１図参照）である。配列５’Ｇ−ＡＡＧ−Ｇ ＣＣ−工ΔΔ−ＡＧＣ−ＡＴＡ−Ｇを持ったオリゴヌクレオチドを合成した。２ つの配列の差はアンダーラインを施しである。普通のＴ４ｃＤＮＡのＴＣＣによ りフードされたセリンは停止コドン（ＴＡＡ）に修飾されており、コードされた 修飾されたタンパク質はこの点で終わっている（末端三塩基連鎖がＧＣＣであり 、末端アミノ酸がアラニンであるｃＤＮＡ断片を生じる）。

二本鎖ＤＮＡの製造 修飾されたオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、モしてｄＣＴＰｏｅＳの存在 下にＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片によるＤＮＡの第２の鎖の合成のための テンプレートとして働＜Ｍｌ　３Ｔ４テンプレートにハイブリダイゼーションさ せた。ティラー・ジェイ・ダブリュ（Ｔａｙｌｏｒ、Ｊ。

ヌクレイツクアシッド・リサーチ、−口−：９７６４−８７８５（１９８５）： ナカヤマ、ケイ及びエフ・エクスタイン（Ｎａｋａｙａｍａ、に、　ａｎｄ　Ｆ 、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、ヌクレイツクアシッド・リサーチ、■：９６７９−９ ６９８Ｃ１９８６）。これにより普通のＴ４ｃＤＮＡヌクレオチド配列（即ち第 １図に示された配列）の修飾を含むＤＮＡの鎖（第２鎖）が生成された。この修 飾された鎖を突然変異体調（ｍｕｔａｎｔ　５ｔｒａｎｄ）と呼ぶ。複製されな かった一本ｉ１１［ＤＮ、Ａを除去し、二本鎖ＤＮＡを制限酵素Ｎｃｉ　Ｉでニ ックした。

ＮｃｉｌはホスホロチオエートＤＮＡを切断しないので、新しい鎖はｄｃＴＰ− ５を含んでおり、突然変異部はニックされなかった。ニックされた、修飾されな かったＤＮＡは、他の酵素（エキソヌクレアーゼ■）による消化により除去され た。

このギヤングのあるＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下にＤＮＡポリメラー ゼエを使用して再重合した。突然変異体鎖がテンプレートとして作用したので、 突然変異又は修飾は両鏡にコピーされた。得られる二本ＭＤＮＡを形質転換によ りコンピテントＴＧＩに導入した。マンデル・エム及びニー・ヒガ（Ｍａｎｄｅ ｌ、　Ｍ、　　ａｎｄ　Ａ、　Ｈｉｇａ）、ジャーナル・オブφモレキュラー・ バイオロジー（Ｊｏｒｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ ）、５３：１５４（１９７０］。誘導されたプラークを生育させ、−末鎖の複製 形態ＤＮＡ５を単離した。このＤＮＡの配列を決定して突然変異の存在を確認し ｔ；。

突然変異したＤＮＡ（上記のように、修飾されたオリゴヌクレオチドを使用する ＤＮＡ合成の結果として導入された突然変異を含むＤＮＡ）を、複製形態のＤＮ ＡからＸｂａにより切り出し、Ｘｂａにより切断されているベクターＣＤＭ８に 連結した。このＣＤＭ８ベクターを、トランスフェクションによりＣｏｓ細胞中 で発現させる。Ｃｏｓ細胞はシミアンウィルス（ｓｉｍｉａｎ　ｖｉｒｕｓ）４ ０（ＳＶ４０）ＤＮＡにより形質転換されたサル腎臓細胞系統であり、このシミ アンウィルス４０（ＳＶ４０）ＤＮＡは、機能的初期遺伝子領域を含んでおり、 従って構成的ｊ：５Ｖ４０大Ｔ抗原を大曳抗原が、ウィルスＤＮＡ複製の欠陥の ある複製起点（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｏｒｉｇｉｎ）を有している。グルラマン ・ワイ（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ、）等、、セル（Ｃｅｌｌ）、ベクターをＣｏｓ細 胞中にトランスフェクションし、この細胞中で発現すせ、かくして突然変異体Ｃ Ｄ４タンパク質をアッセイすることを可能とする。ベクター−インサート連結混 合物をコンピテントＭＣ１０６］、Ｐ３宿主バクテリアに導入し、突然変異体Ｔ ４ｃＤＮＡを含むＣ０Ｍ８を放射標識したＴ４ＤＮＡにハイブリダイゼーション させることにより同定した。アウスベル・エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ、Ｍ 、）等（編者）、カレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（ Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ）、グリーン・パブリック・アソシエーテズ（Ｇｒｅｅｒ＋Ｐｕｂｌｉｓｈ ｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）、１．４．９頁（１９８８）。シード・ビー及 び３３６９（１９８７）。少量調製Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ　ＤＮ Ａ５）の制限酵素分析を使用して、’ＣＤＭ８ベクター中のインサートの正しい 位置を決定した。

修飾された可溶性ＣＤ４断片のＨＩＶ結合能力の決定突然変異体Ｔ４ｃＤＮＡを 含むＣＤＭ８ベクターでトランスフェクションされたＣｏｓ細胞を、下記節に簡 単に述べられそして例示に詳細に述べられているように、ＨＩＶに結合する能力 のある修飾された可溶性ＣＤ４タンパク質の生産についてアッセイした。

突然変異体Ｔ４ｃＤＮＡ含有ＣＤＭ８ベクターでトランス７エクシ３ンされたＣ ｏ５Ｊｌ［ｌ胞を処理して透析された上澄液を生成させ、この上澄液を、非特異 的結合を最少とするためにセファロース支持体に結合した対照ウサギ抗Ｔ細胞受 容体１ｇＧで予め清掃した。

この予め清掃した上澄液を、セファロース支持体に結合したモノクローナル抗Ｃ Ｄ４抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ？）と免疫法でんさせた。１９Ｔｈｙ５Ｄ７は、ｇｐ １２０の結合についてＨＩＶと競合するＴ４４エピトープ位に対する抗体である 。かくして、上澄液の成分の１９７ｈｙ５Ｄ７への結合は、ＨＩＶに結合する能 力のある成分が上澄液中に存在していることを示唆する。

このようにした製造された修飾された可溶性ＣＤ４断片のＨＩＶ外側ｇｐ１２０ 糖タンパク質に結合する能力は、直接下記の如くして決定することができる。

最適レベルの組換え分泌ＣＤ４タンパク質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　５ｅＣｒ ｅｔｅｄＣＤ４　ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むことが決定された標識されそして透析 されたＣｏｓ上澄液を共沈の検査のために採取する。例えば、６７ｎｇのｇｐ１ ２０（ＰＢＳｌｏ、１％ＢＳＡ中６７ｐｇ／ｍＱでｌμＩ２）をＣｏｓ上澄液０ ．５ｍＱに加えることができる。対照として、上澄液０−５ｍＱの第２アリクオ ートにはなにも加えない。３７℃で２時間インキュベーションしｊ；後、５００ ｎｇのモノクローナル抗ｇｐ１２０を雨上澄液に加え、統いてセファロース４Ｂ に結合したウサギ抗マウスＩｇＧＣ１０μｇ）を加える。次いで試料を１００μ ｇの冷ＰＢＳで２回洗浄し、非還元性ＳＤＳ試料緩衝液（３０μＱ）で溶離する 。アリフォートを１２．５％非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥで試験し、続いてオートラ ジオグラフィーで試験する。Ｃｏｓ系で生産されたＴ４□、タンパク質（修飾さ れたＴ４ＤＮＡによりコードされているタンパク質）は、ａｐ１２０の存在下に 抗ｇｐ１２０抗体と容易に共沈することができる。ＣＤ４タンパク質（Ｔ　４　 、、ｌ）に対するウサギ異種抗血清も又、モノクローナルＣＤ４エピトープがも はや存在していない修飾されたＣＤ４生成物の同定に利用できる。かくして、こ れは、ｇｐ１２０結合物質の不存在下ですらＣＤ４関連タンパク質がＣｏｓ中で 翻訳されていることを確かめることを可能とする。Ｃｏｓ中で生成されたＴ４． ３．タンパク質とｇｐ１２０との共沈は、抗ｇｐ１２０抗体＋ウサギ抗マウスＩ ｇの存在下に容易に検出することができる。共沈した生成物は、オートラジオグ ラフィー後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で５０ＫＤバンドにあるであろう。ｇｐ１２ ０の不存在下では同等な３ｆｉＳ−システィン標識”ｒ４．、、バンドが検出さ れないという事実は、この反応の特異性を証明する。

上記の如くして製造された修飾された可溶性ＣＤ４タンパク質は、アミノ＃１８ ３までのＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列（第１図に示されたように）を含む。

このＨＩＶへの結合能力、従ってウィルスによる細胞の感染を妨げる能力の他に 、このトランケーションされた可溶性ＣＤ４タンパク質は、Ｔ　Ｊ　ｔ　ｘ　ｌ 中に存在するグリコジル化部位に欠けており、従って免疫原性が少ないはずであ る。更に、第１図のヌクレオチド配列によりコードされた成熟ＣＤ４タンパク質 中に存在する末端アミノ酸（ヒスチジン）は、本発明の生物学的に活性な修飾さ れた可溶性ヒトＣＤ４断片には存在しない。それは天然のＣＤ４分子中にも存在 しない。このようにして製造されたＣＤ４断片にはグリコジル化部位は存在しな いので、このタイプの断片は、バクテリア宿主中で発現させることができる。

アミノ酸残基１−１８２（第１図に示されたような）を有するＣＤ４タンパク質 の免疫法でんは、トランスフェクションされたＣｏｓ上澄液からの１９Ｔｈｙ５ Ｄ７免疫沈でん物の５ＤＳ−ＰＡＧＥでの約１９ＫＤのバンドを同定する。ａｐ １２０及び抗ｇｐ１２０抗体との共沈の検査で同じバンドが同定される。

前述の如く、アミノ酸１８３でのタンパク質のトランケーションにつぃて前記し た如くして製造することができるＣＤ４タンパク質ノ多くノ可能な修飾（例えば 、アミノ酸配列の変更、トランケーション）がある。

これらの修飾のいくつかは前記に説明した。追加の修飾は、修飾されたＤＮＡが 修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片を生じるように、ＣＤ４をコードしているＤＮ Ａ内の他の部位で行うことができる。生物学的活性（例えば、ＨＩＶｇｐ１２０ に結合する能力及び細胞のＨＩＶ感染を妨げる能力）は本明細書に記載の如くし て評価することができる。

例えば、種々のアミノ酸のところでトランケーションを行うことができる。１つ の場合には、アミノ酸３６９後のＴ４ｏ＋のトランケーション（即ち、カルボキ シ末端ヒスチジンの除去）を、停止コドンの挿入（８１図参照）により同様にし て行うことができる。得られるトランケーションされた形態はＨＩＶ結合能力を 保持していると予想するのは合理的である。更に、このような修飾された形態は 、第１図のｃ　Ｄ　Ｎ　ＡによりコードされたＣＤ４タンパク質中に存在してい て天然分子中には存在しないヒスチジンに欠けているいう利点を有する。

他の方法は、フードされたタンパク質の１つ又はそれより多くのドメインを含む 断片が得られるような方法で、生物学的に活性な可溶性ＣＤ４断片を製造するこ とである。

１つ又はそれより多くのドメインが存在している本発明の断片の製造は、例えば 、ＨＩＶとＣＤ４との結合には少なくとも最初の２つのドメイン（第７図参照） が重要である故に、興味深い。即ち、ＣＤ４（Ｔ４）の外側セグメントは、比較 的高い親和性で主ＨＩ　Ｖフートタンパク質（ａｐ１２０）に結合することによ り、ＨＩＶに対するＴ細胞受容体として機能することが知られている。

しかしながら、ｇｐ１２０に結合するＣＤ４分子の領域はまだ明確にされていな い。仮定された生理学的ＣＤ４リガンドであるクラスＩ［ＭＨＣ分子の不変領域 にＣＤ４の同じセグメントが結合するのか又はＣＤ４の異なるセグメントが結合 するのかは知られていない。モイエル・ニス（Ｍメン・ダブリュ（Ｂｉｄｄｉｓ ｏｎ、Ｗ）等、、ジャーナルメオブ・エキスペリメン分析は、４つの免疫グロブ リン関連ドメイン（第１Ａ図）を持った構造からの進化的起源を示唆した。これ らのドメインの２つ（最初の２つ）は、ＨＩＶｇｐ１２０の結合に関与している 。ドメインｌと名付けたＮＨ，末端ＣＤ４ドメイン（アミノ酸１−９２）は、Ｉ ｇ軽鎖可変領域に対する大部分の構造的相同性（アミノ酸レベルで約３２％）を 担っている。１４の不変残基の内８つが、Ｔ４のドメインｌとＶにドメインとの 間に保存されている。マトン・ビー（Ｍａｄｄｏｎ、Ｐ）等０．肚、４２：９３ （１９８５］。

ＣＤ４配列のドメイン１の第１システインと第２のシスティン（アミノ酸１６及 び８４；第７Ａ図及び第７Ｂ図参照）は、６７個のアミノ酸により分離されてお り、これは１ｇ７アミリーの構成員に類似した位置と間隔である。ヒツジ及びマ ウスＣＤ４に対する類似性により、ヒトＣＤＪ中のこれらのシスティンも又Ｖド メインの保存された鋼内ジスルフィド結合特性を形成する。更に、第２の構造分 析は、ＣＤ４ドメインｌ内の７つのβ鎖の存在を示唆している。鋼内ジスルフィ ドによりブリッジされたシスティンは、仮想的ドメイン２（アミノ酸１２０乃至 １５１）の境界を形成しており、それらのまわりには成る短い１ｇ状配列のスト レッチがクラスターされている。対照的に、ドメイン３にはシスティンは見出だ されないが、ドメイン３はポリＩｇ受容体との配列整合により相同性を担ってい る。

免疫グロブリンＶ状ドメインを含むＣＤ４のＮＨ，末端領域は、ｇｐ１２０相互 作用に必要であることが示された。対照的Ｉこ、２つの潜在的Ｎ−グリコジル化 部位を含む分子のカルボキシ末端半部は必要であるようには見えない。

例えば、位置１２８のバリンコドン（第１図のＧＴＧ）後のＴＡＡ終結コドンの 挿入は、ドメイン］Ｔ４．．ｌ構成物の生成をもたらす。ドメインｌ　Ｔ　４　 、、Ｉ構成物及び部分ドメイン２突然変異体は、ＴＡＧ終結コドンが第４システ イン後に挿入される場合に得られ、これはアミノ酸１６２（第１図）の後のトラ ンケーションを生じる。これは、）ＩＩＶ結合能力のある修飾された可溶性ＣＤ ４断片を生じさせ、そして細胞系統に構築物を導入するための改良された能力の 故に、製造／生産を容易にするであろう。

同様にして、ドメイン１．２及び部分ドメイン３構成物の製造を行うことができ る。この場合に、アミノ酸位置２４３（第１図参照）のグルタミンをコードして いる三塩基連鎖は、ＴＡＧ終結コドンに変えられる。

これは、ｔＪｃ４システィンの後の終結により得られるタンパク質について前記 した利点と同じ利点を有する修飾された可溶性ＣＤ４タンパク質を生成させる。

位置２７１及び３００のアスパラギン及びＮ−結合グリコシル化部位（Ｎ−１ｉ ｎｋｅｄ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　５ｉｔｅｓ）をアスバレートに転化す るのに、本明細書に述べた方法を適当に修正して使用することができる。これ１ よ、同じ構成物（ｃｏｎｓｔｒｎｃｔｓ）又は２つの別々の構成物（各々２つの 修飾の１つを含む）において行うことができる。いずれの場合にも、指示された 位置の２つのコドンが修飾される。アミノ酸２７１のコドンの場合はＧＡＣに、 アミノ酸３００のコドンの場合はＧＡＴに修飾される。この修飾されたタンパク 質も又ＨＩＶに結合し、そしてグリコジル化部位はもはや存在していないので、 このような部位を含む断片よりも免疫原性が少ないという利点を有する。

成熟ＣＤ４タンパク質の追加の修飾は、所望に応じて同様に行うことができ、次 いで本明細書に記載の手段によってＨＩＶに結合する能力を有することが示され た。追加の構成物（追加の修飾された可溶性ＣＤ４断片をコードしているＤＮＡ ）の発現は、例えば、バキュロウィルス（例えばオートグラ７ア・カリフォルニ カ）、中国ハムスター卵巣（ＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒＸ　ＣＨＯ）細胞又 はＥ、ｃｏｌｉで行なわれる。

バキュロウィルスで生産する場合には、これは下記の如くして且つ行なわれ、ハ ツセイ等及びスミス等により述べられた方法と同様にして行なわれる。この教示 は傍熱により本明細書での説明に代える。／％ツセイ・アール・イー等、ネイチ ャー、３３１ニア８−８１（１９８８）；スミス、ジー等、、プロシーデインダ ス・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、ニー・ニス・ニ ー、８２：８４０４−８４０８（１９８５）。

Ｔ４．＆＋配列のプラスミドベクターからオートグラ７ア・カリ７オル二力核多 角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）ゲノム−の移行は、スミス等１．（１９８５）グ ロシーデインダス・オグ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンズ・ ニー・ニス・ニー、８２：８４０４−８４０８゜４ｉｔｇのｐＡｃ３７３／Ｔ４ ．、＋ＤＮＡと１２ｇの精製したＡｃＮＰＶ　　ＤＮＡとのリン酸力ルンウム沈 でんによる、公に入手可能なスホムロプテラ。

フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓ　Ｆ　９　 ）細胞へのコトランス７エクションは、移行ベクターの組換え配列とＡｃＮＰＶ のポリヘトリン遺伝子間の相同性組換えを生じさせる。組換えＡｃＮＰＶは、も はや感染細胞中に封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎｓ）を形成しない不活性化された ポリヘトリン遺伝子を含んでおり、かくして感染細胞と非感染細胞を識別できる 手段を提供する。プラーク精製のために、２ＸＩＯ’個のＳＦ９細胞をアッセイ の２４時間前に１００ｍＭベト９皿に接種することができる。最終培地（ブレー スのインセクト培地（Ｇｒａｃｅ’　ｓ　１ｎｓｅｃｔ　ｍｅｄｉｕｍ）にニー ヨーク、グランドアイランド、ギブコ社）、ＴＣイーストレート（ＴＣｙｅａｓ ｔｏｌａｔｅ）０．３３％、ラクトアルブミン加水分解物０．３３％、２ｍＭ補 充グルタミン及びｌＯ％ＦＣ３（ユタ州、ローガン、サイクロン社）を含むゲン タマイシン５０μｇ／ｍＱを使用して、ウィルス上澄液の１０倍希釈物を調製し た。各プレートにウィルス（例えば、１ｍ１２，１０−”乃至１Ｏ−７希釈物） 十最終培地２ｒ１２を接種する。２時間インキュページ苫ンの後、接種物を取り 出し、最終培地中の１．５％ジ−プラークアガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　 ａｇａｒｏｓｅ）（メイン州、ロックランド、ＦＭＣバイオプロダクツ社（ＦＭ ＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））　１０　ｍＱで置き換える。プレートを２７℃で ４−６日間のアガロース固化の後湿った雰囲気に移す。

トランスフェクション上澄液のプラークアッセイは、感染細胞間の明白な形態学 的差を示す。封入体ポジティブである感染細胞は野性型ＡｃＮＰＶを含んでおり 、封入体ネガティブである感染細胞は組換えＣＤ４ウイルスを含んでいる。封入 体ネガティブプラークを同定し、選択し、更ニフラークを精製した。推定ＣＤ４ 組換えウィルスに感染した細胞力らのＤＮＡは、３２Ｐ標識ＣＤ４ｃＤＮＡプロ ーブとハイブリダイゼーションしてＣＤ４配列の存在を証明する。

Ｔ４゜ポリペプチドの製造は下記の如くして行う。２４ウエルのナンクプレート （Ｎｕｎｃ　ｐｌａｔｅｓ）（カリフォルニア州、サウザンドオークス、インタ ーラボ社）にウェル毎にＳＦ９細胞（６Ｘ１０’個の細胞／ウェル）を２７°Ｃ で２時間接種し、次いで付着ＳＦ９細胞に最終培地０．２ｍ４中のｌＯのＭｏｌ で２時間ウィルスに感染させる。次いで接種物を除去し、細胞を０．５ｍ１２の 新しい培地で２７℃で４８時間培養する。次いで付着細胞を、血清とメチオニン の欠如したブレースの培地０．５ｒ＋１で２回洗浄する。続いて、同じ培地０． ５ｍ４中で１時間培養する。付着細胞を、１回洗浄し、次いで６７ｕＣｉ”Ｓメ チオニンにニーイングランドヌクレアー、ボストン、ＭＡ　　１１３４ｃｉ／ナ ノモル）を含む血清及びメチオニンを含まないブレースの培地で６時間培養する 。培養上澄液を回収し、１０分間マイクロフユージしくｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）、 アジ化ナトリウム０．５％と冷メチオニンＩＯＩＩＩＭを含むＰＢＳに対して４ ℃で透析する。細胞をウェルから取り出し、ブレースの培地で４℃で２回洗浄し くｌ　ＯＯＯｒｐｍで５分間ツルバール（Ｓｏｒｖａｌ　１）ＲＴ　６０００で 遠心分離により）、最後に、１％のトリトンＸ−１００，０−１５ＭＮａｃｌ及 び下記するようなプロテアーゼ抑制剤の混合物を含有するＲＩＰＡ緩衝液の添加 により４℃で３０分間溶解する（Ｉｙｓｅ）。溶解物をｌＯ分間マイクロフユー ジし、培養上澄液に用いた方法と同じ方法を使用して４℃で透析する。

溶解物と培養上澄液の両者をアフィゲル−１０ビーズ（Ａｆｆｉｇｅｌ−１０ｂ ｅａｄｓ）に結合したモノクローナル抗ＣＤ４抗体（１９Ｔｈｙ５　Ｄ　７Ｘモ ノクロ一ナル抗体５ｍｇ／ｍ１２ゲル）との４℃で１６時間の免疫性でんに付す 。

免疫性でんの後、ビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ 緩衝液、ｐＨ２，０でビーズを処理することにより、結合した物質を溶離する。

溶離物及び溶解物又は培養上澄液の全試料を、２−メルカプトエタノールを含む ＳＤＳ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）に従う １２．５％ミニスラブゲル（ｍｉｎｉ−ｓｌａｂ−ｇａυ中で電気泳動にかける 。レムリ、ネイチャー、２２７：６８０−６８５（１９７０）。次いで、ゲルを 固定し、乾燥し、コダックＭＡＲ−５フィルムを使用してオートラジオグラフィ ーにかける。

ＩのＭｏｌで５Ｆ９Ｊｉｌｉｌ胞を感染させそして最終培地中でｌＸｌ０’個Ｊ ａｌＪａｌ／ｍρで４日間培養することにより、高力価のウィルスストックを発 生させる。これらのストックは、タンパク質の製造のためにＳＦ９細胞を感染さ せるのに使用する。タンパク質の大規模製造の場合には、ＳＦ９ｍ胞を最終培地 中で２ａの撹拌培養７ラスコで生育させる。細胞を回収し、ｌ０ＸＩＯ＆個の細 胞／ｍＱの濃度で、１５のＭｏｌで（高力価ウィルスストックを使用して）感染 させる。

細胞を次いでベレットとし、培地中にｌＸｌ０’／ｍ１２で再懸濁させ、撹拌培 養フラスコで２７°Ｃで３日間培養する。この時点で、培養物を遠心分離して細 胞を除去することにより上澄液を集める。

大規模精製の場合には、感染ＳＦ９細胞培養上澄液は、ツルバールビー４０００ ロータで８００　ｒｐｍで、４℃で６時間細胞を遠心分離することにより回収さ れる。次いで培養上澄液を、ロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチン、及び キモスタチンから成るプロテアーゼ抑制剤の混合物を０−５１ｇ／ｍＱの最終濃 度となるように、大豆トリプシン抑制を０．０２μｇ　／　ｍ　Ｑの最終濃度と なるように及びフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を１．２５ ｍＭとなるように添加し、続いて１ＭＮａＯＨの滴下による添加によりｐＨを６ ．８に調節することによりプロテアーゼ抑制に付す。次いでこの試料を、ツルバ ールＧＳＡロータで８０００　ｒｐｍで４°Ｃで２５分間の遠心分離により清澄 化し、３０ｍ＋２／時間の流速でポンプで、２ｍＱの予め清浄化された免疫吸着 剤カラム、アフィゲル−１０に結合した２１Ｔｈｙ２Ｄ３モノクロ一ナル抗体（ 抗Ｔ８）（バイオラッド）、統いて、直列に配置されたモノクローナル抗体７． ５゜ｇ／ｍＱゲルの濃度の７フイゲルーｌＯに結合した抗ＣＤ４モノクローナル 抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）の７ｍＱカラムに通す。モノクローナル抗体は、慣用 の方法により製造される。次いで抗ＣＤ４カラムを３０ｍＱの１０ｍＭトリス− ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６，３、続いて１５ｍＱの０．１Ｍグリシン−ＭＣＩ、ｐＨ ５，０で洗浄する。結合したＣＤ４ポリペプチドは、洗浄しｔ；抗ＣＤ４カラム にＯ，１Ｍグリシン−ＭＣＩ、ｐＨ２，０をポンプで通すことにより溶離し、溶 離液の０−８ｍ（２の画分を、０，１５ｍｆｆの１Ｍトリス−ＭＣＩ、　ｐＨ７ ，５が入っている管に集める。全カラム分別工程中、溶離物吸着は、イベントマ ーカー（ｅｖｅｎｔ　ｍａｒｋｅｒ）を９Ｍしたユビコード（Ｕｂｉｃｏｒｄ） 　２　（Ｌ　Ｋ　Ｂ　、ゲイザースブルグ、メリーランド州）により２８０ｎｍ で監視する。タンパク質を含む中和したｐＨ２，ｏ溶離物の画分をプールし、Ｙ Ｍ−５膜を備えた撹拌槽（アミコン、モデル３）での遠心分離により濃縮する。

典型的には、精製したＴ４−ポリペプチドの収率は、約ｌμｇ／ｍＱ感染したＳ Ｆ９培養上澄液である。１２ｇのタンパク質濃縮物を含有するアリフォート（２ ８０ｎｍにおけるｌＯＤ単位＝ｌｍｇ／ｍＱと仮定する）を１２，５％ＳＤＳポ リアクリルアミドスラブゲル中テ、統いてクーマシーブルーで染色することによ り純度を検査する。

このようにして製造されたポリペプチドを精製しそして公知の方法を使用して同 定して、説明した如く細胞に導入された修飾されたＣ　Ｄ　４　（ＤＮＡにより コードされているポリペプチドであることを確認することＨｒＶｇｐ１２０の結 合に重要なヒトＣＤ４上の領域又は部位を下記の如くして同定し、重要部位の同 定に基づいて、改変されたＨＩＶｇｐ１２０結合能力を持った可溶性ヒトＣＤ４ 残基を下記の如くして、特に実施例４及び５に記載の如くして製造する。

ａｐ１２０結合に重要なヒトＣＤ４のアミノ酸残基の同定不ズミＣＤ４の細胞外 セグメントは、アミノ酸（ａ、　ａ、　）レベルでその０１２０には結合しない 。マクルーレ・エム・オー（ＭｃＣｌｕｒｅ、Ｍ、Ｏ，）等、ネイチャー、３３ ０：４８７−４８９（１９８７）。これらの差は、ｇｐ１２０結合に重要なヒト ＣＤ４のこれらの残基を正確に規定するのに使用された。アミノ酸位置２７−１ ６７のヒトＣＤ４残基によるすべての非保存ネズミの置換を行った。このために 、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発（ｏｉｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄ ｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、ｌ−４個のアミノ酸置 換を含む１６の個々の突然変異体ヒトＣＤ４分子の各々を造り出した。ヒトＣＤ ４の対応する位置に３個という少ないアミノ酸を４人すると、ｇｐ１２０に結合 できないＣＤ４断片が生じた。これらの重要な残基は、ＣＤ４のドメインエとド メイン■に位置していることが示され、従って、ａｐ１２０結合部位は複雑であ り、両方のＮＨ，末端ドメインが関与している。Ｖ　ペンス・ジョーンズホモダ イマー（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）、ＲＥＩ、の三次元座 標を使用するモデル化の研究は、ドメインＩの部位をＣ″β鎖に局限する。かく してドメイン■は、超可変部に類似したループから離れている。

ＨＩＶｇｐ１２０結合に関与するＣＤ４構造の残基は、Ｃｏ５−１細胞発現系及 びＴ４．、ｒと呼ばれるアンカーマイナスＣＤ４セグメント（ａｎｃｈｏｒ−ｍ ｉｎｕｓ　ＣＤ４　ｓｅｇｍｅｎｔ）をコードしているｃＤＮＡの使用により特 徴付けられる。ハッセイ・アール・イー等、ネイチャー、３３↓ニア８−８１（ １９８８）。３７０個のアミノ酸Ｔ４　、、、タンパク質（第１図）は、ＣＤ４ 細胞外セグメントの３７２のＮＨ，末端アミノ酸のうち３６９個とＣ０ＯＨ末端 ヒスチジンを含む。第８図に示されたように、これらの構造は、３つの鋼内ジス ルフィド結合ドメイン（ｔｈｒｅｅ　１ｎｔｒａｃｈａｉｎ　ｄｉｓｕｌｆｉｄ ｅ　ｂ。

ｎｄｅｄ　ｄｏｍａｉｎｓ）（ドメインは、システィンの間にありそしてシステ ィンのいずれかの側に２０個のアミノ酸を含む残基として定義される）と、シス ティン残基が欠如しているがその対応物と同様に免疫グロブリン状である１つの ドメイン（ＩＩＩ）とから成る。クラーク・ニス（Ｃ１ａｒｋ、Ｓ）等、、！ロ シーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ・ニ ー・ニス・ニー、８４：１６４９−１６５３（１９８７）。ナノモル濃度の７４ −１は、ａｐ１２０発現細胞に結合することにより、ｇｐ１２０−１−ランスメ ンプランＣＤ４相互作用、融合細胞の形成及びＨＩＶ感染を抑制する。ハッセイ ・アール・イー等、ネイチャー、３３１ニア８−８１（１９８８）。

実施例４に記載の如く、Ｔ４，３．構成物は、ベクターＣＤＭ３にサブクローニ ングされモしてＣｏ５−１細胞にトランスフェクションされる。

６９（１９８７）。代謝により標識されたトランスフェクションされた細胞から の上澄液を抗ＣＤ４モノクローナル抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）との免疫法でんに より試験した。得られる沈でんを５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。

結果は、トランスフェクションされたＣｏ５−１細胞上澄液中に５０ＫＤＣＤ４ 由来の分子が存在することを示した（第９図、レーン３）。同じ分子を、上澄液 をｇｐ１２０と予備インキュベーションした後Ｃｏ５−１上澄液から抗ｇｐ１２ ０モノクローナル抗体と共沈させる（第９図、レーン５）。

これらの反応は、ｌ）無関係な抗体（抗Ｔ８）はＴ４　、、、を沈でんさせない （第９図、レーン１）ことと、２）ＣＤ４バンドはｇｐ１２０の不存在下では抗 ｇｐ１２０抗体で検出されない（第９図、レーン６）ことにより証明されるよう に、Ｔ４．、、に対して特異的である。

ＣＤ４ＤＮＡ）ランケーション又はタンパク質分解消化を用いる上記の先行の研 究は、ｇｐ１２０相互作用に重要な残基は、もっばらドメインＩ及び／又はドメ イン■にあることを証明した。トララネツカ−・ニー（リチャードソン、エヌ・ イー等、プロシーデインダス・オプ・ザ・す中）。同様に、アミノ酸残基１８２ の後でトランケーションされた（ｃＤＮＡ配列に停止コドンを挿入することによ り）Ｔ４　ｓｘ＋タンパク質のＣｏ５−１細胞由来の生成物は、抗ＣＤ４抗体に より２０ＫＤタンパク質として沈でんされそしてｇｐ１２０に結合する（第９図 、レーン４及び７）。対照的に、アミノ酸１１０でトランケーションされたｃＤ ＮＡの発現（ドメイン■のみを含む）はｇｐ１２０結合タンパク質を生じさせな かった。（実施例４）。これらのデータは、■と■の両方のドメインがＨＩＶｇ ｐ１２０結合には必要であることを示唆する。

故に、アミノ酸残基２６と１６７の間のＣＤ４の最初の２つのドメイン内のすべ ての非保存性マウス−ヒト種の差を包含する３５アミノ酸置換を造り出すことに よりＣＤ４−ａｐ１２０相互作用の分析をさらに行った。ＮＨ，末端ＣＤ４アミ ノ酸はここでは考慮しながかった。その理由は、ＮＨ２末端合成ペプチドはミリ モル濃度ですらＨＩＶｇｐ１２０結合を阻止しなかったからである。各置換につ いて、ヒト配列のアミノ酸をネズミＣＤ４配列の対応する部分に見出だされるア ミノ酸で置き換えた。

マトン畢ピー・ジェー等、プロシーデインダス・オプ壷ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・ニー、８４：９１５５−９１５９（１ ９８７）。不ズミＣＤ４配列はｇｐ１２０に結合せず、従って、成るネズミ置換 はヒトＣＤ４−ｇｐ１２０相互作用を妨げるであろうと予想された。表１に示さ れたように、実施例４に記載のように、標準特定部位突然変異誘発プロトコルに １５のオリゴヌクレオチドを使用して、各々１〜４の置換を含むヒトＣＤ４分子 の１６の異なるバージョンを製造した。これらの置換の位置は表１に記載されて おり、第８図に略図でマツプされている。すべての１６のＣＤ４突然変異体は、 抗ＣＤ４モノクローナル抗体との免疫流でんにより及び抗ｇｐ１２０抗体とのｇ ｐ１２０共沈によりＣ０８−１細胞へのトランスフェクション後にアンセイされ Ｉこ。

＋　　　　　　Φ　　　　　　＋　　　　　　　　　　　　　＋＋＋＝　　）脣 　ｇ　：：　　：：；　　５Ｈ脣　認＝＝　　詔ｃ６　　　　　　■　■　Ｃ６ 弓　ｄ　−Ｃ６■　Ｃ６弓　　　−■　■ ａ　このオリゴヌクレオチドを使用する突然変異誘発から２つの突然変異体を回 収した。

ｂ　抗ｃＤ４モノクローナル０ＫＴ４Ａとの免疫性でんについて試験すると、Ｍ １４も又負であった。

’　　ａｐ１２０との共沈により極めてかすかな５０ＫＤバンド（Ｔ４より　１ ０倍強度が小さい）が観察された。

突然変異誘発、免疫性でん及び共沈は第１図についての説明文に記載されている 。

元のＴ４　ｓｔｌ及び４つの代表的な突然変異体の免疫性でんを第１θ図（パネ ルａ）に示す。Ｔ４　ａｉｌの他にも、突然変異体Ｍ５、ＭＩＯ，Ｍ７及びＭ３ を抗ＣＤ４モノクローナル抗体１９Ｔｈｙ５Ｄ７と反応させる。表１に示されて いるように、１６の突然変異体のうち１５の突然変異体は抗ＣＤ４抗体と反応す る。突然変異体Ｍ１４のみが反応せず、それは０ＫＴ４Ａとも非反応性であった 。この０ＫＴ４Ａは異なるＣＤ４エピトープを指向する第２のモノクローナル抗 体である。

１６の突然変異体のうち１３種は共沈アッセイにより判定して、Ｔ４ｅｔｌと同 等な方法でｇｐ１２０に結合した。第１Ｏ図（パネルｂ）は、Ｔ４−１、Ｍ５、 ＭＩＯ及びＭ７はｇｐ１２０の存在下に抗ｇｐ１２０によりすべて共沈されるこ とを示す。全体として、ｇｐ１２０との共沈においては２−３倍の実験変動が観 察された（第１Ｏ図パネルｂのＴ４．１１対Ｍ５）。しかしながら、ｇｐ１２０ 結合性ＣＤ４タンパク質のうち、すべての実験（最少２−３の別々のトランスフ ェクションを使用する）において正の信号が観測された。対照的に、Ｍ３は抗Ｃ Ｄ４抗体により認識されるけれども、ａｐ１２０には結合しない（第１０図、パ ネルｂ）。更に、Ｍ９（表１）は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体がＴ４−１と同 一のサイズ及び同一の強度のバンドを免疫性でんするけれども、実質的に減少し たｇｐ１２０結合能力を有する。Ｍ３は、ヒトＣＤ４ドメインＩにおいて位置４ ８，５０及び５１で３つのアミノ酸置換を含む。これらの変更の１つ又はそれよ り多くの変更は、ＣＤ４のＨＩＶｇｐ１２０への結合能力を妨げる。Ｍ９は、Ｃ Ｄ４のドメイン■において位置１２１−１２３に３つのアミノ酸置換を含む。か くして、ＣＤ４ドメインＩ又はドメイン■における少数の残基の変更が、ＨＩＶ ｇｐ１２０結合の妨げを生じさせる。

更に、Ｍ１４は、ｇｐ１２０への減少した結合を示す（表１）。Ｍ１４は又、試 験した２つの抗ＣＤ４モノクローナル抗体にも結合しなかった。

Ｍ１４の３つの置換（位置１５５．１５６及び１５８の）がともかくもこの突然 変異体ＣＤ４タンパク質の発現を減少させるという可能性を除外することはでき ない。おそらく、これらの置換は、ａｐ１２０結合部位及び２つのモノクローナ ル抗体により認識されるエピトープの両方を破壊したのであろう。これは試験管 内でＭ１４から転写されたＲＮＡはＴ４、．１転写ＲＮＡと同一の結果を与える 故、多分ＣＤ４タンパク質の三次元構造の一般的な崩壊によるものであろう。

ＣＤ４ドメイン■のｇｐ１２０結合への寄与は、タンパク質分解切断分析、マイ クロシーケンシング及び特異的ＣＤ４−ａｐ１２０結合アッセイを伴うバキュロ ウィルス系で生産したＴ４　、、、ポリペプチドの研究で以前に認められていた 。リチャードソン・エフ・イー等、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・ニー。リチャードツンと共同 研究者は、トリプシン切断によるリシン７２でのペプチド結合の崩壊は、ＣＤ４ の他のドメインに何等の検出可能な改変を誘発することなく、ＣＤ４−ｇｐｌ　 ２０相互作用を破壊したことを示した。更に、ＣＤ４分子中の鋼内ジスルフィド 結合の還元も又高い親和性のａｐ１２０結合を妨げ、それにより、ａｐ１２０に 対する結合部位は複雑であり且つ安定化されたＣＤ４構造に依存していることを 強く示唆する。上記の研究において導入されたドメインエ及びドメイン■突然変 異がｇｐ１２０接触残基それ自体に影響を与えるのか、又は接触残基のまわりの 三次構造に影響を与えるのかどうかは現時点では結論されていない。ＣＤ４−ｇ ｐ１２０タンパク質問相互作用の７ツトプリント法による分析又はＣＤ４−ａｐ １２０コクリスタル（ｃｏｃｒｙｓｔａｌｓ）の分析が、上記の突然変異の効果 を決定するのに必要であろう。それにもかかわらず、アミノ酸残基２３−５６を 含む合成ペプチドのｌ　Ｏ−’Ｍでの融合細胞形成を抑制する能力は、残基４８ ．５０及び／又は５１がｇｐ１２０結合部位に寄与するという見解を支持するか も知れない。ジャムソン・ビー・ニー（Ｊａｍｓｏｎ、Ｂ、Ａ、）等、サイエン ス、２４０：１３３５−１３３９（１９８８）。

ＣＤ４のドメイン■とに軽鎖可変（Ｖ）領域との間に８つの残基が保存されてい る。マトン・ビー等、−ｋｔｋ、４２：９３−１０４１９８５）。更に、ＣＤ４ のドメインＩの第１のシスティンと第２のシスティン（アミノ酸１６及び８４） は、６７個のアミノ酸により分離されており、これは、免疫グロブリンファミリ ーのメンバーの位置及び間隔と同様な位置及び間隔である。更に、二次構造の予 想は、ＣＤ４ドメインＩに８つのに鎖が存在していることを示唆する。これらの Ｉｇに対する相同性に照らして、ＣＤ４ドメインエを■、ベンス・ジョーンズの ホモダイマー、ＲＥＩの既知の三次元座標に基づいてモデル化した。このモデル の使用は、表面露出されるべきドメインエにおける３つのトリプシン開裂部位の 各ヶの正確な予想をもたらし、かくして、ＣＤ４モデルの斐当性を支持する。リ チャードソン・エフ・イー等、プロシーデインダス・オブ・ザ、ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシズメニー・ニス・ニー。

故に、ＣＤ４のアミノ酸残基４８，５０及び５１におけるＭ３突然変異の相対的 位置を決定することは興味深い。

ａｐ１２０結合を妨げる突然変異したＣＤ４残基に対応するＲＥＩホモダイマー のσ炭素骨格における残基の領域を決定した。この領域は、２つのシートを接続 するＶドメインに独特なＣ“鎖に対応する。ウィリアムス・ニー・エフ等、アニ ュアルＯレビュウ・イン・イムノロジー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、 、６：３８１　４０５（１９８８）。ＲＥＩとＣＤ４の整合にはこのセグメント におけるギャップが必要であり、かくして、ＣＤ４σ炭素骨格はこの領域の同じ 経路に従うことを示唆することを意味しない。それにも拘わらず、ＣＤ４配列は ループから外れ（ｌｏｏｐ　　ｏｕｔ）しそして溶媒露出されるらしい。更に、 この部位は、ＲＥＩホモダイマーの超可変ループに対応する３つのセグメントか ら離れていることに留意されるべはである。

上記の分析に基づいて、１つの予想は、ｇｐ１２０がＲＥＩのＣ“鎖に類似した 領域の残基に接触するならば、それはねこの領域に隣接したＣＤ４ドメイン■の 残基にも接触する可能性がある。多分、Ｍ９及び／又はＭ１４突然変異はこのよ うな部位に局限されている。ＣＤ４のドメインエとドメイン■が成る領域で相互 に空間的に近接しているかもしれないということは、抗体競合実験により更に支 持される。この抗体競合実験においては、エピトープがドメインＩの領域にマツ プされているところの抗体（ＯＫＴ４Ａ）が、エピトープがドメイン■にマップ サレテいる２つの抗体（ＯＫＴ４Ｆ及び０Ｋ７４Ｂ）との相互に競争的結合を示 した。

ジャムメン・ビー・ニー等、サイエンス、２４０：１３３５−］　３３９（１９ ８８）。

ｇｐ１２０の可能な結合部位として示唆されたＣＤ４ドメイン■の領域は、超可 変相補性決定セグメントに類似したループから離れている。これらのループがク ラスＩＩＭＨＣ，ＣＤ４の推定天然リガンド、に対する結合部位を形成するとす れば、ｇｐ１２０はＣＤ４構造への結合の後ですらクラス■認識行為を抑制する ことはできないという推測をすることができる。クレンスキー・ニー・エム等、 プロシーデインダス・オブ・ザ・デイツプス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ・斯０１上旦６：１０６４−１０７６（１９８２）；マ ラチ・ビー等、！ヱユナル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン、１５８： １０７７−１０９１（１９８３）；ドイルメシー等、ネイチャー、３３０：２５ ６−２５９（１９８７）。本明細書に記載のＣＤ４突然変異体はＣＤ４−クラス ■ＭＨＣ相互作用の更なる分析において有用であるにちがいない。

ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質に対するＣＤ４の結合に重要な部位の 同定の結果として、ｇｐ１２０への結合能力が改変されている（即ち、ｇｐ１２ ０への結合能力が対応する天然に存在するヒトＣＤ４断片のｇｐ１２０への結合 能力とは異なる）修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片を製造することが今や可能で ある。前節及び実施例４及び５に記載の如く、このような部位は、第１図に示さ れたとおり、アミノ酸位置２７−１６７間のヒ１−ＣＤ４残基をすべての非保存 不ズミアミノ酸残基での置換をもたらした１６の突然変異体ヒトＣＤ４分子を造 り出すのに使用されたオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発により同定された 。

表１に示されたように、上述の如くした造り出された１６のＣＤ４’突然変異体 パのうちの１５のものは抗ＣＤ４モノクローナル抗体ｒ９Ｔｈｙ５Ｄ７と反応し 、１６のうちの１３はＴ４ｏ＋により証明されたｇｐ１２０結合と同等な方法で ｇｐ１２０に結合する、Ｍ３、Ｍ９及びＭＩ３と名付けた３つの突然変異体は、 Ｔ　４　、、、のｇｐ１２０結合に相当するｇｐ１２０結合を示さず、Ｍ３はｇ ｐ１２０に結合せず、Ｍ９は実質的に減少したｇｐ１２０結合能力を有し、Ｍ１ ４は減少したｇｐ１２０結合能力を示す。

表１に示されたように、Ｍ３とＭ９は抗ＣＤ４抗体により認識され、Ｍ１４は使 用される２つの抗ＣＤ４抗体のいずれによっても認識されない。

これらの結果は、これらの部位がＣＤ４によるｇｐ１２０結合に重要であること と、これらのＣＤ４突然変異体を製造するためにヒトＣＤ４のアミノ酸配列にお いてなされた変更（第４図に示されたように）はａｐ１２０結合の排除又は減少 をもたらすことを示す。同様に、これらの重要部位の１つ又はそれより多くの部 位の他の変更は、ｇｐ１２０結合能力の排除又は減少をもたらすことがある。反 対に、高められたａｐ１２０結合能力を持った修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片 を製造するためにこれらの重要部位にアミノ酸残基を導入することかでさる。

このような置換は、１）重要部位の１つ又は２つ又は３つのすべて（即ち、突然 変異体Ｍ３、Ｍ９及びＭ１４により示された３つのアミノ酸部位の１つ又はそれ より多くの部位に）において、及び／又は２）各部位内の１つ又は２つ又は３つ のすべてのアミノ酸残基（即ち、重要な部位内の個々にアミノ酸残基Ｌ　２又は ３の、又は１．２及び３のうち２つのアミノ酸残基の任意の組み合わせの、又は すべての３つのアミノ酸残基の）置換がなされうる。

例えば、突然変異体Ｍ３では、プロリン、リシン及びロイシンがグリシン、プロ リン及びセリンに替わっており、これらはヒトＣＤ４のアミノ酸位置４８．５０ 及び５１″Ｃ起こる。これらのアミノ酸の１つ又はそれより多くを、Ｍ３のその 位置に存在するアミノ酸と同じタイプ他のアミノ酸による置換（例えば位置４８ において、非極性Ｒ基を持った他のアミノ酸による）を行うことができ、ｇｐ１ ２０結合能力に対する効果を決定することができる。

これらの３つの部位において、これらの部位での存在がｇｐ１２０結合能力を排 除又は減少させることが示されたアミノ酸の特性とは異なる特性を持ったアミノ 酸の個々の又は組み合わせの置換も行うことができ、そして実施例に記載された 抗ＣＤ４免疫沈でん及び抗ｇｐ１２０共沈法により、結合能力に対するそれらの 効果を決定することができる。特に、高められたｇｐ１２０結合能力を持った修 飾された可溶性ＣＤ４断片をもたらす、これらの重要部位の１つ又はそれより多 くの部位でのアミノ酸の一部又は全部の置換を行うことができる。本明細書に記 載の方法を使用して、高められた結合能力を持ったＣＤ４断片を同定することが できる。

高められたｇｐ１２０結合能力を持つ修飾された可溶性ヒ）ＣＤ４断片を製造す る１つの方法は、下記のとおりである。ヒ１−ＣＤ４の前記３っの部位に存在す るアミノ酸残基（第１図に示されている）及び前記３つの突然変異体ＣＤ４分子 の対応する位置に存在するアミノ酸残基は、これらの部位に導入される場合に、 ｇｐ１２０結合能力に対する効果を評価されるべきアミノ酸残基の群から排除す る。同様な特性（例えば、非極性Ｒ基、電荷のない極性Ｒ基等）を持ったアミノ 酸も排除する。次いで、このように考慮から外されたアミノ酸残基以外のアミノ 酸残基を含むように突然変異体を製造する。次いで、説明した抗ＣＤ４免疫沈で ん及び抗ｇｐ１２０共沈法を使用して、各突然変異体を評価する。

結果として、高められたｇｐ１２０結合能力を持った修飾された可溶性ヒトＣＤ ４断片を同定することができる。同様な方法を使用して、追加の重要部位を、こ のような部位が存在する場合には、同定し、次いで置換を行い、そして得られる 修飾された可溶性ＣＤ４断片のｇｐ１２０結合能力に対するそれらの効果を評価 することができる。

改変されたｇｐ　Ｉ　２０結合能力を有する修飾された可溶性ＣＤ４断片のＵ 修飾された可溶性ＣＤ４断片は実施例４及び５に詳細に記載された技術を用いて 製造される。筒路にいえば、それらは下記のように製造される： 所望のＣＤ４断片をコードするＤＮＡは、このような断片をコードするｃＤＮＡ を含むベクターからそれを削除するような、組換えＤＮＡ技術を使用することに より、又は既知の技術を用いて所望の断片を機械的に又は化学的にコードするＤ ＮＡを合成することによって製造することができる。これらの技術により製造さ れたＤＮＡはＣＤ４の疎水性の膜透過（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎａ）領域のい ずれをも含まないか、又は断片の可溶化を妨害しない程小さい該領域の一部（一 般にアミノ酸６個又はそれ以下）を含む可溶性ＣＤ４断片をコードする。更に、 特に強力なｇｐ１２０結合能力を有するＣＤ４断片の場合は、ＨＩＶｇｐ１２０ エンベロープ蛋白質に効果的に結合する程度に充分長い（例えばアミノ酸１０個 又はそれ以上）。

引き続いて突然変異形成のための鋳型がＣＤ４断片をコードしたｃＤＮＡ又はＤ ＮＡを用いて生産される。下記に述べるように、これはＭ２Ｓのような一重鎖バ クテリオファージクローニングベヒクルを用いて行うことができる。この結果と して所望のＣＤ４断片をコードするＤＮＡの二重鎖の一つにだけ相同な一重鎖Ｄ ＮＡの生産をもたらす。得られる一重鎖ＤＮＡは所望の改変された可溶性ＣＤ４ 断片を製造する鋳型として、下記のように使用される： オリゴヌクレオチドはその配列が塩基の変化又はＣＤ４断片の生産に引き続き使 用されるＤＮＡのヌクレオチド配列中に組み込まれた時にコードされたＣＤ４蛋 白質中に所望の変化（即ち、第１図のヌクレオチド配列によりコードされたもの と異なる）を起こすような、塩基の変化を含むように生産される。かようなオリ ゴヌクレオチドは標準的な方法を用いて生産される。塩基の変化を有するオリゴ ヌクレオチドは突然変異を誘発された又は突然変異体オリゴヌクレオチドと称さ れる。

このようにして生産された突然変異オリゴヌクレオチドは上記のようにして生産 された鋳型にハイブリッドされて（即ちキナーゼ処理されることによって）、突 然変異プライマー／鋳型と称される、鋳型突然変異オリゴヌクレオチド複合体を 生じる。突然変異プライマー／鋳型は周知の技術によってＤＮＡの第二の鎖の生 産に使用される。例えば、第二のＤＮＡ鎖の合成はｄＣＴＰ匡Ｓの存在において ＤＮＡポリメラーゼのり得られるＤＮＡ鎖はＴ４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に おける修飾を含んでおり（即ち第１図に表現されたヌクレオチド配列とは異なっ ており）、突然変異鎖と称される。

未複製−重鎖ＤＮＡは除去され、二重鎖ＤＮＡが選択された制限酵素（例えばホ スホロチオエートＤＮＡを切断せず、従ってｄＣＴＰ　　Ｓ又は突然変異鎖を含 む新ＤＮＡ鎖を切断しないＮｃ　ｉ　Ｉ）でニックされる。

ニックされた非修飾のＤＮＡはエクソヌクレアーゼｍのような他の酵素で消化さ れることにより除去される。得られるギャップしたＤＮＡは再重合され、突然変 異鎖は再重合の鋳型として役立つから、突然変異又は修飾は両方の鎖にコピーさ れる。

一度生産されると、両方の鎖が所望の可溶性ＣＤ４断片のアミノ酸配列における 対応する修飾をコードしている突然変異又は修飾を含む二重鎖ＤＮＡはコンピテ ント細菌宿主のように（例えば形質転換によって）コンピテント宿主細胞中に導 入される。得られるプラークが増殖し、それらの中に含まれるＤＮＡは既知の技 術を用いて単離され、突然変異の存在を確認するために配列決定される。

このようにして生産された突然変異ＤＮＡはそれを含むＭ１３ベクターから切り 出され、ＣＤＭ８のような適当な表現ベクター中に導入され、それが表現される コス（Ｃｏｓ）細胞のような適当な宿主細胞中にトランスその結果として突然変 異ＣＤ４蛋白質は既知の技術を用いて分析される。

ベクター−挿入連結混合物は公的に利用できるＥ、　Ｃｏ１１　ＭＣ１０６ＩＦ ３のようなコンピテント宿主細菌中に導入され、突然変異Ｔ４ｃＤＮＡを含むＣ ＤＭ８を同定するために放射能標識されたＴ４ＤＮＡが使用される。

突然変異Ｔ４ｃＤＮＡを含むベクターでトランスフェクトされたニス細胞中の、 ｇｐ１２０結合能力において所望の改質を有する修飾された可溶性のＣＤ４断片 の生産は、下記に記載される既知の技術を用いて引き続き分析される。

この手順の結果として、改質されＩ：：ｇｐ１２０結合能力を有する修飾された 可溶性ＣＤ４断片をコードする二重鎖ＤＮＡが生産され、コードされたＣＤ４断 片は発現され、そのＨＩ　Ｖ　ｇ　ｐ　ｌ　２０エンベロープ蛋白質を結合する 能力が評価される。

改質されたｇｐ１２０結合能力を有する修飾された可溶性のヒトのＣＤ４断片を 生産するもう一つのアプローチは、かような断片のアミノ酸配列を有するペプチ ド又はポリペプチドを作るペプチド合成を使用することである。

上記の技術はその配列が第１表に示された１６の突然変異体ＣＤ４断片を生産す るために使用される。１６の突然変異体の構成、トランスフェクション、免疫沈 降及び共同沈降は実施例４に記載されるように行われた。各突然変異体の存在は 個々のトランスフェクションに使用されたプラスミドＤＮＡを直接に配列決定す ることにより確認された。

可溶性ヒトＣＤ４断片の使用 本発明の可溶性ヒトＣＤ４断片は診断的、予防的及び治療的な用途を有している 。例えば、生物学的に活性な可溶性ヒトＣＤ４断片はＨＩＶによる感染の診断、 治療及び予防のために使用できる。

倒えばかような断片はＨＩＶに感染した個体をｆ＆療するために治療学的＜’ｒ ａｐ＞に使用することができる。かような断片は許容し得る経路（例えば静脈内 的に、筋肉内的に、腹膜組織内的に、経口的に）により、単独で、又は許容し得 る担体（例えば食塩水緩衝液）と組み合わせて投与することができる。それらは ＨＩＶのＴ４りンパ細胞への結合を阻害するために及びシンシチウム形成を妨害 することによって感染した細胞から未感染の細胞へのＨＩＶの伝達を抑制するた めに投与することができる。投与されるこうしたＣＤ４断片の量は個体を基本に して決定されるが、一般に体重１　ｋｇ当たり約１０μ９ないし体重１１２ｇ当 たり約５０ＯＮ！？（−日当たり一回又は多数回の投薬量で）の範囲にある。

本発明の生物学的に活性な可溶性ＣＤ４断片は診断の目的に使用することもでき る。例えば、それらは既知の免疫学的検定法において、血液、精液、唾液のよう な試料中のＨＩＶ　ｇｐ１２０エンベロープ蛋白質（及び、その結果としてＨＩ Ｖそれ自身）の存在を検出し、必要に応じて、その量を定量するために使用する ことができる。本発明のＣＤ４断片は例えばラテックスビーズのような固体支持 体にＣＤ４断片を付着又は結合させることができ、次いでＨＩＶが試料中に存在 するか否かを検定すべき試料と接触させるとそれは結合するであろう（ＣＤ４断 片−ｇｐ１２０の相互作用のために）。これは抗ｇｐ１２０抗体との接触によっ て沈降及び／又は標識し、既知の方法を用いて沈降又は標識された生成物を検出 することによて行うことができる。

生物学的に活性な可溶性ＣＤ４断片はＨＩＶ感染の予防にも使用することができ る。例えば、かような断片をＨＩＶと接触する可能性のある物質に混和又は付着 させることができる。それらは殺精子剤中に混和でき、コンドーム、外科用手袋 、包帯及び他の医学用設備が製造される材料中に混和又はそれらの表面に付着さ せることができ、又は血液を受容し、加工し及び／又は貯蔵する容器又は他の材 料（例えばフィルター）の表面に付着させることができる。各場合共、本発明の ＣＤ４断片はＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ蛋白質（及び従ってＨＩＶ）に結合 し、それ以上通過すること（例えば殺精子剤、コンドームの場合に）ことを防止 し、又は除去（例えば献血された又は貯蔵された血液の場合）することができる 。

改質点（例えば増強されたｇｐ１２０結合能力）を有する本発明の修飾された可 溶性ＣＤ４断片が可溶性のヒ）ＣＤ４断片に記載された利点と同じ利点を有する ことが示されると考えることは合理的である。即チ、本発明の該断片がＨＩＶｇ ｐ１２０エンベロープ蛋白質に結合し、Ｔ細胞のＨＩＶ感染を妨害する能力を有 するが、ＨＩＶに感染していないヒトＴリンパ細胞の機能及び増殖を妨害しない と考えることは合理的である。断片がｇｐ１２０エンベロープ蛋白質に結合し、 及びＨＩＶ感染を妨害し・及び未感染のＴリンパ細胞との相互作用を妨害するこ とがないという能力は本文記載の手段により評価できる。

改質されたｇｐ１２０結合能力を有する修飾された可溶性のヒトｃＤ４断片はＨ ＩＶによる感染の治療、診断及び予防のために使用することができる。例えば、 僅かに減少又は縮小した親和性を有する断片の使用は、治療の効果的な薬物動力 学を改善することができる。例えばかような断片は一時的にｇｐ１２０（及び従 ってＨＩＶ）と結合又は保持するために使用することができる。かような断片は 感染剤としてウィルスを無効にし、ウィルスが他の治療剤（例えばウィルスを破 壊する薬剤）と結合し又は該剤を受容する準備ができるする程長くウィルスと結 合する。

更に、ｇｐ１２０の可能性ある結合部位として想定されたＣＤ４ドメインＩの区 域は超可変的な相補性決定セグメントに類似したループから明らかである。もし これらのループが推定されているＣＤ４の天然リガンドである、クラスｎＭＨｃ の結合部位を形成するならば、ｇｐ　１２０は、ＣＤ４構造に結合した後でも、 クラス■の認識を抑制することができなくなるであろう。従ってここに記載され たＣＤ４突然変異体はＣＤ４クラスｎＭＨｃ相互作用の将来的分析において有用 であるに相違ない。

増強されたｇｐ　ｌ　２０結合能力を有する本発明の断片はＨＩＶに感染した個 体を治療するために治療学的（生体内）に使用することができる。

かような断片は許容し得る経路（例えば静脈内的に、筋肉内的に、腹膜組織内的 に、経口的に）により、単独で、又は許容し得る担体（例えば食塩水緩衝液）と 組み合わせて投与することができる。それらはＨＩＶのＴ４リンパ細胞への結合 を阻害するために及びシンシチウム形成を妨害することによって、感染した細胞 から未感染の細胞へのＨＩＶの伝達を抑制するために投与することができる。投 与されるこうしたＣＤ４断片の量は個体を基本にして決定されるが、一般に体重 １ｋｇ当たり約ｌＯμ９ないし体重１ｋｇ当たり約５００μｇ　（−日当たり一 回又は多数回の投薬量で）の範囲にある。

増強されたｇｐ１２０結合能力を有する修飾された可溶性ＣＤ４断片は診断の目 的に使用することができる。増強された結合能力のために、それらは既知の免疫 学的検定法において、血液、精液、唾液のような試料中のＨＩＶ　ｇｐ１２０エ ンベロープ蛋白質（及び、その結果としてＨＩＶそれ自身）の存在を検出し、必 要に応じて、その量を定量するために使用することができる。本発明のＣＤ４断 片は例えばラテックスビーズのような固体支持体にＣＤ４断片を付着又は結合さ せることができ、次いでＨＩＶが試料中に存在するか否かを検定すべき試料と接 触させると、それは結合するであろう（ＣＤ４断片−ｇｐ１２０の相互作用のた めｌこ）。これは抗ｇｐ１２０抗体との接触によって沈降及び／又は標識し、既 知の方法を用いて沈降又は標識された生成物を検出することによって行うことが できる。

増強されたｇｐ１２０結合能力を有する修飾された可溶性ＣＤ４断片は、ＨＩＶ 感染の予防にも使用することができる。例えば、かような断片をＨＩＶと接触す る可能性のある物質に混和又は付着させることができる。それらは殺精子剤中に 混和でき：コンドーム、外科用手袋、包帯及び他の医学用設備が製造される材料 中に混和又はそれらの表面に付着させることができ；又は血液を受容し、加工し 及び／又は貯蔵する容器又は他の材料（例えばフィルター）の表面に付着させる ことができる。

各場合共、本発明のＣＤ４断片はＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ蛋白質（及び従 ってＨＩＶ）に結合し、それ以上通過すること（例えば殺精子剤、コンドーム、 外科用手袋、包帯の場合に）ことを防止し、又は除去（例えば献血されＩ；又は 貯蔵された血液の場合）することができる。

実施例　ｌ　可溶性ＣＤ４断片の製造 通常ＣＤ４を膜に結合させそして不溶性とする、疎水性の膜透過領域をコードし ているヌクレオチド配列を削除するために、始めにｃＤＮＡをコードするヒトＣ Ｄ４を加工処理する。その結果、ｃＤＮＡをコードするヒトＣＤ４断片が生産さ れた。

プラスミド　構成 プラスミドの構成は第２図を参照すれば最もよく記載できる。第２図に見られる ように、切断されたＣＤ４遺伝子を含むプラスミドベクターｐＡｃ３７３／Ｔ４ −はプラスミドｐＡｃ　３７３及びｐＳＰ６５−Ｔ４から構成された。

プラスミド伝達ベクターｐＡｃ　３７３はポリヘトリンＡＴＧ出発部位の上流方 向に、単一のＢａｍＨＩクローニング部位８塩基対を含んでいる。ＣＤ４分子の 分泌形を生産するために、プラスミドＣＤ４蛋白質−コーディングｐＳＰ６５− Ｔ４　（サン７ランンスコのカリホルニア大学のダン・りントマン［Ｄａｎ　Ｌ ｉｔｔｍａｎ］氏から恵与された）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌで消化し、ＣＤ４ ｃＤＮＡ挿入体を開放した（例えばマッダン［Ｍａｄｄｅｎ］等の（旦、４２＋ ９３−１０４（１９８５）のような文献に記載されたようにして、容易に得るこ とができる）。ＣＤ４ｃＤＮＡ挿大体は引き続きＮｃｉｌで消化された。これは ＣＤ４ｃＤＮＡをヌクレオチド位置８３．１２５３及び１６０４で切断し、ＡＴ Ｇ開始コドンを欠き、膜透過領域の直前で終わる１、１７Ｋｂの断片を生産する 。

標準的なシアノエチルホスホルアミダイト化学を用いて二つのオリゴヌクレオチ ド５″ＣＧＧＴＴＣＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＴ３″及び５′ＣＧＧＴＴＣＡＴＴ ＡＡＧＧＡＴＣＣＴ３’　を合成した。それらをアニーリングし、キナーゼ処理 してＡＴＧ翻訳開始コドンを再構成し、転写の終結のための停止フドン（ＴＡＡ ）を含み、Ｎｃｉｌ付着端を創出し、及びＢａｍＨＩクローニング部位を添加す るリンカ−分子を発生させｔ；。

リンカ−は１．１７ＫｂＣＤ４をコーディングする断片に連結され、次いでＢａ ｍＨＩで消化されてＢａｍＨＩ付着端を生成した。引き続きＣＤ４コ一デイング 断片を公的に利用できる伝達ベクターｐＡｃ３７３のＢａｍＨＩクローニング部 位中に挿入した。正しい配向で切断されたＣＤ４分子の単一コピーをを含む組換 えプラスミドは、制限マツピングにより同定された。次いで構成は”５−ＡＴＰ 標識ジデオキシ法により挿入の結合部における予想された配列を確認するために 次いで配列決定された。組換えプラスミドｐＡｃ３７３／Ｔ４．．＋及びｐＡＣ ３７３／Ｔ４３１は詳細に特性決定された。それらは同一の５′末端を含んでい た。

合成リンカ−はｐＡｃ３７３／Ｔ４．、＋中の予想された配向中に連結されて、 予想されたＣＤ４蛋白質のＬＰＴＷＳＴＰＶＨのカルボキシ末端ウィルス（Ａｃ ＮＰＶ）ゲノムへのＴ４ｅ、配列の伝達は、本質的にスミス（Ｓｍｉｔｈ）等（ １９８５）Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８２．８４０４−８４０８に記載さ れたようにして行われた。この方法において、４μｇｐＡｃ　３７３／Ｔ４・・ ＤＮＡの精製されたｌｐｇのＡｃＮＰＶ　　ＤＮＡを用いた燐酸カルシウム沈降 による公的に利用できるＳ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（ＳＦ９）への同時ト ランスフェクションは伝達ベクター及びＡｃＮＰＶのポリヘトリン遺伝子配列の 組換え配列の間の相同的組換えの結果を招いた。組換えＡｃＮＰＶは感染した細 胞中でもはやオフルージョン（ｏｃｃ　Ｉｕｓ　１ｏｎ）を形成しない、不活性 化されたポリヘトリン遺伝子を含む。プラークの精製のためは、検定の約２４時 間前に２ＸｌＯ’ＳＦ９細胞が１００ｍＭベトリ皿中に接種された。ウィルス上 澄み液の１０倍の希釈液が最終培地［ブレース（Ｇｒａｃｅ）の昆虫培地（ギブ コ［Ｇｉｂｃｏｌ、ゲランドアイアランド［Ｇｒａｎｄ　［５ｌａｎｄ］、ニュ ーヨーク）、ディフコ［Ｄｉｒｃｏｌ　Ｔ　Ｃイーストオレエート０．３３％、 アラクトアルブミンヒドロシレート０．３３％、２ｍＭ追加グルタミン及び１０ ％ＦＣ５（ハイクローン［Ｈｙｃｌｏｎｅｌ、ロガ［Ｌｏｇａ］、ＩＪＴ）を含 む５０μｇ／ＩＩＩＱゲンタマイシン］を用いて製造された。各プレートに１ｍ １２のウィルス（１０−”ないし１Ｏ−７希釈）プラス２ｍＱの最終培地が接種 された。２時間インキュベート後、接種物を除去し、最終培地中でＩＯ−の１． ５％シー・プラーク・アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ［Ｂｉｏｐｒｏｄｕ ｃ’ｔｓｌ　、ロックランド、ＭＥ）で置き換えた。アガロースの硬化後、プレ ートを４−６日間２７°Ｃの湿気のある環境に移した。

トランスフェクション上澄み液のプラーク検定によれば、明確な形態のプラーク が生じたニオクルージョン陽性（原種型のＡｃＮＰＶ）又はオフルージョン陰性 （組換えＣＤ４ウイルス）である感染した細胞のいずれかである。想定されたＣ Ｄ４組換えウィルスで感染された細胞からのＤＮＡは、ＣＤ４配列の存在を確証 するために３２ｐ標識ＣＤ４ｃＤＮＡプローブとハイブリッドされた。Ｔ４．、 ポリペプチドの生産は下記のように行われた：６ＸＩＯ’ＳＦ９細胞は２４ウエ ルのヌンク（Ｎｕｎｃ）プレート（インターラブ［Ｉｎｔｅｒｌａｂｌ、サウザ ンド・オークス［Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ］ＣＡ）中にウェル毎に２７℃で ２時間接種し、次いで付着する細胞を０．２ｔｎＱの最終培地中で２時間ｌＯの ＭＯＩでウィルスに感染させた。

接種物を次いで除去し、細胞を０．５−の新しい培地で２７℃で４８時間培養し た。付着する細胞を次いで血清及びメチオニンを欠＜０．５ｍＱのブレースの培 地で二回洗浄し、Ｑ、５ｍｆｆの同じ培地中で４８時間インキュベートした。次 いで付着する細胞を血清及びメチオニンを欠くブレースの培地で二回洗浄し、０ ．５ｍＱの同じ培地中で１時間インキュベートした。付着する細胞を一度洗浄し 、６７μＣｉ”Ｓメチオニンにニーイングランド　ヌクレア［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒｌボストン、ＭＡＩＩ３４Ｃｉ／ミリモル）を含む血清 及びメチオニンを欠くブレースの培地で培養した。培養液の上澄みを取り出し、 １０分間微量遠心し、０．０５％のナトリウムアジド及び１０ｍＭの冷メチオニ ンを含むＰＢＳに対して４℃で透析した。細胞をウェルから取り出し、４℃でブ レースの培地で二度洗浄しくソーヴアル［５ｏｒｖａｌ　Ｉ］　ＲＴ　６０００ 中でｌｏＯｒｐｍで５分間遠心することによりＬ１％のトリトンＸ−１００，０ ，１５ＭＮａＣ１及び成分混合（ｃｏｃｋｔａｉｌ）のプロテアーゼ阻害剤（下 記参照）を含むＲＩＰＡ緩衝液を添加して４°Ｃで３０分間溶解（ｌｙｓｅ）さ せた。

透析物を１０分間微量遠心し、培養液の上澄みに対して４”Ｃで透析した。両方 の透析物及び培養液の上澄みアフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）　−１０ビーズに結 合した単りローン性抗ＣＤ４抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）（ゲル１ｍｇ当たり５ｍ ｇの単クローン抗体を含む）を用いて４℃で１６時間免疫沈降に付した。免疫吸 着後、ビーズを透析用緩衝液で二度洗浄し、結合した物質をｐＨ２，０のＯ，１ Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液により溶離した。

溶離液及び透析物の全体の試料又は培養上澄みを２−メルカプトエタノールを含 むＳＤＳ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）に従 って１２．５％ミニ−スラブゲル中で電気泳動した。引き続きゲグラ７にかけた 。高タイターのウィルス原質はｌのＭｏｌでＳＦ９細胞を感染させ、最終培地中 でｌＸｌ０’細胞／ｍＱで４日間培養することにより発生した。これらの原質は 蛋白質の生産用のＳＦ９細胞の感染に使用された。大規模な蛋白質の生産の場合 は、ＳＦ９細胞を最終培地中で２両方のスピンナーフラスコ中で増殖させｔ；。

細胞を採取し、１ｘ１０６細胞／ｌａＱの濃度で１５のＭｏ１（高タイターウィ ルス原質を用いて）感染させた。次いで細胞をペレット化し、ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏ” ｍＱで培地中に再分散し、スピンナーフラスコ中で２７°Ｃで３日間培養した。

この時点で培養液を遠心することにより上澄み液を集めて、細胞を除去した。

大規模の精製の場合は、ソーヴアルＨ−４０００ローター中で８０゜ｒｐｍで４ ℃で６分間細胞を遠心することにより感染させたＳＦ９細胞培養上澄み液を集め た。次いで培養上澄み液はロイペプチン、アンチパイン、ペプスタチン、及びキ モスタチンから製造された最終濃度０．５ｐｇ／ｍＱの濃度の成分混合のプロテ アーゼ阻害剤；０．０２μｇ／ｍＱの濃度の大豆トリプシン阻害剤：及び１２５ ｍＭまでの弗化フェニルメチルスルホニルを添加し、次いでＩＭＮａＯＨを滴下 して加え、ｐＨを６．８に調節することによりプロテアーゼ明害処理に付した。

引き続きソーヴアルＧＳＡローター中で８０Ｏｒｐｍで４°Ｃで２５分間試料を 遠心することにより清澄化し、２ｍＱの予め清浄化したアフィゲル−１０（、＜ イオラド［Ｂｉｏｒａｄ］　）に結合させた２１Ｔｈｙ２Ｄ３単クロ一ン抗体（ 抗Ｔ８）である、免疫吸収剤カラムを通して３０１１１１２／時間の流速で４° Ｃで汲み上げ、ゲル１ｍｇ当たり単クローン抗体７．５ｍｇの濃度で７フイゲル ー１０に結合させた抗ＣＤ４単クローン抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）７ｍＱのカラ ムに並列に入れた；単クローン抗体は慣用の方法によって製造された。抗ＣＤ４ カラムを次いでｐＨ５，０の、１０ｍＭトリス−ＭＣＩ緩衝液で洗浄した。結合 したＣＤ４蛋白質を洗浄した抗ＣＤ４カラムを通してｐＨ２，０のＯ，ＩＮグリ シン−ｆ（ＣＩを送入することにより溶離し、溶離液の０．８ｍＱの両分をｐＨ ７，６のｌＮｌ−リス−ＨＣｌ緩衝液０゜１５ｍＱを含むチューブに集める。全 体のカラム分画操作の間、溶離液に吸収はイベント・マーカーを取り付けたユビ コード２　（ＬＫＢ、ガイタースバーグ［ＧａｉＬｈｅｒｓｂｕｒｇ］、ＭＤ） を用いて２８０ｎｍで監視した。中和された蛋白質を含むｐＨ２，０の画分を貯 留し、ＹＭ−５膜を取り付けた撹拌されたセル（アミコン［Ａｍ１ｃｏｎ］、形 式３）中で限外濾過により濃縮された。一般に精製されたＴ４ｏポリペプチドの 収量は換算されたＳＦ９培養上澄み液の１ｍ１２当たり１μ９であった。１．ｕ ｇの蛋白質濃縮物を含むアリコート（２８０ｎｍにおけるＩＯＤ単位が１ｍｇ／ ｍＱであると仮定して）を、クーマシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉｅ）青を用いて染 色して１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル中で純度を検査した。

Ｔ４３．ポリペプチドの精製及び特性決定Ｔ４．ＫｃＤＮＡ又は野生型のＡｃＮ ＰＶのいずれかのウィルスで感染されたＳＦ９細胞を３５Ｓ−メチオニン中で培 養し、生産物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、次いでオートラジオグラフィーにより 検査した。Ｔ４．。

ポリペプチドはＴ４．１．組換え体バキュロウィルスで感染させたＳＦ９細胞の 主要な分泌生産物であることが示された。Ｔ４−１組換え体バキュロウィルス感 染後５４時間に得られたＳＦ９ｍ胞からの上澄液５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析における 主要な３ＳＳ標識蛋白質バンド（全標識物質の４５％）は減少条件下の５０ＫＤ バンドである。このバンドはＴ４．Ｉｌバキュロウィルス感染５ＤＳ−ＰＡＧＥ ９上澄液又は細胞透析液からの抗ＣＤ４単クローン性抗体（１９Ｔｈｙ５Ｄ７） により免疫沈降した物質と同時に移動する。更に後者は恐らくなお未開裂のシグ ナルペプチドを保持するＴ４．８ポリペプチドを示す５２ＫＤの強く標識された バンドを示している。５０ＫＤバンドは、抗ＣＤ４単クローン性抗体による免疫 沈降がない場合でも、Ｔ４＊ｇｌ４膜ルス感染細胞の全細胞透析物中に容易に検 出されるが、それは標識された細胞内ポリペプチドの複雑な混合物の少量成分で ある。予期されたように、ＣＤ４物質は野生型ＡｃＮＰＶ感染細胞の上澄液から は沈降されず、又は全体の上澄液中には検出されなかつに。

二つの代表的なＴ４．ヨ、調製物の各々は減少条件下では５１ＫＤの分子量と共 に移動する（そしてエンドグリコシダーゼＦ実験により示されるようにグリコジ ル化される）が、”ｒ　４．１．蛋白質は５０ＫＤの分子量と共に僅かに速く移 動する蛋白質をを与えた。Ｔ４゜８１及びＴ４−２蛋白質の間の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ中のこれらの異なる移動度は、Ｔ４ｏ２はポリヘトリン遺伝子との融合から誘 導された■７の追加的カルボキシ末端アミノ酸を含んでいるから、予期されない ことである。非還元的条件的条件下では、Ｔ４．、、蛋白質の移動度は還元的条 件下よりも速く、ＣＤ４外部セグメントには鎖間のジスルフィド結合があるとい う予想と一致し、及びＴ４　、、、蛋白質の共有結合的にジスルフィドで連結さ れた重合体の不存在を示している。上記のような蛋白質生産機構により７２時間 の培養期間に互り通常ＳＦ９ｍ胞Ｉα　（１−２Ｘ１０”細胞）当たりＩ−２即 の分泌されたＴ４ｃ、、又はＴ４．、！蛋白質を生産する。

５０　ＫＤＴ　４、−＋及びＴ４．−２蛋白質が真にＣＤ４遺伝子の生産物であ ることを確認するために、精製さ・れたポリペプチドをポリ二弗化ビニリデン膜 （ミリボア製、孔径０．４５ミリμ）上にエレクトロブロッティング（ｅｌｅｃ ｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）　Ｌ、クーマシー青で染色された５Ｏ−５１ＫＤ物質 を０３ＲＰＴＨプログラムを用いるオンラインｌ　２ＯＡＰＴＨアナライザーを 備えたアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）製型式４７０Ａ７−クエ不−ターを用いて、アミノ末端配列分析を行った。各 場合共、最初のｌＯプサイルは明らかな配列：　ＫＫＶＶＬＧＫＫＧＤを与えた 。対照的に、ｃＤＮＡの翻訳に基づいた予想されたＣＤ４のＮ−末端配列ハ事前 ｊ：ＱＧＮＫＶＶＬＧＫＫＧＤ又はＮＫＶＶＬＧＫＫＧＤであることを示唆して いた。これらの二種の指定の第二のものはラットのＮ末端配列ＫＴＶＶＬＧＫと の相同性を基礎としたものである。

ここで経験的に誘導された配列は後者のＮ〜末端ヒトの指定の配置及び鼠及び羊 のＣＤ４の配置と一致するが、このアミノ酸配列分析により指定された１位のＫ はｃＤＮＡのヌクレオチド配列から予想されたアミノ酸と一致しない。これらの 違いを解決するためにｐＡｃ３７３／Ｔ４□２挿入体のＤＮＡ配列分析が行われ た。アミノ末端残基のコドンは他の違いが見られることなく、始めのＣＤ４ｃＤ ＮＡクロ一ニング論文（マダン等、既出）により示されたように、ＡＡＣである よりも、ＡＡＧであることが決定された。この−個のヌクレオチドの相違はｐＡ ｃ３７３中のクローニングから生じる突然変異が未知であることを表すが、相同 的なラットのＣＤ４配列のＮ−末端において見いだされるリジン残基の見地から 見ると、あり得ないように思われる。これらのデータから、成熟したヒトのＣＤ ４のアミノ末端は二つのりジン残基で始まり、二つのバリン残基が統くこと、及 びＴ　４　、、、及びＴ４□２はＣＤ由来のポリペプチドであることが結論され た。更に、このデータはバキュロウィルス発現系はＴ４ｏポリペプチド先駆体を 分泌させながら、それからシグナルペプチドを酵素的に開裂する能力を有するこ とを示している。従って通常は蛋白質を不溶性とする、ＣＤ４蛋白質の疎水的な 膜透過部分は、膜透過部分に隣接する最初の三又は四個の外部アミノ酸であるか ら、削除される。これは切断されたＣＤ４ポリペプチドは３７４アミノ酸の成熟 細胞外セグメントに比較して、３７１アミノ酸残基（Ｔ　４　、、、）又は３７ ０アミノ酸残基（Ｔ４．ｗ２）を有することを意味する。

可溶性ＣＤ４断片のＨＩｖｇｐ１２０への結合バキュロウィルス系中に生産され た可溶性ＣＤ４ｉ白質がＨＩＶｇｐ１２０外部グリコプロティンに結合できるか 否かを決定するために、下記の二つの相反的な共沈降実験を行った。最初に、Ｈ ＩＶピリオンから誘導された代謝的に標識されたｇｐ１２０蛋白質を、未標識の 精製したＴ４．、ｘと共にＣＤ４蛋白質の明瞭なエピトープ（ＯＫＴ４及びＯＫ Ｔ４Ａ）に対して向けられた単クローン抗体の不存在又は存在において、インキ ュベートした。０ＫＴ４単クロ一ン抗体ではない０ＫＴ４Ａ抗体（１９Ｔｈｙ５ Ｄ７のような）はＣＤ４分子に対しｇｐ１２０の結合能力を呈することが知られ ている。培養上澄液は１．５＋ｉ（＋の全容積中で１００ｕＣｉ／ｍ１２の３ｓ Ｓ−システィンで一夜代謝的に標識されたＨＩＶ株ＩＢで安定的に感染されたＩ Ｘ　Ｉ　Ｏ’Ｍｏ　Ｉ　ｔ−３リンパ細胞から集められた。最終濃度０．５％ま でＮＰ−４０を添加し、５μｇ／ｍＱの０ＫＴ４Ａ　（オーソファーマシニーチ カル［０ｒｔｈｏ　ＰｆａｒｍａｃａｕＬｉｃａｌ］、ラリタン、ＮＪ）と共に 可溶性Ｔ４を予備インキュベーションせずに、又は行って、上澄液を３７℃で１ 時間ｌＯμ９のＴ４１１と共にインキュベートした。次いで試料を単クローン性 抗体０ＫＴ４で免疫沈降させ、カワルスキ（Ｋａｗａｌｓｋｉ）等、５ｃｉｅｎ ｃｅ、　２３７：１３５１−１３５５（１９８７）に記載されたようにＳＤＳポ リアミドゲル上で処理する。更に、１．５ｕＱの未標識の培養上澄液をｌＸｌ０ ’の未感染Ｍｏ＋ｔ−３リンパ細胞又はＨＩＶ感染Ｍ。

＋ｔ３、リンパ細胞のいずれかから集め、ポルＩ・シーハンター試薬（ＭＥＮ、 ボストン、ＭＡ）により放射性沃素化されたｌ！ｌ　■標識可溶性Ｔ４と共にイ ンキュベートされた。次いで試料はカワルスキ等（既出）に記載されたように、 羊の抗＝ｇｐ１２０抗血清を用いて免疫沈降させた。

０ＫＴ４Ａ単クロ一ン性抗体の予備インキュベーションなしに、ｇｐ１２０蛋白 質は０ＫＴ４単クロ一ン性抗体により共沈降した。これと対照的に、０ＫＴ４Ａ 抗体との予備インキュベーションはｇｐ１２０共沈降を阻害した。これらの発見 はｇｐ１２０はＴ４．、ｚ蛋白質に結合し、この結合は０ＫＴ４Ａにより阻害さ れることを示す。０ＫＴ４単クロ一ン性抗体は添加されたＴ４−、ｚ蛋白質の不 存在下にはｇｐ１２０蛋白質を沈降しない。

第ユの実験において、未標識のＨＩＶピリオンは放射性沃素化されたＴ４．．２ 蛋白質と共にインキュベートされた。次いで混合物を精製されたＨＩＶｇｐ１２ ０蛋白質に対して飼育された羊の抗血清と共に免疫沈降させた。沃素化されたＴ ４−２蛋白質はＨｒＶピリオンが存在する時にのみ抗ｇｐ１２０血清によって共 沈降し、Ｔ４　ｃｌ、蛋白質はＨＩＶピリオン成分と結合できることを示してい る。

Ｔ４可溶性ＣＤ４断片に対するｇｐ１２０結合の阻害Ｔ４．１□蛋白質がＣＤ４ リンパ細胞へのｇｐ１２０蛋白質の結合を阻害できるか否かを検査するために、 ウィルス感染細胞の上澄液から代謝的に標識されたｇｐ１２０蛋白質がＴ４．、 、蛋白質又はバキュロウィルス系（細胞外Ｔｌｌセセグメント）中で作られた対 照蛋白質と共に下記のように予備インキュベートされた。

ＨＩＶ株１１１Ｂで安定的に感染された１Ｘ１０’１−１９リンパ細胞を、ｌ。

５ｕＱの全容積中で３ＳＳ−システィンで標識されたＨＩＶを含む上澄液を：燐 酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、２．５μｇ／蛯の０ＫＴ４Ａ；　３０μｇ　／ｒｎ ＱＴ　４　、、ｌ；又は３０　ｐｇ　／ｍＱのＴｌｌのいずれかと共に３７℃で １時間インキュベートした。５ｕｐＴｌ細胞を遠心し、一度ＰＢＳで洗浄し、０ ．７５＋ａＱの透析緩衝液で透析し、５ｕｐＴ１細胞に結合したｇｐ１２０をカ ワルスキ等（既出）に記載されたように、免疫沈降させた。

結合の特異性をみるために対照に標識された蛋白質を添加する前に、０ＫＴ４及 び０ＫＴ４Ａ単クロ一ン性抗体を５ｕｐＴｌ細胞に添加した。

０ＫＴ４ではない０ＫＴ４Ａ単クロ一ン性抗体は５ｕｐＴｌ細胞への標識された ｇｐ１２０蛋白質の結合を阻害することが見出された。Ｔ４．１１蛋白質は５ｕ ｐＴ細胞の表面への標識されたｇｐ１２０の結合を著しく阻害した。対照蛋白質 を３０μｇ／ｒＩＩＱの濃度まで使用しても阻害は認められなかったが、ｇｐ１ ２０結合の阻害はＧ、３μｙ／ｍＱのＴ４．、。

蛋白質濃度で見られた。

ＨＩＶ複製に及ぼす可溶性ＣＤ４断片の効果Ｔ４．．．ポリペプチドがＨＩＶに よる細胞の感染を阻害するか否かを決定するために、二種のリンパ細胞（Ｃ８１ ６６及びＨ９）を用いて実験を行った。各細胞種について、２Ｘ１０’細胞を１ ｏｏｏＴｃＩＤｓ。

単位のＨ９Ｉ［［、株のＨＩＶを用いて蛋白質の存在において感染させた。

蛋白質は感染時に添加され、実験の全期間を通じて下記の濃度に保持された：蛋 白質の添加なし；卵アルブミン（対照）、ｌＯμｇ／ｍＱ；Ｔ４１．２蛋白質、 ｌ　Ｏｔｔｇ／ｍＱ；　Ｔ４．、！蛋白質、２　μｙ　／　ｍＱ　；　Ｔ　４　 、、ｚ蛋白質、０．２ｐ９／ｒｌｌＱ；２１Ｔｈｙ２Ｄ３　（抗ＣＤ８、対照） 、１０μ９／ｍＱ；及び１９Ｔｈｙ５Ｄ７　（抗ＣＤ４、対照）０．２μｇ／ｍ Ｑ。−日に９の下記感染上澄液を集め、放射免疫定量法によりウィルスのｐ２４ ギャグ（ｇａｇ）蛋白質の分析を行った。第４図を参照すると、細胞上澄液中の ｐ２４蛋白質の量が添加された卵アルブミン（ロ）、バキュロウィルス中で生産 された可溶性Ｔ　１１　（閣）　、Ｔ　４−＋蛋白質（０）、Ｔ４．１蛋白質（ ・）又は１９Ｔｈｙ５Ｄ７　（）の濃度に対してプロットされている。

第４図に示すように、卵アルブミン、組換えＴｌｌ及び２１Ｔｈｙ２Ｄ３蛋白質 はウィルスの複製に対して効果を及ぼさないが、Ｔ４−＋及びＴ４−、ｚ及び抗 Ｔ４　（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）はウィルス蛋白質の発現及びウィルスの生産の著し い阻害を呈した。Ｔ４−１及びＴ４ｃｚｚ蛋白質は０．２μｙ／ｍＱの濃度でＨ ＩＶｐ２４蛋白質の発現を減少することができた。これらの研究はＴ４　ｇｔｌ 及びＴ４．．２蛋白質がＣＤ４＋リンパ細胞中でのＨＩＶの複製を阻害すること を示している。

可溶性ＣＤ４断片によるＨＩＶエンベロープ誘発誘発シンクチウム害ＨＩＶエン ベロープによるシンシチウムの誘導はＣＤ４分子へのｇｐ１２０外部糖蛋白質の 結合及び引き続いて起こる膜融合に包含される事例に依存する。’ｒ　４　、、 、蛋白質がＨＩＶエンベロープによるシンシチウムの形成を阻害できるか否かを 検査するために、ＨＩＶで慢性的に感染している細胞をＴ４．、、蛋白質の存在 又は非存在下にＣＤ４＋５ｕｐＴｌリンパ細胞と共に培養した。同時培養した細 胞に対照蛋白質、卵アルブミン又は抗Ｔ８単りローン性抗体（２１Ｔｈｙ２Ｄ３ ）を添加しても同時培養の開始後６時間で評価した所、シンシチウムの形成に影 響を与えなかった（第２表）。対照的に、２μｇ／ｌ１ＩＱ程度の少量のＴ４． 、、又は抗Ｔ４　（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）を添加すると、この検定法でシンシチウ ムの形成を完全に阻害することができた。Ｔ４．、＋及びＴ４−７蛋白質の両者 は構成上ＨＩＶエンベロープを発現するＣＨＯ細胞が５ｕｐＴｌリンパ細胞と同 時培養されてもシンシチウムの誘発を阻害した。バキュロウィルス発現系中で作 られた組換え体の分泌されたＴｌｌ蛋白質については、シンシチウムの形成の阻 害は認められなかった。

第２表 可溶性Ｔ４蛋白質によるＨＩＶエンベロープ−誘発シンシチウム阻害蛋白質　　 　　　　　濃度（μｇ／ｍＱ）　　　　　シンシチウム２　　　　　　　　　　 　−ｍ− ２−ｍ− Ｔ４□２蛋白質　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　　−においでＩｍｎ の容積で）（ＩＶのＨＸＢｅ２株で感染された５Ｘ１０’ジヤーカド（Ｊｕｒｋ ａｔ）リンパ細胞と共に同時培養された。同時培養の開始後１０時間で、希釈が なされ、１ｒｎＱ当たりのシンシチウムの数が見積もられた（−ｍ−、＞１００ ０；−−１５００−１０００；＋、５０−５００゜−１＜５０） Ｔ４ｇｒｚ生成物により観察されたシンシチウムの阻害がエンベロープ発現細胞 との、又はＣＤｄ＋“標的”細胞との相互作用によるものであるか否かを判定す るために、これらの細胞のいずれをも別個にＴ４．、。

蛋白質と共にインキュベートし、洗浄し、次いで共培養検定に使用された。第３ 表はエンベロープ判定細胞（Ｈ９／ＨＴＬＶＩ［ＩＢ）の予備処理がエンベロー プ発現及びｃＤ４＋８　（ＳｕｐＴＩ）ＩＢ胞の予備処理を同様にシンシチウム の阻害に効果的であったことを示している。対照的に、Ｔ４□、２蛋白質と共に “標的”５ｕｐＴｌ細胞をインキュベートしてもシンシチウムの形成にはほんの 僅かな効果しか示さなかっｔ；。従って可溶性ＣＤ４断片はエンベロープ発現細 胞との相互作用を通じてそのシンシチウム阻害効果を及ぼすものと思われる。

第　　　　３　　　　表 エンベロープ発現細胞との相互作用によるシンシチウム形成の阻害Ｈ９／ＨＴＬ ＶＩＩＩＢ＋ 卵アルブンミン　　　　　　１５６０　　　　　　　　１１２００Ｈ９／ＨＴＬ ＶＵＩＢ＋ Ｔ４．、、　　　　　　　　　　１３０　　　　　　　　　１２０約ｌＸｌ０’ 　　Ｈ９／ＨＴＬＶＩ［ＩＢリンパ細胞又１；ｔ４ＸｌＯ’５ｕｐＴｌ！Ｊ７パ 細胞を卵アルブンミン又はＴ４−、ｘ蛋白質を有する培地中で２０　ｐｙ　Ｉｍ ｎの濃度で３７°Ｃで１０分間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離し、 緩衝された食塩水で洗浄し、遠心し、培地中に再分散した。次いで処理されたＨ ９／ＨＴＬＶＩ［［Ｂを２４ウエルのディツシュ中で処理された５ｕｐＴｌ細胞 と混合し、３７°ｃ１５％ＣＣｈのイアキュベーターに５時間戻し、ウェル当た りの合計シンシチウムを計数した。

可溶性ＣＤ４断片によるクラスＩＴＭＨＣ認識行為の阻害の欠如ＣＤ４機能はク ラス■特異的ＣＴＬ及びＩａ制限ヘルパーＴリンパ細胞の活性化を容易にするた めに必要であるから、同じＴ４９．蛋白質がＣＤ４＋リンパ細胞の生理的な応答 を廃止するか否かを試験するために実験を行った。これに関して、二種類の実験 が実施された。第一の実験はＣＤ４＋細胞溶解クローンＡＡ８により仲介された クラスＩ［ＭＭＣに向けられた障害（ｋｉｌｌｉｎｇ）に及ぼすＴ４．１の効果 を試験した。Ｔ４＋細胞溶解クローンＡＡ８は同種ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系統ラ ックス（Ｌａｘ）５０９上のクラスＩ［ＭＨＣ遺伝子生成物について特異的であ る。第３図を参照すると、”Ｃｒ標識ラックス５０９細胞は分泌されたＴ４−２ （△）又は対照蛋白質（ＢｓＡ（ロ））と共に二７エクター細胞の添加の前に、 ４°Ｃで３０分間予備インキュベートされた。他のウェルには、抗Ｔ４　（１９ Ｔｈｙ５Ｄ７）（Ｃ））及び抗ＣＡＬＬＡ　　Ｊ５　（ダナ・ファーバー［Ｄａ ｎａ　Ｆａｒｂｅｒ）癌研究所、ボストン、ＭＡ、のジエローム・リッツ（Ｊｅ ｒｏｍｅ　Ｒ４ｔｚ１氏から恵与された）（・）抗体が阻害剤として使用された 。

分泌されたＣＤ４断片阻害剤と共に標的細胞（３０００細胞／ウエル）を予備イ ンキュベートした後、３０：ｌのＥ／Ｔ比で標準的な４ｈ”Ｃｒ放出検定法で透 析液を測定した。示された結果は標準偏差が１０％よりも大きい四通りの試料の 平均である。

図示のように、対照蛋白質ＢＳＡ及び抗Ｔ８単りローン性抗体と同様に、Ｔ４１ □は１００μｇ／顧もの高濃度でもＣＴＬエフェクターの機能の阻害に役立たな い。対照的に、特異的抗Ｔ４　（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）単クローン性抗体は１−３ μ９／顧の少量でも細胞溶解を５０％以下に減少させた。Ｔ４．、、も細胞溶解 には効果がなかった。

可溶性ＣＤ４断片によるＴ−細胞増殖に及ぼす効果の欠如下記の実験はＴ４＋テ タヌス・トキソイド特異的、クラスｎＭＨＣ制限ヘルパーＴ細胞クローンＣＴＴ ７の増殖に及ぼすＴ４．、ｌの効果を測定するために行われた。第６図を参照す ると、増殖実験のために標準的クローニング法により誘導されたテタヌス・トキ ソイド特異的クローンＣＴＴ７の５０，０００細胞／ウエルが１％のベンースト レプ（ｐｅｎ−ｓｉｒｅｐ）及び２％のグルタミン単独を追加された１０％のＦ 　ＣＳ／ＲＰＭ　１１６４０中で、ＩＯｐｇ／ｍ（ｌのテタヌス／トキソイド（ ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅ ａｌｔｈ、ｊａｍａｉｃａ　Ｐｌａｉｎｓ　ＭＡ）と共に又はテタヌス・トキソ イド（ＴＴ）及びｌＯ％自原性のマクロファージ（ＭＯ）との組み合わせで、最 終濃度４０　ｐｇ／ｍＱの卵アルブミン（ｏｖａ）　、抗Ｔ４、抗Ｔ８、又は二 回免疫吸収されたＴ４．、、の存在又は不存在において、６％のＣＯ２を含む湿 った雰囲気中で３７℃で２４時間培養した。引き続き、ウェルにｌ、ｕｃｉ／ウ ェルの”Ｈ−ＴｄＲを加えた。自動細胞採取器を用いて４８時間で細胞を採取し た。プラス記号（＋）は所与の添加剤の存在を示す。

第６図に示すように、ＣＴＴ７クローンはテタヌス・トキソイド及び０原性抗原 提供細胞の存在においてのみ活性化されて増殖を受ける。４０μｇ／蛯の濃度に おいて、抗ＣＤ４　（１９Ｔｈｙ５Ｄ７）単クローン性抗体はヘルパーＴ細胞応 答におけるＣＤ４の重要な役割と一致して８０％組み込まれた３Ｈ−ＴｄＲを示 した。対照的に、当量のＴ４ｅ、＋、卵アルブミン、又は抗Ｔ８単りローン性抗 体は効果を有していない。

従ってＴ４２．蛋白質はＨＩＶｇｐ１２０に結合し、それによってｇｐ１２０の 他の受容体への結合を阻害し、ＨＩＶエンベロープ誘発誘発シンクチウム形成Ｈ ＩＶ複製を阻害し、これらの実験条件と同一の濃度では、クラス■指向性生理的 Ｔ細胞応答を認識できる効果を持たない。この差異の基本は解決されるべき問題 としである。一つの可能性はｇｐ１２０に対するＣＤ４の親和性はその天然のり ガント（多分クラス■ＭＨＣ）に対するＣＤ４親和性よりも事実上高い。更に、 ＣＤ４はＣＴＬ及び標的又は誘導物質Ｔ細胞及び抗原提供細胞の間の細胞−細胞 相互作用を容易にする数種の要素（他者はＬＦＡ−１、Ｔｌ１等を含む）の唯一 つであるから、”ｒ４ｅ、＋蛋白質でのＣＤ４機能の部分的妨害はなおＴ細胞活 性過程を阻害されずに残すことができる。

従ってピコモル範囲の可溶性ＣＤ４断片の濃度であっても、或種の抗Ｔ４単りロ ーン性抗体のように、ンンシチウムの形成及びＨＩＶの感染を阻害する。しかし 、抗Ｔ４と対照的に、可溶性ＣＤ４蛋白質の効果はｇｐ１２０発現細胞のレベル で働く。更にクラス■特異性子細胞相互作用は機能的に可溶性ＣＤ４蛋白質によ り邪魔されないが、それらは同じ実験条件下では当量の抗Ｔ４抗体により事実上 妨げられる。この選択的な効果が抗体に比較してｇｐ１２０に対するＣＤ４の親 和性の結果であるか否かは、決定すべき問題である。しかし、本発明はＣＤ４蛋 白質の細胞外セグメント又はそれから誘導されたペプチド断片がＴリンパ細胞上 の天然の膜透過ＣＤ４構造とウィルスｇｐ１２０蛋白質の間の相互作用を競合的 に阻害するのに有用である。更に、これらの可溶性ＣＤ４蛋白質はｇｐ１２０− ＣＤ４相互作用を妨害する薬剤を検出するように設計された検定法の確立を可能 としなければならない。重要なことは、Ｔ４１．蛋白質自体又はＴ４３．から誘 導された断片は、健康な細胞上の表面ＣＤ４の生理学的な正常な役割を妨害する ことなく、Ｔリンパ細胞、単核細胞、又は脳細胞上の膜に結合したＣＤ４へのｇ ｐ１２０の結合を阻害する点で臨床的に有用性を有している。

実施例　２　　Ｔ４．、蛋白質及び誘導されたペプチド断片とＨＩＶｇｐ１２０ との相互作用の評価 Ｔ４．１蛋白質又はそれらの誘導されたペプチド断片とｇｐ１２０との間の特異 的な物理的相互作用を更に分析するために、５ＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズ分画 及びそれに続くポリ二弗化ビニルアジン膜上へのＴ４６．３．蛋白質のエレクト ロブロッティングを含む方法が使用された。Ｔ４ｅ１２（中和された免疫親和性 溶離液中の７５μｇ）を、４０ｍＭＣａＣ１，を含む１／９容積の０．９Ｍトリ ス−ＭＣ１％ｐＨ８，０の０．９容積と混合した。ＴＰＣＫ）リプシン（Ｗｏｒ ｔｈｉｎｇｔｏｎ）を酵素対蛋白質の比率を１：５０（重量７Ｍ量）として添加 し、３７℃で消化を行った。１Ｏ１２０及び４５分間に２５μ９のアリコートを 取り出した。非還元ＳＤＳ試料緩衝液の添加し、１００℃に５分間加熱すること により消化を停止した。アリコートを非還元条件下で１２，５％のミニスラブゲ ル上で電気泳動にかけた。引き続きマツダイラの方法を用いて二弗化ポリビニリ デン膜（ミリポア；孔径０．４５μｍ）上でエレクトロブロッティングを行った 。Ｐ、　Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２：１ ００３５（１９８７）。重複路のトラックは室温で２時間クーマシー青で染色さ れるか又はＰＢＳ／アジｒ中の５％ドライミルク溶液で粘着された。粘着後のエ レクトロプロットは、ＨＩＶｇｐ１２０の反応性を試験するためにミニプロッタ ー装置（インミニーンティックス［Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｋｓ］）及びＰＢＳ中の １％ドライミルク中に、５０．ｕｎの精製された天然ＨＩＶｇｐ１２０を２０μ ｇ／ｍＱの濃度で充填された適当なトラックを含むスロット中に組み込まれた。

振盪して４℃で一夜インキュベーションを行った。ＰＢＤｌｏ、０５％トリトン Ｘ−１００で５分間三回洗浄した後、プロットをＰＢＳ中の１％ミルク２５ｍＱ 中に希釈された、放射性沃素化されたマウスの単りローン性ＩｇＧ、抗ＨＴＬＶ Ｉ［Ｉｇｐ１２０　２．６ｐｇ　（比活性、２ｐＣｉ／μｇ）と共に室温で１時 間、次いで４℃で１時間インキュベートした。

更にミロトリトンＸ−１００で洗浄し、ＰＢＳで二回洗浄した後、プロットを風 乾し、−７０℃でオートラジオグラフィー測定された（プレフラッシュされたコ ダックＸＡＲフィルム及び増感スクリーンを使用して）。適当な場合は関心のあ る染色バンドを切り取り、０３ＲＰＴＨプログラムを使用したオンラインＰＴＨ アナライザー（１２ＯＡ）を用いて、ガス相蛋白質シーケンサ−（ｓｅｑｕｅｎ ｃｅｒ）　（アプライドバイオシステム４７ＯＡ）により配列分析を行った。

未還元で電気泳動された時の５０ＫＤ　　ＭＷにおけるＴ４．、ｔのシングル・ バンドはＨＨＩＶｇｐ１２０に強く結合することが示された。対照的に、還元さ れたか又は還元されそしてアミドメチル化された、同一量のＴ４．、、は、同様 に検査した時にｇｐ１２０に結合しなかった。還元され及びアルキル化されたＴ ４．、、へのｇｐ１２０の結合の欠如は、同時に起こる還元されたＴ４゜０への ｇｐ１２０の結合の欠如によって示されるように、システィン残基自体のアルキ ル化の際の修飾によるものではない。還元後のＴ４．１蛋白質の電気泳動移動度 は還元されない場合よりも遅く、ヒトＴ４の外部セグメント中に鏡開ジスルフィ ド結合があるという予想と一致する。更に、５０ＫＤの単一成分としての非還元 Ｔ４．８□蛋白質の移動は、純粋な蛋白質がＴ４−２蛋白質のジスルフィドで連 結された重合体を含まないことを示す。考え合わせると、これらの結果は、これ らの条件下でのＴ４．、蛋白質のｇｐ１２０への結合が、恐らくはそれらの結合 領域の三次構造を安定化する、無傷のジスルフィド結合の存在に依存するものと 思われることを示している・上記のように行われた精製されたＴ４．。蛋白質の 酵素断片化は広範囲の断片を生じた。４５分間パパイン消化から得られたプロッ トされた物質のＨＩＶｇｐ１２０結合分析は５０ＫＤ残留Ｔ４．、ｒ蛋白質によ る予想された結合以外に、ｇｐ１２０と結合する２８ＫＤの移動度を有する断片 が存在することを示している。２８ＫＤ断片を明確に同定し、精製するために、 ４０倍以上のＴ４　、、ＪＦ白質がパパインで消化され、調製用５Ｄｓ−ＰＡＧ Ｅで分離された。プロットの部分はｇｐ１２０結合のための分析に付され、及び 染色されたプロットのジンシトメトり一的走査とオートラジオグラフとの比較は ２８ＫＤ物質が、同じトラック中の残余の７４　、、ｌに結合されたものと同様 の相対量のｇｐ　ｌ　２０に結合していることを示した。従って２８ＫＤの断片 は元のＴ４．．２蛋白質と同じ効果を持ってＨＩＶｇｐ１２０に結合していた。

２８ＫＤのバンドをこの同じプロットのクーマシー青染色蛋白質から切り取り、 アミノ酸末端微量配列分析に付された。最初の１１サイクルではＫＫＶＶＬＧＫ ＫＧＤＴの配列のみを生じ、２８ＫＤ断片はＴ４ｅ、＋蛋白質のアミノ末端領域 から誘導された無傷のポリペプチド鎖であることを示している。各アミノ酸の平 均ＭＷが１１０ダルトンであると仮定すると、２８ＫＤ断片を生じるＴ４．１□ のパパイン開裂は１５９位に於けるシスティン残基へのＣ末端であり、２５６及 び３００位におけるオリゴサツカライド付加部位に最も近いドメイン３を有する ものとして位置付けることができる（第７Ｃ図）。従ってＨＩＶｇｐ１２０のＴ ４−＋への結合は、Ｔ４構造のＮ−結合グリコシル化部位、又はドメイン４の両 者を含む、ドメイン３中のアミノ酸のＣ末端の範囲を含まない。この結果は蛋白 質のＮ−末端領域中にあるとしてＴ４のｇｐ１２０結合部分を明確にするもので ある。

同様な実験は更にｇｐ１２０結合断片の性質を明らかにするためにＴ４−のトリ プシン断片化を利用した。トリプシンを用いるＴ４．．２蛋白質の消化は、パパ イン消化の場合に見られたものと異なる一連の断片を生じる。ｇｐ１２０結合に 対する４５分間のトリプシン消化から分離された断片の分析によれば、消化後に 残った痕跡量の５ＱＫＤＴ４．．２により生じた弱いシグナルのみを示す。４５ 分間消化物のプロットから誘導された強くクーマシー染色する４５ＫＤ復合バン ドのアミン末端配列は、リジン残基７及び７５におけるトリプシン開裂、及びリ ジン７２における開裂に対応する少量の配列を示している（第７Ｃ図）。この物 質には他のシグナルは見みられず、これらの三種のりジン残基はトリプシンに対 して極めて不安定であること、及び１−７残基のかような開裂及び又は／喪失は ｐｇ１２０の結合を妨害するのに充分である。

一層制限された消化を用いて、ｇｐ　ｌ　２０結合トリプシンＴ４　、、、断片 を得ることができる可能性を研究するために、Ｔ４□、にお２０分間トリプシン 消化からの４Ｏ−４５ＫＤ領域中で移動する物質を検査し、ｇｐ　ｌ　２０との 結合がないことが明らかとなった。１０分間のトリプシン消化から誘導された４ ５ＫＤ物質の微量配列分析によれば、二つの主要なシグナルを持ち、一つはリジ ン７２での開裂に対応する、混合した配列が示された。更に一つはりジン７の開 裂から誘導され、他はりジン７５の開裂による二つの小さいシグナルがあった。

この情報によれば、多分子４１、中の最もトリプシンに不安定な残基は７２のリ ジンであり、及び１−７の残基はＣＤ４へのＨＩＶｇｐ１２０の結合に単独で応 答するものではないという結論が導かれる。

トリプシン開裂後のＴ４〜蛋白質の唯一の検出し得る改質はドメイン１にあり、 これらの変化はｐｇ１２０結合を阻害することができることは、本来のドメイン １領域の本質的な役割を証拠立てるものである。Ｔ４−１のＮＨ，末１２８ＫＤ パパイン断片のＨＩＶｇｐ１２０に結合する能力はこの見解と一致する。Ｉｇ状 ドメインの本来のコンホメーションを維持するための鏡開ジスルフィド結合の必 要性が示されれば、Ｔ４．。

１又はＴ４．、、還元後のＨＩＶｇｐ１２０結合の喪失は更に上記の見解を支持 するものとなろう。

それ以上の結合部位の情報が、同じ制限トリプシン開裂が抗Ｔ４単りローン性抗 体１．９７ｈｙ５Ｄ７により認識される抗原エピトープを不安定化するのに充分 であるという観察によってもたらされる。即ち、両Ｔ４−蛋白質のトリプシン消 化物は１９Ｔｈｙ５Ｄ７免疫吸収剤をを通過し、無傷のＴ４１、蛋白質のみが結 合する。１９Ｔｈｙ５Ｄ７はＣＤ４に対するＨＩＶｇｐ１２０の結合を阻害する ことが知られているという事実はこの結果を予期しないものではなくすると同時 に、ＨＩＶｇｐ１２０結合領域、及び１９Ｔｈｙ５Ｄ７エピトープがＣＤ４の免 疫グロブリンＶ状ＮＨ，末端セグメントに局在していることを示唆する。しかし 、Ｔ４ドメイン１に対する抗体分子の寸法が大きく、従って立体的妨害の可能性 があるので、ｇｐ１２０部位に対する１９Ｔｈｙ５Ｄ７エピトープの局在は正確 には知ることができない。

Ｔ４配列中のシスティン及び多重的な他の不変的なＩｇ残基の保全、並びに二次 構造の予想は、Ｔ４分子の最初の９２残基はＩｇＶドメインに類似した三次構造 を有することを証拠立てるものである。従って７．７２及び７５の位置のりジン 残基はドメインの表面から伸びて相互に空間的に近接してクラスターを形成して いることが予想できる。恐らく■ドメインの塩橋特性を形成する、アスパラギン 酸残基（第７Ｃ図、アミノ酸７８）及びアルギニン残基（第７Ｃ図、アミノ酸５ ４）により結合された高度に保全された区域内に入る、リジン残基の場合には、 この配列が正確なことは殆ど確実である。このクラスターはＣＤ４へのＨＩＶｇ ｐ１２０の結合に包含される。

上記の結果はアミノ酸の直鎖状範囲がＣＤ４−ＨＩＶｇｐ１２０相互作用の効果 的な、高度に親和性ある阻害剤として効果的であることは無さそうであることを 指示しており：該結果はＴ４．ｆ蛋白質のジスルフィド架橋がこうした相互作用 の中心的な役割を演じていることを示している。リジン残基７２の開裂（即ち、 Ｖ状ドメイン中のシスティン残基の間の）はｇｐ１２０及び１９Ｔｈｙ５Ｄ７結 合領域の両者を不安定化するのに充分であるという発見は、この見解と一致する 。更に、これらの結果はｇｐ１２０のＴ４への結合中にＶ状ドメインを巻き込ん でいるが、１３０及び１５９位のシスティン残基（第７Ｃ図）を含むドメイン２ がＶ状ドメインｌとの関連において或役割を演じる可能性をまだ除外して産及び それらの活性の評価 Ｔ４ｃＤＮＡの修飾物はＭ１３　　Ｔ４鋳型を用いて生産された。Ｔ４、、ｃＤ ＮＡ断片は、ＢａｍＨＩを用いてプラスミドベクターｐＡｃ３７３Ｔ４．、から 切断された。プラスミドベクターｐＡｃ３７３Ｔ４．ｊ：を実施例１及びハッセ イ（Ｈｕｓｓｅｙ）、等、填胡朋、３３１　ニア８（１９８８）に記載されてい る。断片の末端はＤＮＡポリメラーゼ■でプラント（ｂｌｕｎｔ）され、断片は ＸｂａＩ結合剤にニーイングランド・バイオラプス［Ｂｉｏｌａｂｓ］）に連結 された。連結された断片はＸｂａＩで消化され、過剰な結合剤を除去するために ゲル精製され、Ｘｂａ切断Ｍ１３複製型に連結された。連結混合物をコンピテン トＴＧｌ宿主細菌中に形質転換し、平板培養し、得られるプラークをＴ４オリグ ヌクレオチドとハイブリッド形成することによりスクリーニングした。オリゴヌ クレオチドを感受するべく／１イブリッド形成するプラークは増殖され、突然変 異形成のための一重鎖Ｍ１３鋳型を生産した。

突然変異形成プロトコールはアメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａ［１１）により市販 され）に基づいている。それらの配列中に、組み込まれた時に、切断されたＴ４ 蛋白質が生じる停止コドンを生産するような、塩基の変化を含むオリゴヌクレオ チドが生産された。これは＃１８３アミノ酸において１４分子の切断をもたらし た。５’　Ｇ−ＡＡＧ−ＧＣＣ−工ΔΔ−ＡＧＣ−ＡＴＡ−Ｇの配列を含むオリ ゴヌクレオチドが合成された。正常のＴ４配列はＧ−ＡＡＧ−ＧＣＣ−工ＣＣ− ＡＧＣ−ＡＴＡ−Ｇである。こうしてＴＣＣによりコード化されたセリンが停止 コドンＴＡＡに変化し、突然変異Ｔ４蛋白質はこの点が末端となった。

突然変異オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、ｌＯμ９のＭ１３Ｔ４鋳型にハ イブリッドされｌ−０ＤＮＡの第二の鎖は、チオノヌクレオチドｄＣＴＰ−５の 存在においてフレナラ（Ｋ　ｌｅｎｏｗ）のＤＮＡポリメラーゼ断片によりＭ１ ３　　Ｔ４鋳型及びオリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成された。複製さ れなかった一重鎖ＤＮＡはニトロセルロースフィルターを通して濾過により除去 され、精製二重鎖ＤＮＡは制限酵素ＮｃｉＩでニックされた。Ｎｃｉｒはホスホ ロチオエートＤＮＡを切断しない。従って新しい鎖を含むｄＣＴＰｏ：Ｓ及び突 然変異対はニックされなかった。ニックされたＤＮＡはエキソヌクレアーゼ■で 消化され、それはニックされた、非突然変異ＤＮＡ鎖も消化した。

ギャップしたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在において、ＤＮＡポリメラーゼ ■により再合成した。この段階において、突然変異鋼は突然変異形成が両方の鎖 中にコピーされるような鋳型として役立った。

得られたＤＮＡをコンピテントＴＧＩに形質転換し、誘導されたプラークを増殖 した。−重鎖及び複製型ＤＮＡを単離し、突然変異の存在を確認するためにＤＮ Ａの配列分析を行った。突然変異したＤＮＡをｘｂａでＤＮＡの複製型から切断 し、Ｘｂａ切断ベクターＣＤＭ８に連結した。このベクターはプライアン・シー ド（Ｂｒｉａｎ　５ｅｅｄ）博士（マサチューセッツ・ゼンネラル病院）により 開発され、提供された。ＣＤＭ８はトランスフェクションに際し、ゴス細胞中に 発現される。従って突然変異Ｔ４蛋白質はゴス細胞中にトランスフェクション後 は分析できなかった。

突然変異Ｔ４ｃＤＮＡを含むＣＤＭ８は、コンピテントＭＣ１０８１Ｐ３ホスト 細菌中へのベクター挿入連結体の形質転換後に、放射性標識されたＴ４ＤＮＡに ハイブリッドすることにより同定された。ベクター中の挿入体の本来の配向はミ ニープレプ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）Ｄ　Ｎ　Ａの制限酵素分析により測定された 。大規模なプラスミドの調製物が形質転換のために使用された。

トランスフェクションのために、１３Ｘｌｏ’コス細胞がＲＰＭＩ−１０％、Ｆ ｅ２−１％、グルタミン＝１％、ペンーストレフ（Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）１０μ ｇ／ｍｌゲンタマイシンを含む１００ｃｍのディツシュ中で平板培養された。１ ２−２４時間後に、細胞をＰＲＭＩで洗浄し、４００ｇｇ／ｍＱのＤＥＡＥデキ ストラン及び４５μｇのグラスミドＤＮＡを含む４ｍＱのＤＭＥの存在において 、２−２．５時間インキュベートされた。

細胞をＲＰＭＩで洗浄し、ｌＯｍＱのＤＭＥ−２％、Ｆｅ２−１％、グルタミン １５ベン−ストレフ−１０ｐｇ／ｍＱゲンタマイシン−１２０ｇＭクロロキン中 で３時間インキュベートした。細胞をＲＰＭＩ洗浄し、始めの培地中で２日間イ ンキュベートした。

実施例　４　修飾された可溶性ＣＤ４断片の生産方法：　１．１７ＫｂＴ４ｔ、 、断片をＢａｍＩを用いてＡＣ３７３／Ｔ４ｔｗｌから切断し、ＤＮＡポリメラ ーゼ■のフレナラ断片を用いてプラントし、Ｘｈ０１結合剤にニーイングランド ・バイオラプス）に連結し、ベクターＣＤＭ８のＸｈｏＩ部位にスブ・クローン （ｓｕｂｃｌｏｎｅ）　シた。ハックジョンするために、２−３ＸＩＯ’細胞を ｌＯ％胎児牛血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）を含むＲＰＭＩ　１６４０　（ギブコ［Ｇｉｂ ｃｏ］）を入れた１ｏＯＸＩＯｃ＋１デイツシユ中で平板培養した。１２ないし ２４時間後に、４５μりのプラスミンＤＮＡを２　、５　ｒｎＱのＰＲＭＩに添 加し、２．５蛯のＰＲＭＩ−８００ｇｇ／ｍＱＤＥＡＥデキストランと混合し、 次いで洗浄したコス細胞に添加した。３７°Ｃで約２時間後に、細胞を洗浄し、 次いで２％ＦＣ３，１％グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、ｌ Ｏμｇ／ｍＱゲンタマイシン及び１５０ｇＭクロロキンを含むＰＲＭＩ中でイン キュベートシた。代謝標識のために、トランスフェクトされたコス細胞（トラン スフェクション後２日）をｌＯ％ＦＣ３を含む５ｍＱのＰＲＭＩマイナスシステ ィン中で１時間インキュベートした。培地を取り去り、細胞を１０％の透析され たＦｅ２及び１００μＣｉ　／ｍＱ”　Ｓ−システィンを含むＰＲＭＩマイナス システィン中で３７℃で５−６時間インキュベートした。取り出した上澄み液を ２００ｇで１０分間遠心し、ＰＢＳｌｏ。

０２５％アジド／１０ｍＭ冷システインンに対し４℃で一夜透析した。

免疫沈降のために５ｍｆｆの透析した３ｓＳ−システィン標識上澄み液を、２０ μ０の抗Ｔ８抗体（２１Ｔｈ　ｙ　２Ｄ３）を用いてアフィゲル−１０（バイオ ラド）ビーズ（１ｍ１２のビーズ当たり約５Ｔｎｇの抗体）上で４°Ｃで４５分 間インキュベートすることにより予備清浄化した。次いで予備清浄化した上澄み 液を７フイゲルーＩＯビーズ上で４℃で３時間２０μαの抗ｃＤ４　（１９Ｔｈ ｙ５Ｄ７）を用いてインキュベートした。ビーズをｌＯｍＱのトリス、ｐＨ６， ８１０，１％トリトンＸ−１００１０，１％５ＤＳ１０．５％ＤＯＣ中で一度、 ±１ｍＱの同じ緩衝液中で一度及び１ｒｘＱの０、ＩＮグリシン、ｐＨ５，０１ ０，１％トリドアＸ−１００中で一度洗浄し、次いで３５ｐＱ　（７）Ｏ，１Ｍ グリシン、ｐＨ２１０，１％トリトンＸ０１００で溶離し、６μＱの１Ｍトリス 、ｐＨ７，６で中和した。試料を０．７５又は１．５ｍｍの１２，５％ミニ−ポ リアクリルアミド−３ＤＳ−ゲル上で非還元的条件下で処理した。ゲルを固定し 、乾燥し、約７０℃で１−７日オートラジオグラフ処理をした。抗ＣＤ８を用い てアフイゲル−１０ビーズ上で２０μＣの抗ＣＤ８を免疫沈降し使用する以外は 、免疫沈降を上記にように行った。ｇｐ１２Ｑ（ポロ不ン［Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ ｌ博士・ジニーク大学より恵与）との共沈降のために、０．５蛯の標識された上 澄み液を６７ｎｇの野生のｇｐ１２０と共に３７°Ｃで２時間インキュベートし た。５００　ｎｇの抗ｇｐ１２０（デュポン）及び１０μｍＱの兎の抗−マウス ＩｇＧセブナローズ（Ｓｅｐｎａｒｏｓｅ）　４　Ｂビーズを添加し、４℃で３ 時間回転した。ビーズを一度１ＯＩＩｌＱの冷ＰＢＳ、及び一度１ｒｎＱの冷Ｐ ＢＳで洗浄し、溶離し、試料を上記のように５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で操作した。

ＣＤ４蛋白質（１８２アミノ酸の長さ）オリゴヌクレオチド部位指向の突然変異 形成のチオヌクレオチド方法を用いて創出した。テーラ−Ｊ。

Ｗｏ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３：８７４９−８７６５（１９ ８５）；テーラ−」、Ｗ９等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３：８７ ６５−８７８（１９８５）；ナカヤマ等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、 １４：９６７９−９６９８（１９８６）。Ｔ４−＋のＸｈｏＩ挿入はＣＤＭ８か ら切断され、ＸｂａＩ結合剤にニーイングランド・バイオラブ）に連結されたフ レナラのＤＮＡポリメラーゼエでプラントされ１、及びＭ１３ｍｐｌａ中にスブ クローンされた。−重鎖ＤＮＡは鋳型として製造され、突然変異形成は製造者の 推奨法（アメルシャム）に従って行われた。１８２アミノ酸切断のために、オリ ゴヌクレオチド５’　ＧＡＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＡＴＡＧ３°は標準的シアノエ チルホスホロアモダイト化学を用いて合成された。アミノ酸１８３におけるセリ ンを停止コドンに転換する終結コドンが明示される。突然変異の存在はＭ１３ｍ １８−７４構造の配列分析により確認され、突然変異含有ＤＮＡの複製型のミニ ープレフが製造された。変化した挿入体はＸｂａｌで切断され、ＣＤＭ８のＸｂ ａＩ部位中に連結された。突然変異の存在は二重鎖ＤＮＡを鋳型として使用して ＣＤＭＥ−Ｔ４挿入体を配列分析することによって直接確認された。明示されて はいないが、オリゴヌクレオチドＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＡＧＧＧＧＣＡＧを用い てアミノ酸１１０で切断が初めて行われた。

実施例　５　　ＣＤ４部位指向突然変異体の生産及び分析１６ｃＤ４突然変異体 が実施例４に記載されたように構成された。第１表に示すように標準部位指向突 然変異形成プロトコール（実施例４）中で各１ないし４アミノ酸置換基を含むヒ トのＣＤ４分子の種々の変形物を形成するために、１５のオリゴヌクレオチドが 使用された。その結果として、第１表に指摘された位置におけるヒトＣＤ４蛋白 質に通常存在するアミノ酸残基（第１表参照）がマウスのＣＤ４配列の等価の位 置に存在するアミノ酸によって置換された。

これらの突然変異体、Ｍ３、Ｍ９及びＭ１４は改質された９ｇｐ１２０結合能力 を立証した一Ｍ３はｇｐ１２０に結合できず、Ｍ９はｇｐ１２０結合能力が事実 上減少しており、及びＭ１４は又減少したｇｐ１２０結合能力を示している。

各々においてなされたアミノ酸の置換は下記のようである：Ｍ３アミノ酸４酸二 ８：Ｐに変換 アミノ酸５０：にはＰに変換 アミノ酸５１：ＬはＳに変換 Ｍ９アミノ酸１２１：ＰはＳに変換 アミノ酸１２２：ＰはＫに変換 アミノ酸１２３：ＧはＶに変換 Ｍ１４アミノ酸ｔｓｓ：ＧはＤに変換 アミノ酸１５６：ＴはＦに変換 アミノ酸１５８：ＴはＮに変換 Ｌ：ロイシン　　　　Ｄ：アスパラギン酸当業者は日常的実験法を出ない実験を 使用して、本文に記載された特定の具体化である多くの等価物を認識又は確認す るであろう。かような等価物は本発明の範囲内に包含されるものと思考される。

Ｆ工ＧＯＲＥ　　１ ＦＩＧＵＲＥ　ｌ　ｆｃＯＮＴ’Ｄｌ Ｆ工ＧＵＲＥ　　１　　（ＣＯＮＴ’ＤＩｑ　ａｌ　　ｐ　（ｉＹａ（ｉｓｑｎ ｌｔＬａｌａａｋｔ＋＋＋＋、＋＋＋＋＋＋＋＋＋、＋−−−＝−−−−−−− −＋＋＋＋、＋−＋ｇ＋＋＋、＋＋−一−＋＋＋、−＋＋−：：。

ｇｋｌｈｑｅｖｎｌｖｖｍｒａｔｑｌｑｋｎ−−一−１−一一一一一一一、−一 一一〒−＋−＋、−−−−−−−＋、　−−−−−−−−−、−−−−−−−− ＋、−−−−−ＩＣＣｇ　　ｍ　　ｗ　　ｑ　　ｃ　　ｌ　　ｌ　　ｓ　　ｄ　 　ｓ　　ｑ　　ｑ　　ｖ、　　ｌ　　ｌ　　ｅ　　ｓ　　ｎ　　ｉ　　ｋ−一− −、−−−１−−−−１−−−−ふ−”−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−、−−−−−−−−−１−−−−−３６０４τア祠Ｆｌ　リ１屓　　 　　　　９１コ／而）Ｆ工ＧＵＲＥ　　７Ｃ、−、−−−、、、−、、、、−、 −、、−、、、−−−−、−−−１，１−、−−−−１゜Ｆ工ＧＵＲＥ　　９ Ｆ工ＧＵＲＥ　　１０ 国際調査報告 １内１・判１１りｎａｌ＾””””””ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３４５４国際調査 報告

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト免疫不全ウイルスのｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質への結合能力 を有する可溶性ヒトＣＤ４断片。
2. ２．前記可溶性ヒトＣＤ４断片がＨＩＶに感染していないヒトＴリンパ球の機能 及び増殖を妨げず、該可溶性断片がＣＤ４のトランスメンブラン部分を全然含ま ないか又は該トランスメンブラン領域の一部しか含まず、該トランスメンブラン 領域の一部は、該断片の可溶化を妨げない程度に十分に小さい、請求の範囲第１ 項記載の可溶性ヒトＣＤ４断片。
3. ３．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質への結合能力を有し、ＨＩＶに 感染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない可溶性ヒトＣＤ４断片 であって、第１図のアミノ酸配列のすべて又は一部を含んで成る可溶性ヒトＣＤ ４断片。
4. ４．ＨＩＶｇＰ１２０エンベロープタンパク質への結合能力を有し、ＨＩＶに感 染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない修飾された可溶性ヒトＣ Ｄ４断片であって、該断片は、ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列から少なく とも１個のアミノ酸が欠失しているか、ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列に おいて少なくとも１個のアミノ酸が置換されているか、又はヒトＣＤ４タンパク 質のアミノ酸配列に少なくとも１個のアミノ酸が付加されていることにより、可 溶性ヒトＣＤ４タンパク質とは異なる、修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
5. ５．ＨＩＶｇｐ１２０への結合能力を有し、ＨＩＶに感染していないヒトＴリン パ球の機能及び増殖を妨げない修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片であって、本質 的に、第１図に示されたヒトＣＤ４タンパク質の最初の１８２のアミノ酸から成 る、修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
6. ６．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質への結合能力を有し、ＨＩＶに感 染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない修飾された可溶性ヒトＣ Ｄ４断片であって、本質的に、ヒトＣＤ４タンパク質の最初の３６９のアミノ酸 から成る、修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
7. ７．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質への結合能力を有し、ＨＩＶに感 染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない修飾された可溶性ヒトＣ Ｄ４断片であって、本質的に、ＣＤ４タンパク質のドメイン１、２及び部分ドメ イン３から成る、修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
8. ８．可溶性ＣＤ４タンパク質のアミノ酸配列がアミノ酸位置２４３でトランケー ションされている、請求の範囲第７項記載の修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
9. ９．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質への結合能力を有し、ＨＩＶに感 染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない修飾された可溶性ヒトＣ Ｄ４断片であって、１）ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸位置２７１に存在する アスパラギンがアスパルテートであり、そしてヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸 位置３００に存在するアスパラギンがアスパルテートであるか、２）ヒトＣＤ４ タンパク質のアミノ酸位置２７１に存在するアスパラギンがアスパルテートであ るか、３）ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸位置３００に存在するアスパラギン がアスパルテートである修飾された可溶性ヒトＣＤ４タンパク質から本質的に成 る、修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
10. １０．ａ．第１図の最初の５４９個のヌクレオチド、ｂ．第１図の最初の７２９ 個のヌクレオチド及びｃ．第１図の最初の１１０７個のヌクレオチドから成る群 より選ばれるヌクレオチド配列によりコードされている、生物学的に活性な修飾 された可溶性ヒトＣＤ４断片。
11. １１．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合し、ＨＩＶに感染してい ないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片 であって、アミノ酸配列が第１図に示されているヒトＣＤ４断片に存在するＮ− 結合グリコシル化部位を含まない、修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片。
12. １２．ヒトＣＤ４タンパク質のドメインＩ及びドメインＩＩから本質的に成る、 ＨＩＶｇｐ１２０に結合することができる可溶性ペプチド。
13. １３．本質的に１７９のアミノ酸から成る、ＨＩＶｇｐ１２０に結合することが できる可溶性ペプチドであって、第１図に示されたヒトＣＤ４タンパク質のドメ インＩ及びドメインＩＩのアミノ酸配列を有する可溶性ペプチド。
14. １４．改変されたｇｐ１２０結合能力を有する修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片 。
15. １５．減少したｇｐ１２０結合能力を有する請求の範囲第１４項記載の修飾され た可溶性ヒトＣＤ４断片。
16. １６．高められたｇｐ１２０結合能力を有する請求の範囲第１４項記載の修飾さ れた可溶性ヒトＣＤ４断片。
17. １７．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質への結合能力を有する可溶性ヒ トＣＤ４断片をコードしているＤＮＡ。
18. １８．更に、ＨＩＶに感染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない 可溶性ヒトＣＤ４断片をコードしている請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ。
19. １９．ＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質への結合能力を有する修飾され た可溶性ヒトＣＤ４断片をコードしているＤＮＡ。
20. ２０．更に、ＨＩＶに感染していないヒトＴリンパ球の機能及び増殖を妨げない 修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片をコードしている請求の範囲第１９項記載のＤ ＮＡ。
21. ２１．アミノ酸配列が第１図に示されているヒトＣＤ４断片に存在するＮ−結合 グリコシル化部位を含まない生物学的に活性な修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片 をコードしているＤＮＡ。
22. ２２．ヒトＣＤ４タンパク質の最初の１８２のアミノ酸から本質的に成る、ＨＩ Ｖｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合することができる修飾された可溶性 ヒトＣＤ４断片をコードしているＤＮＡ。
23. ２３．ヒトＣＤ４タンパク質の最初の３６９のアミノ酸から本質的に成る、ＨＩ Ｖｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合することができる修飾された可溶性 ヒトＣＤ４断片をコードしているＤＮＡ。
24. ２４．アミノ酸配列がアミノ酸位置２４３でトランケーションされている修飾さ れた可溶性ヒトＣＤ４断片をコードしているＤＮＡであって、ＣＤ４タンパク質 のドメイン１，２及び部分ドメイン３から木質的に成るＣＤ４断片を生じさせる ＤＮＡ。
25. ２５．１）ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸位置２７１に存在するアスパラギン がアスパルテートであり、そしてヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸位置３００に 存在するアスパラギンがアスパルテートである修飾された可溶性ヒトＣＤ４タン パク質をコードしているＤＮＡ、２）ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸位置２７ １に存在するアスパラギンがアスパルテートである修飾された可溶性ヒトＣＤ４ タンパク質をコードしているＤＮＡ、及び３）ヒトＣＤ４タンパク質のアミノ酸 位置３００に存在するアスパラギンがアスパルテートである修飾された可溶性ヒ トＣＤ４タンパク質をコードしているＤＮＡから成る群より選ばれるＤＮＡ。
26. ２６．第１図に示された修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片をコードしているヌク レオチド三塩基連鎖を含んで成るＤＮＡであって、ａ．ヒトＣＤ４タンパク質の 位置４８のアミノ酸をコードしているヌクレオチド三塩基連鎖、 ｂ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置５０のアミノ酸をコードしているヌクレオチド 三塩基連鎖、 ｃ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置５１のアミノ酸をコードしているヌクレオチド 三塩基連鎖、 ｄ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置１２１のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ド三塩基連鎖、 ｅ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置１２２のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ド三塩基連鎖、 ｆ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置１２３のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ド三塩基連鎖、 ｇ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置１５５のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ド三塩基連鎖、 ｈ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置１５６のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ド三塩基連鎖、 ｉ．ヒトＣＤ４タンパク質の位置１５８のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ド三塩基連鎖、 から成る群より選ばれる前記ＤＮＡにおける少なくとも１つのヌクレオチド三塩 基連鎖部位で、ネズミＣＤ４タンパク質の対応する位置に存在するアミノ酸をコ ードしているヌクレオチド三塩基連鎖により置換されている場合を除いたＤＮＡ 。
27. ２７．ＨＩＶを含む流体とＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合する ことができる修飾された可溶性ＣＤ４断片とを、ｇｐ１２０エンベロープタンパ ク質と該断片との結合が起こるのに適当な条件下に接触させることより成る、試 験管内でＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質を結合させる方法。
28. ２８．生物学的試料とＨＩＶのｇｐ１２０エンベロープタンパク質に結合するこ とができる修飾された可溶性ＣＤ４断片とを、該断片と該ｇｐ１２０エンベロー プタンパク質との結合が起こるのに適当な条件下に、一緒にすることより成る、 生物学的試料中に存在するＨＩＶを結合させる方法。
29. ２９．請求の範囲第４項の修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片を含んで成るコンド ーム。
30. ３０．殺精子剤と請求の範囲第４項の修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片とを含ん で成る組成物。
31. ３１．請求の範囲第４項の修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片を含んで成る、血液 採集、血液処理及び／又は血液貯蔵用の装置。
32. ３２．請求の範囲第４項の修飾された可溶性ヒトＣＤ４断片を含んで成る医学的 下着。