JP2852515B2 - ベクターウイルスおよびベクターウイルスを含む薬用組成物 - Google Patents
ベクターウイルスおよびベクターウイルスを含む薬用組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は腫瘍特異抗原のための配列の全てもしくは一
部を有する組換え体ベクターウイルスと、人間もしくは
動物における前記腫瘍の予防もしくは治療におけるその
利用、さらに詳しくはベクターウイルス、これに感染し
た哺乳動物細胞、これに由来する腫瘍特異蛋白質および
その製造法、これらを利用した薬用組成物ならびにこれ
らに対応する抗体に関するものである。 （従来の技術） 腫瘍細胞は、自然のものであるかウイルスによって誘
発されたものであるかに関係なく、それらの表面に新し
い抗原を有することがある（１）。腫瘍特異抗原（Ｔ抗
原）は既にヒト癌腫を診断（２）および視覚化（３）す
るために用いられている。 より新しくは特定の抗腫瘍療法における標的としての
これらの使用が着想された。抗Ｔ抗体の投与は、自由型
でも毒素もしくは放射性同位元素に結合した型でも、い
くつかの臨床例の治療において既に望みのある結果をも
たらしている（４）。 さらに、Ｔ抗原を発現する死細胞の接種（５−７）、
抗Ｔ免疫グロブリンの可変部に対する抗イディオタイプ
抗体の誘発（８−９）もしくはＴ抗原自体の注入（10）
等の異なったアプローチに従って、Ｔ抗原に対する宿主
特異性免疫反応を刺激するのを試みることも可能であ
る。これらの実験は、入手可能な抗原の量により制限さ
れ、また抗腫瘍免疫において特に重要な細胞型免疫反応
には抗原と宿主の組織適合性決定基とを同時に供給する
ことが要求されるという事実によって制限される（1
1）。 （発明が解決しようとする問題点および問題点を解決す
るための手段） 本発明は生きた組換え体ウイルスによる、生体内で抗
腫瘍免疫を誘発することのできるＴ抗原もしくはその重
要部分の発現に関するものである。実験モデルとして使
用され、実施例において詳述されるＴ抗原はポリオーマ
ウイルス（PY）によって形質転換されたラット細胞表面
上に出現するものである（12-14）。 ポリオーマウイルスは齧歯類に数タイプの腫瘍を誘発
する。腫瘍の誘発はウイルスDNAの宿主ゲノム内への組
込みおよびウイルスの初期遺伝子の発現を伴なう（15-1
7）。PYで形質転換された死細胞を齧歯類に接種する
と、PYにより誘発された腫瘍細胞の試験接種に対して免
疫を誘発させることが可能となる（12-13）。しかしな
がら、腫瘍特異移植抗原の存在と、PYウイルスゲノムの
初期領域によってその合成が制御されるＴ抗原と腫瘍特
異移植抗原との関係はまだ明確に立証されていない。こ
の研究は、PYゲノムの初期領域が分子量によって「ラー
ジT:LT」、「ミドルT:MT」および「スモールT:ST」と呼
ばれる３つの別の蛋白質を同時にコードするものであり
（17）、これら３つの抗原は同一のＮ末端配列を有し、
同一のポリクローナル抗体によって認識されるという事
実によって複雑化されている。 実施例に記載されるように、これら３つのＴ抗原はそ
れらの役割および個々の能力を正確に把握するために、
個別にクローン化し発現させた。 外来抗原のためのクローニングおよび発現ベクターと
してのワクシニアウイルスの使用は既に記載されている
（18-19）。異種（heterologous）ウイルスもしくは寄
生体（parasites）の抗体を発現する組換え体ウイルス
は対応する病原体に対して動物を免疫するために使用さ
れている（参考文献20の概論参照）。組換え体ワクシニ
アウイルスによって発現された抗原は感染した細胞の表
面上に適当な方法で表出され、細胞型免疫反応の誘発を
可能にする（21-24）。このことは、腫瘍細胞の除去が
細胞免疫を伴うということが知られている（25,26）た
め、特に有利である。 本発明はＴ抗原と称される腫瘍特異蛋白質の必須領域
をコードするDNA配列のための発現ベクターとしてのウ
イルスの使用に関するものである。 「腫瘍特異蛋白質」とは自然腫瘍に特異的であって正
常成体組織には不在の抗原もしくは腫瘍ウイルスによっ
てコードされる抗原であって、前記腫瘍の原因であるも
のを意味する。 前記蛋白質の「必須領域」とは抗腫瘍免疫の誘発もし
くは前記腫瘍を退行させることのできる機構の誘発を可
能にする蛋白質配列部分を意味する。 ベクターウイルスとしてはワクシニアが好ましいが、
特にヘルペス科のウイルスやアデノウイルスのような他
のウイルスを使用することもできる。 このウイルスはより高級な細胞（真核細胞）中におけ
るＴ蛋白質の発現に必要な全ての範囲の要素を含むこと
ができる。これには特にベクターウイルスのためのプロ
モーターを含ませることができる。例えばワクシニアの
場合には7.5Kdの蛋白質が使用される。プロモーター/T
コーディング配列アセンブリはウイルスの非必須遺伝子
内に挿入することができる。例えば、ワクチンの場合に
はチミジンキナーゼ（TK）のための遺伝子内に挿入する
ことによって、TK-組換え体ウイルスが容易に選択でき
るようになる。 本発明はまた上述のウイルスに感染した真核細胞に関
し、さらにこれらの細胞を原料とする、腫瘍特異蛋白質
の必須領域を有することを特徴とするＴ抗原の製造法に
関する。 細胞およびウイルスを培養するための条件は当業者に
知られており、使用される細胞およびウイルスによって
変化する。蛋白質を分離するための方法についても同様
である。蛋白質の分離は様々な精製度で行なうことがで
きる。 さらに、本発明は活性成分として本発明のウイルスも
しくは上述の特異蛋白質を含んだ、Ｔ抗原を用いて腫瘍
を予防もしくは治療するための薬用組成物に関する。 本発明の一実施態様によれば、Ｔ抗原を発現する生き
たウイルスが人間もしくは動物に接種される。 本発明の別の実施態様によれば、組換え体ウイルスに
感染した細胞の抽出物もしくはこれらの抽出物から得た
完全に精製されたＴ抗原あるいは表面にＴ抗原分子を有
する死んだ組換え体ウイルス自身を含む薬用組成物が人
間もしくは動物に注射される。 本発明の薬用組成物は人間もしくは動物に注射できる
ような形状とすることが好ましい。 これらの薬用組成物はワクチンおよび蛋白質治療の分
野において公知の方法で製造することができる。 投与できる量は広範囲で変化し、特に予防もしくは治
療すべき腫瘍、患者の状態および医師によって査定され
る他のパラメーターに依存する。 また、本発明はＴ抗原もしくはその実質的な部分に対
応する抗体に関し、さらにこれらの抗体もしくはＴ抗原
自体の診断剤としての使用に関する。これらの分子は当
業者に公知の方法に従って標識することができる。 以下の実施例は、ラット腫瘍細胞と腫瘍産性の原因と
なるポリオーマウイルスPYによってコードされたＴ抗原
とからなる動物モデルにおいて本発明の基体概念を説明
するものである。しかしながら、正常成体組織に不在の
他のいかなる腫瘍特異抗原を用いても同様の結果が得ら
れること、およびこれらの異なったＴ抗原も本発明の一
部を形成することは明らかである。 本発明のプロセスにおいて標的として用いることので
きる他のＴ抗原としては結腸直腸癌腫，黒腫，腎臓癌，
神経芽細胞腫，膀胱癌腫，乳癌腫，リンパ腫および内分
泌腺腫に特異的なＴ抗原を挙げることができる。 本発明において標的として用いることのできる腫瘍抗
原は発現が腫瘍素質内において変化する宿主成分もしく
は、より一般的には、細胞を癌細胞に形質転換する役割
を果たす、特にパピローマもしくはポリオーマ等のレト
ロウイルスもしくはパポーバウイルスのようなウイルス
によってコードされた抗原とすることができる。 （実施例） 実施例１ 各々PYウイルスのＴ抗原のうちの１つを発現する３つ
の組換え体ワクシニアウイルスの形成。 第１図（参考文献17に基づいて補正したもの）はPYDN
Aの初期領域の構造を示し、重複する３つの遺伝子LT,M
T,およびSTと特にそれらに共通なＮ−末端領域の対応部
分を表わすものである。PY中の転写開始位はTATAで示さ
れ、翻訳開始および終了信号はATGおよびTGAでそれぞれ
示され。イントロンおよびポニアデニル化位の位置も示
されている。 PYウイルスの３つのＴ抗原のためのコーディング配列
は既にインビトロにおける切除によってイントロンを除
去した後にクローン化されており（27-28）、プラスミ
ドp PY-LT1,p PY-MT1,p TY-ST1が得られている（28）。
これらのコーディング配列は一端をBglI、他端をLTにお
いてはHindII、MTにおいてはEcoRI、STにおいてはPvuII
で消化させることによって回収した。BglI端は一重鎖合
成アダプター（42）： を用いてBamHI位に適合するようにした。このように処
理した３つのDNAセグメントをp TG186ポリベクターのBa
mHI-SmaI位間、BamHI-EcoRI位間およびBamHI-SmaI位間
にそれぞれ導入した（第２図）。このp TG186ポリベク
ターは、ワクシニアのTK遺伝子内に挿入されるワクシニ
アウイルスの7.5K遺伝子のためのプロモーターの下流の
p TG1H-TK-7.5Kベクター（29）にいくつかの制限位を与
えるM13TG131ポリリンカー（41）の挿入によって得られ
る。Ｔ抗原のための３つのコーディング配列およびそれ
らの翻訳開始および終了信号は、ワクシニアウイルスの
ためのプロモーターの下流に位置させた後、それぞれワ
クチンウイルスの非必須遺伝子内に挿入した。以前に記
載されたとおり（29）、組換えプラスミドを形質導入
し、かつ野生型ウイルスを感染させた細胞における二重
組換えを行った後、Ｔ抗原をコードしている配列がワク
シニアウイルスのゲノムに組み込まれていることが発見
された。外来遺伝子を担持する組換え体ウイルスは５−
ブロモデオキシウリジンの存在下でTK-143 B細胞中にお
ける増殖により、TK-特性によって選択する。 Ｔ抗原のためのコーディング配列を組込んだ組換え体
ウイルスはサザン法で同定し、３つの代表的なウイル
ス:VV.PY.LT-H,VV.PY.MT-IおよびVV.PY.ST-Jを選択し
た。 実施例２ VV-PY組換え体ウイルスによって合成されたＴ抗原の
特性のインビトロ研究。 組換体ワクシニアウイルスによって発現された３つの
Ｔ抗原は生のPYT抗原に対応する抗体によって認識され
る。 螢光抗体を用いて抗原の細胞内局在を調べた。すなわ
ち、VV.PY.T組換え体ウイルスに半集密的ハムスター（B
HK 21）細胞を個別に感染させ（0.1pfu/細胞；一晩のイ
ンキュベーション）、高度免疫ラット抗血清、抗Ｔ（RA
F no.4 CNRS-Nice（43）;1/50 PBS＋１％ウシ血清アル
ブミン）を続けて適用し、次いで螢光抗ラット抗体（ヤ
ギ免疫グロブリン、Miles供給、1/100PBS＋１％ウシ血
清アルブミン）を適用したところ、アセトン（濃度80
％）で固定した細胞中にＴ抗原が認められた。２つの抗
体は各々20分間37℃において吸収させ、次いで未結合の
抗体を除去するために洗浄した。第３図はVV.PY.LY
（Ａ）,VV.PY.MT（Ｂ）,VV.PY.ST（Ｃ）に感染した細胞
および未感染の細胞（Ｄ）の免疫螢光を示すものであ
る。 第３図から明らかなように、予想通り（30,16）LT蛋
白質は核内のみに位置し、ST蛋白質は主として細胞質内
に位置し（第３図Ｃ）、報告されたように（15,31）MT
蛋白質は主として細胞質内に位置し（第３図Ｂ）、表面
上には位置しない。核周囲領域におけるその弱い、しか
し再現可能な検出は他の最近の研究によって示されるよ
うに（32-33）ゴルジ装置および他の細胞内膜との関係
を示唆するものである。 実施例３ 組換え体ウイルスを皮下接種した動物に誘発された免
疫反応の研究。 ３つのVV-PY組換え体の予防接種能力を査定するため
に、これらが抗腫瘍反応を誘発する能力をインビボで測
定した。 PYで形質転換された同系細胞を皮下接種したラットで
は移植位において急速に腫瘍が発達することが知られて
いる。この実験モデルは腫瘍の発達を阻止することので
きる免疫反応の誘発を証明することができるに違いな
い。 ４週齢の雌ラット（Fischer）群に異なった組換え体
ウイルスを皮下接種し（100μｌ中107pfuの投与）、12
日後に同じ投与量で再接種し、次いで16日目に完成PYで
形質転換した3T3ラット細胞（PYT-12）を100μｌ中２×
104個の投与量で試験接種した。既に示唆されたように
（28）、３つのＴ抗原の累積効果を証明するために、１
つのラット群に対しては３つの組換え体ウイルスを同時
に接種した。 その結果を表Ｉに示す。 観察したワクチン未接種の動物では全て、形質転換細
胞の接種14日以内に腫瘍の発達が検出される一方、実験
期間（42日間）内には自然退行は認められなかった。 VV.PY.LTおよびVV.PY.MTを予防接種した動物では小さ
な腫瘍（直径＞5mm）が発達したが、これらは急速に退
行し、50〜60％の動物においては完全に消滅した。した
がって、VV.PY.LTおよびMTにおいて観察された効果は極
めて特異的であって、BCGのそれと類似した活動様式を
持ち得た（34）極めて良好な免疫源であるワクチンウイ
ルスによる免疫系の非特異的な刺激に起因されることは
できない。 ３つの組換え体の当時接種は有意な効果をもたらさな
かった。 42日後、被験動物を屠殺し、それらの血清を分析した
（表II）。予防接種を行なった全ての動物は、腫瘍を拒
絶することができるか否かに関係なく、ワクチンウイル
スに対して、およびPYによって形質転換された細胞に対
して高い抗体価を有している。 したがって、腫瘍の拒絶は循環している抗体に起因し
得るものではなく、他の免疫機構の関与を必要とするよ
うである。実施例４ 組換え体を皮内予防接触した動物における腫瘍の拒
絶。 ワクチンウイルスを接種するための他の経路を試験し
た。 尾の根元を小刀で乱切することによって４週齢の雌ラ
ット（Fischer）に精製ウイルス（10μｌの２×109pfu/
mlストック）を皮内予防接種した。 15日後に第２の接種を行なった。その４日後、100μ
ｌ中２×104個のPYT-21細胞を皮下注射することによ
り、動物に体する試験接種を行なった。 その結果をIII表に示す。 実施例５ 腫瘍にかかった動物のVV.PY.T組換え体ウイルスによ
る治療。 腫瘍治療用に組換え体ウイルスの投与を試みた。 PYで形質転換した細胞を接種し、腫瘍を発達させた10
匹のラットに、12〜16日後、VV.PY.LT組換え体を接種し
た。腫瘍は第１回目の接種時において２〜3mmの大きさ
であった。 全ての動物において、腫瘍は直径15mmになるまで成長
し続けた。次いで２匹の動物においては腫瘍はかなり退
行し（35日目における観察）、完全に消滅した。VV.PY.
MTおよびVV.PY.STにおいては同様の結果は認められなか
った。これは３タイプのＴ抗原の間の免疫原性の違いを
示唆するものである。 本発明の代表的な株の寄託 後にワクシニアウイルス中において組換えることがで
きるようにＴ抗原のためのいかなるコーディング配列を
も組込むことのできるベクタープラスミドを1985年６月
20日に国立微生物培養物収集館（Collection Nationale
de Cultures des Microbial Cultures）に寄託番号I45
8の下に寄託した。 このp ML2由来のE.コリ（coli）プラスミドはE.コリ
中の複製源，β−ラクタマーゼ遺伝子、およびワクシニ
アの7.5Kプロモーターとそれに続く、Ｔ抗原をコードす
る配列と交換可能なコーディング配列（ヒトIL2配列）
とによって中断されたワクシニアTK遺伝子からなる。 参考文献 1.Hellstrom,K.E.,Hellstrom,I.＆ Brown,J.P.Sp ringe
r Semin.Immunopathol.5,127-146（1982）． 2.Herlyn,M.,Blaszczyk,M.＆ Koprowski,H.Contr.Onco
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21,329-337（1961）． 13.Habel,K.proc.Soc.Exp.Biol.Med.106,722-725（196
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en,B.＆ Kamen,R.J.Virol.51,170-180（1984）． 33.Dilworth,S.M.,Hansson,H.A.,Darnfors,C.,Bjursel
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34,403-406（1984）． 36.Sharma,S.,Rodgers,L.,Brandsma,J.,Gething,M.J.＆
Sambrook,J.EMBO J.4,1479-1589（1985）． 37.Koprowski,H.,Herlyn,M.,Steplewski,Z.＆ Sears,H.
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Chem.259,15196-15203（1984）．
部を有する組換え体ベクターウイルスと、人間もしくは
動物における前記腫瘍の予防もしくは治療におけるその
利用、さらに詳しくはベクターウイルス、これに感染し
た哺乳動物細胞、これに由来する腫瘍特異蛋白質および
その製造法、これらを利用した薬用組成物ならびにこれ
らに対応する抗体に関するものである。 （従来の技術） 腫瘍細胞は、自然のものであるかウイルスによって誘
発されたものであるかに関係なく、それらの表面に新し
い抗原を有することがある（１）。腫瘍特異抗原（Ｔ抗
原）は既にヒト癌腫を診断（２）および視覚化（３）す
るために用いられている。 より新しくは特定の抗腫瘍療法における標的としての
これらの使用が着想された。抗Ｔ抗体の投与は、自由型
でも毒素もしくは放射性同位元素に結合した型でも、い
くつかの臨床例の治療において既に望みのある結果をも
たらしている（４）。 さらに、Ｔ抗原を発現する死細胞の接種（５−７）、
抗Ｔ免疫グロブリンの可変部に対する抗イディオタイプ
抗体の誘発（８−９）もしくはＴ抗原自体の注入（10）
等の異なったアプローチに従って、Ｔ抗原に対する宿主
特異性免疫反応を刺激するのを試みることも可能であ
る。これらの実験は、入手可能な抗原の量により制限さ
れ、また抗腫瘍免疫において特に重要な細胞型免疫反応
には抗原と宿主の組織適合性決定基とを同時に供給する
ことが要求されるという事実によって制限される（1
1）。 （発明が解決しようとする問題点および問題点を解決す
るための手段） 本発明は生きた組換え体ウイルスによる、生体内で抗
腫瘍免疫を誘発することのできるＴ抗原もしくはその重
要部分の発現に関するものである。実験モデルとして使
用され、実施例において詳述されるＴ抗原はポリオーマ
ウイルス（PY）によって形質転換されたラット細胞表面
上に出現するものである（12-14）。 ポリオーマウイルスは齧歯類に数タイプの腫瘍を誘発
する。腫瘍の誘発はウイルスDNAの宿主ゲノム内への組
込みおよびウイルスの初期遺伝子の発現を伴なう（15-1
7）。PYで形質転換された死細胞を齧歯類に接種する
と、PYにより誘発された腫瘍細胞の試験接種に対して免
疫を誘発させることが可能となる（12-13）。しかしな
がら、腫瘍特異移植抗原の存在と、PYウイルスゲノムの
初期領域によってその合成が制御されるＴ抗原と腫瘍特
異移植抗原との関係はまだ明確に立証されていない。こ
の研究は、PYゲノムの初期領域が分子量によって「ラー
ジT:LT」、「ミドルT:MT」および「スモールT:ST」と呼
ばれる３つの別の蛋白質を同時にコードするものであり
（17）、これら３つの抗原は同一のＮ末端配列を有し、
同一のポリクローナル抗体によって認識されるという事
実によって複雑化されている。 実施例に記載されるように、これら３つのＴ抗原はそ
れらの役割および個々の能力を正確に把握するために、
個別にクローン化し発現させた。 外来抗原のためのクローニングおよび発現ベクターと
してのワクシニアウイルスの使用は既に記載されている
（18-19）。異種（heterologous）ウイルスもしくは寄
生体（parasites）の抗体を発現する組換え体ウイルス
は対応する病原体に対して動物を免疫するために使用さ
れている（参考文献20の概論参照）。組換え体ワクシニ
アウイルスによって発現された抗原は感染した細胞の表
面上に適当な方法で表出され、細胞型免疫反応の誘発を
可能にする（21-24）。このことは、腫瘍細胞の除去が
細胞免疫を伴うということが知られている（25,26）た
め、特に有利である。 本発明はＴ抗原と称される腫瘍特異蛋白質の必須領域
をコードするDNA配列のための発現ベクターとしてのウ
イルスの使用に関するものである。 「腫瘍特異蛋白質」とは自然腫瘍に特異的であって正
常成体組織には不在の抗原もしくは腫瘍ウイルスによっ
てコードされる抗原であって、前記腫瘍の原因であるも
のを意味する。 前記蛋白質の「必須領域」とは抗腫瘍免疫の誘発もし
くは前記腫瘍を退行させることのできる機構の誘発を可
能にする蛋白質配列部分を意味する。 ベクターウイルスとしてはワクシニアが好ましいが、
特にヘルペス科のウイルスやアデノウイルスのような他
のウイルスを使用することもできる。 このウイルスはより高級な細胞（真核細胞）中におけ
るＴ蛋白質の発現に必要な全ての範囲の要素を含むこと
ができる。これには特にベクターウイルスのためのプロ
モーターを含ませることができる。例えばワクシニアの
場合には7.5Kdの蛋白質が使用される。プロモーター/T
コーディング配列アセンブリはウイルスの非必須遺伝子
内に挿入することができる。例えば、ワクチンの場合に
はチミジンキナーゼ（TK）のための遺伝子内に挿入する
ことによって、TK-組換え体ウイルスが容易に選択でき
るようになる。 本発明はまた上述のウイルスに感染した真核細胞に関
し、さらにこれらの細胞を原料とする、腫瘍特異蛋白質
の必須領域を有することを特徴とするＴ抗原の製造法に
関する。 細胞およびウイルスを培養するための条件は当業者に
知られており、使用される細胞およびウイルスによって
変化する。蛋白質を分離するための方法についても同様
である。蛋白質の分離は様々な精製度で行なうことがで
きる。 さらに、本発明は活性成分として本発明のウイルスも
しくは上述の特異蛋白質を含んだ、Ｔ抗原を用いて腫瘍
を予防もしくは治療するための薬用組成物に関する。 本発明の一実施態様によれば、Ｔ抗原を発現する生き
たウイルスが人間もしくは動物に接種される。 本発明の別の実施態様によれば、組換え体ウイルスに
感染した細胞の抽出物もしくはこれらの抽出物から得た
完全に精製されたＴ抗原あるいは表面にＴ抗原分子を有
する死んだ組換え体ウイルス自身を含む薬用組成物が人
間もしくは動物に注射される。 本発明の薬用組成物は人間もしくは動物に注射できる
ような形状とすることが好ましい。 これらの薬用組成物はワクチンおよび蛋白質治療の分
野において公知の方法で製造することができる。 投与できる量は広範囲で変化し、特に予防もしくは治
療すべき腫瘍、患者の状態および医師によって査定され
る他のパラメーターに依存する。 また、本発明はＴ抗原もしくはその実質的な部分に対
応する抗体に関し、さらにこれらの抗体もしくはＴ抗原
自体の診断剤としての使用に関する。これらの分子は当
業者に公知の方法に従って標識することができる。 以下の実施例は、ラット腫瘍細胞と腫瘍産性の原因と
なるポリオーマウイルスPYによってコードされたＴ抗原
とからなる動物モデルにおいて本発明の基体概念を説明
するものである。しかしながら、正常成体組織に不在の
他のいかなる腫瘍特異抗原を用いても同様の結果が得ら
れること、およびこれらの異なったＴ抗原も本発明の一
部を形成することは明らかである。 本発明のプロセスにおいて標的として用いることので
きる他のＴ抗原としては結腸直腸癌腫，黒腫，腎臓癌，
神経芽細胞腫，膀胱癌腫，乳癌腫，リンパ腫および内分
泌腺腫に特異的なＴ抗原を挙げることができる。 本発明において標的として用いることのできる腫瘍抗
原は発現が腫瘍素質内において変化する宿主成分もしく
は、より一般的には、細胞を癌細胞に形質転換する役割
を果たす、特にパピローマもしくはポリオーマ等のレト
ロウイルスもしくはパポーバウイルスのようなウイルス
によってコードされた抗原とすることができる。 （実施例） 実施例１ 各々PYウイルスのＴ抗原のうちの１つを発現する３つ
の組換え体ワクシニアウイルスの形成。 第１図（参考文献17に基づいて補正したもの）はPYDN
Aの初期領域の構造を示し、重複する３つの遺伝子LT,M
T,およびSTと特にそれらに共通なＮ−末端領域の対応部
分を表わすものである。PY中の転写開始位はTATAで示さ
れ、翻訳開始および終了信号はATGおよびTGAでそれぞれ
示され。イントロンおよびポニアデニル化位の位置も示
されている。 PYウイルスの３つのＴ抗原のためのコーディング配列
は既にインビトロにおける切除によってイントロンを除
去した後にクローン化されており（27-28）、プラスミ
ドp PY-LT1,p PY-MT1,p TY-ST1が得られている（28）。
これらのコーディング配列は一端をBglI、他端をLTにお
いてはHindII、MTにおいてはEcoRI、STにおいてはPvuII
で消化させることによって回収した。BglI端は一重鎖合
成アダプター（42）： を用いてBamHI位に適合するようにした。このように処
理した３つのDNAセグメントをp TG186ポリベクターのBa
mHI-SmaI位間、BamHI-EcoRI位間およびBamHI-SmaI位間
にそれぞれ導入した（第２図）。このp TG186ポリベク
ターは、ワクシニアのTK遺伝子内に挿入されるワクシニ
アウイルスの7.5K遺伝子のためのプロモーターの下流の
p TG1H-TK-7.5Kベクター（29）にいくつかの制限位を与
えるM13TG131ポリリンカー（41）の挿入によって得られ
る。Ｔ抗原のための３つのコーディング配列およびそれ
らの翻訳開始および終了信号は、ワクシニアウイルスの
ためのプロモーターの下流に位置させた後、それぞれワ
クチンウイルスの非必須遺伝子内に挿入した。以前に記
載されたとおり（29）、組換えプラスミドを形質導入
し、かつ野生型ウイルスを感染させた細胞における二重
組換えを行った後、Ｔ抗原をコードしている配列がワク
シニアウイルスのゲノムに組み込まれていることが発見
された。外来遺伝子を担持する組換え体ウイルスは５−
ブロモデオキシウリジンの存在下でTK-143 B細胞中にお
ける増殖により、TK-特性によって選択する。 Ｔ抗原のためのコーディング配列を組込んだ組換え体
ウイルスはサザン法で同定し、３つの代表的なウイル
ス:VV.PY.LT-H,VV.PY.MT-IおよびVV.PY.ST-Jを選択し
た。 実施例２ VV-PY組換え体ウイルスによって合成されたＴ抗原の
特性のインビトロ研究。 組換体ワクシニアウイルスによって発現された３つの
Ｔ抗原は生のPYT抗原に対応する抗体によって認識され
る。 螢光抗体を用いて抗原の細胞内局在を調べた。すなわ
ち、VV.PY.T組換え体ウイルスに半集密的ハムスター（B
HK 21）細胞を個別に感染させ（0.1pfu/細胞；一晩のイ
ンキュベーション）、高度免疫ラット抗血清、抗Ｔ（RA
F no.4 CNRS-Nice（43）;1/50 PBS＋１％ウシ血清アル
ブミン）を続けて適用し、次いで螢光抗ラット抗体（ヤ
ギ免疫グロブリン、Miles供給、1/100PBS＋１％ウシ血
清アルブミン）を適用したところ、アセトン（濃度80
％）で固定した細胞中にＴ抗原が認められた。２つの抗
体は各々20分間37℃において吸収させ、次いで未結合の
抗体を除去するために洗浄した。第３図はVV.PY.LY
（Ａ）,VV.PY.MT（Ｂ）,VV.PY.ST（Ｃ）に感染した細胞
および未感染の細胞（Ｄ）の免疫螢光を示すものであ
る。 第３図から明らかなように、予想通り（30,16）LT蛋
白質は核内のみに位置し、ST蛋白質は主として細胞質内
に位置し（第３図Ｃ）、報告されたように（15,31）MT
蛋白質は主として細胞質内に位置し（第３図Ｂ）、表面
上には位置しない。核周囲領域におけるその弱い、しか
し再現可能な検出は他の最近の研究によって示されるよ
うに（32-33）ゴルジ装置および他の細胞内膜との関係
を示唆するものである。 実施例３ 組換え体ウイルスを皮下接種した動物に誘発された免
疫反応の研究。 ３つのVV-PY組換え体の予防接種能力を査定するため
に、これらが抗腫瘍反応を誘発する能力をインビボで測
定した。 PYで形質転換された同系細胞を皮下接種したラットで
は移植位において急速に腫瘍が発達することが知られて
いる。この実験モデルは腫瘍の発達を阻止することので
きる免疫反応の誘発を証明することができるに違いな
い。 ４週齢の雌ラット（Fischer）群に異なった組換え体
ウイルスを皮下接種し（100μｌ中107pfuの投与）、12
日後に同じ投与量で再接種し、次いで16日目に完成PYで
形質転換した3T3ラット細胞（PYT-12）を100μｌ中２×
104個の投与量で試験接種した。既に示唆されたように
（28）、３つのＴ抗原の累積効果を証明するために、１
つのラット群に対しては３つの組換え体ウイルスを同時
に接種した。 その結果を表Ｉに示す。 観察したワクチン未接種の動物では全て、形質転換細
胞の接種14日以内に腫瘍の発達が検出される一方、実験
期間（42日間）内には自然退行は認められなかった。 VV.PY.LTおよびVV.PY.MTを予防接種した動物では小さ
な腫瘍（直径＞5mm）が発達したが、これらは急速に退
行し、50〜60％の動物においては完全に消滅した。した
がって、VV.PY.LTおよびMTにおいて観察された効果は極
めて特異的であって、BCGのそれと類似した活動様式を
持ち得た（34）極めて良好な免疫源であるワクチンウイ
ルスによる免疫系の非特異的な刺激に起因されることは
できない。 ３つの組換え体の当時接種は有意な効果をもたらさな
かった。 42日後、被験動物を屠殺し、それらの血清を分析した
（表II）。予防接種を行なった全ての動物は、腫瘍を拒
絶することができるか否かに関係なく、ワクチンウイル
スに対して、およびPYによって形質転換された細胞に対
して高い抗体価を有している。 したがって、腫瘍の拒絶は循環している抗体に起因し
得るものではなく、他の免疫機構の関与を必要とするよ
うである。実施例４ 組換え体を皮内予防接触した動物における腫瘍の拒
絶。 ワクチンウイルスを接種するための他の経路を試験し
た。 尾の根元を小刀で乱切することによって４週齢の雌ラ
ット（Fischer）に精製ウイルス（10μｌの２×109pfu/
mlストック）を皮内予防接種した。 15日後に第２の接種を行なった。その４日後、100μ
ｌ中２×104個のPYT-21細胞を皮下注射することによ
り、動物に体する試験接種を行なった。 その結果をIII表に示す。 実施例５ 腫瘍にかかった動物のVV.PY.T組換え体ウイルスによ
る治療。 腫瘍治療用に組換え体ウイルスの投与を試みた。 PYで形質転換した細胞を接種し、腫瘍を発達させた10
匹のラットに、12〜16日後、VV.PY.LT組換え体を接種し
た。腫瘍は第１回目の接種時において２〜3mmの大きさ
であった。 全ての動物において、腫瘍は直径15mmになるまで成長
し続けた。次いで２匹の動物においては腫瘍はかなり退
行し（35日目における観察）、完全に消滅した。VV.PY.
MTおよびVV.PY.STにおいては同様の結果は認められなか
った。これは３タイプのＴ抗原の間の免疫原性の違いを
示唆するものである。 本発明の代表的な株の寄託 後にワクシニアウイルス中において組換えることがで
きるようにＴ抗原のためのいかなるコーディング配列を
も組込むことのできるベクタープラスミドを1985年６月
20日に国立微生物培養物収集館（Collection Nationale
de Cultures des Microbial Cultures）に寄託番号I45
8の下に寄託した。 このp ML2由来のE.コリ（coli）プラスミドはE.コリ
中の複製源，β−ラクタマーゼ遺伝子、およびワクシニ
アの7.5Kプロモーターとそれに続く、Ｔ抗原をコードす
る配列と交換可能なコーディング配列（ヒトIL2配列）
とによって中断されたワクシニアTK遺伝子からなる。 参考文献 1.Hellstrom,K.E.,Hellstrom,I.＆ Brown,J.P.Sp ringe
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【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に用いられるPY DNAの初期領域の構造を
示す模式図、 第２図は本発明による組換え体ウイルスの製造法を示す
模式図、 第３図は本発明による組換え体ウイルスに感染した細胞
および未感染の細胞の免疫螢光を示す模式図である。
示す模式図、 第２図は本発明による組換え体ウイルスの製造法を示す
模式図、 第３図は本発明による組換え体ウイルスに感染した細胞
および未感染の細胞の免疫螢光を示す模式図である。
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｐｒｏｃ．ＮａＴｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
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ｉ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81（1984）Ｐ.
193−197
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．Ｔ抗原と称される腫瘍特異蛋白質の必須領域と真核
細胞中における該蛋白質の発現に必要とされる要素とを
少なくともコードする異種DNA配列を有するポックスウ
イルス科のウイルスからなる群より選ばれたベクターウ
イルス。 ２．前記ポックスウイルス科のウイルスがワクシニアウ
イルスであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載のウイルス。 ３．前記Ｔ抗原をコードするDNA配列が自然腫瘍に特異
的であって正常成体組織に不在の蛋白質もしくは腫瘍ウ
イルスによってコードされた蛋白質をコードするDNA配
列であることを特徴とする特許請求の範囲第１項もしく
は第２項記載のウイルス。 ４．前記Ｔ抗原をコードするDNA配列が、使用されるウ
イルス遺伝子のためのプロモーターに依存していること
を特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか
１項に記載のウイルス。 ５．前記プロモーターがワクシニアウイルスの7.5K蛋白
質遺伝子のためのプロモーターであることを特徴とする
特許請求の範囲第４項記載のウイルス。 ６．前記Ｔ抗原をコードするDNA配列が使用されるウイ
ルスの非必須遺伝子中にクローン化されていることを特
徴とする特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項
に記載のウイルス。 ７．前記非必須遺伝子がTK遺伝子であることを特徴とす
る特許請求の範囲第６項記載のウイルス。 ８．前記腫瘍特異蛋白質をコードする配列が該配列自身
の翻訳開始および終了信号を含んでいることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載
のウイルス。 ９．前記腫瘍特異蛋白質をコードする配列がイントロン
を欠いたものであることを特徴とする特許請求の範囲第
８項記載のウイルス。 １０．前記腫瘍特異蛋白質が腫瘍DNAウイルスもしくは
腫瘍RNAウイルスのDNAコピーのための配列に対応するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第８項もしくは第９項記
載のウイルス。 １１．前記腫瘍ウイルスがパポーバウイルスおよびレト
ロウイルスからなる群より選ばれたウイルスに由来する
ものであることを特徴とする特許請求の範囲第10項記載
のウイルス。 １２．Ｔ抗原と称される腫瘍特異蛋白質の必須領域と真
核細胞中における該蛋白質の発現に必要とされる要素と
を少なくともコードする異種DNA配列を有するポックス
ウイルス科のウイルスからなる群より選ばれたベクター
ウイルスと薬学上許容できるビヒクルとを有する抗腫瘍
剤。 １３．前記ポックスウイルス科のウイルスがワクシニア
ウイルスであることを特徴とする特許請求の範囲第12項
記載の抗腫瘍剤。 １４．前記ウイルスが生きているものであることを特徴
とする特許請求の範囲第12項または第13項記載の抗腫瘍
剤。 １５．前記ウイルスが死んでいるものであることを特徴
とする特許請求の範囲第12項または第13項記載の抗腫瘍
剤。 １６．人間もしくは動物に対する注射による投与を可能
とするような薬学上許容できるビヒクルを有しているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第12項〜第15項のいずれ
か１項に記載の抗腫瘍剤。
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