DK173755B1 - Farmaceutisk komposition omfattende en viral vektor - Google Patents

Farmaceutisk komposition omfattende en viral vektor Download PDF

Info

Publication number
DK173755B1
DK173755B1 DK198704216A DK421687A DK173755B1 DK 173755 B1 DK173755 B1 DK 173755B1 DK 198704216 A DK198704216 A DK 198704216A DK 421687 A DK421687 A DK 421687A DK 173755 B1 DK173755 B1 DK 173755B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
tumor
pharmaceutical composition
antigen
sequence encoding
dna sequence
Prior art date
Application number
DK198704216A
Other languages
English (en)
Other versions
DK421687A (da
DK421687D0 (da
Inventor
Richard Lathe
Marie-Paule Kieny
Original Assignee
Transgene Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene Sa filed Critical Transgene Sa
Publication of DK421687D0 publication Critical patent/DK421687D0/da
Publication of DK421687A publication Critical patent/DK421687A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173755B1 publication Critical patent/DK173755B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

i DK 173755 B1
Den foreliggende opfindelse angår farmaceutiske præparater til forebyggelse eller behandling af tumorer, der præsenterer T-antigenet, hvilke præparater som aktiv bestanddel indeholder en rekombinant viral vektor udvalgt blandt poxvira, adenovira og vira af herpes-5 gruppen indeholdende en heterolog DNA-sekvens kodende for mindst den essentielle region af et tumorspecifikt protein, kaldet T-antigen.
Tumorceller kan, hvad enten de er spontane eller induceret af vira, præsentere nye antigener på deres overflade (i). Specifikke tumorantigener (T-antigener) er allerede blevet anvendt til diagnose (2) 10 og visualisering (3) af humane carcinomer.
For nylig er deres anvendelse som mål for en specifik antitumorterapi blevet overvejet. Administration af anti-T-antistoffer, der enten er frie eller fikserede til toxiner eller til radioaktive isotoper, har allerede givet opmuntrende resultater ved behandlingen af visse kli-15 niske tilfælde (4).
For øvrigt kan man også forsøge at stimulere værtens egne immunreaktioner mod T-antigeneme, hvilket kan ske ved forskellige procedurer såsom inokulation af dræbte celler, der udtrykker T-antigenet (5-7), induktion af anti-idiotype-antistoffer mod det variable område af 20 anti-T-immunoglobuliner (8-9) eller injektion af selve T-antigenet (10). Disse forsøg er begrænset af den tilgængelige mængde antigen og af, at stimuleringen af et cellulært immunrespons, der er særlig betydningsfuldt ved antitumoral immunitet, kræver samtidig præsentation af antigenet og histokompatibilitetsdeterminanter for værten 25 (11).
Den foreliggende opfindelse angår ekspression af et T-antigen eller en betydelig del deraf ved hjælp af et levende rekombinant virus med det formål in vivo at inducere en antitumor-immunitet. Det T-antigen, der anvendes som forsøgsmodel, og som er beskrevet i eksemplerne, er 30 det, der forekommer på overfladen af rotteceller transformeret med polyom-viruset (PY) (12-14).
Polyom-viruset inducerer flere typer af tumorer hos gnavere. Induktion af tumorer omfatter integration af virus-DNA i værtens genom og 2 DK 173755 B1 ekspression af tidlige virusgener (15-17). Inokulation af gnavere med dræbte celler transformeret med PY gør det muligt at inducere en immunitet mod en test-inokulation med tumorceller induceret af PY (12-13). imidlertid har man endnu ikke klart fastslået påvisningen af 5 tilstedeværelsen af specifikke transplantations-tumorantigener og deres forhold til de T-antigener, hvis syntese er styret af det tidlige område af PY-virusgenomet. Denne undersøgelse er kompliceret, fordi det tidlige område af PY-genomet samtidig koder for tre forskellige proteiner (17), der betegnes "large-T : LT", "middle-T : MT" 10 og 1,small-T : ST" under henvisning til deres respektive molekylvægte; disse tre antigener har samme N-terminale sekvens og genkendes af de samme polyklonale antistoffer.
Som beskrevet i eksemplerne er de tre T-antigener blevet klonet og udtrykt separat for at præcisere deres respektive roller og poten-15 tialer.
Anvendelse af vacciniavirus som vektor for kloning og ekspression af fremmede antigener er tidligere beskrevet (18-19). Rekombinante vira, der udtrykker antigener fra heterologe vira eller parasitter, er blevet anvendt til immunisering af dyr mod det tilsvarende patogen 20 (se oversigt i reference 20). De antigener, der udtrykkes af rekom-binant vacciniavirus, er korrekt præsenteret på overfladen af de inficerede celler og muliggør induktion af et cellulært immunrespons (21-24), hvilket er særlig fordelagtigt, da det er kendt, at eliminering af tumorceller medfører cellulær immunitet (25,26).
25 Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af et virus som ekspressionsvektor for en DNA-sekvens, der koder for det essentielle område i et specifikt tumorprotein, betegnet T-antigen. Med udtrykket "specifikt tumorprotein" menes et specifikt antigen for en spontan tumor, hvilket antigen mangler normale voksenvæv, eller et antigen, der er 30 indkodet af et onkogent virus, som er det agens, der forårsager tumoren. Med "essentielt område i proteinet” betegnes den del af proteinsekvensen, der er i stand til at inducere en antitumoral immunitet eller inducere en mekanisme, der kan få tumoren til at aftage.
3 DK 173755 B1
Det skal bemærkes, at selv om vaccinia foretrækkes som virusvektor, kan andre vira også anvendes, især vira fra herpesgruppen samt adeno-vira.
Viruset omfatter alle de elementer, der er nødvendige til ekspression 5 af T-proteinet i celler fra højerestående dyr, og især omfatter det en virusvektorpromotor. I tilfælde af vaccinia anvendes fx promotoren for proteinet på 7,5 Kd. Forbindelsen promotor/T-kodende sekvens indsættes i et ikke-essentielt virusgen; i tilfælde af vaccinia fx genet for thymidinkinase (TK), hvilket tillader en let selektion af rekom-10 binante TK”-vira.
Den foreliggende opfindelse muliggør tilvejebringelse af celler fra højerestående dyr, der er inficeret med de ovenfor beskrevne vira, samt en fremgangsmåde til fremstilling af et T-antigen ud fra disse celler, hvilket T-antigen er ejendommeligt ved, at det omfatter det 15 essentielle område fra et specifikt tumorprotein. Betingelserne for dyrkning af celler og vira er kendte for fagfolk og varierer alt efter de anvendte celler og vira ligesom teknikkerne for separation af proteinet, idet dette kan anvendes i mere eller mindre oprenset form.
20 I en første udførelsesform inokuleres det levende virus, der udtrykker T-antigenet, i et menneske eller dyr. 1 en anden udførelsesform injiceres i et menneske eller dyr et farmaceutisk præparat, der omfatter ekstrakter af celler inficeret med det rekombinante virus, eller T-antigenet, der er fuldstændig oprenset ud fra disse ekstrak-25 ter, eller også selve det rekombinante dræbte virus, der på sin overflade har T-antigenmolekyleme.
De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis i former, der kan injiceres i mennesker eller dyr. Disse farmaceutiske præparater kan fremstilles ved fremgangsmåder, der er kendte inden 30 for området med vacciner og forarbejdning af proteiner. De doser, der kan anvendes, kan variere inden for et bredt område og er især en funktion af den tumor, der skal forebygges eller behandles, af patientens tilstand og af andre parametre, som lægen vurderer.
4 DK 173755 B1
Den foreliggende opfindelse muliggør tilvejebringelse af antistoffer mod T-antigenet eller det vigtige område heraf og anvendelse som diagnostisk middel af disse antistoffer eller af selve T-antigenet, idet disse molekyler kan være mærkede eller umærkede ved fremgangs-5 måder, der er kendte for fagfolk.
Nedenstående eksempler belyser opfindelsens idé i en dyremodel bestående af rottetumorceller og et T-antigen, der er indkodet af polyom-viruset, PY, som er ansvarligt for den tumorigene virkning, men det er klart, at lignende resultater kan opnås med ethvert andet speci-10 fikt tumorantigen i fraværelse af normale voksenvæv, og at anvendelse af disse forskellige T-antigener også er omfattet af opfindelsen.
Blandt de andre T-antigener, som kan fungere som mål ved fremgangsmåden, kan nævnes specifikke antigener for colorektalt carcinom, mela-nom, nyrecancer, neuroblastom, blærecarcinom, mammalt carcinom, 15 lymfomer og adenomer i de endokrine kirtler.
De tumorantigener, der fungerer som mål ifølge den foreliggende opfindelse, kan være bestanddele af værten, hvis ekspression er ændret i tumorvævet, eller mere almindeligt antigener, der indkodes af vira, som er ansvarlige for cellernes omdannelse til cancerceller, især 20 retrovira eller papovavira såsom papillomer og polyomer.
EKSEMPEL 1
Konstruktion af tre rekombinante vacciniavira, der hver udtrykker ét a£ T-antigenerne fra PY-virus
Pig. 1 (modificeret i forhold til reference 17) viser strukturen af 25 det tidlige område af PY-DNA og viser de tre gener, LT, MT og ST, som overlapper hinanden, og især den del, der svarer til det N-terminale område, som er fælles for dem. Transkriptionsinitieringsstedet i PY er vist med TATA, og signalerne for initiering og afslutning af translationen er vist som henholdsvis ATG og TGA. Stillingen af in-30 tronerne er vist, og det samme er tilfældet for polyadenyleringsste-derne.
5 DK 173755 B1
De sekvenser, der koder for de tre T-antigener fra PY-virus, er allerede blevet klonet efter at være blevet frigjort for deres introner ved udskæring in vitro (27-28), hvilket giver plasmideme pPY-LTl, pPY-MTl og pPY-STl (28). Disse kodende sekvenser blev isoleret ved 5 spaltning med Bgll i den ene ende og med Hindu for LT, EcoRI for MT og PvuXI for ST i den anden ende. Bgll-enden blev gjort kompatibel med et BamHI-sted ved hjælp af en enkeltstrenget syntetisk adaptor (42), 5'-d.GATCTGG-3'. De tre således behandlede DNA-segmenter blev indsat i vektoren pTG186-poly henholdsvis mellem stederne BamHI-SmaX, 10 BamHI-EcoRI og BatriHI-Smal (fig. 2). Vektoren pTGl86-poly stammer fra indsætning af polylinkeren i M13TG131 (41), som indfører flere restriktionssteder i vektoren pTGlH-TK-7,5 K (29) nedstrøms for 7,5 K-genpromotoren fra vacciniavirus, der selv er indsat i TK-genet fra vaccinia. De tre sekvenser, der koder for τ-antigenerne, og deres 15 respektive signaler for translationsinitiering og -afslutning blev således indsat i et ikke-essentielt vacciniavirusgen efter at være blevet anbragt nedstrøms for en vacciniaviruspromotor. Efter en dobbelt rekombination i de celler, der er inficeret med vildtype-virus og transficeret med det rekombinante plasmid som tidligere beskrevet 20 (29), findes den sekvens, der koder for T-antigenet, indsat i vacci- niavirusgenomet. De rekombinante vira, der bærer det fremmede gen, selekteres for deres TK~-karakter ved multiplikation på 143 B-celler, TK~, i nærværelse af 5-bromdeoxyuridin.
De rekombinante vira, i hvilke de sekvenser, der koder for T-antige-25 nerne, er indsat, blev identificeret ved "Southern blot", og tre repræsentative vira blev isoleret: W.PY.LT-H, W.PY.MT-I og W.PY.ST-J.
EKSEMPEL 2
Jn vi tro-undersøgelse af egenskaberne hos T-antigener syntetiseret a£ 30 de rekombinante W-PY-vira
De tre T-antigener, der udtrykkes af de rekombinante vacciniavira, genkendes af antistoffer mod T-antigenet fra nativ py.
6 DK 173755 B1
Den intracellulære beliggenhed af antigenerne blev undersøgt ved hjælp af fluorescerende antistoffer: semikonfluente hamsterceller (BHK21) blev separat inficeret med de tre typer rekombinante W.PY.T-vira (0,1 pfu/celle; inkubation natten over); T-antigeneme blev 5 påvist i cellerne fikseret med acetone (80%) ved sekventiel påføring af antiserum fra hyperimmun rotte, anti-T (RAF nr. 4, CNRS-Nice (43); 1/50 i PBS + 1% bovint serumalbumin), derefter anti-rotte-antistof-fer, fluorescerende (gede-immunoglobuliner, leveret af Miles, 1/100 i PBS + 1% bovint serumalbumin). De to antistoffer adsorberes hver i 10 20 minutter ved 37°C, hvorefter cellerne vaskes for at eliminere ikke-fikserede antistoffer, i fig. 3 er vist immunfluorescensen af celler inficeret med W.PY.LT (A) , W.PY.MT (B), W.PY.ST (C) og ikke-inficerede celler (D).
Det fremgår af fig. 3A, at LT-proteinet som forventet (30,16) udeluk-15 kende befinder sig i kernen; ST-proteinet befinder sig hovedsageligt i cytoplasmaet (fig. 3C); MT-proteinet befinder sig hovedsageligt i cytoplasmaet (fig. 3B) og ikke på overfladen, som det er beskrevet (15,31). Dets svage, men reproducerbare detektion i det perinukleare område antyder en forbindelse med Golgi-apparatet og andre intracel-20 lulære membraner, hvilket er beskrevet i andre nylige undersøgelser (32-33) .
EKSEMPEL 3
Undersøgelse af immunresponset induceret hos dyr, der subkutant er inokuleret med de rekombinante vira 25 For at bedømme vaccinationsevnen hos de tre W-PY-rekonibinanter blev deres evne til at inducere et antitumoralt immunrespons bedømt in vivo.
Det er kendt, at rotter, der inokuleres subkutant med syngenetiske celler transformeret med PY, hurtigt udvikler tumorer, som findes på 30 transplantationsstedet. Denne forsøgsmodel bør derfor muliggøre på- 7 DK 173755 B1 visning af induktion af et immunrespons, der er i stand til at blokere udviklingen af tumoren.
Grupper af hunrotter (Fischer), 4 uger gamle, blev subkutant in-okuleret med de forskellige rekombinante vira (i en dosis på 107 pfu 5 pr 100 μΐ), på ny inokuleret med samme dosis efter 12 dage og derefter underkastet en test-inokulation den 16. dag med 3T3-rotteceller transformeret med komplet PY (PYT-21) i en dosis på 2xl04 celler pr.
10O μΐ. En gruppe rotter blev samtidig inokuleret med de tre rekombinante vira for at påvise en eventuel kumulativ virkning af de tre T-10 antigener, hvilket tidligere er antydet (28) . Resultaterne er vist i tabel I:
Alle ikke-vaccinerede kontroldyr udvikler detekterbare tumorer i løbet af de 14 dage efter inokulationen af de transformerede celler; desuden ses ingen spontan regression i løbet af forsøget 15 (42 dage).
De dyr, der er vaccineret med W.PY.LT og W.PY.MT, udvikler små tumorer (med en diameter på > S mm) , som hurtigt aftager og fuldstændig er elimineret hos 50-60% af dyrene.
De dyr, der er vaccineret med W.PY.ST, udvikler tumorer, som 20 ikke svinder med tiden. Den virkning, der ses med W.PY.LT og MT, er således meget specifik og kan ikke tilskrives en uspecifik stimulering af iiranunsysternet med vacciniavirus, som er et fortræffeligt immunogen og kunne have en virkningsmåde, der ligner BCG's (34).
25 - Samtidig inokulation af de tre rekombinanter giver ingen signi fikant forbedring.
TABEL I
8 DK 173755 B1
Afstødning af tumorer hos rotter, der er subkutant inokuleret med W.PY.T-rekombinanterne
Samlet antal dyr, der afstøder tumoren/ 5 samlet antal inokulerede dyr vacci- ----- nations- Tid efter in- virus okulationen: 18 dage 21 dage 27 dage 35 dage 10 - 0/4 0/4 0/4 0/4 W.PY.ST 0/7 0/7 0/7 0/7 W. PY.MT 0/10 1/10 3/10 6/10 W.PY.LT 0/10 0/10 2/10 5/10 W.PY.LT + W.PY.MT + 15 W.PY.ST 2/4 2/4 1/4 1/4* * 1 dyr udviklede ingen detekterbar tumor før 35 dage efter in- okulationen.
Dyrene blev aflivet efter 42 dage, og deres sera blev analyseret 20 (tabel II). Alle de vaccinerede dyr havde høje antistoftitere mod vacciniavirus og mod de med PY transformerede celler, hvad enten de var i stand til at afstøde tumorerne eller ej.
Det ser således ud til, at afstødelsen af tumorer ikke kan tilskrives antistoffer i kredsløbet, men kræver deltagelse af en anden immun-25 mekanisme.
TABEL II
9 DK 173755 B1
Antistoftitere hos vaccinerede og inficerede dyr, der blev aflivet efter 42 dage
Antistoftiter1 mod 5 vaccinia celler transforme -
Vacci- Tumorens meret med PY
nations- diameter (middel- (middelvirus (i mm) værdi) værdi) - 15 1,8 13,7 20 6,9 (7,9) 10,2 (12,3) 15 15,9 7,3 5 6,7 18,0 W.PY.ST 15 253 56,5 15 10 220 (224) 26,1 (37,0) 15 21B 31,6 20 203 33,8 W.PY.MT - 227 35,9 258 (243) 32,6 (30,7) 20 - 266 28,4 10 222 25,9 W.PY.LT - 226 11,8 14 226 (243) 21,2 (37,9) 227 30,9 25 - 295 87,8 W.PY.LT + - 180 16,0 W.PY.MT + 15 300 (247) 23,4 (22,8) W.PY.ST 3 252 33,9 8 255 17,9 30 _
Antistofferne titreres i mikroplaques med oprenset vacciniavirus (106 pfu pr. 100 μΐ) eller en suspension af PYT-21-celler (105 celler pr. 100 μΐ); det fikserede antistof detekteres ved sekventiel tilsætning af fåre-antirotte-IgG mærket med biotin (Amersham) og derefter 35 streptavidin-peroxidase (Amersham) og derefter ELAVIA-R9-reagens (Pasteur-Diagnostic). Absorptionen ved 492 nm måles med en Titertek-Uniskan-plaqueaflæser. Antistoftiteret angives ved produktet af multiplikationen af den målte optiske tæthed med fortyndingen af det anvendte antiserum. Hvert resultat er en middelværdi af tre fortyn-40 dinger (1/50, 1/250 og 1/1250).
EKSEMPEL 4 10 DK 173755 B1
Afstødning af tumorer hos dyr, der er intradermalt vaccineret med de rekombinante vira
Der blev forsøgt en anden inokulationsvej for vaccinationsviruset.
5 Grupper af hunrotter (Fischer), 4 uger gamle, blev vaccineret intradermalt ved skarifikation af haleroden ved hjælp af en skalpel med oprenset virus (10 μΐ af en stamopløsning på 2xl09 pfu/ml). Endnu en dosis inokuleres efter 15 dage. Dyrene udsættes 4 dage senere for en test-inokulation ved subkutan injektion af 2xl04 PYT-21-celler pr.
10 100 μΐ.
Resultaterne er vist i tabel III.
TABEL III
Afstødning af tumorer hos rotter, der er intradermalt inokuleret med W.PY.T-rekombinanterne 15 Samlet antal dyr, der afstøder tumoren/ samlet antal inokulerede dyr
Vaccinati- Tid efter in- onsvirus okulationen: 22 dage 29 dage 39 dage 20------__-- 0/4 0/4 0/4 W.PY.ST 0/4 0/4 0/4 W.PY.MT 2/8 7/8 8/8 W.PY.LT 0/8 0/8 5/8 25 -—---------------- EKSEMPEL 5 DK 173755 B1 11
Behandling af dyr, der bærer tumorer, med de rekombinante VV.PY.T-vira
Administration af de rekombinante vira blev forsøgt som helbredende 5 behandling af tumorer.
10 rotter, der var inokuleret med celler transformeret med PY, og som havde udviklet en tumor, blev inokuleret med rekombinanten W.PY.LT efter 12 og 16 dage; tumoren målte 2-3 mm ved den første inokulation.
Hos alle dyrene fortsatte tumoren med at vokse, indtil den nåede en 10 diameter på 15 mm. Hos 2 dyr svandt tumoren derefter signifikant (iagttagelse på dag 35) og blev derefter fuldstændig elimineret.
Et lignende resultat blev hverken observeret med W.PY.MT eller med W.PY.ST, hvilket antyder forskelle i immunogenicitet mellem de tre T-antigenarter.
15 Deponering af stamme ifølge opfindelsen
Det vektorplasmid, i hvilket en hvilken som helst sekvens, der koder for et T-antigen, kan indsættes og senere rekombineres i vaccinia-virus, blev den 20. juni 1985 deponeret i Collection Nationale de Cultures de Microorganismes med nummeret 1-458.
20 Dette E. coli-plasmid, der stammer fra pML2, omfatter et replikati-onsinitieringssted i E. coli, /3-lactamasegenet, TK-genet fra vaccinia, afbrudt af 7,5 K-promotoren fra vaccinia og en fremmed kodende sekvens (sekvens fra humant IL-2), som kan erstattes med den sekvens, der koder for et T-antigen.
25 REFERENCER
1. Hellstrom, K.E., Hellstrom, I. & Brown, J.P. Springer Semin. Immunopathol. 5, 127-146 (1982).
12 DK 173755 B1 2. Herlyn, M., Blaszczyk, M. & Koprowski, H. Contr. Oncol. 19, 160-170 (1984).
3. Begent, R.H.J. Biochim. Biophys. Acta 780, 151-166 (1985).
4. Miller, R.A., Maloney, D., Wamke, R., McDougall, R., Wood, G., 5 Kawakami, T.r Dilley, J., Goris, M.I. & Levi, R. i: Hybridomas in Cancer Diagnosis and Treatment, Mitchell, M.S. & Oettgen, H.F. (red.), Raven Press, New York (1982).
5. Gross, L. Cancer Res. 3, 326-333 (1943).
6. Foley, E.J. Cancer Res. 13, 835-837 (1953).
10 7. Prehn, R.T. & Main, J.M. J. Natl. Cancer Inst. 18, 769-778 (1957).
8. Lee, V.K. , Harriott, T.G., Kuchroo, V.K., Halliday, W.J., Hellstrom, I. & Hellstrom, K.E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6286-6290 (1985).
15 9. Herlyn, D., Ross, A.H. & Koprowski, H. Science 232, 100-102 (1986) .
10. Teventhia, S.S., Flyer, D.C. & Tijan, R. Virology 107, 13-23 (1980).
11. Zinkernagel, R.M. & Doherty, P.C. Adv. Immunol. 27, 51-177 20 (1979).
12. Sjogren, H.O., Hellstrom, I. & Klein, I. Cancer Res. 21, 329-337 (1961).
13. Habel, K. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 106, 722-725 (1961).
14. Ito, Y., Brocklehurst, J.R. & Dulbecco, R. Proc. Natl. Acad.
25 Sci. USA 74, 4666-4670 (1977).
15. Basilico, C. Pharmac. Ther. 26, 235-272 (1984).
16. Griffin, B.E. & Dilworth, S.M. Adv. Cancer Res. 39, 183-268 (1983).
17. Tooze, J. DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Press, New York 30 (1981).
18. Panicali, D. & Paoletti, E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).
19. Mackett, M., Smith, G.L. & Moss, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419 (1982) .
35 20. Smith, G.L., Mackett, M. & Moss, B. Biotechnol. Genet. Eng. Rev.
2, 383-407 (1984).
21. Wiktor, T.J., MacFarlan, R.I., Reagan, K.J., Dietzschold, B.,
Curtis, P.J., Wunner, W.H., Kieny, M.P., Lathe, R., Lecocq, 13 DK 173755 B1 J.P., Mackett, M., Moss, B. S Xoprowski, H. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81, 7194-7198 (1984).
22. Wiktor, T.J., Kieny, M.P. & Lathe, R. Appl. Virol. 2, under udgivelse (1986).
5 23. Bennink, J.R., Yewdell, J.W., Smith, G.L., Moller, C. & Moss, B.
Nature 311, 578-579 (1984).
24. McMichael, A.J., Michie, C.A., Gotch, F.M., Smith, G.L. & Moss, B. J. Gen. Virol. 67, 719-726 (1986).
25. Hellstrom, K.E. & Hellstrom, I. Adv. Cancer Res. 12, 167-223 10 (1969).
26. Heberman, R.B. Adv. Cancer Res. 19, 207-263 (1974).
27. Treisman, R., Novak, U., Favaloro, J. & Kamen, R. Nature 292, 595-600 (1981).
28. Rassoulzadegan, M., Cowie, A., Carr, A., Glaichenhaus, N., 15 Kamen, R. & Cuzin, F. Nature 300, 713-718 (1982).
29. Kieny, M.P., Lathe, R., Drillien, R., Spehner, D., Skory, S.,
Schmitt, D., Wiktor, T.J., Koprowski, H. & Lecocq, J.P. Nature 213, 163-166 (1984).
30. Takemoto, K.K., Malmgren, R.A. & Habel, K. Virology 28, 485-488 20 (1966).
31. Schaffhausen, B.S., Dorai, H., Arakere, G. & Benjamin, T.L.
Molec. Cell. Biol. 2, 1187-1198 (1982).
32. Zhu, Z., Veldman, G.M., Cowie, A., Carr, A., Schaffhausen, B. &
Kamen, R. J. Virol. 51, 170-180 (1984).
25 33. Dilworth, S.M., Hansson, H.A., Darnfors, c., Bjursell, G.,
Streuli, C.H. & Griffin, B.E. EMBO J. 5, 491-499 (1986).
34. Old, L.J., Clarke, D.A. & Benacerraf, B. Nature 184, 291-292 (1959).
35. Dalianis, T., Ramqvist, T. & Klein, G. Int. J. Cancer 34, 403- 30 406 (1984).
36. Sharma, S., Rodgers, L., Brandsma, J., Gething, M.J. & Sambrook, J. EMBO J. 4, 1479-1589 (1985).
37. Koprowski, H., Herlyn, M., Steplewski, Z. & Sears, H.F. Science 212, 53-56 (1981).
35 38. Real, F.X., Mattes, M.J., Houghton, A.N., Oettgen, H.F., Lloyd, K. O. told, L.J. J. Exp. Med. 160, 1219-1233 (1984).
39. Ueda, R., Shiku, H., Pfreudschuh, M. Takahashi, L., Li, C., 14 DK 173755 B1
Whitmore, W.F., Oettgen, H.F. & Old, L.J. J. Exp. Med. 150, 564-572 (1979).
40. Drebin, J.A., Stern, D.F., Link, V.C., Weinberg, R.A. & Greene, Μ.I. Nature 312, 545-548 (1984).
5 41. Kieny, M.P., Lathe, R. & Lecocq, J.P. Gene 26, 91-99 (1983).
42. Lathe, R., Balland, A., Kohli, V. & Lecocq, J.P. Gene 20, 187-195 (1982).
43. Clertant, P., Gaudray, P., May, E. & Cuzin, P. J. Biol. Chem.
259, 15196-15203 (1984).

Claims (7)

1. Farmaceutisk komposition beregnet til forebyggende eller helbredende behandling af en tumor, kendetegnet ved, at den som terapeutisk bestanddel omfatter en rekombinant 5 viral vektor udvalgt blandt poxvira, adenovira og vira af herpesgruppen, indeholdende en heterolog DNA-sekvens kodende for mindst den essentielle region af et tumorspecifikt protein, kaldet T-antigen.
2. Farmaceutisk komposition ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den som terapeutisk be-10 standdel omfatter en viral vektor udvalgt blandt poxvira, adenovira og vira af herpesgruppen indeholdende en heterogen DNA-sekvens kodende for mindst den essentielle region af et tumorspecifikt protein, kaldet T-antigen.
3. Farmaceutisk komposition ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den virale vektor er 15 et vacciniavirus.
4. Farmaceutisk komposition ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen kodende for et T-antigen er en DNA-sekvens kodende for et protein, som er specifikt for en human tumor, som er fraværende i normalt væv hos en vok- 20 sen.
5. Farmaceutisk komposition ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen kodende for et T-antigen er en DNA-sekvens kodende for et protein af viral oprindelse. 25
6. Farmaceutisk komposition ifølge krav 5, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen kodende for et protein af viral oprindelse stammer fra en virus valgt blandt papovavira og retrovira.
7. Farmaceutisk komposition ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, 30 at den omfatter en farmaceutisk acceptabel bærer, som tillader den at blive administreret via injektion i mennesker eller dyr.
DK198704216A 1986-08-13 1987-08-12 Farmaceutisk komposition omfattende en viral vektor DK173755B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8611700A FR2602790B1 (fr) 1986-08-13 1986-08-13 Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante
FR8611700 1986-08-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK421687D0 DK421687D0 (da) 1987-08-12
DK421687A DK421687A (da) 1988-02-14
DK173755B1 true DK173755B1 (da) 2001-09-10

Family

ID=9338277

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198704216A DK173755B1 (da) 1986-08-13 1987-08-12 Farmaceutisk komposition omfattende en viral vektor

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0259212B1 (da)
JP (2) JP2852515B2 (da)
AT (1) ATE101648T1 (da)
AU (1) AU619448B2 (da)
CA (1) CA1341241C (da)
DE (1) DE3789082T2 (da)
DK (1) DK173755B1 (da)
ES (1) ES2061520T3 (da)
FR (1) FR2602790B1 (da)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2222165B (en) * 1988-08-20 1992-06-17 Animal Health Inst Recombinant capripoxvirus
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US5770442A (en) * 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US6783980B2 (en) 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6344445B1 (en) 1995-10-19 2002-02-05 Cantab Pharmaceutical Research Limited Herpes virus vectors and their uses
US6884430B1 (en) 1997-02-10 2005-04-26 Aventis Pharma S.A. Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles
BR9810369A (pt) 1997-06-30 2000-09-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Processo de transferência de ácido nucleico para o interior de um ou mais músculos estriados, in vivo, composição, ácido mucleico e campo elétrico, e, produto de combinação
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US6929946B1 (en) 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
FR2799472B1 (fr) 1999-10-07 2004-07-16 Aventis Pharma Sa Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales
IL154044A0 (en) 2000-07-21 2003-07-31 Essentia Biosystems Inc Multi-component pharmaceutical compositions containing a complex of a positively charged backbone and a negatively charged backbone and methods for the preparation thereof
DE60138403D1 (de) 2000-09-26 2009-05-28 Crucell Holland Bv Adenovirale vektoren für die übertragung von genen in zellen der skelettmuskulatur oder myoblasten
FR2829136B1 (fr) 2001-08-29 2006-11-17 Aventis Pharma Sa Derives lipidiques d'aminoglycosides
CN1308643C (zh) 2002-01-17 2007-04-04 阿尔法·拉瓦尔股份公司 包括沉入式蒸发器的壳体
SI1497438T1 (sl) 2002-04-25 2010-03-31 Crucell Holland Bv Sredstva in postopki za pripravo adenovirusnih vektorjev
WO2010026537A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Novel multimodular assembly useful for intracellular delivery
ES2536747T3 (es) * 2009-01-20 2015-05-28 Transgene Sa ICAM 1 soluble como biomarcador para predicción de respuesta terapéutica
WO2016075314A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-19 Institut National De La Recherche Agronomique Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica affectant la production de proteines
FR3028527A1 (fr) 2014-11-13 2016-05-20 Pivert Identification de facteurs de transcription de yarrowia lipolytica
FR3081169B1 (fr) 2018-05-15 2020-06-19 Messenger Biopharma Substitution de la coiffe des arn messagers par deux sequences d'arn introduites a leur extremite 5'

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0795954B2 (ja) * 1982-11-30 1995-10-18 アメリカ合衆国 外来性遺伝子発現のためのポックスウイルス組換え体の製造方法
CA1282721C (en) * 1984-06-04 1991-04-09 Bernard Roizman Herpes simplex virus as a vector
WO1987004463A1 (en) * 1986-01-27 1987-07-30 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same

Also Published As

Publication number Publication date
JPH09173061A (ja) 1997-07-08
AU7679787A (en) 1988-02-18
FR2602790A1 (fr) 1988-02-19
EP0259212A1 (fr) 1988-03-09
JPS6349077A (ja) 1988-03-01
CA1341241C (fr) 2001-06-05
ATE101648T1 (de) 1994-03-15
DE3789082T2 (de) 1994-09-01
DK421687A (da) 1988-02-14
AU619448B2 (en) 1992-01-30
DE3789082D1 (de) 1994-03-24
JP2852515B2 (ja) 1999-02-03
FR2602790B1 (fr) 1990-06-01
DK421687D0 (da) 1987-08-12
EP0259212B1 (fr) 1994-02-16
ES2061520T3 (es) 1994-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173755B1 (da) Farmaceutisk komposition omfattende en viral vektor
US6007806A (en) Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventive or curative treatment of the corresponding tumor
US5744133A (en) Expression of a tumor-specific antigen by a recombinant vector virus and use thereof in preventitive or curative treatment of the corresponding tumor
CA1341435C (en) Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
Hanke et al. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice
CA2050304C (fr) Composition pharmaceutique, utile a titre preventif ou curatif contre les tumeurs induites par les papillomavirus
Bernards et al. Effective tumor immunotherapy directed against an oncogene-encoded product using a vaccinia virus vector.
EP0344808B1 (en) Recombinant coccidiosis vaccines
EP0652967B1 (en) Self-assembling replication defective hybrid virus particles
US5770210A (en) Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
NL8602422A (nl) Recombinant-virus, antigeen peptide of eiwit, vaccin tegen verworven immuundeficientiesyndroom, vector voor recombinant-dna en eencelligen die deze vector bevatten.
WO1991019803A1 (en) Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles
Marín et al. Immunogenic properties of rabbit haemorrhagic disease virus structural protein VP60 expressed by a recombinant baculovirus: an efficient vaccine
Zheng et al. Construction and immunogenicity of a recombinant fowlpox virus containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus
US7645455B2 (en) Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides
Hu et al. Characterization of a recombinant vaccinia virus expressing human melanoma-associated antigen p97
Gilbert et al. Feline leukemia virus envelope protein expression encoded by a recombinant vaccinia virus: apparent lack of immunogenicity in vaccinated animals
WO1994012617A1 (en) Hepatitis b virus vaccines
US6458362B1 (en) Recombinant VP2 parvoviral pseudo-particles encoding CTL or T-helper cell epitopes
JPH10512151A (ja) Ｈｔｌｖ抗原を発現する組換え弱毒化ポックスウイルスを含有する免疫原性組成物
EP0471457A2 (en) Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot & mouth disease virus epitope
CN114107227B (zh) 一种同时表达经典株和变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗
EP1171454A1 (en) Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides
Clertant et al. Recombinant polyoma—vaccinia viruses: T antigen expression vectors and anti-tumor immunization agents
Mackett The live vector approach—viruses

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PBP Patent lapsed

Country of ref document: DK