JPH037594A - 組換えコクシジウム症ワクチン類 - Google Patents

組換えコクシジウム症ワクチン類

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JPH037594A
JPH037594A JP1140268A JP14026889A JPH037594A JP H037594 A JPH037594 A JP H037594A JP 1140268 A JP1140268 A JP 1140268A JP 14026889 A JP14026889 A JP 14026889A JP H037594 A JPH037594 A JP H037594A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）は、アイメ
リア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属の細胞内の原虫類の寄生生物
類（ｐｒｏｔｏｚｏａｎ　ｐａｒａｓｉｔｅ）による家
禽の疾患である。
この疾患は、大規模な風土病であり、集約的な家禽の育
種の確立弱よび化学療法による該疾患の管理の見積もり
費用は、米国だけでも毎年１００億ドルを越える。抗コ
クシジア薬に対する耐性の発現は、新規薬剤の継続的な
開発を必要とし、同時に薬剤の開発にますます費用が掛
かりつつあり、かつ消費者の食用動物類中の薬剤残留に
対しての容認がますます小さくなる。
自然のコクシジウム症の感染に対する保護的免疫は、よ
（典拠されている。管理された数週間にわたる、小数の
成育可能な接合子嚢（ｏｏｃｙｔ）の毎日の投与は、通
常には有毒な投与量の誘発的な感染（ｃｈａｌｌｅｎｇ
ｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）に対して完全な免疫をもたら
すことが示されている（ＲｏｓｅらのＰａｒａｓ　ｉ　
ｔ。
１ｏｇｙ　７３：２５（１９７６）ｓ　Ｒｏｓｅ　らの
Ｐｏｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　８８：１９９　（１９８４
））。感染に対して獲得された抵抗力の証明は、化学的
なコクシジウム症薬に対する要求を迂回して、若いニワ
トリに免疫を誘発するワクチンの構築ができることを示
唆している。事実、その様な考えは、米国、アラバマ州
、オペリカ、Ｓｔｅｒｗｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　　Ｃｏｃｃｉｖａｃ（商標）薬剤について試験さ
れている。
コクシジウム症ワクチンの製造の目的で、Ｍｕｒｒａｙ
ら（ヨーロッパ特許出願、発行番号１６７．４４３）は
、それらの多くが胞子小体くスボロヅイト：　５ｐｏｒ
ｏ−ｚｏｉｔｅ）の表面に会合していた少なくとも１５
種のポリペプチドを含有するＥｉｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅ
ｌｌａの胞子小体類または胞子化接合子嚢（オーシスｌ
−：ｏｏｃｙｓｔ）類からの抽出物類を調製した。これ
らの抽出物類のニワトリへの注射は、Ｅ、　ｔｅｎｅｌ
ｌａの毒性量の胞子化接合子嚢の経口接種の結果である
。盲腸障害（ｃｅｃａｌ　１ｅｓｉｏｎｓ）を減少させ
た。更に最近、５ｃｈｅｎｋｅｌ　ら（米国特許第４　
、６５０．６７６　）は、Ｅ。
ｔｅｎｅＩＩａの分裂小体（モロゾイト：　ｍｏｒｏｚ
ｏｉ　ｔｅ）　ＩＮに対するモノクローナル抗体類の製
造を開示した。
これらの抗体類を使用して、５ｃｈｅｎｋｅｌらは、咳
抗体が支配される多数の抗原を同定した。Ｅ　、　ｔｅ
ｎｅ　、　ｌａの胞子小体類とそれらの抗体類の前培養
、続いての処理された該胞子小体類のニワトリの盲端（
ｃｅｃａ）への挿入によって、５ｃｈｅｎｋｅｌらは、
胞子小体で処理されなかった対照に比べて盲腸障害の評
価値がやや低下することを示すことができた。
組換えＤＮＡ技術に於ける進展は、他の取り掛かり、す
なわち、サブユニットワクチン（ｓｕｂｕｎｉｔ。
ｖａｃｃｉｎｅ）類の入手を可能にしている。現在の組
換えＤＮＡ法の応用に於いて、特定のＤＮＡ配列が、適
当なりＮＡベヒクルまたはベクターに挿入され、宿主細
胞中で複製できる組換えＤＮＡ分子類を形成する。プラ
スミドと称される環状二重鎖ＤＮＡ分子類は、ベクター
類として頻繁に使用されており、また該組換えＤＮＡ形
態類の調製は、特定の塩基配列部位に於て開裂できる制
限エンドヌクレアーゼ酵素類の使用を伴なう。−旦、プ
ラスミド中および挿入されるべき外来ＤＮＡの分節中に
、制限酵素によって切断がなされた後には、２種のＤＮ
Ａ分子を、リガーゼとして知られている酵素によって共
有的に結合し得る。この様な組換えＤＮＡ分子類の一般
的な調製方法は、Ｃｏｈｅｎら〔米国特許第４，２３７
．２２４号〕、Ｃｏ１１ｉｎｓら（米国特許第４，３０
４，８６３号）およびＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ門ａｎｕａｌ、１９Ｂ２．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　”Ｊによって記
述されている。これらは多くの技術の情況を説明してい
るので、これらの参考文献を参照して以下に示す。
多くの条件が適合する場合に限り、−変調製された組換
えＤＮＡ分子類は、挿入された遺伝子配列によって特定
された生成物を調製するのに使用されることができる。
組換え分子が適合しえ、従って、宿主細胞中で自律的に
複製しうるということが第１位の必要条件である。ごく
最近の研究には、広範囲の組換えプラスミド類に適合す
るため、宿主微生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉが使用されている。使用されるベクター／宿主細
胞系に応じて、組換えＤＮＡ分子は、形質転換、トラン
スフクションまたはトランスフェクションによって宿主
中に導入される。
宿主細胞中の組換えプラスミド類の存在の検出は、フラ
スミドマーカー活性、例えば抗生物質耐性を使用するこ
とによって都合よく達成される。
従って、アンピシリン分解酵素の産生をコードするプラ
スミドを有する宿主は、アンピシリンを含有する培地中
で、宿主を成育させることにより非改造細胞（ｕｎａｌ
ｔｅｒｅｄ　ｃｅｌｌ）から選択することができた。更
に別の利点は、選択された制限ヌクレアーゼが切断し、
更に外来遺伝子が挿入される部位に於いて、第２番目の
抗生物質分解活性をコードするプラスミドである抗生物
質耐性マーカーを取っても良いことである。次に紺換え
プラスミドを正しく含有している宿主細胞は、第１番目
の抗生物質に耐性であるが第２番目のものには感受性で
あることによって特徴付けられる。
宿主細胞中への組換えプラスミドの単なる挿入および変
更された宿主の単離は、著量の所望の遺伝子産物が産生
されるということをそれ自体で保証するものではない。
これが生ずるため、外来遺伝子配列は、プロモーターと
称されるＤＮＡ転写のためのシグナル領域と正しい関係
でプラスミド中に融合されなければならない。別法とし
て、外来遺伝子は、これが宿主によって認識される限り
、それ自体のプロモーターを有していても良い。その出
来を問わず、プロモーターは、ｌ？ＮＡボリメラ−ゼの
結合を支配し、従って、メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）に対するＤＮＡの転写を“促進する”ＤＮＡ配列で
ある。
多量のｍＲＮＡを与えることができる強い促進が与えら
れた場合に、所望の遺伝子産物の最終的な産生は、ｍＲ
ＮＡから蛋白質への変換の有効性に依存するであろう。
また逆にこれは、ｍＲＮＡに対するリボゾーム結合の効
率に依存する。Ｅ、ｃｏｌｉ中、ｍＲＮＡ上のりボゾー
ム結合部位は、開始コドン（ＡＵＧ）および上流のシャ
イン・ダルガーノ（ＳＤ）配列を包含する。３−９個の
ヌクレオチドを包含し、そしてＡＵＧコドンから３−１
１個のヌクレオチドに位置するこの配列は、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　１６ＳリボゾームＲＮ＾（ｒＲＮ＾）の３′末端に
相補的である（ＳｈｉｎおよびＤａｌｇａｒｎｏ。
Ｎａｔｕｒｅ２５４：３４（１９７５））　、明らかに
、ｍＲＮＡに対するリボゾーム結合は、ｍＲＮＡ中のＳ
Ｄ配列と１６Ｓ　ｒＲＮＡ３′末端に於ける配列との間
の塩基対によって促進される。遺伝子発現の最大化に対
しての再吟味のためには、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＬａｕ
ｅｒのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ６８
：４７３（１９７９）を参照。
別の発現系が、ラムダファージベクターとの組合せに於
いて１ａｃＺオペロンに基づいての開発がなされている
（ＨｕｙｎｈらのＩｎ　ＯＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　
１巻、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ、Ｅｄ、）　＊　この系に
於いて、その発現を制限する誘発可能なプロモーターを
伴ったβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子が、ファージ
ベクター中に巧みに処理されている。β−ガラクトシダ
ーゼに対する遺伝子の３′末端における特異的なりロー
ニング部位は、ｍＲＮＡのｃＤＮＡの複製または蛋白質
コード領域を包含するゲノムＤＮＡ断片の挿入によって
遺伝子の融合をもたらす。
挿入物がβ−ガラクトシダーゼのための読み出しわくと
して同一のレジスター中に開始読み出しわくを包含する
場合に於いて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現は、
１１４ｋｄのβ−ガラクトシダーゼおよびｃＤＮＡ挿入
物によってコードされたカルボキシ末端ポリペプチドを
含む融合蛋白質の産生をもたらす、生成物がモノクロー
ナルまたはポリクローナル抗血清によって認識される様
な遺伝子を包含するファージは、従って、１ａｃＺレプ
レツサーを不活性化させるためにβ−Ｄ−チオガラクト
シビラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて該融合蛋白質の発現
の誘発に続いて該ライブラリーの免疫スクリーニングに
より同定されうる。この発現ベクター系は、ＤＮＡの充
填およびそのＥ、ｃｏｌｉ細胞中への導入におけるファ
ージ系の効率とβ−ガラクトシダーゼとのポリペプチド
の融合の安定性の増加とを兼ね備える。
ワクチンサブユニットの研究による方法では、完全な伝
染性の生物のサブユニットは、免疫学的に適切な情況下
、宿主動物に搬入される。該サブユニットは、寄生生物
からの精製された蛋白質、組換え蛋白質または異種の系
に於いて発現された蛋白質の断片、単一の中和決定因子
から成る合成ペプチドまたはウィルス性のベクター、例
えばワクチンによって導入された蛋白質であっても良い
。
該宿主免疫系は、寄生生物全体にさらされることなしに
、サブユニットに対する特異的応答を果す。
それまでにさらされたことのあるワクチンサブユニット
によってのみ指示されると、染色性の生物の有毒な投与
量に対する誘発によって、該宿主免疫系は、好結果の防
御を果す。
証拠は、コクシジウム症に対する獲得耐性に於いては循
環している抗体類、腸管上皮中の分泌ＩｇＡ　　（Ｄａ
ｖｉｓ　らのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　、１４：８７９（
１９７８）　）、および細胞伝達免疫系（Ｇｉａｍｂｒ
ｏｎｉ　らのｐＨ１ｔｒｙＳｉｅｎｃｅ　５９：３Ｂ（
１，９８０）　）が関与している文献中に見出される。
再吟味のためにＰ、Ｓ、Ｄａｖｉｓ　ｉｎ　Ａｖｉａｎ
ｌｗｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｍ、Ｅ、Ｒｏｓｅ著、Ｂｒ１
ｔｉｓｈ　ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｎｃｅ、Ｌｔｄ、エデ
ンバーグｐｐ、３６１−３８５（１９８１）参照。免疫
系の各種の支流のありうるかかわりは、完全でまた永続
する保護が、自然な感染の過程の特異的な面をまねる能
力を必要とするであろうことを意味する。これらの面は
、保護が望まれる部位に於ける局所的な露呈、配列抗原
加工細胞に対しての炎症性の応答の喚起、適切な寄生生
物の抗原の提示およびおそらく特別な膜配列に於けるＭ
）Ｉｃ決定因子との会合を含む。
本発明は、アイメリア表面抗原の免疫反応性および／ま
たは抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因子を有する
精製された蛋白質またはその断片を提供する。
更に詳しくは、本発明は、表面抗原が約２８．３７．１
２０または２００ｋｄ　（Ｋ　ｉ　１ｏｄａ　１　ｔｏ
ｎ）よりも大きい見かけの分子量を有し、アメリカン・
タイプ・カルチ＋−−’：ｌＬｙクシゴン　（Ａｍｅｒ
ｆｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ　：　ＡＴＣＣ）に寄託されており、かつ寄託番号
ＨＢ　９７０７からＨＢ　９７１２が割り当てられた１
種もしくはそれ以上のモノクローナル抗体類に特異的に
結合するアイメリア表面抗原の免疫反応性および／また
は抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因子を有する蛋
白質を提供するものである。該蛋白質の例は、第１５図
、第１７図、第１９図および第２１図に示されたアミノ
酸配列を有する蒼白質およびこれと機能的に同等な蛋白
質である。該機能的に同等な蛋白質は、付加、削除、挿
入およびアミノ酸置換による前記したアミノ酸配列から
誘導されたアミノ酸配列を存する蛋白質類であり、これ
らの蛋白質は、アイメリア表面抗原の免疫反応性および
／または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因子を有
する蛋白質類である。該蛋白質類を、コクシジウム症に
対する家禽の免疫化に使用してもよい。
更に本発明は、前記蛋白質類に対して支配される抗体類
、特に例えば寄託番号）ＩＢ　９７０７、）ＩＢ　９７
０８、）ＩＢ　９７０９、ＨＢ　９７１０．　　）１８
９７１１およびＨ８９７１２を伴うモノクローナル抗体
を提供する。
更にまた本発明は、前記蛋白１１をコードするＤＮＡ配
列類、該ＤＮＡ配列類を包含する組換えベクター類、特
に適合しうる宿主微生物類中で該ＤＮＡ配列類の発現を
支配しうる組換えベクターおよび該組換えベクターで形
質転換された宿主微生物類、特に前記蛋白質をコードす
る該組換えベクター中に包含されたＤＮＡ配列類を発現
しうる形質転換宿主微生物類を提供するものである。
更にまた本発明は、アイメリア表面抗原の免疫反応性お
よび／または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因子
類を有する蛋白質の製造方法に於いて、 （ａ）　　該蛋白質をコードするＤＮＡ配列を包含する
組換えベクターで形質転換させた宿主微生物を、ＤＮＡ
配列が発現する条件下に培養し；更に ０〕）培養物から蛋白質を単離する することを特徴とする蛋白質の製造方法を提供するもの
である。
更にまた本発明は、それ自体公知の方法を使用し、本発
明の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を包含する組換えベ
クターで宿主微生物を形質転換させることを特徴とする
前記形質転換宿主微生物の製造方法を提供するものであ
る。
更にまた本発明は、１種もしくはそれ以上の本発明の蛋
白質類および生理学的に許容しうる担体を包含するコク
シジウム症に対して家禽を保護するためのワクチン類を
提供するものである。
更にまた本発明は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ
配列またはその断片を包含し、該ＤＮ＾配列または断片
を発現しうるウィルス性のベクターおよび生理学的に許
容しうる担体を包含するコクシジウム症に対して家禽を
保護するためのワクチン類を提供するものである。
更にまた本発明は、コクシジウム症を受けやすい若い鳥
に有効量の本発明のワク゛チンを投与することを特徴と
するコクシジウム症に対して家禽を保護するための方法
を提供するものである。
本発明は、本発明の以下の記載および以下の図面と関連
する実施例によってより容易に理解されるであろう。
第１図は、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイト類のＥＬ
ＩＳＡの結果を示す。免疫マウス血清（ＭＳ　１０７−
２；Δ）および対照マウス血清（Ｘ）の希釈物を、４Ｘ
１０’の止端製スポロゾイト類と共に培養させた。スポ
ロゾイト類に結合した特異的抗体を、ペルオキシダーゼ
接合抗マウスＩｇＧ抗体およびペルオキシダーゼ基質の
０−フェニレンジアミンで測定した。
ＯＤｎ＊ｚがＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　
（商標）プレート読み取り機によって読まれた。
第２図は、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイトから可溶
化させた蛋白質類を用いて行なったウェスタン・プロッ
ト検査の結果を示す。可溶化させたスボロゾイト蛋白質
類を、１２．５％のゲル中、還元性５ＯＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分離させ、ニトロセルロ
ース膜に移し、更に各抗体と反応させた。各抗体によっ
て認識された特異的蛋白質類を、ペルオキシダーゼ接合
抗マウスＩｇＧ抗体およびペルオキシダーゼ基質の４−
クロロ−１−ナフトールで可視化させた。各帯と反応さ
せた抗体は、該帯の上部に示されている。
第３図は、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイトおよび
モロザイトおよびＥ、ａｃｅｒｖｕｌｉｎａのスポロゾ
イトから可溶化させた蛋白質類を用いて行なったウェス
タン・プロット検査の結果を示す。各種のモノクローナ
ル抗体類および血清類を、ニトロセルロース結合アイメ
リア蛋白質と共に培養させ、更に第２図の説明で述べら
れていると同様に可視化させた。
使用したモノクローナル抗体類は、３Ａ５　（１）、２
０Ｃ６（２）、？ＤＩ　（３）、１３Ａ６　（４）、６
＾５（５）およびアイメリア蛋白質に不反応であった対
照抗体を包含していた。
使用した血清は、マウス番号１０７−２免疫血清（７）
および対照血清（８）を包含していた。
第４図の左のパネルは、Ｅ、　ｔｅｎｅｌ　ｌａのスポ
ロゾイトの１２５）−標識表面蛋白質類による免疫沈澱
検査の結果を示す。スポロゾイト表面蛋白質類を、ｌ０
ＤＯＧＥＮまたはｌ０ＤＯＢＥＡＤＳ法のいずれかで標
識し、オートラジオグラフィーによる１２．５％のゲル
中での５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続い
て可視化させた。右のパネルは、化スポロゾイト類で免
疫させたマウスからの血清による＋２５１−標識スポロ
ゾイト表面蛋白質類の免疫沈澱の結果を示す。免疫マウ
ス血清（１０５−１，１０５−２，１０５−３，１０７
−１，１０７−２および１０７−３）および対照マウス
血清（対照）を、１２５■−スポロゾイト表面抗体と共
に培養し、免疫複合体を、アガロースに結合した抗マウ
ス抗体によって捕らえた。該免疫複合体を、Ｌａｅｍｍ
　ｌ　ｉ試料緩衝液で可溶化させ、１２．５％のゲル中
、５ＤＳ−ゲル電気泳動によって分離させ、オートラジ
オグラフィーによって可視化させた。Ｍは、ｋｄ　（ｋ
　ｉ　１　ｏｄａ　１　ｔｏｎ）での標準マーカー蛋白
質の分子量を示す。
第５図は、モノクローナル抗体による＋２Ｊ−スポロゾ
イト表面蛋白質類の免疫沈澱の結果を示す。
各抗体による１５１−蛋白質結合の同定の方法は、第４
図の記述に説明されている。使用された特異的スポロゾ
イトおよび対照抗体（対照）は、各レーンの上部に示さ
れている。標準マーカー蛋白質の分子量は、ｋｄで示さ
れている。
第６図は０、空気乾燥させたＥ、　ｔｅｎｅｌｌａのス
ポロゾイトの固体調製物類の相対比顕微鏡写真および各
種のモノクローナル抗体類を使用する免疫蛍光検査の染
色模様の顕微鏡写真を示す。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ
の左側は、大きな後方の屈折性組ｂｔｕ（ｌａｒｇｅ　
ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ　ｒｅｆｒａｃｔｉｌｌｅ　ｂｏｄ
ｙ）（ＰＢＲ）、小さな前方の屈折性組［１（ｓｍａｌ
ｌ　ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄ
ｙ）　（ＡＲＢ）および該後方の屈折組織の反対側の先
端部（Ａ）による完全に伸長されたスポロゾイト類を示
す相対比顕微鏡写真である。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤ
の右側は、それぞれモノクローナル抗体１４Ｃ３（表面
抗体に特異的）　、６Ａ５（表面および屈折性組織蛋白
質に特異的）　、１１０２　（スポロゾイト先端の先端
部に特異的）および対照抗体で処理されたスライドを示
す。ポリペプチドに結合した抗体は、ローダミン結合抗
マウス抗体類によって局在化させ、Ｌｅｉｔｚ　Ｄｉａ
ｌｕｘ　２２（商標）顕微鏡を使用するエビ蛍光（ｅｐ
ｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）によって可視化させた。
全ての顕微鏡写真は、６３０倍である。
第７図は、細胞内のスポロゾイト類の抗体染色およびニ
ワトリ腎臓細胞内に於ける発育寄生生物を示す。ニワト
リ腎臓細胞を、スポロゾイト類で感染させ、感染後、示
された時間に細胞は、抗体染色処理された。固定の前に
、培養物を洗浄し、全ての細胞外のスポロゾイト類を除
去した。相対比および対応する免疫蛍光顕微鏡写真を、
示された様に抗体類７Ｄ４．８Ａ２．７Ｂ２および１５
Ａ３を使用して作成した。調製物に結合した抗体類をロ
ーダミン結合抗マウス抗体類によって局在化させ、エビ
蛍光によって可視化させた。全ての顕微鏡写真は、６３
０倍である。
第８図は、細胞内のスポロゾイト類の抗体染色およびニ
ワトリ腎臓細胞内に於ける発育寄生生物を示す。相対比
および対応する免疫蛍光顕微鏡写真を、示された時間に
、モノクローナル抗体類１４Ｂ１および１９Ｄ６、免疫
ひよこ血清および蛍光第２抗体を使用して作成した。
第９図は、抗スポロゾイト抗体類による細胞内のスポロ
ゾイトの発育の中和を示す。精製されたｔＥ、ｔｅｎｅ
ｌｌａのスポロゾイト類を、４０°Ｃで１時間、対照抗
体（×）かまたは抗スポロゾイト抗体類７Ｄ４（ロ）、
８八２（○）、１４Ｂ１（・）あるいは６八５（■）か
と共に前培養させ、次いでＭｌ）ＢＫ細胞培養物で怒染
させた。更に、スポロシイ＋−ｉを、培地（Δ）または
抗コクシジジア薬、ラサロシド（ｌａｓａｌｏｃｉｄ）
（×）と共に前培養させた。
感染後、細胞内のスポロゾイトの発育を、細胞培養物中
への３Ｈ−ウラシルの取り込みによって測定した。ラサ
ロシドは、スポロゾイトの細胞内の発育を阻止するため
、この薬剤と共に調製された培養物は、３Ｈ−ラウシル
最小取り込みを示した。
第１０図は、示されている様に、６５　Ｋｄ−β−ガラ
クトシダーゼ融合蛋白質試料または他の試料の５ＯＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の１ウエスタン・プロ
ット分析の結果を示す。ウェスタン・プロット分析は、
マウス抗−β−ガラクトシダーゼ抗体（パネルＡ）また
はヤギ抗マウスＨＰＯＤ接合体に接合する貯蔵されたモ
ノクローナル抗体類７０、７Ｄ４および２０Ｃ６（パネ
ルＢ）を使用して行なった。両方のパネル中のレーンは
、（１）β−ガラクトシダーゼ、（ｍ）表示された分子
量のマーカー類、その大きさはパネルＡの左側にｋｄで
示されている。（２）全ての細胞ベレット蛋白質、（３
）超音波処理により該細胞ベレットから遊離した蛋白質
および（４）超音波処理後の該ベレットからのグアニジ
ン−ＦＩＣＩで可溶化した蛋白質を示す。
第１１図は、ファージλ、−４から、７１＜ｂのＥｃｏ
ＲＩＤＮ＾挿入を含み６５ｋｄの蛋白質発現プラスミド
であるプラスミドｐＥＶ／２−４の模式的表示を示す。
挿入中の各種の制限酵素部位の位置が、ＰｓｔＩ（Ｐ、
　ｂｐ５３および７７６に於ける）　、Ｘｐｎｌ（Ｘ、
　ｂｐ２０２に於ける）　、ＢｓｔＮＩ（Ｂ、　ｂｐ５
８４．１３０３および１４１２に於ける）および５ａｕ
３Ａ（Ｓ、　ｂｐｌｏ１７および１４３９に於ける）を
含めＥｃｏＲＩ部位に関して示されている。
第１２図は、ｐＥＶ−ｖｒｆ３のＥｃｏＲＩ　と５ａｉ
ｌとの間に挿入された表示された部位を伴うポリリンカ
ーを含むｐＥＶ３−５ＥＱの地図を示す。ダッシュ矢印
で示された合成オリゴヌクレオチドＣＧＧＴＣＧＡＣＴ
ＣＧＡＧＣＣＡが、鎖停止ＤＮＡ配列分析のためのブラ
イマーとして使用された。
第１３図は、モノクローナル抗体６Ａ５で認識される蛋
白質をコードするｃＤＮＡクローンの制限地図を示す。
、１ｋｂ　ｃＤＮＡのＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ　Ｄ
ＮＡ配列分析のために使用される制限エンドヌクレアー
ゼ部位が示されている。括弧内のＥｃｏＲ１部位は、０
．９ｋｂｃＤＮＡの末端の位置である。地図上の棒は、
充填された潜在的シグナルペプチドを伴う、ＤＮＡから
断定された開始読みわくを示す。地図の下の線は、鎖停
止配列分析に使用されたｏｘｏＩＩＩ削除を示す。
第１４図は、モノクローナル抗体６Ａ５によって認識さ
れる２０ｋｂ蛋白質をコードする１、　１　ｋｂ　ｃＤ
ＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。
第１５図は、第１４図のヌクレオチド配列から調製した
蛋白質のアミノ酸配列を示す。
第１６図は、モノクローナル抗体７０、７Ｄ４および２
０Ｃ６によって認識される５　５　ｋ　ｄ蛋白質をコー
ドする１、　７　ｋｂ　ｃＤＮ八分へのヌクレオチド配
列を示す。
第１７図は、第１６図のヌクレオチド配列から断定され
、発現された６５ｋｂ蛋白質から調製されたトリプシン
の蛋白質類の配列分析により確認された蛋白質のアミノ
酸配列を示す。該蛋白質類のいくつかに対応する全体に
わたるアミノ酸配列中の領域が、下線で示されている。
該蛋白質類の測定された配列は、上線付けされている。
第１８図は、モノクローナル抗体８Ａ２によって認識さ
れる２８ｋｄの蛋白質をコードする１、　１　ｋｄ　ｃ
ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す。
第１９図は、第１８図のヌクレオチド配列から堆定され
る蛋白質のアミノ酸配列を示す。
第２０図は、モノクローナル抗体７Ｂ２によって認識さ
れる蛋白質をコードする３、　２　ｋｂ　ｃＤＮＡ分子
のヌクレオチド配列を示す。
第２１図は、第２０図のヌクレオチド配列から推定され
る蛋白質のアミノ酸配列を示す。
第２２図は、免疫アフィニティー精製された６５ｋｂの
蛋白質のＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を
示す。ゲルは、コマシーブルー染色およびウェスタン・
プロット分析によって可視化された。
レーン２と４および３と５は、２種の調製物からの精製
された蛋白質を含む。レーン１と６は、図の左右に示さ
れた分子量を有する分子量マーカー蛋白質類の混合物を
含む。
第２３図は、カラム保持時間を関数とする２１５ｍμに
於ける吸光度を示す。６５ｋｂの蛋白質のβ−メルカプ
トエタノール還元（パネルＡ）および未還元（パネルＢ
））リプシン消化のＨＰＬＣ溶出曲線を示す。
第２４図は、ワクチンウィルスへのコクシジア抗体類を
コードする遺伝子の組換えに使用される基本ベクターの
４種の要素の制限地図を示す。これらの要素は、７．５
にプロモーター要素（ａおよびｂ、左）、ＴＫ遺伝子座
（ａおよびす、右）、プラスミドｐＵｃ８　　（ｃ）　
（Ｄ一部およびＭ１３ｔｇ１３１からのポリクローン部
位を含む。ウィルス７．５におよびＴにプロモーターの
転写の方向は、左から右、すなわち、ポリリンカー中、
ＢｇｌＩＩからＥｃｏＲＩ制限部位である。
第２５図は、　（Ａ）第２４図のベクターのポリリンカ
ー要素中、ＡＵＧ翻訳部位コドンを含む構築物から発現
させ、（Ｂ）マラリアの１９０ｋｄリ一ダー切片（始め
の３４個のアミノ酸）および第２４図（次の１３個のア
ミノ酸）のクローンベクターのポリリンカーに融合させ
たモノクローナル抗体８Ａ２によって認識されたアイメ
リア抗原のＮ−末端のアミノ酸配列を示す。蛋白質の形
質転換工程中、Ｎ−末端に於ける始めの１９個のアミノ
酸を、クローンによって示された位置に於いて開裂させ
ても良い。
図中、標準の単一文字の略号は、ヌクレオチド類を示す
ために使用され、更に標準の１または３つの文字の略号
は、アミノ酸類を示すために使用される。それらの略号
の意味は、例えばＬｅｈｎｉｇｅｒ。
Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、１９８９　Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ＋　
Ｉｎｃ、　１　：’−ニーヨーク、ｐｐ、９６，７９８
等の標準的生化学の教科書中に見出すことができる。
以下に使用されるように、次の用語は、次の意味を持つ
ものとする： “２０ｋｄ蛋白質”は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動において約２０キロダルトンの見かけの分子量
を有する組換えまたは合成蛋白質であって、モノクロー
ナル抗体６Ａ５に特異的に結合するものを意味する。こ
の抗体は、ＳＤＳゲルにおいて約２８キロダルトンの見
かけの分子量を有するアイメリア表面抗原（アイメリア
蛋白質類の全抽出物由来）とも特異的に反応する。この
抗原は、スポロゾイト発生段階中に存在する。この蛋白
質をコードするｃＤＮ八分子分子クレオチド配列および
それから推定されるアミノ酸配列は、それぞれ第１４図
および第１５図に示されている。
“６５ｋｄ蛋白質”は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動において約６５キロダルトンの見かけの分子量
を有する組換えまたは合成蛋白質であって、モノクロー
ナル抗体７０１　、７０４および２００６に特異的に結
合するものを意味する。これらの抗体は、ＳＯＳゲルに
おいて約１２０キロダルトンの見かけの分子量を有する
アイメリア抽出物由来の表面抗原とも特異的に反応する
。この抗原は、スポロゾイト、ジゾントおよびメロゾイ
ト発生段階において存在する。この蛋白質をコードする
ｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列およびそれから推定さ
れるアミノ酸配列は、それぞれ第１６図および第１７図
に示されている。
“２８ｋｄ蛋白質”は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動において約２８キロダルトンの見かけの分子量
を有する組換えまたは合成蛋白質であって、モノクロー
ナル抗体８Ａ２に特異的に結合するものを意味する。こ
の抗体は、ＳＤＳゲルにおいて約３７キロダルトンの見
かけの分子量を有するアイメリア表面抗原とも特異的に
反応する。この蛋白質をコードするｃＤＮＡ分子のヌク
レオチド配列およびそれから推定されるアミノ酸配列は
、それぞれ第１８図および第１９図に示されている。
“４５ｋｄ蛋白質”は、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動において約４５キロダルトンの見かけの分子量
を有する組換えまたは合成蛋白質であって、モノクロー
ナル抗体７Ｂ２に特異的に結合するものを意味する。こ
の抗体は、ＳＯＳゲルにおいて約２００キロダルトン以
上の見かけの分子量を有するアイメリア表面抗原とも特
異的に反応する。この抗体は、スポロゾイト発生段階に
おいて存在する。
この蛋白質をコードするｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配
列およびそれから推定されるアミノ酸配列は、それぞれ
第２０図および第２１図に示されている。
“アイメリア表面抗原の免疫反応性および／または抗原
性の１種もしくはそれ以上の決定因子を有する蛍白質”
なる用語は、免疫学的に適合する宿主生物中に免疫応答
を誘導することが可能であるか、および／または相補的
な抗体に対して特異的に結合することが可能な１以上の
領域もしくはエピトープを有する蛋白質を意味する。
遺伝子コードの縮重性のために、第１５図、第１７図、
第１９図および第２１図に示されるアミノ酸配列をコー
ドし得る多（の可能なヌクレオチド配列（機能的な同等
物）があるものと理解されるであろう。また、ベクター
中に挿入された該発明のＤＮＡ配列および断片のヌクレ
オチド配列は、そのような配列および断片を含む該組換
えベクターが、アイメリア表面抗原の免疫反応性および
／または抗原性の１以上の決定因子を有する蛋白質また
は断片の適当な宿主生物中における産生を支配すること
ができるかぎりにおいて実際の構造遺伝子の部分ではな
いヌクレオチドも包含することができる。
更には、生物学的および免疫学的活性を本質的に変える
ことがない蛋白質中のアミノ酸の置換が知られており、
そして例えばＮｅｕｒａｔ、ｈ　らのＴｈｅＰｒｏｔｅ
ｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｅｒｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ（１９７９）、特に第１４頁の第６図中に記載され
ている。最も頻繁に観察されるアミノ酸の置換は、Ａｌ
ａ／ｓｅｒ、　Ｖａｌ／ｌｉｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ　５Ｔ
ｈｒ／Ｓｅｒ　、　Ａｌａ／Ｇｌｙ　、　Ｖ１ａ／Ｔｈ
ｒ　、　Ｓｅｒ／＾ｓｎ　％　Ａｌａ／Ｖａｔ　、　Ｓ
ｅｒ／Ｇｌｙ　５Ｔｙｒ／Ｐｌ］ｅ　、　Ａｌａ／Ｐｒ
ｏ、。
Ｌｙｓ／Ａｒｇ　、　　Ａｓｐ／’Ａｓｎ、　Ｌｅｕ／
Ｉｌｅ　、　Ｌｅｕ／Ｖａｌ　、、Ａｌａ／Ｇｌｕ　、
＾ｓｐ／Ｇｌｙおよびその逆である。
この発明の例証的態様のこのような機能的に同等なヌク
レオチド配列変異体およびアミノ酸置換体は、得られる
該蛋白質が、アイメリア表面抗原の免疫反応性および／
または抗原性の１種以上の決定因子を保有している限り
、本発明の範囲内になる。
“断片”なる用語は、本発明のｃＤＮＡまたは、蛋白質
のうちの一つの部分配列からなるＤＮＡ配列または蛋白
質を意味する。このような断片は、ＤＮＡに対しては制
限エンドヌクレアーゼを、また蛋白質に対してはプロテ
アーゼを用いてより大きい分子を酵素的に開裂すること
により製造することができる。しかしながら、本発明の
断片は、酵素的開裂の何れかの形態の生成物に限定され
るものではな（、何れの酵素的開裂点にも対応しない末
端の部分配列を包含する。このような断片は、例えば、
ここに与えられている配列を用いて化学合成により作る
ことができる。ＤＮＡ断片は、単離されたメツセンジャ
ーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）から不完全相補的ＤＮＡ　（ｃ
ＤＮＡ）合成により製造することができる。蛋白質断片
は、該蛋白質断片をコードするＤＮＡを発現させること
によっても製造することができる。
このような蛋白質断片は、それらが免疫反応性および／
または抗原性の決定因子を構成するために充分な数のア
ミノ酸残基を有する場合には、本発明において有用であ
る。−船釣には、約７または８残基が必要である。以下
に説明するように、それらを免疫反応性とするには、そ
れらのような断片を免疫原性担体分子と結合させる必要
があるであろう。
本発明の該蛋白質類は、例えば組換えＤＮＡ技術、化学
合成またはアイメリア調製物からの単離などのこの分野
で知られた多くの方法により製造することができる。
本発明の該蛋白質を製造するために必要なりＮＡは、第
１４図、第１６図、第１８図および第２０図に与えられ
たヌクレオチド配列の情報を使用して、化学的に合成す
ることができる。このような化学合成は、公知のどのよ
うな方法によっても行なうことができるが、Ｍａｔｔｅ
ｕｃｉからのホスホルアミダイト固体支持体法（Ｊ、Ａ
ａ＋、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１ｊｌｄ：３１８５（１９
８１）　：１が好適である。
別法として、ｃＤＮＡは、アイメリアｍＲＮＡから作る
ことができる。メンセンジャーＲＮＡは、アイメリアの
胞子を形成する卵原細胞またはメロゾイトから標準的な
方法により単離することができる。次いでこれらのｍＲ
ＮＡ試料は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの前出文献のようにし
て二重鎖ｃＤＮ＾を製造するために使用することができ
る。このｃＤＮＡは、Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換に使用で
きる適当なりローニング用ベクター中に挿入され、ｃＤ
ＮＡライブラリーが調製される。
次いで、８８　ｃＤＮＡライブラリーは、本発明のクロ
ーン化遺伝子またはその断片をプローブとして選別され
得る。このような遺伝子または断片は、例えば１種類が
α位に３２ｐを含む４種のデオキシリボヌクレオチド類
の存在下でＰｏ１Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼを使用するニ
ック−トランスレーション（Ｍａｎｆａｔｉｓらの前出
文献）により、プローブとして使用するために放射能標
識され得る。
下記の実施例においては、ｍＲＮ＾の供給源としてＥｉ
ｍｅｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌを用いたが、この種由来のク
ローン化遺伝子は、種々の種間のＤＮ＾配列の同一性に
よって、アイメリアの他の種由来の遺伝子を単離するた
めのプローブとして使用す・ることができる。
−旦、同定され、そして単離されてのち、本発明の該ア
イメリア遺伝子は、挿入される遺伝子配列の転写および
翻訳に必要な要素を含んだ適当な発現ベヒクル中に挿入
される。有用なりローン化ベヒクルは、染色体性、非染
色体性および合成のＤＮＡ配列、例えば、種々の細菌性
プラスミド類、ファージＤＮＡ　、ファージＤＮＡもし
くは他の発現制御配列を用いるべく修飾されたプラスミ
ドのようなプラスミドとファージＤＮＡとの組合せ、ま
たはイーストのプラスミドの分節からなっていてもよい
、使用可能であり、かつ当業者に知られた特定のクロー
ン化ベヒクルは、限定されるものではないが、ｐＥＶ−
ｖｒｆプラスミド類（ｐＥＶ−ｖｒｆ　１、−２および
−３）　　；ＳＶ４０：アデノウイルス；酵母；ラムダ
−ｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ　；シャロン４Ａおよび２８
；ラムダ−ｇｔ−１１−ラムダＢ　　；　ｐＵｃ８，９
．１８および１９．　ｐＢＲ３１３，３２２および３２
５等のＭ１３誘導ベクター類；　ｐＡＣ１０５；　　ｐ
ＶＡ５１；　　ｐＡｃＹ１７７；　ｐＫＨ４７；　　ｐ
ＡｃＹｃ１８４；　　ｐＵＢｌｌｏ；ｐＭＢ９；　ｃｏ
ｌＥｌ；　ｐｓｃｌｏｌ；　Ｐｍ１２１；　Ｒ５Ｆ２１
２４：　ｐｃＲｌまたはＲＰ４を包含し得る。
クローン化ベクターへのアイメリア遺伝子の挿入は、遺
伝子類および所望のクローン化ベヒクルの両者が同じ制
限酵素または酵素類により切断されたものであると、こ
れにより相補的なりＮＡ末端が形成されるために、容易
に行われる。これを行えない場合には、−本鎖ＤＮＡを
消化して平滑末端を生成させることによるか、あるいは
適当なりＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖末端を充足し
て同様な結果を達成することにより、切断末端を修飾す
る必要があるであろう。このようにして、平滑末端の連
結が、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ等の酵素を用いて行なわれ
るであろう。別法として、所望のいかなる部位も該ＤＮ
Ａ末端にヌクレオチド配列（リンカ−類）を連結するこ
とにより生成させることができる。このようなリンカ−
類は、制限部位認識配列をコードする特定のオリゴヌク
レオチド配列を含んでもよい。開裂されたベクターおよ
びアイメリア遺伝子は、Ｍｏｒｒｏｗ　（Ｍｅｔｈｏｄ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８：３　（１９７９
）　）により記述されたように、ホモポリマー様テーリ
ング（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ）
により修飾されてもよい。
本発明において使用されうる多くのクローン化ベヒクル
は、ｐＢＲ３２２中のアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性、ｐＵｃ　ｓ中のアンピシリン耐性およびβ−
ガラクトシダーゼ活性、ｐＥＶ−ｖｒｆ２中のアンピシ
リン耐性のように所望の形質転換体を選択するために使
用されうる１種以上のマーカー活性を含んでいる。この
ようなベクターが挿入された宿主細胞の選択は、該宿主
細胞が該ベクター類による寄与である活性を別な形で欠
落している場合に非常に単純である。
クローン化ベヒクル中の選択された部位に挿入された該
アイメリア遺伝子のヌクレオチド配列は、実際の構造遺
伝子の部分ではないヌクレオチドを含んでもよいものと
理解されるべきである。別法としては、該遺伝子は、完
全な天然型遺伝子の部分のみを含んでもよい。必要とさ
れることの全ては、クローン化ベヒクル中に挿入された
遺伝子断片が、適当な宿主生物中で、アイメリア表面抗
原の少なくとも１種の免疫反応性および／または抗原性
の決定因子を有するポリペプチドまたは蛋白質の産生を
支配し得ることである。
適当な宿主生物の選択は、この分野で知られた多くの因
子に影響される。これらの因子は、例えば、選択したベ
クターとの適合性、該融合プラスミドによりコードされ
る蛋白質類の毒性、所望の蛋白質の回収の容易性、発現
特性、生物学的安全性およびコストを含む。これらの因
子のつり合いは見出だされねばならず、またすべての宿
主が特定の組換えＤＮＡ分子の発現に対して同等に有効
であるとは限らないと理解されるべきである。
本発明に使用され得る好適な宿主単細胞生物は、限定さ
れるものではないが、植物、哺乳類、または酵母細胞、
ならびにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＢａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｄｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅ
ａｒｏｔ、ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＡｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ等の細菌を含む。特に好適には、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ株−Ｃ１０６１であって、これは
、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　らの（Ｊ、Ｍｏ、Ｂｉｏｌ、１
３８：１７９（１９８０）　］により記述されている。
この株、またはプラスミドｐＲＫ２４８ｃｌｔｓを含む
他のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株が使用できる。他のＥ、
ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株において使用するプラスミドｐＩ
ｌに２４８ｃＩｔｓは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ　Ｉ　ｌｅｃ　ｔ　ｉｏｎから入手
可能であって、受託番号ＡＴＣＣ３３７６６を有してい
る。Ｅ、ｃｏｌｉ株？ＩＣ１０６１もまた寄託されてお
り、受託番号ＡＴＣＣ５３３３８を有している。
組換えクローン化ベクターの宿主細胞中への移動は、種
々の方法により行なうことができる。選択した特定のベ
クター／宿主系従って、このような移動は、形質転換、
トランスダクションまたはトランスフェクションにより
行なうことができる。
−旦このような修飾された宿主細胞が生成された後は、
該細胞が培養され、そして蛋白質生成物が培養物から単
離される。
本発明のアイメリア蛋白質を産生ずるクローンは、適当
に標識された該蛋白質に特異的な抗体類により同定され
得る。モノクローナル抗体類が好適であるが、これらは
標準的な方法を用いて以下のように調製され得る。
Ｅｉｍｅｒｉａ　Ｔｅｎｅｌｌａ由来の抗原性蛋白質は
、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ等の動
物を免疫化し、ミエローマ細胞と融合するための抗体産
生体細胞を得るために使用される。
抗体産生能を有する体細胞、特にβ細胞類は、ミエロー
マ細胞と融合するために適している。これらの体細胞は
、誘発された動物のリンパ節、ヒ臓および末梢血から誘
導されてもよい。本発明の好ましい実施態様においては
、マウスミエローマ株と比較的高い割合で安定した融合
物を生成することもその一部の理由として、マウスヒ臓
細胞が使用される。しかしながら、これに代えて、ラッ
ト、ウサギ、カエルまたは他の細胞を用いることもでき
る。
特殊化したミエローマ細胞株が、ハイブリドーマ生成融
合処理に使用するためにリンパ球腫瘍から開発されてい
る（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのＥｕｒ。
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１　（１９７６）　；
ＳｈｌｍａｎらのＮａｔｕｒｅ　３：２６９　（１９７
８）　；ＶｏｌにらのＪ、Ｖｉｒｏｌ、Ｊ４：２２０（
１９８２）　）　、これらの細胞株は、少なくとも３つ
の理由のために開発されている。第１には、非融合であ
ってかつ類似している無限に自己−繁殖するミエローマ
細胞の中からの融合ハイブリドーマの選択を容易にする
ことである。通常、これは、ハイブリドーマの生育を支
えるある種の選択された培地中において、生育が不可能
となるような酵素欠損を有したミエローマ類を用いるこ
とにより行なわれる。第２の理由は、自体の抗体類を産
生ずるリンパ球腫瘍細胞の本来の能力に由来する。モノ
クローナル技術を使用する目的は、所望の単一の抗体を
ハイブリドーマの体細胞成分の遺伝子的制御下で産生ず
る無限の寿命を有した融合ハイブリドーマ細胞株を得る
ことにある。該ハイブリドーマ細胞による腫瘍細胞に対
する抗体の産生を除くため、軽または重免疫グロブリン
鎖を産生できないが、あるいは抗体分泌機構を欠失した
ミエローマ細胞株が使用される。これらの細胞株を選択
する第３の理由は、融合に対してのそれらの適合性およ
び効率である。
例えばＰ３／Ｘ６３−Ａｇ３、Ｐ３／ＮＳＩ／ｌ−Ａｇ
　４−１　、ＳＰ２１０−Ａｇ−１４および５１９４１
５．ＸＸＯ，ＢＵ、　１を含？ｌ）り多クツミエローマ
細胞株が、融合細胞ハイブリッドの生成のために使用さ
れることができる。該Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ３およびＰ３
／ＮＳＩ／１−へｇ４−１細胞株は、Ｋｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｅｕｒ、Ｊ、ＩｍＩＩＩｕｎｏ
ｌ、　６　：５１１（１９７６）　）により記述されて
いる。Ｓｈｕｌｍａｎ　らは、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４ミ
工ローマ株を開発した（Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９
（１９７Ｂ））。
該５１９４１５．ＸＸＯ，ＢＵ、　１株は、Ｔｒｏｗｂ
ｒｉｄｇｅにより報告されている（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ
、、１４Ｊｌ：３１３（１９７９））　、本発明の実施
例においては、該ＰＡＩ−０マウス細胞株（Ｐ３／Ｘ６
３−Ａｇ３の非−１ｇ−産生サブクローン）が使用され
た。
抗体産生ヒ臓またはリンパ節細胞およびミエローマ細胞
の融合物を創生するための方法は、通常、細胞膜の融合
を促進する試薬または試薬類（化学的、ウィルス的また
は電気的）の存在下において、体細胞とミエローマ細胞
とをそれぞれ１０：１の割合（但し、この割合は、約２
０：１から約１＝１まで変えてもよい）で混合すること
を含む、該融合操作において使用される体細胞およびミ
エローマ細胞の供給源としては、同じ種の動物が好まし
い。
融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（
Ｎｕｔｅｒｅ　２５６：４９５（１９７５）およびＥｕ
ｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６　：５１１（１９７６）
　）、Ｇｅｆ　ｔｅｒら（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　
Ｇｅｎｅｔ、　３　：２３Ｈ１９７？）　）およびＶｏ
ｌｋら（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４２：２２０（１９８２）　
）により記述されている。これらの研究者らにより使用
された融合−促進試薬は、センダイウィルスおよびポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）であった。本発明の実施
例のための融合操作では、ＰＥＧを用いている。
融合操作は、生存可能なハイブリッドを非常に低い頻度
で生ずるため（例えばヒ臓を体細胞の供給源とした場合
、わずか１つのハイブリッドがおよそｌＸｌ０’のヒ臓
細胞毎に得られる）、融合細胞ハイブリッドを残る非融
合細胞、特に非融合ミエローマ細胞から選択する方法を
持っていることは基本的なことである。所望の抗体−産
生ハイブリドーマを他に得られた融合細胞ハイブリッド
の中から検出する方法もまた必要である。
一般的には、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリ
ドーマの生育を助けるが、通常、無限に分裂を続けるミ
エローマ細胞の生育を妨げる培地中にて細胞を培養する
ことにより行なわれる。
（融合において用いた体細胞は、インビトロ培養におい
ては長期間の生存を維持しないので問題を有さない。）
本発明の実施例においては、ヒボキサンチン・ホスホリ
ボシル・トランスフェラーゼを欠損したミエローマ細胞
（ＨＰＲＴ−ネガティブ）を使用した。これらの細胞に
対しての選択は、ヒボキサンチン／アミノプテリン／チ
ミジン（ＩＩＡＴ）培地中で行なわれ、この培地におい
ては、融合細胞ハイブリッドは、ヒ臓細胞のＨＰＲＴ−
ポジティブ遺伝子型のために生存する。別の遺伝子的欠
陥（薬物感受性等）を有したミエローマ細胞は、遺伝子
的に適合するハイブリッドの生育を支持する培地中にお
いて選択可能であり、これらの使用も可能である。
融合細胞ハイブリッドの選択的培養には、数週間が必要
である。この期間の初期には、所望の抗体を産生ずるハ
イブリッド類を同定することが必要であり、これによっ
て、それらは引き続いてクローン化され、そして繁殖さ
れる。一般的には、得られたハイブリッドの約１０％が
所望の抗体を産生ずるが、これが１から３０％までの範
囲にあることは異常なことではない。抗体−産生ハイブ
リッドの検出は、文献に記述されている酵素−結合免疫
試験および放射免疫試験〔例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（編
集者）のＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏ＋ａａｓ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉ
ｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａ
ｌｙｓｅｓ：３７６−３８４頁、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）参照］を含む数種
の標準的試験方法のいずれか１つにより行なえる。数種
の検出方法が、本発明の実施例において用いられた。
一旦、所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の
抗体−産生細胞株にクローン化された後には、それぞれ
の細胞株が、２種の標準的な方法のいずれかによって繁
殖され得る。該ハイブリドーマ細胞の懸濁液は、組織適
合性動物中に注射され得る。該注射された動物は、該融
合細胞ハイブリッドにより産生される特定のモノクロー
ナル抗体を分泌する１１１１を発生する。血清または腹
水等の該動物の体液は、高い濃度でモノクローナル抗体
を与えるため採取され得る。別法として、個々の細胞株
は、研究室用培養器中でインビトロにおいて繁殖され得
る。高濃度の単一の特定モノクローナル抗体を含む培地
は、傾瀉、口過または遠心分離により採集され得る。
Ｅ、ｃｏｌｉ中で産生されるのと同様に、該アイメリア
蛋白質は、細胞質または包接体中に残留する。
該蛋白質を遊離するために、該外部膜を破壊することが
必要である。これは、好ましくは超音波処理またはフレ
ンチプレッシャーセルもしくはＧａｕｆｉｎホモジナイ
ザー等の機械的破砕手段により行なわれる。
細胞破壊は、化学的または酵素的手段によっても行なえ
る。細胞膜の完全性のためには普通、２価の陽イオンが
要求されるので、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ等の適当なキ
レ−ト化剤による処理は、細胞からの該蛋白質の漏出を
促進するために充分に破壊的である。同様に、リゾチー
ム等の酵素類が同様な結果を達成するために使用されて
いる。その酵素は、該細胞壁のペプチドグルカン骨格を
加水分解する。
浸透圧的衝撃の適用もまた使用され得る。これは、概略
的には第１に該細胞を高張溶液中に置き、それらの水を
失なわせて収縮せしめることにより行ない得る。引続き
、低張の“衝撃”溶液中に置くことによって、所望の蛋
白質の排除を伴う該細胞中への水の急速な流入が導かれ
る。
−旦、該細胞から遊離された後、該アイメリア蛋白質は
、硫酸ナトリウムまたはアンモニウム等の塩による沈澱
、限外口過またはこの分野でよく知られた他の方法によ
って濃縮され得る。更なる精製は、限定されるものでは
ないが、ゲル口過、イオン交換クロマトグラフィー、調
製用ディスク−ゲルまたはカーテン電気泳動、等霊的フ
ォーカシング、低温度有機溶媒分画、または逆流分配を
含む通常の蛋白質精製技術により行ない得る。しかしな
がら、精製は、後述するように免疫アフィニティークロ
マトグラフィーにより好適に実施される。
本発明の該蛋白質またはその断片は、全固相合成、部分
固相合成、断片縮合または古典的液相合成等の好適な方
法により、化学的に合成することもできる。Ｍｅｒｒｉ
ｒｉｅｌｄ　［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５：２
１４９（１９６３）により記述されている固相合成法が
好ましい。
このような合成は、アルファーアミノ末端が保護された
アミノ酸を用いて行なわれる。不安定な側鎖を有する三
官能性アミノ酸も、ペプチドの組み上げ時にその部位に
おいて化学反応が起こることを避けるような適当な保護
基により保護される。
該アルファーアミノ保護基は、該アミン末端において続
く反応が行なわれるように選択的に除去される。該アル
ファーアミノ保護基の脱離条件は、側鎖保護基の脱保護
を引き起こさない。
該アルファーアミノ保護基は、段階的ペプチド合成の分
野で有用な公知のものである。アクリル型保護基（例え
ばホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳香
族性ウレタン型保護基（例えばベンジルオキシカルボニ
ル（Ｃｂｚ）および置換ベンジルオキシカルボニル）、
脂肪族性ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル（Ｂｏｃ）　、イソプロピルオキシカルボニル
、シクロへキシルオキシカルボニル）ならびにアルキル
型保護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が
含まれる。好適な保護基は、Ｂｏｃである。Ｔｙｒのた
めの側鎖保護基は、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒ　ｔ
−ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ　、４−Ｂｒ　
−Ｃｂｚおよび２．６−ジクロロベンジルを含む。
Ｔｙｒのための好ましい側鎖保護基は、２．６−ジクロ
ロベンジルである。Ａｓｐのための側鎖保護基は、ベン
ジル、２．６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよ
びシクロヘキシルを含む。Ａｓｐのための好ましい側鎖
保護基は、シクロヘキシルである。
ＴｈｒおよびＳｅｒのための側鎖保護基は、アセチル、
ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジ
ル、２．６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚを含む。Ｔ
ｈｒおよびＳｅｒのための好ましい側鎖保護基は、ベン
ジルである。Ａｇｒのための側鎖保護基は、ニトロ、Ｔ
ｏｓ　５Ｃｂｚ　、アダマンチルオキシカルボニルまた
はＢｏｃを含む。Ａｒｇのための好ましい保護基は、Ｔ
ｏｓである。Ｌｙｓの側鎖アミノ基は、Ｃｂｚ　、　２
−ＣＩＣｂｚ　、　ＴｏｓまたはＢｏｃにより保護され
てよい。２−Ｃ１−Ｃｂｚが、Ｌｙｓの好ましい保護基
である。側鎖保護基の選択は、以下に基づく：側鎖保護
基は、カップリング中には元のまま残り、かつ、アミノ
末端保護基の脱保護の間およびカップリング条件におい
て分離しない。該側鎖保護基は、最終ペプチドの合成の
完成にあたって、目的ペプチドを変化させない条件を使
用して脱離可能でなければならない。
固和合或は、通常、アルファーアミノ保護（側鎖保護）
アミノ酸を適当な固体支持体に結合することにより、カ
ルボキシ末端から行なわれる。クロロメチル化またはヒ
ドロキシメチル化樹脂に対して固定がなされた場合は、
エステル結合が形成され、得られる目的ペプチドは、Ｃ
−末端に遊離のカルボキシル基を有するであろう。別法
として、ベンズヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンズ
ヒドリルアミン樹脂が使用された場合、アミド結合が形
成され、得られる目的ペプチドは、Ｃ−末端にカルボキ
シアミド基を有するであろう。これらの樹脂は、商業的
に入手可能であり、それらの８周製は、Ｓｔｅｗａｒｔ
　らの“５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ”　（第２版、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、　１９８
４）により記述されている。
側鎖においてＴｏｓにより保護され、アルファーアミノ
官能基においてＢｏｃにより保護されたＣ末端アミノ酸
Ａｒｇは、ベンズヒドリルアミン樹脂に対してジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ、Ｎ−ジイソプ
ロピルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾール
を含む種々の活性化剤を用いて連結される。樹脂支持体
への固定に続き、アルファーアミノ保護基が、トリフル
オロ酢酸（ＴＦへ）またはジオキサン中のＨＣＩを用い
て０°Ｃと２５°Ｃとの間の温度で除去される。ジメチ
ルスルフィドがメチオニン（Ｍｅｔ）の導入後に起こり
得るＳ−アルキル化を抑制するために、ＴＦＡに添加さ
れる。アルファーアミノ保護基の除去の後に、残りの保
護されたアミノ酸が所望のペプチド配列が得られるよう
に必要な順序をもって段階的に結合される。
ＤＤＣ，Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド、ベン
ゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチル
アミノ）−ホスホニウムへフサフルオロホスフェート　
（ＢＯＰ）およびＤＣＣ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル（ＨＯＢｔ）を含む種々の活性化剤が結合反応のため
に使用され得る。各々の保護アミノ酸が過剰量（＞２．
５当量）をもって使用され、そして通常は該結合反応は
、ＤＭＦ　、　ＣＨｚＣｌｇまたはそれらの混合物中で
行なわれる。該結合反応７の完了の程度は、Ｋａｉｓｅ
ｒらのＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　３４：５９５　
（１９７９）により記述されているようにニンヒドリン
反応によって各段階で監視される。不完全な結合が検出
された場合には、該結合反応は繰り返される。該結合反
応は、Ｖｅｇａ２５０　、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓ
ｙｓｔｅｍｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒまたは他の商業
的に入手可能な装置において自動的に行なうことができ
る。
目的ペプチドあ全体の組立て後に、該ペプチド−樹脂は
、ＴＦＡ／ジチオエタンを用いて脱保護され、次いで該
ペプチドを樹脂から開裂させると共にすべての側鎖保護
基を脱離させる液体ＨＦ等の試薬により１−２時間、０
°Ｃにて開裂される。
固体支持体上での側鎖と側鎖との間の閉環は、酸性アミ
ノ酸類（例えば、Ａｓｐ）および塩基性アミノ酸類（例
えば、Ｌｙｓ）の側鎖官能基類の選択的な開裂を可能と
する直交保護機構（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｐｒ。
ｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｃｈｅｍｅ）を必要とする。この目
的のためには、Ａｓｐの側鎖に対しての９−フルオルエ
ニルメチル（ＯＦｍ）保護、および、Ｌｙｓの側鎖に対
しての９−フルオルエニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏ
ｃ）保護基が使用できる。これらの場合においては、Ｂ
ｏｃ−保護ペプチド−樹脂の側鎖保護基は、ＤＭＦ中に
おいてピペリジンを用いて選択的に除去される。
固体支持体上での環化は、ＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔま
たはＢＯＰを含む種々の活性化剤を使用して達成される
。
）ＩＰ反応は、上述したように閉環したペプチド−樹脂
上で行なわれる。
合成蛋白質の精製は、組換え的に製造された蛋白質につ
いて上述したのと同様にして行なわれる。
アイメリア蛋白質類は、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａまたは他
のアイメリア種由来の膜蛋白質の抽出物から免疫沈澱ま
たは免疫アフィニティークロマトグラフィーによって回
収されることも可能である。既に記したように、このよ
うな方法では、完全な天然型蛋白質の製造が可能である
。ある場合には、これらの蛋白質は、組換えＤＮＡ法に
より製造された蛋白質より大きい。この目的のためのモ
ノクローナル抗体類は、上述したように合成または天然
アイメリア蛋白質類を抗原として使用して製造すること
ができる。
必要な免疫反応性および／または抗原性の決定因子を有
する他の有用な蛋白質類は、本発明の蛋白質類上の活性
決定因子または決定因子類に対して抗−イディオタイプ
的な抗体類またはその断片である。このような抗−イデ
ィオタイプ的抗体類は、本発明の蛋白質上の決定因子類
に対して特異的な他の抗体類に対して生じされ得る　（
すなわち、該抗−イディオタイプ的抗体類は、抗−抗体
である）。好ましく、はモノクローナル抗−イディオタ
イプ的抗体類が使用される。このような抗体類は、該ア
イメリア蛋白質類自体が使用され得るのと同様な方法に
おいて、ワクチンとして投与され得る。
本発明の１種またはそれ以上の該アイメリア蛋白質類お
よび抗−イディオタイプ的抗体類は、該蛋白質類および
生理学的に許容される担体を含有するワクチン類として
裂開化され得る。好適な担体は、例えば０．０１から０
．１？Ｉの中性ｐｌ＋のリン酸緩衝剤または生理的食塩
溶液を含む。
コクジウム症に対する増強された免疫は、２種類の方法
の１つにより作られ得る。第１には、アジュバントまた
は免疫増強剤がワクチンに対して添加され得る。第２に
は、本発明の蛋白質類は、免疫されるべき動物に対して
交差結合複合体として、または担体分子に結合されたよ
り大きい形態をもって提示され得る。
動物のワクチン接種のための好適なアジュバントは、限
定されるものではないが、アジュバント６５（ビーナツ
ツ油、マンニドモノオレートおよびアルミニウムモノス
テアレートを含む）　；　水酸化アルミニウム、リン酸
アルミニウムおよびミョウバン等の鉱物ゲル；ヘキサデ
シルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメ
チルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、Ｎ、Ｎ−
ジオクタデシル−Ｎ’、　Ｎ’−ビス　（２−ヒドロキ
シメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグ
リセロールおよびブロン酸ポリオール等の界面活性剤；
ビラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸
およびカルボボール等の多価陰イオン類；ムラミルジペ
プチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン等のペプチ
ド類；ならびに油懸濁物を含む。
該蛋白質類は、リボゾームまたは他の微少担体への取込
後に投与することもできる。
リボゾームまたは他の微少担体への取込は、これによっ
てワクチン類の放出が長期間に亘って維持され得る手段
を提供する。Ａｌｚａポンプ等のポンプは、同様の目的
のために使用され得る。
本発明の蛋白質、特により小さい断片の免疫原性は、交
差結合、または免疫原性担体分子（すなわち、本発明の
蛋白質または蛋白質断片を共有的に結合することができ
、独立して宿主動物中に免疫応答を誘発する性質を有す
る巨大分子）に対して結合することにより増強され得る
。小さい蛋白質断片は、しばしばハプテン（抗体に対し
て特異的に結合することができるが、抗体の産生を誘発
できない、すなわち免疫原性でない）として挙動するた
め、交差結合、または担体分子への結合が必要となるこ
ともある。このような断片の免疫原性担体分子への結合
は、“担体効果”として通常知られていることのために
、該断片が免疫原性となる。
好適な担体分子は、例えば蛋白質類およびポリペプチド
、多糖類、リボ多糖類等の天然または合成の高分子化合
物を含む。有用な担体は、ＱｕｉｌＡと称されるグリコ
シドであって、これらＭｏｒｅ　ｉ　ｎらのＮａｔｕｒ
ｅ　匡：４５７　（１９８４）に記述されている。蛋白
質担体分子は、特に好適であって、限定されるものでは
ないが、キーホールリンベットのヘモシアニン、ヒトも
しくはウシガンマグロブリン、ヒト、ウシもしくはウサ
ギ血清アルブミン、またはこのような蛋白質類のメチル
化もしくは他の誘導体を含む。他の蛋白質担体類は、当
業者には自明であろう。必須ではないが、好ましくは、
該蛋白質担体は、アイメリア蛋白質類に対する抗体が誘
発される宿主動物に対して外来性であるだろう。
担体分子に対する共有的結合は、この分野において良く
知られた方法を用いて行なうことができ、その正確な選
択は、使用される担体分子の性質により要件が書かれる
。該免疫原性担体分子が蛋白質である場合には、本発明
の蛋白質または断片は、例えは、ジシクロへキシルカル
ボジイミドまたはグルタルアルデヒド等の水溶性カルボ
ジイミド類を用いて結合され得る。
これらのような結合剤は、別の担体分子を使用すること
なく、蛋白質類および断片類それら自体を交差結合する
ためにも使用することができる。
このような蛋白質または蛋白質断片凝集体への交差結合
も、また、免疫原性を増大することができる。
本発明のワクチン類の有効量の投与は、Ｅ、　ｔｅｎｅ
ｌｌａによる感染に対して家禽を保護し得る。Ｅ、ｔｅ
ｎｅｌｌａ抗原に対するモノクローナル抗体類は、イン
ビトロにおいてＥ、ａｃｅｒｖｕｌｉｎおよびＥ、ｍａ
ｘｉｍａと交差反応し、これらの種に対する保護も与え
られるであろうことを示している。該蛋白質または蛋白
質断片の有効な投与量は、ワクチン接種される動物の体
重において、約１０から約５０マイクログラム／ｋｇの
範囲を有する。約２２５−５０ｕ　／ｋｇの投与量が好
ましい。最初のワクチン接種は、好ましくは、１ないし
数週間後に与えられる増進用ワクチン接種に引き継がれ
る。複数回の追加が投与されてもよい。このような追加
の投与量は、−船釣には約５から５０μｇ／ｋｇ、好ま
しくは約２０−５０μｇ／ｋｇである。皮下、皮肉、筋
向、経口、肛門または卵内投与等の標準的投与経路が使
用できる。
鳥類の免疫系に対する本発明のコクシジア抗原の提示は
、該抗原をコードする遺伝子を細菌（例えばＩ！、ｃｏ
ｌｔまたはＳａＬｍｏｎｅｌ　ｌａ）中、またはウィル
ス（例えばｐｏｘｖｉｒｕｓまたはｈｅｒｐｅｓｖｉｒ
ｕｓ）中にクローン化し、そして該生ベクター系を鳥類
に経口的、注射により、または他の通常使用されている
経路により投与することにより達成できる。
Ｃａｒｂｉｔら（Ｖａｃｃｉｎｅｓ、１９８７．Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ＩａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、　６８−７１中〕は、Ｅ、ｃｏｌｉの使用を記述し
、一方、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　（Ｐａｔｈｏｌ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｐａｔｈｏｌ、ＲｅＳ。
６　：１３７（１９８７）　）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａの使用を記述した。
Ｍｏ５ｓら〔＾ｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５
　：３０５（１９８７）　）は、組換えポックスウィル
ス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）を使用したウィルスベクター系
の使用を評論している。
ポックスウィルスの一種であるワタシニアウイルス（ｖ
ａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）は、細胞培養物中および
動物中でコクシジア抗原の放出の試験のために使用し得
る０分析的な研究のために、ワタシニアウイルスは、使
用し得る他のポックスウィルス担体であるｆｏｗｌｐｏ
ｘ　ｖｉｒｕｓよりも効果的であることが見出された。
これは、ワタシニアウイルスが鳥類のウィルスより急速
に複製され、かつニワトリ細胞に限定されない宿主範囲
を有するためである。大量の異種ＤＮＡが、ウィルスの
成熟および感染力を阻害することなしにワタシニアウイ
ルスのゲノム中に挿入され得る（Ｓｎ＋ｉｔｈらのＧｅ
ｎｅ　、２Ｍ：２１（１９８３）　：ｌ。
ウィルスを使用した多重異種遺伝子の挿入および発現は
、感染を受けた動物中に発現された抗原に対する抗体の
産生を誘発する（Ｐｅｒｋｕｓらの５ｃｉｅｎｃｅ牙ツ
：９８Ｈ１９８５）　）。
組換えワタシニアウイルスの製造のために用いた技術は
、ｆｏｗｌｐｏｘまたはｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ系に対
する一定の処理手続に容易に適合させることができる。
このような組換えウィルスのコクシジウム症に対するワ
クチン中の担体としての使用は、ワクチン接種された鳥
類がコクシジア抗原およびウィルス担体の両者に対して
免疫を発生する（すなわち、このようなワクチン類は、
二価である）点において特に優れている。このようなワ
クチン類の有用性は、付加的な遺伝子類を担体ウィルス
中に挿入することにより、更に増強され得る。得えば、
ニューカッスル病ウィルスゲノムの部分がコクシジア抗
原遺伝子と共にｆｏｗｌｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ中に挿入さ
れ得、これによりニューカッスル病、コクシジウム症お
よび鶏痘のすべてに対して単一のワクチンにより免疫が
与えられる。
本発明の生ベクターワクチンの投与は、この分野でよく
知られた多くの方法により行なうことができる。例えば
、鶏痘ウィルスに対して家禽にワクチン接種するために
通常使用されている“突きさし”法が使用される。この
方法は、ワクチン中に浸された鋭い針により、翼の翔の
皮膚を突くまたは刺すことからなる。この針は、通常ミ
シン針のように先端近くに目を有し、これによりワクチ
ンの滴を運ぶ。別法として、該生ワクチンは、翼の１ま
たは他の部位に皮下的または皮肉的に注射することがで
きる。
該組換え生ベクターワクチンは、飲料水中に添加されて
もよく、またワクチン接種される鳥に噴霧することもで
きる。それらは、飼料中において、好ましくは保護的な
カプセル化の後に（ＢａｌａｎｃｏｕらのＮａｔｕｒｅ
３２Ｌ２Ｌ：３７３（１９８６）　）　、または卵内的
に投与することもできる。後者の方法においては、ウィ
ルスワクチンは、直接的に鶏胚中に注射される（Ｓｈａ
ｒｍａの八ｒｉａｎ　　Ｄｉｓ、２５：１１５５（１９
８！５））　　。
１旋■ 別途特定しない限り、以下では、固体混合物中の固体の
パーセントは−ｔ／ｗｔ（重量７重Ｍ）、液体中の液体
のパーセントはｖｏｌ／νｏｌ（容Ｎ／容量）、液体中
の固体のパーセントはｗｔ／ｖｏｌ（重量／容量）をそ
れぞれ基準とする。
、１　１」Ｊｌ長 Ｅ、テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａ）、　　Ｅ−アセルブ
リナ（Ｅ。
ａｅｅｒｖｕｌｉｎａ）、　　Ｅ、プルネッティ（Ｅ、
Ｂｒｕｎａｔｔｉ）、及びＥ、マキシマ（Ｅ、Ｍａｘｉ
ｌ！ｌａ）のスポロゾイトが通常の方法で胞子形成した
接合子嚢（ｓｐｏｒｕｌａｔｅｄ　ｏｏｃｙｔｅ）から
単離された。簡単に述べると、胞子形成した接合子嚢は
蒸留水及び２０％漂白剤で洗浄し、そして、蒸浄水で洗
浄される。接合子嚢はＭｉ織ホモジェナイザーで破壊さ
れ、スポロシストを含む不溶材料は遠心分離により回収
された。沈澱中の放出されたスポロシスト及び他の材料
は０．２５％トリプシン、ヒナ鶏胆汁含有ｐＦＩ８のハ
ンクス氏塩溶液に再懸濁され、４０°Ｃで２時間インキ
エベートされた。
切除溶液は、１０％牛脂児血清（ＦＢＳ）を含有する１
’ｌＰＭＩ−１６４０培地で２度洗浄し、ｐＨ７，４の
ＰＢＳで２度洗浄することで除去された。
次に、スポロゾイトは、次にメトラジミドのグラジェン
ト　（勾配）により精製された。（ウィシ＋　−（ｗｉ
ｓｈｅｒ）他、バラシトロジ−８８巻Ｐ、５１５（１９
８４）　）。簡単に述べるとスポロゾイトは、ｐＨ７，
０のＰＢＳ　２雇に再懸濁され、懸濁液１７ｄが１５ｍ
１のメトリザミドのグラジェントに重層された。グラジ
ェントは、１２％、１８％、２４％のメトラジミド含有
ＰＢＳ、　　ｐＨ７，０、それぞれ５Ｉｄからなってい
る。スポロゾイトは９００Ｘｇ４０分間の遠心分離によ
り沈降される。精製されたスポロゾイトは、２１ゲージ
の針をチューブの側面を通して１８％と２４％のメトリ
ザミド間の界面へ挿入し、注射器ヘスボロゾイトを吸引
することにより分離された。精製されたスポロゾイトは
ｐＨ７，０のＰＢＳで３度洗浄され、直ちに免疫、感染
研究、ｎｉｌによる表面ラベル、蛍光免疫分析、５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０）　）及びウ
ェスタンブロッティング研究に使用された。
Ｅ、テネラ（Ｅ　、　ｔｅｎｅ　１１ａ）のメロゾイト
は以下６．２．３節に記載されるように分離された。精
製されたメロゾイトは免疫に用いられ、そして、５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロ
ッティング研究用のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液で可溶化
された。
、２　　免−役 以下のスケジュールにしたがい、精製された生存スポロ
ゾイトで８匹のメスのＢａ、ｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌ
ｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、Ｗｔｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ）
が免疫された。
１日日　ｌＸｌ０’スポロゾイト静脈注射（ｉ、ｖ、）
７日日　６Ｘ１０’スポロゾイト腹膜腔内注射（ｉ、ｐ
、）８５日日日６Ｘ１０’スボロソ゛イト　ｉ、ｐ。
１２０日目日目Ｘ１０’スボロン゛イト　ｉ、ｐ。
２４４日目日目合前免疫促進剤（ブースター）１日日　
５Ｘ１０’スポロソ゛イトｉ、ｖ。
５Ｘ１０”スポロゾイト　ｉ、ｐ。
２日目　１日目と同じ ５日目　過免疫牌臓細胞とミエローマ細胞との融合 各々のマウスからの血清は、抗スポロゾイト抗体につい
て、精製スポロゾイト蛋白質を用いてＥＬＩＳＡにより
、可溶化スポロゾイト蛋白質を用いてウェスタンブロッ
ティングアッセイにより、１２Ｊでラベルされたスポロ
ゾイト表面蛋白質の免疫沈澱により、そして、精製スポ
ロゾイトを用いる免疫蛍光分析によりテストされた。も
っとも高いスポロゾイト抗体反応性を示したマウス（マ
ウス１０７−２）が融合前免疫ブースターに選ばれた（
この抗血清のＥＬＩＳＡ分析に関し、図１参照）。５日
目に当該マウスは屠殺され、肺細胞調製のため肺臓が取
り除かれた。
、３　　　　　　　　　　び　　　　ム融合２日前に、
肺臓細胞のフィ′−ダー細胞が純粋なマウスから完全培
地〔イソコツの修正ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ、Ｇｉｂ
ｃｏ）に１０％ＦＢＳ、グルタミン（２，０ｍＭ）及び
２−メルカプトエタノール（１００ｔｔ　Ｍ）を加えた
もの〕及びＩＩＡＴ　（１００μｉヒポキサンン、１０
μ門アミノプテリン、及び１６μ門キミジン）中に調製
された。ｄｅ　ｓｔ　Ｇｒｏｔｈ他の方法（Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏＬＭｅｔｈｏｄｓ　３５：Ｈ１９８０）　）の
変法により、１０”コの肺臓細胞が１０３個のＦＡＩ−
０マウスミエローマ細胞と融合された。ハイブリドーマ
の調製に好適ないかなる他のミエローマ細胞をも用い得
る。多くのそのようなミエローマ細胞は公知であり、当
業者に人手可能である。
細胞は混合され、遠心分離により沈澱され、１戚の３５
％（ｖｏｌ／νｏｌ）ポリエチレングリコールを含むＩ
ＭＤＭに３７°Ｃで１分間ゆっくりかく拌し続け、再懸
濁された。
３７°Ｃで３分間の培養後、上記細胞は再度沈澱させら
れ１０ｄのＩＭＤＭ＋ＨＡＴにゆっくり再懸濁された。
細胞は次に１×１０ｈ細胞／ｌｌ１１になるように完全
培地＋ＨＡＴ中へ希釈され、１ｄの完全培地に５Ｘ１０
’牌臓フイーダー細胞を含有する２４穴マイクロタイタ
ープレー）（１ｗ１／穴）へ分散された。
ハイブリドーマ上清は、精製スポロゾイトを用いＥＬＩ
ＳＡにより、スポロゾイト蛋白質を用いウェスタンブロ
ッティングにより、＋２Ｊラベルされたスポロゾイト表
面蛋白質を用い免疫沈降法により、及び精製スポロゾイ
ト及びスポロゾイト感染細胞を用い免疫蛍光により抗ス
ポロゾイト抗体が分析（アッセイ）された。ハイブリド
ーマは限界希釈によりクローン化された。
、４　　スポロゾイトＥＬＩＳＡ あらかじめ１％ＢＳＡ含有ｐＨ７，０、ＰＢＳでブロッ
クされた９６穴Ｕ−底ＰｖＣプレートの各人に精製され
たスポロゾイト（４Ｘ１０’）が加えられた。スポロゾ
イトは５分間１０００　Ｘ　ｇの遠心分離で穴の底へ沈
降された。スポロゾイトは１００μｌの希釈抗血清又は
ハイブリドーマ上清中に再懸濁され、連続かく拌しなが
ら室温で２時間培養された。
スポロゾイトへ結合した特異的抗体の検出のためにパー
オキシダーゼ結合した抗−マウス（ＩｇＧ）ヤギＩｇＧ
が再懸濁されたスポロゾイトへ添加され、懸濁液は室温
で２時間培養された。スポロゾイトは洗浄され、結合し
た抗体は、基質溶液（０−フェニレネジアミン０．４■
／ｄ含有０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．１２％過酸化水
素）を添加、室温３０分で可視化された。反応は、５０
ｍＭメタビスルファイトナトリウム含有２．５Ｍ　ｕｚ
ｓｏ４を添加することで停止された。結合抗体量は基質
呈色の０Ｄｎａａの読み取りにより決定された。
細胞融合から培養された合計４８０のウェル（穴）の内
、４３２がハイブリドーマ成長に陽性であった。
この内、３５８のハイブリドーマが一次スポロシイ）　
ＥＬＩＳＡにおいて抗体酸性が陽性であった。これらの
もとの親ハイブリドーマ細胞の増殖及び継代中に、１０
４の細胞は死滅するか、抗体産生を停止し、したがって
、その後のスポロゾイトＥＬＩＳＡ及びウェスタンプロ
ットアッセイによるスクリーニングでは陰性であった。
スポロゾイトＥＬＴＳＡにより１０×バツクグランドレ
ベルで抗体を産している２０５のハイブリドーマが同定
された。
精製されたスポロゾイト（約５Ｘ１０’スポロゾイトｍ
／ｇｅｌ）がＬａｅｍｍｌ　ｉ　の試料緩衝液に可溶化
され、１２．５％ゲルまたは、７．５から２０％の勾配
ゲル（Ｌａｅｍｍｉｌ、　５ｕｐｒａ）を用いる５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分離され、
電気泳動的にニトロセルロースシートへ移された。Ｓ裏
シートは３０％ゼラチンバッファー（３％ゼラチン、　
　ＴｒｉｓｔＩＣＩ、　ｐｉ（７，５，０，１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１）でブロックされ細片に切断され、細片は希釈抗
血清又はハイブリドーマ上清と１２時間４　”Ｃで１％
ＢＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡ。
５抛閂リン酸ナトリウムｐＨ６，５，０，５Ｍ　ＮａＣ
１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で反応させられた
。細片はｐＨ７，４゜０．０５％Ｔｉｍｅｅｎ−２０Ｐ
ＢＳ中で洗浄され、特異的結合抗体は、パーオキシダー
ゼ結合抗マウス抗体により検出された。結合抗体は基質
溶液（４−ｃｈｌｏｒ。
１−ｎａｐｈｔｈｏｌ　（１０ｍの氷温メタノール及び
５０ｍ１のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５中に３０■？
容解された）、０．１りＭＮａＣ１，０，０１５％最終
濃度）１ｚｏｚ）を添加室温で３０分で可視化された。
反応は蒸留水で過度に洗浄することで終結された。スポ
ロゾイトＥＬＩＳＡにおいて陽性であった抗体のうち、
可溶化スポロゾイト蛋白質で用いるウェスタンブロッテ
ィング分析によっても１６０が陽性であった。
ウェスタンプロット分析（第２図参照）により、モノク
ローナル抗体は３種類の反応性（ａ）単一のアイメリア
蛋白質（例、ｌｌＡｌ及びＩＩＤＩ）に結合するもの、
（ｂ）２又は３の蛋白質（例、６Ａ５及び２０Ｃ６）に
結合するもの、及び（Ｃ）多数の蛋白質（例、ｌｌＡ３
゜１３Ａ６及び１４Ｂ５）に結合するもの、の一つにあ
てはまることが示された。
抗体は、更にＥ、テネラメロゾイト及びＥ、アセルブリ
ナのスポロゾイト蛋白質を用いるウェスタンプロット分
析により特徴づけられた（第３図）。
３＾５．１３Ａ６．７０、及び２０Ｃ６を含む多数の抗
体はＥ。
テネラ及びＥ、マセルブリナのスポロゾイトから単離さ
れた蛋白質及びＥ、テネラのメロゾイトから単離された
蛍白質を認識した。６Ａ５のような他の抗体は種及び段
階特異的であり、Ｅ、テネラのスポロゾイトにのみ結合
することが示された。
いくつかの抗体について得られた結果の要約が第１表に
示されており、抗体の特異性は（ａ）抗体が結合するゲ
ル中の蛋白質の起源及びサイズ、及び（ｂ）抗体で沈降
された１２５ニーラベルされたアイメリアテネラ蛋白質
の大きさの両者で示された（右欄）。
抗体は更にアイソタイプにより表中で特徴づけられた。
（本頁以下余白） Ｂ２ Ｄ４ ０１ ０Ｃ６ Ａ５ ９Ｄ６ Ａ２ Ａ５ ４Ｂ５ ５Ｂ３ ４Ｂ１ ２Ｂ２ ５Ａ３ ５Ａ４ ２Ｃ３ Ｂ６ Ｃ４ ６Ｄ２ ３Ａ６ １Ｂ６ １２＾３ ２Ｄ４ 第　　１−一表 〉２００ ２０ ２０ ２０ ２０ ８０ ７ ２８／２６ 〉１５０ 〉１５０ ２８／２６ ８７６ ２８／２６ ８ Ｎ、Ｄ。
Ｎ、Ｄ。
Ｎ、Ｄ。
Ｎ、Ｄ。
Ｎ、　Ｄ。
７ Ｎ、Ｄ。
１０ １０ １０ ２０ ２０ ７ ５ Ｎ、Ｄ。
Ｎ、Ｄ。
２４／１７ ２４／１７ １７／１５／６ １０５／１５／６ ５ ０ ７０／８５ １０ ０５ ２４／１７ Ｎ、Ｄ。
・Ｓｐｚ及びＭｒｚは、それぞれスポロゾイト及びメロ
ゾイトの略号である。
・Ｇ及び門は、それぞれＩｇＧ及びＩｇＭを示す。
・ｍは、２４〜２００ｋｄ以上のサイズの範囲の複数の
蛋白質と抗体が結合することを示す。
・Ｎ、Ｄで示される価は決定（定量）されなかった。
精製されたスポロゾイトの表面蛋白質はｌ０ＤＯＧＥＮ
法（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）又はＩＯＤＯ
ＢＥＡＤＳ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａ１社）を用い
て１２Ｓ１でラベルされた。後者の手法の場合、４つの
ｌ０ＤＯＢＥＡＤＳは、ｐＨ７，５０，２Ｍのリン酸ナ
トリウム溶液で３度洗浄され、１−３ｍＣ１の１１％１
４ａが添加され、室温で５分間培養された。
精製されたスポロゾイト（３Ｘ　１０＠）を含む２００
μｌのＰＢＳ　ｐＨ？、ｏが反応バイヤルへ添加され、
培養は１５分間続けられた。培養終了時にフェニルメタ
ンスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）が最終濃度０
．５ｍＭになるように添加された。
スポロゾイトは１２．０００Ｘｇ　３０秒の遠心分離に
より培養混合液から回収され、２％ＳＯＳ又は１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むｐＨ７，ＯＰＢＳ中で可溶
化された。不溶成分は１２，０００ｘｇ　３分間の遠心
分離により除去され、該可溶化スポロゾイト蛋白質は３
２のｐＨ７，ＯＰＢＡに対し４°Ｃでカットオフ分子量
３５００の（透析）膜を用いて残留自由＋２Ｓ１を除去
するために透析された。
ｔｚｓｌ−ラベルされたスポロゾイト蛋白質（典型的に
は、５Ｘ１０”ｃｐｍが蛋白質にとり込まれている。）
は使用時まで４°Ｃで貯蔵された。ＴＣＡで沈降可能な
放射能は典型的には全放射能の９５％を超えていた。Ｉ
ｔ＆！１■でラベルされたスポロゾイト蛋白質のＳＯＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析が図４左部分に示
されている。
免疫沈降は、３００μ２のハイブリドーマ上清又は希釈
抗血清を２５０μ２の１２５■でラベルされたスポロゾ
イト蛋白質（Ｉ　Ｘ　１０’ｃｐｍ）を含有するＢｕｆ
ｆｅｒｌ（０，２５％ＮＰ−４０，１０ｏ＋Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，０，１５ＭＮａＣ１）に添
加することで行なわれた。４°Ｃで１６時間培養後、ア
ガロース（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社）にカップ
リングされた抗マウス　ヤギＩｇＧの５０％懸濁液１０
０μｆ−２００μ２が添加され、混合液は室温で２時間
回転ミキサーで培養された。ビーズは１２、ＯＯＯＸｇ
で１分間遠心分離して沈澱され、洗浄バッファー（０，
１％ＳＤＳ、　０．５％ＮＰ−４０，０，２％デオキシ
コール酸ナトリウム、　　１０ｍＭ　ＰＭＳＦ、　１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，５，０，１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１）で３度洗浄された。
固相抗体に結合したＩｔＳｌ−ラベル蛋白質ははずされ
、２ＸＬａｅｍｌｉ試料緩衝液を６０ｕｌ添加し、９５
°Ｃで３分間加熱することにより変性された。免疫沈降
させられた１２８１−ラベルされたスポロゾイト蛋白質
は１２．５％ゲル中での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離され、オートラジオグラフィーに
より可視化された。
免疫マウス血清を用いた免疫沈降アッセイの結果は図４
右欄に示されている。スポロゾイトＨＬＩＳ＾で陽性で
あったハイブリドーマ抗体のうち、７４が免疫沈降によ
っても陽性であった。第５図に示されたようにハイブリ
ドーマ抗体は２つのカテゴリー、すなわち一つの蛋白質
を沈降させるもの（例、３Ｃ４，６Ａ５．７Ｄ４．８Ａ
２．１１０２及び２０Ｃ６）　、及び２以上の蛋白質を
沈降させるもの（例、１２Ｂ２．１５Ａ３゜１５Ｃ４及
び１９０６）にあてはまる。
、７　　　　スポロシイ　　　いる ＰＨ７，ＯＰＢＳ中の８室あるスライドガラスにスポロ
ゾイト（Ｉ　Ｘ　１０’）が添加され、３７°Ｃで１２
時間空気乾燥された。スライドは１０％正常ヤギ血清を
用い２時間、３７℃でブロックされた。希釈された抗血
清又はハイブリドーマ上清が各々の室（チャンバー）へ
添加され室温で２時間培養された。スライドは洗浄され
、ローダミンの結合した抗マウス抗体（ＰＢＳ　ｐＨ７
，ｏ、　０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で希釈）が
室温で１時間添加された。スライドを洗浄後、結合抗体
は蛍光で可視化された。
抗体の大部分は表面膜及び／又は空気乾燥されたスポロ
ゾイトの屈折体（ｒｅｆｌａｃｔＨｅ　ｂｏｄｙ）に対
して特異的免疫蛍光を示した。ある抗体はスポロゾイト
の頂部末端（ａｐｉｃａｌ　ｔｉｐ）を強く染色し、残
りのスポロゾイト表面は（第６図、パネルＣ）はわずか
に染色した。
空気乾燥した精製スポロゾイトは図６、パネルＡ、Ｂ、
Ｃ及びＤの左側スライドに示されている。
精製スポロゾイトは元通りであり、伸長しており、優性
後部大屈折体（ＦＲＢ）及び前部小屈折体（ＡＲＢ）を
示した。そのスポロゾイト頂部端（Ａ）は、後部屈折体
の反対側にあった。完全スポロシスト（パネルＢ、左側
）及び破壊スポロシスト膜により調製物は若干コンタレ
（汚染）されていた。
５５のモノクローナル抗体の上記分析から生じた結果の
サマリーが第２表に示されている。
（本頁以下余白） ａ、　示される価は、ウェスタンブロッティングで、抗
体により認識されるＥ、テネラスポロゾイト蛋白質又は
、４４０−１５０ｋｄ（’）、１２０及び８８０−１５
０ｋａ（”）並びに２５及び４４０−１５０ｋｄ（”）
の分子量を持つ認識された蛋白質群の分子量である。
ｂ、　ウェスタンプロットアッセイは、通常のＥ、テネ
ラスポロゾイト蛋白質の１１５で行なわれた。
したがって、陽性反応を示す抗体は、高親和性を有して
いる。
Ｃ０ウェスタンプロット反応性は、Ｅ、アセルブリナス
ポロゾイト蛋白質に対して示されている。
ｄ、　ウェスタンプロット反応性は、Ｅ、テネラメロゾ
イト蛋白質に対して示されている。
ｅ、免疫螢光分析（ＩＦＡ）染色のパターンの結果は、
空気乾燥Ｅ、テネラスポロゾイトの間接分析として（１
）表面、（２）頂部、（３）パッチ表面、（４）ブライ
ト表面、（５）ライト表面、（６）拡散表面、（７）屈
折体及び（８）パンクテート染色として要約されている
。
ｆ、免疫沈降において抗体により捕えられた１２５１−
ラベルされたＥ、テネラスポロゾイト蛋白質の分子量が
示されている。
好適なモノクローナル抗体７Ｄ４．７０、２０Ｃ６゜８
Ａ２．６Ａ５及び７Ｂ２．はこれらのモノクローナル抗
体を分泌するハイブリドーマの形でＡＴＣＣ１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
　Ｍａｒｙｌａｎｄブタペスト条約上の寄託をされ、そ
れぞれ寄託番号はＨＢ　９７０７、　ＨＢ　９７０８．
　ＨＢ　９７０９．　ＨＢ　９７１０．　ＨＢ　９７１
、及び）ＩＢ　９７１２である。
、９　　インビ　ロ感仇ア・・セイ ー次鶏ジン臓上皮細胞がＤｏｒａｎ等のＪ　、　Ｐｒｏ
　ｔｏｚｏｏ　１２５：５４４（１９７８）の方法に従
って樹立された、４−室のＬａｂ−７６ｋ　５ｌｉｄｅ
で４０−５０％になるまで培養されたＭＯＢＫ（Ｍａｄ
ｉｎ−Ｄａｒｂｙ　ｂｏｖｉｎｅ　ｋｉｄｎｅｙ）細胞
（ＡＴＣＣＣＬ　２２）がニワトリジン臓上皮細胞のか
わりに用いられた。
細胞は５０．０００又は２００，０００の精製されたス
ポロゾイトを接種された。感染１６時間目に細胞単層は
細胞に侵入しなかったスポロゾイトを除去するため数回
洗浄された。感染後３．１６，２４．４Ｂ、６４．９６
及び１２０時間目に１００％メタノール（室温で５分間
）で代表的な接種ＩＪＩｌ抱培養物は固定された。固定
されたスライドは、上述のように免疫螢光で現象される
までｐｌ！７．ｏ、　　１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に４　
’Ｃで保存された。多様な抗体で得られた染色パターン
は第７図に示されている。
感染後３時間目と２４時間目の間に、固定された培養物
は、細胞間にスポロゾイト（第７図、３時間目に７０４
及び１９時間目に８Ａ２）。その後、スポロゾイトは屈
折体のみへ退化した（７Ｄ４．６０時間）。
細胞内スポロゾイトの表面及び頂部、端は、７Ｄ４抗体
（第７図、７Ｄ４．３時間目）で明るく染色された。
しかしこの抗体は感染された細胞の表面は染色しなかっ
た。
２４時間後スポロゾイトは変性し始め、シゾント（分裂
前体）に発育し、次の４８時間でシゾントへ成熟した。
抗体７Ｄ４は変性しているスポロゾイトと反応し続けた
が未成熟のシゾント（第７図、７Ｄ４゜６０時間）と反
応しなかった。しかしながら、シゾントが成熟するにつ
れ、シゾント（第７図、７０４．１００時間）内の構造
物と７０４は反応し始めた。これらの構造は、発育中の
メロゾイトであり、７Ｄ４抗体は成熟と放出されたメロ
ゾイト（第７図、７０４１２０時間）の表面抗原と反応
し続けた。
このように７０４は、Ｅ、テネラスボロヅイト及びメロ
ダイト上に存在１２０ｋｄ　Ｉｆｆ抗原と同定した。
この抗原は、未成熟メロゾイトがシヅント中で発育する
まで寄生虫発育のシゾント段階では発現されなかった。
抗体１４Ｂ１は抗体７Ｄ４のそれと類イ以の反応性パタ
ーン、すなわち、細胞内スポロシイｌ−（第８図、１４
Ｂ、１６時間）の表面及び頂部を染色し、細胞内スポロ
ゾイトの直接近接部における細胞質（サイトプラズム）
を拡散染色することを示した。１４Ｂ１に認識された抗
原は、成熟シゾント（第８図、１４Ｂｌ、　　１００時
間）中の未成熟メロゾイトの頂部及び成熟し放出された
メロゾイトの頂部（第８図、１４Ｂ、１２０時間）に存
在する。抗体７Ｄ４及び１４Ｂｌにより示される染色パ
ターンは類似している。しかし、これらの抗体が認識す
る蛋白質はそれぞれ１２０ｋｄと６ｋｄと非常に異なる
分子量を有している。
しかしながら抗体７Ｄ４及び１４Ｂｌは寄生虫の発育の
大部分の段階と反応するが他の抗体は表面抗原のみ（第
７図、１５Ａ３　）又は細胞内スポロゾイト屈折体と反
応し寄生虫のシゾント又はメロゾイトの段階とは反応し
ない。
２つの独特な抗体、８Ａ２及び１９Ｄ６は感染分析によ
り固定された。８八２抗体は、スポロゾイトの表面（第
７図Ｃ１８Ａ２．１９時間）、発育中のシゾントの全て
の段階（第７図Ｃ１８Ａ２．　１２０時間）及び放出さ
れたメロゾイトの表面（第７図Ｃｌ８Ａ２１２０時間）
に存在する３７ｋｄの蛋白質と反応する。
７Ｄ４及び１４Ｂ１抗体により認識される蛋白質には類
似せず、３７ｋｄ蛋白質は、寄生虫の細胞内での発育期
間中合成された。
抗体１９Ｄ６は１８ｋｄスポロゾイト表面抗原蛋白質と
反応するのみならず、スポロゾイト感染細胞（第８図、
３時間後１９０６）の細胞質中の蛋白質とも反応した。
１９Ｂ６抗体により認識された細胞質内蛋白質は細胞感
染後スポロゾイトにより出されたものかもしれない。と
いうのは、未成熟シゾント発育中には上記蛋白質は消失
し、成熟したシゾント及び放出されたメロディト中に再
び現われるからである。
Ｅ、テネラの感染を生きのびた、ニワトリからの抗体血
清は７Ｄ４抗体の染色と同様なパターンで、細胞内スポ
ロゾイトの頂部端及び表面を染色する（第８図Ｂ免疫ニ
ワトリ血清、３時間）が、しかし、細胞内スポロゾイト
の屈折体は染色しない。
スポロゾイトに感染したニワトリ腎臓細胞を用いる免疫
螢光研究は、（ａ）スポロゾイト（例えば２００ｋｄ以
上及び２８ｋｄの蛋白質でそれぞれ７Ｂ２及び６八５に
より認識されるもの）に特異的で、（ｂ）細胞内寄生体
のすべての段階（例えば８Ａ２により認識される３７ｋ
ｄ蛋白Ｖ）にみられ、そして（Ｃ）スポロゾイト及びメ
ロゾイトに特異的であるがシゾント（例えば１２０ｋｄ
及び６ｋｄの蛋白質でそれぞれ７０４抗体及び１４Ｂ１
抗体により認識されるもの）には特異的ではない抗原と
確認された。
、１０インビ　ロ　のスポロゾイト Ｓｃｈｍａ　ＬｚらのＪ、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ　３３：
１０９（１９８６）の方法の−修正手法において、ＭＤ
ＢＫ細胞はトリプシン処理され、１％ＦＢＳを追加した
最小限必須培地中に７．５　ＸＩＯ’細胞／成の濃度で
懸濁された。マイクロタイタープレートの各々の穴（組
織培養処理された９６穴）へ、５　Ｘ　１０’の細胞が
添加され、４０°Ｃで４８時間培養された。精製された
スポロゾイトは単層細胞への感染に先だち、４０°Ｃで
１時間抗体と前処理されるか、又は未処理で放置された
。抗体（組織培養物、腹水又は抗血清のいずれか）は、
ｐＨ７，０ＰＢＳに対して十分に透析され、５６°Ｃ３
０分間熱失活させられ、使用前に除菌濾過された。
感染直後、（５，６）　−’Ｈ−ウラシルが最終濃度５
μＣｉ／Ｉｎｌとなるように金穴に添加された。感染１
９時間後、上記培地は除去され、培養物はＰＢＳで一回
洗浄された。
上記細胞はトリプシン−ＥＤＴＡで４０°Ｃ１５分間処
理することではがされ、ガラスファイバーフィルター上
へ集められた。
上記フィルターは乾燥され、シンチレーション液体（Ｒ
ＥＡＤＹ−ＳＯＬＶ＠　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ
ｃｌｅａｒ）上に置かれ、結合放射能がカウントされた
。抗体のスポロゾイト侵入及び又は発育の阻害能力は、
抗体処理されたスポロゾイトで感染された細胞と比較し
た。未処理スポロゾイトで感染された細胞へ取り込まれ
た放射能により定量された。
スポロゾイトは、また対照抗体、バッファー又はラサロ
シド（ｌａｓａｌｏｓｉｄ）、っまり静球虫剤で前処理
された。ラサロシドは、ＭＤＢＫ細胞中におけるスポロ
ゾイトの発育を完全に阻止し、３Ｈ−ウラシルの取り込
みを大きく低下させた。
結果は、第９図に示されている。７Ｄ４抗体（ロ）８Ａ
２抗体（Ｏ）、及び１４Ｂ１抗体（・）は、感染ＭＤＢ
Ｋ培養物への３Ｈ−ウリジンの取り込みを大きく阻害し
た。６Ａ５（■）抗体あまり有効ではないが、いくらか
の阻害を示した。
バッファー（Δ）及び対照抗体（×）で処理では阻害を
起こさなかったが、ラサロシド（×）は実質的に完全な
阻害を起こした。
２、ｃＤＮ＾　　−イ　−１−の ２．１　　　　ノ　　中　人　　の１０１１３週令のニ
９トリ（ヒュバードクロス、アビアンサ−ビスフレンチ
ダウン、ニューシャーシー〇、Ｓ、Ａ）から。−羽につ
き、５０，０００　Ｂ、テネラの胞子形成接合子嚢で経
口接種した後７日目に盲腸が除去され、蒸留水を用いワ
ーリングブレングー中で１分間ですりつぶされた。
容量は蒸留水で１１に調整されペプシン（シグマケミカ
ルＣｏ、セントルイス、ミズリー、　ｔｌ、Ｓ、Ａ、）
が３　ｇ／ｌになるように加えられた。ｐＨは濃塩酸で
２．０に調整され、混合物は２〜３時間、即ち単一の接
合子嚢懸濁液が得られるまで、３９°Ｃで培養およびか
く拌がなされた。消化後、ＩＯＮ　ＮａＯＨによりｐＨ
を８．０に調整し、３ｔの蒸留水を添加した。
混合物は沈澱のため一晩放置された。上清は取り除かれ
沈澱は上清が透明になるまで洗浄された。
接合子嚢は室温で蒸留水中で懸濁物に泡だて通気するこ
とで胞子形成させられた。胞子形成は、２４時間後ＲＮ
Ａ調製のために停止された。
２．２　　　　　　　　　人　　ａ＋ＲＮＡの全ＲＮＡ
は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）ら
の前述文献ｐ１９６に記載された、グアニジニウム／塩
化セシウム法の修正法により調製された。接合子嚢はＰ
ＢＳ（０，１５Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　リン酸ナトリ
ウム。
ｐＨ７，９）で洗浄され、そして５Ｍグアニジニウムイ
ソチアシアネート＋　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　１
０ｍＭ１：チＬ／７ジアミンテトラアセテート（ＥＤＴ
Ａ）、　０．５％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ：Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム、シグマケミカルＣｏ
、）及び０．１μｌ−メルカプトエタノールを含有し、
５μｌのアンチフオームＡ（ユニオンカーバイド、ダン
ブリ−、コネチカッ）　Ｕ、Ｓ、Ａ、）又は他の消泡側
が好適には添加された溶液１０ｄ中でゆるやかに渦流か
く拌を行ない再懸濁された。細胞懸濁液は、顕微鏡で観
察した時、接合子嚢が良好に破壊されたと見えるまで上
記細胞懸濁液はホモゲナイズされた。
不溶細胞断片は低速遠心分離により除去され、ホモジネ
ートは４分画に分けられ、１２−のポリカーボネート、
遠心管中で５．７Ｍ　ＣｓＣ１，０，１Ｍ　ＥＤＴＡ。
ｐＨ７，５の溶液、２　ｄの上へ重層された。遠心管は
ベックマン５Ｗ５０．１０−ター中で４０００ｒｐｍで
１５°Ｃ１７時間遠心された。上清液体は捨てられ、遠
心管壁は乾燥せられ、ペレットは２００μｇ／ｍｌのプ
ロティンキナーゼ（ベーリンガーマンハイム）を添加し
た、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ
、　１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）、　ｐＨ７
，５溶液、２５ｄ中に再懸濁された。３７°Ｃで３０分
間培養後、上記溶液はフェノールで３回抽出された。最
終水相中のＲＮＡは、エタノールで３回沈澱せられ、１
戚の水に溶解せられた。
ポリアデニル酸化（ポリ（Ａ）　ａ　ＲＮＡは、マニア
ティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら前述文献ｐ１９７に記載
されたオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラム（ファルマシ
アファインケミカル）上で全ＲＮＡ　２■を２度通過さ
せて調製された。ポリ（Ａ）”　ＲＮＡはエタノールで
２度沈澱され、水２００μｌに溶解された。生成量は２
６０ｎｍのＯＤから測定された所、約２６μｇであった
。
２．３　Ｌニブ土上夏坦製 Ｅ、テネラのメロゾイトは、−羽につきｓｏ、ｏｏｏの
前述胞子形成接合子嚢で感染後５臼目に、５０匹の感染
ニワトリ（３週令、ヒュバードクロス、トリ（アビアン
）サービスフレンチタウム、　ＮＪ）の盲腸から得られ
た。
盲腸は取り出され、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）でマグ
ネチックスターラーを用い１５分間洗浄された。
上皮破片は、低速度遠心分離により部分的には除去され
、粗メロゾイトは２０００ｘｇ　４°ＣＩＯ分間の遠心
分離により回収された。沈澱は、溶解バッフｙ　　　　
（８，２９ｇ／　ｌ　　　ＮＨ４Ｃｌ、　０．３７２ｇ
／　ｌ　　　Ｎａｚ　　ＥＤＴＡ。
、０ｇ、／ｅ　ＫＣＯｔ、　ｐＨ７，６）に再懸濁され
、氷上で３０分間培養された。
メロゾイトは、遠心分離により回収され、ＰＢＳで一度
洗浄され、分離用ロート中に紡糸ナイロンファイバー（
スクラブナイロンファイバーフェンウオールシラバラト
リーＵ、Ｓ、八、イリノイ州、ディアフィールド）Ｉｇ
を含有するカラムを通過させられた。メロゾイトは前述
のように、遠心分離で回収され、ＲＮＡ単離のためにド
ライアイス上で凍結されるか、または更にジエチルアミ
ンエチルセルロース（ＤＥＡＥ、　　ワットマンＤＥ５
２　、　ワットマン。
ｔｌ、ｓ、Ａ、ニューシャーシー州、クリフトン）中で
ウェスタンブロンド分析のために精製された。
ＤＥＡＥセルロースでの精製のため、約１×１０９のメ
ロゾイトがＰＢＳ中で１０厩のベット容量のカラムにか
けられ、ＰＢＳで溶出された。メロゾイトは、最初の１
００ｍｆｆ１の実質的に赤血球や他の細胞破片のない、
溶出液中に回収された。
２．４　　メロゾイトｍＲＮＡの１ １×１０９〜Ｉ　ＸＩＯ”の個体を含有する冷凍メロシ
イＩ・ペレットは１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ
）及び３００単位のＲＮａｓｉｎ　（プロメガバイオチ
ック。
マジソン、ウィスコンシン、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を含有ス
るＴ　Ｅ　Ｌ　／　Ｓ　ＯＳバッフｙ−（０，２Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ、　０．１Ｍ　ＬｉＣｌ２５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、　１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ
Ｓ）　、　ｐｌ（８，８）　１０１１！ｉ中へ溶解され
、テフロンコートされたｍ織ホモゲナイザー中で１０−
１２ストロークでホモゲナイズされた。不溶破片は、冷
却下３０００　ｘ　ｇで遠心分離により分けられた。上
清液体は置バッファーで平衡化されたフェノール：クロ
ロフォルム：イソアミルアルコール（２４：２４：Ｌｖ
／ｖ）で２回で抽出された。
水相は、ブロティナーゼＫ　１０００μｇ／戚で３７°
Ｃ３０分間消化（分解）され、同量のフェノール：クロ
ロフォルム（１：１）で再抽出され、核酸は２倍容量の
エタノールでドライアイス上で１時間、又は−２０°Ｃ
で一晩で沈降された。ペレット（沈澱）は、１０．ＯＯ
ＯＸｇ　１時間の遠心分離後、ＴＥ　（１０ｍＭＴｒｉ
ｓ、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁され
、２０時間１５°Ｃで１５０．ＯＯＯＸｇで４ｒｎｉの
ＣｓＣ１クツション（５，７Ｍ　ＣｓＣ１，０，１Ｍ　
ＥＤＴＡ）を通し回転された。
ＲＮＡの沈澱は０．２Ｍ酢酸カリウム溶液から２．５倍
容量のエタノールで再沈降された。この全ＲＮＡはアユ
アティス前述文献Ｐ１９７に記載されたようにポリ（Ａ
）”　ＲＮＡを濃縮するためにオリゴ−ｄＴセルロース
上を一度通過させられた。典型的には、５×１０″のメ
ロゾイトからの全ＲＮＡ、９１１１ｇの産量には、約２
０μｇのポリ（Ａ）”　ＲＮＡを含有している。
２重鎖ｃＤＮＡは、胞子形成している接合子嚢ポリ（Ａ
）”６μｇから、グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）　らにより
Ｇｅｎｅ　２５：２６３（１９８３）に記載された方法
で、オリゴ（ｄＴ）プラノマーから伸長させるための逆
転写酵素（ＢＲＬ）及び相補鎖を合成するためのＥ、Ｃ
ｏ１１　ＤＮＡポリメラーゼＩ　にューイングランド　
バイオラブズ）を用いて、合成された。２末鎖ｃＤＮＡ
はＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）で非付着性プラン
ト末端化され、そしてＥｃｏＲＩメチラーゼにューイン
グランド　バイオラブズ）で処理後ＥｃｏＲＩ　リンカ
−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ，コラボレーティプリサーチ）が
、製造元のプロトコールにしたがって、付加された。
このようにして調製されたｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで（切
断）消化した後、ヒュン（Ｈｕｙｎｈ）らによりデイ−
・グローバー（Ｄ、Ｇｌｏｖｅｒ）　Ｗ　ＤＮＡクロー
ニング巻１、実際的アプローチ、１９８５、ＩＲＬプレ
ス、ワシントン、　Ｄ、Ｃ，ｐ４９−７８に記載された
ように、λｇｔｌｌ　（ストラジーンクローニングシス
テムズ、サンジエゴ。
カリフォルニア、Ｕ、Ｓ、Ａ、）中にライブラリーが調
製された。ＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩで
分解（切断）し、脱リン酸化したλｇｔｌｌの腕（スト
ラタジーンクローニングシステムズ）へ結合（ライゲー
ト）された。得られたＤＮＡはＧｉｇａｐａｃｋ■キッ
ト（スラタジーンクローニングシステム）で、製造元の
プロトコールにしたがい、ファージ中ヘバッケージされ
た。
得られたライブラリーは、Ｙ１０８８の宿主細胞（ＡＴ
ＣＣＮα３７１９５）上でブレーティングすることによ
り増幅させられた。組換えの比率は、（マニアティス、
前述文献、ｐ２４）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ、シグマケミカルＣｏ、）の存
在下で、Ｘ−ｇａｌプレート上で青と無色のプラークの
比から約９０％と見積られた。
メロゾイトポリ（Ａ）”　ＲＮＡの２末鎖ｃＤＮＡのコ
ピーは、実質的には、上述のように合成された。変性ゲ
ルでの移動から判断して〔ベイゾー（Ｂａｉｌｅｙ）ら
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７０ニア５（１９７６））
　、ライブラリーの構築に用いられた２末鎖ｃＤＮＡは
約２００〜４　、５００塩基対を含む。
メロゾイトｃＤＮＡはメチル化されＣＣＧＡＡＴＴＣＧ
Ｇリンカ−（コラボレーティプリサーチ）が用いられた
点を除いては、先述のように、ＥｃｏＲＩ　リンカ−へ
結合された。ＥｃｏＲＩでの分解（切断）の後、ｃＤＮ
ＡはＢｉｏｇｅｌ　Ａ−５０Ｍ中で過剰のリンカ−分子
、及び約３００ｂ、　ｐより小さいｃＤＮＡを除去する
ためにＨｕｙｎｈ　らの前述の文献に記載されたように
、分画された。
ｃＤＮＡはλｇｔｌｌの腕へ結合され、先述のように、
上記ＤＮＡは、ファージへパッケージされた。得られた
ライブラリーは、約ｓｏ、ｏｏｏのファージを含んでお
り、Ｙ１０８８宿主細胞上でブレーティングすることに
より増幅させられた。ＩＰＴＧ存在下でのＸ−ｇａ！プ
レート上でのプラーク分析により約９０％の組換えが示
された。
３、ｃＤＮＡ−イブ−１−の　　　　スク１−ニングλ
ｇｔｌｌメロゾイドｃＤＮＡ発現ライブラリーは、１５
０ｍｍプレートあたり１０．０００プラークの濃度でＹ
１０９０細胞（ＡＴＣＣＮα３７１９７）上ヘプレート
された。
６枚の上記プレートは、４２℃で３．５時間培養され、
β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の発現を誘導するため
に、あらかじめ１０ｍＭ　ＩＰＴＧに浸たされたニトロ
セルロースフィルターで重層され、３７°Ｃで更に４〜
５時間から１晩培養された。フィルターは、プレートか
ら取り除かれＴＢＳ　（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８
，０゜０．５Ｍ　ＮａＣ１）で数回のバッチ式洗浄に付
された。
非特異的な蛋白質結合部位は、２０％牛脂児血清含有Ｔ
ＢＳで４°Ｃでロータリーシェーカー上で２〜４時間培
養することでブロックされた。
メロゾイト抗原と反応することが公知の９種のモノクロ
ーナル（７Ｄ４．７０、２０Ｃ６，１３Ａ６．２０Ｃ１
゜１１８６、３八５．１３ＡＩ及び１５８２と命名）の
ための腹水がプールされ、最終容量１００ｄ中に２０％
ＦＣ３，０，１５Ｍ　ＮａＣ１となるよう調整され、ペ
トリ皿あたり２フイルターの割合で、ペトリ皿中の各々
のフィルターに注がれた。フィルターは、−次モツクロ
ーナル抗体プールと４°Ｃで一晩ロータリーシェーカー
上で培養された。非結合抗体は、室温で、ＴＢＳでフィ
ルターを５〜６回洗浄することにより除去された。結合
抗体は、ホークス（Ｈａｗｋｅｓ）ら、Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ　皿１４２（１９８２）に記載されたよ
うに、フィルターをホースラディシュペルオキシダーゼ
（ＨＰＯＤ）Ｐａ合（ベーリンガーマンハイム）抗−マ
ウスヤギ抗体とフィルターを培養し、次に３　ｍｇ　／
　ｍＲのべ−クロロ−１−ナフトール（バイオランド）
及び０．０１８％Ｈ２０□を用い発色させることにより
検出された。
初期の高濃度スクリーニングで同定された陽性プラーク
は、同じモノクローナル抗体プールを用いる２次スクリ
ーニングでプラーク精製された。
各々の陽性のものは、陽性のものを多重グリッドアレイ
にプレートし、その各々がＩＰＴＧで誘導され、ニトロ
セルロースに移され、上記プールからのモノクローナル
抗体の一つと培養された。λｍ２−４と命名された一つ
の陽性ファージは、上記プール中の８つの抗体の内３つ
の抗体、すなわち７０１抗体、７Ｄ４抗体及び２０Ｃ６
抗体により認識されると同定された。
最初のスクリーニングには、６Ａ５．７Ｂ２．１５Ａ３
゜及び２０Ｃ６抗体を含むモノクローナル抗体を用いら
れ、２次スクリーニングでは、７Ｂ２．１５Ａ３．２０
Ｃ６゜及び８＾２が用いられ、１５Ａ３．７Ｂ２及び２
０Ｃ６が３次スクリーニングでは用いられ、培養バッフ
ァーが更に０．０５％のｔｗｅｅｎ−２０（ポリオキシ
エチレン（２０）ソルビタンモノラウリル酸）を含有す
る点を除いて、胞子形成接合子嚢ｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングにも同様な方法が用いられた。このよ
うにして、λ５１−３、λ５１−４及びλ５ｌ−７；　
　λ５２−１、λ５２−４及びλ５２−５；並びにλ５
３−１と命名された。それぞれモノクロール抗体６Ａ５
．８Ａ２及び７Ｂ２により認識されるプラークが接合子
嚢のｃＤＮＡライブラリー中に同定された。６Ａ５抗体
と反応する蛋白質を産生するファージから作られたＤＮ
ＡがＥｃｏＲＩによる消化（切断）及びアガロースゲル
中での電気泳動（マニアテイス（Ｍｇｎｉａｔｉｓ）ら
、前述文献ｐ１５０）により分析された。はぼ１１５０
．８９０及び６１５の塩基対のサイズを持つ３つの異な
る挿入部がこのようにして発見された。
４、　　　　　でのアイメｉア（ＥＩＭＥｆｌｌＡ　’
　　　の里 ファージλ５１−７とλ５１−３からの、ＩＫｂと０．
９ｋｂＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ分子がそれぞれ分離され、そ
して３つの可変読み枠発現ベクター、すなわちｐＥＶ−
νｒｆｌ、ｐＥＶ−ｖｒｆ２及びｐＥＶ−ｖｒｆ３、の
それぞれのＥｃｏＲＩＯ部位に挿入された。これらのベ
クターはＧｅｎｅ　３８：３１（１９８５）にＣｒｏｗ
　１等によって述べられているようにして組み立てられ
た。両方の可能な方向づけでそう入物を含むプラスミド
が、Ｂｅｒｎａｒｄ等によって述べられている（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８　：　４
８２（１９７９）　）適合するプラスミドｐＲＫ２４８
ｃｌｔｓを保持する大腸菌株ＭＣ１０６１中に、Ｍａｎ
ｄｅｌ等によって述べられている（Ｊ、Ｍｏ、Ｂｉｏｌ
、　５３：１５９（１９７０）：ｌようにしてトランス
フオームされた。菌株ＭＣ１０６１とプラスミドｐＲＫ
２４８ｃ　Ｉ　ｔｓはＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ
ｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅＧｏ　ｌ　ｌｅｃ　ｔ　１ｏｎ
）に寄託されておりそれぞれ受は入れ番号ＡＴＣＣ３３
７６６及び５３３３８が付与された。
細菌のトランスフォーマント　（形質転換体）は０．５
％のグルコースと０．５％のカザミノ酸を含有する旧培
地（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、上記、６８ページ］中３０゛
Ｃで生育させられ、λＰＬプロモーターでの転写を誘発
させるために、Ｃｒｏｉｍｌ等、上記、によって述べら
れているように０．Ｄ、　（５５０ｍμ）が０．５の時
点で４２゛Ｃに変えられる。２〜３時間の培養（ｉｎｃ
ｕ−ｂａｔｉｏｎ）の後、ｌ！ｎｉの試料を取り、そし
て試料中の細胞は遠心分離により集められた。細胞のベ
レフトはＣｒｏｗｌ等、上記、によって述べられている
ように取り扱われ、そのリゼートはＬａｅｍｍｌｉ等、
Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０）、によって
述べられているようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ
）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。電気
泳動に続いて、ゲル中の蛋白質はクマシー（Ｃｏｏｍａ
ｓｓ　ｉｅ）ブリリアントブルーで着色されたか、又は
６Ａ５モノクロ一ナル抗体及びヤギ抗−マウスＨＰ　Ｏ
Ｄコンジュゲート（Ｃｏｎ、ｉｕｇａｔｅ）を検出のた
めに使用する、ウェスタン・プロット分析（Ｔｏｗｂｉ
ｎ等、Ｐｒｏｃ　。
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　ヱ６：　　４
３５０（１９７９）；　　Ｂｕｒｎｅｔｔ、１Ａｎａ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２　：１９５（１９８１）：ｌ
のための二Ｉ・ロセルロース膜に移された。
この分析は、ベクターｐＥＶ−ｖｒｆｌ中の１方向での
０、９　ｋｂ　ｃＤＮＡ分子が６Ａ５抗体と反応する２
０ｋｄの蛋白質を生産するということを示していた。、
１Ｊｂ分子に関しては、それが多分５′側をコードして
いない（５”ｒ＋□ｎｃｏｄｉｎｇ）配列を含んでいる
ためであるが、発現は観察されなかった。この蛋白質の
生産を最も効果的にするために、種々の発現培地が試験
された。より好適な培地はリットル（±１０％）当り　
ＫＨ２ＰＯ４６，Ｏｇ、　ＫＪＰｏ、４．０ｇ、　　（
ＮＨ４）２ＳＯ４５、Ｏｇ、　ＭｇＳＯ４−７８２０３
，５ｇ、　　酵母抽出物２、０ｇ。
バタトトリプトン（Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　
３．５　ｇ＋　ＬＢ６２５アンチフオーム（Ａｎｔｉｆ
ｏａｏ＋）　、０　ｍ１’、グルコース２５ｇ、チアミ
ン−〇ＣＩ　？Ｏｎｔｇ、　　ビタミン溶液（ＧＩＢＣ
ＯＭＥＭ　（１００Ｘ）ビタミン溶液）２．５ｄ及び微
量元素１、　Ｏｒ／１１、を含有していることが明らか
となった。
Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅの製品であるＬＢ６２５ア
ンチフオームは３７．８°Ｃで６２５セイボルトユニバ
ーサルセコンド（Ｓａｙｂｏｌ　ｔυｎ１ｖｅｒｓａｌ
　５ｅｃｏｎｄｓ）の粘度を有するエチレンとポリプロ
ピレンオキサイドの線状ポリマーである。
発酵ブロスｌリットル当りのビタミンはＤ−Ｃａパント
テン酸塩、塩化コリン、葉酸、ニコチンアミド、ピリド
キサール−〇ＣＩ及び付加的なチアミン−）ＩｃＩのそ
れぞれ０．２５■；ｉ−イノシトール０．５０■：及び
リボフラビン０．０２５■を含有していた。プロスリッ
ター当りの微量元素は、ＦｅＣ１ｇ−６ＭｇＯを２．７
ｍｇ：Ｚｎ５Ｏａ−７Ｈ２ＱとＣｕ５０４−５１２０の
それぞれを０．８ｍｇ；ＣｏＣ１ｇ−６ＨｚＯとＮａｔ
Ｍ００４−２）１ｚＯのそれぞれを０．７ｍｇ；Ｈ３Ｂ
Ｏ３を０．２．　ｍｇ　；そしてＭｎ５Ｏ４−ｔｈｏを
０．５　ｍｇ含有していた。
ファージλｍ２−４によって発現された免疫反応性（ｉ
ｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）　蛍白質の性質は、許容
（３０°Ｃ）及び非許容（４２°Ｃ）温度での差別的な
生育によって、Ｙ１０９０細胞の感染から分離されたラ
イソジェン（ｌｙｓｏｇｅｎ）中においてまず、研究さ
れた。このライソジェンによって合成された蛋白質のウ
ェスタン・プロット分析のために、５０成の培養物（ｃ
Ｂｌｔｕｒｅ）はＬＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、上記
、６９ページ）中、３０℃で０．０．　（５５０ｍ　ｕ
　）が０．５になるまで生育させられ、ファージの複製
を誘発するために４２°Ｃに変えられた。４２°Ｃで１
５分後、ＩＰＴＧを１０ｍＭになるように加え、培養を
３７°Ｃで３０分間継続した。
細胞は４°Ｃで遠心分離によって集められ、そしてＬａ
ｅｍｍｌｉの試料緩衝液（０，１２５Ｍ　）リス、ｐＨ
６，８，１％（ｗ／ｖ）　５ＩＩＳ、　、４Ｍ　β−メ
ルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブル
ー（Ｗ／Ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中、５
分間煮沸することによって分離させられた。
培養物の、０　ｄの同等物が１２．５％５Ｏ９−ポリア
クリルアミドゲル中で電気泳動法によって分析され、電
気泳動法的にニトロセルロース移行させられそして、λ
ｍ２−４ファージを確認する３つのモノクローナル抗体
（７０１，７Ｄ４及び２０Ｃ６）のプールを上記したよ
うにしてプローブ（ｐｒｏｂｅ）させた。ウェスタンプ
ロットの発展は、誘導したライソジェン（第１０図、パ
ネルＢ、レーン２）中に存在する１５０ｋｄサイズより
も大きい融合蛋白質を明らかにした。
β−ガラクトシダーゼに特異的な抗体もまたこの高分子
量の蛋白質と反応し、そして約１１４ｋｄの蛋白質；す
なわち、β−ガラクトシダーゼのみの期待されるサイズ
（第１０図、パネルＡル−ン２）である、に反応を示し
た。
ファージλｍ２−４　ＤＮＡはＥｃｏＲＩで消化され、
、７ｋｂ　ＤｌｌｔＡ分子が生成した。この分子は、プ
ラスミドｐＥＶ−ＶＲＦＩ、２及び３　（Ｃｒｏｗｌ等
、上記〕を含有するＥｃｏＲＩ−線状化プラスミドプー
ル中にサブクローン化され、そして、上記したようにし
て、′プラスミドＰＲＫ２４８ｃｌ　ｔｓを含む大腸菌
菌株ＭＣ１０６１中に形質転換させられた。形質転換体
は、λｍ２−４ライソジェン中、融合蛋白と反応するこ
とが示された３つのモノクローナル抗体のプールを使用
して、温度誘発での免疫反応性の蛋白質の発現に対して
、選抜させられた。免疫反応性の組換え蛋白質は更に、
大腸菌溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）のウェスタンプロット
分析により、３つのモノクローナル抗体の１つ、すなわ
ち７０４をそのプールから用いて特徴づけられた。陽性
のコロニーのそれぞれがＳＯ３−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動分析によって決定されるように、望みの、７
　ｋｂ挿入物を有すプラスミドＤＮＡを含有しているこ
と、及び誘発に基づく約６５ｋｄの蛋白質の合成を命令
していることがわかった。
この６５ｋｄ蛋白質の発現は生育培地及び誘発のための
プロトコール中、変化に対して比較的非感受性であるこ
とがわかった。この蛋白　質は、細胞ペレットの音波粉
砕のあとで表面部 （ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）中で定量的に回収された。
、７ｋｂの挿入物を含む発現プラスミドは、組換え蛋白
質（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の後の
生産に使用された。そして、第１１図に図式的に示され
ている。このプラスミドは、λｃ１８５７　（Ａｒｂｅ
ｒ等、１ｎＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｍ
ｏｎｏｇｒａｐｈ、Ｌａｍｂｄａ　ＩＬ１９８３、Ｈｅ
ｎｄｒｉｘ等＋Ｅｄｓ、＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［
（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ、。
ｒｉｅｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ、
ｐ４５０、によって示されているようにλファーシライ
ソジエンの発生に対する標準方法を用いることによって
調製される）に対し温源性（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ）であ
るＭＣ１０６１宿主細胞中で、３０°Ｃでプラスミド中
のＰＬプロモーターの抑制状態を維持するために増殖さ
せられた。
同様な方法を用いて、約、１ｋｂを有する胞子分裂する
（ｓｐｏｒｕｌａｔｅ）接合子嚢（ｏｏｃｙｓ　ｔ）の
ｃＤＮＡの断片によって、コードされた２８ｋｄ蛋白質
の発現が行なわれた。この蛋白質はモノクローナル抗体
８Ａ２に特異的に接合する。約、２　ｋｂの胞子分裂す
る接合子嚢のｃＤＮＡによってコードされた４５ｋｄ蛋
白質の発現も又実施された。この蛋白質はモノクローナ
ル抗体７Ｂ２に特異的に結合する。
５、　助＋七た近 一般的に、標準の一晩の培養物の１戚からのプラスミド
ＤＮＡの小規模の分離はＢｉｒｎｂｏｉｍ等（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７　：　１５
１３（１９７９）　：ｌの操作を用いて行なわれた。こ
の操作は分析目的のために細菌のコロニーからの小量の
ＤＮＡの分離を考慮に入れている。プラスミドＤＮＡの
より多量のものは、塩化セシウム遠心分離によって、標
準プロトコールの後に１１培養物を用いて調製される。
（Ｍａｒｌｉａｔｉｓ等、上記、９３ページ〕。
胞子分裂する接合子嚢ライブラリーからのｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａ　ｓのＤＮＡ配列は、スミス等、Ｃｅ１ｌ旦：　７５
３（１９７９）及びＷａｌｌａｃｅ等、Ｇｅｎｅ旦５　
：　２１　（１９８１）によって、２重らせんプラスミ
ドＤＮＡが修正されたとおりに、Ｍａｘａｍ等、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５：４９９
（１９８０）、の化学的開裂法によって、またＳａｎｇ
ｅｒ等、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓａｉ、ｔｌＳＡ　７４：５４
６３（１９７７）　、の鎖−終結方法によって決定され
た。鎖終結のためのプロトコールにおいて、７−ジアザ
−ｄＧＴＰ　（Ｂａｒｒ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ　］：４２８（１９８６））は、Ｇ−Ｃの圧縮加工物
（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を除
去するために、ｄＧＴＰで置換させられた。
配列分析を容易にするため、λ５１−７からの、１ｋｂ
　ＢｃｏＲＩはプラスミドｐＥν３−５ＥＱ　（第１２
図）に移された。このプラスミドはｐＥＶ−ｒｖｆ３の
ＥｃｏＲＩ部位に隣接するポリリンカーを有している。
このポリリンカーは、エキソヌクレアーゼ■で一方向の
削除を生じさせるためにＢａｍ１ｌｌ　とにｐｎ１部位
でプラスミドを線状化するために使われた（Ｈｅｎｉｋ
ｏｆｆ。
Ｇｅｎｅ　２８：３５１（１９８４））　、ポリリンカ
ー中のＸｂａ１部位は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔの
削除の配列化に適する３′−末端のラベル化のために使
用される。そして、ブライマーＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧ
ＡＧＣＣＡはサンガーの配列化のために用いられた。こ
のブライマーは、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、上記、１２２ペ
ージ、によって述べられているように、〔γ”Ｐ　）　
ＡＴＰ（ＩＣＮ）とポリヌクレオチドキナーゼを用いて
その５′末端を３！Ｐでラベルされた。
第１３図は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉ　１ｂｅｒｔ配列化のた
めに使用する、、１　ｋｂ　ＥｃｏＲ１分子中の制限部
位を示している。０．９ｋｂ分子中のＥＣＯＲ１部位の
位置もまた示されている。それは、これらもまた使われ
るからである。エキソヌクレアーゼ■で作られた削除の
末端の点もまた示されている。これらは、ＭａｘａｍＧ
ｉｌｂｅｒｔ法によるｐＥＶ３−ＳＥＱポリリンカー中
のＸｂａ１部位からのか、又はＳａｎｇｅｒ法による、
ブライマーの伸長（第１２図）を用いて、配列化された
。完全なｃＤＮＡの両方のスタンド（ｓｔａｎｄｓ）　
は、これらの方法の１又は両方によって、配列化された
。ＤＮＡ中の高いＧ−Ｃ含有量のために、Ｍａｘａｍ−
Ｇｉｌｂｅｒｔ反応は通常、８％と１５％のポリアクリ
ルアミド−尿素ゲルで分画させられた。
ブライマーの伸長は、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡの、５．μ
ｇを、５′−末端をラベルした合成オリゴヌクレオチド
ブライマー、ＧＡＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣ、の
２己虹匹とともに、４２°Ｃで６０分間、Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ　５０ｍＭ、　ｐＨ８，０＋Ｍｇ５Ｏ１８ｍＭ、　
ＮａＣ１０，ＬＭ、　　ジチオトレイトール２ｍＭ、そ
れぞれのデオキシヌクレオチドトリリン酸（ｄＮＴＰ、
　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
）の２１ＩＩＭ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉ
ｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）　２０単位及びＡＭ
Ｖ逆転酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｔｍ
ａｙ、ＮＪ、　ＦＰＬＣｐｕｒｅ）　２０単位、中でイ
ンキュベートすることによって行なわれた。生産物は、
配列分析のために用いられる８％アクリルアミド−尿素
ゲル中で、分子サイズマーカーとして３２ｐ−ラベル化
のＨｐａ　Ｉ　Ｉ消化ＰＢＲ３２２ＤＮＡを用いて、分
析された。
配列分析のために、最初の生産物はゲルから溶出させ、
Ｍａｘａｍ等、上記、の化学的開裂法によって分析され
た。または、ｄｄＮＴＰｓが伸長反応において、使用さ
れた。（Ｔｏｌａｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｆｆｉ、
２５９：１１２７（１９８４）　、Ｇｒａｖｅｓ等、Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｇｆｉｌ　：　１１４０９（１
９８６）　）。反応は８％ポリアクリルアミド−尿素ゲ
ル中で分析された。
１、１　ｋｂ　ｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は第１
４図に示されている。０．９ｋｂ分子の配列は、塩基１
８Ｂから塩基１０８２まで、この、より大きい分子内で
伸長する。このヌクレオチド配列の開放読み枠（ｏｐｅ
ｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｎ＋ｅ）分析から予測される
アミノ酸配列は、第１５図に示される。第１５図に示さ
れる予測されるアミノ酸配列の正確さは、次のようにし
て確認された。
第１５図の残基４１−５４と１４５−１６４に対応する
アミノ酸配列を有する、合成ポリペプチドが調製された
。これらのポリペプチドの両方に対して集められた（ｒ
ａｉｓｅｄ）ウサギ抗血清が、全スポロゾイト蛋白質と
０．９　ｋｂ　ｃＤＮＡを発現する大腸菌のリゼートの
両方のウェスタンプロット分析において使用された。そ
のポリペプチドの両方に対する抗体が、ウェスタンプロ
ットの両者において蛋白質に結合した。
同様な方法を用いて、ファージ７ｍ２−４中に６５ｋｄ
の蛋白質をコードする１、７ｋｂ挿入物のヌクレオチド
配列が、第１６図に示される結果を用いて決定された。
このＤＮＡ配列によってコードされた蛋白質の予測され
たアミノ酸配列が第１７図に示されている。この配列は
、下記のようにして、発現された６５ｋｄ蛋白質のトリ
プシン消化によって製造されたポリペプチドに対して行
なわれたアミノ酸配列分析によって確認された。これら
のペプチドの幾つかに対応する全部のアミノ酸配列中の
領域が第１７図でアンダーラインされている。
奇妙ながら、、７　ｋｂ分子に対する、ＤＮ＾配列配列
開放枠は、約３３，３４９ダルトンの蛋白質をコードし
ていることが期待されそうである。然し、このＤＮＡ断
片からの発現生産物は、約６５ｋｄの明らかな分子量に
よってＳＯＳゲル中を移動する。予測されたものを観察
された蛋白質サイズの間の、この相違の理由はわかって
いない。この蛋白質は、ここではｒ　６５ｋｄ　Ｊ蛋白
質と呼ぶ。
同じような態様で、モノクローナル抗体８Ａ２によって
認識された２８ｋｄ蛋白質をコードするｃＤＮ八分への
ヌクレオチドと予測されたアミノ酸の配列が、第１８及
び１９図において、それぞれ示される結果によって決定
された。
同じように、、２　ｋｂ　７Ｂ２　ｃＤＮＡのヌクレオ
チドと予測されたアミノ酸の配列が決定された。連続す
る開放読み枠が見つかり、スポロゾイトから免疫沈降に
よって分離された蛋白質が２００ｋｄよりも大きかった
ことから、プローブとして、、２　ｋｂｃＤＮ＾を用い
、そのライブラリーは、より大きいｃＤＮＡｓに対して
ふるい分けられた。
このようにして第２０図及び２１図にそれぞれ示される
ヌクレオチドと予測されるアミノ酸の配列とを有してい
る、３．２　ｋｂ　ｃＤＮＡが得られた。
６、　６５ｋｄ　　　　　　の　　　と６．１　　Ｉｎ
１■盪製 ｐＥＶ／２−４発現プラスミドを有する大腸菌ＭＣ１０
６１（ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ）の高細胞濃度発酵が、ｉ
ｏｚ発酵槽で、、５ＸＭ−９培地中において、許容され
る温度で約４時間の生育の後、上記したようにして、温
度誘発の標準プロトコールを用いて、行なわれた。細胞
塊は誘発の後５時間収穫され、細胞ペース）　５００ｇ
をもたらした。
大腸菌細胞ペースト５０ｇがＴｒｉｓ−ｔｌｃｌ　１０
ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭ、　ｐＨ８，０の５０Ｍ中に均一
に懸濁させられ２時間２−８°Ｃで撹拌させられた。
懸濁液は、ガラリン（Ｇａｕｌｉｎ）ホモゲナイザ−（
ＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ、Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ）を７．０００　ｐｓｉで
２〜３回通過させた。細胞リゼートは、ツルパル（Ｓｏ
ｒｖａｌｌ）ＲＣ−５遠心分離機で１時間２４．０００
Ｘｇで遠心分離した。そして、そのベレットは捨てた。
面形の硫安が上清液（最終濃度８０％）になるよう加え
られた。これは、４　”Ｃに２時間保たれ、２４．００
０　Ｘ　ｇで１時間遠心分離させられた。
そのベレットは２０ｍＭリン酸カリウム＋ｐＨ６，Ｌ　
中に溶解させられた。遠心分離後、上清液は２０ｍＭ’
Ｊン酸カリウム、ｐＨ６，８，に対して透析させられた
。
ファーマシアグラスカラム（５ｃｍ直径Ｘ１０ｃｍ長さ
）は、Ｐ−ＤＥ２００　＠　（２００オングストローム
、４〇−６０μｍ、弱アニオン交換、５ｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ。
Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、　ＮＪ）シリカ支持体で詰められた
。ゲルは２０ｍＭリン酸カリ、ｐＨ６，８，で平衡にさ
せられた。
試料が加えられ（１０ｍ／ｍ１ｎ）　、平衡緩衝液で洗
浄させられ、０．４　Ｍ　ＮａＣ１，ｐ）１６．８　、
を含有する２０ｍＭリン酸カリで溶出させられた。カラ
ム分画は、６５ｋｄ蛋白質を検出するために抗体７Ｄ４
を用いてウェスタンプロットによって分析された。
免疫アフィニティカラムが、６５ｋｄ蛋白質を更に精製
するために使用された。二〇カラムのための吸収剤は、
モノクローナル抗体７Ｄ４をＮｕＧｅｌ　Ｐ−ポリアル
デヒド＠（５００オンゲスＩ〜ローム、４０−６０　ｐ
　ｍ。
５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＋　Ｍｅ
ｔｕｃｈｅｎ、　Ｎｅｗ　ＪｅｒｓｅｙＵ、Ｓ、Ａ、）
　シリカ支持体上に固定化することによって調製された
。固定化の操作は次の工程を含む；ポリアルデヒド支持
体１０ｇが懸濁化され、０．１Ｍリン酸カリ、　　Ｏ，
ＩＭ　ＮａＣ１，ｐ）ｉ６．８で洗浄され、８ｍｇ　／
　ｒｎｉの蛋白質濃度に対してモノクローナル抗体２０
ｍ１を含むエレンマイヤーフラスコに定量的に移した。
ソディウムシアノーブロハイドライド（Ｓｏｄｉｕｍ　
ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）　（４ｍｇ）がそ
の後懸濁液に添加された。混合液は４°Ｃで、１６時間
ゆっくり振られた。ゲルは濾過され０．１Ｍ　リン酸カ
リウム、　Ｏ，Ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ６，８、で洗浄
された。プールされた濾過物は、結合していない抗体が
調査された。結合密度（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｅｎｓｉｔ
ｙ）は支持体の８　ｍｇ／ｇであった。結合していない
活性化部位は、そのゲルを１Ｍエタノールアミン、ｐＨ
７，５の２０戒中に懸濁させることによって封鎖された
。ソディウムシアノボロハイドライド（Ｓｏｄｉｕｍ　
ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）（４■）が懸濁液
に加えられ、それは４°Ｃで１６時間撹拌された。ゲル
は集められ、冷却カップリング緩衝液で徹底的に洗浄さ
れた。
免疫アフィニティクロマトグラフを行なうために、カラ
ム（１ｃｍ　Ｘ　１０ｃｍ）は固定化した７Ｄ４抗体で
詰められ、０．１％トライトン（Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ）　
Ｘ−１００を含有する冷却リン酸緩衝化含塩物（ｂｕｆ
ｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で平衡化された
。６５ｋｄ蛋白質を含有するＮｕＧｅｌ　Ｐ−ＤＨ２０
００カラムからの分画物のプールは、０、１％トライト
ン（Ｔｒｔｔｏｎ）Ｘ−１００を含有するＰＢＳで２倍
（２×）に希釈され、１０　ｙｄｌ　／　ｍ　ｉ　ｎの
流速でカラムに加えられた。加えた後、ゲルは結合して
いない物質を除くためにＰＢＳで洗浄された。吸着した
免疫反応性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）物質は、
０．３門酢酸、　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ２，７
、の緩衝液で溶出させられた。蛋白質はその後ＹＭＩＯ
膜（Ａｍｉｃｏｒ＋＋　Ｄｉｖ、Ｗ、Ｒ。
Ｇｒａｃｅ　＆Ｃｏ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）を使用するアミコンスチ
ルセル＠　（Ａｍｉｃｏｎ　５ｔｉｒｃｅｌｌ）装置、
で濃縮された。
蛋白質の純度は、Ｌａｅｍｍｌｉによって述べられてい
る（ＮａｔｕｒｅＪＬ２１：６８０（１９７０）　）よ
うに、ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっ
て決定された。ゲルはクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓ　ｉｅ
）ブルーで着色させられた。又、ウェスタンプロット分
析は、７Ｄ４モノクロ一ナル抗体をヤギ抗−マウス西洋
ワサビバーオキシダーゼコンジエゲート（Ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ）とともに用い、実施された。結果は第２２図に
示されている。レーン２．３．４及び５は２つの調製物
からの精製蛋白質を含有している。レーン１及び６はそ
の図面の左及び右に示された分子量を有する分子量マー
カー蛋白質の混合物を含んでいる。
蛍白質の１０マイクログラムがそわぞれのレーンに流さ
れた。
第２２図において、精製された蛋白質が、ＳＤＳゲル中
を約６５ｋｄの明らかな分子量を有する主要なハンドと
して、より高いまたより低い移動度を有する小さいバン
ドと共に移動していくということがわかる。
６．２　　等里立夏決定 精製した６５ｋｄ蛋白質の１０マイクログラムは、ＬＫ
ＢＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、八、　から得られる予め
形成された等霊的集中化（ｉｓｏｅｌｅｃ−ｔｒｉｃ　
ｆｏｃｕｓｉｎｇ）ゲル中で等電集中化（ｆｏｃｕｓｉ
ｎｇ）を受けた。既知の等電点を有する標準蛋白質の混
合物が同時に通過させられた。ゲルは、３．５−９．５
のｐＨ勾配で製品説明に従って５０ｍＡ、　１，５００
Ｖで約２時間の間通過させられた。
電気的集中化（ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）の完
了の後、そのゲルは蛋白質のバンドの検出のためクマシ
ー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー染色液で着色された。
精製された蛋白質の等電点は、標準蛋白質の位置との関
係でｐｔｔ勾配内でのバンドの位置を測定することによ
って決定される。このようにして°決定されたその蛋白
質の等電点は４．６であった。
６．３　　ヱｌム酸組底立灰 アミノ酸組成分析は、Ｐａｎ等、蛋白質微小特定記述の
方法において（ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎＭｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）
　１９８６．５ｈｉｖｅｌｙ、ｅｄ、、ＴｈｅＨｕｍａ
ｎａ　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐｐ、１０５−１１９＋によって
記述されているように、フルオレスアミン（ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃａｓ＋１ｎｓ）との次のカラム反応を用いて行な
われた。６５ｋｄ蛋白質の３μｇを含む試料は、４％チ
オグリコール酸を含む、６ＮＨＣ１中で、２０〜２４時
間、真空中で加水分解させられた、そして加水分解物の
１０％が分析のために使用された。システィン値は過蟻
酸（ｐｅｒｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ）酸化の後で決定さ
れた。結果は第３表に示されている。
（本頁以下余白） ５ＫＯ 皇」Ｌ聚 白　のアミノ　組 １」−θ喪 ｓｐ ｈｒ ｅｒ １ｕ Ｐｒ。
ｔｙ ｌａ ｙｓ ａ１ ｅｔ ｉｅ ｅｕ ｙｒ ｈｅ ）Ｉｔｓ ｙｓ ｒｇ ｒｐ ＮＤ−未決定 モルバーセント ロ、０６ ６．０７ ７．２７ １８．２４ ３５ ６７６ １７１ ４．４５ ８８ ０Ｂ ２．１７ ２２ ２０ ２．１３ 、０７ ７２ ３．６１ ＮＤ ６．４Ｎ−びＣ−ｒｆｉｌ＼ 蛋白質の２００ピコモル（アミノ酸組成分析によって決
定されたとおりに）は、Ｈｅｗｉｃｋ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ
。
Ｃｈｅｍ、３ｊｆｉ　：　７９９０（１９８１）　、の
方法と、応用バイオシステムモデル４７０Ａシークエン
サー（八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。
ｓｙｓｔｅｍｓ＋Ｉｎｃ、、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、［１，Ｓ、Ａ、）を用いてＮ−
末端分析を、受けた。このようにして決定されたＮ−末
端配列はＭ−Ｎ一に−Ｎ−３−？−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−？
−８−トＱ−Ｈ−Ｓ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−であった。疑問符に
よって指示された位置でのアミノ酸残基の正体は、ＰＴ
ＨＣｙｓの収量が少なかったため不確実である。そして
、システィン残基はジスルフィド結合に含まれる［Ｈｅ
ｗｉｃｋ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５６　ニ
ア９９０　（１９８１）　）。
Ｃ末端分析は、）ｌａｙａｓｈｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ４７　：　８４　（１９７７
）　、によって述べられているように、時間コース（ｔ
ｉｎｇｅ　ｃｏｕｒｓｅ）カルボキシペプチダーゼＹ消
化によって、６５ｋｄ蛋白質の１２００ピコモルに対し
て行なわれた。カルボキシペプチダーゼＹ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ、ＩＮ）は、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、Ｐ
Ｈ５，９中０．８μｇ／３５０μ２の濃度で使用された
。そして、試料分画（ａｌｉｑｕｏｔｓ）が分析のため
、０，２，５，１０．２０及び３０分後に採取された。
試料分画（ａｌｉｑｕｏｔｓ）は−層進む反応を停止さ
せるためＨＣＩで酸性化され、その後前記のようにして
アミノ酸分析を受ける。この分析は、Ｃ−末端でのアミ
ノ酸配列は多分（Ｍｅｔ。
Ｔｒｐ）−Ａｌａ−３ｅｒであることを示していた。ト
リプトファンはメチオニンと共に、同時に増加すること
が観察された。しかし、Ｔｒｐは、それがフルオレスア
ミンと低い反応性を有するので、フルオレスアミン（ｆ
　ｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）分析器で定量することは
困難である。それ故、ＴｒｐとＮｅｔの相対位置はこの
分析による確実性によって決定はできない。
６・５　１プシンベブ　・＼ ６５ｋｄ蛋白質をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配
列から予測されるアミノ酸配列を一部分確証するため、
幾らかの蛋白質がトリプシン（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏ−
ｍｅｄｉｃａｌ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐｅｎｎ
５ｙｌｖａｎｉａ、υ、Ｓ、Ａ、）で消化された。そし
て、生成したペプチドは下記のようにして配列が決めら
れた。
トリプシン消化物は、０．２Ｍ重炭酸アンモニウム（ａ
ｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、　ｐＨ８
、中の蛋白質１４８μｇに対して、１８３０（重量又は
モルベース）の酵素対基質比を用いて、３７°Ｃで一夜
行な、った。
このようにして生成したペプチドは、０．１％（基準）
トリフルオロ酢酸中増加するアセトニＩ・リルのＯから
５５％の勾配によって、Ａｌｔｅｘ　ｕｌｔｒａｓｐｈ
ｅｒｅ２５０Ｘ４．６ｍｍ　Ｃ−１８カラム（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ　ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＦｕｌｌｅｒｔｏｎ、
　Ｃ＾）を使用する、水ＨＰ　Ｌ　Ｃシステム（ａＷａ
ｔｅｒｓ　ＨＰＬＣｓｙｓｔｅｍ）において分離させら
れた。
ＨＰＬＣ分離の前に、消化物はペプチド中のジスルフィ
ド結合をいずれも破壊するために、３７°Ｃで３０分、
β−メルカプトエタノールで還元させられた。カラム流
出液は実験室データ制御検出器（Ｌａｂｏｒａ　ｔｏｒ
ｙＤａｔａ　　ＣｏｎｔｒｏｌＪｉｖｅｒａ　　Ｂｅａ
ｃｈ、Ｆｌｏｒｉｄａ、　　　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を使用し
２１５ｍμで監視された。ＨＰＬＣカラムは、第２３Ａ
図に示されるように、８″つの主要ピークに分解した。
それぞれのピークは、ペプチドの量と組成の両方を決定
するために、上記したようにアミノ酸分析によってまず
第１に分析された。その後、１（ＰＬＯカラムからのペ
プチドのピークの殆んどは、応用バイオシステムモデル
４７０Ａガス相シークエンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｎｓ　Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａｇａｓ　ｐｈａ
ｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を使用し、自動化エドマン分
解によって配列が決められた。フェニルチオヒダントイ
〉′（ＰＴ）Ｉ）アミノ酸誘導体は、Ｈａｗｋｅ等、（
Ａｎａｌ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　１２０　：　３０２（
１９８２）　）　、によって述べられているＡｌｔ、ｅ
ｘ　ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ　Ｃ−１８カラムを使用す
る、水ＨＰＬＣシステム（ａ　Ｗａｔｅｒｓ　ＨＰＬＣ
ｓｙｓｔｅｍ）で、または、応用バイオシステムモデル
（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ）
　１２０Ａ、オンラインＰＴＨアミノ酸分析機において
、確認された。
これらのペプチドの幾つかのアミノ酸配列は、第１７図
の下線を入れた領域に示されている。これらのペプチド
のそれぞれの数（ＦＩＰＬＣビーク数に対応する）は、
対応する配列のそばに丸で囲んで示しである。ペプチド
配列中の残基の幾つかの正体（ｉｄｅｎｔｉ　ｔｙ）の
不確実さは、ペプチドのアミノ酸組成分析が予想配列の
対応位置に表示されたアミノ酸がペプチド中に存在する
ということを示してはいるけれども、それらの位置に疑
問符によって表示されている。ペプチド残基の幾つかの
正体（ｉｄｅｎｔ、１ｔｙ）の不確実さは、フルオレス
アミン（ｆｌｕｏｒｅｓ−（ａｍｉｎｓ）とのトリ１Ｉ
・ファンの低反応性のためであった。
完全な６５ｋｄ蛋白質のＮ−末端に対応している、ペプ
チド６は、発現プラスミド中にヌクレオチドによってコ
ードされているＮ−末端に４残基を含有している。ペプ
チド８の分析は、ペプチド３のアミノ酸配列に頻イ以し
ているが、しかし４Ｃ−末端残基を欠いているアミノ酸
配列を明示しており、それは多分不完全なトリプシン消
化の結果であるということを示唆している。ペプチド５
は、このペプチドのアミノ酸組成分析がペプチド６と同
様であるが、Ｎ−末端の最初の３アミノ酸が足りないと
いうことを、それが示しているために、配列が決められ
ていない。
前記したように、しかし前のメルカプＩ・エタノール還
元は行なわないで実施されたトリプシン消化物のＨＰＬ
Ｃ分析は、ピーク４．７及び８が存在しない（第２３Ｂ
図）溶出のプロフィール（輪郭）を明示した。この観察
は、システィン−含有ペプチドが還元されていない蛋白
質において多分ジスルフィド結合形成に巻き込まれ（ｉ
ｎｖｏｌｖｅ）ているということを示唆している。
７、塞皇夏灸疫１（Ｐｏｕｌｔｒｙ　ｉｍｍｕｎｉｚａ
ｔｉｏｎ）７．１　　区Ｕ拉厘企使■ 精製した組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）　６５ｋ
ｄ蛋白質の投与がアイメリアテネラ（Ｅｉｍｅｒｉａ　
ｔｅｎｅｌｌａ）胞子分裂する接合子嚢（ｓｐｏｒｕｌ
ａｔｅｄ　ｏｏｃｙｓｔｓ）によるチャレンジに対して
鶏（ｃｈｉｃｋｅｎｓ）を保護できるかどうかを決定す
るために、一連の免疫にする実験が行なわれた。これら
の実験において、１日〜３週の年令のレグホン鶏（Ｌｅ
ｇｈｏｒｎ　ｃｈｉｃｋｅｎｓ）（＾ｖｉａｎＳｅｒｖ
ｉｃｅｓ、　Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ
ｓｅｙ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）が清潔な室に置かれ、そして
、チャレンジの時期まで他の鳥類と接触していない看護
人（ａｔｔｅｎｄａｎｔｓ）によって世話をされた。鳥
類は、それらが３又は４週の年令になるまで電気的に加
熱された、ひな保育箱（ｂｒｏｏｄｅｒ）のかご中に置
かれた。その後、成長させる鳥かご（ｇｒｏｗ−ｏｕｔ
　ｃａｇｅｓ）に移された。
薬を混入されていないブロイラーのスターター飼料及び
水が実験全体にわたって随意に供給された。
接合子嚢（ｏｏｃｙｓ　ｔｓ）のチャレンジの時点で、
鳥は実験の終りまで置かれる他の建物に移された。動物
の治療状況は、免疫にする前は一週間に少なくとも３回
、そして免疫の後は毎日を標準として検査される。鳥は
、色ルな試験グループに任意に割り当てる前に、３〜４
週の年令で翼のバンドによって個々のものが確認された
。
前記したように、免疫アフィニティクロマトグラフィー
によって精製された６５ｋｄ蛋白質の色々のロフトが免
疫原として使用された。免疫原のこれらのロットは、Ｕ
ｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ
＋　’２１ｓｔ　Ｒｅｖｉｓｉｏｎ、１９８５．Ｕｎｉ
ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ。
Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｃ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、　Ｍｄ、、ｐｐ、１１５５−１１６７゜において述
べられているようにして決定され定義された活性につい
ては、蛋白質のμｇ当り約０．３から約５０エンドトキ
シン単位の範囲にある細菌のエンドトキシン活性を含有
していた。その蛋白質は使用前に０．０２Ｍ　ＫｚＨＰ
Ｏａ緩衝液、ｐＨ６，８に溶解させられ、そして必要と
するときに同じ緩衝液で希釈させられた。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｐｅｎｔｅｘ）が対照と
して使用された。使用された免疫原にピロゲン活性が存
在していたために、このような活性の凡そ等量が、この
活性のためかもしれないどんな非特異的な影響も明らか
にする（ａｃｃｏｕｎｔ　ｆｏｒ）ために、全てのＢＳ
Ａコントロールに対して加えられた。このピロゲン活性
は、大腸菌を高周波音分解により崩壊することにより、
そしてその後０．４５μミリ細孔（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）フィルターを通して、その物質を濾過することにより
調製された非形質転換大腸菌すゼートの形態でＢＳＡに
添加された。
コントロールＢＳＡの希釈試料又はアイメリア（Ｅｉｍ
ｅｒｉａ）抗原はアジュバントの等量と合せられ投与の
前に１８ゲージ針を備え付けた、ガラスシリンジで完全
に混合された。　Ｆｒｅｕｎｄの完全なアジュバントと
不完全なアジュバントとは、それぞれ最初でかつ補助注
射（ｂｏｏｓ　ｔｅｒ）の免疫化に使用された。両方の
アジュバントは、ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ
ｄ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｕ、Ｓ、＾、、から入手され
た。
最初の免疫は、鳥が４週年令のとき、首の基部で体の背
部に皮下で行なわれた。幾らかの鳥は６週の年令で、補
助注射（ｂｏｏｓ　ｔｅｒ）の免疫も受けた。
注射された物質の量は約０．４〜２．４ｒｒｄｌの範囲
であった。より多い量では、投薬量（ｄｏｓｅ）は２回
の注射に分割された。最後のワクチン注射の後２〜３週
間、鳥は経口的に与えられた、Ｅ＋　ｔｅｎｅｌｌａの
２５．０００又はｓｏ、ｏｏｏの胞子分裂した接合子嚢
ｐｏｒｕｌａ−ｔｅｄ　ｏｏｃｙｓｔ）でチャレンジさ
れた。感染の後の７日で、生き残った鳥は犠牲にされ、
死体解剖され、そして全部の病変に対して採点された。
実験中に死んだ全ての鳥もまた死体解剖された。診断が
なされ、腸の病変は０＝＝正常、■＝わずかな病変（ｉ
ｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ）　、２　＝適度の病変（ｉｎｆ
ｅｓｔａｔｉｏｎ）、３−猛烈な病変及び４＝死、のよ
うに採点された。
得られた表示は、鳥のグループごとに対し感染の平均程
度としてまとめられた。鳥は又感染の時点と感染後７日
日に重量が測られた。幾つかの鳥はＢＳＡ又はコシシア
ル（ＣＯＣＣｉｄ　ｉａ　ｌ）抗原でワクチン注射され
ていないが、感染又は非感染のワクチン注射されていな
いコントロールとして取り扱かわれた。
２つの実験の結果を第４表に示す。
（本頁以下余白） 第　　４　　表 遺伝子組み換えによる６５キロダルトンの精製抗原で１
回しくは２回　下にワクチンを　　されたヒナトリの　
　の各週令における接種 体重 発病度の　増／減 ＩＵＣ 八ｎｔｉｇｅｎ Ａｎｔｉｇｅｎ ＢＳＡ ＩＵＣ ＩＵＣ Ａｎｔｉｇｅｎ Ａｎｔｉｇｅｎ ＢＳＡ ［ＩＵＣ ３，１５ １２，２５ １７，５ ３，１５１，６ １７，５１３，２ １２，２５１３，２ 一太一験−ｌ ＩＵＣ Ａｎｔｉｇｅｎ　　　　　　４ Ａｎｔｉｇｅｎ　　　　　２０ Ａｎｔｉｇｅｎ　　　　１００ ＢＳＡ　　　　　　　１００ ＩＵＣ Ａｎｔｉｇｅｎ　　　　　　４ Ａｎｔｉｇｅｎ　　　　　２０ Ａｎｔｉｇｅｎ　　　　１００ ＢＳＡ　　　　　　　１００ ＪＵｃ ａ、　ＩＩＪＣ，Ａｎｔｉｇｅｎ、　ＢＳＡ、　ＵＵＣ
は、各々、　（のう胞体を）感染させた免疫していない
対照区、精製された分子量６５キロダルトンのタンパク
、ウシ血清アルブミン、感染させておらず免疫してもい
ない対照区、を示す。
ｂ、実験１においては、最初のワクチン接種をしてから
３週間後のヒナトリに胞子形成されたＥ、　ｔｅｎｅｌ
ｌａののう胞体５０．０００個を投与した。また、追加
のワクチン接種を行ったヒナトリについては、該（２回
目の）接種を行ってから２週間後に２５＋０００個のの
う胞体を投与した。実験２では、のう胞体投与の時期は
実験１と同様であるが、−次接種したヒナトリ、追加接
種をも行ったヒナトリともに２５，０００個ののう胞体
を投与した。各実験において感染させた非免疫対照区を
設け、同じ生育段階において、即ち屠殺の７日前に、胞
子形成されたのう胞体を各々一定数ずつ投与した。結果
は、ｔｅｘ　を記載のように、０−４の得点に基づいて
いる。
Ｃ１数値は、ヒナトリの球出（のう胞体）感染時の体重
と、感染時より７日後の体重の差を示す。
ｄ、この区では当初、ヒナトリを９個体用いたが、１週
間後２個体が死亡した。
ｅ、ＩＵｃと比較してＰ≦０．０５ 第４表のデータは、分子ｆｆ１６５．ｏｏｏのタンパク
で免疫しておくと、ＩＵＣ区と比較して一般に病変の度
合が減少したことを示している。実験１においては、追
加のワクチン接種がなされた２つの処理区（表中のｅ）
のヒナトリには、統計上有意な発病度の減少がみられた
。他の区では、これほど大きな発病度の減少はなかった
が１、それにもかかわらず、ワクチン接種されたヒナト
リにおいては、概して体重は増加した。
二度目のワクチン接種が、抵抗力をさらに高めるのか否
か明らかにするため、実験が行われた。
（即ち、）ヒナトリ８個体からなる各（処理）区につい
て、ワクチン接種なしで感染させた、または感染させな
い対照区を設けたり、もしくはＢＳＡやメロゾイト（分
裂小体）のタンパクを、３週令及び５週令、または３．
５．７週の各段階において接種したりした。最初の２回
のワクチン注射にはフロイントの完全アジユバントを用
いて行った。
３回目を行うときは、フロイントの不完全アジュバント
を用いた。接種は前記したように皮下（注射）で行われ
た。
最終接種から２週間後、ヒナトリ各々にＥ。
ｔｅｎｅｌｌａの胞子形成されたのう胞体２５．０００
が投与された。各ヒナトリの体重を、めう胞体投与時と
その１週間後、即ち層殺して病変度スコアをはかる時点
で測定した。結果を第５表に示す。
（本頁以下余白） ａ、　ＩＵＣ，Ａｎｔｉｇｅｎ、　ＢＳＡ、　ＵＵＣは
、各々、　（のう胞体を）感染させた免疫していない対
照区、精製された６５キロダルトンのタンパク、ウシ血
清アルブミン、感染させておらず免疫もしてもいない対
照区、を示す。
ｂ、最後のワクチン接種から２週間後、Ｅ、　ｔｅｎｅ
ｌｌａの胞子形成されたのう胞体２５，０００をヒナト
リに投与した。対照区のヒナトリは２回免疫用、３回免
疫用のものは感染させた時点でそれぞれ７週令、９週令
であった。結果は、テキスト記載のように、０−４まで
のスコアに基づいている。
Ｃ０数値は、ヒナトリの感染時の体重と、感染時より７
日後の体重の差を示す。
第５表のデータは、３回のワクチン接種により、抵抗力
は増強されなかったことを示す。ｃｅｃａｌ病変度の減
少によって示されるように、ＩＵＣ区もしくはＢＳＡ接
種区と比較して、抗原投与区のヒナトリにはより強い抵
抗力が与えられた。
皮下注射以外の投与経路を採用することで、さらによい
結果が得られるものか否か明らかにするため、分子量６
５キロダルトンのタンパク注射の２回分の量を２週間間
隔で、３週令のレグホン種ヒナトリ８個体ずつに対し、
皮肉、皮下、筋肉内、経口、肛門という各々の経路で３
回投与した。最終抗原投与から２週間後、Ｅ、　ｔｅｎ
ｅｌｌａの胞子形成されたのう胞体２５．０００を各区
のヒナトリに経口で投与した。さらに１週間の後、各ヒ
ナトリを層殺し、病変度のスコアを測定した。
皮下注射は前述と同様に行った。筋肉内注射は左腿部外
側の深部に行った。皮下注射は右翼前方部に行われた。
経口投与は長さ５ｃｍ、１８ゲージのポールチップ型の
針を用いて行い、注射物を螺のう部に蓄積させた。肛門
部からの投与には５ｃ＋ｎ。
１８ゲージのオリーブチップ型の針を用いて、排出腔を
開いた状態で針を最大限に挿入して行った。
経口投与、もしくは肛門投与後は、各々ヒナトリを数分
間、立たせておくか逆さにしておくかした。
これは、接種物が体外に放出されてしまうのを防ぐため
であった。
皮下注射に際しては、投与物の形態は上述と同様、　（
即ち、）１次注射にはフロイントの完全アジュバントを
、追加注射にはフロイントの不完全アジュバントを用い
た。他の投与経路の場合の投与形態は、規定量のタンパ
クを含む０．０２Ｍ　ｐＨ６，８のリン酸水素二カリウ
ム緩衝溶液とした。結果を第６表に示す。
（本頁以下余白） ａ、　ＩＬＩＣ，Ａｎｔｉｇｅｎ、　ＢＳＡ、　ＩＩＵ
Ｃは、各々、　（のう胞体を）感染させた免疫していな
い対照区、精製された分子量６５キロダルトンのタンパ
ク、ウシ血清アルブミン、感染させておらず免疫もして
いない対照区、を示す。ＳＣ，ＩＭ、　Ａ、　０．　Ｉ
Ｄは、各々、投与経路として皮下、筋肉内、肛門、経口
、皮膚内を示す。
ｂ、ワクチン接種区のヒナトリについては、最終接種か
ら２週間後、■ＵＣについては、屠殺の７日前に各々２
５，０００のＥ、ｔｅｎｅｌｌａの胞子形成されたのう
胞体を投与した。これら■ＵＣ対照区のヒナトリは、感
染時（のう胞体投与時）９週令であった。結果は、テキ
スト記載のように、〇−４の得点に基づ（ものである。
Ｃ９数値は、ヒナトリの球史感染時の体重と、感染時か
ら７日後の体重の差を示す。
ｄ、Ｉｔｌｃ　と比較してＰ＜０．０５第６表の結果は
、抗原５μｇを経口投与したヒナトリ及び同２５μｇを
皮下投与したヒナトリの病変度のスコアが最も少ないこ
とを示している。これらの結果は統計上有意であった。
その他の投与経路をとった場合でも、また、上記と異な
る投与量でも、ｃｅｃａ　１病変度の減少が見られ、抵
抗力が生じる傾向にあることが示唆された。しかし、こ
れら（試験区の）値とＩＯＣ区の値との間には、有意な
差はみられなかった。
上述の実験において、抗原（ワクチン）投与量と、それ
に対する反応に一次的な相関関係がみられなかったが、
これは、６５キロダルトンの抗原中の微量の夾雑物質及
び／または発熱物質含有量の差違に起因するものである
か、あるいは他の要因によるものであろう。
７．２　　　クシニアベク　一による　クチン本発明に
おいて、ヒナトリをＥ、　ｔｅｎｅｌｌａ由来の抗原で
免疫する、より効果的な免疫方法を開発するため、モノ
クローナル抗体６Ａ５　（１４図）により認識される分
子量２０．０００のタンパクをコードする１、１ｋｂの
ｃＤＮＡ、及び、モノクローナル抗体８＾２（１８図）
によって認識される分子量２８．０００のタンパクをコ
ードしている１、１ｋｂのｃＤＮＡを種痘ウイルス内で
クローン化して、ヒナトリに対するワクチン接種に用い
た。詳細は以下に述べた通りである。
？、２．１　−’：ｌｊ上づ旧几製 すべての組み換え体は、Ｍａｃｋｅｔｔらによって述べ
られている（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ　７９ニア４１５（１９８２）　）ような、ウィ
ルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）部位での相同的遺伝子
組み換えに基づくものであった。該ＴＫ部位は、種痘ウ
ィルス由来の（遺伝子であって）ＨｉｎｄＩ［［による
Ｊ断片上に位置づけられており、また、その断片の塩基
配列が一部明らかにされている（Ｗｅｉｒ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４ｆｉ：５３０（１９８３）　）
。
ベクター調製のため、種痘ウィルスの旧ｎｄｕＩによっ
てできるＪ断片を、ｐｕｃ８　　（第２４図ａ）でサブ
クローン化した。この構造物質をＨｐａ　ｎで切断した
。得られた断片を大腸菌のＤＮＡポリメラーゼのフレノ
ウフラグメント　（フレノウ）で処理し、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで再び分解して、ウィルスのＴＫ遺伝子をもつ断片を
ｌｏｗ　ｍｅｌｔｉｎｇアガロースゲルから分離した。
分離した断片を、ｐｕｃ　８ベクター（第２４図ｂ）の
旧ｎｄＩ［Ｉ認識部位と鈍角をなす端部（Ｓｌ処理によ
る）のＥｃｏＲＩ認識部位に連結した。次に、１１ｉｎ
ｄＩ［Ｉにより分解されたＤＮＡをフレノウ処理し、ベ
クターフラグメントを再連結することによって、Ｈｉｎ
ｄＩＩ［認識部位を除去した。種痘ウィルスプロモータ
ー（７，５にプロモーターといわれている）を挿入する
ため、該ベクターをＣ１ａＩ及びＥｃｏＲｒで切断した
。
Ｖ、Ｖ、由来の７．５にプロモーターは、そのウィルス
ＤＮＡの５ａｌｌにより得られる遺伝子フラグメントの
中でも最小のものの１つの上に位置している（Ｖｅｎｋ
ａｔｅｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　２５：８０
５（１９８１））　６該フラグメントをＭ１３ｍｐ８　
（第２４図ａ左）に組み込んでクローン化した。クロー
ンは、転写方向がＭ１３ｍｐ８　（第２４図ａ左）のＥ
ｃｏＲＩ認識部位に向かうように選択した。このＤＮＡ
を５ｃａＩ、　ＳｍａＩで切断し、Ｂｇｌ　Ｉｆの認識
するリンカ−を加えて再連結した（第２４図ｂ）。ウィ
ルスプロモーター断片を含むＥｃｏＲＩ−Ａｃｃｌによ
る断片を、Ｍ１３構造物質から単離して、上記のｐｕｃ
８−ＴＫ断片に連結し、ベクターｐＵｃ８−ＴＫ−７，
５Ｋ”を得た。この新ベクターをさらにＢｇｌｌｌ及び
ＥｃｏＲＩで分解した。
多様なりローニング部位をもつベクターを開発するため
、上記の構造物に適当なポリリンカーを挿入した。この
目的のために、Ｍ１３ｔｇ１３１（＾ｍｅｒｓｈａｍ）
（第２４図ｄ）中のポリリンカーが選ばれた。該ファー
ジＤＮＡをＢｇＩ　ｎ及びＥｃｏＲＩに分解することに
よりポリリンカーフラグメントを単乱し、前記ｐｕＣ８
−ＴＫ−７，５Ｋ”　ニ挿入して、最終的ニｖ、ｖ、内
テノ外来抗原の遺伝子組み換えのための基本となるベク
ター、即ちｐｕｃ８−ＴＫ−７，５Ｋがつくられた。
モノクローナル抗体８Ａ２と結合する２８キロダルトン
のタンパクをコードする遺伝子のＥｃｏＲＩによってで
きるフラグメントには、該タンパクのＮ末端部分をコー
ドする塩基配列は含まれていない。
本来の返還開始コドンが失われている。
この欠失部位を補うため、２つの異なる構造を作製し、
発現を試験した。まず、第１の構造として、形式上の開
始コドンは、前記基本ベクターｐＵｃ８−ＴＫ−７，５
Ｋ（第２４図Ｃ）中のポリリンカーを一部削除すること
により得られた。　（即ち、）該ベクターをＥｃｏＲＶ
及びＳｍａ　Ｉで分解し、ポリリンカーの一部を除去し
てから（第２４図ｄ）、連結させた。
この操作によって、ｓｐｈ　Ｔの認識部位上に含まれる
ＡＴＧコドンは、ＥｃｏＲＩ断片上ののう胞体由来のタ
ンパクコード領域を正しく読みとれる位置に設けられた
。（また、）この操作がうま（いったことは、新しくで
きたポリリンカーの遺伝子断片の塩基配列を調べること
によっても確認された。こうしてできた塩基配列により
コードされるタンパクの予想アミノ酸−次構造を第２５
図Ａに示す。
開始コドンのみでなく、欠失しているリーダー部位をも
補うため、ＥｃｏＲＩによる遺伝子断片をマラリア抗原
のリーダ一部位の後のｃｏｒｒｅｃｔ　ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ内につけた。リーダ一部位単離のために採用
されたマラリア抗原は、Ｒｏ−３３（Ｃｅｒｔａ　ｅｔ
　ａｌ、。
ＥＭＢＯＪ、　　６：４１３７（１９８７）　）として
記載されているような１９０キロダルトンのタンパクで
あった。しかし、原虫類由来のリーダ一部位のような、
他のリーダ一部位を同じ目的に利用することはできなか
ったということを記しておかねばならない。
リーダ一部位を含むＤＮＡ断片を単離するため、Ｒｏ−
３３ＤＮＡをくまず）　Ｄｒａｌで分解した。　（次に
、）Ｐｖｕ　ＩＩ及び１（ｉｎｄｌの認識部位をもって
いる断片を分離し、さらに、）ｌｉｎｄＩ［Ｉで分解し
た。本発明独自のベクターｐＵｃ８−ＴＫ−１，５Ｋ　
（第２４図Ｃ）を５ａｌＩで切断し、フレノウフラグメ
ントと共に処理してから１１ｉｎｄ［［で分解した。次
いで、このベクターフラグメント内に、［１ｒａｌ−Ｉ
Ｈｎｄ　ＩＩＩによる断片から単離したマラリア抗原の
リーダ一部位をクローン化した。
こうしてできた構造物を、Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ１１
由来の１９０ｋｄタンパクと、モノクローナル抗体８Ａ
２によって認識されＥｃｏＲＩによる遺伝子断片により
コードされているＥ、　ｔｅｎｅｌ　Ｉａの抗原との融
合タンパクを発現するために用いた。該融合タンパクの
、予想されるＮ末端−次配列を第２５ｍ８に示す。
（上述のように、）２８にダルトンのタンパクをコード
する、ＥｃｏＲＩにより得られた断片を、基本ベクター
（第２４図Ｃ）内のポリリンカー上のＥｃｏＲＩによる
認識部位に組み込んでクローン化した。また、該断片を
正しい向きに組み込んだ構造物を増殖させ、種痘ウィル
スの遺伝子組み換えに用いた。
該（ＥｃｏＲＩによる）フラグメントを翻訳するための
翻訳開始部位を基本ベクター内に組み込んだやり方から
、組み換えにＶ、ν、より発現するタンパクのＮ末端−
次構造には、異なる２種類のものがあることが予想され
た。　（第２５図）考えられる第１の一次構造において
は（第２５図Ａ）、オリジナルの配列に３個のアミノ酸
（Ｍｅｔ、　Ａｒｇ、　Ｔｒｐ）が付加されただけのも
のだが、予想されるもう１つの一次構造においては、１
９０ｋｄのマラリア抗原のリーダー配列由来の、全部で
４７個のアミノ酸が、モノクローナル抗体８Ａ２（第２
５図Ｂ）により認識されるポリペプチドのＮ末端に付加
している。該リーダー配列部位がもつ解裂部位のプロセ
ッシングによって、そのうちの１９のアミノ酸が除かれ
、Ｎ末端からＶａｌ＋Ｔｂｒ、　１（ｉｓで始まる成熟
タンパクとなる。
ＥｃｏＲＩによって切り出された、モノクローナル抗体
６Ａ５により認識される２０にダルトンの方のタンパク
をコードする遺伝子断片は、完全な塩基配列を含んでい
る。該フラグメントは、補足的な操作なしで、上述のよ
うにしてＶ、Ｖ、ベクターのＥｃｏＲＩ認識部位に組み
込まれてクローン化された。
球出由来の抗原をコードする上記遺伝子の組み換えによ
る一株のＷＲＶ、Ｖ、の調製は、組み換えウィルスの選
別のための２つの過程を通してなされた。
まず、サルＣＶＩ細胞を、培地Ｉ　　（Ｅａｇｌｅ’ｓ
　ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｃｌｉｕｍ
　（ＭＥＭ）、５％ウシ胎児血清（Ｆｅ２；Ａ…ｉｍｅ
ｄ）　、ペニシリン／ストレプトマイシン（各々１００
ｕｎｉｔｓ／戚、１００μｇ／成）、２叶グルタミンＧ
ｉｂｃｏ　］中、８ＣＩｆ！培養プレートで８０〜９０
％に集密的になるまで培養した。培地を除去し、０．１
プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）／細胞濃度の、温度感受性
の種痘ウィルス株ｔｓＮ７　（Ｄｒｉｌｌｅｎ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１３１　：３８５（１９８３
）　）を含むウィルス懸濁液で置きかえた。プレートを
室温下で１時間おいてから、培地２成を加え、３３’Ｃ
（このウィルスの生育許容範囲）で２時間、ＣＯｚイン
キュベーター内で培養した（Ｘｉｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：１６３（１９８４）　）。
上記培養が終了する１時間半前に、ＤＮＡを含むリン酸
カルシウム沈澱物を調製した。これは、ＨｅＢ５１ｉ衝
液（２８０ｍＭ　ＮａＣ１，１，５ｍＭリン酸水素ナト
リウム、５０ｍＭ　）ＩＥＰＥｓ）　、２００ｎｇの精
製ＷＲＶ、Ｖ、のＤＮＡ、及び球出由来の抗原をコード
する遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ　２００ｎｇを含み
、全体量を０．５５−とした、　ＤＮＡは各々１μ℃の
ＴＥ１１衝液（１０ｍＭ　）リス−塩酸、　ｐＨ７，５
，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に加え、これニユるやかにゆすり
ながら、０．５５ｍの２５０ｍＭ塩化カルシウムを滴加
した。この混合液は、室温で２０分間放置した。
２時間の培養終了後、プレートの培地を吸引し、上記の
ＤＮＡ含有カルシウム沈澱物０．２５ｍｆにおきかえて
、室温下に１時間放置した。この後、培地Ｉを各々２戚
ずつ加えて、３９．５°ＣＸＣＯ２濃度５％のインキュ
ベーターで２時間培養した。（Ｋｊｅｎｙ　ｅｔａｌ、
　、　５ｕｐｒａ）。この温度下では、ｔｓＮ　７ウイ
ルスは複製され得す、少なくともｔｓ７部位で組み換え
が起こったウィルスが選別される。リン酸カルシウムは
、結果的には細胞の生育を阻害するので、２時間の培養
後、培地を除去し、細胞を各回ｌＩｎ１のＰＢＳでゆる
やかにゆすりながら３回洗浄した。３回目の洗浄用ＰＢ
Ｓを吸引した後、培地Ｉを２Ｉｄずつ各プレートに加え
、ＣＯ□インキュベーター内で３９．５°Ｃの下２日間
培養を続けた。
２日間の培養後、培養プレート、を、培地及び細胞ごと
一３０°Ｃで短時間処理し、さらに解凍した。
プレート底部にまだ付着している細胞をはがし、この懸
濁液を前述のように超音波処理した。このホモジェネー
トを第２の選別段階に供した。
本段階では、８ｃｉ！プレート内でほぼ集密的に近い生
育をしているヒト１４３８７に細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　
８３０３）から培地を除去して、そのままか、もしくは
、ＰＢＳで１：５または１　：　３０（ｖ／ｖ）に希釈
した上記ホモジェネート０．２１ｄでおきかえた。Ｔ）
［−細胞のウィルス感染を、室温下に１時間進めた。
前記培養後、０．１■／ｉのブロモデオキシウリジン（
ＢｕｄＲ，Ｓｉｇｎ＋ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、
）を含む半固体培地■〔培地■に非必須アミノ酸（Ｇｉ
ｂｃｏＨ注文番号０４３−１１４０）　、必須ビタミン
（ＧｔｂｃＯ；注文番号０４２−１１２０）　、１％ア
ガロースを加えたもの）２ｄを細胞に加え、プレートを
３７°Ｃ下で１６−２４時間、ＣＯ。
インキュベーター内で培養した。これに０．２％の中性
赤を含む上記半固体培地■に重層し、さらに１６−２４
時間培養した。すると明瞭に目視確認できる無色のプラ
ークが現れるから、このプラーク領域をパスツールピペ
ットで吸引する（プラーク精製）ことによって、クロー
ン性のウィルスが生じた。このようにして生じせしめた
ウィルスは、上記ＣＶＩ細胞を宿主として培養し、１４
３Ｂ　ＴＫ−ｃｅｌｌ上で第２．第３段階のプラーク精
製に供された。
このようなプラーク精製過程を経たウィルスを上記のよ
うに培養し、精製した。
組み換えウィルスにより原虫抗原が発現されるか否か調
べるために、組み換えウィルスに感染した細胞を、卓上
遠心機（Ｈｅｔｔｉｃｈ　Ｍｉｋｒｏｒａｐｉｄ　Ｋ。
１００％３分間、２０°Ｃ）で遠心し、ペレットをＰＢ
Ｓで２回洗浄してから再び遠沈し、ＰＢＳに再懸濁した
。該懸濁液を、顕微鏡用ガラスプレー）　（Ｆｌｏｗ）
にのせ、乾燥させた。また、もう１つの方法として、Ｃ
ＶＩ細胞を顕微鏡用スライド（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ−Ｔ
ｅｋ４８０Ｂ）上で直接生育させ、ウィルスを感染させ
て１〜２日間培養することもできた。その後、無培地下
、ＰＢＳで細胞を洗浄し、室温で乾燥させた。
さらに、細胞を固定するため、スライドを一３０°Ｃア
セトン中に最低１時間沈めた後、室温で乾燥させた。
抗球出抗原マウスモノクローナル抗体をＰＢＳで希釈し
て、これを細胞が均等に液で覆われるようにスライド上
にのせた。このスライドを湿潤チャンバー中に３７°Ｃ
で１時間おき、続いてＰＢＳで数回洗浄した。スライド
を乾かさずに、ＰＢＳで希釈した２次抗体（ＰＩＴＣ標
識抗マウスヤギＩｇＧ、　Ｎｏｒｄｉｃ）をスライド上
にのせ、これを３７°Ｃで湿潤チャンバーに入れて１時
間おき、抗体を反応させた。ＰＢＳで数回スライドを洗
浄してから乾燥させた。こうしてできたスライドの上か
ら２０％グリセリン（ｖ／ｖ）溶液を２〜３滴ピペット
で落とし、その上にカバーガラス（Ｍｅｎｚｅｌ　２４
Ｘ６０）を上にのせた。顕微鏡下でこの試料の蛍光を、
紫外線照射下でモニタリングした。　（Ｚｅｉｓｓ　Ｉ
ＣＭ　４０５．ＦＩＯｏｒ　Ｐｌａｎａｐｏ　６３ｏｂ
ｊｅｃｔｉｖｅ） ＷＲウィルスは、はとんどあらゆる種の細胞中で増殖で
き、増殖はプラーク形成により確認できる。
しかし、多くの場合、ウィルスを多量に調製するには、
ヒナトリ胎児の線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）を用いた。
ＣＥＰ細胞を得るために、発生後１１日のヒナトリ胎児
を卵生から分離し、四段を除いて小片に切断し、０．２
５％トリプシン溶液（Ｄｉｒｃｏ）中に室温下で２時間
再懸濁した。これを１容の培地Ｉで希釈し、ｃｅｌｌ　
５ｉｅｖｅ　（Ｂｅｌｌｃｏ、１５０ｍｅｓｈ）で濾過
してから細胞を沈降させた（Ｈｅｒｍｉｅ卓上遠心機、
５分間。
２、００Ｏｒｐｍ、室温）。細胞のペレットを当初の区
の培地■に懸濁し、このＣＥＦ細胞懸濁液を培養プレー
トに注入した。培養開始時の細胞濃度にもよるが、培養
物は１〜２日生育させ、直接もしくは１−２の過程を経
た後、ウィルス感染用に供した。
このような培養細胞の確立のための要領は、Ｆｒｅｈｎ
ｅｙ、　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１
ｌｓ、　Ａｌａｎ　Ｒ，ＬｉｓｓＶａｒｌａｇ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　１９８３＋　Ｃｈａｐｔｒｅ　ＩＬ　ｐ
、９９にみることができる。
ウィルス感染のため、１７５ｃＪ培養フラスコ（Ｆａｌ
ｃｏｎ　３０２８）中で生育する８０％〜９０％集密性
のＣＥＦ細胞から培地を除去し、ウィルスを含むＰＢＳ
溶液（０，１ｐｆｕ／ｃｅ、、　Ｏ，０１ｍ１／ＣＴＡ
）中で１時間、室温下で培養した（２０°Ｃ）　（ＰＢ
Ｓ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ａｍｉｍｅｄ）。
次いで培地Ｉを添加（０，２ｄ／ｃｕｔ）　Ｉ、、３７
°Ｃで２〜３日、約８０％の細胞が溶菌するまで培養し
た。こうしてできた保存溶液は、ウィルスの精製を行う
まで、直接細胞及び培地とともに、当初の培養フラスコ
中で一３０°Ｃ下で保存した。
続いての（ウィルスの）精製工程は、宿主直に特異的な
成分をもたないウィルス調製液を獲得するために用いら
れた。−３０″Ｃで保存していたウィルス怒染後の培養
細胞を解凍し、フラスコ表面に付着している残存細胞を
、振とうしたりゆすったりして遊離させた。細胞及びウ
ィルスを共に遠沈し、培地から分離した。細胞及びウィ
ルス粒子のベレットをＰＢＳ　（ベレットの体積Ｘｌ０
−２０倍）中に再懸濁し、上記と同様にして再遠沈させ
た。こうしてできたベレットを、１０倍量のＲ５１ｉ衝
液（１０ｍＭ）リス−塩酸、　ｐＨ８，帆１０ｍＭ　Ｋ
Ｃｌ、　１　ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ）に再懸濁した。
無傷の細胞を溶菌させ、該細胞の膜よりウィルスを放出
させるために、上記懸濁液を超音波処理した（６０ワツ
トにて１０秒×２回、室温下、　Ｌａｂｓｏｎｉｃ１５
１０　ｗｉｔｈ　４ｍｍ　ｐｒｏｂｅ）。次に、コノ混
合溶液を５ｏｒｖａｌ　ＧＳＡローターで１０°Ｃ下、
３＋　ＯＯＯｒｐｍで３分間遠心分離した。このように
して、核や巨大な細胞の残骸が除去されたウィルス懸濁
液を調製した。
上清は注意深（除き、ベレッＩ・をＲＳＢ緩衝液に再懸
濁した後、超音波処理及び遠心分離を上記と同様に繰り
返した。
２回目の遠心画分の上清を最初の上清と合わせて、１０
戚の３５％ショ糖溶液の上に重層しくＦｌｕｋａ。
ｉｎ　１０ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ、　ｐＨ８，０）　
Ｋｏｎｔｒｏｎ　ＴＳＴ　２８゜３Ｂ／ＩＴ　ローター
（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　２７　ａｎａｌｏｇ）にて、
１０°Ｃ下で９０分間、１４．０００回転で遠心分離し
た。上清をデカンチーシロンし、ウィルス粒子のベレッ
トを１０成の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣＩ　ｐＨ８，０
の緩衝液に再び溶かし、超音波処理により攪拌して（上
述のように、室温で１０分間×２回）、以降の精製のた
め、ステップグラジェントにかけた。
ステップグラジェントはｐＨ８，０，１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ中に各々以下の濃度、すなわち２０％、２５
％、３０％、３５％、４０％のショ糖を含む溶液を各５
ｄずつより構成した。これをＫｏｎｔｒｏｎ　ＴＳＴ　
２８．３８／１７型ローターで３５分間、１０°Ｃ下、
１４．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。
ウィルス粒子を含む数本のバンドが３０％〜４０％ショ
、ｌｆ１度の域にみられた。グラジェント中のこの部分
を採取しく１０ｍ１り　、ＰＢＳ（２０ｄ）で希釈した
後、ウィルス粒子を沈降させた（にｏｎｔｒｏｎ　ｒｏ
ｊＱｒ＋　９０分間、１４．ＯＯＯｒｐｍ　、　１０°
Ｃ）。こうして得られたベレットは、大部分ウィルス粒
子よりなるものであった（００測定とプラークアッセイ
により判断。以下参照）。このベレットをＰＢＳに溶か
して、ウィルス濃度が平均１〜５　Ｘ　１０９ｐｆｕ　
／　Ｉｎ１となるようにした。このウィルスの５ｔａｃ
ｋは、直接そのまま、もしくはＰＢＳで希釈して用いた
。
ウィルスｓ　ｔａｃｋ中のウィルス濃度及び純度を測る
ため２つの方法を用いた。ウィルス粒子の絶対濃度は、
分光光度計で該５ｔａｃｋの００を測定することによっ
て簡便に得られた。ここで、１００／２６０ｎｍは、約
、２Ｘ１０Ｉ０粒子／ｄの濃度に等しい（Ｊｏｋｌｉ、
　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８：９（１９６２））　。また
、ウィルス濃度は、６０のウィルスのうち１粒子のみ感
染能力があると仮定して細胞上のウィルスの力価を測定
する（プラークアッセイ）ことによっても得られた。
培養細胞におけるウィルス濃度を測定するため、ＣＥＦ
細胞を培地Ｉ中で８　ｃ１ｉプラスチックプレート（Ｆ
ａｌｃｏｎ）上で生育させた。細胞が８０〜９０％の集
密性をもつに至った時点で培地を除去し、ＰＢＳで希釈
したウィルス溶液０．２−でおきかえ、室温で１時間放
置した。ウィルスの５ｔｏｃｋ　５ｏｌｕｔｉｏｎは１
０倍毎に希釈した。室温下で培養した後、２戚の半固体
培地（培地１＋１％アガロース）を各プレートに添加し
、ＣＯ８インキュベーター内で１６〜２４時間培養した
−０次いで、０．２％のｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ（Ｆｌ
ｕｋａ７２２１０）を含む半固体培地■を生細胞染色の
ために重層し、さらに１６−２４時間培養した。染色さ
れないプラークを顕微鏡下でカウントした。
？、２．２　　且ｌ」児感γ肛旋 モノクローナル抗体８＾２や６Ａ５と特異的に結合する
Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａ由来のタンパクをコードする遺伝
子をもつ種痘ウィルスベクターが、病原性のあるＥ、ｔ
ｅｎｅｌｌａ中のある株（Ｔ２−７５０／７．　Ｔ７−
７６６／１゜もしくはＴ６−７７１）の胞子形成された
のう胞体の投与に対し、　（ワクチンとしてはたらくこ
とで）ヒナトリに抵抗力を与えることができるかどうか
を明らかにするため、以下のような試験を行った。
すべての試験はｔｈｅ　ｈａｔｃｈｅｒｙ　ｔ！、Ｗｕ
ｔｈｒｉｃｈ、Ｂｅ１ｐ。
Ｓｗｉ　ｔｚｅｒｌａｎｄによって提供された。産卵鶏
品種のｃｏｃｋｅｒｅｌｓを用いて行った。Ｄａｙ−ｏ
ｌｄのヒナトリを加温したｂａｔｔｅｒｙ−ｂｒｏｏｄ
ｅｒ中で一定令まで飼育し、その後様々な試験区に分け
たり、床が針金のケージ中で胞子虫症フリーの状態で育
てたりした。
試験全般を通じて、トウモロコシ、小麦や大豆粉（粗タ
ンパク２、７％）を基本とした業務用のｂｒｏｉｌｅｒ
−ｇｒｏ鍔ｅｒ飼料を与えた。
最初の試験では、体重が同程度のヒナトリを無作為に６
個体ずつ３グループに分けた。３日後、ヒナトリに組み
換え型もしくは野生型の種痘ウィルスを懸濁液（１０Ｉ
６ｐｆｕ／　ｍｌ　ｉｎ　ＰＢＳ）として、各々５０μ
ｌずつ２回、右翼翔部皮下に注射することによって免疫
した。２種類の組み換え型種痘ウィルスを用いたが、い
ずれも、モノクローナル抗体８＾２型と特異的に結合す
るＥ、　ｔｅｎｅｌｌａ由来のタンパクをコードするＤ
ＮＡを含むものであった。該ウィルスの一方（３７Ｋ　
Ｍ３とする）は、１９０キロダルトンのマラリア抗原の
リーダー遺伝子配列を有しており、もう一方（３７Ｋ　
Ｋ３とする）は、該リーダー遺伝子配列を欠いていた。
種痘ウィルスの野生型である−８株を陰性対照とした。
第１次接種から１週間後、追加接種を一定条件下左翼惰
部に行った。ウィルスは、前回接種したものと同種のも
のを用いた。追加免疫から１週間後（５９日令時）、す
べてのヒナトリから血液を２蔵ずつ採取し、その血清画
分は、特異的な抗体が存在するため、ＥＬＩＳＡによっ
て測定した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレ
ート（ＮＵＮＣイムノプレートＦ９６）のウェルを、Ｅ
、ｔｅｎｅｔｔａのスポロゾイト懸濁液（１０，０００
ｃｅｌ　Ｉｓ　／　ｍｌ）でコーティングし、希釈率を
増したヒナトリの血清と共に培養した。検出試薬として
、抗ニワトリヤギ免疫グロブリンー西洋ワサビペルオキ
シダーゼｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　
ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、）を、基質であるテトラメチルベンジジン
とともに用いた。青色の発色をＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕ
ｌｔ４ｓｋａｎＭＣＣ／３４０　ＭＫＩＩで、測定波長
４５０ｎｍで読み取った。
抗体価は、バックグラウンドの最低２倍のＯＤを与える
血清の希釈率の逆数と定義した。
第１次注射より４週間後（７３日）、ヒナトリにｓｏ、
ｏｏｏの胞子形成されたのう胞体を投与した。投与物は
生理食塩水１ｄに懸濁し、目盛付きシリンジについてい
る鈍角な針で、螺のう内に経口的に投与した。８０日令
時、ヒナトリをすべて層殺し、解剖して、全体の病変度
を得点で評価した（Ｏ点＝正常、１点＝軽い病変、２点
＝中程度の病変、３点＝深刻な発病、４点＝胞子虫症に
より死亡）。
ヒナトリの尿は発病ｃｙｃｌｅの末ｇＪ１２日間以上定
量的に集め、糞便のサンプルにおいて、体外排出された
胞子虫の数を測定した。結果を第７表に示す。
（本真以下余白） 育し、免疫を行ったが、試験の開始はヒナトリが２２日
令のときであった。１００ｄ　ＰＢＳ中（７）２Ｘ１０
”ρｆｕのウィルスを投与した。用いたウィルスは、２
８キロダルトンのタンパクをコードするＤＮＡを有し、
マラリア由来のリーダー配列をもたないもの（３７Ｋ５
を示す）もしくはもつもの（３７Ｍ１９を示す）とは異
なるものであった。　（前記試験と）同じ野生型のＷｌ
？株を対照として用いた。−次接種後１遇間後もしくは
２週間後、右翼１部に同量の追加接種を行った。
５７日目（−次接種より５ｉ！！間後）、すべてのヒナ
トリに５０，０００の胞子形成されたのう胞体を投与し
た。１週間後、ヒナトリを層殺し、解剖して」記と同様
にして得点で評価を行った。感染時以陥の毎回の体重増
加や、層殺までの最後の２日間Ｃ間の胞子虫の排出量も
測定した。結果を第８表番Ｊ示す。
（本頁以下余白） ａ、ウィルス３７Ｍ３株は、１９０キロダルトンのマラ
リア抗原のリーダー遺伝子配列を有していた；３７に３
はこれを有していなかった。野生型ウィルスは畦株であ
った。
ｂ、２匹のヒナトリは、胞子虫投与前に層殺した。
第７表は、病変度のスコアが減少した点及び胞子虫の体
外排出が減少した点からみると、陰性対照である野生型
ウィルスと比較した場合、２８キロダルトンのタンパク
をコードしているＤＮＡを有する２種のウィルスは、ど
ちらも寄生虫に特異的な抗体生産を誘導し、のう胞体の
投与に対しである程度の抵抗力を与えたことを示してい
る。胞子虫に対する抵抗力という点においては、該２種
のウィルスの効果は同等であるが、マラリア抗原のリー
ダー遺伝子配列を有する方（３７１１３株）は、胞子虫
の抗原に対しより高い抗体の力価を生ぜしめた。
これは標準的なウィルスの創造物（３７Ｋ３株）に対し
、融合した創造物は優位であることを示している。
第２の試験においては、検体は上記と同様に飼ａ、ウィ
ルス３７　Ｍ１９株は１９０キロダルトンのマラリア抗
原由来のリーダー配列を有していた。３７に５株にはこ
れがなかった。野生型のウィルスは、種痘ウィルスＷＲ
株であった。
第８表は、胞子虫のＤＮＡを有する２種のウィルスは、
野生型の対照ウィルスと比較した場合（ヒナトリ）、体
重の増加や発病の度合いのスコアやのう胞体の排出とい
った点からみると、どちらも病原性を有するのう胞体の
投与に対して、ある程度の抵抗力を生ぜしめることを示
している。どちらのウィルスもほぼ同等の効果を及ぼし
た。第１次接種から１週間後に追加接種を行ったことで
、幾分体重の増加や胞子虫の排出の減少が起こったが、
発病度のスコアは、どちらの（時期の）追加接種の場合
でも（１次接種から１週間後でも２週間後でも）はぼ変
わらなかった。
第３の試験では、３度のワクチン注射の効果について検
討した。野生株の種痘ウィルス、もしくはモノクローナ
ル６Ａ５に特異的に結合する２０キロダルトンのタンパ
クをコードするＤＮＡを含むウィルスの３　Ｘ１０’ｐ
ｆｕ／ｍ１濃度の懸濁液を、５０μ２ずつ２本、２１日
令のヒナトリに接種した。２８日令時に、すべてのヒナ
トリの左翼１部に同様の追加接種を行った。このうち、
何個体かのヒナトリには、３５日令時にさらにもう１度
同様の追加接種を両翼の１部に行った。その他のヒナト
リは、そのままさらなる追加接種を行わず、対照区とし
た。
４２日令時、すべてのヒナトリから血液を採取し、前記
のような寄生虫のスポロゾイト段階に特異的な抗体の存
在を、ＥＬＩＳＡによって測定した。４９日令時（第１
接種より４週間後）に、すべてのヒナトリにｓｏ、ｏｏ
ｏの胞子形成されたのう胞体を投与した。それから１週
間後、ヒナトリを層殺し、解剖して全体の発病度を、前
述と同様に得点で評価した。日々の体重増加を算出する
ために毎週体重を記録し、のう胞体の排出量を測定する
ため、感染サイクルの最後の２日間は、糞便を採取した
。結果を第９表に示す。
（本頁以下余白） 第９表のデータは、原虫特有の抗原を生産するウィルス
を３回接種すると、スポロゾイトタンパクに特異的な抗
体の力価が増加せしめられることを示している。さらに
、このタイプの組み換えウィルスを用いると、どちらの
処理でも、体重増加促進や発病度のスコアの減少及びの
う胞体の体外排出の減少といった点からみて、のう胞体
怒染に対するある程度の抵抗力が与えられた。ワクチン
接種していない対照区から得られた結果を比較すると、
野生型の種痘ウィルスをワクチンとして接種しても抵抗
力は生じなかったことがわかる。ゆえに、法主由来のＤ
ＮＡをもつウィルスにより与えられる抵抗力は特異的な
ものであって、種痘ウィルスそのものにさらされたこと
に起因する一般的な免疫的刺激によるものではなかった
。接種を３回行うと、２回の場合よりいっそう効果的で
あった。
当該技術分野における当業者にとっては明らかになるで
あろうように、本発明の修正されたものや多少変更され
たものが、その思想や範囲から離れることなしに数多く
創造され得る。本文中に記載されている特徴的な具体的
表現は、（実施）例を以て開示されており、本発明も同
温のクレームの表現によってのみ制限を受けるべきもの
である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｅ、　ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイト類のＥ
ｌ、ＩＳＡの結果を示すグラフ、 第２図は、Ｅ、ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイト類から可
溶化させた蛋白質を用いて行なったウェスタン・プロッ
ト検査の結果を示す電気泳動のパターン、第３図は、Ｅ
、　ｔｅｎｅｌ　ｌａのスポロゾイト類、モロゲイト類
およびＥ、　ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイト類から可溶
化させた蛋白質を用いて行ったウェスタン・プロット検
査の結果を示す電気泳動のパターン、第４図は、Ｅ、　
ｔｅｎｅｌｌａのスポロゾイト類の１２５１−標識表面
蛋白質類および化スポロゾイト類で免疫化させたマウス
からの血清による１２５Ｉ−標識スポロゾイト表面蛋白
類の免疫沈澱の結果を示す電気泳動パターン、 第５図は、モノクローナル抗体による＋２Ｊ−標識スポ
ロゾイト表面蛋白質類の免疫性゛隊の結果を示す電気泳
動パターン、 第６図は、空気乾燥させたＥ、　ｔｅｎｅｌｌａのスポ
ロゾイトの固体調製物類の相対比顕微鏡写真および各種
のモノクローナル抗体類を使用する免疫蛍光検査の染色
模様の顕微鏡写真、 第７図および第８図は、細胞内のスポロゾイト類の抗染
色およびニワトリ腎臓細胞内に発育寄生生物の顕微鏡写
真、 第９図は、抗スポロゾイト抗体類による細胞内のスポロ
ゾイトの発育の中和を示すグラフを示し、第１０図は、
６５ｋｄ−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質試料または
他の試料の電気泳動／ウェスタン・プロット分析の結果
を示すパターン、第１１図は、プラスミドｐＥν／２−
４の模式的表示図、第１２図は、ｐＥＶ３−ＳＥＱノ地
図、第１３図は、モノクローナル抗体６八５で認識され
る蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの制限地図、第
１４図は、モノクローナル抗体６＾５によって認識され
る２０ｋｂ蛋白質をコードする１、１ｋｂ　ｃＤＮＡ分
子のヌクレオチド配列、 第１５図は、第１４図のヌクレオチド配列から調製した
蓋白質のアミノ酸配列、 第１６図は、モノクローナル抗体７０、７０４および２
００６によって認識される６５ｋｄ蛋白賞をコードする
１、７ｋｂ　ｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列、第１７
図は、第１６図のヌクレオチド配列から推定され、発現
された６５ｋｄ蛋白質から調製されたトリプシンの蛋白
質類の配列分析により確認された蛋白質のアミノ酸配列
、 第１８図は、モノクローナル抗体８＾２によって認識さ
れる２８ｋｄ蛋白質をコードするＬｌｋｄ　ｃＤＮ八分
へのヌクレオチド配列、 第１９図は、第１８図のヌクレオチド配列から推定され
る蛋白質のアミノ酸配列、 第２０図は、モノクローナル抗体７Ｂ２によって認識さ
れる蛋白質をコードする３、２ｋｂ　ｃＤＮＡ分子のヌ
クレオチド配列、 第２１図は、第２０図のヌクレオチド配列から推定され
る蛋白質のアミノ酸配列、 第２２図は、免疫アフィニテー精製された６５ｋｂ蛋白
質の電気泳動分析の結果を示すパターン、第２３図は、
６５ｋｂ蛋白質のβ−メルカプトエタノール還元および
未還元トリプシン消化の１（ＰＬＣ溶出曲線、 第２４図は、ワタシニアウイルスへのコクシジア抗体類
をコードする遺伝子の組換えに使用される基本ベクター
の４種の要素の制限地回を示し、更に 第２５図は、モノクローナル抗体８Ａ２によって認識さ
れたアイメリア抗原のＮ−末端のアミノ酸配列を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、表面抗原が、約２８、３７、１２０または２００ｋ
    ｄよりも大きい見かけの分子量を有し、アメリカン・タ
    イプ・カルチャー・コレクションに寄託されており、か
    つ寄託番号ＨＢ９７０７からＨＢ９７１２が割り当てら
    れた１種もしくはそれ以上のモノクローナル抗体類に特
    異的に結合するアイメリア表面抗原の免疫反応性および
    ／または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因子類を
    有する蛋白質。 ２、第１５図中に示されたアミノ酸配列を有する請求項
    １に記載の蛋白質またはそれと機能的に同等な蛋白質。 ３、第１７図中に示されたアミノ酸配列を有する請求項
    １に記載の蛋白質またはそれと機能的に同等な蛋白質。 ４、第１９図中に示されたアミノ酸配列を有する請求項
    １に記載の蛋白質またはそれと機能的に同等な蛋白質。 ５、第２１図中に示されたアミノ酸配列を有する請求項
    １に記載の蛋白質またはそれと機能的に同等な蛋白質。 ６、請求項１ないし５のいずれかの一に記載の蛋白質を
    コードするＤＮＡ配列。 ７、第１４図中に示されたヌクレオチド配列の全部また
    は一部を包含する請求項６に記載のＤＮＡ配列。 ８、第１６図中に示されたヌクレオチド配列の全部また
    は一部を包含する請求項６に記載のＤＮＡ配列。 ９、第１８図中に示されたヌクレオチド配列の全部また
    は一部を包含する請求項６に記載のＤＮＡ配列。 １０、第２０図中に示されたヌクレオチド配列の全部ま
    たは一部を包含する請求項６に記載のＤＮＡ配列。 １１、請求項６ないし１０のいずれかの一に記載のＤＮ
    Ａ配列を包含する組換えベクター。 １２、適合しうる宿主微生物中に於けるＤＮＡ配列の発
    現を支配しうる請求項１１に記載の組換えベクター。 １３、ポックスウイルスベクターである請求項１１また
    は１２に記載の組換えベクター。１４、Ｅ．ｃｏｌｉベ
    クターである請求項１１または１２に記載の組換えベク
    ター。 １５、ｐＥＶ／２−４である請求項１４に記載の組換え
    ベクター。 １６、請求項１１ないし１５のいずれかの一に記載の組
    換えベクターで形質転換させた宿主微生物。 １７、前記請求項に記載された組換えベクター中に包含
    された請求項１ないし５のいずれかの一に記載された蛋
    白質をコードするＤＮＡ配列を発現しうる請求項１６に
    記載の形質転換宿主微生物。 １８、請求項１ないし５のいずれかの一に記載された蛋
    白質に支配される抗体。 １９、モノクローナル抗体である請求項１８に記載の抗
    体。 ２０、ＡＴＣＣ番号ＨＢ９７０７、ＨＢ９７０８、ＨＢ
    ９７０９、ＨＢ９７１０、ＨＢ９７１１およびＨＢ９７
    １２から成る群から選ばれた請求項１９に記載のモノク
    ローナル抗体。 ２１、コクシジウム症に対する家禽の免疫化のための請
    求項１ないし５のいずれかの一に記載の蛋白質。 ２２、請求項１ないし５のいずれかの一に記載の蛋白質
    の製造方法に於いて、 （ａ）該蛋白質をコードするＤＮＡ配列を包含する組換
    えベクターで形質転換させた宿主微生物を、ＤＮＡ配列
    が発現する条件下に培養し；更に （ｂ）培養物から蛋白質を単離する ことを特徴とする蛋白質の製造方法。 ２３、それ自体公知の方法で、宿主微生物を請求項１１
    ないし１５のいずれかの一に記載の組換えベクターで形
    質転換させることを特徴とする請求項１６または１７に
    記載の形質転換宿主微生物の製造方法。 ２４、請求項１ないし５のいずれかに記載された１種も
    しくはそれ以上の蛋白質および生理学的に許容しうる担
    体を包含するコクシジウム症に対して家禽を保護するた
    めのワクチン。 ２５、請求項１３に記載の組換えポックスウイルスベク
    ターを包含するコクシジウム症に対して家禽を保護する
    ためのワクチン。 ２６、コクシジウム症に対して家禽を保護しうるワクチ
    ンの製造のための請求項１ないし５のいずれかの一に記
    載の蛋白質の使用。 ２７、請求項１から５のいずれかの一に記載の蛋白質で
    、請求項２２に記された様な行程により製造されたもの
    の全てのもの。 ２８、請求項１６或いは１７に記載の形質転換宿主微生
    物で請求項２３に記された様な行程により製造されたも
    のの全てのもの。
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