ES2253746T3

ES2253746T3 - Vacuna contra la coccidiosis aviar.

Info

Publication number: ES2253746T3
Application number: ES96201818T
Authority: ES
Inventors: Jacobus Johannes Kok; Paul Van Den Boogaart; Arnoldus Nicolaas Vermeulen
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1995-07-03
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2016-07-01
Also published as: US7638131B2; AU707350B2; HUP9601809A2; DE69635472D1; EP0775746A3; DK0775746T3; CA2180309A1; JP4116680B2; CA2180309C; US7230075B1; US6100241A; US20080233138A1; EP0775746B1; AU5628796A; EP0775746A2; JPH0948797A; ZA965586B; DE69635472T2; ATE310747T1; HUP9601809A3

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS PROTEINAS DE EIMERIA, CON PROPIEDADES INMUNOGENICAS, QUE TIENEN ACTIVIDAD LACTATODESHIDROGENASA, ASI COMO A LAS SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA DICHAS PROTEINAS. LAS CITADAS PROTEINAS, PUEDEN ADMINISTRARSE AL GANADO AVIAR, PROTEGIENDOLO ASI DE LA COCCIDIOSIS. ADEMAS, EL ADN QUE CODIFICA PARA DICHAS PROTEINAS, PUEDE UTILIZARSE PARA LA PREPARACION DE UNA VACUNA VECTOR CONTRA LA COCCIDIOSIS.

Description

Vacuna contra la coccidiosis aviar.

La presente invención se refiere a una proteína derivada de Eimeria acervulina, que es capaz de estimular los linfocitos inmunes. Asimismo se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte significativa desde el punto de vista antigénico de esta proteína, a un vector recombinante que comprende semejante secuencia de ácido nucleico, a una célula huésped u organismo transformado con semejante vector recombinante y a una vacuna para la protección de la volatería frente a la coccidiosis.

La coccidiosis es una enfermedad causada por la infección con una o más de las muchas especies de coccidios, parásitos protozoicos intracelulares del subfilum Apicomplexa y del género Eimeria. La volatería se define aquí como las aves domésticas que sirven como fuente de huevos o carne y que incluyen clases comercialmente importantes tales como pollos, pavos, patos, gansos, gallinas de Guinea, faisanes, palomas y pavos reales.

La coccidiosis en pollos es conocida por estar causada por numerosas especies diferentes de Eimeria, esto es Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati y E. hagani. Algunas personas, no obstante, dudan de la verdadera existencia de las dos últimas especies. La infección de bajo nivel con cualquiera de estas especies de Eimeria produce una inmunidad protectora frente a la reinfección.

Las especies difieren en su efecto patogénico sobre los pollos, jugando también el tipo de pollo un papel; así, un pollo de engorde será sometido a una gran cantidad de lesiones por un parásito tal como E. acervulina o E. maxima debido a que estos parasitan grandes porciones del intestino delgado, donde la digestión del alimento juega un papel principal.

E. acervulina es una de las especies más comunes encontrada en las camadas y en las baterías de engorde tanto en Europa como en Estados Unidos. Tiene un gran potencial reproductivo y se considera patogénico debido a que produce una marcada depresión en la ganancia de peso corporal, mayor conversión de alimento y produce lesiones groseras en el intestino delgado proximal.

Durante el ciclo vital (ver también la Tabla 1), el parásito Eimeria pasa a través de numerosas fases. El ciclo vital comienza cuando el pollo ingiere la fase infecciosa, conocida como oocisto esporulado, durante la alimentación en el suelo o mediante inhalación de polvo. La pared del oocisto esporulado se rompe mediante la combinación de una acción de trituración mecánica y acción química en la molleja y el tracto intestinal, produciendo la liberación de cuatro esporocistos. Los esporocistos pasan al duodeno donde se exponen a la bilis y a las enzimas digestivas produciendo la liberación de dos esporozoitos por esporocisto.

TABLA 1 Fases endógenas de Eimeria acervulina en secciones coloreadas de duodeno infectado (de MdDonald V. y col., Parasitol. 8, 21-30, 1982)

Tiempo de infección	Observaciones histológicas
24 h	Fases asexuales de 1ª generación inmaduras
36 h	Esquizontes de 1ª generación semi-maduros
42 h	\begin{minipage}[t]{126mm}Esquizontes de 1^{a} generación maduros. Parásitos de 2^{a} generación inmaduros.\end{minipage}
48 h	\begin{minipage}[t]{126mm}Esquizontes de 2^{a} generación maduros. Algunos esquizontes de 3^{a} generación con 8-16 merozoitos.\end{minipage}
60 h	\begin{minipage}[t]{126mm}Esquizontes de 3^{a} generación maduros, parásitos de 4^{a} generación inmaduros.\end{minipage}

Los esporozoitos son móviles y buscan células epiteliales del huésped adecuadas con el fin de penetrar en ellas y reproducirse. Tras la infección de una célula epitelial, el parásito entra en la fase de esquizonte de su ciclo vital, produciendo de 8 a 16 a >200 merozoitos por esquizonte. Una vez liberados del esquizonte, los merozoitos son libres para infectar más células epiteliales. Después de dos a cinco de estos ciclos de reproducción asexual, los merozoitos intracelulares crecen en formas sexuales conocidas como hembra o macrogametocito y macho o microgametocito. Tras la fertilización del macrogametocito por los microgametos liberados del microgametocito, se forma un zigoto que crea una pared quística alrededor de sí mismo. El oocisto recién formado sale del pollo infectado con los excrementos.

Con las condiciones medioambientales correctas de temperatura y humedad y oxígeno suficiente en el aire, el oocisto esporulará en la fase infecciosa, listo para infectar un nuevo huésped y propagando de ese modo la enfermedad. Por tanto no se requiere un huésped intermedio para la transferencia del parásito de ave en ave.

El resultado del parásito Eimeria infectando el tracto digestivo de un pollo puede ser una reducción de la ganancia de peso, aumento de la conversión de alimento, cese de la producción de huevos y, en algunos casos, la muerte. El incremento de la producción intensiva de la volatería ha estado acompañado de pérdidas graves debidas a este parásito; en efecto, la coccidiosis se ha vuelto la enfermedad parasítica más importante económicamente. En Holanda, las pérdidas que sufren los avicultores cada año alcanzan millones de florines; en 1986 la pérdida fue de aproximadamente 13 millones de florines. En el mismo año, Estados Unidos sufrió una pérdida de 300 millones de dólares.

En el pasado, se han utilizado diversos métodos para intentar controlar la coccidiosis. Antes de la llegada de agentes quimioterapéuticos, la mejora de la higiene utilizando desinfectantes, junto con la eliminación mecánica de las camas, era el método principal empleado; no obstante, normalmente quedaban oocistos suficientes para transmitir la enfermedad.

La introducción de los agentes coccidiostáticos en el alimento o el agua de bebida, además de una buena gestión, da como resultado cierto éxito en el control de la enfermedad. Se ha encontrado que tales agentes sufren una caída de la eficacia a lo largo de los años, debido parcialmente al desarrollo de cepas de coccidia resistentes a los fármacos. Además, se han descubierto diversos agentes quimioterapéuticos que dejan restos en la carne, haciéndola inadecuada para el consumo.

Se han realizado intentos de controlar la enfermedad inmunológicamente administrando a pollos una vacuna viva que comprende oocistos de las siete especies de Eimeria, siendo los oocistos administrados de líneas precoces. Tales líneas precoces se obtienen inoculando pollos con una población salvaje de una especie de Eimeria y recogiendo los primeros parásitos que se secretan como resultado de la infección. Los parásitos recogidos son devueltos a los pollos y se repite el ciclo varias veces. Eventualmente se produce una línea de parásito precoz que tiene menos ciclos de reproducción asexual en el intestino. Por tanto tales líneas conservan su inmunogenicidad, a la vez que producen menos parásitos en el intestino ocasionando por consiguiente un daño menor en el pollo huésped. La desventaja de este tipo de vacuna es que resulta cara de producir debido a la necesidad de producirla en pollos vivos y a su menor potencial reproductivo.

La llegada de la ingeniería genética ha proporcionado nuevos métodos para producir vacunas eficaces. Utilizando estos métodos, el ADN que codifica las proteínas antigénicas de algunos microorganismos patógenos ha sido clonado en microorganismos tales como Escherichia coli o Salmonella sp., con el resultado de que la proteína ha sido expresada a niveles suficientemente elevados de manera que pueda ser incorporada a la vacuna. La ventaja de las proteínas producidas de esta manera es que no son infecciosas y son relativamente poco costosas de producir. De este modo, se han preparado vacunas frente a numerosos virus tales como el de la hepatitis, el herpes simplex y de enfermedades de los pies y la boca.

Se han realizado intentos para diseñar genéticamente una vacuna para la coccidiosis. En la solicitud de Patente Europea Núm. 337.589 se describe el aislamiento de una proteína del Eimeria tenella del Grupo B y su inserción en un vector de expresión novedoso que, a su vez, ha sido utilizado para transformar huéspedes apropiados. En la Solicitud del Tratado de Cooperación de Patentes WO 92/04461 se describe la construcción de un microorganismo que produce una proteína antigénica utilizando o bien "la ruta del ARNm" o bien "la ruta del ADN nuclear". De este modo, se prepararon ciertos antígenos de E. tenella y E. maxima y se secuenciaron. La adopción de este tipo de ruta para preparar antígenos para la incorporación a una vacuna cuenta solamente con la selección de antígenos que podrían inducir anticuerpos en una especie heteróloga. Este enfoque no termina necesariamente con la selección del antígeno más protector.

Se puede concebir, a partir de H.S. Lillehoj (Vet. Immunol. Immunopath., 13, 321-330, 1986) que el desarrollo de inmunidad protectora en pollos infectados con coccidios puede ser debido al desarrollo de una respuesta de las células T específica de la especie.

Se ha descubierto ahora que se puede aislar una proteína muy inmunógena de la fase del desarrollo de 42 horas de esquizontes de Eimeria. Sorprendentemente, esta proteína se encuentra intracelularmente en Eimeria y parece contener una elevada homología de secuencia con las lactato deshidrogenasas (LDH) heterólogas conocidas.

Así, la invención proporciona una proteína que tiene uno o más determinantes imunorreactivos y/o antigénicos de la lactato deshidrogenasa de Eimeria, que tiene un peso molecular monomérico de aproximadamente 37 kD.

Más específicamente la lactato deshidrogenasa deriva de Eimeria acervulina.

Conforme a un segundo aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica toda o una parte sustancial, en particular la parte inmunológicamente activa, de una lactato deshidrogenasa de Eimeria purificada. Semejante secuencia de ácido nucleico puede estar conectada operablemente a secuencias para el control de la expresión que dan como resultado una molécula de ácido nucleico recombinante que, cuando es insertada en un vector adecuado, da como resultado un vector recombinante capaz de expresar la secuencia de ácido nucleico.

Semejante vector recombinante, o secuencia de ácido nucleico como se ha definido antes, puede ser utilizado par transformar una célula huésped u organismo adecuado. Semejante célula huésped u organismo transformado puede, a su vez, ser utilizado para producir la proteína estimuladora para la incorporación en una vacuna para la protección de la volatería frente a la coccidiosis. Alternativamente, la propia célula huésped o el propio organismo transformado puede ser incorporado a una vacuna.

En general, el término "proteína" hace referencia a una cadena molecular de aminoácidos con actividad biológica. Una proteína no tiene una longitud específica y puede, si se requiere, ser modificada in vivo o in vitro, por ejemplo, mediante glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación; así, entre otros, los péptidos, oligopéptidos y polipéptidos están incluidos en la definición.

Más concretamente, esta invención proporciona proteínas que poseen actividad LDH, o partes inmunogénicamente activas de las mismas, que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 2 y sus equivalentes o variantes biológicamente funcionales.

Los equivalentes o variantes biológicamente funcionales de las proteínas descritas específicamente aquí son proteínas derivadas de las secuencias de aminoácidos anteriormente indicadas, por ejemplo mediante deleciones, inserciones, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos, pero conservan uno o más determinantes inmunogénicos de los antígenos de Eimeria, es decir, dichas variantes tienen uno o más epítopos capaces de lograr una respuesta inmune en un animal huésped.

Se entenderá que, para las proteínas concretas abarcadas aquí, pueden existir variaciones naturales entre parásitos o cepas de Eimeria individuales. Estas variaciones pueden ser demostradas por una o varias diferencias de aminoácidos en la secuencia global o mediante deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o varios aminoácidos en dicha secuencia. Las sustituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, han sido descritas, v.g. por Neurath y col., en "The Proteins" Academic Press Nueva York (1979). Las reposiciones de aminoácidos entre aminoácidos afines o las reposiciones que se han producido frecuentemente en la evolución son, entre otras, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Entre otras sustituciones de aminoácidos se incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu. Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 227, 1435-1441, 1985) y la determinación de la similitud funcional entre proteínas homólogas. Tales sustituciones de aminoácidos de las realizaciones ejemplares de esta invención están dentro del alcance de la invención con tal que las proteínas resultantes conserven su inmunorreac-
tividad.

Además, también están incluidos en la presente invención fragmentos imunogénicos de las proteínas descritas específicamente aquí o sus variantes funcionales.

El término "fragmento" utilizado aquí representa una secuencia de ADN o de aminoácidos que comprende una subsecuencia de la secuencia de ácido nucleico o de la proteína de la invención. Dicho fragmento es o codifica un polipéptido que tiene uno o más determinantes inmunogénicos de un antígeno de Eimeria. Los métodos para determinar los fragmentos polipeptídicos inmunogénicos utilizables se esbozan más abajo. Los fragmentos pueden ser producidos entre otros, mediante escisión enzimática de moléculas precursoras, utilizando endonucleasas de restricción para el ADN y proteasas para los polipéptidos. Entre otros métodos se incluyen la síntesis química de los fragmentos o la expresión de fragmentos polipeptídicos por los fragmentos de ADN.

Los fragmentos polipeptídicos inmunogénicos adecuados de una proteína según la invención que contiene uno o varios epítopos pueden ser encontrados por medio del método descrito en la Solicitud de Patente WO 86/06487, Geysen, H.M. y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002, 1984), Geysen, H.M. y col. (J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987) basándose en el método denominado del pepscan, donde se sintetizan una serie de péptidos parcialmente solapantes correspondientes a las secuencias parciales del polipéptido completo en consideración, y se investiga su reactividad con los anticuerpos.

Además, numerosas regiones del polipéptido, con la secuencia de aminoácidos establecida, pueden ser designadas epítopos basándose en consideraciones teóricas y concordancia estructural con los epítopos que son conocidos ahora. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de los criterios del carácter hidrófobo según Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828, 1981) y los aspectos de la estructura secundaria según Chou y Fasman (Advances in Enzymology 47, 45-148, 1987).

Los epítopos de las células T que pueden ser necesarios pueden igualmente derivar de campos teóricos, v.g. con la ayuda del criterio de carácter anfífilo de Berzofsky (Science 235, 1059-62, 1987).

La invención proporciona adicionalmente secuencias de ácido nucleico aisladas y purificadas que codifican las proteínas de Eimeria antes mencionadas. Una de estas secuencias de ácido nucleico se muestra en la SEC ID NUM: 1. Es bien sabido en la técnica que la degeneración del código genético permite la sustitución de bases en el codón dando como resultado otro codón que codifica todavía el mismo aminoácido, v.g., el codón para el aminoácido ácido glutámico es tanto GAT como GAA. Por consiguiente, está claro que, para la expresión de una proteína con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 2, la secuencia de ácido nucleico puede tener una composición de codones diferente de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEC ID NUM: 1.

Se puede aislar una secuencia de ácido nucleico según la presente invención de una cepa de Eimeria y multiplicarla mediante técnicas de ADN recombinante incluyendo la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o se puede sintetizar químicamente in vitro mediante mecanismos conocidos en la técnica.

Se puede ligar una secuencia de ácido nucleico según la invención a diversas secuencias de ADN que efectúan la replicación con las cuales no está asociada, o conectada en la naturaleza, dando como resultado un vector denominado recombinante que puede ser utilizado para la transformación de un huésped adecuado. Los vectores recombinantes útiles derivan preferiblemente de plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus.

Los vectores específicos o los vehículos de clonación que se pueden utilizar para clonar secuencias de ácido nucleico según la invención son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, vectores plasmídicos tales como pBR322, los diversos plásmidos pUC, pGEM y Bluescript; bacteriófagos, v.g., \lambdagt-Wes, Charon 28 y los fagos derivados de M13 o vectores virales tales como SV40, adenovirus y virus del polioma (ver también Rodriguez, R.L. y D.T. Denhardt ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lensatra, J.A. y col., Arch. Virol., 110, 1-24, 1990). Los métodos que se van a utilizar para la construcción de un vector recombinante según la invención son conocidos por los expertos normales en la técnica y se exponen, entre otros, en Maniatis, T. Y col. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edición; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Por ejemplo, la inserción de la secuencia de ácido nucleico según la invención en un vector de clonación se puede lograr fácilmente cuando ambos genes y el vehículo de clonación deseado han sido cortados con la misma o las mismas enzimas de restricción, ya que de ese modo se producen extremos de ADN complementarios.

Alternativamente, puede ser necesario modificar los sitios de restricción que son producidos a extremos romos o bien sometiendo a digestión el ADN de doble hebra o bien rellenando los extremos monocatenarios con una ADN polimerasa apropiada. Con posterioridad, se puede llevar a cabo la ligadura de los extremos romos con una enzima tal como la ADN ligasa de T4.

Si se desea, se puede producir cualquier sitio de restricción mediante la ligadura de conectores sobre los extremos del ADN. Tales ligadores pueden comprender secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican las secuencias de los sitios de restricción. El vector escindido por la enzima de restricción y la secuencia de ácido nucleico también pueden ser modificados mediante la formación de colas homopoliméricas.

"Transformación" según se utiliza aquí, hace referencia a la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga en una célula huésped, independientemente del método utilizado, por ejemplo absorción directa o transducción. La secuencia de ácido nucleico heteróloga puede ser mantenida por medio de la replicación autónoma o, alternativamente, puede ser integrada en el genoma del huésped. Si se desea, se proporcionan los vectores recombinantes con secuencias de control compatibles con el huésped designado. Estas secuencias pueden regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico insertada. Además de microorganismos, también se pueden utilizar como huéspedes cultivos celulares derivados de organismos multicelulares.

Los vectores recombinantes según la invención contienen preferiblemente una o más actividades marcadoras que pueden ser utilizadas para seleccionar los transformantes deseados, tales como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina en pBR322, la resistencia a la ampicilina y el péptido \alpha de la \beta-galactosidasa en pUC8.

Una célula huésped adecuada es un microorganismo o célula que puede ser transformada por una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o por un vector recombinante que comprende semejante secuencia de ácido nucleico, y que puede, si se desea, ser utilizado para expresar dicho polipéptido codificado por dicha secuencia de ácido nucleico. La célula huésped puede ser de origen procariótico, v.g., bacteria tal como Escherichia coli, Bacillus subtilis y Pseudomonas sp; o de origen eucariótico tal como levaduras, v.g. Saccharomyces cerevisiae o células eucarióticas superiores tales como células de insecto, de planta o de mamífero, incluyendo células HeLa y células de ovario de hámster Chino (CHO). Entre las células de insecto se incluyen la línea celular Sf9 de Spodoptera frugiperda (Luckow y col., Biotechnology 6, 47-55, 1988). La información con respecto a la clonación y expresión de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención en sistemas de clonación eucarióticos se puede encontrar en Esser, K. y col. Plasmids of Eukaryotes, Springer Verlag, 1986).

En general, se prefieren los procariotas para la construcción de los vectores recombinantes útiles en la presente invención. Son particularmente útiles las cepas de E. coli K12, especialmente las cepas DH5a o MC1061.

Para la expresión, se introducen secuencias de ácido nucleico de la presente invención en un vector de expresión, es decir dichas secuencias son conectadas operablemente a las secuencias de control de la expresión. Tales secuencias de control de la expresión pueden comprender promotores, intensificadores, operadores, inductores, sitios de unión al ribosoma etc. Por lo tanto, la presente invención proporciona un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de Eimeria identificada antes conectada operablemente a secuencias de control de la expresión, que es capaz de expresar las secuencias de ADN contenidas allí en una o varias células huésped transformadas.

Se debe entender, por supuesto, que las secuencias de nucleótidos insertadas en el sitio seleccionado del vector de clonación pueden incluir nucleótidos que no son parte del gen estructural real para el polipéptido deseado, o pueden incluir solamente un fragmento del gen estructural completo para la proteína deseada con tal que el huésped transformado produzca un polipéptido que tenga al menos uno o más determinantes inmunogénicos de un antígeno proteico de Eimeria.

Cuando las células huésped son bacterias, entre las secuencias de control de la expresión útiles que se pueden utilizar se incluyen el promotor y el operador Trp (Goeddel, y col., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); el promotor y el operador lac (Chang, y col., Nature, 275, 615, 1978); el promotor de la proteína de la membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); los promotores y operadores del bacteriófago lambda (Remaut, E. y col., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); el promotor y el operador de la \alpha-amilasa (B. Subtilis), las secuencias de terminación y otras secuencias de intensificación y control de la expresión con el huésped seleccionado. Cuando la célula huésped es una levadura, entre las secuencias de control de la expresión útiles ilustrativas se incluyen, v.g., el factor de emparejamiento \alpha. Para las células de insecto se pueden utilizar los promotores de la polihedrina o p10 de baculovirus (Smith, G.E. y col., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Cuando la célula huésped es de origen mamífero, entre las secuencias de control de la expresión útiles ilustrativas se incluyen el promotor de SV40 (Bertman, P.W. y col., Science, 222, 524-527, 1983) o el promotor de la metalotioneina (Brinster, R.L., Nature, 296, 39-42, 1982) o un promotor de choque térmico (Voellmy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985). Alternativamente, las secuencias de control de la expresión presentes en Eimeria también se pueden aplicar. Para maximizar la expresión génica, ver también Roberts y Lauer (Methods in Enzymology, 68, 473, 1979).

Por lo tanto, la invención también comprende una o varias células huésped que contienen una secuencia de ácido nucleico o una molécula de ácido nucleico recombinante o un vector recombinante como se ha descrito antes, capaz de producir la proteína de Eimeria mediante la expresión de la secuencia de ácido nucleico.

La inmunización de la volatería contra la infección por Eimeria puede ser lograda administrando a las aves una proteína según la invención en un contexto inmunológicamente relevante en forma de una vacuna denominada de sub-unidades. La vacuna de sub-unidades según la invención puede comprender una proteína en forma pura, opcionalmente en presencia de un portador farmacéuticamente aceptable. La proteína puede estar unida covalentemente a una proteína no relacionada, que puede resultar ventajosa en la purificación del producto de fusión. Los ejemplos son
la \beta-galactosidasa, la proteína A, la proquimosina, el factor Xa de coagulación de la sangre, etc.

En algunos casos la capacidad para incrementar la inmunidad protectora utilizando estas proteínas per se puede ser baja. Los fragmentos pequeños son conjugados preferiblemente con moléculas portadoras con el fin de aumentar su inmunogenicidad. Los portadores adecuados para este fin son macromoléculas, tales como polímeros naturales (proteínas como la hemocianina de lapa ojo de cerradura, la albúmina, las toxinas), polímeros sintéticos como poliaminoácidos (polilisina, polialanina), o micelas de compuestos anfífilos como las saponinas. Alternativamente, estos fragmentos pueden ser proporcionados en forma de polímeros de los mismos, preferiblemente polímeros
lineales.

Si se requiere, las proteínas según la invención que van a ser utilizadas en una vacuna pueden ser modificadas in vitro o in vivo, por ejemplo mediante glicosilación, acilación, amidación, carboxilación o fosforilación.

Una versión de vacuna recién desarrollada es una vacuna en la cual el ADN que codifica la proteína de la invención es administrado en una forma farmacéuticamente aceptable, por ejemplo en forma de "balas", que pueden ser disparadas al tejido. Este ADN desnudo puede ser utilizado como vacuna siempre que está presente en un plásmido o en una combinación con secuencias promotoras eucarióticas adecuadas tales como las del virus SV40. De este modo se puede lograr la introducción de este ADN en el ADN genómico, asegurando así la expresión del antígeno in situ.

Una alternativa a las vacunas de sub-unidades son las vacunas vivas. Se introduce una secuencia de ácido nucleico según la invención mediante mecanismos de ADN recombinante en un microorganismo (v.g. una bacteria o un virus) de tal manera que el microorganismo recombinante todavía sea capaz de replicar, expresando de ese modo un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico insertada y logrando una respuesta inmune en el ave huésped infectada.

Una realización preferida de la presente invención es un virus vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga descrita antes, capaz de expresar la secuencia de ADN en una o varias células huésped o un ave huésped infectada con el virus vector recombinante. El término "heteróloga" indica que la secuencia de ácido nucleico según la invención no está normalmente presente en el virus vector.

Además, la invención también comprende una o varias células huésped o un cultivo celular infectado con el virus vector recombinante, capaz de producir la proteína de Eimeria mediante la expresión de la secuencia de ácido nucleico.

Por ejemplo el mecanismo bien conocido de recombinación homóloga in vivo puede ser utilizado para introducir una secuencia de ácido nucleico heteróloga según la invención en el genoma del virus vector.

Primero, se inserta un fragmento de ADN correspondiente a una región de inserción del genoma del vector, es decir, una región que puede ser utilizada para la incorporación de una secuencia heteróloga sin desorganizar las funciones esenciales del vector tales como aquellas necesarias para la infección o replicación, en un vector de clonación según los mecanismos de rec de ADNc normalizados. Se ha informado sobre las regiones de inserción para un gran número de microorganismos (v.g., EP 80.806, EP 110.385, EP 83.286, EP 314.569, WO 88/02022, WO 88/07088, US 4.769.330 y US 4.722.848).

Segundo, si se desea, se puede introducir una deleción en la región de inserción presente en la molécula de vector recombinante obtenida de la primera etapa. Esto se puede lograr por ejemplo por medio de digestión con la exonucleasa III apropiada o tratamiento con enzimas de restricción de la molécula vectora recombinante de la primera etapa.

Tercero, la secuencia de ácido nucleico heteróloga es insertada en la región de inserción presente en el vector recombinante de la primera etapa o en lugar del ADN suprimido de dicho vector recombinante. La secuencia de ADN de la región de inserción debe tener la longitud apropiada con el fin de permitir que se produzca la recombinación homóloga con el genoma vector. Después de eso, se pueden infectar células adecuadas con el virus vector de tipo salvaje o transformar con el ADN genómico del vector en presencia del vector recombinante que contiene la inserción flanqueada por las secuencias de ADN vectoras apropiadas por medio de lo cual se produce la recombinación entre las regiones correspondiente en el vector recombinante y el genoma del vector. La progenie del vector recombinante puede ser producida ahora en un cultivo celular y puede ser seleccionada por ejemplo genotípicamente o fenotípicamente, v.g., mediante hibridación, detectando la actividad enzimática codificada por un gen integrado simultáneamente junto con la secuencia de ácido nucleico heteróloga, o detectando el polipéptido heterólogo antigénico expresado por el vector recombinante inmunológicamente.

A continuación, estos microorganismos recombinantes pueden ser administrados a la volatería para la inmunización después de lo cual se mantiene durante algún tiempo, o incluso replica en el organismo del animal inoculado, expresando in vivo un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico insertada según la invención dando como resultado la estimulación del sistema inmune del animal inoculado. Los vectores adecuados para la incorporación de una secuencia de ácido nucleico según la invención pueden derivar de virus tales como los virus de la viruela, v.g. virus vaccinia (EP 110.385, EP 83.286, US 4.769.330 y US 4.722.848) o el virus de la viruela aviar (WO 88/02022), el herpes virus tal como HVT (WO 88/07088) o el virus de la enfermedad de Marek, adenovirus o virus de la influenza, o bacterias tales como E. coli o especies de Salmonella específicas. Con los microorganismos recombinantes de este tipo, el polipéptido sintetizado en el animal huésped puede ser expuesto como un antígeno se superficie. En este contexto son concebibles la fusión del polipéptido con las proteínas OMP, o las proteínas del pilus por ejemplo de E. coli o la provisión sintética de secuencias señal y ancla que son reconocidas por el organismo. También es posible que el polipéptido de Eimeria, si se desea como parte de una totalidad mayor, sea liberado dentro del animal que se va a inmunizar. En todos estos casos también es posible que encuentren expresión uno o más productos inmunogénicos que generen protección frente a diversos patógenos y/o frente a diversos antígenos de un patógeno dado.

Una vacuna vectora según la invención puede ser preparada cultivando una bacteria recombinante o una célula huésped infectada con un vector recombinante que comprenda una secuencia de ácido nucleico según la invención, después de lo cual las células que contienen la bacteria o el vector recombinante y/o los virus vectores recombinantes desarrollados en las células pueden ser recogidos, opcionalmente en forma pura, y formados en una vacuna opcionalmente en forma liofilizada.

Las células huésped transformadas con un vector recombinante según la invención también pueden ser cultivadas en condiciones que sean favorables para la expresión de un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácido nucleico. Las vacunas pueden ser preparadas utilizando muestras del cultivo bruto, productos lisados de células huésped o extractos de células huésped, aunque en otra realización se forman polipéptidos más purificados según la invención en una vacuna, dependiendo de su uso pretendido. Con el fin de purificar los polipéptidos producidos, se cultivan células huésped transformadas con un vector recombinante según la invención en un volumen adecuado y los polipéptidos producidos son aislados de tales células, o del medio si la proteína es excretada. Los polipéptidos excretados al medio pueden ser aislados y purificados mediante mecanismos normalizados, v.g. fraccionamiento salino, centrifugación, ultrafiltración, cromatografía, cromatografía de filtración en gel o de inmunoafinidad, mientras los polipéptidos intracelulares pueden ser aislados recogiendo primero dichas células, desorganizando las células, por ejemplo mediante sonicación o mediante otros métodos de desorganización mecánica tales como la prensa French, seguido de separación de los polipéptidos de los otros componentes intracelulares y formando con los polipéptidos una vacuna. La desorganización celular también podría ser lograda mediante métodos químicos (v.g. EDTA o detergentes tales como Triton X114) o enzimáticos, tales como la digestión con lisozimas.

Los anticuerpos o el antisuero dirigido contra un polipéptido según la invención tienen un uso potencial en la inmunoterapia pasiva, los inmunoanálisis de diagnóstico y la generación de anticuerpos anti-idiotípicos.

Las proteínas de Eimeria caracterizadas antes pueden ser utilizadas para producir anticuerpos policlonales, monoespecíficos o policlonales. Si se desean anticuerpos policlonales, los mecanismos para producir y elaborar sueros policlonales son conocidos en la técnica (v.g. Mayer y Walter. Eds, Immunolchemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1987). Los anticuerpos monoespecíficos para un inmunógeno pueden ser purificados por afinidad a partir de sueros poliespecíficos mediante una modificación del método de Hall y col. (Nature, 311, 379-387, 1984). El anticuerpo monoespecífico, según se utiliza aquí, se define como una única especie de anticuerpo o múltiples especies de anticuerpos con características de unión homogéneas para el antígeno relevante. La unión homogénea, según se utiliza aquí, hace referencia a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo específico.

Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra las proteínas de Eimeria según la presente invención, pueden ser preparados inmunizando ratones consanguíneos mediante mecanismos conocidos en la técnica (Köhler y Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Las células de hibridoma se seleccionan mediante crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina en un medio de cultivo celular apropiado tal como Medio de Eagle modificado de Dulbecco. Los hibridomas productores de anticuerpos son clonados, preferiblemente utilizando la técnica de agar blando de
MacPherson, (Soft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson, eds., Academic Press, 276, 1973). Las colonias discretas son transferidas a pocillos individuales de placas de cultivo para el cultivo en un medio de cultivo apropiado. Las células productoras de anticuerpos son identificadas rastreando con el inmunógeno apropiado. Las células de hibridoma inmunógeno positivas son mantenidas mediante mecanismos conocidos en la técnica. Los anticuerpos anti-monoclonales específicos son producidos cultivando los hibridomas in vitro o preparando fluido de ascitis en ratones tras la inyección de hibridoma mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos anti-idiotípicos son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" del antígeno del patógeno contra el cual se desea protección y pueden ser utilizados como inmunógeno en una vacuna (Dreesman y col., J. Infect. Disease, 151, 761, 1985). Los mecanismos para originar los anticuerpos anti-idiotípicos son conocidos en la técnica (MacNamara y col., Science, 226, 1325, 1984).

La vacuna según la invención puede ser administrada en un esquema de inmunización activa convencional: administración sencilla o repetida de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea profilácticamente eficaz, es decir, la cantidad de antígeno inmunizador o microorganismo recombinante capaz de expresar dicho antígeno que inducirá inmunidad en la volatería frente a una sensibilización por parásitos de Eimeria virulentos. La inmunidad se define como la inducción de un nivel significativo de protección en una población de pollos tras la vacunación en comparación con un grupo no vacunado.

Inmediatamente después de un incremento en la protección una vacuna que comprenda el polipéptido de la invención también reducirá el número de oocistos desprendidos por los animales infectados. Normalmente, los oocistos desprendidos infectarán otros animales en la bandada. Una disminución en el número de oocistos desprendidos también producirá después un descenso en el número de animales que son infectados con posterioridad y asimismo una disminución en el número de oocistos desprendidos dará lugar a una carga infectiva menor.

Además, incluso sin efecto sobre el propio parásito, la vacuna puede disminuir la incidencia de la enfermedad. Esto es así especialmente cuando los síntomas de la enfermedad están causados por productos liberados por el parásito. Las vacunas dirigidas contra tales productos alivian los síntomas sin atacar al parásito.

Para las vacunas virales vivas la tasa de dosificación por pollo puede oscilar de 10^{5}-10^{8} pfu. Una vacuna de sub-unidades típica según la invención comprende 1 \mug - 1 mg de la proteína según la invención. Semejantes vacunas pueden ser administradas intradérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intravenosamente, oralmente o intranasalmente.

Adicionalmente la vacuna también puede contener un medio acuoso o una suspensión conteniendo agua, a menudo mezclados con otros constituyentes con el fin de incrementar la actividad y/o la vida en el estante. Estos constituyentes pueden ser sales, tamponadores del pH, estabilizadores (tales como leche desnatada o producto hidrolizado de caseína), emulsionantes, coadyuvantes para mejorar la respuesta inmune (v.g., aceites, muramildipéptido, hidróxido de aluminio, saponina, polianiones y sustancias anfipáticas) y conservantes.

Una vacuna que comprende el polipéptido de la invención también puede comprender otras proteínas inmunogénicas de E. maxima o proteínas inmunogénicas de otras especies de Eimeria. Semejante vacuna combinada disminuirá la carga parasítica en una bandada de volatería y disminuirá el nivel de protección contra la coccidiosis.

Esta claro que una vacuna según la invención también puede contener inmunógenos relacionados con otros patógenos de la volatería, o puede contener secuencias de ácido nucleico que codifiquen estos inmunógenos, como antígenos del virus de la Enfermedad de Marek (MDV), del virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), del virus de la Bronquitis Infecciosa (IBV), el Agente de la Anemia de los Pollos (CAA), del Reo Virus, del Retro virus Aviar, del Adenovirus de la Volatería, del virus de la Rinotraqueítis del Pavo o E. coli para producir una vacuna multivalente.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Manipulación de los parásitos

Se recogieron los parásitos Eimeria acervulina (cepa Houghton) y Eimeria tenella (cepa Weybridge) tras la infección deliberada de pollos criados en ausencia de coccidios. Los oocistos de E. acervulina fueron aislados del material fecal a los 4 y 5 días de la infección (p.i.). Los ooscistos de E. tenella fueron cosechados de los ciegos el día 7 p.i.

Los oocistos fueron esporulados con aireación fuerte a 30ºC durante 7 horas, dando como resultado oocistos parcialmente esporulados. La liberación de los esporocistos y esporozoitos de los oocistos esporulados 48 horas se realizó como se ha descrito antes por A.N. Vermeulen y col. en FEMS Microbiological Letters 110, (1993), 223-230.

Para obtener las fases intracelulares de E. acervulina, los pollos fueron infectados a las 5 semanas con 10^{8} oocistos de E. acervulina esporulados. Los parásitos intracelulares fueron cosechados del duodeno al cabo de 42 horas. A este fin los pollos fueron desangrados a las 42 horas de la inoculación y el duodeno fue separado del estómago hasta el divertículo de Meckel. El tejido fue lavado y cortado en pequeños trozos de aproximadamente 1 cm^{3}. Los trozos fueron suspendidos en BSS de Hanks libre de calcio/magnesio conteniendo 10 mg/ml de glucosa (CMF-Hanks). Las células epiteliales fueron liberadas de la matriz mediante 10 minutos de incubación en EDTA (EDTA 2 mM en CMF Hanks a 35-37ºC). Los sobrenadantes de cuatro incubaciones fueron reunidos y centrifugados 10 minutos a 750 g, lo que hizo que las células sedimentaran. Los parásitos intracelulares (adicionalmente denominados "esquizontes", aunque también estaban presentes trofozoitos) fueron liberados con posterioridad de las células huésped mediante lisis con saponina (15 minutos en saponina en CMF-Hanks al 0,1% a la temperatura ambiente) y cizalla mecánica.

Los esquizontes fueron sedimentados y separados del material huésped a través de Percoll al 45% (Pharmacia Fine Chemicals) (20 minutos, 700 g, 4ºC). Los sedimentos secos de esquizontes fueron almacenados a -70ºC hasta su nuevo uso.

Extracción con Triton X114

Se llevaron a cabo extracciones con Triton X114 para obtener la fracción de proteínas hidrófilas de los esquizontes. El procedimiento utilizado había sido descrito previamente por C. Bordier (1981) Journal of Biological Chemistry, vol. 256 núm. 4 (feb) págs. 1604-1607.

Se sometieron a sonicación 10^{8} a 10^{9} esquizontes de E. acervulina por ml de TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,4) \pm3 X 20 seg. Sobre hielo con la micropunta (Branson Sonifier, posición 7). Se añadió PMSF (concentración final 1 mM) y ADNasa/ARNasa (concentración final para ambas de 0,02 mg/ml) (provisión de ADNasa/ARNasa:
2 mg/ml de ADNasa, 2 mg/ml de ARNasa en MgCl_{2} 5 mM).

Se añadió Triton X114 precondensado a los esquizontes sometidos a sonicación en suspensión a una concentración final del 10% (v/v) y se mezclaron bien para disolver las proteínas. El material no extraible fue sedimentado mediante centrifugación 20 minutos a 12.000 g a 4ºC. La fracción soluble se dispuso en capas sobre un colchón de sacarosa (sacarosa al 6%, TX114 en TBS al 0,06% (v/v)), se incubó durante 10 minutos a 40ºC y se centrifugó durante 10 minutos a 400 g a la temperatura ambiente. La fracción hidrófila se extrajo de nuevo mediante el mismo procedimiento.

Las fracciones hidrófilas fueron almacenadas a -70ºC hasta su nuevo uso. La concentración de proteína total fue determinada utilizando el análisis BCA (Pierce Chemicals)

Fraccionamiento con PrepCell

Se separaron adicionalmente las proteínas hidrófilas con respecto a sus masas moleculares relativas sobre SDS-PAGE en condiciones reductoras en el sistema tampón de Laemmli. A este fin, los autores de la presente invención hicieron uso de la electroforesis preparativa en el denominado PrepCell.

Materiales

: Aparato PrepCell (Biorad Labs.) con columna PrepCell (37 mm ID).

: Membrana de Diálisis para PrepCell (corte 6 kD).

: Suministro de energía (EPS 600 Pharmacia).

: Tampón muestra reductor: Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8; glicerol al 10%; SDS al 2%; azul bromofenol al 0,01% (Merck);

: DTT 0,13 M (ditiotreitol, Merck).

: Tampón de electoforesis/Tampón de elución: Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS al 0,1% pH 8,6.

Método y Resultados

Todos los procedimientos se realizaron a 4ºC. Para el fraccionamiento de las proteínas hidrófilas se utilizó un gel de apilamiento al 4%/separador al 9% (poliacrilamida) en el tubo de 37 mm (lleno hasta 6 cm) de PrepCell según el protocolo de los fabricantes, pero con la adición de SDS al 0,1%.

La fase hidrófila de las extracciones con TX114 mantenida a -70ºC fue descongelada y las proteínas hidrófilas (aproximadamente 8 mg por serie) fueron diluidas en tampón de muestra reductor (el volumen total era de \pm6 ml), hervidas 3 minutos a 100ºC, y cargadas sobre la superficie del gel de apilamiento al 4% utilizando un tubo estrecho pegado a una jeringa.

Se conectó el PrepCell al suministro de energía y se inició la electroforesis a 40 mA, 500 V máx.

La recolección de las fracciones (volumen de la fracción \pm 2,5-3 ml; flujo 0,6 ml/min) comenzó al cabo de aproximadamente 6 horas, cuando el colorante de rastreo eluía de la célula. Las fracciones fueron recogidas durante la noche (\pm 100 fracciones) en tubos de plástico de 3,5 ml (Sarstedt).

Se tomaron muestras de las fracciones para el análisis mediante SDS-PAGE y Transferencia Western. Las fracciones fueron almacenadas a -70ºC.

Este método de purificación dio como resultado fracciones que contenían proteínas casi puras como resulta de los análisis mostrados más abajo.

Secuenciación de aminoácidos

Se reunieron las fracciones seleccionadas de las series de PrepCell COC9314612 conteniendo una banda casi pura a aproximadamente Mr = 37 k (denominada EASC2), se concentraron mediante precipitación en acetona y se hicieron correr sobre gel de PAA al 12%. El gel era teñido en poco tiempo con un protocolo de tinción con Coomassie Brilliant Blue no desnaturalizante: tinción: 20 min. a la temperatura ambiente en CBB al 0,2% en metanol al 20%/ácido acético al 0,5%. Decoloración: 60 min en metanol al 30%.

La banda de 37 kD teñida se cortó. Se realizó una secuenciación de aminoácidos interna del péptido purificado mediante HPLC seleccionado de un producto digerido con tripsina de EASC2, realizado todo por medio de Eurosequence BV Groningen Holanda.

La secuencia de aminoácidos del péptido tratado con tripsina era GWIKQEEVDDIVQK (ver la SEC ID NUM: 2 aminoácidos 212-225).

Esta secuencia codificadora de este péptido también fue detectada tras la secuenciación del ADN del clon.

Ejemplo 2 Preparación de anticuerpos monoespecíficos en conejos

Se rastrearon sueros de prevacunación de conejos SPF en antígenos de E. acervulina sometidos a transferencia Western de diferentes fases de desarrollo y en una transferencia de proteínas de E. coli. Los conejos "negativos" fueron seleccionados para la producción de anticuerpos.

Las fracciones de las series de PrepCell que contenían EASC2 (37 kDa) fueron seleccionadas mediante SDS-PAGE, reunidas y concentradas (\pm 3x) con un Amiconcell (filtro YM10) hasta 3,5 ml.

El conejo fue inmunizado dos veces con antígeno concentrado en GNE (8x 0,25 ml i.c.; 1 ml i.p.) con un intervalo de 4 semanas. Dos semanas después de la segunda inmunización el conejo fue desangrado y el suero sometido a ensayo en transferencias western de esporozoitos y esquizontes de Eimeria acervulina y tenella 42 horas. La Figura 1 muestra el resultado de la inmunodetección del antisuero monoespecífico en los antígenos de esporozoitos de ambas especies. Parecía que los anticuerpos reconocían un producto parasítico de aproximadamente 37 kDa tanto en E. acervulina (Calle A1) como E. tenella (Calle B1). Los sueros de control del mismo conejo antes de la inmunización no reconocían estas bandas (Calles A/B2). La proteína también está presente en las fases de esquizonte de las dos especies (no mostradas).

Ejemplo 3 Vacunación de pollos con la fracción hidrófila TX114 y EASC2 de E. acervulina

La fase hidrófila de TX114 del material con los esquizontes fue separada y sometida a diálisis extensamente frente a PBS 0,01 M pH 7,3 a 4ºC.

Las fracciones seleccionadas que contenían la proteína de 37 kDa EASC2 fueron sometidas a diálisis extensamente frente a 3 x 5 litros de PBS 0,01 M pH 7,3 a 4ºC.

La concentración de proteína en las preparaciones de vacuna fue estimada tiñendo diferentes concentraciones de la muestra con CBB tras la SDS-PAGE y comparando la intensidad de la tinción con una muestra de referencia de BSA.

Los volúmenes fueron corregidos para obtener \pm 5 mg de proteína/dosis para la proteína purificada y aproximadamente 15 mg/dosis para la fracción hidrófila total.

Estos fueron almacenados en forma de volúmenes de alícuotas para las vacunaciones de cebado y refuerzo a -70ºC. Las preparaciones de vacuna congeladas fueron descongeladas.

A cada 15 ml de vacuna se añadían 3,2 mg de Quill A Superfos Biosector como coadyuvante en un volumen de 1 ml de PBS 0,01 M pH 7,3.

La vacuna fue mezclada bien sometiéndola a vórtice e inyectada en pollos White Leghorn libres de coccidios de 4-6 semanas de edad en 0,75 ml administrados subcutáneamente.

La vacuna contenía 150 \mug de Quil A/dosis.

La Figura 2 muestra una SDS-PAGE teñida con Coomassie BB de EASC2 (Calle 1) y fracción hidrófila TX114 de 42 horas (Calle 2) inyectados en los pollos en forma de vacuna.

Cuatro semanas después del cebado las aves fueron reforzadas con la misma dosis a través de la misma ruta. La vacuna de refuerzo fue preparada de nuevo a partir de la provisión de antígeno congelada.

Los pollos de control fueron inoculados con 150 \mug de Quil A/dosis en PBS. Cada grupo comprendía 14 pollos.

Once días después de la vacunación de refuerzo todos los pollos fueron inoculados oralmente con 240 oocistos esporulados de Eimeria acervulina H en 1 ml de sacarosa en agua al 15%.

Los pollos fueron colocados en jaulas a 2 aves por jaula. Se evaluó la producción de oocistos en muestras fecales tomadas los días 4 a 8 después de la sensibilización.

En la Tabla 2 se muestran los resultados de este experimento. La producción de oocistos es expresada como % de oocistos de la producción en los animales de control.

La evaluación estadística de los datos fue realizada en el LOG del número de oocistos utilizando el test de la t de Student o el test de Mann-Whitney si los datos de la distribución no son normales.

Cuando p<0,05 la diferencia era considerada significativa.

En esta tabla se muestra que tanto la fracción de TX114 como la fracción purificada con prepcell EASC2 inducen una reducción estadísticamente significativa (p<0,05) en la producción de oocistos tras la sensibilización.

La purificación con PrepCell parecía mejorar la protección inducida por la vacuna TX114.

TABLA 2 Producción de oocistos en porcentajes del control y valor estadístico de la diferencia

Inmunógeno	% producción de oocistos	Valor p diferente
	del control \pm D.T.	del control
PrepCell EASC2 puro \pm 5 \mug/dosis	72 \pm 30	p=0,01
Proteínas hidrófilas TX114 de Esquizontes \pm 15 \mug/dosis	84 \pm 17	p=0,02

En otro experimento en el cual se utilizaban solamente extractos totales de esquizontes de 42 horas como vacuna no se pudo inducir una reducción significativa de oocistos (resultados no mostrados).

En un segundo experimento se utilizó EASC2 purificado mediante PrepCell a dos concentraciones diferentes de 0,2 y 2 mg/dosis. Siguiendo el mismo protocolo para la inmunización y la sensibilización, se midió la protección en diez pollos por grupo como la reducción de la producción de oocistos en comparación con el grupo al que se había inoculado PBS/QuilA.

En la Tabla 3 se resume la producción de oocistos media porcentual del control para los dos grupos vacunados con EASC2. Esta tabla demuestra que EASC2 protegía de una manera dependiente de la dosis mostrando una diferencia estadísticamente significativa a una dosis de 2 \mug/dosis.

TABLA 3 Producción de oocistos en porcentajes del control y valor estadístico de la diferencia

Grupo	% oocistos \pm D.T.	Diferencia significativa
	(producción de control = 100%)	del control (valor p)
EASC2/QuilA 2 \mug/dosis	64,0 \pm 22	0,008
EASC2/QuilA 0,2 \mug/dosis	90,2 \pm 27	NO SIGNIFICATIVA

Ejemplo 4 Estimulación inmunológica tras la vacunación con las proteínas hidrófilas EASC2 o TX114

En ambos experimentos de protección mencionados antes se analizó en los pollos la estimulación de los parámetros inmunológicos tales como la proliferación de linfocitos T y los anticuerpos del suero.

Anticuerpos del Suero

Los anticuerpos que reconocen los constituyentes de la vacuna solamente fueron detectados en sueros de grupos vacunados con la fracción hidrófila TX114 de 42 horas y no del grupo vacunado con EASC2 purificada.

Proliferación de Linfocitos

Se sometió a ensayo la proliferación de linfocitos tras el estímulo antigénico en un ensayo de estimulación de linfocitos (LST).

Método

Antes de la sensibilización se recogieron glóbulos rojos periféricos de todos los pollos de cada grupo.

Los leucocitos periféricos de la sangre (PBL) fueron aislados mediante centrifugación de 3 ml de sangre completa durante 7 minutos a 64 g a la temperatura ambiente. La capa leucocitaria fue recogida en RPMI 1640 (modificación Dutch) y lavada dos veces. La concentración celular fue ajustada a 1 x 10^{7} células por ml en RPMI 1640. El RPMI 1640 (modificación Dutch) utilizado fue suplementado con piruvato de sodio (1 mM), Glutamina (2 mM), penicilina 200 U/ml y estreptomicina 200 \mug/ml.

Se sembraron placas para el cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos con 0,05 ml de suspensión celular con suero de pollo al 3,0% (Gibco BRL), 0,05 ml de suspensión de "antígeno estimulador" y 0,05 ml de RPMI 1640, se cultivaron durante 64 horas a 41ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%. Con posterioridad se añadieron 18,5 kBq de timidina-3H (Amersham Beckenham U.K.) por pocillo y 8 horas más tarde las células fueron cosechadas sobre un filtro de fibra de vidrio (Skatron Norway Bluemat) utilizando un Cell Harvester de 96 pocillos (Skatron Norway). Los filtros fueron saturados con fluido de centelleo (LKB BetaScint) y sometidos a recuento en un Betaplate 1205 (Pharmacia/LKB Sweden).

Como "antígeno estimulador" se utilizaron esquizontes de E. acervulina, que habían sido sometidos a sonicación utilizando un aparato de sonicación Branson equipado con una micropunta en la posición 6 durante 3 x 20 segundos con una refrigeración intermedia y almacenamiento a -70ºC. Los antígenos fueron descongelados antes de su uso y diluidos para satisfacer la concentración utilizada para la estimulación. Los PBL de todos los grupos fueron estimulados con 3\cdot10^{5} esquizontes de E. acervulina.

La evaluación estadística se realizó utilizando el test de la t de Student sobre el Log del Indice de Estimulación (SI) (el número de cuentas por minuto (cpm) de los cultivos estimulados dividido por las cpm del control no estimulado). Cuando p<0,05 la diferencia era considerada significativa.

Resultados

Tabla 4. Muestra el S.I. medio de los grupos de ambos experimentos descritos antes. El primer experimento en el cual se comparaba la vacuna de EASC2 con la fracción hidrófila TX114, y el segundo experimento que trataba de las dos dosificaciones de la vacuna de EASC2.

Parecía que todos los antígenos o dosificaciones inducían una respuesta de las células T positiva significativa detectable en la sangre periférica en el momento de la sensibilización.

En ambos experimentos, no obstante, la dosis más alta de vacuna de EASC2 pura de PrepCell (2 ó 5 \mug/dosis) inducía la más elevada estimulación de las células T. La graduación de la estimulación de las células T se correspondía con la reducción en la producción de oocistos tras la sensibilización.

TABLA 4 Incorporación media de timidina-H^{3} tras la estimulación con esquizontes de E. acervulina por PBL de grupos inmunizados con las diferentes vacunas, expresada como Indice de Estimulación (S.I.) \pm Error Estándar (SE)

Experimento	Grupo	Incorporación de timidina-H^{3} en S.I. \pm SE
I	EASC2 5 \mug	120 \pm 47 @
	Proteínas hidrófilas TX114	31 \pm 12 @
	Placebo	6 \pm 1
II	EASC2 2 \mug	112 \pm 28 @
	EASC 0,2 \mug	24 \pm 4 @
	Placebo	2,3 \pm 0,3
@) Significativo a partir del grupo de control p<0,001

Ejemplo 5 Experimentos de clonación Esporulación de oocistos de E. acervulina

Se centrifugó una suspensión de 5*10^{8} oocistos de E. acervulina en 60 ml de ditionita de sodio 10^{-4} M, después de lo cual el sedimento se lavó una vez con 100 ml de agua estéril. Las células fueron resuspendidas en 500 ml de bicromato de potasio al 2% y después incubadas bajo la influencia de una aireación fuerte durante 7 horas a -30ºC. Los oocistos fueron recogidos después mediante centrifugación y lavados tres veces con 200 ml de agua estéril.

Aislamiento de ARN

Para el aislamiento del ARN (Pasternak J. y col., Mol. & Bioch. Par. 3, 133-142, 1981) se recogió el sedimento celular en 2,8 ml de tampón conteniendo Tris acetato 10 mM (pH 7,6), acetato de sodio 75 mM, SDS al 1%, EDTA
2 mM, 0,2 mg/ml de proteinasa K y complejos de vanadil-ribonucleósido 10 mM. Los oocistos fueron destruidos sometiendo a vórtice durante 60 segundos (máx) en presencia de 13 g de cuentas de vidrio (\diameter 0,5 mm). Se añadieron 5 ml de fenol al extracto total y la mezcla se sometió a vórtice durante 60 segundos más. Tras centrifugar, el licor sobrenadante fue separado pipeteando y de nuevo extraído con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). El ARN se hizo precipitar tras añadir 2,5 volúmenes de etanol y el producto precipitado resultante se disolvió en
800 ml de Tris 10 mM, EDTA 0,1 M pH 7,6 (T_{10}E_{0,1}), después de lo cual el producto fue extraído dos veces más con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y dos veces con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y después se hizo precipitar con etanol. Se aisló ARN-poliA^{+} por medio de cromatografía en oligo(dT)-celulosa (Maniatis T. y col.: Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Se aislaron aproximadamente
100 \mug de ARN-poliA^{+} partir de 5*10^{8} oocistos.

Síntesis de ADNc

Se convirtió el ARN-poliA^{+} en ADNc por medio de la enzima transcriptasa inversa MMLV. Para este fin, se disolvieron 25 \mug de ARN-poliA^{+} en 90 ml de agua y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 20ºC añadiendo hidróxido de metilmercurio a 10 \muM, después de lo cual se añadió \beta-mercaptoetanol a 45 \muM y la mezcla se incubó durante 3 minutos más a 20ºC. La reacción enzimática se llevó a cabo en 190 ml de tampón conteniendo 4 mg de oligo(dT)15, 150 U de ARNasin(R), Tris 20 mM (pH 7,6), KCl 30 mM, ditiotreitol 4 mM (DTT), MgCl_{2} 2 mM, cada uno de los dNTP 1 mM y 3.000 U de transcriptasa inversa de MMLV. La reacción se detuvo al cabo de una hora de incubación a 37ºC añadiendo 10 ml de EDTA 0,5 M. Tras la extracción con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), el híbrido de ARN/ADN se hizo precipitar añadiendo acetato de amonio 2 M y 2,5 volúmenes de etanol. La acción combinada de las enzimas ADN polimerasa I y ARNasa H (Gubbler U. y col., Gene 25, 263-269, 1983) produce la síntesis de la segunda hebra. El sedimento fue disuelto en 960 \mul de tampón conteniendo Tris 20 mM (pH 7,6), MgCl_{2} 5 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, \beta-NAD 0,6 mM, 16 U de ARNasa H, 200 U de ADN polimerasa I y 20 U de ADN ligasa (E. coli). El tiempo de incubación era de 1 hora a 12ºC y después 1 hora a 22ºC, después de lo cual la reacción se detuvo añadiendo un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y precipitando con etanol.

Antes de que el ADNc fuera clonado en un vector adecuado para este propósito, fue modificado primero. El ADNc (5 \mug) fue disuelto en 100 \mul de tampón conteniendo acetato de sodio 30 mM (pH 5,6), NaCl 50 mM, ZnSO_{4} 1 mM y 21 U de Nucleasa de Judía Mung. Tras incubar durante 30 minutos a 37ºC se detuvo la reacción añadiendo EDTA hasta 10 mM y Tris hasta 25 mM. Tras la extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) la mezcla fue desalada en una columna Sephadex G50. Se añadieron al producto eluido (125 \mul) los siguientes: Tris pH 7,6 hasta
50 mM, EDTA hasta 2,5 mM, DTT hasta 5 mM, S'-adenosilmetionina hasta 0,5 mM y 100 U de EcoRI-metilasa. Tras incubar durante 30 minutos a 37ºC, la reacción se detuvo calentando durante 15 minutos a 65ºC, después de lo cual se añadió 1/10 el volumen de una solución que contenía Tris-HCl 100 mM, MgCl_{2} 100 mM y NaCl 500 mM (pH 7,5), y, al mismo tiempo, cada dNTP hasta 1 mM y 12,5 U de ADN polimerasa de Klenow. La reacción se detuvo añadiendo un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) después de incubar durante 60 minutos a 22ºC. El licor sobrenadante se hizo precipitar después de añadir 350 \mul de H_{2}O y 50 \mul de acetato de sodio 3 M (pH 5,6) con 500 \mul de isopropanol. Después de disolver en 100 ml de H_{2}O, el sedimento fue desalado sobre Sephadex G50 y el producto eluido se hizo precipitar con etanol. Después de disolver el sedimento en 24 \mul de H_{2}O, se llevó a cabo la ligadura en 50 \mul añadiendo 2 \mug de conector EcoRI, Tris-HCl (pH 8,0) hasta 30 mM, MgCl_{2} hasta 10 mM, ditiotreitol hasta 10 mM, ATP hasta 1 mM, gelatina hasta 0,1 mg/ml y 10 U de ADN ligasa de T4. La reacción se detuvo después de una incubación de 16 horas a 4ºC calentando (durante 15 minutos a 70ºC) después de lo cual se llevó a cabo el corte con endonucleasas de restricción EcoRI en 210 \mul de tampón conteniendo Tris-HCl 100 mM (pH 7,6), NaCl
50 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2,5 mM y 500 U de EcoRI. Tras 90 minutos de incubación a 37ºC, la reacción se detuvo por medio de extracción con un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). El licor sobrenadante se hizo precipitar con 2,5 volúmenes de etanol después de añadir acetato de sodio (pH 5,6) a ADNc 300 mM y los conectores fueron separados por medio de una columna Biogel A15M. El ADNc se hizo precipitar con etanol, después de lo cual el producto precipitado se disolvió en Tris-HCl 19 mM, EDTA 0,1 mM (pH 7,6). Las moléculas de ADNc fueron clonadas después en el fago lambda ZAPII (Stratagene).

El rastreo del banco de ADNc (2*10^{5} pfu) con los anticuerpos dirigidos contra la fracción de proteína EASC2 de esquizontes de E. acervulina reveló seis clones del fago positivos. Estos anticuerpos fueron diluidos 1:2.000 con 1x sal Tris (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0) + Tween 20 al 0,05% + Suero de Ternera Fetal (FCS) al 10% e incubados durante dos horas a la temperatura ambiente (TA) con los filtros. Después los filtros fueron lavados 4 veces, durante 10 minutos cada vez, con 50 ml de 1x sal Tris + Tween 20 al 0,05%, cada filtro. Para la incubación del segundo anticuerpo se utilizó un producto conjugado de anticuerpos anti-cabra de conejo y fosfatasa alcalina (diluida 1:7.500 en 1x sal Tris + Tween 20 al 0,05% + FCS al 10%) y se incubó durante 30 minutos a la TA, después de lo cual los filtros se lavaron como se ha descrito después de la primera incubación. La reacción de color se llevó a cabo en Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM (pH 9,6), en el cual se disolvieron 0,33 mg/ml de nitroazul de tetrazolio y 0,17 mg/ml de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. Los filtros fueron evaluados al cabo de 30 minutos de incubación a la TA. Los clones inmunopositivos fueron purificados en placa y rescatados por medio de separación por corte in vivo, según el protocolo del fabricante (Stratagene). El ADN plasmídico fue aislado, de los clones de la separación por corte in vivo resultantes, con el fin de secuenciarlos según los protocolos normalizados (Maniatis T., y col., supra). La información de la secuencia parcial mostró que todos los clones eran homólogos, a partir del clon más grande se determinó completamente la secuencia de nucleótidos. Este clon, denominado pBLUE EASC2, contenía un inserto de 1566 pb.

Leyenda de las figuras

Fig. 1. Transferencia Western de proteínas de esporozoitos de E. acervulina (A) y E. tenella (B) sondeadas con antisueros originados contra la proteína EASC2 purificada mediante PrepCell (Calle 1) o suero de control pre-inmune (Calle 2). Los marcadores indican la calibración del peso molecular en kD.

Fig. 2. SDS-PAGE teñido con Azul Brillante de Coomassie de la proteína EASC2 purificada mediante PrepCell (Calle 1) o fracción hidrófila de TX114 de esquizontes de 42 horas de E. acervulina (calle 2). La calle M contiene marcadores para la calibración del peso molecular en kD.

(1) INFORMACION GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Akzo Nobel N.V.

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(B): CALLE: Velperweg 76

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(C): CIUDAD: Arnhem

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(E): PAIS: Holanda

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(F): CODIGO POSTAL: 6824 BM

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(G): TELEFONO: 14120-66204

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(H): TELEFAX: 04120-50592

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(I): TELEX: 37503 akpha nl

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(ii): TITULO DE LA INVENCION: proteína estimuladora de las células T de Eimeria

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(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:

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(A): TIPO MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C): SISTEMA OOPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOPORTE LOGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 1:

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(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1679 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGIA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLECULA: ADNc a ARNm

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(iii): HIPOTETICO: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): ORGANISMO: Eimeria acervulina

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(D): FASE DE DESARROLLO: Esquizonte

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: EASC2_1

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(ix): RASGOS:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACION: 280..1269

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(D): OTRA INFORMACION: /función="lactato-deshidrogenasa de Eimeria"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: rasgo misc_

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(B): LOCALIZACION: 1..51

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(D): OTRA INFORMACION:/marca=pBluescriptII

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: rasgo misc_

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(B): LOCALIZACION: 1624..1679

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(D): OTRA INFORMACION:/marca=pBluescriptII

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: rasgo misc_

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(B): LOCALIZACION: 45..54

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(D): OTRA INFORMACION:/marca=conector EcoRI

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: rasgo misc_

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(B): LOCALIZACION: 1621..1630

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(D): OTRA INFORMACION:/marca=conector EcoRI

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(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NUM: 2:

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(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 330 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): topología: lineal

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(ii): TIPO DE MOLECULA: proteína

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(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 2:

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4

5

Claims

1. Una lactato deshidrogenasa (LDH) de Eimeria que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NUM: 2, o una variante natural de dicha LDH de Eimeria.

2. Una proteína según la reivindicación 1, donde la especie de Eimeria es Eimeria acervulina.

3. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 3, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID NUM: 1.

5. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, conectada operativamente a una secuencia de control de la expresión que permite la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.

6. Un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4.

7. Un vector recombinante según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico está conectada operativamente a una secuencia de control de la expresión.

8. Una célula huésped u organismo no humano transformado con una secuencia de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, o una molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 5, o un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7.

9. Un procedimiento para expresar la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 8.

10. Una vacuna para la protección de la volatería contra la coccidiosis, caracterizada porque comprende una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, una molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 5, un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, una célula huésped u organismo según la reivindicación 8, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Un procedimiento para la preparación de una vacuna para la coccidiosis que comprende las etapas de cultivar una célula huésped u organismo no humano infectado con un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, recoger el vector recombinante y formular dicho vector recombinante en una preparación farmacéutica con actividad inmunizadora.

12. Un procedimiento para la preparación de una vacuna de la coccidiosis que comprende formular una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una proteína preparada según el procedimiento de la reivindicación 9 en una preparación farmacéutica con actividad inmunizadora.

13. Un anticuerpo o antisuero específicamente inmunorreactivo con una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.