DE3785404T2

DE3785404T2 - Impfstoffe.

Info

Publication number: DE3785404T2
Application number: DE8787307267T
Authority: DE
Inventors: Vincent Mcdonald; Martin William Shirley
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1986-08-18
Filing date: 1987-08-17
Publication date: 1993-07-29
Anticipated expiration: 2007-08-18
Also published as: EP0506211A1; ES2054679T3; EP0256878B1; CA1300013C; DE3752263D1; US20060165731A1; DE3785404D1; DE3752263T2; JPH10291938A; US5055292A; ES2129423T3; JPS6399019A; EP0506211B1; EP0256878A3; JP3020226B2; EP0256878A2

Description

Die Erfindung betrifft Impfstoffe gegen Coccidiose in Haushühnern und Stämme von Eimeria mit abgeschwächter Virulenz zur Verwendung in solchen Impfstoffen.
Coccidiose von Haushühnern, insbesondere des Hühnchens Gallus domesticus (nachfolgend der Einfachheit halber als Hühnchen bezeichnet) ist eine ökonomisch wichtige Erkrankung, die von einer der sieben Spezien von Eimeria verursacht wird, die bei Entwicklung und Vermehrung innerhalb der Epithelzellen des Darmes darin Läsionen hervorrufen. Die meisten Geflügelzüchter verwenden vorbeugende Mittel, um einen Ausbruch dieser Krankheit zu verhindern, deren typische Anzeichen Anorexie, Gewichtsverlust, Durchfall und Blut in den Fäkalien sind. Trotz der Verwendung solcher Mittel bleibt die Coccidiose weiterhin ein großes Problem und die jährlichen Kosten, die von ihr in der Geflügelindustrie hervorgerufen werden, wurden mit 500 Millionen $ geschätzt, wobei die Hälfte davon der medikamentösen Behandlung zugeordnet wird.
Es wurde jedoch gefunden, daß die Lebensdauer vieler Mittel gegen Coccidiose aufgrund des Auftretens resistenter Stämme oder des Aktivitätsverlustes gegenüber allen Stämmen oder Spezien von Eimeria relativ kurz ist. In Vögeln, außer denen, die zum Grillen bestimmt sind, wird eine medikamentöse Behandlung nur mit einem Mittel (Amprolium) während der Eiproduktion erlaubt. Darüberhinaus beeinträchtigen solche Behandlungen während der Aufzuchtperiode den Erwerb von Immunität, und machen so die Vögel empfänglich, wenn die Mittel abgesetzt werden.
Es wurde auch vorgeschlagen, die Coccidiose immunologisch unter Verwendung eines aktiven Impfstoffes zu kontrollieren, der aus einer Suspension von vollständig virulenten Oozyten von Eimeria-Spezien besteht. Diese Technik stützt sich jedoch auf die Selbst-Reinfizierung mit Oozyten, die aus der ursprünglichen Verabreichung stammen, und ist nur für Vögel geeignet, die auf Streu gehalten werden, was sb durchgeführt werden muß, daß man günstige Bedingungen für das Überleben und die Sporenbildung der Oozyten bereitstellt. Ein anderes Problem ist es, sicherzustellen, daß jeder Vogel die richtige Anfangsdosis erhält; eine zu große Menge an Impfstoff einiger Spezien ruft pathogene Effekte hervor, während eine zu geringe Menge an Wirkstoff zu einer unzureichenden Immunisierung führt, um dem Angriff virulenter Oozyten in der Streu entgegen zu wirken. Diese Schwierigkeiten sind vermutlich für die meisten Fehlschläge verantwortlich, die erhalten werden, wenn ein solcher Impfstoff für zum Gillen bestimmte Vögel verwendet wurde.
Der Lebenscyclus aller Eimeria-Spezien ist im wesentlichen der gleiche, obwohl jede für die Entwicklung eine bevorzugte Stelle im Darm besitzt. Die Infektion erfolgt durch Verdauung von mit Sporen versehener Oozyten, die im Darm Sporozyten freisetzen, die ihrerseits Sporozoiten freisetzen. Die letztern lokalisieren sich im Epithel und wandeln sich in Trophozoiten um. Diese unterliegen einem Merogonie-Prozeß und werden Schizonten der ersten Generation. Merozoiten werden dann freigesetzt und lokalisieren sich wieder im Epithel des Darmes und wachsen, um Schizonten der zweiten Generation zu bilden. Auf gleiche Weise kann sich eine dritte oder sogar vierte Generation von Schizonten bilden. Diese Schizonten, oder die geschlechtlichen Stufen, die sich daraus bilden, sind relativ groß und verantwortlich für den Gewebeschaden, der der hauptsächliche pathogene Effekt der Infektion ist.
Nachfolgend bilden die Merozoiten Macrogametozyten und Microgametozyten, die Microgameten freisetzen. Die ersteren werden durch Microgameten befruchtet und bilden nicht mit Sporen versehene Oozyten, die in den Darm freigesetzt und mit den Fäkalien ausgeschieden werden. Die Sporenbildung erfolgt in der Streu und die unvermeidliche Aufnahme dieses Materials durch die Vögel führt zu einer weiteren Infektion mit den mit Sporen versehenen Oozyten.
Das Auftreten von Oozyten in den Fäkalien ist als Durchgängigkeit bekannt. Die Zeit von der Aufnahme von mit Sporen versehenen Oozyten bis zum Auftreten in den Fäkalien wird als latente Zeit bezeichnet. Diese ist unter den verschiedenen Eimeria-Spezien verschieden.
Es wurde gefunden, daß eine gewisse Verminderung der Pathogenizität der Parasiten erreicht werden kann durch wiederholten Durchgang in Hühnchen mit Selektion auf ein frühes Auftreten Oozyten. Auf diesem Wege können Populationen mit stark verringerten Latentzeiten und stark verringerter Pathogenizität selektiert werden. Obwohl der Mechanismus einer solchen Verminderung nicht vollständig aufgeklärt ist, wird allgemein angenommen, daß dies von Erschöpfung und/oder Verringerung in der Größe mindestens einer Schizonten-Generation verursacht wird, wodurch die Gewebsschädigung verringert wird. Solche Stämme mit abgeschwächter Virulenz, mit verkürzten Latenzzeiten werden allgemein als "frühreife Stämme" bezeichnet.
Es wurde nun gefunden, daß eine solche abgeschwächte Virulenz (Verringerung) bei gleichzeitiger Beibehaltung der Immunogenizität erreicht werden kann, und dies stellt die Möglichkeit einer immunologischen Kontrolle der Coccidiose unter Verwendung von Impfstoffen auf der Basis lebender verdünnter frühreifer Stämme von Eimeria mit abgeschwächter Virulenz bereit. Dies vermeidet einige der Probleme, die mit nichtabgeschwächten lebenden Impfstoffen verbunden sind, weil im allgemeinen die Überschreitung der empfohlenen Dosis dann weniger wahrscheinlich zu pathogenen Effekten führen wird, und die Akkumulierung nichtvirulenter Oozyten in der Spreu wird keine pathogene Infektion in Vögeln mit einer Unterdosierung, die noch keine Immunität entwickelt haben, hervorrufen.
Die frühreifen Stämme können aus dem Mutterstamm, wie vorstehend angegeben, durch seriellen Durchgang in Hühnchen und Einsammeln der Oozyten aus den Fäkalien oder dem homogenisierten Blindarmgewebe in den ersten Stunden nach der Durchgängigkeit erhalten werden. Auf diesem Wege wird die Latenzzeit fortschreitend verringert.
Dieser Typus des Durchgangs wird als Selektionsdurchgang bezeichnet. Um die Zahl der erhältlichen Oozyten zu erhöhen kann es vorteilhaft sein, die Oozyten zu einem Zeitpunkt zwischen dem Beginn der Durchgängigkeit und etwa der Latenzzeit des Mutterstammes (neutraler Durchgang) einzusammeln, oder praktisch alle Oozyten, einschließlich der nach der Latenzzeit des Mutterstammes (relaxierter Durchgang) auftretenden einzusammeln.
In Anbetracht der weiten Verbreitung und Pathogenizität der verschiedenen Eimeria-Spezien sind wir zu dem Schluß gekommen, daß ein erfolgreicher abgeschwächter Impfstoff gegen Coccidiose mindestens lebende abgeschwächte frühreife Stämme von Eimeria acervulina, Eimeria maxima und Eimeria tenella enthalten sollte. Vorteilhafterweise sind aktive abgeschwächte frühreife Stämme von Eimeria necatrix, Eimeria mitis und Eimeria brunetti vorhanden; wünschenswerterweise ist auch ein abgeschwächter aktiver Stamm von Eimeria praecox vorhanden.
Es wurde gefunden, daß bestimmte Eimeria-Spezien, insbesondere Eimeria maxima, eine bemerkenswerte gegenseitige antigene Verschiedenheit zeigen, so daß eine Infektion mit einigen Stämmen Hühnchen nur in einem begrenztem Ausmaß gegen andere Stämme der gleichen Spezies schützen wird. Es kann deshalb wünschenswert sein, in einem Impfstoff gegen Coccidiose zwei oder gegebenenfalls mehrere Stämme einzubauen, die von wechselseitig immunologisch verschiedenen Stämmen von Eimeria abgeleitet sind, insbesondere Eimeria maxima.
Bei der Formulierung eines Wirkstoffs, der eine Anzahl abgeschwächter Stämme von Eimeria-Spezien enthält, ist es wichtig, daß diese in Anteilen vorhanden sind, die dazu geeignet sind, um einen zufriedenstellenden Immunitätsgrad gegen die relevanten Eimeria-Spezien ohne bedeutsame pathogene Effekte hervorzurufen. Die geeigneten Anteile basieren somit unter anderem auf der Immunogenizität und Pathogenizität der abgeschwächten Stämme. Wir haben diese Parameter im Hinblick auf abgeschwächte frühreife Stämme aller relevanten Eimeria-Spezien bestimmt. Obwohl einige Information über solche Parameter im Hinblick auf die getrennten Eimeria-Spezien veröffentlicht wurden (so wurden z.B. frühreife Stämme von E. tenella, E. acervulina und E. mitis hergestellt) geschah dies aber nicht in einer Form, die die Berechnung der am meisten geeigneten Anteile der abgeschwächten Stämme für den Einbau in einem erfolgreichen Impfstoff gegen Coccidiose erlauben würde. EP 0 047 662 und McDonald et al., Parasitology 1982, 84, 21-30 beschreiben einen frühreifen Stamm von E. acervulina. Jeffers, J. Parasitology 1975, 61, 1083 - 1090 beschreiben einen frühreifen Stamm von E. tenella und Abschwächung von E. mitis durch Selektion für eine frühreife Entwicklung, wie von McDonald et al. Parasitology 1983, 86, 371-379 beschrieben.
Die bevorzugten Anteile der Anzahl an mit Sporen versehenen Oozyten jeder der getrennten abgeschwächten frühreifen Stämme im Impfstoff (wo vorhanden) können zweckmäßigerweise als Zahl der mit Sporen versehenen Oozyten, bezogen auf 100 mit Sporen versehenen Oozyten von E. acervulina ausgedrückt werden, nämlich wie folgt:
E. maxima 15 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, insbesondere 18 bis 22, z.B. ca. 20.
E. tenella 70 bis 110, vorzugsweise 75 bis 105, insbesondere 95 bis 102, z.B. ca. 90.
E. brunetti 15 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, insbesondere 18 bis 22, z.B. ca. 20.
E. mitis 180 bis 220, vorzugsweise 190 bis 210, insbesondere ca. 200.
E. necatrix 70 bis 110, vorzugsweise 90 bis 110, insbesondere 75 bis 105, z.B. ca. 90.
E. praecox 15 bis 25, vorzugsweise 18 bis 22, insbesondere ca. 20.
Wie vorstehend angegeben kann es wünschenswert sein, zwei oder mehrere immunologisch verschiedene abgeschwächte Stämme von Eimeria-Spezien, z.B. E. maxima, einzuschließen, und die obigen Zahlenwerte beziehen sich auf jede der getrennten Stämme, wenn diese vorhanden sind.
Gemäß einem Merkmal der Erfindung wird deshalb ein abgeschwächter Impfstoff gegen Coccidiose bereitgestellt, der lebende abgeschwächte frühreife Stämme von mindestens E. acervulina, E. maxima und E. tenella enthält, wobei die Anzahl von mit Sporen versehener Oozyten jedes getrennten Eimeria-Stammes, die pro 100 mit Sporen versehener Oozyten von E. acervulina für E. maxima 15 bis 30 und E. tenella 70 bis 110 beträgt.
Wenn mit Sporen versehene Oozyten anderer lebender abgeschwächter frühreifer Eimeria-Stämme vorhanden sind, kann die Anzahl relativ zu E. acervulina in Übereinstimmung mit den vorstehend angegebenen Zahlenwerten sein.
Die Abschwächung kann zweckmäßigerweise ausgedrückt werden als Latenzzeit in einer Standard-Hühnchenbrut; für die Zwecke dieser Beschreibung wird die Latenzzeit definiert als die Zeit zwischen der oralen Aufnahme gewaschener, mit Sporen versehener Oozyten von Light Sussex-Hühnchen (die vor der Beimpfung coccidiosenfrei gehalten werden, und zum Experimentieren in mit Drahtboden versehene Käfige überführt werden) und dem ersten Auftreten von Oozyten in den Fäkalien.
Um einen brauchbaren Abschwächungsgrad zu erzielen, sollte die Latenzzeit von abgeschwächten Stämmen kürzer sein als die des nicht abgeschwächten Mutterstammes. Die Selektion von außerordentlich kurzen Latenzzeiten führt jedoch zur Verringerung in der Reproduktion in einem Ausmaß, daß im Darm ungenügend Parasiten vorhanden sind, um die erforderliche immunologische Antwort hervorzurufen. Es ist deshalb wichtig, daß die Latenzzeiten der selektierten Stämme innerhalb relativ enger Grenzen liegen.
Vorteilhafte Bereiche von Latenzzeiten der getrennten abgeschwächten frühreifen Stämme von Eimeria-Spezien zur Verwendung im Impfstoff sind nachfolgend angegeben. Die Verringerung der Latenzzeit im Vergleich zum Mutterstamm ist (in Bezug auf die kürzeste Latenzzeit) angegeben.
E. acervulina 60 bis 84 Stunden (Verringerung bis zu 37 Stunden der 97stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 64 bis 78 Stunden, insbesondere 66 bis 72 Stunden.
E. maxima MFP 80 bis 118 Stunden (Verringerung bis zu 31 Stunden der 21stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 104 bis 110 Stunden, insbesondere 108 bis 110 Stunden.
E. maxima CP 90 bis 120 Stunden (Verringerung bis zu 36 Stunden der 126stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 100 bis 118 Stunden, insbesondere 110 bis 120 Stunden.
E. tenella 90 bis 125 Stunden (Verringerung bis zu 42 Stunden der 132stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 107 bis 120 Stunden.
E. necatrix 90 bis 126 Stunden (Verringerung bis zu 48 Stunden der 138stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 100 bis 120 Stunden.
E. mitis 60 bis 84 Stunden (Verringerung bis zu 41 Stunden der 101stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 64 bis 78 Stunden, insbesondere 64 bis 72 Stunden.
E. brunetti 70 bis 100 Stunden (Verringerung bis zu 50 Stunden der 120stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 70 bis 90 Stunden, insbesondere 75 bis 88 Stunden.
E. praecox 44 bis 75 Stunden (Verringerung bis zu 40 Stunden der 84stündigen Latenzzeit des Mutterstammes), vorzugsweise 64 bis 75 Stunden, insbesondere 64 bis 70 Stunden.
Gemäß einem zweiten Merkmal der Erfindung wird ein abgeschwächter Impfstoff gegen Coccidiose bereitgestellt, der mindestens einen abgeschwächten frühreifen Stamm von E. acervulina enthält, mit einer Latenzzeit im Bereich von 60 bis 84 Stunden, von E. maxima mit einer Latenzzeit im Bereich von 80 bis 120 Stunden und von E. tenella mit einer Latenzzeit im Bereich von 90 bis 125 Stunden.
Wenn andere abgeschwächte frühreife Eimeria-Stämme vorhanden sind, so sind die Latenzzeiten wünschenswerterweise in Übereinstimmung mit den vorstehend angegebenen Latenzzeiten.
Im allgemeinen ist es wünschenswert, daß die durch ihre obigen Latenzzeiten selektierten abgeschwächten Stämme stabil sind, wenn sie durch Hühnchen hindurchlaufen, um eine Reversion zu Virulenz zu vermeiden, wenn, wie dies normalerweise unvermeidbar ist, mit Sporen versehene Oozyten, die in den Fäkalien nach der Beimpfung auftreten, aufgenommen werden und so mehrere Male durchlaufen, bevor die Vögel ausreichend immunisiert werden. Eine Reversion zur Virulenz könnte so zu einer pathogenen Infektion führen. Wenn die Vögel davon abgehalten werden, Fäkalien aufzunehmen, z.B. wenn sie in Käfigen mit einem Drahtboden gehalten werden, wird dieses Problem nicht auftauchen und die Stabilität der Abschwächung ist dann nicht wesentlich. Darüberhinaus sind einige Spezies ausreichend immugen, so daß die Vögel zum Zeitpunkt, bei dem die Oozyten einmal oder zweimal durchgelaufen sind, immunisiert sind. Im allgemeinen sind jedoch die optimal selektierten abgeschwächten Stämme solche, die bei einem relaxierten Durchgang mindestens fünfmal, und wünschenswerterweise mindestens siebenmal im Wirtshühnchen stabil sind.
Eine Anzahl abgeschwächter frühreifer Eimeria-Stämme, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, wurden in Form von Sporozyten bei der European Collection on Animal Cell Cultures, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, England als Patenthinterlegungen gemäß dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren unter den folgenden Nummern und Daten hinterlegt: Stamm Code* Nummer Zeitpunkt der Hinterlegung E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella Juli November
Die abgeschwächten Stämme werden gemäß dem folgenden Code identifiziert: Dem Mutterstamm wird ein Code-Buchstabe gegeben, der seinen Ursprung angibt, z.B. E. acervulina H oder E. maxima C. Die abgeschwächten oder frühreifen Stämme werden mit dem zusätzlichen Buchstaben P codiert, gefolgt von einer Zahl, die die Zahl der seriellen Durchgänge, denen sie unterworfen wurden, anzeigt. Wo ein Sub-Stamm aus einem einzelnen Oozyt des Stammes geschaffen wurde, wird der Buchstabe s angefügt, und wo der Sub-Stamm einem seriellen neutralen oder relaxiertem Durchgang unterworfen wurde, ist eine weitere Zahl hinzugefügt, die der Zahl solcher Durchgänge entspricht. So bezieht sich E. acervulina HP 71s + 13 auf einen frühreifen Stamm, der durch 71 Durchgänge des H-Stammes von E. acervulina mit Selektion für eine frühe Entwicklung von Oozyten, gefolgt von einem Durchgang eines einzelnen Oozyt und dann von 13 seriellen relaxierten oder neutralen Durchgängen abgeleitet ist. Wo der Durchgang eines einzelnen Oozyten oder Sporozoiten wiederholt wird, wird "2s" angegeben, gefolgt von der Zahl der relaxierten oder neutralen Durchgänge nach dem zweiten "s"-Durchgang.
Varianten der vorstehend genannten hinterlegten Stämme können Latenzzeiten im vorstehend angegebenen Bereich besitzen, wodurch sie sich von ihren nichtabgeschwächten Mutterstämmen unterscheiden können. Solche Varianten-Stämme umfassen Nachkommen, die sich aus dem weiteren Druchlaufenlassen ergeben, und andere Varianten, die von den hinterlegten Stämmen nicht unterscheidbar sind. Mutanten umfassen solche, die sich aus natürlicher oder anderer Mutation ergeben.
Um die Merkmale eines frühreifen Stammes zu stabilisieren, wurde es für nützlich gefunden, einen Sub-Stamm durch Hindurchgehenlassen eines einzelnen Oozyten des frühreifen Stammes oder, wenn gewünscht, eines einzelnen Sporozyten oder Sporozoitens davon, auszubilden. Diese Sub-Stämme der frühreifen Stämme können zu den obigen Stämmen colateral sein (indem sie vom gleichen Mutterstamm abgeleitet wurden) oder davon abstammen (nachdem sie von den hinterlegten Stämmen durch weiteres Hindurchgehenlassen, insbesondere neutrales oder relaxiertes Hindurchgehenlassen, wie vorstehend beschrieben, abgeleitet wurden).
Die Oozyten der vorstehend hinterlegten Stämme und ihre Mutanten und Varianten sind morphologisch nicht von denen der Mutterstämme zu unterscheiden. Die frühreifen Stämme unterscheiden sich von den Mutterstämmen in ihren Latenzzeiten, der endogenen Entwicklung, der Pathogenizität und des Reproduktionspotentials. Die Charakteristika der verschiedenen Eimeria-Spezien werden vollständig von P. L. Long und W. M. Reid angegeben (1982: A Guide for the Diagnosis of Coccidiosis in Chickens; University of Georgia Research Report 404) und von L. P. Joyner (1978: Identification und Diagnosis, Avian Coccidiosis, Poultry Science Symposium Nr. 13, British Poultry Science Ltd.). Eine Methode zur Identifizierung der verschiedenen Spezien ist die Enzymelektrophorese, um z.B. Varianten der Enzymglucosephosphatisomerase und -lactatdehydrogenase zu bestimmen. Die charakteristischen Varianten wurden von M. W. Shirley (Proceedings of the Georgia Coccidiosis Conference 1985) kategorisiert. Die abgeschwächten Stämme sind im Hinblick auf diese charakteristischen Enzymvarianten identisch mit den Mutterstämmen.
Mutanten der vorstehend hinterlegten Stämme können z.B. durch weitere Anwendung von Selektionsdruck, wie vorstehend beschrieben, oder anderer Techniken erhalten werden (Goodenough and Levine, Genetics, Holt, Rinehart and Winston Inc. 1974).
Charakteristika von einigen der ungeschlechtlichen Stufen der hinterlegten Stämme und Mutanten und Varianten davon, bestimmt durch Messungen von angefärbten und fixierten Abschnitten infizierter Eingeweide sind die folgenden:
E. acervulina: Der Großteil der Gametozyten entwickelt sich direkt von der dritten Generation von Schizonten; die mittleren Größen der Schizonten und die mittlere Anzahl von darin befindlichen Merozoiten sind im wesentlichen ähnlich zu denen des Mutterstammes.
E. brunetti: Die Mehrzahl von Gametozyten entwickelt sich direkt aus der ersten oder zweiten Generation von Schizonten; die mittleren Größen der ersten und zweiten Generation von Schizonten sind etwas geringer als die des Mutterstammes, während die Anzahl an Merozoiten pro Schizont etwa die gleiche ist.
E. maxima MFP und E. maxima CP: Gametozyten treten ca. 72 Stunden oder früher nach der Infektion auf; die mittleren Größen der Schizonten und die mittlere Anzahl von darin befindlichen Merozoiten sind im wesentlichen ähnlich zu denen des Mutterstammes.
E. mitis: Gametozyten treten nach ca. 66 Stunden auf und entwickeln sich hauptsächlich aus der dritten Generation an Merozoiten; die mittlere Größe der ersten Generation an Schizonten und die mittlere Anzahl von darin befindlichen Merozoiten ist geringer als im Fall des Mutterstammes.
E. necatrix: Die mittlere Größe der zweiten Generation an Schizonten und die mittlere Anzahl der darin befindlichen Merozoiten ist wesentlich geringer als im Fall des Mutterstammes.
E. praecox: Der Großteil der Gametozyten entwickelt sich direkt aus der dritten Generation von Schizonten; die mittleren Größen der Schizonten und die mittlere Anzahl der darin befindlichen Merozoiten sind im wesentlichen ähnlich zu denen des Mutterstammes.
E. tenella: Der Großteil der Gametozyten entwickelt sich direkt aus der dritten Generation der Merozoiten; die mittlere Größe der zweiten Generation der Schizonten und die mittlere Anzahl der darin befindlichen Merozoiten ist beträchtlich geringer als im Fall des Mutterstammes.
Eine "Dosis" des Impfstoffes ist die Menge, die für einen Vogel vorgesehen ist. Im allgemeinen kann die Gesamtzahl an mit Sporen versehenen Oozyten pro Dosis des Impfstoffes zwischen ca. 2,5 x 10² und 2 x 10&sup5;, vorzugsweise zwischen 5 x 10² und 6 x 10³ variieren. Im allgemeinen kann deshalb eine Dosis des Impfstoffes die folgende Anzahl an mit Sporen versehenen Oozyten für jeden vorhandenen frühreifen Stamm von Eimeria enthalten. E. acervulina E. maxima E. tenella E. brunetti E. mitis E. necatrix E. praecox vorzugsweise 100 bis 2 000
Wenn zwei Stämme von E. maxima vorhanden sind, z.B. MFP 15s und CP 12s, können von jedem Stamm Mengen im Bereich von 10 bis 5 000, vorzugsweise 20 bis 400, verwendet werden.
E. brunetti ECACC 86112013 wird im Hinblick auf eine verbesserte Stabilität der Abschwächung nach dem Hindurchlaufen in Vögeln dem collateralen Stamm 86072204 vorgezogen.
Im allgemeinen umfaßt der Impfstoff eine Suspension der Oozyten in sterilisiertem destillierten Wasser, das ein Suspensionsmittel enthält, z.B. ein Polysaccharid- Suspensionsmittel, wie z.B. einen Gummi, z.B. Xanthangummi oder Akaziengummi, ein Cellulose-Derivat, z.B. Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder microcrystalline Cellulose, Carageenan, Natriumalginat, Pectin oder Stärke; ein Polypeptid-Suspensionsmittel wie z.B. Gelatine; ein Suspensionsmittel auf Basis eines synthetischen Polymers, wie z.B. Polyacrylsäure; oder ein Silicat-Suspensionsmittel wie z.B. Magnesiumaluminiumsilicat. Im allgemeinen liegt die Menge an Suspensionsmittel im Impfstoff im Bereich von 1 bis 25 g/l, vorzugsweise von 1,5 bis 12 g/l. Zur Verhinderung der Contaminierung mit anderen Organismen kann auch ein Konservierungsmittel vorhanden sein, z.B. Formalin in einer Konzentration von z.B. 0,01 Gew.%.
Die Konzentration der mit Sporen versehenen Oozyten im Impfstoff kann z.B. im Bereich von 10&sup7; bis 10&sup8;/l liegen.
Im allgemeinen wird der Impfstoff oral verabreicht, zweckmäßigerweise mit der Nahrung und/oder Trinkwasser der Vögel. Der Impfstoff ist wirksam, wenn er im Trinkwasser verabreicht wird. Eine Einzeldosis kann jungen Hühnchen verabreicht werden, die vorteilhafterweise zwischen 3 und 10 Tage alt sind, und vorzugsweise zwischen 5 und 10 Tage. Es kann jedoch auch günstig sein, mit der sogenannten "Tröpfel"-Methode ("Trickle") zu beimpfen, das heißt sehr niedrige Dosen des Organismus an aufeinanderfolgenden Tagen zu verabreichen, um Immunität aufzubauen. Wenn die Vögel auf Spreu gehalten werden, kann die Reinfektion durch Aufnahme von ausgeschiedenen Oozyten des frühreifen Organismus die Immunisierung verstärken. Die Verwendung von erfindungsgemäßem Impfstoff ist insbesondere wertvoll bei der Behandlung von Hühnern, die zum Brüten vorgesehen sind, und die Erzeugung schwerer Grillhühner (z.B. Hühner, die 55 Tage oder länger gezüchtet werden).
Vögeln, die den Impfstoff erhalten, werden zweckmäßigerweise ein oder mehrere antibiotische Wachstumspromotoren, wie z.B. Avoparcin und Virginiamycin verabreicht. Diese können vorteilhafterweise in der Nahrung in einem Konzentrationsbereich von 7,5 bis 12,5 ppm, z.B. von ca. 10 ppm, vorhanden sein.
Die Pathogenizität der frühreifen Stämme kann bestimmt werden durch Überprüfung der Veränderungen des Körpergewichtes von infizierten Hühnchen in Bezug auf die Körpergewichtveränderungen von Vögeln mit Eimeria-Spezien vom Wild-Typus. Wenn ein zufriedenstellend abgeschwächter Stamm erhalten wurde, ist es wünschenswert, einen Sub-Stamm durch Hindurchgang eines einzelnen Oozyten, Sporozyten oder Sporozoiten zu züchten, um die Gleichmäßigkeit der Population zu erhöhen und auf diese Weise die Wahrscheinlichkeit einer Reversion zur Virulenz, das heißt Instabilität, zu verringern. Es kann wünschenswert sein, diese Stufe zu wiederholen. Nachfolgend kann der Sub-Stamm einer Anzahl aufeinanderfolgender relaxierter Durchgänge unterworfen werden, um die Stabilität zu testen. Wenn ein stabiler abgeschwächter Sub-Stamm erhalten wurde, kann er einem relaxierten Durchgang unterworfen werden, um eine relativ große Anzahl für den Einbau im Impfstoff zu produzieren.
Die gesammelten Oozyten sind normalerweise nicht mit Sporen versehen, und erfordern eine Sporenbildung vor der Reinokulierung, z.B. durch Suspension in einer wäßrigen Lösung eines Oxidans, wie z.B. 2%iges wäßriges Kaliumdichromat, und Inkubierung, z.B. bei 29ºC, mit Zwangsbelüftung (die sauerstoffreiche Umgebung fördert die Sporenbildung und inhibiert auch das Bakteriumwachstum). Nach Sporenbildung können die Oozyten mit einer oder mehreren antibakteriellen Substanzen behandelt werden, um die Contaminierung durch andere Mikroorganismen zu vermeiden. Die Oozyten können aus Fäkalien oder homogenisiertem Blinddarmgewebe durch Salzflotation gesammelt werden (Long, Proceedings of the 9th Symposium of the British Society for Parasitology, Seiten 65-67, 1971).
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung:

Beispiel 1 - Herstellung des Impfstoffs

Samen-System

Muttersamen von jedem zu verwendenden abgeschwächten Eimeria-Stamm werden unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Aus einer Probe jedes dieser Muttersamen wird ein Arbeitssamen durch orale Beimpfung von SPF-Hühnchen hergestellt. Die Oozyten werden aus den Fäkalien und/oder dem Blinddarm gewonnen, um Arbeitssamen herzustellen. Der Arbeitssamen wird bei 4ºC gelagert und verwendet um jede Impfstoffherstellung zu initiieren. Arbeitssamen haben eine Haltbarkeit von 6 Monaten, nach der sie ersetzt werden.
Wenn Arbeitssamen hergestellt wird, werden Oozyten nur bis zur Latenzzeit des Wild-Typ-Mutterstammes für diese Spezies, das heißt neutralem Durchgang, eingesammelt.
Wenn der Impfstoff hergestellt wird, werden die Oozyten während der offenen Periode der Infektion, das heißt relaxiertem Durchgang, eingesammelt.

Züchten der Hühnchen

Die Hühnchen werden aus Eiern von SPF-Tieren ausgebrütet. Sie werden in Isolation bei einer Diät, die Robenidin enhält, bis zu einem Alter von 4 bis 6 Wochen gezüchtet. Sie werden dann in die Einrichtung zur Impfstoffproduktion überführt, wobei sie in getrennten Räumen in Gruppen unterteilt werden, die für jede Eimeria-Spezies bestimmt sind, und das Robenidin wird aus der Diät 2 Tage vor der Infektion weggelassen.

Beimpfung

Jede Gruppe der Vögel wird oral mit einer vorher bestimmten Dosis des Arbeitssamens beimpft. Die Beimpfung wird vorzugsweise gemäß einem Stufenplan durchgeführt, so daß nur eine Spezies von Eimeria eingesammelt und an einem Arbeitstag verarbeitet wird.

Einsammeln

Die Fäkalien werden gesammelt, obwohl die Zeit und Dauer der Sammlung von Spezies zu Spezies variiert. Eine Aufschlämmung von Fäkalien (und/oder des Blinddarminhalts) in Wasser wird hergestellt und dann homogenisiert. Die Homogenisate werden durch ein 150 Mikrometer-Sieb gewaschen und die Waschungen in einer kontinuierlichen Durchfluß- Zentrifuge zentrifugiert. Der zentrifugierte Niederschlag wird in gesättigter Salzlösung resuspendiert und rezentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt. Dieser wird mit Wasser abgeschwächt und ein drittes Mal durch die Zentrifuge hindurchgeführt. Der Niederschlag wird in einer 2%igen Kaliumdichromat-Lösung resuspendiert.

Sporenbildung

Die Oozyt-Suspension in Kaliumdichromat-Lösung wird bei 29ºC 48 h lang unter Zwangsbelüftung zur Sporenbildung der Oozyten inkubiert. Nach Sporenbildung wird die Dichromatlösung durch Zentrifugieren entfernt und die Oozyten werden mit 10%igen Chlorox (Natriumhypochloritlösung) 10 min lang behandelt. Die behandelten Oozyten werden in Wasser resuspendiert und Formalin bis zu einer Konzentration von 0,05 % zugegeben. Die Suspension wird bei 4ºC gelagert.

Mischen

Von jeder Oozyt-Lösungssuspension werden Oozytzählungen durchgeführt und berechnete Volumina jeder Suspension werden mit einem Suspensionsmittel gemischt, um einen Multikomponenten-Impfstoff mit Oozyten jeder der Spezies in den gewünschten Anteilen zu ergeben. Der Impfstoff wird in Endcontainer abgefüllt und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 2

1 l Impfstoff, der 4000 Dosen enthält, kann wie folgt formuliert werden: E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella Xanthangummi Wasser Oozyten
Die Zugabe von 25 ml dieses Impfstoffs zu 500 ml Trinkwasser stellt ausreichend Impfstoff in Xanthangummi bei einer Endkonzentration von 0,03 % (G/V) für 100 Hühnchen bereit.

Beispiel 3

500 ml Impfstoff, der 5000 Dosen enthält, kann wie folgt formuliert werden: E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella Xanthangummi Wasser Oozyten
Die Zugabe von 10 ml diese Impfstoffs zu 500 ml Trinkwasser stellt ausreichend Impfstoff in Xanthangummi bei einer Endkonzentration von 0,03 % (G/V) für 100 Hühnchen bereit.

Beispiel 4

(a) 500 ml Impfstoff, enthaltend 5000 Dosen, können wie folgt formuliert werden: E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella Xanthangummi Wasser Oozyten
Die Zugabe von 10 ml dieses Impfstoffs zu 500 ml Trinkwasser stellt ausreichend Impfstoff in Xanthangummi bei einer Endkonzentration von 0,012 % (G/V) für 100 Hühnchen bereit.
(b) 500 ml Impfstoff, enthaltend 5000 Dosen, können wie folgt formuliert sein: E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella Xanthangummi Wasser Oozyten
Die Zugabe von 10 ml dieses Impfstoffs zu 500 ml Trinkwasser stellt ausreichend Impfstoff in Xanthangummi bei einer Endkonzentration von 0,012 % (G/V) für 100 Hühnchen bereit.

Beispiel 5

Mutterstämme der sieben Eimeria-Spezien wurden einem seriellen Durchlauf unterworfen, mit Selektion auf verkürzte Latenzzeiten wie vorstehend beschrieben. Die Reproduktion der verschiedenen abgeschwächten Stämme wurde durch orale Beimpfung von Light Sussex Hühnchen und Zählung der durchschnittlichen Anzahl von von jedem Vogel produzierten Oozyten bestimmt. Die Immunogenizität der abgeschwächten Stämme wurde auch durch Experimente bestimmt, in denen Hühnchen, denen eine primäre Beimpfung mit Oozyten verabreicht wurde, der Einwirkung von Oozyten des Mutterstammes unterworfen wurden. Der durchschnittliche Ausstoß an Oozyten pro Vogel wurde bestimmt und der Prozentsatz Schutzwirkung unter Bezugnahme auf den Ausstoß an Oozyten durch (mit Oozyten des Mutterstammes) angegriffenen Kontrolltieren berechnet. Die Pathogenizität der abgeschwächten Stämme im Vergleich zum Mutterstamm wurde ebenfalls durch Beimpfung von Gruppen von Light Sussex Hühnchen mit dem gleichen Gewicht mit einer Standarddosis jedes Parasiten und Bestimmung des Körpergewichts nach 12 bis 14 Tagen im Vergleich zu uninfizierten Kontrollen und solchen, denen der nichtabgeschwächte Mutterstamm gegeben wurde, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 angegeben. Tabelle 1 Endgewicht der Vögel (g) Spezies Referenz des frühreifen Stammes (Code) Zahl der obsierten Oozyten (in Tausend) Anfangsgewicht (g) der Vögel Anzahl Tage des Tests Nichtinfizierte Kontrolle Frühreifer Stamm (Gewichtsreduktion cf. Kontrolle) Mutterstamm (Gewichtsreduktion cf. Kontrolle) E.-acervulina HP E. brunetti HP E. maxima MFP E. mitis HP E. necatrix HP E. praecox HP E. tenella HP * Gewichtszunahme Tabelle 2 Spezies und frühreifer Stamm Durchlauf Dosis (Oozyten/Vogel x 10²) Immunitätstest (Callenge) (Oozyten/Vogel x 10²) Ausstoß (Oozyten/Vogel x 10&sup6;) Prozent Schutzwirkung E. acervulina HP None E. brunetti HP None E. maxima MFP None E. mitis HP HMF E. necatrix HP None E. praecox HP None E. tenella HP None

Beispiel 6 - Impfstoff-Erprobung

Bei der Erprobung an 4 480 Cobb-Grillhühnchen, in Bodengehegen gehalten, wurde der Impfstoff des Beispiels 3 verwendet. Die Konzentration an Xanthangummi in dem Impfstoff wurde so eingestellt, daß die Verabreichung von 140 Dosen des Impfstoffs an jedes Trinkgefäß eine endgültige Xanthangummikonzentration von 0,03 % ergab. Die Untersuchung wurde so ausgestaltet, um die Werte der mit aktivem abgeschwächtem Coccidiose-Impfstoff gemäß der Erfindung geimpften Vögel und der mit einem Coccidiostatikum, Monensin, gefütterten Vögel im Hinblick auf einen Immunitätstest mit sieben homologen oder sieben heterologen Stämmen jeder der sieben Eimeria-Spezien zu vergleichen. Die heterologen Stämme wurden aufgrund der Annahme ausgewählt, daß sie entweder pathogener als die homologen oder antigenisch verschieden sind.
Die Vögel wurden in Gruppen von 140 gehalten. Vier Gehege wurden für jede Behandlung zugeteilt, und zwei Gehege jeder Kontrollgruppe zugeteilt. Jede Behandlung umfaßte deshalb 560 Vögel und jede Kontrolle 280 Vögel. Die Zuordnung der Gehege zur Behandlung wurde über die gesamte Anlage zufällig angeordnet. Die Prüfung erfolgte nach dem folgenden Muster: Tabelle 3 Behandlung Homologer Immunitätstest (Challenge) Tag 31 Heterologer Immunitätstest (Challenge) Tag 31 Impfstoff (Tag 7) Monensin (Tag 1-45) 100 ppm Robenidin (Tag 1-28) 33 ppm Gruppe 1-4 = 560 Vögel Gruppe 5-6 = 280 Vögel
Der Impfstoff wurde über das Trinkwasser verabreicht. Die Vögel wurden auf der Basis einer kommerziellen Formulierung gefüttert, die den antibiotischen Wachstumspromotor Avoparcin in einer Menge von 10 ppm enthielt. Die anticoccidischen Mittel wurden in der Nahrung verabreicht.
Es muß angemerkt werden, daß, um einer Infektion durch Wild-Eimeria-Stämme vorzubeugen, und einer konsequenten Entwicklung von Immunität, die zwei Kontrollgruppen während 28 Tagen mit Robenidin (30 ppm) gefüttert wurden. Eine Gruppe erhielt eine heterologe Verabreichung und die andere eine homologe Verabreichung.
Alle Vögel erhielten eine individuelle orale Verabreichung, die durch Beimpfung in den Kropf am Tag 31 verabreicht wurde. Die Zahl der Oozyten jeder Spezies in den verabreichten Dosen war die folgende: Tabelle 4 Spezies Homolog Heterolog Oozyten/Vogel (x10³) E. acervulina E. brunetti E. maxima E. mitis E. necatrix E. praecox E. tenella London Road Watchill Buxted
Die Lebendgewichte und die kumulierte Nahrungsaufnahme wurde an den Tagen 30, 37 und 49 gemessen. Die Nahrungskonversions-Verhältnisse wurden berechnet, indem man die Nahrungsmittelaufnahme durch die Zunahme an Lebendgewicht vom Tag 1 an dividierte. Die Zählung der Oozyten in der Streu wurde für jedes Gehege in wöchentlichen Intervallen durchgeführt. Am Tag 37 wurde eine Probe von 5 Vögeln aus jedem Gehege (insgesamt 160) aussortiert und die erzielten Coccidiose-Läsionen bestimmt. Die Bewertung wurde an einer Skala von 0 bis 3,5 bestimmt, mit zunehmender Schwere der Läsionen, die für die Infektion mit E. acervulina, E. brunetti, E. maxima/necatrix (zusammengruppiert, weil sie schwierig zu unterscheiden sind) und E. tenella symptomatisch sind. Es wurden die mittleren Läsionswerte berechnet.

Ergebnisse

Lebendgewichte

Am Ende der Prüfung (Tag 49) waren die geimpften Gruppen unbedeutend schwerer als die mit Monensin behandelten Gruppen, aber die Unterschiede waren nicht bedeutsam. Die Lebendgewichte jeder Gruppe der Vögel sind in der nachfolgenden Tabelle 5 angegeben.

Nahrungsaufnahme und Nahrungskonversionsverhältnis

Am Ende der Prüfung waren die Unterschiede in der Nahrungsaufnahme und den Nahrungskonversionshältnissen zwischen den geimpften und mit Monensin behandelten Gruppen statistisch nicht bedeutsam.

Läsionswerte

Sowohl die Beimpfung als auch die Monensinbehandlung ergaben geringere Läsionswerte sowohl bei homologer als auch bei heterologer Verabreichung. Der durch den Impfstoff erzielte Schutz gegen heterologe Herausforderung war jedoch im Hinblick auf E. acervulina, E. brunetti und insbesondere E. tenella besser als der durch Monensin erreichte. Geringfügig erhöhte Werte wurden für heterologes E. maxima/necatrix sowohl bei den geimpften als auch den mit Monensin behandelten Vögeln beobachtet, aber in jedem Fall waren diese niedriger als bei den Kontrollen. Die Läsionswerte im Hinblick auf die einzelnen Gruppen der Vögel sind in der nachfolgenden Tabelle 6 angegeben.

Zählungen der Oozyten in der Spreu

Bei diesen Zählungen trat eine sehr hohe Veränderung von Gehege zu Gehege auf. Nach Verabreichung mit heterologen Stämmen waren die Zählungen in den Gehegen der mit Monensin behandelten Vögel im Durchschnitt jedoch zwei- bis dreimal höher als die in den Gehegen mit den geimpften Vögeln.

Schlußfolgerung

Die Werte der Vögel zeigten, daß insgesamt genommen der erfindungsgemäße Impfstoff und das Monensin zum Schutz gegen Coccidiose gleich wirksam waren. Der Impfstoff widerstand der heterologen Verabreichung gut, und zeigte insbesondere im Hinblick auf die heterologe E. tenella- Herausforderung einen markanten Vorteil. Tabelle 5: Lebendgewicht (g/Vogel) Tag Behandlung Homologe Herausforderung Heterologe Herausforderung Impfstoff Monensin Kontrolle* * Robenidin am Tag 28 weggelassen Tabelle 6: Läsionswerte Verabreichung Behandlung Probengröße Mittlerer Läsionswerte E. acervulina E. brunetti E. maxima/necatrix E. tenella Homolog Heterlog Impfstoff Monensin Kontrolle

Claims

1. Abgeschwächter Impfstoff gegen Coccidiose enthaltend aktive abgeschwächte frühreife Stämme von Eimeria acervulina, Eimeria maxima und Eimeria tenella, wobei die Zahl der mit Sporen versehenen Oozyten jedes getrennten Eimeria-Stammes pro 100 mit Sporen versehenen Oozyten von Eimeria acervulina für Eimeria maxima 15 bis 30 und für Eimeria tenella 70 bis 110 beträgt.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er pro 100 mit Sporen versehenen Oozyten von Eimeria acervulina 15 bis 30 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven abgeschwächten frühreifen Stammes von Eimeria brunetti, 180 bis 220 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven abgeschwächten frühreifen Stammes von Eimeria mitis, und 70 bis 110 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven abgeschwächten frühreifen Stammes von Eimeria necatrix enthält.

3. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er 15 bis 25 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven abgeschwächten frühreifen Stammes von Eimeria praecox pro 100 mit Sporen versehenen Oozyten von Eimeria acervulina enthält.

4. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zahl der mit Sporen versehenen Oozyten jedes getrennten Eimeria-Stammes, die für 100 mit Sporen versehene Oozyten von Eimeria acervulina vorhanden sind, für Eimeria maxima 18 bis 22 und für Eimeria tenella 75 bis 105 beträgt.

5. Impfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er pro 100 mit Sporen versehenen Oozyten von Eimeria acervulina 18 bis 22 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven frühreifen abgeschwächten Stammes von Eimeria brunetti enthält, 190 bis 210 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven frühreifen abgeschwächten Stammes von Eimeria mitis und 75 bis 105 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven frühreifen abgeschwächten Stammes von Eimeria necatrix enthält.

6. Impfstoff nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er 18 bis 22 mit Sporen versehene Oozyten eines aktiven frühreifen abgeschwächten Stammes von Eimeria praecox pro 100 mit Sporen versehenen Oozyten von Eimeria acervulina enthält.

7. Aktiver Impfstoff für die Verwendung zur Bekämpfung von Coccidiose bei Hühnchen umfassend eine wirksame Konzentration aktiver mit Sporen versehener Oozyten eines Eimeria acervulina-Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 60 und 84 Stunden, eines Eimeria maxima-Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 80 und 120 Stunden und eines Eimeria tenella- Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 90 und 125 Stunden.

8. Impfstoff nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine wirksame Konzentration aktiver mit Sporen versehener Oozyten eines Eimeria necatrix Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 90 und 126 Stunden, eines Eimeria mitis-Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 60 und 84 Stunden und eines Eimeria brunetti-Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 70 und 100 Stunden umfaßt.

9. Impfstoff nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine wirksame Konzentration aktiver mit Sporen versehener Oozyten eines Eimeria praecox- Stammes mit einer Latenz-Zeit in Hühnchen zwischen 44 und 75 Stunden umfaßt.

10. Impfstoff nach Anspruch 1 in Form einer Dosiereinheit, in welcher jede Dosiereinheit 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria acervulina, 10 bis 5 000 der Oozyten von Eimeria maxima und 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria tenella enthält.

11. Impfstoff nach Anspruch 2 in Form einer Dosiereinheit, in der jede Dosiereinheit 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria acervulina, 10 bis 5 000 der Oozyten von Eimeria maxima, 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria tenella, 10 bis 5 000 der Oozyten von Eimeria brunetti, 100 bis 50 000 der Oozyten von Eimeria mitis und 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria necatrix enthält.

12. Impfstoff nach Anspruch 3 in Form einer Dosiereinheit, in der jede Dosiereinheit 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria acervulina, 10 bis 5 000 der Oozyten von Eimeria maxima, 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria tenella, 10 bis 5 000 der Oozyten von Eimeria brunetti, 100 bis 50 000 der Oozyten von Eimeria mitis, 50 bis 25 000 der Oozyten von Eimeria necatrix, und 10 bis 5 000 der Oozyten von Eimeria praecox enthält.

13. Impfstoff nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Eimeria-Stämme nach 5 Durchgängen in Hühnchen ohne Selektion stabil sind.

14. Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Eimeria acervulina-Stamm E. acervulina ECACC 86072203 ist, der Eimeria tenella-Stamm E. tenella ECACC 86072201 ist, und der Eimeria maxima-Stamm E. maxima ECACC 86112011 und/oder ECACC 86112012 ist.

15. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Eimeria mitis-Stamm E. mitis ECACC 86072206 ist, der Eimeria necatrix-Stamm E. necatrix ECACC 86072202 ist, und der Eimeria brunetti-Stamm E. brunetti ECACC 86112013 ist.

16. Impfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Eimeria mitis-Stamm E. mitis ECACC 86072206 ist, der Eimeria necatrix-Stamm E. necatrix ECACC 86072202 ist, und der Eimeria brunetti-Stamm E. brunetti ECACC 86072204 ist.

17. Impfstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Eimeria praecox-Stamm E. praecox ECACC 86072205 ist.

18. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß es die Ausbildung von Sporen an den Oozyten der Eimeria- Stämme und ihr Vermischen mit einem Träger und/oder Adjuvans umfaßt.