CN107469074A

CN107469074A - 一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂

Info

Publication number: CN107469074A
Application number: CN201710714187.5A
Authority: CN
Inventors: 龚振兴; 刘百林; 魏红梅; 余荣霞; 刘宇; 殷宏
Original assignee: CHINA AGRICULTURAL VET BIO SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHINA AGRICULTURAL VET BIO SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2017-12-15

Abstract

本发明公开了一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，属于动物疫苗免疫接种领域。本发明通过将鸡球虫病活卵囊疫苗加入至海藻酸钠水溶液中，可以维持疫苗中卵囊长时间不发生沉降，且对疫苗免疫效果不产生任何影响。本发明的益处在于：采用海藻酸钠作为鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，免疫接种简单方便，适用于不同类型和不同规模的养鸡场，并能使疫苗中的卵囊均匀悬浮于海藻酸钠溶液中维持8小时以上，可使鸡只获得均匀免疫，同时，疫苗接种前无须对免疫鸡只采取控水措施，避免了鸡只出现抢水现象，极大的减少了疫苗接种过程中的应激反应。

Description

一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂

技术领域

本发明属于动物疫苗免疫接种领域，具体涉及一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂。

背景技术

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳属球虫（Eimeria spp.）同时或先后寄生于鸡肠道所引起的寄生原虫病，流行广泛，是目前危害集约化养鸡业生产的最严重的疾病之一，经济损失巨大，据不完全统计，我国每年仅因亚临床球虫病而导致饲料报酬下降所致的间接经济损失就达100亿元。免疫预防是目前鸡球虫病防治中有效解决球虫抗药性所致药效下降、最大限度地消除抗球虫药物残留所引起我国鸡产业出口技术壁垒的最科学、最可行、最有效、最安全的方法，正逐渐成为新一代的“可持续”绿色技术。鸡球虫病疫苗对提高我国养鸡业生产效益、改善和提高食品卫生质量、保障人民生命健康有重要意义，并具有广阔的市场需求。

目前，鸡球虫病活卵囊疫苗免疫方法有饮水法、滴口法、喷料法及喷雾法等。其中，以滴口法为最佳，可确保100%免疫，但对于大型养鸡场则操作不便且对鸡只应激较大；喷雾法较适用于设备先进的孵化室；饮水法和喷料法是较为适用的免疫方法。

其中，饮水法是鸡球虫病活卵囊疫苗临床应用最简便的方法，同时所产生的应激小，但是由于卵囊密度大，在饮水中容易自然沉降而造成免疫不均匀或免疫失败，因此，在鸡球虫病活卵囊疫苗免疫接种时通常加入一定量的助悬剂，使疫苗中的球虫卵囊均匀的悬浮在饮水中并维持一定时间不沉降，以提高疫苗免疫均匀度。

目前，鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂的主要成分一般选用羧甲基纤维素类/纤维素类衍生物。这些助悬剂悬浮球虫卵囊的时间仅为6 h左右，虽然也有使球虫卵囊均匀的悬浮在饮水中并维持10小时不沉降的发明，但其组分相对复杂，生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，以保持鸡球虫病活卵囊疫苗中的卵囊在饮水中均匀分布，使鸡只获得均匀免疫，从而减少疫苗免疫应激反应。

为了达到所述的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，在常温下配制海藻酸钠水溶液，再加入鸡球虫病活卵囊疫苗，搅拌混匀而成，其中海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.1—0.5%。

优选的，所述海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.15—0.2%。

本发明中的鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂为海藻酸钠。

海藻酸钠为无色或淡黄色细丝颗粒或粉末状固体，英文名：Sodium alginate，分子式为(C6H7O6Na)n。海藻酸钠为一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性，几乎无臭无味，溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。溶于水成粘稠状液体，1%水溶液pH值为6—8。当pH=6—9时粘性稳定，加热至80 ℃以上时则粘性降低。海藻酸钠无毒，LD50>5000mg/kg。

本发明采用海藻酸钠作为鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，免疫接种简单方便。并进行了一系列海藻酸钠水溶液对鸡球虫病活卵囊疫苗悬浮效果试验。结果表明，鸡球虫病活卵囊疫苗中的卵囊在海藻酸钠的水溶液中维持既不上浮也不沉降的时间长达8 h以上，且对疫苗免疫效果不产生任何影响，可使鸡只获得均匀免疫，同时，疫苗接种前无须对需免疫的鸡只采取控水措施，避免了鸡只在免疫接种过程中出现“抢水”现象，极大的减少了疫苗接种过程中的应激反应，疫苗生产成本亦大幅降低。适用于不同类型和不同规模的养鸡场。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明中，鸡球虫病活卵囊疫苗、海藻酸钠水溶液的用量并未给出特别限定，可以根据具体应用需求进行调整。

实施例1

在海藻酸钠的水溶液中加入鸡球虫病活卵囊疫苗，搅拌混匀而成，其中海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.5%。

选用1000羽/瓶的鸡球虫病活卵囊疫苗，每瓶疫苗对应的海藻酸钠水溶液用量为2—8 L。

实施例2

在海藻酸钠的水溶液中加入鸡球虫病活卵囊疫苗，搅拌混匀而成，其中海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.15%。

实施例3

在海藻酸钠的水溶液中加入鸡球虫病活卵囊疫苗，搅拌混匀而成，其中海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.2%。

实施例4

在海藻酸钠的水溶液中加入鸡球虫病活卵囊疫苗，搅拌混匀而成，其中海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.1%。

材料选择如下：

1 、鸡球虫卵囊

堆型艾美耳球虫YL株、巨型艾美耳球虫HS株和柔嫩艾美耳球虫YL株早熟系，为中农威特生物科技股份有限公司分离、鉴定和保存。

、鸡球虫病活卵囊疫苗

实验室试制的鸡球虫病三联三价活卵囊疫苗（批号为20150301，1000 羽份/瓶，24.9×104个孢子化卵囊/mL），系用堆型艾美耳球虫YL株、巨型艾美耳球虫HS株和柔嫩艾美耳球虫YL株早熟系，通过球虫卵囊分离纯化、孢子化培养之后，按一定比例配比混合而成。

、检验用虫种

柔嫩艾美耳球虫YL株、堆型艾美耳球虫HS株和巨型艾美耳球虫YL株，为中农威特生物科技股份有限公司分离、鉴定和保存。

、试验动物和饲料

1日龄黄羽肉鸡，购自于广东智威农业科技股份有限公司，饲养于无鸡球虫污染笼舍内，按肉鸡饲养标准（鸡饲养标准NY/T 33-2004）饲养。

饲料为不含任何抗球虫药物肉小鸡全价料，购自兰州养动力饲料有限公司。

、主要试剂

纯水；

海藻酸钠（化学纯CP，购自北京索莱宝科技有限公司）；

羧甲基纤维素钠（化学纯CP，购自国药集团化学试剂有限公司）。

海藻酸钠溶液配制：分别称取0.5、1、2、3、4、10 g海藻酸钠，加入至2 L纯水中，常温下溶解（期间可多次搅拌或过夜溶解）。

羧甲基纤维素钠溶液配制：称取2g羧甲基纤维素钠，加入至2 L纯水中，常温下溶解（期间可多次搅拌或过夜溶解）。

《不同浓度海藻酸钠溶液悬浮球虫卵囊效果比较试验》

准备8个2 L烧杯，分别配制不同浓度海藻酸钠溶液（0.025%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.5%）和0.1%羧甲基纤维素钠溶液各2 L，同时以2 L纯水为对照。溶液配制完成后，各烧杯中分别加入等体积的卵囊液（各组卵囊浓度约为10×10⁴个），充分搅拌混匀后，分别吸取各组10个不同位置的上层卵囊液各100 ul至洁净的2 mL离心管中，混匀后用血细胞计数板进行卵囊计数，每份样品计数5—10次，每次计数数8个大格内的卵囊总量，最后求平均值，并以此为卵囊基数（0 h）。以同样的方法分别吸取各试验组静置2、4、6、8、10、12 h后的上层卵囊液并进行混合和卵囊计数，并计算卵囊在不同试剂中静置不同时间后的悬浮效率。

悬浮效率计算公式为：

各组静置不同时间段的上层卵囊量/对应组0 h卵囊基数×100%。

各组悬浮率计算结果显示，球虫卵囊在0.15%—0.5%海藻酸钠溶液中静置8 h后，上层卵囊量仍维持90%以上；球虫卵囊在0.1%海藻酸钠溶液中静置4 h后的上层卵囊量为97.61%，6 h后的上层卵囊量为87.85%；而球虫卵囊在0.1%羧甲基纤维素钠溶液中静置4 h后的卵囊量仅为88.89%，仅相当于球虫卵囊在0.1%海藻酸钠溶液中静置6 h的悬浮效果，各试剂悬浮效果如表1。

结果表明，0.1%海藻酸钠溶液悬浮球虫卵囊的时间可达6 h，0.15%—0.5%海藻酸钠溶液悬浮球虫卵囊的时间可达8 h以上，悬浮效果明显优于终浓度为0.1%羧甲基纤维素钠溶液。但由于浓度在0.2%以上的海藻酸钠溶液粘度太高且不易溶解，优选0.15%—0.2%的海藻酸钠水溶液作为鸡球虫病活卵囊疫苗悬浮液。

《海藻酸钠溶液对鸡球虫病三联三价活卵囊疫苗的悬浮效果》

准备2 L烧杯3个，分别加入1 L 0.15%海藻酸钠溶液、0.2%海藻酸钠溶液和纯水，各加入10 瓶（1000 羽份/瓶）球虫疫苗（批号：20150301，24.9×10⁴个孢子化卵囊/mL），配成球虫疫苗混悬液，静置。分别于0 h、2 h、4 h、6 h和8 h，于烧杯800 mL、600 mL、300 mL刻度处（亦即疫苗混悬液的上、中、下层）分别吸取10 µL的混悬液，重复取样3次，在 10×10 倍显微镜下对10 µL疫苗混悬液中的卵囊总数直接进行计数。

计数结果显示，2—8 h从0.15%和0.2%海藻酸钠疫苗混悬液的800 mL、600 mL、300mL刻度处分别吸取的10 µL疫苗混悬液中的卵囊平均数与基数相比，均在90%以上；而疫苗在水溶液中静置2 h，各刻度处仅剩40%不到的卵囊，结果如表2。试验结果表明，疫苗卵囊在0.15%和0.2%海藻酸钠溶液中既不上浮也不沉降，符合混悬要求。

《海藻酸钠溶液对鸡球虫病三联三价活卵囊疫苗的免疫效果》

100 只 1 日龄雏鸡饲养于无球虫环境中，7日龄按随机分组法分成 5 组（G1—G5），每组 20 只鸡，每只鸡体重差异不超过5 g，每组总重不超过100 g，笼养（垫报纸）。

分组后，以实验室试制生产的疫苗（疫苗批号：20150301，1000 羽份/瓶，24.9×10⁴个孢子化卵囊/mL）进行免疫接种。具体免疫接种方式按表3设计的接种方式进行免疫接种。

接种后21天，G1—G4分别经口接种1 mL含3×10⁴、10×10⁴和5×10⁴个柔嫩艾美耳球虫YL株、堆型艾美耳球虫HS株和巨型艾美耳球虫YL株的混合强毒株孢子化卵囊。观察攻虫后4—7天，观察各组粪便情况、鸡只死亡情况，剖检所有鸡只，，检查肠道部位 ( 柔嫩艾美耳球虫检查盲肠；巨型及毒害艾美耳球虫检查小肠中段；堆型艾美耳球虫检查十二指肠) 的病变并记分。

结果显示，攻虫后，G5组（不免疫不攻虫对照组）鸡只全部存活，各肠道完全正常；G4组（不免疫攻虫组）试验鸡只死亡率为10%，十二指肠、小肠中段和盲肠病变记分均大于+3.0分；G1组（滴口免疫组）和G3组（1.5%海藻酸钠组）试验鸡只全部存活，无血便，十二指肠、小肠中段和盲肠病变记分均小于+1.0分；G2组（水溶液组）试验鸡只全部存活，但有血便产生，50%试验鸡只十二指肠、小肠中段和盲肠病变记分大于+1.0分，结果如表4。

试验结果表明，鸡球虫三联三价活卵囊疫苗直接兑水进行饮水免疫，部分鸡只会出现免疫失败；而通过采用1.5%海藻酸钠溶液可以维持疫苗中卵囊长时间不发生沉降，且对疫苗免疫效果不产生任何影响，可以减少鸡球虫病活卵囊疫苗的副作用，适合用作鸡球虫活卵囊疫苗的助悬液，使鸡只获得均匀免疫。

Claims

1.一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，其特征在于：在常温下配制海藻酸钠水溶液，再加入鸡球虫病活卵囊疫苗，搅拌混匀而成，其中海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.1—0.5%。

2.根据权利要求1所述的一种鸡球虫病活卵囊疫苗助悬剂，其特征在于：所述海藻酸钠溶液的质量体积比浓度为0.15—0.2%。