CN111821464B - 一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂及其制备方法 - Google Patents

一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫生物学领域，具体涉及一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂及其制备方法。以质量百分数计，所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂含有0.3～0.6‰的卡拉胶和0.3～0.6‰的KCl。本发明中的助悬剂可使兔球虫卵囊在饮水中均匀悬浮，并保持8h不发生沉降，提高了兔摄入疫苗卵囊的均匀度，增加了免疫效果。而且，由于其尽量简化了助悬剂的组分，同时降低了组分的用量，可以最大程度地避免助悬剂对疫苗和兔可能造成的影响，且有利于降低生产成本。

Description

一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫生物学领域，具体涉及一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂及其制备方法。
背景技术
兔球虫病是危害集约化养兔业最严重的传染病之一，其在家兔(Oryctolaguscuniculus)种群中感染率高，致病力强，对养兔业的危害极大，被列为国家二类动物疫病，与兔瘟、兔巴氏杆菌病、兔疥癣病同被列为四大兔病。该病的病原为兔艾美耳球虫(rabbitEimeria spp.)，其属于顶复门(Apicomplexa)，孢子虫纲(Sporozoa)，球虫亚纲(Coccidia)，真球虫目(Coccidiida)，艾美耳属(Eimeiria)。兔艾美耳属球虫种类繁多，已有25个种兔球虫被发现并命名。目前国际公认的为11种，我国主要流行种为肠艾美耳(Eimeria intestinalis)、大型艾美耳(Eimeria magna)、中型艾美耳(Eimeria media)等。该寄生虫一旦感染家兔就会寄生于宿主的消化系统上皮细胞，在其中完成有性生殖和无性生殖，在此过程中数量庞大的虫体会导致家兔消化系统上皮细胞的严重破坏，进而导致家兔饮食不振甚至废绝，体重降低，从而造成生产性能下降；严重时可造成兔群中个体的大量死亡，尤以幼兔为甚。家兔一旦耐过感染便会通过粪便不断向环境中排出未孢子化卵囊，在适宜的温度、湿度条件下，未孢子化卵囊会通过孢子生殖形成具有感染性的孢子化卵囊，该卵囊污染笼舍、水槽、料槽等设施，一旦被幼兔吞食便可造成感染，感染后的个体又可再次排出卵囊，进而感染其他个体，造成循环感染。该循环是兔球虫病不能得到有效控制的重要原因，即使长期使用抗球虫药的兔场，兔球虫的感染率仍居高不下。
对于兔球虫病目前仅能依靠药物防治，尚无疫苗的应用。而药物防治的弊端也日益凸显，如耐药虫株的出现，新药开发困难及不合理用药导致的食品安全等。这使得生产中对于疫苗的需求日益增加。
中国农业大学国家动物原虫实验室通过早熟压力选育法获得的三价球虫减毒活疫苗，经过实验室表明具有良好的安全性和有效性。在球虫活卵囊疫苗的应用中饮水法被认为是现阶段规模化养殖场对于球虫病免疫的最佳方法，但由于卵囊的比重大于水，在水中易造成沉降，使卵囊在饮水中的不均匀分布，最终造成群体的不均匀免疫，严重影响免疫效果。
同时，现有技术中虽然提到了较多关于鸡球虫病疫苗的助悬剂，但是，兔球虫与鸡球虫的卵囊大小存在较大的差异。比如，鸡球虫疫苗中，常见的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫早熟株的卵囊平均大小分别为22μm×19μm、18μm×15μm、31μm×21μm、20μm×17μm。而在兔球虫病减毒活疫苗中大型艾美耳球虫卵囊平均大小为37.3μm×24.1μm，中型艾美耳球虫为25.4μm×15.3μm、肠艾美耳球虫为27μm×18μm。因此，将现有技术中应用于鸡的球虫疫苗助悬剂应用于兔球虫病减毒活疫苗时，会在悬浮稳定性上出现问题。此外，还需要考虑助悬剂对疫苗和动物机体可能造成的不利影响，更加难以将应用于鸡的球虫疫苗助悬剂直接应用于兔球虫病减毒活疫苗。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可使兔球虫疫苗中卵囊成分在饮水中均匀分布，且价格低廉，应用简便，对兔体无毒无害的助悬剂及其制备方法与应用，为兔球虫病疫苗的开发、生产和应用提供有力保障。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，以质量百分数计，含有0.3～0.6‰的卡拉胶和0.3～0.6‰的KCl。
本发明发现，通过在上述配比下卡拉胶和KCl的复配，可以使兔球虫病减毒活疫苗在较长的时间下维持稳定的悬浮状态。同时，由于尽量简化了助悬剂的组分，同时降低了组分的用量，可以进一步避免助悬剂对疫苗和兔可能造成的影响。
作为优选，以质量百分数计，所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂含有0.3‰的卡拉胶和0.3‰的KCl。
作为优选，所述卡拉胶和所述KCl的质量比为1:0.8～1.2。
本发明进一步提供所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂的制备方法，在60℃以上将卡拉胶和KCl混合配置成水溶液。
在本发明中，所述卡拉胶和所述KCl优选为食品级，配方中所使用水为饮用水。
本发明进一步提供一种兔球虫病减毒活疫苗悬浮液，含有兔球虫病减毒活疫苗和所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂。
本发明进一步提供一种可经口摄入的兔球虫病减毒活疫苗产品，含有所述的兔球虫病减毒活疫苗悬浮液及其药学上可接受的佐剂。
本发明进一步提供所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂在制备疫苗中的应用。
作为优选，所述疫苗为兔用疫苗。
本发明进一步提供所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂在提高兔球虫病减毒活疫苗的卵囊均匀度中的应用。
本发明进一步提供所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂或所述的兔球虫病减毒活疫苗悬浮液或所述的可经口摄入的兔球虫病减毒活疫苗产品在兔的养殖中的应用。
本发明有益效果如下：
(1)本发明中的助悬剂可使兔球虫卵囊在饮水中均匀悬浮，并保持8h不发生沉降，提高了兔摄入疫苗卵囊的均匀度，增加了免疫效果。
(2)本发明尽量简化了助悬剂的组分，同时降低了组分的用量，可以最大程度地避免助悬剂对疫苗和兔可能造成的影响。
(3)本发明的助悬剂所使用成分价格低廉、用量少，降低了生产成本，有利于在实际应用中进行推广。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
在以下实施例中，所用助悬剂成分为市售产品；所用水为饮用水；所用兔球虫病减毒活疫苗由中国农业大学国家动物原虫实验室提供，其按照CN110694058A的实施例7中的最佳免疫剂量和方法配置得到，即先将大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、肠艾美耳球虫早熟系分别通过球虫卵囊分离纯化、孢子化，而后按大型艾美耳球虫早熟系1500卵囊/只兔、中型艾美耳球虫早熟系3000卵囊/只兔、肠艾美耳球虫早熟系2000卵囊/只兔的比例配比混合而成；所用实验兔为30日龄新西兰大白兔，购自内蒙古大学实验动物中心，实验前通过筛选确保无球虫感染。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，以质量百分数计，含有0.3‰的卡拉胶和0.3‰的KCl。
本实施例进一步提供所述饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂的制备方法，在60℃以上将卡拉胶和KCl混合配置成水溶液。
实施例2
本实施例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，以质量百分数计，含有0.6‰的卡拉胶和0.6‰的KCl。
制备方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，以质量百分数计，含有0.3‰的卡拉胶和0.5‰的KCl。
制备方法同实施例1。
对比例1
本对比例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，与实施例1的区别在于：以质量百分数计，含有0.1‰的卡拉胶和0.1‰的KCl。
对比例2
本对比例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，与实施例1的区别在于：以质量百分数计，含有0.8‰的卡拉胶和0.8‰的KCl。
对比例3
本对比例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，与实施例1的区别在于：将卡拉胶替换为2％的羧甲基纤维素钠。
对比例4
本对比例提供一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，以质量百分数计，含有0.3‰的卡拉胶和0.1‰的KCl。
制备方法同实施例1。
实验例1助悬剂的稳定性测试
将实施例、对比例中的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂各分为6组，每组均为250mL混悬液置于300mL的烧杯中。而后各加入兔球虫病减毒活疫苗1mL(卵囊浓度为1×106/mL)，搅拌均匀后各组按表1～7中的时间取样。取样点为上层(刻度150-250mL处)、中层(刻度100-150mL处)、下层(刻度0-100mL处)，每层取样3个，取样体积为1mL。将取出的样品加入9mL饱和食盐水中稀释并混合均匀，取1mL加入改良麦克马斯特计数板中于普通光学显微镜下计数，表1～7所示卵囊数为各配方计数板左右两室的平均数，如平均数为小数，则按小数点后进一位计(如56.5在表1数据中计为57)。统计结果依次见表1～7。
表1实施例1的试验结果
表2实施例2的试验结果
表3实施例3的试验结果
表4对比例1的试验结果
表5对比例2的试验结果
表6对比例3的试验结果
表7对比例4的试验结果
由上述结果可知，在对比例1、4的助悬剂中，卵囊无法保持长时间悬浮，而在实施例1～3和对比例2可以让卵囊长时间(8h)在体系中均匀悬浮的目的。需要指出的是当卡拉胶浓度达到0.8‰时，配制好的混悬液在室温下出现浑浊情况，而浓度达到1‰时混悬液恢复室温后即成胶冻状，不适合动物饮水。对比例3中使用了鸡球虫疫苗常用的助悬剂，且在8h的时候已经有了下降的趋势，同时，为了使卵囊具有良好的悬浮效果，羧甲基纤维素钠需要达到2％，远远大于卡拉胶的需求量，结合二者市价，使用卡拉胶与使用羧甲基纤维素相比要便宜156倍左右。综合考虑悬浮效果、稳定性和经济成本问题，实施例1为本发明的最优配方。
实验例2助悬剂对免疫效果的影响
材料与方法：将12只30日龄新西兰大白兔平均分为3组，每组4只。第1组为空白对照组，第2组实验动物口服接种疫苗(将实施例1中的助悬剂与兔球虫病减毒活疫苗在常温下混合得到)，第3组通过饮水10h进行免疫。所有动物单笼喂养。根据疫苗中各早熟株的潜伏期测算后，收集免疫后3-10d粪便进行卵囊计数。
实验结果见表8，通过实验结果发现，口服接种与饮水接种组卵囊产量无显著差异，说明助悬剂成分及饮水免疫方式不会影响免疫效果。
表8助悬剂对卵囊产量的影响
实验例3助悬剂对兔体增重无影响
将10只30日龄新西兰大白兔平均分为2组，每组5只。第1组为空白对照组，本组中实验动物正常饮水；第2组为悬浮剂组，本组实验动物饮水为实施例1配置的悬浮液。所有动物单笼喂养。分别于实验前和实验14d后对实验动物进行称重，以确定每组实验动物的体增重情况。实验结果见表9。
表9助悬剂对实验动物体增重的影响
通过实验结果发现，两组动物的平均体增重无显著差异。表明助悬剂成分对实验动物不产生毒害作用，不会影响影响家兔的体增重。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，其特征在于，以质量百分数计，含有0.3~0.6‰的卡拉胶和0.3~0.6‰的KCl，余量为水；
所述卡拉胶和所述KCl的质量比为1:0.8~1.2。
2.根据权利要求1所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂，其特征在于，以质量百分数计，含有0.3‰的卡拉胶和0.3‰的KCl。
3.权利要求1~2中任一项所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂的制备方法，其特征在于，在60 ℃以上将卡拉胶和KCl混合配置成水溶液。
4.一种兔球虫病减毒活疫苗悬浮液，含有兔球虫病减毒活疫苗和权利要求1~2中任一项所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂。
5.一种可经口摄入的兔球虫病减毒活疫苗产品，含有权利要求4所述的兔球虫病减毒活疫苗悬浮液及其药学上可接受的佐剂。
6.权利要求1~2中任一项所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂在制备兔球虫病减毒活疫苗中的应用。
7.权利要求1~2中任一项所述的饮水免疫用兔球虫病减毒活疫苗助悬剂在制备提高兔球虫病减毒活疫苗的卵囊均匀度的物质中的应用。
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