JPH04507098A - トキソプラズマオーシストの散布に対してネコを免疫感作するためのワクチン - Google Patents
トキソプラズマオーシストの散布に対してネコを免疫感作するためのワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
トキソプラズマオーシストの散布に対してネコを免疫感作するためのワクチン
[技術分野]
本発明は広くは、Toxoplasma gondiiの生きている、生殖性欠
失突然変異体を用いて行う、トキソプラズマ症に対してネコを免疫感作する方法
に関する。さらに特定すれば、該突然変異体がT−263と称され、ATCC寄
託番号第4061.5号を有するものである上記方法及びこれと関連するワクチ
ンに関する。
[背景技術]
トキソプラズマ症は寄生虫感染症であって、寄生虫は複雑なライフサイクルを有
し、多くの動物がこれに感染していることを研究は示唆している。オーシスト(
卵芽胞)は飼いネコやある種の野生ネコの糞に排泄される。そこでオーシストは
排泄物との接触によって拡散する。排泄物を食べるノ1工やゴキブリは輸送媒体
となって、ネコの排泄物に直接接触しない動物を汚染する。ネズミや鳥は輸送媒
体からか、或いは直接接触により感染して、次にはこれらを食べる動物へとさら
に感染を拡大していく。ヒトは生の或いは生焼けの肉を食べることにより、また
は感染排泄物や汚染土に直接接触することにより感染する。
トキソプラズマ症は極めて普遍的で、アメリカや他の国でも成人の4分の1から
2分の1が不顕性感染をしている。トキソプラズマ症の存在は昔から知られてい
たが、トキソプラズマ症がアメリカで新生児に発見された1930年代終わりか
ら1940年代まで、トキソプラズマの伝染についてはほとんど知られていなか
った。しかし、現在ではトキソプラズマのライフサイクルとその中におけるネコ
の中心的役割は、はっきりと明らかになった。
トキソプラズマ症によるヒトの病気は、血清学的、免疫学的及び伝染病学的研究
の組合わせと、病原体となるToxoplasma gondiiの分離によっ
て特徴が解明された。急速に増殖する病原体によって細胞が破壊される急性感染
では、発熱、肺炎、及び心臓筋肉、肝臓や皮膚の炎症(発疹)を伴う。その期間
の終了時または準臨床的急性感染に続いて、局部的或いは全身的なリンパ節浮腫
が、特に女性に観察される。胎児感染した新生児では亜急性症状が典型的に起こ
る。上記した急性トキソプラズマ症に加えて、しばしば水頭症(”脳中の水”)
を伴う脳を髄膜炎(”脳熱”)及び網脈絡膜炎(眼内炎症)が重要な症状である
。
感染新生児を出産した母親の多くは症状を伴わない不顕性感染であった。
従って、トキソプラズマ症はヒト胎児に及ぼす深刻な危険性のために特別な注意
を要する。妊婦が感染し、知らないうちに胎児を感染する恐れがある。もしも適
切な時に診断して治療しなければ、子供は生涯続く脳と目の障害を背負って生ま
れてくるかも知ねない。こういった理由から妊娠中の感染を防ぐ努力が重要であ
る。
飼いネコが糞の中にトキソプラズマオーシストを排泄する重要なオーシストの散
布源であるので、オーシスト散布に対して飼いネコを免疫感作する試みが今まで
になされてきた。一般的に言うと、今までの免疫感作はトキソプラズマ症でネコ
を初感染し、通常のオーシスト散布を伴いながら免疫を確立させることを必要と
した。しかしながら、この方法の免疫感作は、まさに回避すべき現象、すなわち
オー7スト散布をもたらすので、欠陥性と見なされる。特に感染性オーシストが
数カ月から1年半の期間、活性であると考えられる場合には問題となる。この間
、オーシストのないトキソプラズマ株のブラディゾイトを用いてネコを免疫感作
する試みがなされたが、失敗に終わっている。
ネコを免疫感作する首尾よい試みが米国特許第4.473.548号に記載され
ており、これは免疫性を与える間のオーシスト散布を抑えるために、トキソプラ
ズマ初感染後にネコを化学予防法的に治療することを含む。この方法では、まず
ネコを感染し、次いでネコ体内に免疫感作を生成させる間のオーシスト散布を本
質的に防ぐためにモネンシンまたはサリノマイシンをネコに経口投与する。モネ
ンシンは顕著な毒性なしに子猫に受け入れられるが、その他の動物に記載される
時折りの毒性問題のためにモネンシンを使用するには躊躇がある。さらに、モネ
ンシンに対するヒトの耐性は検討されておらず、これもモネンシン予防を受け入
れられない理由の一つである。
従って、糞中へのオーシスト散布の問題を排除し、かつ予防医薬処置を伴わない
、トキソプラズマ症に対するネコの免疫感作方法の需要が極めて大きかった。
[発明の開示]
本発明は、上記した問題を解決し、予防接種したネコのオーシスト散布現象を排
除する、T、gondiiに対してネコを免疫感作する方法(及びそのワクチン
)を提供する。
包括的に言えば、本発明の方法は、化学予防の必要なく、ネコを84%免疫感作
するT、−go n d i iの特定な突然変異体からなるワクチンの有効量
をネコに(好ましくは経口的に)投与することを含む。この免疫感作レベルは米
国特許第4.473.548号に記載の方法を用いたときのレベル(85%)と
ほぼ同じである。
本発明に使用する特定な突然変異体はT−263と命名され、American
Type Cu1ture Co11ectionl:ATCC寄託番号第4
0615号として寄託されている。この突然変異体は従来゛C”株として知られ
たトキソプラズマのタキシイトをアルキル化剤、N−メチル−N゛−二トローN
−二トロソグアニジンで処理して得られる多数の突然変異体の一つである[Pf
efferkorn、E、R,、and Pfefferkorn、L、C。
Toxoplasma gondii:l5olation and prei
iminary characterization of temperat
ure−sensitive mutants、 ExperimentalP
arasitology 39,365−376 (1976)〕oプラークア
ッセイで、アデニンアラビノサイドに対して耐性な突然変異化タキシイトを選択
し、5−フルオロ−デオキシウリジンに耐性な1個のクローンを選択した。アデ
ニンアラビノサイド耐性突然変異体を再度同じ突然変異誘発物質またはエチルニ
トロソウレアで突然変異化し、選択したクローンのワクチンとしての適性を試験
した。
合計で117個の突然変異体をネコワクチンとして試験し、ただ1個の突然変異
体T−263のみが本発明の目的に合致した。
[発明を実施するための最良の形態]
以下に本発明に用いるT−263トキソプラズマ突然変異体の突然変異誘発、ス
クリーニング及び試験を記載する。ここに引用する文献は参照することにより本
明細書に包含される。
A、材料及び方法
実験に使用したマウスは5ASCO,Inc、(Omaha、NE)から得たC
F−1マウスであった。子ネコのほとんどは無作為に選んだ妊娠ネコから得た。
これらのネコは、研究用の妊娠ネコまたは子ネコをめる新聞広告に応じて、寄付
されたものか、或いはUniversity of Kansas Medic
al CenterのAnimal Care Unitから借りたものである
。さらに、Theracon Inc、Topeka、KSから得た実験室で飼
育された子ネコも用いた。全ての子ネコは使用前にトキソプラズマ抗体の有無を
血清学的に試験し、糞の寄生虫を検査した。使用した全ての子ネコは血清陰性で
あり、Toxo、、cara卵、Cystoisospora felisやc
、−rivoltaのオーシストは時たま見られたが、トキソプラズマのオーシ
ストは見られなかった。Theraconから得た子ネコはp2ゴユy9ユta
のオーシストのみを示した。
トキソプラズマをヒト皮膚繊維芽細胞からなる細胞培養系で成長させた。対数増
殖に達した後、1細胞当たりに8個の生物個体が存在する段階で、突然変異誘発
物質であるエチルニトロソウレアを加えた。エチルニトロソウレアの濃度は1m
1当たり300μgであり、処理時間は4時間であった。この時点で生存性を測
定し、生存率は対照培養に比較して3%であった。突然変異誘発物質処理の後、
培地を除去し、生物体を毎日継代培養しながらさらに2日間培養した。この時点
でトキソプラズマの希釈物を96ウエルのトレイに植えて、さらに117クロー
ンを分析した。
4へra−A耐性トキソプラズマのクローンはヒト繊維芽細胞組織培養で短期間
成長させたが、通常はマウス中のクローン感染として維持した。これらは皮下(
S C)または腹腔内(]p)注射し、病気を防ぎ、また組織シスト(嚢子)内
にブラディゾイトを成長させるために、マウスに3日から14日の間、水100
m1中に15mgのスルファメラシンナトリウム(S igma Chemic
ai Co、、St Louis、MO)を混入したものを任意量、飲ませた。
少なくとも1力月後に、特定の株で感染したマウスを殺し、血液抗体の生成を検
査し、トキソプラズマのシストの存在を調べるために脳塗抹標本を光学顕微鏡で
検査した。次いで候補株で感染したマウスの死体を、1匹または数匹の血清陰性
で、離乳した子ネコに食べさせ、続く30日間真中のオーシストの有無を調べた
。
5日から12日の間は毎日、その後は通常30日まで1週間に3回、検査のため
に糞を採集した。115の特定重力のショ糖溶液中での浮上によってオーシスト
を濃縮し、スポロゾイト形成させるために2%(V / V )の硫酸に貯蔵し
た。
オーンスト排泄度は1から4のスケールで評価し、1+はスライドにただ1個の
オーシストを意味し、2+はスライドに数個ないしは多数のオーシストを意味し
、+3は高倍率視野光たり平均1個のオーシストを意味し、+4は高倍率(40
0X)視野光たり多数のオーシストを意味する。いくつかの実験では、標準手法
を用いて血球計数器でオーシストを計数した。
突然変異体の候補株で初感染した後、ネコがオーシストを排泄しない場合は、T
−265ブラデイゾイトの接種原でチャし〆ンシ(po)L、再び30日間オー
シスト生成をチェックした。処理後肉眼でオーシストを同定しなかった場合は、
5日から12日の標本を合わせたもののショ糖浮遊液をマウスに接種してオーシ
スト散布のないことを確認した。フェノールレッドを指示薬として、試料を3゜
3%(W/V)水酸化すトリウムで中和し、沈降し、沈降物を数匹のマウス群に
食べさせるか、或いは注射(ip)した。
マウスが死ぬと、ギュムザ染色した肺、肝臓、肺臓及び脳のスタンプ塗抹標本を
作製し、トキソプラズマの存在を検査した。生存マウスは21日後に採血し、ト
キソプラズマ抗体の存在を血清学的に検査した。
ネコは感染マウスの組繊で処理する前、その少な(とも30日後、及び以後のチ
ャレンジ感染時に耳から採血した。マウスはエーテル麻酔下に後眼窩洞から採血
した。マウス内に急性感染として保持し、1週間に3回継代(ip)したトキソ
ブラズマRH株のタキシイトを用いて、抗体価をサビンーフエルドマン染色試験
で測定した[Frenkel and Jacobs、”0cular T。
xoplasmosis”、 A、M、A、Arch、0phth、(1958
)]。
突然変異体の候補株が初感染後3匹のネコにオーシスト生成をもたらさず、かっ
こねら3匹の免疫感作を完了したのち、該株が配偶子を形成できるか否かを検知
する試みがなされた。Ara−A耐性(非オーンスト形成性)ワクチン候補株の
ブラディゾイトを含むマウス組織を、F[JDR耐性オーシスト形成性株のブラ
ディゾイトと混合し、混合物を1匹または数匹の子ネコに食べさせた。Ara−
A及びFUDRの両方に対する耐性を併せ持つオー7ストの形成は、候補株によ
る1個の配偶子形成の故に、2個のゲノムの組み替えができたことを示唆する[
Pfefferkorn、L、C,、and Pfefferkorn、ER,
Toxoplasma gondii:Genetic recombinat
ion between drug resist、ant mutants。
Experimer+tal Parasitology 50,305−31
6 (1980)]。
マウス脳中のトキソプラズマのシストの存在を顕微鏡的に確認し71個または数
個の脳を子ネコに食べさせ、感染をオーシスト排泄により評価し、もしも排泄が
ない場合は血清転化により評価した。オーシスト数は肉眼で評価し、6匹のマウ
スにおける、繊維芽細胞培養中の脱嚢液で処理した後の滴定によって定量化した
。塗抹標本におけるトキソプラズマを有するマウス、及び血清陽性な動物の数を
集めてl[)50を計算した。細胞培養では、一定希釈度におけるプラークの存
在を感染の指標として用いた。
B、結県
合計で117個の突然変異誘発したaraAR突然変異体を上記のようにネコで
試験した。106個の突然変異体がオーシスト排泄をもたらしたので捨てた。
このうち85個の突然変異体が1匹目のネコに、16個が2匹目のネコに、3個
が3匹目のネコにオーシストを排泄させた。2個の突然変異体を11匹または1
2匹のネコで試験【2.11匹のうちの6匹と1,12匹のうちの2匹がオーシ
スト排泄した。
10個の突然変異体を用いた感染でオーシスト排泄が観察されなかった。このう
ち、6個の突然変異体を用いる感染では免疫を付与せず、3個の突然変異体では
免疫が失われていた。T−263と命名した1個の突然変異体を合計37匹のネ
コで試験したところ、このいずれもが肉眼、及びマウス接種で観察してオーシス
トを排泄しなかった。これらのネコをチャレンジしたところ、31匹或いは83
7%が免疫された。この中には、6力月後にチャレンジした5匹の子ネコ群が含
まれており、そのうち3匹が免疫された。試験の結果を以下の表に示す:T−2
63 0/37 0/37<2−128 9.2 6/37 6/37 <2−
128 6.9 84%ワクチン
T−265−−−−16/1616/16 16−51297p=< o、oo
i
T−263による雄性または雌性配偶子のいずれかの存在を試験するためにこの
ara−、A’突然変異体のブラディゾイトを、FUDRRオーシスト生産体で
あるT−237のブラディゾイトと同時にネコに食べさせた。得られるオーシス
トをクローン化し、ara−A耐性を試験した。3回の異なる実験において、3
%。
1.5%及び0,01%のオーシストがa、ra−A耐性であり、0.1%、0
゜1%及び0,01%のオーシストが二重耐性であることが明らかとなった。
オーシスト数の肉眼計数による感度を評価するために、浮遊液を数え、滴定した
。肉眼計数が50.000オーシスト存在するとき、マウスの経口滴定は10゜
000であり、皮下滴定は19であり、ヒト皮膚繊維芽細胞培養における滴定で
は4.400感染ユニツトであった。
上記したように、T−263突然変異体からなるワクチンは、チャレンジしたネ
コのうち実質的に84%を免疫感作した。これはオーシスト散布を伴う、通常の
ブラディゾイトを用いる感染の際の免疫感作率(88−94%・Frenkel
、J、に、、and Sm1th、D、D、Immunization ofc
ats against shedding of Toxoplasmaoo
cyst、s、 Journal of Parasitology 68(5
)・74.4−74.8.1982)よりもやや低い値ではあるが、統計的には
ささいな差である。新規ワクチン及び方法の特に優れた点は、これがモネシシン
などの化学予防法を排除する点であり、また本発明の免疫感作がオーツスト生成
を伴わないというへにある。低い確率とはいえ、ara−、AR遺伝子及び遺伝
組み替えの出現は、T−263突然変異体が1個の配偶子を形成することを示唆
し、従ってこの突然変異体はこの属性を特徴づけるために”生殖性決失゛である
と命名された。
予防注射の目的に使用するT−263突然変異体は、シストにおいて独特の感染
性ブラディゾイトを生成させるために、マウス中で繁殖させることに成功した。
別法としては、ラットのような他の小さな実験動物を用いたり、或いはシスト生
成が自発的にまたは抗体の存在下に起きるような、ある種の細胞培養で繁殖させ
ることもできる[Hoffら、”Toxoplasma gondii Cys
is in Ce1l Cu1ture+、J、Parasitol、63:1
121−24.、、(1977)]。さらに、ブラデイゾイトシストを直接食べ
させる際に、所望するならばワクチンに適当な担体を含めることもできる。
国1g膿査鰯牛
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、T−263突然変異体と命名され、ATCC寄託番号第40615号を有す る、T.gondiiの突然変異体の有効量をネコに投与することからなるトキ ソプラズマ症に対してネコを免疫感作する方法。 2、上記突然変異体をネコに経口投与する請求の範囲第1項記載の方法。 3、上記突然変異体を実験動物中でinvivoで繁殖させるか、または細胞培 養で繁殖させ、該実験動物の組織または感染培養細胞をネコに食べさせる、請求 の範囲第1項記載の方法。 4、T−263突然変異体と命名され、ATCC寄託番号第40615号を有す る、T.gondiiの突然変異体からなるワクチンであって、不コのオーシス ト排泄を伴わずにトキソプラズマ症に対してネコを免疫感作するためのワクチン 。
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