CN104840956A - λ-角叉菜胶在制备免疫佐剂中的用途及抗原-佐剂复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种海藻多糖在疫苗佐剂中的应用。本发明要解决的技术问题是目前疫苗制备尤其是肿瘤疫苗制备的理想的佐剂难以获得。本发明解决的技术问题的技术方案是提供了λ-角叉菜胶在制备免疫佐剂中的新用途。该λ-角叉菜胶是以2-硫酸化的半乳糖和2,6-硫酸化的半乳糖通过β-1，4键连接而成双糖单元，每双糖单元有3个硫酸化位点的多糖。本发明以λ-角叉菜胶作为佐剂制备的肿瘤疫苗可以明显增强抗原的血清抗体滴度，减少小鼠的成瘤率，具有明显的抗肿瘤效果，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及λ-角叉菜胶作为疫苗佐剂的应用，以及以λ-角叉菜胶为佐剂的抗原-佐剂复合物。
背景技术
对于疫苗来说，佐剂的添加至关重要。佐剂是一种非特异性免疫增强剂，作为改善机体对疫苗抗原的免疫应答已经有几十年应用的历史了。将抗原与佐剂一起注入机体，可以减少有效免疫接种所需的抗原量和免疫接种频率，提高早期免疫应答和免疫功能不全者的应答成功率等等。
角叉菜胶是从海洋红藻的细胞壁提取出的一种多糖，它由2-硫酸化的半乳糖和2,6-硫酸化的半乳糖通过β-1，4键连接而成的。根据硫酸化位点的数目和位置的不同，角叉菜胶可分为κ-,ι-,λ-三种。其中，λ-角叉菜胶每个双糖单元有3个硫酸化位点。
而本领域目前需要提供新的、性能良好的免疫佐剂，尤其是为肿瘤疫苗的研制提供新的有效选择。而目前并无以角叉菜胶作为免疫佐剂制备疫苗的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的、性能良好的免疫佐剂，尤其是用于肿瘤疫苗的研制。
解决该技术问题的技术方案是提供λ-角叉菜胶在制备免疫佐剂中的新用途。
其中，上述用途中所述的λ-角叉菜胶是以2-硫酸化的半乳糖和2,6-硫酸化的半乳糖通过β-1，4键连接而成双糖单元，每双糖单元有3个硫酸化位点的多糖。
进一步的，上述用途中所述的λ-角叉菜胶的分子结构如下：
其中的n为大于1的整数。
本发明在上述技术方案的基础，提供了一种抗原/免疫佐剂复合物，该抗原-免疫佐剂复合物中的免疫佐剂含λ-角叉菜胶。
进一步的，该抗原-佐剂复合物中的免疫佐剂为λ-角叉菜胶。
其中，上述抗原-佐剂复合物中的λ-角叉菜胶是以2-硫酸化的半乳糖和2,6-硫酸化的半乳糖通过β-1，4键连接而成双糖单元，每双糖单元有3个硫酸化位点的多糖。
更进一步的，上述抗原-佐剂复合物中的λ-角叉菜胶的分子结构如下：
其中的n为大于1的整数。
其中，上述抗原-佐剂复合物中的抗原与λ-角叉菜胶的重量配比为1:5～50。
优选的，上述抗原-佐剂复合物中的抗原与λ-角叉菜胶的重量配比为1:20。
其中，上述抗原-佐剂复合物中的抗原为肿瘤抗原或肝炎抗原。
进一步的，上述的肝炎抗原为HBsAg。
进一步的，上述的肿瘤抗原可选自NY-ESO-1；人黑色素瘤相关抗原gp100；黑色素瘤抗原mage-1或癌胚抗原等常用的肿瘤抗原。
同时，本发明还提供了上述抗原-佐剂复合物的制备方法。该方法包括以下步骤：
a、取抗原用水稀释；
b、加入所需量的λ-角叉菜胶，混匀，即得。
本发明同时提供了上述λ-角叉菜胶作为免疫佐剂在制备疫苗中的用途。抗原-佐剂复合物在本领域也可称为疫苗。
其中，所述的疫苗为预防和/或治疗性疫苗。
比如，当抗原为HBsAg等肝炎抗原时，可以制备成为肝炎疫苗。当抗原为OVA或其他的肿瘤抗原时，可以制备成预防和/或治疗性肿瘤疫苗。
本发明所述疫苗可以通过皮下、腹腔或肌肉等方式注射给药，对个体进行免疫。当然也可以采用本领域的其他可用方式进行免疫，或者是多种方式的组合。并且本发明所述疫苗可以有不同的免疫时间间隔。可以给药一次，也可以多次。具体实施过程中可以根据实际情况改变或者调整免疫次数和免疫时间点。
本发明进一步地考察了不同抗原与λ-角叉菜胶的重量配比，对不同用量的λ-角叉菜胶进行筛选，发现抗原与免疫佐剂中λ-角叉菜胶的重量配比为1:20时制成的疫苗效果最好。
本发明中的新型λ-角叉菜胶多糖疫苗佐剂，可适用于肝炎等传染病疫苗和肿瘤疫苗的研发。其作用机制初步分析可能为λ-角叉菜胶激活了小鼠的免疫系统，募集活化了在疫苗中起重要作用的抗原呈递细胞(DC，巨噬细胞)，诱导并激发体液免疫，产生了高滴度的血清抗体。另外实验发现诱导产生的IL17A也有可能有益于疫苗中产生特异性的细胞免疫反应，从而加强肿瘤疫苗的效果。
在本领域常用的OVA模式肿瘤抗原疫苗模型中，分别通过预防性免疫和治疗性免疫实验证明，体内产生了更多的针对OVA的抗体，降低了小鼠的成瘤率，明显抑制了肿瘤的生长。
本发明的有益效果为：本发明创造性地使用了λ-角叉菜胶作为免疫佐剂。该技术方案具有方法简便、成本低、免疫活性强、临床安全性高等优点。本发明表明λ-角叉菜胶是一种优秀的具有免疫调节作用的疫苗免疫佐剂，尤其是适合制备肿瘤疫苗，为肿瘤疫苗的研制提供了新的选择和方向。
附图说明
图1、是疫苗预防性实验中，OVA-λ-角叉菜胶复合物免疫后，各组小鼠的肿瘤生长曲线比较。
图2、是疫苗治疗性实验中，OVA-λ-角叉菜胶复合物免疫后，各组小鼠的肿瘤生长曲线比较。
图3、是疫苗预防性实验中，OVA-λ-角叉菜胶复合物免疫后，各组小鼠的成瘤率。
图4、是疫苗预防性实验中，OVA-λ-角叉菜胶复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图5、是免疫活化实验中，λ-角叉菜胶募集M1型巨噬细胞和DC的结果。
图6、是免疫活化实验中，λ-角叉菜胶对小鼠脾脏淋巴细胞活化情况影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的描述说明。以下实施中将进一步说明该多糖作为佐剂的疫苗制备和使用方法。本发明包括但不限于以下实施中所列举的具体方法步骤。
实施例一使用λ-角叉菜胶作为佐剂制备的OVA疫苗及其免疫治疗实验
实验材料及试剂：λ-角叉菜胶(CAT.22049)与OVA(CAT.A5503)均购自美国Sigma公司；C57BL/6小鼠购自北京维通利华公司；小鼠淋巴癌细胞EG.7-OVA购自美国ATCC；ELISA自包被板购自NUNC。
(一)OVA疫苗的制备
OVA溶液的配制：称取10mgOVA溶解于10mL生理盐水，配成浓度为1mg/mL的溶液；再用生理盐水稀释10倍成0.1mg/mL的储备液。
λ-角叉菜胶溶液的配制：称取10mgλ-角叉菜胶溶解于5mL生理盐水，配成浓度为2mg/mL的储备液。
将配制好的OVA和λ-角叉菜胶溶液各取50μl等体积混合即可，得到每只小鼠所需的疫苗溶液(100μl/只，含5μgOVA，100μgλ-角叉菜胶)。
(二)本发明新型佐剂对小鼠移植瘤生长的预防及治疗性实验
预防性实验：C57小鼠随机分为3组：1、生理盐水组；2、OVA组3、OVA/λ-角叉菜胶疫苗；每组8只。
各组分别在第0、2、3周在各组小鼠的左背侧皮下注射疫苗，生理盐水组注射100μl生理盐水，OVA组和OVA/λ-角叉菜胶疫苗组的每只小鼠按5μg OVA/次注射。在最后一次免疫后第7天，在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋巴瘤细胞3×106/只，建立小鼠移植瘤模型，每3天测量一次小鼠的肿瘤体积。
治疗性实验：小鼠仍按预防性试验随机分为3组，在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋巴瘤细胞3×106/只，待肿瘤长至可触及时(约3mm，接种后3～5天)，小鼠开始皮下免疫治疗(每组的注射治疗剂量与上述预防性实验剂量一样)，每周1次，连续治疗3次，每3天测量一次小鼠的肿瘤体积。
预防性和治疗性实验结果分别见图1和图2，与生理盐水组和单独OVA疫苗组相比，OVA/λ-角叉菜胶组的肿瘤生长明显得到抑制。其中预防性实验中，其小鼠成瘤率明显降低(图3)。
(三)抗体滴度的测定
实验方法及分组同预防性实验。小鼠最后一次免疫后第7天收集血清，通过ELISA检测各组小鼠血清中的抗体滴度。血清样品用5％脱脂奶粉做等二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图4。单独OVA组只能产生微量抗体难以发挥免疫作用。而加入λ-角叉菜胶作为佐剂后可，使针对OVA的特异性抗体的抗体滴度提高了4倍，产生有了显著的提高。
实施例二λ-角叉菜胶的免疫活化作用探讨
实验材料及试剂：λ-角叉菜胶购自美国Sigma公司(CAT.22049)；C57BL/6小鼠购自北京维通利华公司；小鼠黑色素瘤B16-F10购自美国ATCC；各种流式抗体购自美国BD-Pharmingen公司。
(一)、λ-角叉菜胶的处理对小鼠体内免疫功能的影响
将B16-F10肿瘤接在小鼠右侧皮下位置，106/只，待肿瘤长至可触及时(约3mm，接种后3～5天)，将小鼠随机分成2组，小鼠开始瘤内注射生理盐水NS和λ-角叉菜胶处理，50mg/kg体重，间隔一天一次。
在λ-角叉菜胶处理后期，每组选取3只小鼠处死后，将肿瘤组织剪碎后用胶原酶消化得到单细胞悬液，染表面抗体FITC-CD11b，PerCP-CD11b，PE-F4/80，PE-CD11c，4℃，30min后上机检测。结果见图5。
实验发现λ-角叉菜胶处理后，小鼠组织中侵润性的M1型巨噬细胞和DC有明显增高。特别是M1型巨噬细胞从1.15％增加到9.68％，增加了约10倍。DC也从0.65％增加到2.44％。而巨噬细胞和DC还在小鼠的免疫系统中起重要作用，特别是在抗原递呈过程中，这可能是λ-角叉菜胶具有潜在的佐剂效应的原因。
(二)λ-角叉菜胶对小鼠脾脏淋巴细胞活性的影响
在λ-角叉菜胶处理后期，每组选取3只小鼠处死后，将脾脏用注射器针尖撕碎后，裂红得到含淋巴细胞的单细胞悬液。将得到的细胞表面进行PerCP-CD4,FITC-CD8,PE-CD69染色，4℃，30min后上机检测。结果见图6。
实验发现λ-角叉菜胶不仅能使脾脏淋巴细胞增殖，还能活化淋巴细胞(CD69是淋巴细胞表面早期活化标志)。无论是CD4还是CD8阳性的淋巴细胞，都约增殖活化了一倍。
上述实验表明，本发明λ-角叉菜胶能够有效激活免疫系统，使抗原产生4倍以上的抗体滴度，是一种有效的免疫佐剂，为本领域提供了一种新的有效选择。
Claims (11)
1.λ-角叉菜胶在制备免疫佐剂中的新用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的λ-角叉菜胶是以2-硫酸化的半乳糖和2,6-硫酸化的半乳糖通过β-1，4键连接而成双糖单元，每双糖单元有3个硫酸化位点的多糖。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的λ-角叉菜胶的分子结构为：
4.一种抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述的免疫佐剂含λ-角叉菜胶。
5.根据权利要求4所述的抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述的免疫佐剂为λ-角叉菜胶。
6.根据权利要求4所述的抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述λ-角叉菜胶是以2-硫酸化的半乳糖和2,6-硫酸化的半乳糖通过β-1,4键连接而成双糖单元，每双糖单元有3个硫酸化位点的多糖。
7.根据权利要求6所述的抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述λ-角叉菜胶的分子结构为：
8.根据权利要求4所述的抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述抗原-佐剂复合物中的抗原与λ-角叉菜胶的重量配比为1:5～50。
9.根据权利要求8所述的抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述抗原-佐剂复合物中的抗原与λ-角叉菜胶的重量配比为1:20。
10.根据权利要求4～9中任一项所述的抗原/免疫佐剂复合物，其特征在于：所述抗原-佐剂复合物中的抗原为肿瘤抗原或肝炎抗原。
11.制备权利要求4～10中任一项所述的抗原/免疫佐剂复合物的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
a、取抗原用水稀释；
b、加入所需量的λ-角叉菜胶，混匀，即得。
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