CN105999260B - 氢氧化铝凝胶-氯化钠复合免疫佐剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氢氧化铝凝胶‑氯化钠复合免疫佐剂及其制备方法和用途。本发明所要解决的技术问题是提供一种性能良好的、新的免疫佐剂。解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有氢氧化铝凝胶和化学纯的氯化钠。本发明氢氧化铝凝胶‑氯化钠复合免疫佐剂具有方法简便、成本低、免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对各种抗原的复合免疫佐剂。本发明的氢氧化铝凝胶‑氯化钠复合物作为佐剂制备的肝炎疫苗和肿瘤疫苗具有更强的免疫效果和抗肿瘤效果，特别是促进CD8阳性T细胞的激活和增殖，特异杀伤肿瘤细胞，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氢氧化铝凝胶-氯化钠复合免疫佐剂及其制备方法和用途。
背景技术
佐剂是一种非特异性免疫增强剂，作为改善机体对疫苗抗原的免疫应答已经有几十年应用的历史了。疫苗中加入佐剂目的是为了增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，表现为促进抗原的特异性体液免疫和/或细胞免疫，从而可以提高特异性抗体的产生或/和特异性细胞免疫功能。将抗原与佐剂一起注入机体，可以减少有效免疫接种所需的抗原量和免疫接种频率，提高早期免疫应答和免疫功能不全者的应答成功率等等。
以氢氧化铝和磷酸铝为代表的铝佐剂至今仍然是我国被批准合法使用的人用疫苗佐剂。氢氧化铝还是唯一被美国FDA批准使用的人用佐剂。虽然应用悠久，但是铝盐佐剂的作用机理目前尚不完全清楚。目前认为有“库存效应”和“免疫刺激效应”两种机制。铝佐剂吸附抗原后在接种区域形成抗原贮存库，一方面在该处的非特异免疫刺激吸引树突状细胞巨噬细胞等抗原提呈细胞(APC)识别与内吞；另一方面，在注射局部缓慢释放抗原，延长了APC与T淋巴细胞相互作用的时间，从而提高抗体应答，增强体液免疫。
氯化钠对于地球上的生命非常重要，无论是在生活，工业还是医学上都广泛应用。生活中饮食所需的食盐和医学上使用的生理盐水注射液的主要成分都是氯化钠。它具有获取方便，价格便宜和安全性高等优点。
随着新型佐剂的飞速发展，传统佐剂已经越来越无法满足疫苗的需求。大量的临床免疫试验认为氢氧化铝胶体佐剂对体液免疫反应具有很强的激发作用，而对细胞免疫反应的作用较弱。如何提高铝佐剂介导的细胞免疫，既能有效地诱导机体产生体液免疫，又能有效地诱导细胞免疫则是目前免疫佐剂研究的重点与难点。
目前还没有人使用氯化钠与氢氧化铝一起作为复合免疫佐剂，而本领域目前需要提供新的、性能良好的免疫佐剂，为疫苗的制备提供新的有效选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种新的、性能良好的免疫佐剂，为本领域提供一种新的有效选择。
解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有氢氧化铝凝胶和高于生理水平的氯化钠。
其中，上述复合免疫佐剂所述氯化钠化学纯或者化学纯以上的氯化钠。
其中，氯化钠在免疫佐剂中的用量为高于生理水平是指在最终佐剂-抗原复合物溶剂中氯化钠的质量分数高于0.9％。该最终质量分数指免疫佐剂与抗原的复合物在注射使用前的浓度。
其中，上述复合免疫佐剂中所述氯化钠的最终质量分数为1.2％～7.2％。进一步的，上述复合免疫佐剂中所述氯化钠的最终质量分数为2.7％～4.5％。优选的，上述复合免疫佐剂中所述氯化钠的最终质量分数为3.6％。
其中，上述的质量分数是指在每100毫升佐剂-抗原复合物溶剂中氯化钠的质量(克)。
其中，上述复合免疫佐剂中所述氢氧化铝凝胶的颗粒粒径范围为1μm～10μm。优选的，所述氢氧化铝凝胶的颗粒粒径范围为2μm～6μm。粒径3μm左右为佳。本发明另外还提供了上述复合免疫佐剂添加抗原形成的免疫佐剂/抗原复合物。免疫佐剂/抗原复合物在本领域也可称为疫苗。
其中，上述免疫佐剂/抗原复合物中所述抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝的重量配比为1︰1～100。进一步的，抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝的重量配比为1︰5～50。
其中，上述免疫佐剂/抗原复合物中所述抗原为乙型肝炎表面抗原或肿瘤抗原。进一步的，上述的肝炎抗原为HBSAg。进一步的，上述的肿瘤抗原可选自NY‐ESO‐1；人黑色素瘤相关抗原gP100；黑色素mage‐1或癌胚抗原等常用的肿瘤抗原。
本发明另外还提供了制备上述的免疫佐剂/抗原复合物的方法。该方法包括以下步骤：
a、取所需抗原用水稀释或溶解；
b、加入所需的氯化钠，混匀；
c、加入所需量的氢氧化铝凝胶，混匀。
进一步的，上述的所需抗原为乙型肝炎表面抗原或肿瘤抗原。
进一步的，上述的肝炎抗原为HBSAg。
进一步的，上述的肿瘤抗原可选自NY‐ESO‐1；人黑色素瘤相关抗原gP100；黑色素mage‐1或癌胚抗原等常用的肿瘤抗原。
上述技术方案中的质量分数是指在每100毫升佐剂-抗原复合物溶剂中氯化钠的质量(克)。
本发明同时提供了上述免疫佐剂/抗原复合物在制备疫苗中的用途。所述疫苗为预防和/或治疗性疫苗。比如当抗原为HBsAg等肝炎抗原时，可以制备成为肝炎疫苗，比如当抗原为OVA或者肿瘤特异性抗原时，可以制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗。本发明所述疫苗可以通过皮下、腹腔或肌肉等方式注射给药，对个体进行免疫。当然也可以采用本领域的其他 可用方式进行免疫，或者是多种方式的组合。并且本发明所述疫苗可以有不同的免疫时间间隔。可以给药一次，也可以多次。具体实施过程中可以根据实际情况改变或者调整免疫次数和免疫时间点。
为了构建好的可用于免疫佐剂的氢氧化铝-氯化钠复合佐剂，考察了多种氢氧化铝-氯化钠配方。本发明对不同质量分数的氯化钠进行筛选，发现使用质量分数3.6％的氯化钠与氢氧化铝的复合物作为佐剂制成的疫苗效果最好。在肝炎疫苗模型中，体内产生了针对HBsAg的高滴度的抗体和IFN-γ；在肿瘤疫苗模型中，分别通过预防性免疫和治疗性免疫实验证明，体内产生了针对OVA的抗体和激活了特异性CD8杀伤性T细胞，增加了IFN-γ的分泌，能有效抑制肿瘤生长。
同时，本发明提供了氯化钠在制备免疫佐剂中的用途。
其中，上述用途中所述的免疫佐剂里还有氢氧化铝凝胶。
其中，上述用途中所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为高于生理水平。
其中，上述用途中所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为使其制备得到的免疫佐剂与抗原的复合物中的氯化钠质量分数为1.2％～7.2％。该浓度为免疫佐剂与抗原的复合物在注射使用前的浓度。
同时，本发明也提供了氯化钠在制备免疫佐剂-抗原复合物中的用途。
其中，上述用途中免疫佐剂-抗原复合物中还含有氢氧化铝凝胶作为佐剂。
其中，上述用途中氯化钠的含量为质量分数1.2％～7.2％。该浓度为免疫佐剂与抗原的复合物在注射使用前的浓度。
其中，上述用途中抗原与氢氧化铝的重量配比为1:1～100。
其中，上述用途中抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝的重量配比为1:5～50。
其中，上述用途中所述抗原为肿瘤抗原或肝炎抗原。
本发明还提供了疫苗的配制方法。该方法的步骤为在疫苗使用前，加入氯化钠和适量注射用水，并使氯化钠在待注射的疫苗体系中的质量分数达到1.2％～7.2％。优选的氯化钠在待注射的疫苗体系中的质量分数达到2.7％～4.5％。最优的为3.6％。
其中，上述方法中所述疫苗含有抗原和氢氧化铝凝胶。
其中，上述方法中23、根据权利要求21所述的疫苗配制方法，其特征在于：所述疫苗中抗原与氢氧化铝的重量配比为1:1～100。
需要说明的是，本发明中所述的抗原与氢氧化铝的重量配比是指抗原与氢氧化铝凝胶中的氢氧化铝纯物质的比例。
本发明得到了新型的疫苗佐剂，氢氧化铝凝胶-氯化钠复合免疫佐剂，可适用于肝炎等 传染病疫苗和肿瘤疫苗的研发。其作用机制初步分析可能为氢氧化铝凝胶中铝盐与抗原结合形成抗原贮存库，使抗原得以缓慢稳定地释放，铝盐佐剂能诱导、激发体液免疫；高渗氯化钠则能激活MΦ、NK、DC等免疫细胞活性，激活MAPK信号通路，促进DC的成熟与抗原摄取或者交叉递呈。这样既可以激发体液免疫，又能够激发细胞免疫。
本发明的有益效果为：本发明创造性地开发出了氢氧化铝-氯化钠复合免疫佐剂，具有免疫活性强、临床安全性高等优点，和单独的氢氧化铝相比引起了特异性的细胞免疫反应，是一种优秀的针对各种抗原的氢氧化铝-氯化钠复合免疫佐剂。试验表明，使用本发明的氢氧化铝-氯化钠作为佐剂制备疫苗，可具有更高的免疫效果和抗肿瘤效果，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。
附图说明
图1是HBsAg蛋白与氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图2是HBsAg蛋白与氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，ELISA检测淋巴细胞产生IFN-γ的情况。
图3是疫苗预防性实验中，OVA-氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，各组小鼠的肿瘤生长曲线比较。
图4是疫苗治疗性实验中，OVA-氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，各组小鼠的肿瘤生长曲线比较。
图5是疫苗预防性实验中，OVA-氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，各组小鼠的生存期。
图6是疫苗预防性实验中，OVA-氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，各组小鼠的成瘤率。
图7是OVA与氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
图8是OVA与氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，ELISA检测淋巴细胞产生IFN-γ的情况。
图9是OVA与氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，疫苗可以诱导针对肿瘤细胞的特异性CTL反应。
图10是OVA与氢氧化铝凝胶-氯化钠复合物免疫后，分离小鼠脾脏中的T淋巴细胞用于细胞过继治疗的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的描述说明。以下实施中将进一步说明该疫苗的制备和使用方法。本发明包括但不限于以下实施中所列举的具体方法步骤。
本发明创造性地发现氢氧化铝凝胶-氯化钠组合作为复合佐剂，既能有效地诱导机体产生体液免疫，又能有效地诱导细胞免疫。
本发明复合佐剂采用了两种成分：其中氢氧化铝凝胶佐剂，是一种无机盐佐剂，具有良好的蛋白吸附作用，能将可溶性抗原吸附于铝胶分子表面；也可以浓缩抗原，减少注射剂量。氢氧化铝凝胶成本低廉、使用方便、无毒，是应用最广的一种佐剂，也是至今唯一被美国FDA批准可用于人类疫苗的佐剂。而氯化钠在生活，工业及医学上广泛应用。
经过进一步的筛选试验，本发明复合佐剂中所述氯化钠用量为使氯化钠的最后质量分数大于生理浓度就能取得免疫效果的提高。在1.2％～7.2％免疫效果的提高较为明显。优选3％～4％能有更好的免疫佐剂的效果。本发明实验中最好的效果是3.6％。本发明中氯化钠的质量分数是指在每100毫升抗原佐剂复合物溶剂中氯化钠的质量(克)。
本发明在氢氧化铝型乙型肝炎疫苗的基础上添加氯化钠佐剂，获得了更高的抗体滴度和IFN-γ的分泌增加；还采用氢氧化铝凝胶-氯化钠新型佐剂制备了一种新型OVA疫苗，并证实了这一新型佐剂疫苗抗EG.7淋巴癌的有效性。
氢氧化铝凝胶一般使用为粒径范围为1μm～10μm的氢氧化铝胶体颗粒。优选为粒径2μm～6μm的氢氧化铝颗粒。当然，可能在于不同的抗原配合时，氢氧化铝凝胶中颗粒的粒径的优选值会有一定合理的变化。优选为粒径3μm左右的氢氧化铝颗粒。
而经过筛选，上述抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝的重量配比为1:1～100，优选1:5～50。
显然，本领域技术人员在使用不同抗原制备疫苗时，可以在上述范围内合理调整氯化钠的质量分数。也可以根据需要合理调整复合免疫佐剂中抗原用量及氢氧化铝凝胶和抗原的重量配比。
比如，本发明的实施例中，当使用HBsAg作为抗原时，免疫佐剂/抗原复合物中HBsAg用量为1μg，抗原和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1：5～1：100，最优选为1：25。
使用OVA时，免疫佐剂/抗原复合物中OVA用量为5μg，抗原和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1：5～1：50，最优选为1∶25。
在上述技术的基础上，还发展出一种新的疫苗配制方法。该方法的步骤为在疫苗使用前，加入氯化钠和适量注射用水配制成待注射的疫苗体系，并使氯化钠在待注射的疫苗体系中的质量分数达到1.2％～7.2％。优选的，氯化钠在待注射的疫苗体系中的质量分数达到2.7％～4.5％。最优的为3.6％。其中，所述疫苗含有抗原和氢氧化铝凝胶。进一步的，抗原与氢氧化铝的重量配比为1:1～100。本发明中的氢氧化铝凝胶可以是目前市售的氢氧化铝免疫佐剂，也可以是目前临床根据《中国药典》配制的氢氧化铝胶体佐剂。
实施例一：复合佐剂的筛选及制备
实验材料及试剂：氢氧化铝佐剂(Alhydrogel，氢氧化铝凝胶)购自美国InvivoGen(白色悬浊液，10mg/mL，粒径3μm)
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)购自美国ARP公司(American Rearch Products)，氯化钠(NaCl)与卵白蛋白(OVA)购自美国Sigma公司。
制备上述的免疫佐剂～抗原复合物的方法包括以下步骤：
a取所需抗原(HBsAg或OVA)用水稀释或溶解；
b加入所需的氯化钠，混匀；
c加入所需量的氢氧化铝凝胶，混匀。
经过进一步的筛选试验，所述氯化钠的最后质量分数为1.2％～7.2％，优选3.6％能有最好的免疫佐剂的效果。本发明中氯化钠的质量分数是指在每100毫升抗原佐剂复合物溶剂中氯化钠的质量(克)。
而经过筛选，上述抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝的重量配比为1:1～100，优选1:5～50。
当使用HBsAg作为抗原时，免疫佐剂/抗原复合物中HBsAg用量为1μg，抗原和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1：5～1：100，最优选为1：25。
使用OVA作为抗原时，免疫佐剂/抗原复合物中OVA用量优选为5μg，抗原和氢氧化铝凝胶的重量配比可为1：5～1：50，最优选为1∶25。
实施例二：本发明使用氯化钠作为乙肝疫苗佐剂的动物免疫试验
实验材料及试剂：氢氧化铝佐剂，氯化钠，HBsAg同实施例一；C57BL/6小鼠购自北京维通利华公司；乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒(万泰生物药业)；IFN-γ的ELISA试剂盒(美国eBioscience公司)；淋巴细胞分离液(中国达科为试剂公司)；70μm尼龙网过滤器(美国BD公司)；圆底24孔板(NUNK)。
实验动物按如下分组：1、Control；2、HbsAg；3、HbsAg/Al(OH)3；4、HbsAg/Al(OH)3/1.8％NaCl；5、HbsAg/Al(OH)3/3.6％NaCl；6、HbsAg/Al(OH)3/7.2％NaCl；所有分组中HbsAg为1μg，Al(OH)3为25μg，HbsAg和Al(OH)3的重量配比1:25。每组5只。于第0,2,3周肌肉免疫，第4周收集血清及脾脏淋巴细胞用于如下实验。
(一)抗体滴度的检测
通过ELISA试剂盒(万泰生物药业)检测各组小鼠血清中的抗体滴度。血清样品用5％脱脂奶粉做等二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图1。单独HBsAg组几乎不能产生抗体。单独使用Al(OH)3组和Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组均能有效刺激抗体的产生。而Al(OH)3+氯化钠复合佐剂相比于单独使用Al(OH)3组能产生更高的抗体滴度，并且在氯化钠质量分数为3.6％时达到最高值。
(二)细胞因子IFN-γ的测定
IFN-γ的测定采用ELISA试剂盒(eBioscience公司)进行。具体如下：小鼠末次免疫后一周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基(1640+10％FBS+双抗生素)混悬，用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至5×106细胞/ml。24孔板中每孔加入500μl细胞液，再加入5μg HBsAg刺激，置于CO2孵箱培养48小时，用ELISA检测试剂盒测定培养上清IFN-γ的浓度。
实验结果见图2，单独HBsAg基本没有IFN-γ的分泌；加入Al(OH)3佐剂后有极少量IFN-γ分泌；采用Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组有较高IFN-γ分泌，P＜0.01，复合佐剂组的效果最佳。结果显示，氯化钠能有效刺激机体的体液免疫和细胞免疫。
实施例三：本发明使用氯化钠作为OVA佐剂的动物免疫试验
实验材料及试剂：氢氧化铝佐剂，氯化钠，OVA同实施例一；小鼠，IFN-γ的ELISA试剂盒，淋巴细胞分离液，70μm尼龙网过滤器，圆底24，96孔板同实施例二；小鼠淋巴癌细胞EG.7(美国ATCC)；Na2 51CrO4(美国PerkinElmer公司)。
(一)本发明新型佐剂对小鼠移植瘤生长的预防及治疗性实验
预防性实验：C57小鼠随机分为4组：1、Control 2、OVA 3、OVA/Al(OH)3 4、OVA/Al(OH)3/3.6％NaCl；其中所有分组中OVA为5μg，Al(OH)3为125μg，OVA和Al(OH)3的重量配比1:25。每组10只,分别在第0，2，3周在各组小鼠的左背侧皮下注射疫苗。在最后一次免疫后第7天，在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋巴瘤细胞3×106/只，建立小鼠移植瘤模型，每3天测量一次小鼠的肿瘤体积。
治疗性实验：小鼠按如上随机分为4组，在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋巴瘤细胞3×106/只，待肿瘤长至可触及时(约3mm，接种后3～5天)，小鼠开始按上述预防性实验的4组分组剂量设计进行皮下免疫治疗，每周1次，连续治疗3次，每3天测量一次小鼠的肿瘤体积。
预防性和治疗性实验结果分别见图3和图4，与对照组(Control，OVA)和单独Al(OH)3佐剂疫苗组相比，Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组的肿瘤生长明显得到抑制。其中预防性实验中，其生存期得到明显延长(图5)，成瘤率明显降低(图6)。
(二)抗体滴度的测定
实验方法及分组同实施例二，如下1、Control；2、OVA；3、OVA/Al(OH)3；4、OVA/Al(OH)3/1.8％NaCl；5、OVA/Al(OH)3/3.6％NaCl；6、OVA/Al(OH)3/7.2％NaCl。其中所有分组中OVA为5μg，Al(OH)3为125μg，OVA和Al(OH)3的重量配比1:25。每组5只，小鼠最后一次免疫后第7天收集血清，通过ELISA检测各组小鼠血清中的抗体滴度。血清样品用5％脱脂奶粉做等二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图7。单独OVA组几乎不能产生抗体。单独使用Al(OH)3组和Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组均能有效刺激抗体的产生。而Al(OH)3+氯化钠复合佐剂相比于单独使用Al(OH)3组能产生更高的抗体滴度，并且在氯化钠质量分数为3.6％时达到最高值。
(三)细胞因子IFN-γ的测定
IFN-γ的测定采用自包被ELISA试剂盒(eBioscience公司)进行。具体如下：小鼠末次免疫后一周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基(1640+10％FBS+双抗生素)混悬，用小鼠淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至5×106细胞/ml。24孔板中每孔加入500μl细胞液，再加入5μg OVA257～264肽段刺激，置于CO2孵箱培养48小时，用ELISA检测试剂盒测定培养上清IFN-γ的浓度。
实验结果见图8，单独OVA基本没有IFN-γ的分泌；加入Al(OH)3佐剂后有极少量IFN-γ分泌；采用Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组有较高IFN-γ分泌，P＜0.01，复合佐剂组的效果最佳。结果显示，氯化钠能有效刺激机体的细胞免疫。
(四)新型佐剂疫苗刺激肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能
细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能检测采用51Cr释放试验检测。
小鼠免疫同预防性模型中所述，最后一次免疫后7天每组随机取3只小鼠。无菌条件下解剖小鼠，分离脾脏，使用70μm尼龙网过滤器碾磨分散脾脏细胞，加入淋巴细胞分离液分离制备单个脾脏淋巴细胞。将分离的脾脏淋巴细胞用培养基清洗3遍，离心后重悬，细胞计数，调整细胞浓度至1×107/ml,获得的淋巴细胞即为效应细胞。
收集体外培养的肿瘤细胞E.G7，细胞计数，用培养基将肿瘤细胞的浓度调整至1×107/ml，取200μl细胞，加入100μci Na2 51CrO4，37℃孵育2h进行标记，清洗3次后，细胞计数，将细胞浓度调整至0.5×105/ml，获得的51Cr标记的肿瘤细胞即为靶细胞。将靶细胞悬液加入圆底96孔板中，每孔100μl，设3个副孔，按照表1的不同比例加入效应细胞：
表1
每孔加入100μl的51Cr标记的肿瘤细胞，自然释放组加入100μl培养基，最大释放组加入100μl 1％Triton X-100。96孔板水平砖头1500rpm/min离心30s，37℃，5％CO2孵箱中培养，4～6小时后，96孔板水平砖头1500rpm/min离心5min，每孔吸取100μl上清，Backmen550B型γ计数仪检测cpm值。
CTL杀伤率计算公式为：杀伤率％＝〔(实验组cpm-自然释放组cpm)/(对照组cpm-自然释放组cpm)〕×100％。
实验结果显示(参见图9)，Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组(OVA/Al/3.6％NaCl)能有效地诱导的针对肿瘤细胞的特异性CTL反应，并且作用明显优于对照组(Control,OVA)和单独Al(OH)3佐剂组(OVA/Al)。
(五)新型佐剂疫苗免疫诱导的小鼠T淋巴细胞过继治疗移植瘤
小鼠右后方注射EG.7细胞3×106/只，建立小鼠移植瘤模型，随机分为4组，每组5只。在建立小鼠移植瘤模型前一天，后一天和后3天，经尾静脉注射预防性实验中所述获取的脾脏淋巴细胞，107细胞/只，共注射3次，每3天观察小鼠肿瘤体积的变化。
实验结果显示见图10，同对照组(Control,OVA)相比，单独Al(OH)3佐剂组(OVA/Al)几乎没有抗肿瘤作用，而Al(OH)3+氯化钠复合佐剂组(OVA/Al/3.6％NaCl)具有显著的抗肿瘤作用。
由上试验可见，本发明开发的氢氧化铝-氯化钠-抗原体系，使用了超出生理浓度的适量氯化钠，和单独的氢氧化铝佐剂相比引起了特异性的细胞免疫反应，免疫活性更强。同时，也具有高的临床安全性，且成本低廉，容易配制，具有很好的应用前景。
Claims (22)
1.复合免疫佐剂，其特征在于：含有氢氧化铝凝胶和氯化钠；所述氯化钠的最终质量分数为2.7％～4.5％。
2.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述氯化钠的最终质量分数为3.6％。
3.根据权利要求1或2所述的复合免疫佐剂，其特征在于：所述氢氧化铝凝胶的粒径范围为1μm～10μm。
4.免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：含有抗原和权利要求1～3中任一项权利要求所述的复合免疫佐剂。
5.根据权利要求4所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：所述抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝凝胶的重量配比为1:1～100。
6.根据权利要求5所述免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：所述抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝凝胶的重量配比为1:5～50。
7.根据权利要求4～6中任一项权利要求所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于：所述抗原为肿瘤抗原或肝炎抗原。
8.制备权利要求4～7中任一项权利要求所述的免疫佐剂-抗原复合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取所需抗原用水稀释或溶解；
b、加入所需的氯化钠，混匀；
c、加入所需量的氢氧化铝凝胶，混匀，即得。
9.权利要求1～3中任一项权利要求所述的复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。
10.氯化钠在制备免疫佐剂中的用途；所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为高于生理水平；所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为使其制备得到的免疫佐剂与抗原的复合物中的氯化钠质量分数为2.7％～4.5％。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为使其制备得到的免疫佐剂与抗原的复合物中的氯化钠质量分数为3.6％。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其特征在于：所述免疫佐剂中还有氢氧化铝凝胶。
13.氯化钠在制备免疫佐剂-抗原复合物中的用途；所述氯化钠的含量为使其在制备得到免疫佐剂-抗原复合物中质量分数为2.7％～4.5％。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述氯化钠的含量为使其在制备得到免疫佐剂-抗原复合物中质量分数为3.6％。
15.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述抗原为肿瘤抗原或肝炎抗原。
16.根据权利要求13～15中任一项权利要求所述的用途，其特征在于：所述免疫佐剂-抗原复合物中还含有氢氧化铝凝胶作为佐剂。
17. 根据权利要求16所述的用途，其特征在于：所述抗原与氢氧化铝凝胶的重量配比为1:1～ 100。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于：所述抗原与氢氧化铝凝胶的重量配比为1:5～50。
19.疫苗的配制方法，其特征在于：在疫苗使用前，加入氯化钠和适量注射用水，并使氯化钠的质量分数达到2.7％～4.5％。
20.根据权利要求19所述的疫苗的配制方法，其特征在于：配得的疫苗中所述氯化钠的质量分数为3.6％。
21.根据权利要求20所述的疫苗的配制方法，其特征在于：所述疫苗中含有抗原和氢氧化铝凝胶，或者在配制时疫苗中加入氢氧化铝凝胶作为佐剂。
22.根据权利要求21所述的疫苗的配制方法，其特征在于：所述疫苗中抗原与氢氧化铝凝胶的重量配比为1:1～100。
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