KR100585456B1 - 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포, 이의 제조방법및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동종 종양-관련 항원 (allogeneic tumor-associated antigen, TAA)이 탑재된 암 치료용 수지상세포 (dendritic cell), 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 사람의 말초혈액에서 얻은 단핵구로부터 CD14⁺ 단구 (monocyte)를 분리하는 단계; GM-CSF 및 IL-4로 미성숙 수지상세포를 배양하는 단계; 미성숙 수지상세포에 종양-관련 항원을 탑재하고 성숙유도인자로 TNF-α 및 CD40L을 첨가하여 성숙한 수지상세포롤 분화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 성숙한 수지상세포, 이의 제조방법 및 상기 수지상세포를 유효성분으로 포함하고 종양 특이적인 면역반응을 증강시켜 항암 면역 치료효과를 갖는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 수지상세포 백신은 강력한 종양 특이적인 세포성 면역반응을 유도할 수 있고 자가 종양조직 대신 동종 종양-관련 항원을 이용함으로써 보다 안전하고 부작용이 없는 항암 치료용 백신으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물{DENDRITIC CELL PULSING ALLOGENEIC TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN, METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF AND VACCINE COMPOSITION CONTAINING SAME FOR TREATING CANCER}

도 1은 본 발명에 따라 제조된 수지상세포 백신을 이용하여 암을 치료하는 과정을 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명에 따라 성숙한 수지상세포를 제조하는 과정의 일례를 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에 따라 말초혈액 단핵구로부터 CD14⁺ 단구를 분리하는 과정을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명에 따라 분리한 CD14⁺ 단구 (A)와 배양을 통해 분화시킨 성숙한 수지상세포 (B)의 현미경 사진을 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명에 따라 성숙·분화시킨 수지상세포의 T 림프구 증식 유도 효과를 나타낸 것이고,

도 6a는 본 발명에서 성숙유도인자의 종류에 따른 수지상세포의 표면항원 발 현양상을 유세포 형광분석기로 분석한 결과이고,

도 6b는 본 발명에서 동종 종양-관련 항원으로 탑재한 세포주의 종류에 따른 수지상세포의 표면항원 발현양상을 유세포 형광분석기로 분석한 결과이고,

도 7a는 본 발명에서 성숙유도인자의 종류에 따른 수지상세포 백신의 안정성을 측정한 결과이고,

도 7b는 본 발명에 따라 제조된 성숙한 수지상세포 백신의 시간 경과에 따른 표면항원 발현양상을 유세포 형광분석기로 분석한 결과이고,

도 8a 내지 8c는 본 발명의 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포가 종양 특이적인 세포독성을 유도하는지 여부를 분석한 결과로, 8a, 8b 및 8c는 각각 SN12C, A498 및 SNU-348 세포주의 용해물을 종양-관련 항원으로 탑재한 수지상세포에 의해 활성화된 T 림프구에 의한 종양 특이적 세포독성을 나타낸 것이고,

도 9는 전이성 B16F10 흑색종 모델에서 본 발명의 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포 백신의 면역 치료효과를 H&E 염색으로 분석한 결과이다.

A: 대조군, B: UDC 처리군,

C: B16F10-DC 처리군, D: K1735-DC 처리군,

E: 클론 M3-DC 처리군, F: 천연 폐조직

본 발명은 성숙 수지상세포에 종양-관련 항원으로서 동종 종양세포주 용해물을 탑재하여 제조한 수지상세포, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

전이암 또는 진행성암은 수술, 방사선치료 및 화학요법과 같은 기존의 일반적인 암 치료법으로는 적절한 치료효과를 거두지 못하는 경우가 많은데, 특히 전이성 또는 진행성 신세포암과 악성 흑색종의 경우는 기존의 치료법으로는 효과가 없다. 지금까지 시행된 치료방법에는 전신화학요법, 인터페론 (Interferon, IFN) 또는 인터루킨-2 (Interleukin-2, IL-2)를 투여한 면역요법, IL-2와 다른 면역치료제 및 항암제의 병용 면역요법 등 다양하다. 그러나, 신세포암은 전신화학요법에 강한 저항성을 나타내고 단일 약제에 의한 화학요법이나 여러 약제의 병용요법에도 20% 이하의 낮은 반응률과 매우 짧은 반응기간을 보이는 것으로 알려져 있기 때문에 전이 신세포암에 화학제제만을 이용한 일차적인 치료는 더 이상 고려되지 않고 있다.

이러한 신세포암의 치료를 위하여 환자로부터 수지상세포의 전구세포를 얻어 수지상세포로 분화시킨 뒤 종양-관련 항원 (tumor-associated antigen, TAA)으로 감작시킨 후 다시 환자에게 투여하는 신세포암의 면역치료가 연구되었다. 이러한 연구를 통해 수지상세포에 암특이 항원을 감작시키고 이를 이용하여 T 림프구를 활성화시키면 강력한 암특이적 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes, CTL)가 유도되어 암세포를 파괴함으로써 암을 면역학적으로 치료할 수 있음을 확인하였다. 수지상세포는 항원을 인지·섭취하는 주조직적합 복합체 (major histocompatibility complex, MHC)와 결합체를 이루어 T 림프구에 항원을 제시할 수 있고, 수지상세포에서 풍부하게 발현되는 공동자극물질이 T 림프구 수용체와 항원-MHC 결합체간의 반응에 중요한 역할을 담당하며, T 림프구의 분화와 성장 또는 유입에 관련된 여러 싸이토카인을 분비하여 면역반응의 활성을 조절할 수 있기 때문에 항암 면역치료에 유용하게 이용될 수 있다. 이러한 수지상세포의 기능은 세포의 분화정도인 성숙도에 따라 달라지는데, 성숙된 수지상세포는 세포표면에 MHC class I 및 class II 분자와 CD80 및 86와 같은 공동자극분자의 표현형의 증가로 항원제시능력이 향상되어 강력한 항원제시세포로서 작용할 수 있으며, INF-γ 및 IL-12와 같은 싸이토카인의 분비로 면역기능 활성의 중심 역할을 할 수 있다. 따라서, 수지상세포의 성숙도는 실질적으로 수지상세포를 질병의 치료에 이용하고자 할 때 가장 효과적인 치료 결과를 얻기 위해 반드시 고려하여야 할 사항이다 (Jonuleit et al., J immumol. 158(6): 2610-15, 1997, Kalinski et al., Immunol. today, 20(12): 561-67, 1999, Sallusto et al., J. Exp. Med. 182(2): 389-400, 1995).

수지상세포를 이용한 최초의 항암 면역치료에서는 환자에게 종양-관련 항원의 재료로 자가 이디오타입 단백질 (autologous idiotype protein)을 미성숙 수지상세포에 탑재하여 사용하였다 (Hsu Fj et al., Nat. Med. 2: 52-58, 1996). 종양 특이적인 면역반응을 유도하기 위해서는 수지상세포에 다양한 방법으로 종양-관련 항원을 전달하여야 하는데, 이를 위해 종양-관련 항원의 합성 펩타이드를 사용하는 방법과 자가 종양세포 용해물이나 고사체 등과 같은 종양세포의 항원 결합체를 사용하는 방법이 주로 이용되고 있다. 그러나, 합성 펩타이드는 그 친화도가 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen, HLA) 분자의 특정 아형에만 국한되어 모든 환자들을 대상으로 할 수 없으며 밝혀진 종양-관련 항원도 적어서 사용에 제한적이다. 반대로 자가 종양세포 용해물을 사용한다면 이러한 제한점을 극복할 수는 있지만, 암환자로부터 필요시 충분한 자가 종양조직을 얻기 어렵고 자가조직을 사용하여 면역기능을 강화하기 때문에 자가항원이 다량 함유되어 있어 자가면역질환을 유발할 잠재적 가능성이 있다.

이에, 본 발명자들은 자가 종양조직을 사용하는 기존 수지상세포 백신의 문제점을 해결하기 위하여 공통의 종양-관련 항원을 발현하는 확립된 동종 종양세포주를 항원의 재료로 사용하여 안전하고 부작용이 없으면서 종양 특이적인 면역반응을 증강시켜 난치성 암질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 수지상세포 백신을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 안전하고 부작용이 없으면서 종양 특이적인 면역반응을 증강시켜 전이성 신세포암 또는 악성 흑색종 등의 난치성 암질환을 효과적으로 치료할 수 있는 세포치료제로서의 수지상세포 백신을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 동종 종양-관련 항원으로 종양세포주-유래 용해물을 탑재한 수지상세포 및 그의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 수지상세포를 유효성분으로 하고 종양-특이적인 면역반응을 증강시킴으로써 전이성 신세포암 또는 악성 흑색종과 같은 난치성 암질환을 치료할 수 있는 백신 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서, "탑재 (loading 또는 pulsing)"란 수지상세포와 같은 항원제시세포 (antigen presenting cell, APC)가 항원을 포획하여 분해한 후 이를 MHC 분자에 실어 표면에 표출하는 것으로써, 이와 같이 항원이 탑재된 세포는 강력한 항원 특이적인 T 림프구의 활성을 유도한다.

본 발명은 동종 종양-관련 항원으로 종양세포주-유래 용해물을 탑재한 수지상세포 및 그의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 수지상세포는

1) 사람의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계;

2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD14⁺ 단구를 분리하는 단계;

3) 분리된 CD14⁺ 단구에 GM-CSF 및 IL-4를 첨가한 후 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계;

4) 미성숙 수지상세포에 종양-관련 항원을 탑재하고 성숙유도인자로 종양 사 멸인자-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 및 CD40 리간드 (CD40 ligand, CD40L)를 첨가하여 성숙한 수지상세포로 분화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다 (도 2 참조).

상기 단계들을 보다 자세히 설명하면, 단계 1)에서는 건강한 공여자 또는 암환자의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계로 인체로부터 체취한 혈액을 이용하거나 혈액분반술 (apheresis)을 이용하여 단핵구 농축액을 얻은 후 밀도구배 (density-gradient) 원심분리를 이용하여 단핵구만을 분리하며, 분리된 단핵구는 이후의 수지상세포 배양에 사용하기 전까지 냉동저장하여 보관하는 것이 바람직하다.

단계 2)는 단계 1)에서 분리된 말초혈액 단핵구로부터 수지상세포 배양을 위한 CD14⁺ 단구 (monocyte)를 분리하는 단계로, 단핵구 중 CD14⁺ 단구만을 분리하기 위해 CD14⁺ 자석입자를 이용한다. 먼저 말초혈액 단핵구를 CD14⁺ 자석입자 용액과 혼합하여 15내지 20분간 3 내지 6℃, 암소에서 반응시킨 다음 적당량의 완충액을 첨가하고 원심분리하여 세포에 붙지 않고 남은 자석입자를 완전히 제거한다. 이를 다시 동일한 완충액에 잘 혼합한 후 자성 분리대에 고정된 분리 컬럼, 바람직하게는 LS 또는 MS 컬럼을 통과시켜 자성으로 표지되지 않은 세포들, 즉 CD14^- 세포를 제거한다. 이들 컬럼들은 분리할 수 있는 용량 (즉, 세포수)에 따라서 달라지는 데, LS-컬럼은 1×10⁹ 세포, MS-컬럼은 1×10⁸ 세포를 분리할 수 있다. 통과가 끝나면 다시 동일한 완충액을 컬럼에 흘려주어 세척하고, 컬럼에 부착된 세포들을 선택적으로 수거하기 위하여 컬럼을 자성 분리대로부터 분리한다. 그리고 나서, 상기 컬럼에 자성에 의해 흡착되어 있는 세포들을 원심분리 용기에 수거한 후 이를 원심분리하여 CD14⁺ 단구를 분리·수득한다 (도 3 참조).

단계 3)은 분리된 CD14⁺ 단구에 GM-CSF 및 IL-4를 첨가한 후 배양하여 미성숙 수지상세포를 분화시키는 단계로, 바람직하게는 무혈청 림프구 배지 (serum free lymphocyte medium)인 AIM-V 배지를 기본배지로 사용하고 여기에 10% FBS와 1% 항생제, 바람직하게는 페니실린-스트렙토마이신, 그리고 500 내지 1,500 U/㎖ IL-4와 500 내지 1,500 U/㎖ GM-CSF를 첨가한 배지에 CD14⁺ 단구를 접종한 후 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 6일간 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시킨다.

단계 4)는 상기와 같이 분화된 미성숙 수지상세포에 종양-관련 항원을 탑재하고 성숙유도인자로 TNF-α 및 CD40L을 첨가하여 성숙한 수지상세포로 분화시키는 단계이다. 상기에서 종양-관련 항원은 동종 종양세포주의 용해물을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 신세포암 세포주 SN12C, A498, Caki-2, SNU-349 또는 SNU-482 등의 종양세포주 배양액에 트립신을 처리한 후 배양액이 들어있는 튜브를 액체질소에서 냉동시켰다가 37℃ 수조에 넣어 녹인 후 잘 흔들어 재부유시키는 일련의 과정을 수회, 바람직하게는 5 내지 9분 간격으로 5 내지 7회 반복하고, 이를 원심분리한 다음 상층액만을 분리하고 3,000 내지 5,000 rad로 방사선을 조사하여 세포 용해물을 얻는다. 단계 3)의 10% FBS, 1% 항생제, 바람직하게는 페니실린-스트렙토마이신, GM-CSF 및 IL-4 이 첨가된 AIM-V 배지에 50 내지 150 ㎍/㎖ 농도의 종양세포주-유래 용해물을 혼합하여 배양중인 미성숙 수지상세포에 첨가하고 5% CO₂ 및 가습 조건의 16 내지 24시간 동안, 바람직하게는 37℃ 배양기에서 18시간 (overnight) 동안 배양하여 탐식작용을 유도함으로써 수지상세포에 종양-관련 항원을 탑재한다.

단계 4)의 AIM-V 배지에 성숙유도인자로 50 내지 150 U/㎖의 TNF-α와 1 내지 3 ㎍/㎖의 CD40L을 첨가한 후 상기 배지에 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포를 재부유시키고, 웰 플레이트에 분주하여 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃에서 24 내지 30시간 동안, 바람직하게는 37℃ 배양기에서 30시간 동안 배양한 후 원심분리하여 성숙한 수지상세포를 분리한다.

상기와 같이 제조된 성숙한 수지상세포의 T 림프구 증식유도 효과를 조사한 결과, 본 발명의 수지상세포는 자가 및 동종 T 림프구에 대해서 자극량에 비례하여 증식반응을 유도하였다 (도 5 참조). 유세포 형광분석기를 이용하여 본 발명의 수지상세포의 표면항원 발현양상을 조사한 결과, 상기 수지상세포는 T 림프구와 단핵구의 대표적인 표지항원인 CD3과 CD14는 발현하지 않았는데, 이는 본 발명의 수지상세포 제조방법에 따라 분리·배양한 세포가 임파구 또는 단핵구가 아니라는 것을 입증하는 것이다 (도 6a 참조). 또한, 미성숙 수지상세포의 배양시 성숙유도인자로 TNF-α와 CD40L 두 가지 모두를 첨가하면 공동자극분자의 표현형이 증가되어 성숙한 수지상세포의 항원제시능력이 향상됨으로써 이들이 강력한 항원제시세포로 작용할 수 있음을 확인하였다.

탑재한 종양-관련 항원의 종류에 따른 수지상세포의 성숙도 차이를 조사한 결과, 수지상세포에 탑재한 동종 종양세포주-유래 항원의 종류에 따라 CD83과 공동자극물질인 CD80, CD86의 발현정도가 다르게 나타났는데, 이는 종양세포주-유래 항원이 수지상세포의 성숙도에 영향을 미치는 또 다른 한가지 요소임을 시사하는 것이다 (도 6b 참조).

본 발명에 따라 제조된 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포의 안정성을 확인한 결과, 실험군 모두에서 144시간까지 80% 이상의 높은 생존율을 보였고 (도 7a 참조), 냉장상태에서 최소 72시간까지는 성숙한 수지상세포의 표현형이 안정적으로 유지됨을 확인하였다 (도 7b 참조).

본 발명의 수지상세포가 T 림프구에 항원을 제시하여 항원 특이적인 세포독성을 유도할 수 있는지를 조사한 결과, 임상적으로 암 환자 치료에 사용할 동종 종양세포주-유래 항원을 탑재한 수지상세포 백신을 제조하기 위해서는 면역원성 (immunogenicity)이 높은 종양세포주의 선별과정이 선행되어야 하며 이러한 종양세포주로 신세포주암 세포주 SN12C와 A498이 유용함을 확인하였다.

본 발명에 따른 수지상세포 백신의 항종양 치료를 위한 생체내 유용성을 흑색종 세포주를 대상으로 평가한 결과, 자가 항원을 탑재한 수지상세포 백신보다 본 발명에서와 같이 동종 종양세포주-유래 항원을 탑재한 수지상세포 백신으로 치료한 실험군들에서 폐 전이의 진행이 확연하게 지연되었고 종양의 크기도 유의한 차이를 보였으며 (표 2 참조), H&E 염색에서도 정상조직에 가까운 소견을 나타내었다 (도 9 참조).

상기 결과들로부터, 본 발명에 따른 수지상세포 백신은 수지상세포에 탑재할 종양-관련 항원으로 자가 종양조직 대신 동종 종양조직을 사용하기 때문에 자가 종양조직의 사용으로 인해 야기되는 안전성이나 부작용 유발과 같은 문제점들을 극복할 수 있을 뿐만 아니라 합성 펩타이드의 인간 백혈구 항원 (HLA)과의 국한된 친화도로 일부 환자에게만 사용할 수밖에 없었던 단점을 해결할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 수지상세포 백신은 인체 투여시 강력한 종양 특이적인 세포독성 면역반응을 유도할 수 있어 전이성 신세포암 또는 악성 흑색종 등의 난치성 암의 면역치료용 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에 따라 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포를 유효성분으로 하는 암 치료용 백신 조성물은 비경구적으로, 예를 들어 피하, 근육내, 경피 (transdermal/transcutaneous) 주사로 간편하게 투여될 수 있다. 투여 요법은 단일 투여 또는 다중 투여 스케쥴일 수 있다. 백신 조성물은 기타 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.

이들 백신 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 본 발명의 수지상세포를 포함하는데, 이러한 담체는 그 자체로 조성물을 투여받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체인 것이 바람직하다. 적합한 담체는 통상적으로 크고 느리게 대사화되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 (예를 들어, 오일 소적 또는 리포좀) 및 불활성 바이러스 입자를 포함한다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 수지상세포 자체의 면역보강제 효과이외에 면역자극제 또는 면역보강제로서 작용할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 또한 조성물의 유효성을 증강시키는 추가의 면역보강제를 포함할 수 있다. 적합한 면역보강제는 (1) 알루미늄염 (명반), 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; (2) 수중유 에멀젼 제제 (뮤라밀 펩티드 또는 세균 세포벽 성분과 같은 특정 면역자극제를 함유하거나 함유하지 않음), 예를 들어 (a) 마이크론 이하의 입자로 제제화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% 스팬 85 (필수적이지는 않지만, 선택적으로 다양한 양의 N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1',2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE)을 함유함)를 포함하는 MF59 (WO90/14837), (b) 마이크론 이하의 입자로 마이크로유체화되거나 큰 입자 크기의 에멀젼을 생성하도록 진탕된, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-블록화 중합체 및 N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP)을 포함하는 SAF, 및 (c) 모노포스포릴리피드 A (MPL), 트레할로오스 디마이콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격(CWS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균 세포벽 성분, 2% 스쿠알렌, 및 0.2% 트윈 80을 포함하는 Ribi^TM 면역보강제 시스템 (RAS); (3) 사포닌 면역보강제; (4) 프로인트의 완전 면역보강제 (CFA) 및 불완전 면역보강제 (IFA); (5) 사이토킨, 예를 들어 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF) 등; (6) 세균의 ADP-리보실화 독소, 예를 들어 콜레라 독소 (CT), 백일해 독소 (PT), 또는 대장균 (E. coli)의 열에 불안정한 독소 (LT), 특히 LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129의 탈독소화된 돌연변이체 (WO93/13302 및 WO92/19265); 및 (7) 조성물의 유효성을 증강시키는 면역자극제로서 작용하는 기타 물질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

전술한 바와 같이, 적합한 뮤라밀 펩티드는 thr-MDP, N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), MTP-PE 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

백신 조성물은 통상적으로 희석제, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤, 에탄올 등을 포함할 수 있으며, 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, pH 완충제 등이 조성물 중에 존재할 수 있다.

주사용으로 적합한 형태는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 수성용액 (수용성) 또는 분산액 및 멸균분말을 포함한다. 이들은 제조 조건하에서 안정해야 하고, 세균 또는 진균과 같은 미생물의 오염에 대항하여 보존되어야 한다. 미생물의 오염은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 예방할 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성 물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 사용함으로써 가능할 수 있다.

전술한 용매 중에 필요량의 수지상세포와 앞에서 열거한 다양한 기타 성분을 결합시키고, 필요에 따라 수지상세포 및/또는 열에 민감한 면역보강제 싸이토카인 등을 제외한 나머지 성분들, 예를 들면 PBS와 같은 완충용액을 여과 멸균함으로써 멸균 주사용액을 제조한다. 일반적으로, 기본적인 분산배지 및 전술한 것으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균화 활성성분을 포함시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사용액의 제조용 멸균분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조 기법이다. 이러한 기법에 의해 활성성분, 및 전술한 이의 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 목적하는 성분의 분말을 얻는다.

본 발명의 작용을 어떤 식으로든 제한하지 않으면서, 본 발명에 따라 수지상세포를 전달하는 것은 면역반응을 유도하는데, 특히 항원에 대한 세포독성 T-림프구의 반응을 유도하는데 특히 유용하다. 상기 면역반응은 특이적 (T 세포 및/또는 B 세포) 및/또는 비특이적 면역반응일 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 인간, 특히 암환자에서 항원에 대한 면역반응을 일으키거나, 유도하거나, 또는 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 전술한 바와 같은 백신 조성물 또는 수지상세포 유효량을 암환자에 투여하는 것을 포함한다.

상기 면역반응은 세포독성 T-림프구 반응을 포함하는 것이 바람직하며, 본 발명의 세포독성 림프구 반응은 헬퍼 T 세포반응, 체액성 반응 또는 기타 특이적이 거나 비특이적인 면역반응과 함께 또는 독립적으로 일어날 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 질병 상태의 치료 및/또는 예방에 관련하여 본 발명의 수지상세포를 사용하는 것에 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 예로는 전이성 신세포암 또는 악성 흑생종과 같은 난치성 암질환을 포함한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 수지상세포 백신을 이용하여 종양-특이적인 면역반응을 증강시킴으로써 전이성 신세포암 또는 악성 흑색종과 같은 난치성 암질환을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 조성물의 투여는, 질병 상태의 발병 또는 진행을 저해하거나, 중지시키거나, 지연시키거나, 예방하는 면역반응을 일으키거나, 유도하거나 또 다르게는 촉진한다.

조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사에 의해 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내로 이루어지거나, 또는 조직의 간극으로 전달된다. 조성물은 또한 병변으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 단일 용량 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다.

'유효량'은 목적하는 면역반응을 적어도 부분적으로 달성하거나 또는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미한다. 이 양은 치료되어야 할 개체의 건강과 물리적 상태, 치료되어야할 개체의 분류적 군, 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 백신 제제, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 인자에 따라 달라진다. 이 양은 통상적인 시도를 통해 측정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것으로 예상되며, 예를 들어 신장암 질환의 치료를 위해서 성인 60 ㎏을 기준으로 1회 투여당 2 ×10⁶ 내지 2×10⁷ 세포/주사의 양으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포 백신의 제조

<1-1> 단핵구의 채집과 저장

단핵구는 밀도구배 (density-gradient) 원심분리 또는 혈액분반술 (apheresis)을 이용하여 정상으로부터 채집하여 분리하였다. 구체적으로, 정상인으로부터 혈액 100 ㎖을 헤파린 튜브에 채취한 후 동량의 생리식염수로 희석시켰다. 이를 25℃, 800 g로 20분간 밀도구배 원심분리하여 중간층에 모이는 세포층을 수획하여 단핵구를 분리하였다. 세포 백신으로 사용하기에 충분한 양의 단핵구를 채집하기 위하여 상기 과정을 수 차례 반복하였다.

다른 방법으로, 정상인을 대상으로 세포 분리기 (Fenwal CS 300^TM Plus cell separator; Baxter, Toronto, Canada)를 이용하여 혈액분반술을 시행하여 단핵구 (mononuclear cell) 농축액을 채집하였다. 소량 채집 챔버 (Small volume collection chamber; SVCC, Baxter, Toronto, Canada)와 GRANULO 분리 챔버 (separation chamber)를 컨테이너 홀더 (Container holder)로 사용하고, 개방 시스 템 혈장교환 키트 (open system apheresis kit)를 설치하였다. 여기에 생리식염수 450 ㎖과 항응고제로 항응고제-시트레이트-덱스트로스 제형 A (anticoagulant-citrate-dextrose formula A; ACD-A) 용액 100 ㎖을 상기의 세트 (set)에 약 15분간 흘려주어 세트 내의 공기를 제거하는 준비과정 (priming)을 거친 후 혈액 공여자의 양팔 정맥을 각각 주입구와 반환구로 확보하여 50∼60 ㎖/분의 유속으로 3∼4 ℓ 가량 처리하였다. 혈액분반술을 통해 모은 단핵구 농축액을 동량의 생리식염수로 희석시킨 후 림포프렙 (Lymphoprep; Axis-shield, Oslo, Norway)에 조심스럽게 중첩하였다. 이를 25℃, 800 g로 20분간 밀도구배 원심분리하여 중간층에 모이는 세포층을 수획하여 단핵구를 분리하였다. 이렇게 수획한 단핵구는 수지상세포 배양에 사용되기 전까지 RPMI 1640 배지에 10% FBS를 첨가한 R10 배지 (GibcoBRL, NY, US)로 1회, 혈청 성분이 포함되지 않은 RPMI 1640 배지로 2회 세척한 후 DMSO와 FBS가 첨가된 냉동 저장 배지 (GibcoBRL) 1 ㎖당 단핵구 1.0×10⁸ 세포씩 부유시켜 -196℃ 질소탱크에 보관하였다 (도 2).

<1-2> 수지상세포 배양을 위한 CD14 ⁺ 단구 (monocyte)의 분리

상기 실시예 <1-1>에서 분리· 저장된 단핵구를 37℃에서 신속하게 해동시킨 후 R10 배지로 세척하여 세포의 손상을 줄이고, 다시 MACS 완충액 (0.5% BSA 및 2 mM EDTA가 첨가된 pH 7.2의 PBS 완충액) 10 ㎖로 세척하였다. 단핵구 중 CD14⁺ 단 구만을 분리하기 위해 단핵구 1.0×10⁸ 세포당 200 ㎕의 CD14⁺ 자석입자 용액 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)과 800 ㎕ MACS 완충액을 혼합하여 15분간 6℃, 암소에서 반응시킨 다음 반응 총 부피에 대해 약 10배의 MACS 완충액을 넣고 300 g에서 10분 동안 원심분리하여 세포에 붙지 않고 남은 자석입자를 완전히 제거하였다. 이를 다시 MACS 완충액 3 ㎖에 잘 혼합하여 재부유시킨 후 자성 분리대인 VarioMACS (Miltenyi Biotech)에 고정된 LS-MACS^TM (Miltenyi Biotech) 분리 컬럼에 통과시켜 자성으로 표지되지 않은 CD14^- 세포들을 제거하였다. 통과가 끝나면 다시 MACS 완충액을 3 ㎖씩 3회 컬럼에 흘려주어 세척하고, 컬럼에 부착된 세포들을 선택적으로 수거하기 위하여 컬럼을 자성 분리대로부터 분리하였다. 그리고 나서, 상기 컬럼을 15 ㎖ 원심분리 용기 위에 올려놓고 5 ㎖ MACS 용액을 첨가한 후 주사기 밀대로 살짝 압력을 가하여 LS 컬럼에 자성에 의해 흡착되어 있는 세포들을 원심분리 용기에 수거한 후 원심분리하여 CD14⁺ 단구를 분리·수득하였다 (도 3). 이와 같이 분리된 CD14⁺ 단구의 분리 순도를 유세포 형광분석기 (EPICS^Ｒ XL flow cytometer; Beckman Coulter, Maseille, France)로 확인한 결과, 85∼95%의 높은 순도를 보였다.

<1-3> 동종 종양세포주 용해물의 제조

신세포암 세포주 SN12C (KCLB 80025), A498 (KCLB 30044), Caki-2 (KCLB 30047)는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 입수하였고, SNU-349와 SNU-482는 서울의대 박재갑 교수로부터 제공받았다 (Shin, K. H. et al., BJU Int. 85(1):130-8, 2000). 상기 신세포암 세포주들은 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지 (R10 배지)로 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 계대배양하였다.

상기 세포주들은 모두 배양용 플라스크 바닥에 붙어서 자라는 부착형 (adherent type)이기 때문에 이들을 수거하기 위해서는 먼저 플라스크 바닥에서 떼어내야 한다. 이를 위해 배양한 신세포암 세포주들에 트립신-EDTA (GibcoBRL, NY, USA)을 처리하여 75 ㎠ 배양용 플라스크 (Corning and Costar, NY, USA)에서 수확한 후, RPMI 1640 배지로 2회 세척하고 세포수를 대략 1×10⁷ 세포/㎖ 농도로 맞추어 무혈청의 PBS 완충용액에 재부유시켰다. 세포 부유액이 들어있는 튜브를 액체질소에서 냉동시켰다가 37℃ 수조에 넣어 녹인 후 잘 흔들어 재부유시키는 일련의 과정을 7분 간격으로 5회 반복하였다.

상기 부유액을 1,500 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액만을 분리한 후 5,000 rad로 방사선을 조사하였다. 이렇게 얻은 세포 용해물의 단백질 양을 브래드포드 단백질 정량방법 (Bio-Rad Laboratiories, CA, USA)으로 측정한 후 -80℃에 냉동보관하였다.

<1-4> 수지상세포 배양 및 종양-관련 항원의 탑재

상기 실시예 <1-2>에서 분리된 CD14⁺ 단구를 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin; GibcoBRL, NY, USA), 1,000 U/㎖ IL-4 (Pharmingen, California, USA), 1,000 U/㎖ GM-CSF (Pharmingen, California, USA)가 첨가된 AIM-Ⅴ 배지 (GibcoBRL)에 1×10⁶ 세포/㎖이 되도록 현탁하여 6웰 플레이트 (Corning and Costar, NY, USA)의 각 웰에 3 ㎖씩 분주한 후 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양 3일째에 동일한 첨가물질이 포함된 배지를 1 ㎖씩 첨가하고 3일간 더 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시켰다. 상기 미성숙 수지상세포에 배양 6일째에 상기 실시예 <1-3>에서 준비된 SN12C 혹은 A498 세포주의 용해물 100 ㎍/㎖이 첨가된 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin; GibcoBRL, NY, USA), 1,000 U/㎖ IL-4, 1,000 U/㎖ GM-CSF AIM-V 배지 1 ㎖를 첨가하고 18시간 동안 배양하여 탐식작용을 유도함으로써 수지상세포에 종양-관련 항원을 탑재하였다 (도 2).

<1-5> CD14 ⁺ 수지상세포에 성숙유도인자 처리

상기 실시예 <1-4>에서와 같이 종양-관련 항원을 탑재한 후 배양 7일째에 플레이트의 표면에 붙어있지 않거나 살짝 달라붙어 있는 세포들을 혈청성분이 첨가되어 있지 않은 RPMI 1640 배지로 3회 세척하여 수득하였다. 이와 같이 수득한 수지상세포의 수를 세어서 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 맞춘 후 성숙유도인자인 100 U/㎖의 종양사멸인자-α (Tumor Necrosis Factor-α; TNF-α) (R&D, Minneapolise, USA)와 2 ㎍/㎖의 CD40 리간드 (CD40L) (R&D, Minneapolise, USA)를 포함하는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 (penicilllin-streptomycin) AIM-Ⅴ 배지에 재부유시켰다. 이를 24웰 플레이트 (Corning and Costar, NY, USA)의 각 웰에 1 ㎖씩 분주하여 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 30시간 동안 배양한 후 원심분리하여 성숙한 수지상세포를 분리하였다 (도 2).

<실시예 2> 성숙한 수지상세포의 T 림프구 증식유도 효과

상기 실시예 1에 따라 제조된 성숙한 수지상세포의 T 림프구 증식유도 효과를 조사하기 위하여 CD3⁺ T 림프구를 분리하였다. 수지상세포와 동일한 혈액 공여자로부터 자가 CD3⁺ T 림프구를 얻기 위하여 상기 실시예 <1-2>에서 LS 컬럼을 통해 빠져나온 CD14^- 세포로부터 CD3 자석입자 용액 (Miltenyi Biotech, Bergisch Glandbac, Germany)을 사용하여 자가 CD3⁺ T 림프구를 분리하였다. 또한, 다른 혈액 공여자로부터 동종 CD3⁺ T 림프구를 얻기 위하여, 헤파린으로 항응고 처리된 전혈 10 ㎖을 생리식염수와 동량으로 희석하여 실온의 림포프렙 (Lymphoprep, Axis-shield, Oslo, Norway)에 조심스럽게 중첩한 후 25℃, 800 g로 20분간 밀도구배 원심분리하였고, 이로부터 단핵구층을 분리하여 R10 배지로 1회, RPMI 1640 배지로 2 회 세척한 후 상기와 동일한 방법으로 CD3 자석입자 용액을 이용하여 동종 CD3⁺ T 림프구를 분리하였다.

성숙한 수지상세포와 자가 및 동종 T 림프구의 비 (stimulator : responder)가 1 : 1, 1 : 10, 1 : 100 및 1 : 1000이 되도록 T 림프구 5×10⁴ 세포/100 ㎕ 및 성숙한 수지상세포 1×10 내지 5×10⁴ 세포/100 ㎕를 각각 96웰 플레이트 (Corning and Costar, NY, USA)의 웰에 분주 (총 200 ㎕)한 후 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 4일 동안 배양하였다. 배양 5일째 1 mCi/㎖의 농도로 ³H-티미딘 (thymidine)을 첨가하여 다시 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 16시간 동안 배양한 후 T 림프구의 증식능을 혼합 림프구 반응 (Mixed lyphocyte reacation; MLR) 방법을 이용하여 측정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 성숙한 수지상세포는 자가 및 동종 T 림프구에 대해서 자극량에 비례하여 증식반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 3> 수지상세포의 표면항원 발현 조사

본 발명에 따라 제조한 수지상세포의 표면항원 발현양상을 조사하기 위하여 PE나 FITC와 같은 형광물질이 표지된 항원에 대한 단일클론 항체 (Beckman Coulter, Maseille, France)를 사용하여 하기와 같이 염색한 후 분석하였다. 우 선, 성숙한 수지상세포를 각각 5×10⁵ 세포/100 ㎕씩 유세포 형광분석용 용기에 분주하고, 단일클론 항체를 첨가하여 암소에서 15분 동안 반응시킨 후 1 ㎖의 PBS 용액을 첨가하여 반응을 중단시켜 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 이때, 단일클론 항체로 IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG2a-FITC, IgG2a-PE, CD1a, CD3, CD11c, CD14, CD54, CD80, CD83, CD86 및 HLA-ABC는 모두 10 ㎕씩, IgG2b-PE 및 HLA-DPQR은 2.5 ㎕씩 반응용기에 첨가하였다.

원심분리한 후 400 ㎕ PBS에 세포를 재부유시켜 유세포형광분석기 (EPICS^? XL flow cytometer; Beckman Coulter, Maseille, France)와 유세포분석 프로그램 (EXPO4 cytometer program; Beckman Coulter)으로 수지상세포의 표면항원 발현양상을 조사하였다.

<3-1> 성숙유도인자에 따른 수지상세포의 성숙도 차이

수지상세포를 성숙하게 분화시키기 위하여 성숙유도인자로서 TNF-α (Steinman R. M. at al., US 6274378 B1, 1998)나 CD40L (Chen B at al., Clinical Immunology 98: 280, 2001)을 단독으로 또는 다른 인자들과 병용하는 방법들이 사용되고 있다. 그러나, TNF-α와 CD40L을 병용한 방법은 현재까지 시도되지 않았다. 본 발명에서는 수지상세포의 성숙을 유도하는 인자로서 상기 두 인자의 상승효과 (synergy effect)를 확인하기 위해, 실시예 1에서와 같은 방법으로 세포주의 용해물을 처리하여 동종 종양-관련 항원을 탑재하고 미성숙 수지상세포를 TNF-α와 CD40L을 동시에 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 유세포 형광분석기를 사용하여 세포의 표면항원 발현양상을 성숙유도인자를 사용하지 않은 경우 (대조군) 및 TNF-α를 단독으로 사용한 경우의 표면항원 발현양상과 비교하였다.

도 6a에 나타난 바와 같이, 성숙한 수지상세포는 T 림프구와 단핵구의 대표적인 표지항원인 CD3과 CD14는 발현하지 않았다. 이러한 결과는 상기 실시예 1에서 분리·배양한 세포가 임파구 또는 단핵구가 아니라는 것을 입증하는 것이다.

또한, 성숙되고 활성화된 항원제시세포의 표면에서 과량 발현되는 공동자극물질인 CD80과 CD86의 발현 정도와 수지상세포의 성숙도를 말해주는 CD83의 발현 정도를 성숙유도인자의 조합에 따라 살펴본 결과, 이들이 수지상세포의 성숙도에 뚜렷한 영향을 미침을 알 수 있었다. 즉, 공동자극물질인 CD80과 CD86의 발현은 성숙유도인자를 첨가하지 않은 대조군의 경우 각각 36.0% 및 31.4%이고, TNF-α만을 첨가하였을 경우엔 각각 54.6% 및 41.2%인 반면, 두 가지 성숙유도인자를 첨가하였을 경우에는 각각 80.7% 및 76.3%로 증가되었다. 공동자극분자의 표현형이 증가된 성숙한 수지상세포는 항원제시능력이 향상되어 강력한 항원제시세포로서 작용할 수 있다. 또한, CD83의 발현은 대조군의 경우 3.61%에 불과했으며, 기존의 TNF-α만을 첨가한 경우에는 CD83의 발현이 각각 13.84%인데 반해 두 인자를 모두 첨가한 경우에는 CD83의 발현이 51.8∼71.4%로 증가하였다. 이러한 결과로부터, 미성숙 수지상세포의 배양시 성숙유도인자로 TNF-α와 CD40L 두 가지 모두를 첨가하는 것이 현저한 상승효과를 나타냄을 확인하였다.

<3-2> 탑재한 세포주의 종류에 따른 수지상세포의 성숙도 차이

실시예 1과 같이 동종 종양-관련 항원으로 신세포암 세포주 SN12C와 A498로 만들어진 종양세포주 용해물 각각을 미성숙 수지상세포의 배양 6일째에 첨가하여 탑재하였고, 배양 7일째에 성숙유도인자인 TNF-α와 CD40L을 함께 첨가하여 하루 더 배양하여 배양 8일째에 수확한 후 세포의 표면항원 발현양상을 조사하였다.

그 결과, 수지상세포에 A498 세포주-유래 항원을 탑재한 경우에는 CD83을 발현하는 세포가 51.8%인 반면, SN12C 세포주-유래 항원을 탑재한 경우에는 71.4%로 상당히 증가되었다 (도 6b). 이와 같이 수지상세포에 탑재한 동종 종양세포주-유래 항원의 종류에 따라 CD83의 발현정도가 다르게 나타나는 것은 종양세포주-유래 항원도 수지상세포의 성숙도에 영향을 미치는 또 다른 한가지 요소임을 시사하는 것이다.

<실시예 4> 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포 백신의 안정성

본 발명의 궁극적인 목적은 종양 특이적인 면역반응을 증강시켜 난치성 암을 치료할 수 있는 세포치료제로서의 활성화된 수지상세포를 제공하는 것이다. 따라서, 수지상세포는 환자에게 투여하기 전까지 충분한 시간 동안 안정성이 유지되어야만 목표한 항암 면역반응을 인체 내에서 유발할 수 있을 것이다. 이에 동종 종양-관련 항원으로 SN12C 세포주 용해물을 탑재하고 실시예 <3-1>과 같이 성숙유도인자를 달리하여 세 군으로 나누어 제조된 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세 포들의 안정성을 확인하기 위하여 상기 세포들을 각각 1×10⁷ 세포/㎖의 농도로 혈청성분과 싸이토카인이 포함되지 않은 RPMI 1640 배지에 부유시켜 4℃ 냉장온도에 보관하면서 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 경과시 수지상세포의 생존도를 0.4% 트립판 블루 염색 (trypan blue stain) 용액으로 염색하여 측정한 결과, 세 군 모두 144시간까지 80% 이상의 높은 생존율을 보였다 (도 7a).

또한, 시간의 경과에 따른 성숙한 수지상세포의 표면항원의 발현정도를 조사하기 위하여 SN12C를 탑재하고, TNF-a와 CD40L를 모두 첨가한 배지에서 세포를 72시간 동안 배양한 후 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 분석한 결과, 공동자극물질인 CD80과 CD86 및 MHC class I과 class II 항원의 발현정도에 별 차이가 없는 것으로 확인되어 (도 7b) 냉장상태에서 최소 72시간까지는 성숙한 수지상세포의 표현형이 안정적으로 유지됨을 확인하였다.

<실시예 5> 수지상세포에 의한 종양 특이적인 세포독성 유도

본 발명에 따라 제조된 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포가 T 림프구에 항원을 제시하여 항원 특이적인 세포독성을 가진 세포로 면역화되는지 여부를 확인하기 위해 하기와 같은 세포독성 분석실험을 실시하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 자가 CD3⁺ T 림프구를 분리한 후 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 5% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 20 U/㎖ IL-7 (Pharmingen, California, USA)이 첨가된 AIM-Ⅴ 배지에 부유시켰다. 상기 부유액에 수지상세포 : T 림프구의 비율이 1:10이 되도록 수지상세포를 첨가한 후, 상기 혼합물을 24웰 플레이트에 1 ㎖씩 분주하여 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 7일간 배양하여 1차 자극을 가하였다. 배양 중 (배양 2∼3일) 세포의 증식을 관찰하면서 상기 AIM-V 배지에 IL-7 대신 50 U/㎖ IL-2 (Pharmingen California, USA)가 첨가된 배지를 각 웰에 0.5 ㎖씩 첨가하였다. 배양 7일째 혈청성분이 첨가되지 않은 RPMI 1640 배지로 2회 세척하여 T 림프구를 수득하고 세포수를 세어서 50 U/㎖ IL-2, 5% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 AIM-Ⅴ 배지에 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 다시 부유시켰다. 여기에 1차 자극과 동일한 비율의 수지상세포를 첨가하고 24웰 플레이트에 1 ㎖씩 분주하여 2차 자극을 가하여 동일한 배양조건에서 4∼5일간 배양한 후 T 림프구를 수확하였다. CD8 자석입자 용액 (Miltenyi Biotech, Bergisch Glandbach, Germany)을 이용하여 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 수확된 T 림프구로부터 CD8⁺ CTL을 분리하였다. 이때, 수지상세포에 탑재하는 종양-관련 항원으로 SN12C, A498, Caki-2, SNU-349 및 SNU-482 신세포암 세포주의 용해물을 각각 사용하였다.

세포독성 분석실험은 신세포암 세포주 SNU-349, A498, 대장암 세포주 SNU-C4 및 백혈병 세포주 K562를 표적세포 (target)로, 상기에서 분리된 CD8⁺ CTL을 반응세포 (responder)로 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 2×10⁴ 세포/200 ㎕의 농도로 ⁵¹Cr이 표지된 표적세포들을 CD8⁺ CTL과 1 : 5 내지 1 : 100 비율로 혼합한 후 96웰 플레이트에 분주하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그리고 배양물에서 100 ㎕ 를 수집하여 γ-측정기를 이용하여 특정 방출의 퍼센트를 계산하였다.

그 결과, SN12C와 A498 세포주-유래 항원을 탑재한 수지상세포로 2차 면역된 CD8⁺ CTL은 신세포암 세포주에 특이적으로 15%∼25%에 이르는 세포독성을 유도하였으나 (도 8a 및 8b), SNU-349 세포주를 비롯해 Caki-2, SNU-482 세포주-유래 항원을 탑재한 수지상세포로 2차 면역된 CD8⁺ CTL은 신세포암 세포주에 특이적인 세포독성 반응이 유도되지 않았다 (도 8c). 이러한 결과는 종양-관련 항원의 재료로 사용된 세포주가 유사한 조직형의 동종 종양세포주라 하더라도 세포주에 따라 세포독성 유도에 현저한 차이를 보일 수 있으므로, 임상적으로 암 환자 치료에 사용할 동종 종양세포주-유래 항원을 탑재한 수지상세포 백신을 제조하기 위해서는 면역원성 (immunogenicity)이 높은 종양세포주의 선별과정이 선행되어야 함을 시사하는 것이고, 이러한 세포주로 신세포주암 세포주 SN12C와 A498이 유용함을 나타내는 것이다.

<실시예 6> 전이성 B16F10 흑색종 모델에서 동종 종양-관련 항원을 탑재한 수지상세포 백신의 면역치료 효과

본 발명에 따라 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포가 항종양 치료용 백신으로서 생체내 유용성을 갖는지를 흑색종 세포주를 대상으로 평가하였다. 즉, C57BL/6 마우스로 B16F10 흑색종 전신전이 모델을 만들어 자가 및 동종 흑색종 세포주의 용해물을 탑재한 수지상세포 백신으로 치료한 후 B16F10 종양에 대한 폐 전 이 억제효과를 비교 분석하였다.

<6-1> 마우스 흑색종 세포주

C57BL/6 마우스에서 유래한 B16 세포주 중에서 폐 전이능이 높은 변종인 B16F10 세포주 (KCLB 80008), C3H/He 마우스에서 유래한 K1735 (KCLB 80013) 세포주 및 DBA/2 마우스에서 유래한 클론 M3 (KCLB 10053.1) 흑색종 세포주들을 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 입수하여 0.5% L-글루타민 (L-glutamine; Sigma, St. Louis, USA)이 첨가된 R10 배지 (mR10)로 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 계대배양하였다.

<6-2> 마우스 골수성 수지상세포의 배양 및 종양-관련 항원의 탑재

C57BL/6 마우스 (Daehan Biolink, Chungbuk, Korea)로부터 대퇴골과 경골을 분리하여 양쪽 끝을 절단기로 잘라낸 다음 mR10 배지를 10 ㎖ 주사기에 넣고 주사기 바늘을 한쪽 뼈끝에 꽂은 후 배지액을 밀어 넣어 다른 한쪽으로 골수를 빼내 페트리 디쉬 (Falcon, Boston, USA)에 모았다. 골수가 섞여 있는 배지를 철망으로 3회 걸러 뼈 조각과 같은 불순물을 제거한 후 원심분리하여 골수세포를 모은 후 0.15 M Tris-NH₄Cl 완충액 (pH 7.2)으로 부유시켜 적혈구를 용혈시켰다. RPMI 1640 배지로 2회 세척한 후 골수세포로부터 T 림프구, B세포 및 호중구 등을 제거하기 위하여 싸이토톡신 (cytotoxin) 배지 (2.5 mM HEPES 및 0.3% BSA가 첨가된 mR10 배 지)에 이들에 대한 네 종류의 항체를 골수세포 1×10⁸ 세포당 각각 1.5 ㎖씩 혼합한 항혈청을 첨가하여 부유시킨 후 얼음 속에 넣고 암소에서 1시간 동안 반응시켰다. 사용한 항체는 GK1.5 (항-CD4, TIB 207, American Type Culture Collection (ATCC)), 3.168 (항-CD8, 한국생명공학연구원의 임 준석 박사로부터 제공받음), RA3-3A1/6.1 (항-B220/CD45R, TIB 146, ATCC) 및 J11d.2 (항-호중구 및 항-B 세포, TIB 183, ATCC) 등의 네 종류이다.

반응이 끝나면 4℃에서 원심분리한 후 침전물을 싸이토톡신 배지에 1×10⁷ 세포/㎖의 농도로 재부유시켜 저독소-M-토끼 (Low-Tox-M-rabbit) 보체 (Cederlane, Ontario, Canada)를 1:20으로 희석시켜 첨가하고 37℃의 CO₂ 배양기에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 원심분리하여 얻은 침전물을 싸이토톡신 배지에 재부유시킨 후 골수성 계열의 세포들 중 살아있는 세포들을 얻기 위하여 실온의 림포사이트-M (Lymphocyte-M; Cederland, Ontario, Canada)에 세포 부유액을 1:1의 비율로 조심스럽게 중첩하여 25℃에서 2,800 rpm으로 20분간 원심분리한 후 단핵구층을 분리하였다. mR10 배지 10 ㎖로 2회 세척한 후 1,000 U/㎖ mGM-CSF, 1,000 U/㎖ mIL-4 (R&D, Minneapolis, USA)가 첨가된 mR10 배지에 세포 농도가 3×10⁵ 세포/㎖이 되도록 부유시키고 웰당 5 ㎖씩 6웰 플레이트 (NUNC, Roscilde, Denmark)에 분주하여 5% CO₂ 및 가습 조건의 37℃ 배양기에서 배양하였다.

배양 6일째 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 제조한 흑색종 세포주 B16F10, K1735 및 클론 M3의 용해물을 각각 50 ㎍/㎖의 농도로 상기 웰 플레이트에 첨가하여 하루동안 배양하였다. 배양 7일째 플레이트의 표면에 붙어있지 않거나 살짝 달라붙어 있는 세포들을 수지상세포로서 수확하여 혈청성분이 첨가되어 있지 않은 RPMI 1640 배지로 3회 세척한 후, 세포 농도가 1 × 10⁶ 세포/200 ㎕이 되도록 주사용 생리식염수로 재부유시켜 종양세포주-유래 항원이 탑재된 수지상세포 백신으로 사용하였다. 이때, 탑재한 종양세포주-유래 항원에 따라 수지상세포 백신을 각각 B16F10-DC, K1735-DC 및 클론 M3-DC로, 종양세포주-유래 항원을 탑재하지 않고 제조한 미탑재 수지상세포 백신을 UDC라고 명명하였다.

<6-3> 전이성 B16F10 흑색종 모델에서 수지상세포 백신 치료

상기 실시예<6-1>과 같이 배양한 B16F10 흑색종 세포주에 트립신을 처리하여 수확한 후 주사용 생리식염수에 1×10⁶ 세포/㎖의 농도로 부유시켰다. 상기 세포부유액 50 ㎕를 1 ㎖용 주사기로 취하여 C57BL/6 마우스의 꼬리부분 정맥에 주사하는 방법으로 흑색종 전신전이 모델을 만들었다. 이들을 각각 다섯 마리씩 모두 네 실험군으로 나누어 종양세포를 주사한지 8일 및 15일 후에 각각 1×10⁶ 세포/200 ㎕의 B16F10-DC, K1735-DC, 클론 M3-DC 및 UDC를 각각 그룹별로 복강내 주사하였다. 또한, B16F10 주사 후 생리식염수만으로 치료한 종양 발생의 양성 대조군 다섯 마리와 B16F10 주사와 수지상세포 백신 치료를 모두 시행하지 않은 음성 대조군 세 마리를 함께 준비하였다. 흑색종 세포 주사 후 22일째까지 실험동물들의 생존여부를 관찰하였으며, 22일째에 살아있는 모든 마우스들을 안락사시킨 후 양측 폐를 적출해 흑색종의 폐 전이 양상을 육안으로 관찰하였다. 적출한 폐를 파라핀 포매하고 조직절편을 제작하여 H&E 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

종양의 전이 정도는 평가하고자 하는 장기를 적출하여 인디아 잉크 (India ink)를 주입한 후 페켓트 용액 (Fekette's solution)으로 고정하여 형성된 전이종양 결절의 수를 세어 평가하는 정량적 방법 (MulёJ. J., et al., Science 225: 1487-89, 1984)과 장기에 생긴 전이 종양의 정도에 따라 몇 개의 등급으로 구분하여 평가하는 반정량적 방법 (Dematos P., et al., Cell Immunol, 185: 65-74, 1998) 에 의해 결정된다. 본 발명에서는 수지상세포 백신의 치료에 반응을 보인 일부의 마우스 이외에는 폐에 생성된 전이종양의 결절들이 대부분 상당히 크고 서로 뭉쳐 있어서 각 결절의 수를 세기가 어려워 후자의 방법으로 흑색종의 폐 전이 정도를 평가하였다. 육안으로 관찰한 흑색종의 폐 전이 진행정도는 하기 표 1에 제시한 기준에 따라 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ의 다섯 등급으로 분류하였으며 각 등급에 따라 0점에서 4점까지의 점수를 부여하여 치료성적을 정량화한 후 각 실험군들의 평균값 차이를 분석하였다.

등급	폐종양 존재량
Ⅰ	비존재: 육안으로 또는 현미경상으로 식별가능한 어떠한 종양도 관찰되지 않음.
Ⅱ	경미한 수준의 종양: 종양이 존재하고 육안으로 식별가능하지만 폐 부피의 10% 미만임.
Ⅲ	중간 수준의 종양: 산재 종양이 폐 부피의 약 10∼50%에 이름.
Ⅳ	심각한 수준의 종양: 폐 부피의 50% 이상이 종양 조직으로 바뀌어 있음.
Ⅴ	사망: 폐종양으로 인한 마우스의 사망.

우선 각 실험군들 간의 치료성적이 차이가 있는지 여부는 먼저 비모수적 방법인 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 검정법을 이용하여 분석하였고, 다음으로 모든 치료성적을 순위 자료로 전환한 후 ANOVA 법으로 사후검정을 시행하였다 (안윤옥 외, 의학통계론, 서울대학교 출판부, 1999). 동일한 흑색종 모델을 대상으로 2회 실험한 결과, 동종 종양세포주-유래 항원이 탑재된 수지상세포 백신은 K1735-DC 및 클론 M3으로 치료한 실험군들만이 양성 대조군에 비해 폐 전이의 진행이 확연하게 지연되어 있었으며, 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (P<0.01). 또한, 동종 종양세포주-유래 항원을 탑재한 수지상세포 백신은 자가 항원을 탑재한 수지상세포 백신보다 우수한 치료효과를 보였다 (P<0.01).

종양 전이정도 평가를 위한 또 다른 방법으로 안락사 후 적출한 폐의 무게를 측정하여 실험군들 간의 평균값 차이를 비교하여 본 결과, 동종 종양세포주-유래 항원 K1735, 클론 M3을 탑재한 수지상세포 백신으로 치료한 실험군들만이 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (P<0.05) (표 2).

백신 종류	마우스 수	평균 폐 무게 (g)	P 값	마우스 수	평균 종양 존재량b	P 값
대조군	5	0.296±0.071	-	10	2.70±0.82	-
UDC	5	0.252±0.096	NSa	10	2.20±1.03	NS
B16F10-DC	5	0.216±0.061	NS	10	2.40±1.07	NS
K1735-DC	5	0.166±0.017	<0.05	10	1.30±0.48	<0.01
클론 M3-DC	5	0.182±0.042	<0.05	10	1.30±0.67	<0.01
aNS: 통계학적으로 유의성이 없음. b폐 전이 종양 존재량: 표 1에 지정된 등급 체계에 따라 분류됨. 등급 Ⅰ=0; 등급 Ⅱ=1; 등급 Ⅲ=2; 등급 Ⅳ=3; 및 등급 Ⅴ=4

폐 조직을 H&E 염색하여 현미경으로 관찰한 결과도 역시 동종 종양세포주-유래 항원 K1735, 클론 M3을 탑재한 수지상세포 백신으로 치료한 실험군들에서 뚜렷한 치료 효과를 보였는데, 흑색종 세포의 미만성 침윤이나 작은 흑색종 결절들이 일부 관찰되기는 하였으나, 대부분이 정상조직 (도 9f)에 가까운 소견을 보였으며 (도 9d 및 9e), 다른 실험군들의 폐 조직에 비해서는 매우 양호한 소견이었다 (도 9a 내지 9c).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 동종 종양-관련 항원이 탑재된 수지상세포 백신은 인체 투여시 강력한 종양 특이적인 세포독성 면역반응을 유도하는 동시에 안전하고 부작용이 없어 난치성 암의 면역치료용 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (13)

1) 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계;

2) 분리된 말초혈액 단핵구로부터 CD14⁺ 단구를 분리하는 단계;

3) 분리된 CD14⁺ 단구에 GM-CSF 및 IL-4를 첨가한 후 배양하여 미성숙 수지상세포로 분화시키는 단계; 및

4) 미성숙 수지상세포에 동종 종양-관련 항원으로서 동종 종양세포주의 용해물을 탑재하고 성숙유도인자로 TNF-α 및 CD40L을 첨가하여 성숙한 수지상세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 수지상세포의 제조방법.

제 1항에 있어서,

단계 1)의 말초혈액 단핵구는 혈액분반술과 밀도구배 원심분리를 이용하여 분리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 2항에 있어서,

단계 2)의 CD14⁺ 단구가 단계 1)의 단핵구에 CD14⁺ 자석입자를 표지하는 단계; 분리 컬럼을 이용하여 자석입자가 표지되지 않은 CD14^- 세포를 분리하여 제거하는 단계; 및 자성 분리대로부터 분리 컬럼을 제거하고 분리 컬럼에 있는 CD14⁺ 단구를 채집하 는 단계에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 3항에 있어서,

분리 컬럼이 1×10⁸ 내지 1×10⁹ 세포의 세포분리용량을 갖는 칼럼인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서,

단계 3)은 GM-CSF를 500 내지 1,500 U/㎖ 농도로, IL-4를 500 내지 1,500 U/㎖ 농도로 첨가하고 6일간 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서,

단계 4)는 동종 종양-관련 항원으로 동종 종양세포주의 용해물을 첨가하여 18시간 동안 탑재하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 6항에 있어서,

종양세포주가 신세포암 세포주 SN12C, A498, Caki-2, SNU-349 및 SNU-482로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 6항에 있어서,

종양세포주 용해물이 세포 배양액을 액체질소에서 냉동시켰다가 37℃ 수조에 넣어 녹인 후 잘 흔들어 재부유시키는 과정을 5 내지 9분 간격으로 5 내지 7회 반복하 고, 이를 원심분리하여 얻은 상층액에 방사선을 3,000 내지 5,000 rad로 조사하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 6항에 있어서,

종양세포주-유래 용해물이 50 내지 150 ㎍/㎖ 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항에 있어서,

단계 4)에서 TNF-α가 50 내지 150 U/㎖의 농도로, CD40L이 1 내지 3 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1항의 방법에 의해 제조되고 동종 종양-관련 항원이 탑재되며 종양 특이적인 면역반응을 유도할 수 있는 수지상세포.

제 11항의 수지상세포를 유효성분으로 하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 백신 보조제를 포함하는 암 치료용 백신 조성물.

제 12항에 있어서,

암이 전이성 신세포암 또는 악성 흑색종인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

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