KR20210105587A - 신규한 종양-관련 항원 단백질 olfm4 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) 단백질 OLFM4(olfactomedin 4) 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 OLFM4 또는 ANTP(antennapedia peptide)-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포가 종양 특이적 세포독성 면역반응을 유도하는 것을 확인하였으므로, 상기 OLFM4를 종양-관련 항원 단백질로서, 상기 종양-관련 항원 단백질이 탑재된 항원-제시 세포 또는 상시 항원-제시 세포로부터 유도된 세포독성 T 림프구를 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

신규한 종양-관련 항원 단백질 OLFM4 및 이의 용도{Novel tumor-associated antigen protein OLFM4 and the use thereof}
본 발명은 신규한 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) 단백질 OLFM4(olfactomedin 4) 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 종양-관련 항원 단백질, 상기 종양-관련 항원 단백질과 세포투과 펩타이드와의 결합 단백질 및 상기 종양-관련 항원 단백질을 포함하는 항원-제시 세포 또는 상기 항원-제시 세포로부터 유도되는 세포독성 T 림프구, 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 암으로 인한 사망의 근본적인 해결이 힘든 이유는 고전적인 암치료법의 부작용과 미세 전이 암세포 및 이들의 유전적인 불안정(genetic instability)로 인한 내성 획득에 기인한다. 따라서 면역감시체계에 근간을 두는 항종양 백신의 개발이 대두되고 있다. 특히, 암의 면역치료는 1) 성장 활동하는 종양뿐 아니라 비활동 상태인 종양에 대해서도 모두 유용하고, 2) 다른 치료법과 비교해 심각한 부작용이 없으며, 3) 다른 치료법에 비해서 전신적인 반응을 하며, 4) 암에 대한 기억을 유도하여 마치 전염병 예방 접종처럼 암을 예방하고 치료할 수 있는 이점을 가지고 있어 새로운 암 치료법으로 개발이 대두되고 있다. 현재까지 합성 펩타이드 백신, 유전자 백신, 열충격 단백질 백신 등 다양한 면역치료법이 시도되었으며, 이중에서 수지상세포(dendritic cell, DC)를 이용한 면역세포치료가 효과적인 것으로 인식되고 있다. 수지상세포는 생체 내의 가장 강력하고 중요한 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)이기 때문에 항종양 백신으로뿐만 아니라 면역 반응이 관여하는 대부분의 질환에서 그 응용가치가 매우 높다.
수지상세포는 효과적으로 항원을 붙잡고(capture), 가공(processing)하여 주조직적합복합체(major histocompatibility complex, MHC)와 결합체를 이루어 T 림프구에 항원을 제시함으로써, 항원에 특이적인 T 림프구 반응을 유도하고 암 면역세포치료의 임상 적용을 가능케 한다. 따라서 암 면역세포치료에 수지상세포를 이용하기 위해서 종양-관련 항원(tumor-associated antigen, TAA)의 탑재는 필수적인 요소이다.
이러한 이유로, 성공적인 암 면역치료를 위해서는 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)에 의해 인식될 수 있는 종양-관련 항원을 밝히는 것이 중요하다. 구체적으로 CD8 양성(CD8 positive) 세포독성 T 림프구는 MHC 클래스 I 분자와 결합한 종양-관련 항원의 에피토프 펩타이드(epitope peptide)를 인지한 후, 종양 세포를 사멸시키는 것으로 알려져 있다. 종양-관련 항원의 일예로 흑색종 항원(melanoma antigen, MAGE) 패밀리의 발견 이후, 다른 많은 종양-관련 항원이 면역학적 접근을 통해 발견되고 있다. 그러나 현재까지 면역치료에 사용될 수 있는 종양-관련 항원의 수는 극히 제한적이고, 이러한 이유로 면역치료 표적으로 신규한 종양-관련 항원의 필요는 여전히 남아있다.
인간 올팩토메딘 4(olfactomedin 4; OLFM4)는 C-말단 올팩토메딘 도메인 (250 아미노산, AA 244-510)을 공유하는 올팩토메딘 계열 단백질에 속한다. OLFM4는 1991년 처음 알려졌고, bA209J19.1, GC-1, GW112, hGC-1, hOLfD, KIAA4294, OlfD, OLM4 또는 UNQ362로도 알려져 있다. hOLFM4는 장내 crypts의 기저에 있는 줄기세포에서 발현되는 당 단백질이다.
한편, 결장암, 유방암 및 폐암에서 OLFM4 mRNA가 상향 조절되고, 대장암과 연관된 췌장, 위, 전립선, 결장, 폐, 유방, 난소 및 간 전이에서 유래한 종양 세포에서 높은 수준의 OLFM4 단백질 발현을 나타낸다. 또한 OLFM4의 발현 수준은 자궁경부 편평상피 병변의 병리학적 등급과 높은 상관 관계를 보인다고 보고되어 있다.
또한, OLFM4는 종양 세포에서 발현될 뿐만 아니라 혈청으로 분비되기 때문에, 다양한 암의 검출 및 진행을 위한 좋은 바이오 마커로 알려져 있다. 일예로, 머리와 목의 편평 세포에서 분비된 단백질 중 OLFM4가 더 많은 양으로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 혈청 OLFM4 수치가 건강한 사람보다 수술 전 위암 환자에서 유의하게 높게 나타나는 것이 보고되었다.
이러한, OLFM4가 종양 세포에 대한 특이적인 면역 반응을 유발한다면, 암의 면역치료의 표적으로 사용될 수 있을 것이나, 현재까지 이에 대해 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 면역치료에 사용될 수 있는 종양-관련 항원을 개발하기 위해 노력한 결과, OLFM4 또는 ANTP(antennapedia peptide)-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포가 종양 특이적 세포독성 면역반응을 유도하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 상기 OLFM4를 종양-관련 항원 단백질로서, 상기 종양-관련 항원 단백질이 탑재된 항원-제시 세포 또는 상기 항원-제시 세포로부터 유도된 세포독성 T 림프구를 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있음을 밝혔으며, 이에 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1224466호 대한민국 등록특허 제10-0982186호 대한민국 등록특허 제10-0585456호
Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80 Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9 van der Flier LG, Haegebarth A, Stange DE, et al. Gastroenterology 2009, 137(1): 15-7 Koshida S, Kobayashi D, Moriai R, et al. Cancer Sci 2007, 98(3): 315-20 Jang BG, Lee BL, Kim WH. Virchows Arch 2015, 467(3): 285-94 Conrotto P, Roesli C, Rybak J, et al. Int J Cancer. 2008, 123(12): 2856-64 Guermonprez P, Valladeau J, Zitvogel L, et al. Annu Rev Immunol. 2002, 20: 621-67
본 발명의 목적은 암 면역치료법으로 이용하기 위한 신규한 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) 단백질, 상기 종양-관련 항원 단백질을 포함하는 항원-제시 세포 또는 상기 항원-제시 세포로부터 유도되는 세포독성 T 림프구를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 면역치료법으로 종양 특이적인 면역 반응을 증가시켜 암 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4(olfactomedin 4) 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) 단백질 및 상기 종양-관련 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질과 세포투과 펩타이드가 결합된 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질 또는 상기 종양-관련 항원 단백질과 세포투과 펩타이드가 결합된 단백질을 포함하는 항원-제시 세포 및 상기 항원-제시 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질 또는 상기 종양-관련 항원 단백질과 세포투과 펩타이드가 결합된 단백질을 포함하는 항원-제시 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 포함하는 항원-제시 세포로부터 유도되는 OLFM4 특이적 세포독성 T 림프구 및 상기 세포독성 T 림프구를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은
하기 단계 중 하나를 포함하는 OLFM4 특이적 세포독성 T 림프구 유도성이 있는 항원-제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다:
(1) 항원-제시 세포와 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질 또는 상기 종양-관련 항원 단백질과 세포투과 펩타이드가 결합된 단백질을 접촉하는 단계; 또는
(2) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 암호화하는 유전자 또는 상기 종양-관련 항원 단백질과 세포투과 펩타이드가 결합된 단백질을 암호화하는 유전자를 항원-제시 세포로 도입하는 단계.
본 발명의 OLFM4(olfactomedin 4) 단백질 또는 안테나페디아 펩타이드(ANTP, antennapedia peptide)가 접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포가 종양 특이적 세포독성 면역반응을 유도하는 것을 확인하였으므로, 상기 OLFM4를 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) 단백질로서, 상기 종양-관련 항원 단백질이 탑재된 항원-제시 세포 또는 상기 항원-제시 세포로부터 유도된 세포독성 T 림프구를 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 제작한, 안테나페디아 펩타이드(ANTP, antennapedia peptide)가 접합된 인간 OLFM4(olfactomedin 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 모식화한 도이다.
도 2a는 및 도 2b는 본 발명의 실시예에서 정제한, 인간 OLFM4(hOLFM4) 및 ANTP가 접합된 hOLFM4(ANTP-hOLFM4) 재조합 단백질 각각을 웨스턴 블럿(도 2a) 및 쿠마시 블루 염색(도 2b)으로 확인한 도이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에서 제작한, hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 각각에서 hOLFM4 및 ANTP-hOLFM4의 탑재 효율을 확인한 도이다.
도 3b는 본 발명의 실시예에서 형질도입 효능을 확인하기 위해 hOLFM4 및 ANTP-hOLFM4의 공초점 레이저 현미경 분석 결과를 확인한 도이다.
도 3c는 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 각각에서 성숙 마커의 발현을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델을 제작하기 위해 사용한 hOLFM4 유전자 발현을 위한 벡터를 모식화한 도이다.
도 5는 종양 성장을 확인하기 위해 본 발명의 실시예에서 제작한 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델에 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포를 백신접종하는 방법을 모식화한 도이다. 대조군으로 PBS를 처리한 수지상세포를 백신접종하였다.
도 6a 및 도 6b는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군에서 종양 크기(도 6a) 및 루시퍼라제 발광(Luminescence)(도 6b)을 확인한 도이다.
도 7은 종양 전이를 확인하기 위해 본 발명의 실시예에서 제작한 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델에 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포를 백신접종하는 방법을 모식화한 도이다. 대조군으로 PBS를 처리한 수지상세포를 백신접종하였다.
도 8a는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군에서 루시퍼라제 발광(Luminescence)을 확인한 도이다.
도 8b는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군에서 폐 전이성 결절 수를 확인한 도이다.
도 8c는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군에서 폐 전이성 종양 부위를 확인한 도이다.
도 9a는 시험관 내에서 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군의 림프구를 hOLFM4 단백질로 자극한 후 T 림프구 증식을 확인한 도이다.
도 9b는 시험관 내에서 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군의 비장세포를 hOLFM4 단백질로 자극한 후 IFN-γ 생성 비장세포수를 확인한 도이다.
도 10은 시험관 내에서 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군, 및 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 백신접종한 hOLFM4 과발현 종양 마우스군의 림프구를 hOLFM4 단백질로 자극한 후 hOLFM4-특이적 세포독성 T 림프구 유도 및 이의 세포 독성을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4(olfactomedin 4) 종양-관련 항원(tumor-associated antigen) 단백질을 제공한다.
또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4(olfactomedin 4) 종양-관련 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
본 발명에서, 상기 OLFM4 종양-관련 항원 단백질에 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptide, CPP)가 추가로 접합될 수 있다. 상기 세포투과 펩타이드는, GRKKRRQRRRPPQ(Tat, 서열번호 6), RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan, 서열번호 7), KLALKLALKALKAALKLA(amphipathic peptide, 서열번호 8), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1, 서열번호 9), PLILLRLLRGQF(Pept1, 서열번호 10), PLIYLRLLRGQF(Pept2, 서열번호 11), KLWMRWYSPTTRRYG(IVV-14, 서열번호 12), MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV(Ig(v), 서열번호 13), LLIILRRRIRKQAHAHSK(pVEC, 서열번호 14), RRIPNRRPRR(HRSV, 서열번호 15), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(VP22, 서열번호 16), YARVRRRGPRR(Hph-1, 서열번호 17), RRRRRRRRRRR(R11, 서열번호 18), RRRRRRRRR(R9, 서열번호 19), AANLLPNLLAAP(MTM, 서열번호 20) 또는 AAVALLPAVLLALLAP(Signal sequence based peptide, 서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있고, 보다 구체적으로 RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 "유전자"는 따로 명시되지 않는 한, "폴리뉴클레오티드, "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"과 호환적으로 사용된다. 또한, 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 종양-관련 항원 단백질 또는 상기 OLFM4 종양-관련 단백질에 세포투과 펩타이드가 추가로 접합된 단백질을 암호화하는 유전자에서 유래한 변형된 유전자뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 유전자 서열을 갖는 유전자를 포함한다. 상기 "보존적으로 변형된 유전자 서열"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 모두 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCU및 GCG은 모두 알라닌 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩타이드의 변경없이, 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이(silent variations)"라 하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류이다. 펩타이드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업계에서 보편적인 것 중 하나는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 각각의 침묵 변이는 공개된 각 서열에서 암시적으로 기재되어 있다.
본 발명에서, 상기 종양은 OLFM4를 과발현하는 종양으로, 예컨대 위암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 신장암, 자궁경부암, 흑색종, 림프종, 신경교종, 교모세포종 또는 백혈병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 OLFM4 또는 세포투과 펩타이드로 ANTP가 접합된 OLFM4 단백질이 탑재된 수지상세포가 종양 특이적 세포독성 면역반응을 유도하는 것을 확인하였으므로, 상기 OLFM4 단백질을 종양-관련 항원 단백질로서 OLFM4를 과발현하는 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 포함하는 항원-제시 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항원-제시 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항원-제시 세포를 유효성분으로 함유하는 암 항원에 대한 면역 반응 유도를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 OLFM4 단백질에 세포투과 펩타이드, 예컨대 GRKKRRQRRRPPQ(Tat, 서열번호 6), RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan, 서열번호 7), KLALKLALKALKAALKLA(amphipathic peptide, 서열번호 8), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1, 서열번호 9), PLILLRLLRGQF(Pept1, 서열번호 10), PLIYLRLLRGQF(Pept2, 서열번호 11), KLWMRWYSPTTRRYG(IVV-14, 서열번호 12), MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV(Ig(v), 서열번호 13), LLIILRRRIRKQAHAHSK(pVEC, 서열번호 14), RRIPNRRPRR(HRSV, 서열번호 15), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(VP22, 서열번호 16), YARVRRRGPRR(Hph-1, 서열번호 17), RRRRRRRRRRR(R11, 서열번호 18), RRRRRRRRR(R9, 서열번호 19), AANLLPNLLAAP(MTM, 서열번호 20) 또는 AAVALLPAVLLALLAP(Signal sequence based peptide, 서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있고, 보다 구체적으로 RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 추가로 접합될 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 ANTP가 추가로 접합될 수 있다. 상기 OLFM4 단백질에 세포투과 펩타이드가 추가로 접합될 경우 항원-제시 세포의 세포질로 OLFM4 단백질 전달을 향상시킬 수 있다. 따라서 세포의 세포질로 단백질 전달을 향상시킬 수 있는 세포투과 펩타이드가 OLFM4와 접합될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-제시 세포는 상기 OLFM4 단백질 또는 상기 세포투과 펩타이드가 추가로 접합된 OLFM4 단백질이 탑재되어 포함될 수 있다. 상기 "탑재"란 항원-제시 세포가 항원을 포획하여 분해한 후 이를 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 실어 표면에 표출하는 것으로서, 이와 같이 탑재된 세포는 강력한 항원 특이적인 T 림프구의 활성을 유도한다. 따라서 OLFM4 단백질 또는 상기 세포투과 펩타이드가 추가로 접합된 OLFM4 단백질이 탑재된 항원-제시 세포는 OLFM4 단백질을 종양-관련 항원으로 포획하여 분해한 후 이를 MHC 분자에 실어 표면에 표출함으로써, OLFM4 특이적인 T 림프구의 활성을 유도할 수 있다.
또한, 상기 OLFM4 단백질 또는 상기 세포투과 펩타이드가 추가로 접합된 OLFM4 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 포함될 수 있다. 상기 유전자는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다.
상기 DNA 형태의 유전자를 투여하여 세포 내로 도입하는 방법으로는, 바이러스 벡터에 의한 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터에 의한 방법으로는, 예를 들면 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련바이러스, 헤르페스바이러스, 왁시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 DNA를 혼합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 RNA 형태의 유전자를 투여하여 세포 내로 도입하는 방법으로는 전기충격법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 항원-제시 세포는 치료 및/또는 예방을 받는 개체로부터 유래될 수 있고, 예컨대 치료 및/또는 예방을 받는 개체의 골수 또는 말초혈액으로부터 선별 배양된 단핵구로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-제시 세포는 치료 및/또는 예방을 받는 개체와 MHC 유전형 또는 혈청형이 유사한 제 3의 개체로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-제시 세포는 그 자체로 또는 세포독성 T 림프구를 포함하는 다른 약물과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-제시 세포는 수지상세포, 단핵세포, 대식세포, 랑겔한스 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포 및 γδ T(gamma delta T) 세포일 수 있고, 구체적으로 수지상세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포 및 γδ T(gamma delta T) 세포는 미경험(naive) 상태, 활성화 상태, 또는 증폭(expansione)된 상태일 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원-제시 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 개체에 접종할 때 항-종양 면역력을 유도하는 기능을 가지는 백신(vaccine)으로 사용될 수 있고, 상기 암은 OLFM4를 과발현하는 암으로, 예컨대 상기 암은 위암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 신장암, 자궁경부암, 흑색종, 림프종, 신경교종, 교모세포종 또는 백혈병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 OLFM4 단백질 또는 상기 OLFM4에 세포투과 펩타이드로 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 ANTP가 접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상 세포를 제작하였다. 또한, 상기 제작한 수지상세포에 의해 OLFM4 과발현 종양-특이적 T 림프구 증식 및 세포독성 T 림프구 반응이 유도되어 종양 성장 및 종양 전이가 억제되는 것을 확인하였으므로, 상기 OLFM4 단백질, 또는 세포투과 펩타이드가 접합된 OLFM4 단백질이 탑재된 수지상세포를 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 포함하는 항원-제시 세포에 제시되는 OLFM4 단백질을 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포독성 T 림프구를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 포함하는 항원-제시 세포에 대해서는 상기 항원-제시 세포에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용한다.
본 발명에서, 상기 세포독성 T 림프구는 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포를 포함한다.
본 발명에서, 상기 세포독성 T 림프구는 하기의 단계에 의해 획득할 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 포함하는 항원-제시 세포와 T 림프구를 혼합한 후 공동배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 유도된 OLFM4 단백질을 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구를 분리하는 단계.
본 발명에서, 상기 세포독성 T 림프구는 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 그 자체 또는 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포독성 T 림프구를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 생체 내에서 항원-제시 세포에 제시된 것과 동일한 OLFM4 단백질을 제시하는 암 세포를 표적으로 면역 반응을 증강하는 백신으로 사용될 수 있고, 상기 암은 OLFM4를 과발현하는 암으로, 예컨대 상기 암은 위암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 신장암, 자궁경부암, 흑색종, 림프종, 신경교종, 교모세포종 또는 백혈병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 OLFM4 단백질 또는 세포투과 펩타이드로 ANTP가 접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상 세포를 제작하였다. 또한, 상기 제작한 수지상세포에 의해 OLFM4 과발현 종양-특이적 T 림프구 증식 및 세포독성 T 림프구 반응이 유도되어 종양 성장 및 종양 전이가 억제되는 것을 확인하였으므로, 상기 OLFM4 단백질 또는 세포투과 펩타이드가 접합된 OLFM4 단백질이 탑재된 수지상세포에 제시되는 OLFM4 단백질을 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구를 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이 또는 침팬치를 포함하지만 이로 제한되지 않은 다른 포유류, 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 사육되는 동물 및 인간을 포함한 개체 또는 환자에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분뿐만 아니라, 암 세포에 대해 세포독성 T 림프구를 유도하는 능력이 있는 다른 펩타이드, 상기 다른 펩타이드를 암호화하는 다른 유전자, 상기 다른 펩타이드들을 제시하는 다른 세포를 포함할 수 있다. 여기서, 암세포에 대해 세포독성 T 림프구를 유도하는 능력을 가지는 다른 펩타이드들은 암 특이적 항원(예를 들어, 동정된 TAA)에 의해 예시가 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분의 항종양적 효과를 억제하지 않는 한, 필요하다면 선택적으로 다른 치료적 물질을 유효성분으로서 포함할 수 있다. 예를 들면, 제제(formulation)는 항염증적 물질, 진통제, 화학요법 및 그와 같은 종류의 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 유효성분은 하나 또는 그 이상의 다른 치료적 물질과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소 투여일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물의 양은, 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법, 등등에 알맞게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은
하기 단계 중 하나를 포함하는 OLFM4 특이적 세포독성 T 림프구 유도성이 있는 항원-제시 세포를 유도하는 방법을 제공한다:
(1) 항원-제시 세포와 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 접촉하는 단계; 또는
(2) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 암호화하는 유전자를 항원-제시 세포로 도입하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 항원-제시 세포는 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내(in vivo)에서 유도될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (1)에서 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (2)에서 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합된 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다.
본 발명에서, 상기 세포투과 펩타이드는, GRKKRRQRRRPPQ(Tat, 서열번호 6), RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan, 서열번호 7), KLALKLALKALKAALKLA(amphipathic peptide, 서열번호 8), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1, 서열번호 9), PLILLRLLRGQF(Pept1, 서열번호 10), PLIYLRLLRGQF(Pept2, 서열번호 11), KLWMRWYSPTTRRYG(IVV-14, 서열번호 12), MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV(Ig(v), 서열번호 13), LLIILRRRIRKQAHAHSK(pVEC, 서열번호 14), RRIPNRRPRR(HRSV, 서열번호 15), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(VP22, 서열번호 16), YARVRRRGPRR(Hph-1, 서열번호 17), RRRRRRRRRRR(R11, 서열번호 18), RRRRRRRRR(R9, 서열번호 19), AANLLPNLLAAP(MTM, 서열번호 20) 또는 AAVALLPAVLLALLAP(Signal sequence based peptide, 서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있고, 보다 구체적으로 RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 OLFM4 단백질 또는 세포투과 펩타이드로 ANTP가 접합된 단백질과 수시상세포를 접촉하여, 상기 OLFM4 단백질 및 상기 ANTP가 접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포를 제작하였다. 또한, 상기 제작한 수지상세포에 의해 OLFM4 과발현 종양-특이적 T 림프구 증식 및 세포독성 T 림프구 반응이 유도되어 종양 성장 및 종양 전이가 억제되는 것을 확인하였으므로, 상기 방법으로 유도된 OLFM4 특이적 세포독성 T 림프구 유도성이 있는 항원-제시 세포를 암의 면역치료에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> OLFM4(olfactomedin 4) 또는 ANTP(antennapedia peptide)-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 제조
<1-1> OLFM4(olfactomedin 4) 또는 ANTP(antennapedia peptide)-접합된 OLFM4 재조합 단백질 제조
인간 OLFM4(olfactomedin 4) 또는 ANTP(antennapedia peptide)-접합된 인간 OLFM4 재조합 단백질을 하기와 같이 제조하였다.
구체적으로, 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 인간 OLFM4(hOLFM4) 단백질 및 상기 hOLFM4에 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 ANTP(antennapedia peptide)가 접합된 ANTP-접합된 hOLFM4 단백질을 각각 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 클로닝하였다. hOLFM4 cDNA를 Origene Technologies, Inc(Rockville, MD)에서 구입하였다. hOLFM4 단백질을 코딩하는 유전자는, hOLFM4 cDNA를 주형으로 하여 1084 내지 1626의 뉴클레오타이드 서열(GeneBank accession No.NM_00641834)에 상응하는 hOLFM4의 N-말단 DNA 단편에 대한 센스 프라이머(서열번호 3) 5'-tccgccgctagcggtacagcagtttacaac-3' (밑줄: NheI 사이트) 및 안티센스 프라이머(서열번호 4) 5'-tccgccctcgagctggggcttctgcaagac-3' (밑줄: XhoI 사이트)를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 또한, ANTP-접합된 hOFLM4 단백질을 코딩하는 유전자는, hOLFM4 cDNA를 주형으로 하여 상기 hOLFM4의 N-말단 DNA 단편에 대한 센스 프라이머에 ANTP를 코딩하는 유전자 서열이 포함된 센스 프라이머(서열번호 5) 5'-gttgctagc(CGT CAG ATC AAG ATC TGG TTC CAG AAT CGA CGC ATG AAG TGG AAG AAG GGC AGC GGC GGC)ggtacagcagtttacaac-3' (밑줄: XhoI 사이트, 괄호: ANTP를 코딩하는 유전자 서열) 및 안티센스 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 생성된 PCR 산물들을 NheI 및 XhoI 제한효소(New England Biolabs, Ipswich, MA)로 분해한 후 겔 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 NheI/XhoI-분해 pET-28a(+) 벡터(Novagen, Darmstadt, Germany)에 각각 클로닝 하여, pET-hOLFM4 컨스트럭트 및 pET-ANTP-hOLFM4 컨스트럭트를 제작하였다. pET-ANTP-hOLFM4의 모식도는 도 1에 나타내었다. 상기 컨스트럭트를 E. coli DH5α (Real Biotech Corp., Taipei, Taiwan)에 표준 열-충격 절차를 통해 형질전환하고, 30 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin, Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 선별하였다.
hOLFM4 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해, 상기에서 선별한 pET-hOLFM4 및 pET-ANTP-hOLFM4 컨스트럭트 각각을 E.coli Rosetta2(DE3) 균주(Novagen)에 형질전환하고, 30 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 그 다음, 37℃에서 4시간 동안 0.5 mM IPTG(isopropyl β-D-thiogalactoside, Sigma-Aldrich)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 4시간 후 박테리아 세포를 1000×g에서 10분 동안 원심분리하여 회수하고, 평형화(equilibration) 완충액(50 mM 인산나트륨, 300 mM 염화나트륨, 6 M 구아니딘-염산염, pH 7.0)에 재현탁하였다. 그 후, 라이소자임(lysozyme)을 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 초음파 처리하여 세포를 파괴하였다. 초음파 처리한 용해물을 1600 ×g, 4℃ 조건에서 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 평형화 완충액으로 미리 평형화시킨 TALON Metal Affinity 수지(Clontech)에 처리하였다. 그 다음, TALON 수지에 결합된 his-태그된 단백질을 용출 완충액(45 mM 인산나트륨, 5.4 M 구아니딘-염산염, 270 mM 염화나트륨, 150 mM 이미다졸)으로 용출하였다. 정제된 단백질을 용출 완충액으로 연속적 투석하여 이미다졸, 구아니딘-염산염 및 잔류염을 제거하였다.
상기 정제된 단백질의 동일성(identity) 및 순도를 확인하기 위하여, 웨스턴블럿(도 2a) 및 쿠마시 블루 염색(도 2b)을 수행하였다.
구체적으로, IPTG 처리 전/후의 전체 박테리아 세포 용해물을 10% SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 분리하여, PVDF 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)에 옮겼다. 그 다음, 멤브레인은 5% 무-지방 밀크 (BD, San Jose, CA)가 포함된 TBST (20 mM Tris-Cl (pH 7.6), 100 mM NaCl 및 0.05 % Tween-20)로 블로킹한 후, 1차 항체로 토끼 항-OLFM4 다클론 항체(Abcam, Cambridge, UK) 또는 마우스 항-His-Tag 단일클론 항체(clone 27E8, Cell signaling, Danvers, MA)를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, TBST로 3회 세척하였다. 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 2차 항체로서 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체 (SantaCruz, California, USA)로 반응시키고 세척한 후, ECL 용액(Amersham, Piscataway, NJ) 및 LAS-4000 (FUJIFILM, FL, Miami Beach)을 사용하여 면역 반응성 밴드를 검출하였다(도 2a). 또한, 상기 정제된 단백질을 10% SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 분리한 후, 쿠마시 블루 염색을 수행하여 밴드를 검출하였다(도 2b).
그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 정제된 단백질이 각각 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 hOLFM4 재조합 단백질(24.1 kDa) 및 상기 hOLFM4에 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 ANTP-접합된 hOLFM4(ANTP-hOLFM4) 재조합 단백질(26.5 kDa)임을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
<1-2> 골수-유래 수지상세포(dendritic cell) 배양
6 내지 10주령 된 C57BL/6 마우스의 골수(bone marrow, BM)로부터 수지상세포(dendritic cell, DC)를 획득하였다.
구체적으로, C57BL/6 마우스는 서울대학교(SNU) 의과대학 동물자원센터 (Center for Animal Resource Development)에서 구입하였다. 동물실험은 SNU 동물복지위원회 (SNU animal welfare committee, IACUC # SNU-140707-1-1)의 승인을 받아 수행하였다. 무혈청 배지를 이용하여 6 내지 10주령 된 C57BL/6 마우스의 대퇴골 및 경골의 골수로부터 골수세포를 채취하였다. 채취한 골수세포의 단일 세포 현탁액을 nylon cell strainer(40-um Nylon mesh: BD)를 통해 여과하고, 완전한 RPMI1640 배지(재조합 마우스 GM-CSF(recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, 10 ng/㎖) 및 마우스 IL-4(interleukin-4, 10 ng/㎖), 페니실린(penicillin, 100 units/㎖), 스트렙토마이신(streptomycin, 100 units/㎖) 및 β-ME(β-mercaptoethanol)가 첨가된 RPMI1640 배지)로 2번 세척하고, 완전한 RPMI 1640 배지 2 ㎖가 포함된 24-웰 플레이트에 1 × 106 세포 농도로 접종한 후, 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 배양액의 절반을 6일 동안 같은 양의 RPMI1640 배지로 교체하였다. 배양 6일째의 수지상세포를 사용하였다.
<1-3> OLFM4 또는 ANTP-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포 제조
상기 실시예 <1-2>의 수지상세포 배양 6일째에 배양액 1 ㎖를 제거하고 상기 실시예 <1-1>에서 정제한 hOLFM4 또는 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질을 10, 30, 50 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 후, 5% CO2, 37℃ 조건에서 1시간 동안 배양하여, hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4]) 또는 ANTP-접합된 hOLFM 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4])를 제조하였다.
또한, 상기 수지상세포의 단백질 전이 효율을 FACS 분석을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, FACS 분석은 다음과 같이 수행하였다. 상기 수지상세포를 차가운 FACS(fluorescence activated cell sorter) 완충액(1% 소혈청 알부민(Hyclone, GE Healthcare, USA) 및 1 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, Gibco invitrogen)을 함유하는 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, pH 7.2)로 세척하고, 울트라-블록 용액(ultra-block solution ; 10% 랫트 혈청, 10% 햄스터 혈청, 10% 마우스 혈청 및 10 ㎍/㎖ 2.42G2 단일클로 항체 (Gibco Invitrogen))으로 30분간 얼음 위에서 차단하였다. 세척 후, 수지상세포를 얼음 위에서 30분 동안 고정/투과 안정화 용액(Fixation/Permeabilization solution, BD Biosciences)으로 고정 및 투과하고, 1 x Perm/Wash 완충액(BD Biosciences)으로 2회 세척한 다음, 항-hOLFM4 항체(Abcam, Cambridge, UK)와 반응시켰다. 항-토끼 lgG-PE 항체(BD Biosciences)를 2차 항체로 사용하였다. 이후, 세포를 FACS LSR Fortesa cytometry (BD Biosciences, Mountain View, CA)로 분석하였다(도 3a). 또한, 수지상세포의 성숙 마커로 보조자극인자(co-stimulatory molecule) CD40, CD86, CD80, I-Ab를 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS 분석을 수행하여 확인하였다. 이 때 1차 항체로 항-CD40 항체, 항-CD86 항체, 항-CD80 항체, 항-I-Ab 항체를 사용하였다(도 3c).
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, hOLFM4 재조합 단백질의 농도가 10 ㎍/㎖에서 50 ㎍/㎖로 증가할수록 %OLFM4pos DC가 증가하고, ANTP-hOLFM4 재조합 단백질의 농도가 10 ㎍/㎖에서 50 ㎍/㎖로 증가할수록 %OLFM4pos DC가 보다 더 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 50 ㎍/㎖의 hOLFM4 및 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 각각 탑재되었을 때, 탑재 효율이 각각 11%, 93%로 나타나, hOLFM4 재조합 단백질보다 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질의 탑재 효율이 우수함을 알 수 있다(도 3a). 공초점 레이저 현미경 분석 결과, 형질도입 효능은 hOLFM4 및 ANTP-hOLFM4 사이에 크게 비교되었다(도 3b). ANTP-hOLFM4 형질도입 효능이 전달체가 없는 hOLFM4보다 훨씬 큰 것을 확인하였다.
또한, 도 3c에 나타낸 바와 같이, DCs [hOLFM4] 및 DCs [ANTP-hOLFM4]는 성숙 마커의 발현에서 차이를 보이지 않음을 확인하였다(도 3c).
<실시예 2> OLFM4 과발현 종양 모델 제조
hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델은 하기와 같이 제조하였다.
구체적으로, 루시퍼라아제 리포터를 포함하고 hOLFM4를 과발현하는 B16F10 흑색종 세포를 제조하기 위하여 루시퍼라아제 리포터 렌티 바이러스 파티클(RediFect Red-FLuc-Puro)은 Perkin-Elmer(Boston, MA)에서 획득하고, 도 4의 모식도와 같이 hOLFM4 유전자 발현을 위한 플라스미드(pcDNA3.0puro-hOLFM4)를 제작하였다. 그 다음, 6-웰 세포배양 플레이트에서 B16F10 마우스 흑색종 세포에 RediFect Red-FLuc-Puro를 감염시키고, pcDNA3.0-puro-hOLFM4를 형질감염시킨 후, 완전한 성장 배지에서 퓨로마이신(puromycin, Gibco Invitrogen)을 첨가하여 B16F10-luc2-hOlfm4 세포주를 선별하였다. B16F10-luc2-hOlfm4 세포주를 10% 열-불활성화 소태아혈청(FBS, Gibco Invitrogen, Grand Island, NY), 1 ㎍/㎖ 퓨로마이신, 100 unit/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco Invitrogen) 및 2 mM L-글루타민(Welgene Inc)을 첨가한 완전한 DMEM 배지(DMEM Dulbecco's Modified Eagle, Welgene Inc., Daegu)로 배양 및 유지하였다. 그 다음, 6 주령의 B6 마우스의 오른쪽 옆구리에 상기 B16F10-luc2-hOLFM4 세포(1x106)를 주사하여 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델을 제조하였다.
한편, B16 마우스 흑색종 세포는 정맥내(i.v.) 주입시 폐에 종양 결절을 형성하는 것으로 알려져 있다. 이에 폐전이를 유발하기 위해 6 주령의 B6 마우스에 상기 B16F10-Luc2-hOLFM4 세포를 100 μL PBS (Ca2+ 또는 Mg2+ 없이) 중 4 x 105 세포수로 정맥내 주사하여 hOLFM4 과발현 종양 전이 마우스 모델을 제조하였다.
<실시예 3> 종양 성장에서 OLFM4 또는 ANTP-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포의 효과
상기 <실시예 2>에서 제조한 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델에 상기 실시예 <1-3>의 hOLFM4 또는 ANTP-접합된 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포를 백신접종한 후 종양 성장을 확인하였다.
구체적으로, 도 5의 모식도와 같이 상기 <실시예 2>의 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델에 B16F10-luc2-hOLFM4 세포 주사 후 8일, 12일 및 16일째에 마우스의 꼬리를 통해 상기 실시예 <1-3>에서 제조한, 50 ㎍/㎖의 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스) 또는 50 ㎍/㎖의 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스)를 백신접종하고, 4주 동안 관찰하였다. 대조군 마우스는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종하였다. 5마리의 마우스를 각 그룹에 사용하였다.
그 다음, 종양 성장을 확인하기 위하여, 종양 크기(mm3)를 가장 긴 길이와 가장 짧은 길이를 측정하여 계산하였다(= 0.5 x 가장 긴 길이 x 가장 짧은 길이2)(도 6a). 또한, 4주 후 d-luciferin(150 mg/kg)을 복강내 투여하고 IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA)을 사용하여 관찰하였다(도 6b).
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, DCs [PBS]를 백신접종한 경우와 비교하여 DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우 종양 크기 및 루시퍼라제 발광이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우를 비교하였을 때, DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우 종양 크기 및 루시퍼라제 발광이 보다 더 감소하는 것을 확인하였다(도 6a 및 도 6b).
상기의 결과를 통해 DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종할 경우 종양 성장이 억제되고, DCs [ANTP-hOLFM4]가 보다 우수한 종양 성장 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 4> 종양 전이에서 OLFM4 또는 ANTP-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포의 효과
상기 <실시예 2>에서 제조한 hOLFM4 과발현 종양 전이 마우스 모델에 상기 실시예 <1-3>의 hOLFM4 또는 ANTP-접합된 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포를 백신접종한 후 종양 전이를 확인하였다.
구체적으로, 도 7의 모식도와 같이 상기 <실시예 2>의 hOLFM4 과발현 종양 전이 마우스 모델에 B16F10-luc2-hOLFM4 세포 정맥내 주사 후 2, 5 및 8일째에 마우스의 꼬리를 통해 상기 실시예 <1-3>에서 제조한, 50 ㎍/㎖의 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스) 또는 50 ㎍/㎖의 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스)를 백신접종하였다. 대조군 마우스는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종하였다. 그 다음, 12일 및 18일째에, 마우스에 d-luciferin(150 mg/kg)을 복강내 투여하고 IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA)을 사용하여 생체 영상 검사를 수행하였다(도 8a). 생체 영상 검사 후, 폐 조직을 획득하고 전이된 검은 색 결절을 육안으로 계수하였다(도 8b). 또한, 조직을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 슬라이드를 Ariol SL-50 자동화 스캐닝 시스템(Genetix Ltd. London, UK)으로 스캔하여 종양 크기를 계산하였다(도 8c).
그 결과, 도 8a 내지 도 8c에 나타낸 바와 같이, DCs [PBS]를 백신접종한 마우스 군과 비교하여, DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 마우스 군의 폐 부위에서 루시퍼라제 발광이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우를 비교하였을 때, DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우 형광 방출량이 보다 더 감소하는 것을 확인하였다(도 8a). 폐의 전이성 결절의 수의 경우, DCs [PBS]를 백신접종한 마우스 군(67 ± 14.84)에 비해 DCs [hOLFM4]를 백신접종한 마우스 군(38 ± 11.31)에서 다소 감소하는 것을 확인하였다. DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 마우스 군에서는 폐의 전이성 결절의 수가 3 ± 2.12로 나타나, DCs [PBS]를 백신접종한 마우스 군에 비해 유의적으로 그 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 8b). 아울러, 폐 조직의 H&E 염색을 통해 DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우 폐 전이성 종양 부위가 DCs [PBS]를 백신접종한 경우에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히, DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우 폐 전이성 종양 부위의 감소 정도가 현저히 높은 것을 확인하였다(도 8c).
상기의 결과를 통해 DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종할 경우 종양 전이가 억제되고, DCs [ANTP-hOLFM4]가 보다 우수한 종양 전이 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실시예 5> OLFM4 또는 ANTP-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포에 의한 OLFM4-특이적 면역 반응 유도 확인
상기 실시예 <1-3>의 hOLFM4 또는 ANTP-접합된 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포에 의해 hOLMF4-특이적 면역 반응이 유도되는지 알아보기 위해, 림프구 증식 분석 및 IFN-γ ELISPOT 분석(Enxyme-linked ImmunoSpot assay)을 수행하였다.
구체적으로, 림프구 증식 분석을 위해, 상기 <실시예 2>의 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델에 B16F10-luc2-hOLFM4 세포 주사 후 8일, 12일 및 16일째에 마우스의 꼬리를 통해 상기 실시예 <1-3>에서 제조한, 50 ㎍/㎖의 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스) 또는 50 ㎍/㎖의 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스)를 백신접종한 후 10일째에, 사타구니 림프절에서 림프구를 회수하였다. 대조군 마우스는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종하였다. 그 다음, 상기 회수한 림프구를 Ig 및 항-Ig로 코팅된 유리 비드를 함유하는 마우스 CD3+ T 세포 농축 칼럼(R & D Systems, Minneapolis, MN)에 로딩하였다. 결과 컬럼 용출액은 고도로 농축된 T 세포 집단(83 ~ 90 %)이 함유되었다. 농축된 T 세포를 CFSE(5(6)-carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester, Invitrogen, CA)로 다음과 같이 염색하였다. 같은 부피의 1μM CFSE를 세포 현탁액에 첨가하고 37℃, 암 조건에서 10분 동안 반응시켰다. CFSE 반응을 퀀칭(quenching) 하기 위해, 2배량의 차가운 FBS를 첨가하였다. 샘플을 다시 볼텍싱(vortexing) 하고, 실온, 암 조건에서 5분 동안 반응시켰다. 세포 현탁액을 10% FBS가 첨가된 25 mM HEPES를 함유하는 따뜻한 RPMI 1640 배지로 2회 세척하여 과량의 CFSE를 제거하였다. 그 다음, 세포를 10% 열-불활성화 FBS, 50 nM β-ME, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신(gentamicin, Invitrogen), 100 units 페니실린-스트렙토 마이신 및 10 ㎍/㎖의 상기 <실시예 1>에서 제작한 hOLFM4 단백질이 포함된 RPMI1640 배지에서 3일 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 항-CD8 항체(BD Biosciences)와 반응시킨 후. CD8+ T 세포의 CFSE희석 정도를 FACS LSR Fortesa (BD Biosciences, Mountain View, CA)로 분석하였다(도 9a).
또한, IFN-γ ELISPOT 분석을 위해 항-마우스 IFN-γ 항체(0.3 ㎍/100 ㎕/웰, BD Biosciences, Mountain View, CA)를 4℃에서 하룻밤 동안 96-웰 NC(nitrocellulose) 플레이트(Millipore, Burlington, MA)에 코팅하였다. 상기 웰을 세척하고 완전한 RPMI 1640 배지로 37℃에서 2시간 동안 블로킹하였다. 또한, 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 실시예 <1-3>에서 제조한, DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 후 10일째에, 비장세포(splenocyte)를 회수하였다. 그 다음, 상기 비장세포를 상기 항-마우스 IFN-γ 항체(5 × 105 세포/웰)가 코팅된 NC 플레이트에서 10 ㎍/㎖ hOLFM4 단백질과 함께 배양하였다. 5% CO2, 37℃ 조건에서 3일 동안 배양한 후, 0.05 % Tween 20(Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany)을 포함하는 PBS로 6번 세척하여 ELISPOT 플레이트에서 세포를 제거하였다. 그 다음, NC 플레이트를 항 IFN-γ 비오티닐화된 항체 (0.5 μg/100 ㎕/웰, BD Biosciences)와 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. PBS로 6회 세척한 후, 스트렙트아비딘-알칼라인 포스파타아제(streptavidin-alkaline phosphatase, BD Biosciences)를 첨가하고(100 ㎕/웰), 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS로 6회 세척한 후, BCIP/NBT 기질(Sigma-Aldrich)로 실온에서 30분 동안 반응하였다. 흐르는 수돗물로 세척하여 발색을 중단하고 실온에서 하룻밤 동안 건조시킨 후, ELISPOT reader(AID, GmbH, Germany)가 장착된 자동화된 이미지 분석 시스템을 사용하여 착색된 스폿을 계수하였다(도 9b).
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 시험관 내에서 hOLFM4 단백질로 DCs [ANTP-hOLFM4] 백신접종한 마우스의 림프구를 자극했을 때, CD3+CD8+ T 림프구가 유의적으로 증식하는 것을 확인하였다. 반면, 대조군의 경우 시험관 내에서 hOLFM4 단백질로 자극하여도 CD3+CD8+ T 림프구의 증식이 미비함을 확인하였다(도 9a).
또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 시험관 내에서 hOLFM4 단백질로 DCs [ANTP-hOLFM4] 백신접종한 마우스의의 비장세포를 자극했을 때, IFN-γ 생성 비장세포 수가 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인하였다. 반면, 대조군의 경우 시험관 내에서 hOLFM4 단백질로 자극하여도 IFN-γ 생성 비장세포 수가 증가하지 않는 것을 확인하였다(도 9b).
상기의 결과를 통해 DCs [ANTP-hOLFM4] 백신접종에 의해 hOLFM4-특이적 T 림프구가 유도됨을 확인함으로써, DCs [ANTP-hOLFM4]가 hOLFM4-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 6> OLFM4 또는 ANTP-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포에 의해 유도된 OLFM4-특이적 세포독성 T 림프구의 세포독성 확인
상기 실시예 <1-3>의 hOLFM4 또는 ANTP-접합된 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포에 의해 유도된 hOLMF4-특이적 세포독성 T 림프구를 이용하여 세포독성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>의 hOLFM4 과발현 종양 마우스 모델에 B16F10-luc2-hOLFM4 세포 주사 후 8일, 12일 및 16일째에 마우스의 꼬리를 통해 상기 실시예 <1-3>에서 제조한, 50 ㎍/㎖의 hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스) 또는 50 ㎍/㎖의 ANTP-hOLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포(DCs [ANTP-hOLFM4], 100 ㎕ PBS 중의 1x106 세포/마우스)를 백신접종한 후 14일째에, 사타구니 림프절에서 림프구를 회수하였다. 대조군 마우스는 PBS를 처리한 수지상세포(DCs [PBS])를 백신접종하였다. 상기 회수한 림프구를 이용하여 OLFM4-특이적 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성을 다음과 같이 분석하였다. 상기 <실시예 5>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 표적 세포(target cell)를 CFSE로 염색하였다. 표적 세포로 B16F10-Luc2-hOLFM4 세포는 강하게 염색하고(5 μM, CFSEhigh), B16F10 세포는 약하게 염색하였다(0.5 μM, CFSElow). 그 다음, CFSEhigh-표지된 표적 세포와 CFSElow-표지된 표적 세포를 1 : 1의 비율로 혼합하였다. 효과 세포(effector cell)로 상기에서 회수한 림프구를 10 ㎍/㎖의 hOLFM4 단백질로 3일 동안 시험관 내에서 활성화하였다. 활성화된 효과 세포와 상기 혼합한 표적 세포를 1 : 1, 20 : 1 또는 40 : 1의 비율로 혼합하였다. 16시간 후, 표적 세포를 FACS LSR Fortesa(BD Biosciences, Mountain View, CA)로 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 시험관 내에서 hOLFM4 단백질로 DCs [hOLFM4] 또는 DCs [ANTP-hOLFM4] 백신접종한 마우스의 림프구를 자극했을 때, hOLFM4-특이적 세포독성 T 림프구가 유도되고, 상기 유도된 hOLFM4-특이적 세포독성 T 림프구가 B16F10-Luc2-hOLFM4 표적 세포를 유의적으로 살해하는 것을 확인하였다. 또한, DCs [hOLFM4]에 비해 DCs [ANTP-hOLFM4]를 백신접종한 경우, hOLFM4-특이적 세포독성 T 림프구에 의한 살해 정도가 보다 높게 나타나므로, DCs [ANTP-hOLFM4]에 의한 hOLFM4-특이적 세포독성 T 림프구 유도 및 이의 세포 독성 효과가 보다 우수함을 확인하였다(도 10).
상기 결과를 통해 OLFM4 단백질이 OLFM4 과발현 종양의 종양 줄기세포 항원으로, 상기 OLFM4 또는 ANTP-접합된 OLFM4 재조합 단백질이 탑재된 수지상세포에 의해 OLFM4 과발현 종양-특이적 T 림프구 증식 및 세포독성 T 림프구 반응을 유도하여 종양 성장 및 종양 전이를 억제하는 것을 확인하였으므로, 상기 OLFM4 단백질 또는 상기 단백질이 탑재된 수지상세포 또는 이로부터 유도되는 OLFM4-특이적 세포독성 T 림프구를 암의 면역치료에 이용할 수 있다.
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Claims (19)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4(olfactomedin 4) 단백질을 포함하는, 항원-제시 세포.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합된 것을 특징으로 하는, 항원-제시 세포.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항원-제시 세포는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질이 탑재되거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 항원-제시 세포.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항원-제시 세포는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합된 단백질이 탑재되거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합된 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 항원-제시 세포.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항원-제시 세포는 수지상세포, 단핵세포, 대식세포, 랑겔한스 세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포 및 γδ T(gamma delta T) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항원-제시 세포.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 CD4 T 세포, CD8 T 세포, B 세포 및 γδ T(gamma delta T) 세포는 미경험(naive) 상태, 활성화 상태, 또는 증폭(expansione)된 상태인 것을 특징으로 하는, 항원-제시 세포.
  7. 제 2항에 있어서,
    상기 세포투과 펩타이드는, GRKKRRQRRRPPQ(Tat, 서열번호 6), RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan, 서열번호 7), KLALKLALKALKAALKLA(amphipathic peptide, 서열번호 8), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1, 서열번호 9), PLILLRLLRGQF(Pept1, 서열번호 10), PLIYLRLLRGQF(Pept2, 서열번호 11), KLWMRWYSPTTRRYG(IVV-14, 서열번호 12), MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV(Ig(v), 서열번호 13), LLIILRRRIRKQAHAHSK(pVEC, 서열번호 14), RRIPNRRPRR(HRSV, 서열번호 15), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(VP22, 서열번호 16), YARVRRRGPRR(Hph-1, 서열번호 17), RRRRRRRRRRR(R11, 서열번호 18), RRRRRRRRR(R9, 서열번호 19), AANLLPNLLAAP(MTM, 서열번호 20) 및 AAVALLPAVLLALLAP(Signal sequence based peptide, 서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항원-제시 세포.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 항원-제시 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 항원-제시 세포는 조성물을 투여받을 개체의 골수 또는 말초혈액으로부터 선별 배양된 단핵구로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 암은 OLFM4를 과발현하는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 암은 위암, 췌장암, 대장암, 폐암, 유방암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광암, 신장암, 자궁경부암, 흑색종, 림프종, 신경교종, 교모세포종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 항원-제시 세포를 유효성분으로 포함하는, 암 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 항원-제시 세포로부터 유도된 OLFM4 특이적 세포독성 T 림프구.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 세포독성 T 림프구는 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포독성 T 림프구.
  15. 제 13항의 세포독성 T 림프구를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 하기 단계 중 하나를 포함하는 OLFM4 특이적 세포독성 T 림프구 유도성이 있는 항원-제시 세포를 유도하는 방법:
    (1) 항원-제시 세포와 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4 단백질을 접촉하는 단계; 및
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 OLFM4(olfactomedin 4) 단백질을 암호화하는 유전자를 항원-제시 세포로 도입하는 단계.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합된 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 단계 (2)에서 OLFM4 단백질에 추가로 세포투과 펩타이드가 접합된 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 16항 또는 제 17항에 있어서,
    상기 세포투과 펩타이드는, GRKKRRQRRRPPQ(Tat, 서열번호 6), RQIKIWFQNRRMKWKK(ANTP, 서열번호 2), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(Transportan, 서열번호 7), KLALKLALKALKAALKLA(amphipathic peptide, 서열번호 8), KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1, 서열번호 9), PLILLRLLRGQF(Pept1, 서열번호 10), PLIYLRLLRGQF(Pept2, 서열번호 11), KLWMRWYSPTTRRYG(IVV-14, 서열번호 12), MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV(Ig(v), 서열번호 13), LLIILRRRIRKQAHAHSK(pVEC, 서열번호 14), RRIPNRRPRR(HRSV, 서열번호 15), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE(VP22, 서열번호 16), YARVRRRGPRR(Hph-1, 서열번호 17), RRRRRRRRRRR(R11, 서열번호 18), RRRRRRRRR(R9, 서열번호 19), AANLLPNLLAAP(MTM, 서열번호 20) 및 AAVALLPAVLLALLAP(Signal sequence based peptide, 서열번호 21)의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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