KR100581508B1

KR100581508B1 - 종양항원 펩티드 유도체

Info

Publication number: KR100581508B1
Application number: KR1020007006147A
Authority: KR
Inventors: 교고 이또; 시게끼 시찌조; 야스히사 이마이
Original assignee: 가부시키가이샤 그린 펩티드
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 1998-12-02
Publication date: 2006-05-22
Also published as: EP1055684A1; NZ504938A; AU748250B2; CN1284083A; KR20010015864A; WO1999029715A1; TW518340B; EP1055684A4; US6555652B1; CA2312289A1; AU1350499A

Abstract

1 내지 여러 아미노산 잔기를 변경시켜 아미노산 서열 Glu Tyr Arg Gly Phe Thr Gln Asp Phe (서열번호 3)으로부터 유래한 전체 또는 이의 일부 아미노산 서열을 포함하고 HLA-A24 항원에 결합할 수 있어 세포독성 T세포에 의해 인식되는 종양 항원 펩티드 유도체; 종양의 치료, 예방 및 진단시 종양 항원 펩티드 유도체의 용도; 및 활성 성분으로서 이러한 펩티드 유도체를 포함하는 종양의 치료제 또는 예방제.

Description

종양항원 펩티드 유도체 {TUMOR ANTIGEN PEPTIDE DERIVATIVES}

본 발명은, 신규인 종양항원 펩티드 유도체에 관한 것이다.

생체에 의한 종양의 배제에는 면역계, 특히 T 세포가 중요한 역할을 하고 있는 것이 알려져 있다. 실제, 인간의 종양국소에는 종양세포에 대하여 상해활성을 나타내는 임파구의 침윤을 볼 수 있고 (Arch.Surg.,126:200-205, 1990), 멜라노마로부터는 자기의 종양세포를 인식하는 세포상해성 T 세포 (CTL) 가 비교적 용이하게 분리되고 있다 (Immunol.Today,8:385,1987,J.Immunol.,138:989,1987,Int.J.Cancer,52:52-59,1992등). 또, T 세포이입에 의한 멜라노마치료의 임상결과도 종양배제에 있어서의 T 세포의 중요성을 시사하고 있다 (J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994).

CTL 이 자기의 종양세포를 공격할 때의 표적분자에 대해서는 오랫동안 밝혀지지 않았는데, 최근의 면역학 및 분자생물학의 진보에 의해 점점 밝혀지고 있다. 즉 CTL 은, T 세포수용체 (TCR) 를 사용하여, 종양항원펩티드라 불리는 펩티드와 주요조직적합 유전자 복합체 클래스 I 항원 (MHC 클래스 I 항원, 인간의 경우는 HLA 항원이라 칭해짐) 과의 복합체를 인식함으로써, 자기의 종양세포를 공격하고 있는 것이 밝혀졌다.

이 종양항원 펩티드는, 종양에 특유의 단백질, 즉 종양항원 단백질이 세포내에서 합성된 후, 프로테아좀(proteasom)에 의해 세포질내에서 펩티드로 분해됨으로써 생성된다. 한편, 소포체에서 형성된 MHC 클래스 I항원 (HLA 항원) 은, 상기의 종양항원 펩티드와 결합하고, 시스골지를 거쳐 성숙측의 트랜스골지로 이동하여, 세포표면에 옮겨져 항원제시된다. 이 항원제시된 복합체를 종양특이적인 CTL 이 인식하여, 세포상해작용이나 림포카인의 생산을 통하여 항종양효과를 나타낸다 (임상면역, 27(9):1034-1042, 1995). 이와 같은 일련의 작용의 해명에 따라, 종양항원 단백질 또는 종양항원 펩티드를 소위 암백신으로 이용함으로써, 종양환자의 체내의 종양특이적인 CTL 을 증강시켜, 종양을 치료하는 것이 가능해졌다.

이 종양항원단백질로서는, 1991년에, T.Boon 등이 처음으로 MAGE 로 명명한 단백질을 인간멜라노마세포로부터 동정하고 (Science, 254:1643-1647,1991), 또 그 후, 약간의 종양항원단백질이 추가로 멜라노마세포로부터 동정되고 있다.

현재까지 동정된 종양항원 단백질은, T.Boon 등의 총설 (J.Exp.Med.,183,725-729,1996) 에 기술되어 있는 바와 같이, 이하의 4 개의 카테고리로 나눌 수 있다.

첫번째의 카테고리에 포함되는 종양항원 단백질은, 정상조직에서는 정소에서만 발현하고 있고, 종양조직에서는 멜라노마, 두경부암, 비소세포성폐암, 방광암 등에 발현을 볼 수 있는 일군의 단백질이다. 이 카테고리의 종양항원 단백질로서는, 상기의 MAGE, 그 12 종류 이상의 유사한 패밀리를 형성하는 단백질군 (J.Exp.Med.,178:489-495,1993), BAGE(Immunity,2:167-175,1995) 및 GAGE (J.Exp.Med,182:689-698,1995) 가 있으며, 모두 멜라노마세포로부터 동정되고 있다.

그러나, 이 카테고리의 종양항원 단백질은, 멜라노마에서는 고발현하고 있는 것도 있지만, 그 외의 종류의 종양에서는 그 종양의 환자중 10% 내지 30% 정도에서만 발현하고 있어, 여러가지 종양의 치료나 진단에 넓게 응용할 수 없다.

두번째의 카테고리에 포함되는 종양항원 단백질은, 정상조직에서는 멜라노사이트, 망막에서만 발현하고 있고, 종양조직에서는 멜라노마에서만 발현을 볼 수 있는 일군의 단백질이다. 이들의 조직특이적인 단백질은 종양세포의 멜라노마에 강도있게 발현하고 있기 때문에, 멜라노마에 특이적인 종양항원 단백질로서 기능하고 있다. 이 카테고리의 종양항원 단백질로서는, 티로시나제 (J.Exp.Med,178:489-495,1993), MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515,1994), gp100(J.Exp.Med.,179:1005-1009, 1994), gp75(J.Exp.Med.,181:799-804,1995) 가 있고, 이들의 유전자는 모두 멜라노마세포로부터 크로닝되어 있다. 또, 별도 Melan-A(J.Exp.Med.,180:35,1994) 가 동정되었으나, MART-1 과 동일한 분자이었다.

그러나, 이 카테고리의 종양항원 단백질은, 멜라노마 이외의 종양에서는 발현되고 있지 않기 때문에, 넓게 종양의 치료나 진단에 응용할 수 없다.

세번째의 카테고리에 포함되는 종양항원 단백질은, 종양특이적인 돌연변이의 결과, CTL 에 인식되는 종양항원 펩티드로서 발현되게 된 일군의 단백질이다. 이 카테고리의 종양항원 단백질로서는, 돌연변이된 CDK4 (Science,269 1281-1284,1995),β-catenin (J.Exp.Med.,183:1185-1192,1996), MUM- 1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:7976-7980,1995) 가 있다. CDK4, β-catenin 은, 하나의 아미노산변이에 의해, 펩티드의 MHC 클래스 I 항원결합친화성이 증가하여, T 세포에 인식되게 된다. MUM-1 에서는, 돌연변이에 의해, 통상은 번역되지않는 인트론부위가 번역됨으로써 발생하는 펩티드가 T 세포에 인식된다. 그러나, 이들의 돌연변이의 빈도는 낮기 때문에, 넓게 종양의 치료나 진단에 응용할 수 없다.

4번째의 카테고리에 포함되는 종양항원 단백질은, 정상조직에도 광범하게 발현하고 있으나, CTL 에 인식되는 단백질로, P15 (J.Immunol, 154:5944-5955,1995) 가 멜라노마세포로부터 동정되고 있다.

지금까지 알려져 있는 종양항원 단백질 또는 종양항원 펩티드의 동정은 이하와 같은 방법으로 이루어져 있다.

먼저, 종양세포 및 이 세포를 공격하는 CTL (통상, 종양세포와 동일한 환자의 임파구로 부터 수립한다) 로 이루어지는 세트를 준비한다. 이어서, 이 세트의 세포를 사용하여 종양항원 펩티드를 직접 동정하거나, 또는 종양항원 단백질을 코드하는 유전자를 결정하여, 대응하는 종양항원 펩티드를 동정한다.

종양항원 펩티드를 직접 동정하는 방법에서는, 종양세포의 MHC 클래스 I 항원에 결합되어 있는 종양항원 펩티드를 산성조건하에서 추출하여, 고속액체크로마토그래피로 분리된 여러가지의 펩티드를, MHC 클래스 I 항원을 발현하고 있으나 종양항원 단백질을 발현하고 있지않은 세포 (예를 들면, 동일 환자의 B 세포등) 에 펄스하여, CTL 의 반응을 조사함으로써, 종양항원 펩티드를 동정하고, 다시 매스스펙트로메트리 등을 사용하여 서열을 결정한다. 이 방법에 의해, 멜라노마세포로부터 gp100 과 동일분자의 Pmel17 유래의 종양항원 펩티드가 동정되었다 (Science,264:716-719, 1994).

종양항원 단백질을 코드하는 유전자를 결정하여 다시 그 대응하는 종양항원 펩티드를 동정하는 방법으로서는, 분자생물학적 수법을 사용하여 종양항원 단백질을 코드하는 유전자를 클로닝하는 방법이 있다. 종양세포로부터 cDNA 를 조제하여, 그 cDNA 를 종양항원 단백질을 발현하고 있지않은 세포 (예를 들면 COS 세포등) 에 MHC 클래스 I 항원유전자와 함께 트랜스펙트하여 일과적으로 발현시켜, 그에 대하는 CTL 의 반응성에 근거하는 스크리닝을 반복 실시하여, 종양항원 단백질을 코드하는 유전자를 단리한다. 이 방법에 의해, 상기의 MAGE, 티로시나제, MART-1, gp100, gp75 의 유전자가 클로닝되었다.

얻어진 종양항원 유전자의 정보로부터 실제로 MHC 클래스 I 항원 (HLA 항원) 에 결합하여 제시되고 있는 종양항원 펩티드를 추정, 동정하기 위헤서는 다음과 같은 방법을 사용한다. 먼저, PCR, 엑소뉴클레아제, 제한효소 등에 의해 여러가지 크기의 종양항원 단백질을 코드하는 유전자의 프래그먼트를 제작하고, MHC 클래스 I 항원유전자와 함께 종양항원 단백질을 발현하고 있지않은 세포 (예를 들면 COS 세포 등) 에 트랜스펙트하여 일과성으로 발현시켜, CTL 의 반응성에 기인하여 종양항원 펩티드를 포함하는 영역을 한정한다. 이어서, 한정된 영역에 근거하는 여러가지 펩티드를 합성하여, MHC 클래스 I 항원은 발현하고 있으나, 종양항원 단백질을 발현하고 있지않은 세포에 펄스하여, CTL 의 반응을 조사하는 등의 방법으로 종양항원 펩티드를 동정한다 (J.Exp.Med.,176:1453,1992, J.Exp.Med.,179:24,759,1994). 또, HLA-A1, -A0201, -A0205, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602 등의 MHC 의 형에 대해서는, 결합하여 제시되는 펩티드 서열의 규칙성 (모티브) 이 판명되어 있어 (Immunogenetics, 41:178-228,1995), 이를 참고로 하여 종양항원 펩티드의 후보를 조사하여, 그 펩티드를 합성하여 상기와 동일한 방법으로 확인하는 방법도 사용된다 (Eur.J.Immunol.,24:759,1994, J.Exp.Med.,180:347,1994).

이상과 같은 방법을 사용하여 여러가지 종양항원 단백질 및 종양항원 펩티드의 동정이 실시되어 왔다. 그러나, 상기와 같이 이미 공지된 종양항원 단백질은 모두 한정된 종양에서만 발현하고 있거나, 또는 많은 종류의 종양에서 발현하고 있어도 그 종양의 환자중의 소수에만 발현하고 있기 때문에, 여러가지의 종양의 치료나 진단에 폭넓게 응용할 수 있는 것은 아니다.

본 발명은, 종양의 종류나 대상에 의한 제한이 없고, 넓게 일반적으로 이용할 수 있는 종양항원 펩티드의 유도체를 얻는 것, 특히 발생빈도가 높은 편평상피암 등의 치료나 진단에 폭넓게 응용할 수 있는 종양항원 단백질 및 그 대응하는 종양항원 펩티드 및 그 유도체를 얻는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명은, 멜라노마 이외의 종양, 더욱 상세하세는, 편평상피암 유래의 신규인 종양항원 펩티드 유도체, 또는 이 종양항원 펩티드 유도체를 사용하여 종양을 치료, 예방 또는 진단하기 위한 방법, 조성물, 키트 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 광범한 인간 대상이 보유하고 있는 HLA 항원인 HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드 유도체를 제공하는 것도 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 식도암유래의 편평상피암 세포주 KE-4 (이하, 식도암세포주 KE-4, 또는 간단히 KE-4 라 칭함) 를 수립하고, 또 이 KE-4 에서 발현하는 HLA 항원인 HLA-A2601, HLA-A2402 등에 구속성의 종양항원 펩티드를 인식하는 CTL (이하, KE-4CTL 이라 함) 도 수립하였다 (Cancer.Res.,55:4248-4253, 1995).

이어서, 섬유아세포주 VA-13 세포에, KE-4 로부터 제작한 cDNA 라이브러리의 재조합 플라스미드와 HLA-A2601 cDNA 재조합 플라스미드를 동시에 트랜스펙트하고, 그 트랜스펙턴트에 KE-4CTL 을 작용시켜, KE-4CTL 이 활성화되었는지의 여부를 IFN-γ를 생산량으로 측정함으로써, 신규인 종양항원 단백질을 코드하는 유전자를 스크리닝하였다. 그 결과, 멜라노마 이외의 종양세포로부터, 처음으로, 신규인 종양항원 단백질을 코드하는 신규인 유전자를 클로닝하는 것에 성공하였다. 클로닝된 유전자의 뉴클레오티드서열을 서열번호 : 2 에, 추정의 아미노산서열을 서열번호 : 1 에 나타낸다.

본 발명자들은, 다음에, 상기의 종양항원 단백질의 아미노산서열중, 실제로 종양항원 펩티드로서 기능하는 부분의 동정을 시험하여, HLA-A26, HLA-A24 등에 구속성의 여러가지 종양항원 펩티드부분을 동정하였다.

이 중 HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드로서, 서열번호 : 1 에 기재된 아미노산서열에서의 제 690 위 ∼ 제 698 위의 아미노산서열을 갖는 펩티드 (서열번호 : 3) 를 동정하였다. 이어서, 본 발명자들은, 서열번호 : 3 에 기재된 HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드의 아미노산잔기를 개변하여 여러가지의 펩티드 유도체를 제작하여, 활성의 유무를 측정한 바, 이들의 유도체도 종양항원 펩티드로서의 활성을 갖는 것이 밝혀졌다.

본 발명은, 이상과 같은 발견에 근거하여 완성한 것이다.

즉, 본 발명의 요지는, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 1 ∼ 수개의 아미노산잔기를 개변한 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 세포상해성 T 세포에 의해 인식될 수 있는, 종양항원 펩티드 유도체를 제공하는 것이다.

도 1 은, 식도암세포주 KE-4 로부터 클로닝한 종양항원 단백질을 코드하는 재조합 플라스미드 6DI 의 삽입서열부분을 DNA 프로브로 사용하여, 노던블롯하이브리다이제이션에 의해 여러가지 세포주 (a) 및 여러가지 조직 (b) (심장(heart), 뇌(brain), 태반(placenta), 폐(lung), 간(liver), 골격근 (skeletal muscle), 신장(kidney), 췌장(pancreas), 비장(spleen), 흉선(thymus), 전립선(prostate), 고환(testis), 자궁(uterus), 소장(small intestine), 결장(점막이장)(colon(mucosal lining)), 및 말초혈액백혈구 (peripheral blood leukocyte) 에서의 종양항원 단백질 mRNA 의 발현분포를 조사한 결과를 나타낸 전기영동의 사진이다.

도 1(a) 중, KE-4, KE-3, TE-8 및 TE-9 는 식도암세포주를, Kuma-1 은 두경부암세포주를, HSC-4 는 구강암세포주를, Bec-1 은 B 세포주를, KMG-A 는 담낭암세 포주를, R-27 은 유방암세포주를, KIM-1, KYN-1 및 HAK-3 은 간암세포주를, 그리고 M36 및 M37 은 멜라노마세포주를, 각각 나타낸다. 도 1 로부터, 클론 6DI 에 코드되어 있는 종양항원 단백질의 mRNA 가 각종 암세포 및 정상조직에서 광범하게 발현되고 있는 알 수 있다.

도 2 는, 서열번호 : 5, 서열번호 : 6 및 서열번호 : 7 에 기재된 아미노산서열을 갖는 펩티드의 시험관 내에서의 IFN-γ 생산유도활성을 나타낸 막대 그래프이다. 즉, 상기 펩티드유도체로 HLA-A24 양성의 건강인 말초형 임파구를 자극하고, 종양항원을 발현하고 있는 HLA-A24 양성의 KE-4 세포의 존재하에서, 그 자극된 임파구로부터 생산되는 IFN-γ 량을 측정하였다. 도 2 로부터, 서열번호 : 5, 서열번호 : 6, 서열번호 : 7 의 각 펩티드 유도체에 의해 CTL 이 유도되는 것을 알 수 있다.

본 명세서 중, 본 발명의 「종양항원 펩티드 유도체」란, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 1 또는 그 이상, 바람직하게는 1 ∼ 복수개의 아미노산 잔기를 개변한 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있다는 종양항원 펩티드로서의 활성을 갖는 것을 가르킨다. 여기에서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열을 갖는 펩티드는, HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드로, 서열번호 : 1에 기재된 종양항원 단백질의 아미노산서열의 제 690 위 ∼ 제 698 위에 위치하는 종양항원 펩티드이다.

따라서, 서열번호 : 3 에 기재된 종양항원 펩티드의 아미노산서열의 1 또는 그 이상의 아미노산잔기를 개변한 유도체의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있다는 종양항원 펩티드로서의 활성을 갖는 것은, 모두, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 범주에 포함된다.

본 발명에 있어서, 「HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있다」란, 종양항원 펩티드 유도체가 HLA-A24 항원과 결합하여 복합체를 형성하고, 이와 같은 복합체를 CTL 이 인식할 수 있는 것을 말한다.

본 발명에 있어서 아미노산잔기의 「개변」 이란, 아미노산잔기의 치환, 결실 및/또는 부가를 의미하고, 바람직하게는 아미노산잔기의 치환을 들 수 있다. 이하, 주로 아미노산잔기의 치환에 관하여 구체적으로 설명하는데, 그 설명은 아미노산잔기의 결실 또는 부가에도 적용할 수 있는 것이다.

본 발명의 종양항원 펩티드 유도체는, 예를 들면, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 1 이상, 바람직하게는 1 ∼ 복수개의 아미노산잔기가 다른 아미노산잔기로 치환된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하는 후보펩티드를 합성하여, 이 후보펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체가 CTL 에 의해 인식되는지의 여부를 검정함으로써 동정할 수 있다.

치환되는 아미노산잔기의 수 및 위치는, 종양항원 펩티드로서의 활성이 유지되는 한, 임의이지만, 서열번호 : 3 의 펩티드단편이 9 아미노산잔기이기 때문에, 1 개 내지 복수개의 범위가 바람직하다.

펩티드의 합성

펩티드의 합성은, 통상의 펩티드화학에서 사용되는 방법에 준하여 실시할 수 있다. 이 공지방법으로서는, 문헌 (펩타이드·신세시스 (Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966 ; 더·프로테인즈 (The Proteins), Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976 ; 펩티드합성, 마루젠(주), 1975 ; 펩티드합성의 기초와 실험, 마루젠(주), 1985 ; 의약품의 개발 속 제14권·펩티드합성, 히로가와서점, 1991) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.

HLA항원-구속성의 CTL 에 의한 인식

합성한 후보펩티드가 HLA-A24 항원에 결합하여 CTL 에 의해 인식되는지의 여부는, 예를 들면 이하의 방법으로 조사할 수 있다.

(1) J.Immunol.,154,p2257,1995 에 기재된 방법에 따라, HLA-A24 항원양성의 인간으로부터 말초혈 임파구를 단리하고, 시험관 내에서 후보펩티드를 첨가하여 자극한 경우에, 이 후보펩티드를 펄스한 HLA-A24 양성세포를 특이적으로 인식하는 CTL 이 유도되는지의 여부를 조사한다. 여기에서, CTL 유도의 유무는, 예를 들면, 항원펩티드 제시세포에 반응하여 CTL 이 생산하는 여러가지의 사이토카인 (예를 들면, IFN-γ) 의 양을 효소면역측정법 (ELISA) 등에 의해 측정함으로써 조사할 수 있다. 또는, ⁵¹Cr 로 표지한 항원펩티드 제시세포에 대한 CTL 의 상해성을 측정하는 방법 (⁵¹Cr 릴리스검정, Int.J.Cancer,58:p317,1994) 에 의해서도 조사할 수 있다. 상기 검정에서 사용하는 HLA-A24 양성세포로서는, 식도암세포주 KE-4(FERM BP-5955) 또는 SKG-IIIa 세포 (JCRB 0232) 등의 일반적으로 입수가능한 세포를 들 수 있다.

(2) 또한, HLA-A24 cDNA 발현 플라스미드를 COS-7 세포 (ATCC No.CRL1651) 나 VA-13 세포 (이화학연구소 세포은행) 에 도입하여, 얻어진 세포에 대하여 상기 후보펩티드를 펄스하고,HLA-A24 구속성의 CTL 주인 KE-4CTL (수탁번호 : FERM BP-5954) 를 반응시켜, KE-4CTL 이 생산하는 여러가지의 사이토카인 (예를 들면 IFN-γ) 의 양을 측정함으로써도, 조사할 수 있다 (J.Exp.Med.,187:277, 1998).

이상과 같은 여러가지 검정법의 구체예는, 후술의 참고예의 7, 8 및 실시예 2 에 기재되어 있다.

또한, 종양항원 펩티드 유도체의 HLA-A24 항원에 대한 결합친화성은, 이 유도체와 방사능동위원소로 표지된 표준펩티드 (서열번호 : 3) 와의 HLA항원으로의 결합의 경합저해 검정에 의해, 무세포계에서 용이하게 측정할 수 있다 (R.T.Kubo 외, J.Immunol.,152:3913,1994).

본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 길이는, HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 인식되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 목적으로부터, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체는, 그 자신이 펩티드단편으로서 HLA-A24 항원과 결합하여 항원제시세포표면에 제시될 뿐만아니라, 적당히, 표적세포내에서 단편화되어, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 1 ∼ 여러개의 아미노산잔기가 개변된 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한, HLA-A24 와 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 적당한 길이의 펩티드 단편을 부여할 수 있는 펩티드 유도체를 포함한다.

그 자신이 HLA-A24 항원과 결합하여 제시되는 펩티드 단편으로서는, 8 ∼ 11 아미노산정도가 바람직하다. 즉, 아미노산잔기의 치환에 관련되는 펩티드 유도체의 경우에는, 예를 들면, 1) 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 1 ∼ 복수개의 아미노산잔기가 다른 아미노산잔기로 치환된 아미노산서열을 갖는 9 아미노산의 펩티드 ; 또는, 2) 상기 1) 의 펩티드 전체를 포함하는 10 ∼ 11 아미노산 정도의 길이의 펩티드, 또는 상기 1) 의 펩티드의 일부를 포함하는 약 8 아미노산 정도의 펩티드로, HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식된다는 종양항원 펩티드 활성을 갖는 유도체를 들 수 있다.

본 명세서의 기재에 따라, 서열번호 : 3 의 아미노산서열의 임의의 위치에서 아미노산이 개변된 펩티드를 합성하고, 종양항원 펩티드로서의 활성에 근거하여 목적의 종양항원 펩티드 유도체를 스크리닝하여 얻을 수 있다.

그러나, HLA 항원에 결합하여 제시되는 항원펩티드의 서열에는 규칙성 (모티브) 이 있어, HLA-A24 항원의 경우, 8 ∼ 11 의 아미노산으로 이루어지는 펩티드 중의 N 말단으로부터 2 번째의 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판이고, C 말단의 아미노산이 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 트립토판 또는 메티오닌인 것이 알려져 있다 (Immunogenetics, 41:178,1995, J.Immunol.,152:p3913,1994, J.Immunol.,155:4307,1994). 또, 이와 같은 모티브상 취할 수 있는 아미노산을 유사한 성질을 갖는 아미노산으로 치환하여 얻어지는 유도체도 HLA-A24 항원결합성 펩티드로서 허용될 가능성이 있다.

따라서, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 예로서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열 중, 제 2 위 및/또는 제 9 위 (C 말단) 의 아미노산잔기를 다른 아미노산잔기로 치환한 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식된다는 활성을 갖는 펩티드 유도체를 들 수 있다.

따라서, 본 발명은, 하나의 실시형태로서 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 2 위 및/또는 제 9 위의 아미노산잔기가 다른 아미노산잔기로 치환된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드 유도체를 제공한다.

바람직한 펩티드 유도체에서는, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 2 위 및/또는 제 9 위의 아미노산잔기가 상기 모티브상 알려진 아미노산잔기로 치환되어 있다. 즉 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 2 위의 티로신을 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환하고, 및/또는 제 9 위의 페닐알라닌을 루이신, 이소루이신, 트립토판 또는 메티오닌으로 치환하고 있는 아미노산서열 (서열번호 : 4) 의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 상기 활성을 갖는 종양항원 펩티드 유도체가 바람직하다.

따라서, 다른 실시형태에서는, 본 발명은 서열번호 : 4 에 기재된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드 유도체를 제공한다.

또한, 상기 모티브에 근거하여 아미노산잔기의 치환을 실시한 종양항원 펩티드 유도체의 적합한 예로서는, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 9 위의 페닐알라닌이 트립토판, 루이신, 또는 이소루이신으로 치환된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양항원 펩티드 유도체, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 2 위의 티로신이 페닐알라닌으로 치환된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하는 종양항원 펩티드 유도체, 또는 이들의 치환의 조합에 관련되는 종양항원 펩티드 유도체를 들 수 있다.

따라서, 본 발명은, 바람직한 실시형태로서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 9 위의 페닐알라닌이 트립토판, 루이신, 또는 이소루이신으로 치환된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드 유도체를 제공한다.

본 발명은 또, 다른 바람직한 실시형태로서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 2 위의 티로신이 페닐알라닌으로 치환된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한, HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드 유도체를 제공한다.

본 발명은, 더욱 바람직한 실시형태로서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 9 위의 페닐알라닌이 트립토판, 루이신, 또는 이소루이신으로 치환되어 있고, 또한 제 2 위의 티로신이 페닐알라닌으로 치환되어 있는 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 CTL 에 의해 인식될 수 있는 종양항원 펩티드 유도체도 제공한다.

특히 바람직한 종양항원 펩티드 유도체는, 서열번호 : 5 에 기재된 아미노산서열의 전부 또는 일부를 포함하고 있다.

본 발명의 종양항원 펩티드 유도체는 광범한 인간대상이 보유하고 있는 (예 를 들면, 일본인의 약 60% 가 보유하고 있음) HLA 항원인 HLA-A24 에 결합하여 제시되는 종양항원 펩티드 유도체이다. 따라서, 많은 종양환자에게 일반적으로 적용가능하고, 또한, 발생빈도가 높은 편평상피암 등에 폭넓게 응용가능한 것이기 때문에, 신규인 항종양제로서의 유용성이 기대된다. 또한 편평상피암은 인간의 암에서 가장 많이 볼 수 있는 암의 하나로, 특히 식도암이나 폐암에서의 편평상피암은 현재의 화학요법이나 방사선요법에 비교적 저항성을 나타내는 것이 알려져 있다.

이하에 상세하게 서술하는 바와 같이, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체는 생체 내 및 시험관 내에서 종양의 치료, 예방, 진단 등의 여러가지 목적에 유용하다.

따라서, 본 발명은 또, 본 발명의 상기 종양항원 펩티드 유도체의 적어도 1 종을 유효성분으로서 함유하는 종양의 치료제 또는 예방제를 제공하는 것이다.

종양의 치료 또는 예방을 목적으로 하는 사용에 있어서는, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 적어도 1 종 또는 2 종 이상을 조합하여, 필요하다면 예컨대 다른 종양항원 펩티드 등과 조합하여 환자에게 투여한다. 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제를 HLA-A24 양성으로, 또한 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체가 유래하는 종양항원 단백질에 관하여 양성의 환자에게 투여하면, 항원제시세포의 HLA-A24 항원에 종양항원 펩티드유도체가 고밀도로 제시되어, 제시된 HLA-A24 항원복합체 특이적 CTL 이 증식하여 종양세포를 파괴한다. 그 결과, 환자의 종양을 치료하고, 또는 종양의 증식 또는 전이를 예방할 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체가 유래하는 종양항원 단백질은, 식도암, 폐암 등의 편평상피암 등에 광범하게 발현하고 있으므로, 본 발명의 종양의 치료제 또는 예방제는, 적용범위가 넓은 이점을 갖는다. 또한, 상기 편평상피암은, 화학요법이나 방사선요법에 저항성을 나타내는 것이 많은데, 본 발명의 종양치료제를 병용함으로써, 치료효과를 올리는 것이 가능해진다. 또, 암발생부위를 특정하지 않아도 치료가 가능한 것도 큰 이점이다.

본 발명의 종양항원 펩티드 유도체를 함유하는 종양의 치료제 또는 예방제는, 세포성면역이 효과적으로 성립하도록 어쥬벤트와 함께 투여하거나, 입자상의 제형으로 하여 투여할 수 있다. 어쥬벤트로서는, 문헌 (Clin.Microbiol.Rev.;7:277-289, 1994) 에 기재된 것 등을 적용할 수 있다. 또, 리포솜제제, 직경 수 ㎛ 의 비즈에 결합시킨 입자상의 제제, 리피드를 결합시킨 제제 등 외인성의 항원펩티드 유도체를 HLA 항원으로 효율적으로 항원제시시킬 수 있는 제제 등도 사용된다. 투여방법으로서는, 피내투여, 피하투여, 정맥주사 등을 생각할 수 있다. 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 투여량은, 치료해야하는 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적당히 조정할 수 있으나, 통상적으로, 0.0001 ㎎ ∼ 1000 ㎎, 바람직하게는 0.001 ㎎ ∼ 1000㎎, 보다 바람직하게는 0.1 ㎎ ∼ 10㎎ 이고, 이것을 몇일 내지 몇개월에 1 회 투여하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체를 사용하여 시험관 내에서 항원제시세포를 유도할 수 있고, 그와 같은 세포는 종양의 치료 등에 유용하다.

따라서, 본 발명은, 종양환자에서 유래하는 항원제시능력을 갖는 단리된 세포의 표면에, HLA-A24 항원과 본 발명의 상기 종양항원 펩티드 유도체와의 복합체를 제시시키는 것을 포함하는 항원제시세포를 제공한다.

본 발명은 또, 상기 항원제시세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 종양의 치료제를 제공한다.

여기에서 「항원제시능력을 갖는 세포」란, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체를 제시할 수 있는 HLA-A24 항원을 세포표면에 발현하고 있는 세포이면 특별히 한정되지 않지만, 특히 항원제시능력이 높은 수상(樹狀)세포가 바람직하다.

이와 같은 항원제시세포를 조제하기 위해서는, 종양환자로부터 항원제시능력을 갖는 세포를 단리하고, 이 세포에 본 발명의 항원종양 펩티드 유도체를 체외에서 펄스하여 HLA-A24 항원과 상기 펩티드 유도체와의 복합체를 제작한다 (Cancer Immunol. Immunother.,46:82,1998).

상기 항원제시세포를 유효성분으로 함유하는 종양의 치료제는, 항원제시세포를 안정적으로 유지하게 위해, 생리식염수, 인산완충생리식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여방법으로서는, 정맥내투여, 피하투여, 피내투여를 들 수 있다. 상기의 종양치료제를 환자의 체내로 되돌리면, HLA-A24 양성이면서 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체에서 유래한 종양항원 단백질 양성의 환자의 체내에서 효율적으로 특이적인 CTL 이 유도되어, 종양을 치료하고, 나아가서는 전이를 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체의 시험관 내에서의 이용법으로서, 이하의 양자면역요법에서의 이용을 들 수 있다.

즉, 멜라노마에 있어서는, 환자 본인의 종양내침윤 T 세포를 체외에서 대량으로 배양하여, 이것을 환자에게 되돌리는 양자면역요법에 치료효과가 인정되고 있다 (J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994). 또, 마우스의 멜라노마에 있어서는, 비장세포를 시험관 내에서 종양항원 펩티드 TRP-2 로 자극하여, 종양항원 펩티드에 특이적인 CTL 을 증식시켜, 이 CTL 을 멜라노마 이식 마우스에 투여함으로써, 전이억제를 볼 수 있다 (J.Exp.Med.,185:453,1997). 이것은, 항원제시세포의 HLA 항원과 종양항원 펩티드와의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL 을 시험관 내에서 증식시킨 결과에 근거하는 것이다. 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체를 사용하여, 시험관 내에서 환자의 말초혈임파구를 자극하여 종양특이적 CTL 을 증가시킨 후, 이 CTL 을 환자에게 되돌리는 것을 포함하는 종양의 치료법은 유용하다고 생각된다.

따라서, 본 발명은 또, HLA-A24 항원과 본 발명의 상기 종양항원 펩티드 유도체와의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포상해성 T 세포도 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 세포상해성 T 세포를 유효성분으로 함유하는 종양의 치료제를 제공한다.

이 치료제는, CTL 을 안정하게 유지하게 위해서는, 생리식염수, 인산완충생리식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여방법으로서는, 정맥내투여, 피하투여, 피내투여를 들 수 있다. 상기의 치료제를 환자의 체내에 되돌림으로써, HLA-A24 양성이면서 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체에서 유래한 종양항원 단백질 양성 환자의 체내에서 CTL 에 의한 종양세포의 상해작용이 촉진되어, 종양세포를 파괴함으로서, 종양을 치료하고, 나아가서는 전이를 예방할 수 있 다.

또, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체를 종양의 진단에 사용하기 위해서는, 예를 들면, 통상적인 방법으로 이 종양항원 펩티드 유도체에 대한 항체를 조제하고, 요컨대 적당히 표지하여, 이를 사용하여 종양이 의심되는 환자로부터 얻은 시료 (예를들면, 혈액, 종양조직 등) 중의 항원의 존재를 검출함으로써 종양의 유무를 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체 그 자체를 진단약에 사용하여, 상기 혈액 또는 종양조직 등의 시료중의 항체의 존재를 검출함으로써 종양의 유무를 진단하는 것도 가능하다.

본 발명은 또, 상기의 종양항원 펩티드 유도체, 이 종양항원 펩티드 유도체를 제시하고 있는 항원제시세포, 이 종양항원 펩티드 유도체와 HLA-A24 항원과의 복합체를 특이적으로 인식하는 세포상해성 T 세포를 사용하여 종양을 치료 또는 예방, 또는 진단하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 종양항원 펩티드 유도체는, 당해 기술분야에 있어서의 연구용 시약으로서도 유용하다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들의 실시예에 조금도 한정되지 않는다.

참고예 종양항원 단백질 cDNA 클로닝 및 HLA-A24 및 HLA-A26 구속성 종양항원 펩티드의 동정

1. 식도암세포주에 대한 세포상해성 T 세포 (CTL) 주의 수립

나카오 등의 저서, Cancer Res.,55:4248-4252(1995) 의 기재에 따라, 조직형이 편평상피암에 분류되는 식도암세포주 KE-4 에 대한 CTL 을 환자의 말초혈단핵구세포로부터 수립하여, KE-4CTL 이라 명명하여 실험에 사용하였다. 식도암세포주 KE-4 및 KE-4CTL 은, 이바라기현 쓰쿠바시 히가시 1-1-3, 공업기술원 생명공학 공업기술연구소에, 각각 수탁번호 FERM BP-5955 및 FERM BP-5954 로 기탁되어 있다 (기탁일 : 모두 평성 9년 5월 23일). 또, 상술의 나카오 등의 보고에 따라, KE-4 의 HLA 클래스 I 분자의 타이핑을 행하여, HLA-A2402, -A2601, -B54, -B60, -Cw1, -Cw3 인 것을 확인하였다.

2. HLA-A2601 cDNA 및 HLA-A2402 cDNA 의 조제

KE-4 로부터, 나카오 등의 저서, Cancer Res.,55:4248-4252(1995) 의 기재에 따라, HLA-A2601 의 cDNA 를 발현벡터 pCR3 (INVITROGEN사 제조) 에 형성한 재조합 플라스미드를 제작하였다. 또 동일한 방법으로, HLA-A2402 에 대해서도 재조합 플라스미드를 제작하였다.

3. KE-4 유래 cDNA 라이브러리의 제작

KE-4 로부터 mRNA 정제 시스템 (팔마시아 바이오텍사 제조) 을 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라, 전체 RNA 획분의 분리 및 oligo(dT) 칼럼에 의한 poly(A)⁺mRNA 의 조제를 실시하였다. mRNA 로부터 슈퍼스크립토플라스미드 시스템 (GIBCO BRL사 제조) 을 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라, 양단에 Notl 어댑터와 Sal1 어댑터를 연결한 cDNA 를 제작한 후, 이 cDNA 를 발현벡터 플라스미드 pSV-SPORT1 (GIBCO BRL사 제조) 의 제한효소 NotⅠ 및 SalⅠ 의 절단부위에 라이게이션에 의해 연결하여 재조합 플라스미드를 얻었다. 이 재조합 플라스미드를 진 펄서 (Bio-Rad사 제조) 를 사용하여 25 μF, 2.5㎸ 의 조건으로, 전기펄스에 의해 대장균 일렉트로막스(ElectroMAX) DH10B/p3^TM 셀 (GIBCO BRL사 제조) 에 도입하여, 암피실린 (50 ㎍/㎖) 를 함유한 LB 배지 (1% 박토트립톤, 0.5% 이스트엑기스, 0.5% NaCl, pH7.3) 에서 재조합 플라스미드가 도입되어 있는 형질전환체를 선택하였다.

4. 종양항원 단백질 유전자의 스크리닝

상기 3. 에 나타낸 형질전환체의 약 100개의 풀로부터의 재조합 플라스미드 DNA 의 회수는 이하와 같이 실시하였다. 즉, 암피실린 (50㎍/㎖) 을 함유한 LB 배지가 들어간 96 웰 U-저 마이크로플레이트에 웰당 100개의 형질전환체를 더하여 배양후, 그 일부를 웰당 0.25 ㎖ 의 TYGPN배지 (F.M.Ausubel 외 편저, CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.) 가 들어간 다른 96 웰 U-저 마이크로플레이트에 옮겨 37℃ 에서 48시간 배양하고, 남은 LB 배지의 마이크로플레이트는 동결보존하였다. TYGPN 배지에서 배양한 형질전환체의 재조합 플라스미드DNA 는, 마이크로플레이트에서 알칼리용해법 (F.M.Ausubel 외 편저, CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.) 에 의해 조제하였다. 이소프로판올 침전으로 회수한 재조합 플라스미드DNA 는, 20 ng/㎖ RNase 를 함유한 50 ㎕ 의 10 mM Tris, 1mM EDTA, pH7.4 용액으로 현탁하였다.

섬유아세포주 VA-13 세포 (이화학연구소 세포개발은행, Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.,44:242-254, 1966) 로, 리포펙틴법으로 이하와 같이 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드와 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드를 더블트랜스펙트하였다. 즉, VA-13 세포를 96 웰 평저 마이크로플레이트에 웰당 7000개를 더하여, 10% FCS 를 함유한 100 ㎕ 의 RPMI 1640 배양액으로 2 일간 배양하였다. 리포펙틴시약 (GIBCO BRL사 제조) 을 사용하여, 형질전환체 약 100개분의 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드 25 ㎕ 과 참고예의 2. 에 나타낸 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드 10 ㎕ (200ng) 와 약 35 배로 희석한 리포펙틴시약 35 ㎕ 의 혼합액 70 ㎕ 의 30㎕ 을 VA-13 세포에 더하여 더블트랜스펙트하였다. 트랜스펙턴트는 2점씩 준비하였다. 5 시간후, 이 트랜스펙턴트에 10% FCS 를 함유한 배양액 200 ㎕ 을 더하고, 다시 72 시간, 37℃ 에서 배양한 후, 배양액을 제거하고, 웰당 10000개의 KE-4CTL 을 더하여 10% FCS 와 25U/㎖ 의 IL-2 를 함유한 100 ㎕ 의 배양액으로 37℃ 에서 24 시간 배양하였다. 배양액을 회수하고, KE-4CTL 이 생산한 배양상등액중의 IFN-γ양을 ELISA 법으로 측정하였다. 즉, 96웰 마이크로플레이트에 고층화항체로서 항인체 IFN-γ마우스 모노크로날항체를 흡착시키고, 소혈청알부민으로 비특이적결합을 블록한 후, 상기 배양상등액중의 IFN-γ 를 항체에 결합시켰다. 다음에 검출항체로서 항인체 IFN-γ토끼 폴리크로날항체를 결합시키고, 다시 알칼리포스파타아제 표지한 항토끼 이뮤노글로블린 염소항체를 결합시킨 후, 발색기질로서 파라니트로페닐포스페이트를 반응시켜, 1N NaOH 를 등량 더하여 반응을 정지시킨 후, 흡광도 (405㎚) 를 측정하였다. 이것을 스탠다드의 IFN-γ에서 얻어진 값과 비교함으로써 정량하였다.

높은 IFN-γ생산이 인정된 4 군에 대해서는, 해당하는 동결보존되어 있던 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드에 의한 형질전환체 약 100개의 풀을 사용하여, 다시 이하와 같이 스크리닝을 실시하였다. 즉, 형질전환체의 풀을 암피실린 (50 ㎍/㎖) 을 함유한 LB 한천배지의 플레이트에 뿌려 콜로니를 얻어, 각 군 200 콜로니, 합계 800 콜로니에 대하여 웰당의 형질전환체가 1 종류가 되는 조건으로 상기와 동일한 방법으로 배양하여, KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드DNA 를 조제하였다. 또한 상기와 동일한 방법으로 VA-13 세포로의 KE-4 cDNA 의 재조합 플라스미드와 HLA-A2601 cDNA 의 재조합 플라스미드의 더블 트랜스펙트를 실시하고, 이어서 KE-4 CTL 과의 혼합배양을 실시하여, KE-4CTL 이 반응하여 생산된 배양액중의 IFN-γ의 정량을 실시하여 양성의 플라스미드를 선택하였다. 이 조작에 의해 KE-4 cDNA 재조합 플라스미드 클론이 선택되어, 6DI 로 명명하였다. 6DI 에 대해서는, 다시한번, 동일한 조작을 반복하여 KE-4 CTL 세포에 의한 IFN-γ의 생산량을 상기와 동일한 방법으로 정량하였다. 그 결과를 이하의 표 1 에 나타낸다.

표적세포	KE-4CTL이 생산한 IFN-γ량(pg/㎖)
VA-13세포 VA-13세포＋HLA-A2601 VA-13세포＋6DI VA-13세포＋HLA-A2601＋6DI VA-13세포＋HLA-A0201¹⁾ VA-13세포＋HLA-A0201＋6DI¹⁾	0 1.8 4.3 24.0 0.9 3.0
1) : 비교를 위해 다른 타입의 HLA 를 트랜스펙트한 경우 (트랜스펙트한 DNA 량, HLA-A2601, HLA-A0201 이 200 ng, 6DI 가 100 ng 일 때의 데이터)

5. 노던하이브리다이제이션에 의한 종양항원 단백질 유전자발현의 해석

여러가지 세포주로부터, RNAzol B(TEL-TEST, INC.사 제조) 을 사용하여 RNA 를 조제하였다. 5 ㎍ 의 RNA 를 포름아미드, 포름알데히드 존재하에서 변성시켜, 아가로스 전기영동을 실시한 후, Hybond-N+ 나일론멤브레인 (Amersham사 제조) 에 전사, 고정하였다. 정상조직의 RNA 에 대해서는, mRNA 를 고정한 시판의 멤브레인 (CLONTECH사 제조) 을 사용하였다. 멀티프라임 DNA 라벨링시스템 (Amersham사 제조) 에 의해, 참고예의 4. 에서 클로닝한 재조합 플라스미드 6DI 의 삽입서열부분을 ³²P 로 표지하여 DNA 프로브를 제작하고, 공지의 방법 (나카야마외 편저, 바이오실험 일러스트레이티드 ②유전자해석의 기초, p.148-151, 슈쥰사, 1995년) 에 따라, 멤브레인상의 RNA 에 하이브리다이즈시킨 후, 오토라디오그래피에 의해, 본 발명의 종양항원 단백질 유전자의 mRNA 를 검출하였다. 다음에, 이 유전자의 mRNA 의 검출에 사용한 멤브레인을, 0.5% 도데실황산나트륨수용액 중에서 끓여 프로브를 떼어낸 후, 세포에서 항상적으로 발현하고 있는 β-액틴을 프로브로서, 동일한 방법으로 노던하이브리다이제이션을 실시하여, mRNA 를 검출하여 내부표준으로 하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 이들의 결과로부터, 본 발명의 종양항원 단백질 유전자의 mRNA 는, 각종 암세포 및 정상조직에서 광범하게 발현하고 있어, 전장은, 약 2.5 kb 인 것이 밝혀졌다.(도 1).

6. 종양항원 단백질을 코드하는 전장의 cDNA 클론의 클로닝과 염기서열의 결정

상기 3. 에 나타낸 KE-4 유래의 cDNA 라이브러리를 암피실린 (50 ㎍/㎖) 을 함유한 LB 한천배지의 플레이트에 뿌려 콜로니를 얻은 후, Hybond-N+ 나일론멤브레인 (Amersham사 제조) 에 첨부의 프로토콜에 따라, 콜로니의 DNA 를 전사, 고정하였다. 참고예의 5. 에서 사용한 것과 동일한 6DI 프로브를 사용하여, 참고예의 5. 와 동일한 조건으로 하이브리다이제이션과 오토라디오그래피를 실시하여, 종양항원 단백질유전자의 cDNA 가 삽입된 재조합 플라스미드를 갖는 형질전환체의 콜로니를 선택하였다. 또한, 선택된 복수의 콜로니에서 재조합 플라스미드를 회수하여, 제한효소 NotI 및 SalI 로 처리한 후, 아가로스 전기영동에 의해 삽입된 cDNA 의 길이를 확인하였다. 약 2.5 kb 의 cDNA 가 삽입된 재조합 플라스미드를 선택하여, 이것을 K3 으로 명명하였다. 이 플라스미드 K3 에 대하여 Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing 키트 (파킨엘마사 제조) 를 사용하여, cDNA 부분의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 서열표의 서열번호 : 2 에 나타낸다. 이 cDNA 의 전장은 2527 염기쌍이었다. 서열번호 : 2 의 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열 (800 아미노산) 을 서열번호 : 1 에 나타낸다.

해석결과, 서열번호 : 2 의 염기서열은, 멜라노마 유래의 이미 공지된 종양항원 단백질의 유전자와는 상동성이 없는 전혀 다른 유전자이었다. WWW Entrez 데이터베이스를 사용하여, 서열번호 : 2 에 기재한 염기서열의 검색을 실시한 결과, 그 염기서열의 일부분이, WashU-Merck EST Project 에 의해 해독되어, GENBANK 에 등록되어 있는 기능불명의 3 종류의 유전자서열, Accession No.R89163, R62890, R00027 과 90% 이상의 높은 상동성을 나타내는 것이 밝혀졌다. No.R89163 은 서열번호 : 2 의 제 1893 ∼ 2267 번, R62890 은 제 2018 ∼ 2389 번, R00027 은 제 2024 ∼ 2510 번에 상당한다. 그러나, 이들 3 개의 서열은 서열번호 : 2 기재된 염기서열의 개시코돈으로부터 3'측의 염기서열이기 때문에, 아미노산서열을 결정할 수 없다.

또한, 상기의 염기서열결정후, 플라스미드 K3 을 E.coli JM109 에 도입하여, 신규인 종양항원 단백질 cDNA 를 함유하는 보존용의 형질전환체인 E. coli JM109(K3) 를 조제하였다. E.coli JM109(K3) 는, 이바라기현 쓰쿠바시 히가시 1-1-3, 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있다 (기탁일 : 평성9년 5월 22일 ; 기탁번호 : FERM BP-5951).

또한, 정상인간조직 (말초혈임파구) 의 cDNA 라이브러리 (GIBCO BRL사 제조) 를 상기와 동일하게 스크리닝한 바, 약 2.5 kb 의 cDNA 가 삽입된 재조합 플라스미드가 클로닝되어, 이 cDNA 의 염기서열을 결정한 바, 서열번호 : 2 의 염기서열의 제 812 위 (정상인간조직에서의 제 812위는 "T" 이다) 가 다른 것 이외에는 동일한 cDNA 가 단리되었다. 이것은, 서열번호 : 2 기재된 종양항원 단백질을 코드하는 유전자를 함유한 전장의 유전자는, 암세포와 정상인간조직에서, 대략 동일한 유전자가 발현하고 있는 것을 나타내고 있다.

다음에, 상기 4. 와 동일한 방법으로, 신규인 종양항원 단백질 유전자의 cDNA 가 포함된 재조합 플라스미드 K3 과, HLA-A2601 의 cDNA 가 포함된 재조합 플라스미드를 VA-13 세포에 더블트랜스펙트한 세포를 표적세포로 하여, KE-4CTL 이 반응하여 생산한 IFN-γ양을, 상기 4. 의 방법으로 정량하였다. 그 결과를 이하의 표 2 에 나타낸다.

표적세포	KE-4CTL¹⁾이 생산한 IFN-γ량(pg/㎖)
VA-13세포＋HLA-A2601＋K3 VA-13세포＋HLA-A0201²)＋K3	1439 10
1) : VA-13 세포에 각각의 HLA 을 트렌스펙트한 세포에 대한 KE-4CTL 이 생산한 IFN-γ양 (백그라운드) 을 뺀 값 2) : 비교를 위해 다른 타입의 HLA 을 트랜스펙트한 경우 (트랜스펙트한 DNA 량 : HLA-A2601, HLA-A0201이 200 ng, K3 이 100 ng 일 때의 데이터)

이상의 결과로부터, 얻어진 cDNA 가 종양항원 단백질을 코드하고 있는 것이 확인되었다.

7. 종양항원 펩티드의 동정

상기 4. 에서 클로닝한 신규인 종양항원 단백질 유전자의 부분 cDNA 가 삽입된 재조합 플라스미드 6DI 로부터, Kilo-Sequence 용 Deletion Kit (다카라슈죠사 제조) 를 사용하여, 첨부의 프로토콜에 따라, 종양항원 단백질 유전자의 cDNA 가 여러가지의 길이로 결실된 플라스미드를 얻었다. 이들의 플라스미드를 대장균의 일렉트로막스 DH10B/p3^TM 셀 (GIBCO BRL사) 에 도입하고, 한천배지의 플레이트상에서 배양하여, 무작위로 50 개의 콜로니를 선택하였다. 이 콜로니로부터 플라스미드 DNA 를 조제하고, 전기영동을 실시함으로써, 적당한 길이의 플라스미드를 갖는 5 개의 클론을 선택하였다.

상기 4. 에 기재된 방법에 의해, VA-13 세포로 HLA-A2601 cDNA 와 상기 플라스미드 DNA 를 더블트랜스펙트하고, 이어서, 이 트랜스펙트와 KE-4CTL 을 혼합배양하여, 4. 에 기재된 방법에 따라, 배양액중의 IFN-γ를 정량하였다. 그 결과, 서열번호 : 2 의 염기서열의 2253 번째 이후가 결실된 플라스미드의 트랜스펙턴트에는, KE-4CTL로부터의 IFN-γ유도활성을 볼 수 없었다. 따라서, 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 739 번째의 근방이후의 서열을 갖는 펩티드에 KE-4CTL 로부터의 IFN-γ유도활성이 있는 것으로 예상되었다.

다음에, 서열번호 : 1 의 아미노산서열의 730 번째의 이후를 3 아미노산씩 어긋나게하여 10 아미노산잔기의 펩티드를 21 종류 합성하였다. 이들의 펩티드를, HLA-A2601 cDNA 트랜스펙트한 VA-13 세포에 펄스하여 항원제시시킨 것 이외에 는 상기와 동일한 벙법으로, 배양액중의 IFN-γ를 정량하였다. 그 결과, 서열번호 : 1 의 제 736 위 ∼ 745 위 (736 ∼ 745), 제 748 위 ∼ 757 위 (748 ∼ 757),제 784 위 ∼ 793 위 (784 ∼ 793) 의 아미노산서열을 갖는 펩티드에 IFN-γ유도활성을 볼 수 있었다.

또한, 이들 3 종류의 펩티드에 대하여, 보다강한 IFN-γ유도활성을 갖는 펩티드를 동정하기 위해, N 말단 또는 C 말단을 1 아미노산 짧게 한 9 아미노산잔기의 펩티드를 합성하고, 동일하게 IFN-γ유도활성을 측정한 바, 서열번호 : 1 의 제 736 위 ∼ 744 위 (736 ∼ 744), 제 749 위 ∼ 757 위 (749 ∼ 757), 제 785 위 ∼ 793 위 (785 ∼ 793) 의 아미노산서열을 갖는 펩티드에 의해 강한 IFN-γ유도활성을 볼 수 있었다. 그 결과를 표 3 에 나타낸다.

펄스한 세포	펩티드	KE4-CTL 세포가 생산한 IFN-γ양(pg/㎖)
VA-13/A2601¹) VA-13/A0201²) VA-13/A2601 VA-13/A0201 VA-13/A2601 VA-13/A0201	「736∼744」「736∼744」「749∼757」「749∼757」「785∼793」「785∼793」	203 44 183 89 394 102
1) VA-13 세포에 HLA-A2601 cDNA 를 트렌스펙트한 경우 2) 대조로서 VA-13 세포에 다른 HLA-A0201 cDNA 를 트랜스펙트한 경우

표 3 으로부터, 이들의 펩티드가 HLA-A26 구속성의 종양항원 펩티드로서 기능하는 것이 나타났다.

이어서, HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드를 이하와 같은 방법으로 동정하였다.

즉, HLA 항원분자에 결합하여 제시되는 항원펩티드의 서열에는 규칙성 (모티 브) 가 있어, HLA-A24 의 경우, 8 ∼ 11 아미노산으로 이루어지는 펩티드 중의 N 말단으로부터 2 번째의 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판으로, C 말단의 아미노산이 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 트립토판 또는 메티오닌인 것이 알려져 있다 (Immunogenetics,41:178,1995, J.Immunol.,152:p3913,1994, J.Immunol.,155:4307,1994).

여기에서 서열번호 : 1 에 기재된 아미노산서열로부터, 상기 모티브에 상당하는 제 690 위 ∼ 698 위 (690 ∼ 698, 서열번호 : 3) 의 부분으로 이루어지는 펩티드를 합성하였다. 그리고, HLA-A2402 cDNA 를 트렌스펙트한 VA-13 세포에 이 펩티드를 펄스하고, 상기와 동일한 방법으로, KE-4CTL 로부터의 IFN-γ유도활성을 조사하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다.

펄스한 세포	펩티드	KE4-CTL 세포가 생산한 IFN-γ양(pg/㎖)
VA-13 VA-13/A2402¹) VA-13/A0201²)	「690∼698」「690∼698 「690∼698」	157 269 166
1) VA-13 세포에 HLA-A2402 cDNA 를 트렌스펙트한 경우 2) 대조로서 VA-13 세포에 다른 HLA-A0201 cDNA 를 트랜스펙트한 경우

표 4 로부터, 「690 ∼ 698(서열번호 : 3)」의 펩티드가, 종양항원 펩티드로서 기능하는 것이 나타났다.

8. 종양항원 펩티드에 의한 말초혈임파구로부터의 CTL 의 유도

상기 7. 에서 나타난 종양항원 펩티드를 사용하여, KE-4 에서 유래한 암환자의 말초혈임파구를 시험관 내에서 자극하여 항원특이적인 CTL 을 유도할 수 있는지를 검토하였다. 사용한 종양항원 펩티드는, 상기 참고예의 7. 에서 얻어진 「736 ∼ 744」, 「749 ∼ 757」, 「690 ∼ 698」의 서열을 갖는 펩티드이다. 상기 암환자유래의 말초혈로부터의 피콜법으로 임파구를 분리하여 동결보존하였던 말초혈임파구를 해동하여, 24 웰의 플레이트에 약 2 ×10⁶세포/웰이 되도록 옮겨, 10% FCS 와 IL-2 (100U/㎖) 를 함유한 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배양액에 상기 종양항원 펩티드를 10㎍/㎖ 이 되도록 더하여, 말초혈임파구를 자극하였다. 1 주간후, X선조사 (50Gy) 한 약 1×10⁵ 개의 말초혈임파구와 함께 상기 종양항원 펩티드를 10㎍/㎖ 더하여, 2 회째의 자극을 실시하였다. 다시 1 주간후, 3 회째의 자극을 동일하게 반복하였다.

「736 ∼ 744」, 「749 ∼ 757」의 서열을 갖는 펩티드에 대해서는 3 회째의 자극으로부터 1 주간후, 말초혈임파구를 회수하여, D.D.Kharkevitch 외 저서의 Int.J.Cancer, 58:317(1994) 에 기재된 방법에 따라, ⁵¹Cr 로 표지된 KE-4, 및 HLA-A로커스가 A2402 및 A2 인 식도암세포주 KE-3 을 표적세포로서, 세포상해활성을 측정하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.

효과세포	표적세포	상해활성(%)
「736∼744」로 자극함 말초혈임파구 「749∼757」로 자극함 말초혈임파구	KE-4 KE-3 KE-4 KE-3	22.1 3.7 35.9 24.2

「736 ∼ 744」의 서열을 갖는 펩티드로 자극한 경우에는, KE-4 는 강하게 상해되었으나, 음성대조의 KE-3 은 상해되지 않았기 때문에, KE-4 특이적인 CTL 이 유도되고 있는 것이 나타났다. 또, 「749 ∼ 757」의 서열을 갖는 펩티드로 자극한 경우에는, KE-3 에 대한 비특이적인 세포상해활성을 볼 수 있었으나, KE-4 에 대하여 보다 강한 세포상해활성이 보였기 때문에, KE-4 특이적인 CTL 이 유도되고 있는 것이 나타났다.

「690 ∼ 698 (서열번호 : 3)」의 서열을 갖는 펩티드에 대해서는, 3 회째의 자극후, 말초혈임파구를 회수하여, 10% FCS, 50% AIM-V(GIBCO BRL 사 제조), IL-2 (100U/㎖) 를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양을 계속하였다. 그 후, 상기와 동일한 방법으로, ⁵¹Cr 로 표지된 KE-4 및 VA-13 세포를 표적세포로서 세포상해활성을 측정하였다. 또, HLA-A 로커스가 A24 의 호모접합인 건강인의 말초혈로부터 임파구를 분리하여, 동일한 방법으로 ⁵¹Cr 로 표지된 KE-4 및 HLA-A 로커스가 A2601 의 호모접합인 폐암세포주의 QG-56 세포를 표적세포로서, 세포상해활성을 측정하였다. 결과를 표 6 에 나타낸다.

효과세포	표적세포	상해활성(%)
「690∼698」로 자극함 암환자말초혈임파구 「690∼698」로 자극함 건강인말초혈임파구	KE-4 VA-13 KE-4 QG-56	24.7 13.8 17.7 11.5

암환자 말초혈임파구 및 건강인 말초혈임파구를 「690 ∼ 698(서열번호 :3)」의 서열을 갖는 펩티드로 자극함으로써, 음성대조인 VA13 세포, QG56 세포에 대한 비특이적인 세포상해활성을 볼 수 있었으나, KE-4 에 대하여 보다 강한 세포상해활성을 볼 수 있었다. 이상의 결과로부터, KE-4 특이적인 CTL 이 유도되고 있는 것이 나타났다.

실시예 1 종양항원 펩티드 유도체의 합성

상기한 바와 같이, HLA 항원분자에 결합하여 제시되는 항원 펩티드의 서열에는 규칙성 (모티브) 이 있어, HLA-A24 의 경우, 8 ∼ 11 아미노산으로 이루어지는 펩티드중의 N 말단으로부터 2 번째의 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판이고, C 말단의 아미노산이 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 트립토판 또는 메티오닌인 것이 알려져 있다 (Immunogenetics,41:178,1995, J.Immunol.,152:p3913,1994, J.Immunol.,155:4307,1994). 상기 참고예의 7 및 8 에서 HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드로서 동정된 「690 ∼ 698 (서열번호 : 3)」에 관하여, 상기 모티브에 따라 아미노산을 치환한 펩티드 유도체의 아미노산서열을, 서열번호 : 4 에 나타낸다.

이와 같은, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열로 이루어지는 HLA-A24 구속성의 종양항원 펩티드의 2 번째의 아미노산잔기 및/또는 9 번째의 아미노산잔기를, 상기 규칙성에 근거하여 개변한 종양항원 펩티드 유도체를, 여러가지 작성하였다.

그 일례를 이하에 나타낸다.

a) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp

b) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu

c) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile

d) Glu-Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Phe

e) Glu-Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp

이들 펩티드는, Advanced Chemtech 사의 MPS 350 을 사용하여, Fmoc 법으로 합성하고, 그 후 HPLC 에 의해 정제하였다 (YMC-Pack ODS-A SH-363-5 칼럼 사용). 정제순도는 모두 95% 이상이었다.

펩티드 유도체의 합성방법을 (1) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile (서열번호 : 5), (2) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu (서열번호 : 6), 및 (3) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp (서열번호 : 7) 을 예로 이하에 기술한다.

(1) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile (서열번호 : 5) 의 합성

수지는 Fmoc-Ile-Alko Resin (0.62m㏖/g, 100-200 mesh) 를 사용하였다. 이 수지 100 ㎎ 을 사용하여, 후기 스케쥴 1 (표 7) 에 따라 합성을 개시하고, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 순차적으로 커플링시켰다. 커플링후 스케쥴 1 의 공정 3 까지 실시하고, 그 결과, 펩티드수지가 얻어졌다.

이 펩티드수지에 Reagent K(5% 페놀, 5% 티오아니솔, 5% H₂O, 2.5% 에탄디티올/TFA 용액) 2 ㎖ 를 더하고, 실온에서 2.5 시간 반응시켰다. 빙냉하반응액에 디에틸에테르 10 ㎖ 를 더하여 10 분간 교반하고, 여과하여 디에틸에테르 10 ㎖ 로 세정하였다. 여과물에 아세트산수 10 ㎖ 를 더하여 30 분간 교반후, 수지를 여별하여, 아세트산수 4 ㎖ 로 세정하였다. 여세액을 동결건조후, 얻어진 조펩티드를 아세트산수에 용해하고, 미리 0.1% TFA수로 평형화시킨 역상계 충전제 YMC-Pack ODS-A SH-363-5 칼럼 (30Φ×250㎜) 에 주입하고, 칼럼을 0.1% TFA수로 세정후, 아세토니트릴농도를 200분에 24% 까지 증가시켜, 유속 7 ㎖/min 으로 용출하였다. 용출액을 A220㎚ 으로 모니터하여, 목적화합물을 함유한 획분을 모아, 동결건조하여, Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile 47.8 ㎎ 을 얻었다.

얻어진 Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile 은, 역상계충전제 YMC-PACK ODS-AM AM-303 칼럼 (4.6Φ×250㎜) 을 사용한, 0% 부터 60%까지의 0.1% TFA 를 함유한 아세토니트릴의 직선농도균배용출법에 의한 분석에서 유지시간 19.3 분을 나타내고, 그 아미노산 분석값 및 질량분석값은 이론값과 일치하였다.

아미노산분석

가수분해 : 1% 페놀/6N 염산수용액, 110℃, 24 시간 ; 분석법 : 닌히드린법 ; ※:기준아미노산 ; ( )내 : 이론값

Asx : 0.94(1)

Thr : 0.91 (1)

Glx : 1.94 (2)

Gly : 0.99 (1)

※Ile : 1.00 (1)

Tyr : 0.93 (1)

Phe : 0.98 (1)

Arg : 0.95 (1)

질량분석 (FAB) : [M ＋ H]⁺ :1128

스케쥴1
공정	시간(분)×처리회수
1.(세정)DMF 1.2㎖ 2.(탈보호)50% 피페리딘/DMF 3.(세정)DMF 1.2㎖ 4.(커플링)각아미노기보호아미노산(5당량)/NMP용액0.9㎖,DIC(5당량)/NMP용액 0.3㎖ 5.(세정)DMF1.2㎖ 6.(커플링)각아미노기보호아미노산(5당량)/NMP용액0.9㎖,DIC(5당량)/NMP용액 0.3㎖ 7.(세정)DMF1.2㎖	1×2 12×1 1×7 30×1 1×2 30×1 1×4

(2) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu (서열번호 : 6) 의 합성

앞의 (1) 과 동일한 방법으로, Fmoc-Leu-Alko Resin (0.54m㏖/g, 100-200 mesh) 100mg 을 사용하여, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 순차적으로 커플링시키고, 그 후 탈보호를 실시하였다. 얻어진 조펩티드를 아세트산수에 용해하고, 미리 0.1% TFA수로 평형화시킨 역상계 충전제 YMC-Pack ODS-A SH-363-5 칼럼 (30Φ×250㎜) 에 주입하여, 칼럼을 0.1% TFA수로 세정후, 아세토니트릴농도를 200분에 25% 까지 증가시켜, 유속 7 ㎖/min 으로 용출하였다. 용출액을 A220㎚ 으로 모니터하여, 목적화합물을 함유한 획분을 모아, 동결건조하여, Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu 52.5 ㎎ 을 얻었다.

얻어진 Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu 는, 역상계충전제 YMC-PACK ODS-AM AM-303 칼럼 (4.6Φ×250㎜) 을 사용한, 0% 부터 60%까지의 0.1% TFA 를 함유한 아세토니트릴의 직선농도균배용출법에 의한 분석에서 유지시간 19.6 분을 나타내고, 그 아미노산 분석값 및 질량분석값은 이론값과 일치하였다.

아미노산분석

Asx : 0.97 (1)

Thr : 0.94 (1)

Glx : 1.98 (2)

Gly : 1.02 (1)

※Leu : 1.00 (1)

Tyr : 0.94 (1)

Phe : 1.00 (1)

Arg : 0.97 (1)

질량분석 (FAB) : [M ＋ H]⁺ :1128

(3) Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp (서열번호 : 7) 의 합성

앞의 (1) 과 동일한 방법으로, Fmoc-Trp(Boc)-Alko Resin (0.65m㏖/g, 100-200 mesh) 100mg 을 사용하여, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH 를 순차적으로 커플링시키고, 그 후 탈보호를 실시하였다. 얻어진 조펩티드를 아세트산수에 용해하고, 미리 0.1% TFA수로 평형화시킨 역상계 충전제 YMC-Pack ODS-A SH-363-5 칼럼 (30Φ×250㎜) 에 주입하여, 칼럼을 0.1% TFA수로 세정후, 아세토니트릴농도를 200분에 26% 까지 증가시켜, 유속 7 ㎖/min 으로 용출하였다. 용출액을 A220㎚ 으로 모니터하여, 목적화합물을 함유한 획분을 모아, 동결건조하여, Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp 14.0 ㎎ 을 얻었다.

얻어진 Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp 는, 역상계충전제 YMC-PACK ODS-AM AM-303 칼럼 (4.6Φ×250㎜) 을 사용한, 0% 부터 60%까지의 0.1% TFA 를 함유한 아세토니트릴의 직선농도균배용출법에 의한 분석에서 유지시간 20.7 분을 나타내고, 그 아미노산 분석값 (Trp 검출될 수 없다)및 질량분석값은 이론값과 일치하였다.

아미노산분석

Asx : 0.67 (1)

Thr : 0.96 (1)

Glx : 2.00 (2)

Gly : 1.02 (1)

Tyr : 0.96 (1)

※Phe : 1.00 (1)

Arg : 1.01 (1)

질량분석 (FAB) : [M ＋ H]⁺ :1202

실시예 2 종양항원 펩티드 유도체의 활성측정

실시예 1 에서 작성된 펩티드를 사용하여, 참고예의 7. 에 기재된 IFN-γ 유 도활성 또는 참고예의 8. 에 기재된 유도능력을 조사함으로써, 이들 펩티드가 종양항원 펩티드로서의 기능을 갖고 있는 것이 밝혀진다. 이하, 일례를 나타낸다.

상기 실시예 1 에서 합성한 3 종의 종양항원 펩티드 유도체 (서열번호 : 5 ∼ 7) 를 사용하여, HLA-A24 양성의 건강인의 말초혈임파구를 참고예의 8. 과 동일한 방법으로 시험관 내에서 펩티드자극하여 CTL 을 유도할 수 있는지 검토하였다. 펩티드에 의한 3 회째의 자극으로부터 1 주간후, 말초혈 임파구를 회수하여, 종양항원을 발현하고 있는 HLA-A24 양성의 KE-4 세포를 표적세포로서, 말초혈 임파구가 반응하여 생산한 IFN-γ양을 참고예의 4. 의 방법으로 측정하였다. 또, HLA-A24 음성의 VA-13 세포를 표적세포로서 동일하게 말초혈 임파구가 반응하여 생산된 IFN-γ양을 측정하여 백그라운드값으로 하였다. KE-4 세포에 대하여 생산된 IFN-γ양으로부터 백그라운드의 VA-13 세포에 대하여 생산된 IFN-γ양을 빼냄으로써, 항원특이적 CTL 활성을 구하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다. 서열번호 : 5, 서열번호 : 6, 서열번호 : 7 의 각 펩티드 유도체에 의해 CTL 이 유도되는 것이 밝혀졌다. 특히, 서열번호 : 5 의 종양항원 펩티드 유도체는 강한 IFN-γ생산유도활성을 나타냈다.

또한, 종양항원 및 HLA-A24 양성의 표적세포로서 KE-4 세포 대신에 시판하는 SKG-IIIa 세포 (JCR B0232) 를 사용하여도, 상기와 동일한 활성측정을 실시할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 신규인 종양항원 펩티드 유도체는, 광범위한 종양의 예방, 치료 또는 진단에 유용하다.

서열표 프리텍스트

서열번호 : 4 에 기재된 아미노서열표의 제 2 번째의 아미노산은, 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판이고, 제 9 번째의 아미노산은, 페닐알라닌, 루이신, 이소루이신, 트립토판 또는 메티오닌이다.

<110> ITOH, KYOGO <120> TUMOR ANTIGEN PEPTIDE DERIVATIVES <130> 1 <150> PCT/JP 98/05430 <151> 1997-12-05 <160> 7 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Ser Lys Lys His Arg Gly Glu Lys Glu Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15 Thr Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Glu Gln Pro Pro Arg His 20 25 30 Arg Glu His Lys Lys His Lys His Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Glu Arg Arg Lys Arg Ser Arg Glu Arg Gly Gly Glu Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Arg Arg Gly Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ser Ser Thr His Gly 65 70 75 80 Arg Glu Arg Ser Gln Ala Glu Pro Ser Glu Arg Arg Val Lys Arg Glu 85 90 95 Lys Arg Asp Asp Gly Tyr Glu Ala Ala Ala Ser Ser Lys Thr Ser Ser 100 105 110 Gly Asp Ala Ser Ser Leu Ser Ile Glu Glu Thr Asn Lys Leu Arg Ala 115 120 125 Lys Leu Gly Leu Lys Pro Leu Glu Val Asn Ala Ile Lys Lys Glu Ala 130 135 140 Gly Thr Lys Glu Glu Pro Val Thr Ala Asp Val Ile Asn Pro Met Ala 145 150 155 160 Leu Arg Gln Arg Glu Glu Leu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Lys Glu 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gag aag cgc gat gac ggc 341 Ala Glu Pro Ser Glu Arg Arg Val Lys Arg Glu Lys Arg Asp Asp Gly 90 95 100 tac gag gcc gct gcc agc tcc aaa act agc tca ggc gat gcc tcc tca 389 Tyr Glu Ala Ala Ala Ser Ser Lys Thr Ser Ser Gly Asp Ala Ser Ser 105 110 115 ctc agc atc gag gag act aac aaa ctc cgg gca aag ttg ggg ctg aaa 437 Leu Ser Ile Glu Glu Thr Asn Lys Leu Arg Ala Lys Leu Gly Leu Lys 120 125 130 ccc ttg gag gtt aat gcc atc aag aag gag gcg ggc acc aag gag gag 485 Pro Leu Glu Val Asn Ala Ile Lys Lys Glu Ala Gly Thr Lys Glu Glu 135 140 145 ccc gtg aca gct gat gtc atc aac cct atg gcc ttg cga cag cga gag 533 Pro Val Thr Ala Asp Val Ile Asn Pro Met Ala Leu Arg Gln Arg Glu 150 155 160 165 gag ctg cgg gag aag ctg gcg gct gcc aag gag aag cgc ctg ctg aac 581 Glu Leu Arg Glu Lys Leu Ala Ala Ala Lys Glu Lys Arg Leu Leu Asn 170 175 180 caa aag ctg ggg aag ata aag acc cta gga gag gat gac ccc tgg ctg 629 Gln Lys Leu Gly Lys Ile Lys Thr Leu Gly Glu Asp Asp Pro Trp Leu 185 190 195 gac gac act gca gcc tgg atc gag agg agc cgg cag ctg cag aag gag 677 Asp Asp Thr Ala Ala Trp Ile Glu Arg Ser Arg Gln Leu Gln Lys Glu 200 205 210 aag gac ctg gca gag aag agg gcc aag tta ctg gag gag atg gac caa 725 Lys Asp Leu Ala Glu Lys Arg Ala Lys Leu Leu Glu Glu Met Asp Gln 215 220 225 gag ttt ggt gtc agc act ctg gtg gag gag gag ttc ggg cag agg cgg 773 Glu Phe Gly Val Ser Thr Leu Val Glu Glu Glu Phe Gly Gln Arg Arg 230 235 240 245 cag gac ctg tac agt gcc cgg gac ctg cag ggc ctc acc gtg gag cat 821 Gln Asp Leu Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln Gly Leu Thr Val Glu His 250 255 260 gcc att gat tcc ttc cga gaa ggg gag aca atg att ctt acc ctc aag 869 Ala Ile Asp Ser Phe Arg Glu Gly Glu Thr Met Ile Leu Thr Leu Lys 265 270 275 gac aaa ggc gtg ctg cag gag gag gag gac gtg ctg gtg aac gtg aac 917 Asp Lys Gly Val Leu Gln Glu Glu Glu Asp Val Leu Val Asn Val Asn 280 285 290 ctg gtg gat aag gag cgg gca gag aaa aat gtg gag ctg cgg aag aag 965 Leu Val Asp Lys Glu Arg Ala Glu Lys Asn Val Glu Leu Arg Lys Lys 295 300 305 aag cct gac tac ctg ccc tat gcc gag gac gag agc gtg gac gac ctg 1013 Lys Pro Asp Tyr Leu Pro Tyr Ala Glu Asp Glu Ser Val Asp Asp Leu 310 315 320 325 gcg cag caa aaa cct cgc tct atc ctg tcc aag tat gac gaa gag ctt 1061 Ala Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ile Leu Ser Lys Tyr Asp Glu Glu Leu 330 335 340 gaa ggg gag cgg cca cat tcc ttc cgc ttg gag cag ggc ggc acg gct 1109 Glu Gly Glu Arg Pro His Ser Phe Arg Leu Glu Gln Gly Gly Thr Ala 345 350 355 gat ggc ctg cgg gag cgg gag ctg gag gag atc cgg gcc aag ctg cgg 1157 Asp Gly Leu Arg Glu Arg Glu Leu Glu Glu Ile Arg Ala Lys Leu Arg 360 365 370 ctg cag gct cag tcc ctg agc aca gtg ggg ccc cgg ctg gcc tcc gaa 1205 Leu Gln Ala Gln Ser Leu Ser Thr Val Gly Pro Arg Leu Ala Ser Glu 375 380 385 tac ctc acg cct gag gag atg gtg acc ttt aaa aag acc aag cgg agg 1253 Tyr Leu Thr Pro Glu Glu Met Val Thr Phe Lys Lys Thr Lys Arg Arg 390 395 400 405 gtg aag aaa atc cgc aag aag gag aag gag gta gta gtg cgg gca gat 1301 Val Lys Lys Ile Arg Lys Lys Glu Lys Glu Val Val Val Arg Ala Asp 410 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Lys Lys Leu Glu 520 525 530 tct cgc cag cgg ggc tgg gag gag gat gag gat ccc gag cgg aag ggg 1685 Ser Arg Gln Arg Gly Trp Glu Glu Asp Glu Asp Pro Glu Arg Lys Gly 535 540 545 gcc atc gtg ttc aac gcc acg tcc gag ttc tgc cgc acc ttg ggg gag 1733 Ala Ile Val Phe Asn Ala Thr Ser Glu Phe Cys Arg Thr Leu Gly Glu 550 555 560 565 atc ccc acc tac ggg ctg gct ggc aat cgc gag gag cag gag gag ctc 1781 Ile Pro Thr Tyr Gly Leu Ala Gly Asn Arg Glu Glu Gln Glu Glu Leu 570 575 580 atg gac ttt gaa cgg gat gag gag cgc tca gcc aac ggt ggc tcc gaa 1829 Met Asp Phe Glu Arg Asp Glu Glu Arg Ser Ala Asn Gly Gly Ser Glu 585 590 595 tct gac ggg gag gag aac atc ggc tgg agc acg gtg aac ctg gac gag 1877 Ser Asp Gly Glu Glu Asn Ile Gly Trp Ser Thr Val Asn Leu Asp Glu 600 605 610 gag aag cag cag cag gat ttc tct gct tcc tcc acc acc atc ctg gac 1925 Glu Lys Gln Gln Gln Asp Phe Ser Ala Ser Ser Thr Thr Ile Leu Asp 615 620 625 gag gaa ccg atc gtg aat agg ggg ctg gca gct gcc ctg ctc ctg tgt 1973 Glu Glu Pro Ile Val Asn Arg 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Claims

삭제
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서열번호 : 4 에 기재된 아미노산서열을 포함하고, 또한 HLA-A24 항원과 결합하여 세포상해성 T 세포에 의해 인식될 수 있는 것을 특징으로 하는 종양항원 펩티드 유도체.
제 3 항에 있어서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 9 위의 페닐알라닌이 트립토판, 루이신, 또는 이소루이신으로 치환되어 있는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양항원 펩티드 유도체.
제 3 항에 있어서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 2 위의 티로신이 페닐알라닌으로 치환되어 있는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양항원 펩티드 유도체.
제 3 항에 있어서, 서열번호 : 3 에 기재된 아미노산서열의 제 9 위의 페닐알라닌이 트립토판, 루이신, 또는 이소루이신으로 치환되어 있고, 또한 제 2 위의 티로신이 페닐알라닌으로 치환되어 있는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양항원 펩티드 유도체.
제 4 항에 있어서, 서열번호 : 5 에 기재된 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 종양항원 펩티드 유도체.
제 3 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 기재된 종양항원 펩티드 유도체로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 치료제.
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제 3 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 기재된 종양항원 펩티드 유도체로부터 선택되는 1 종 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 종양 예방제.
단리한 임파구를 제 3 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 기재된 종양항원 펩티드 유도체로 자극하는 것을 포함하는, 상기 종양항원 펩티드 유도체에 특이적인 세포상해성 T 세포의 제조방법.
제 14 항에 기재된 방법으로 제조된 세포상해성 T 세포.