KR101050703B1

KR101050703B1 - Ｈｌａ-ａ24-구속성 암 항원 펩티드

Info

Publication number: KR101050703B1
Application number: KR1020047020294A
Authority: KR
Inventors: 하루오 스기야마; 고토마사시; 다카스히데오
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤; 인터내셔널 인스티튜트 오브 캔서 이무놀로지 인코퍼레이티드; 다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
Priority date: 2002-06-12
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2011-07-20
Also published as: US7666985B2; US7420034B2; CA2489227C; DE60332355D1; EP1536009A1; CN100408683C; US20090099090A1; JPWO2003106682A1; US20070082860A1; KR20050010913A; CA2489227A1; AU2003242305A1; HK1083866A1; CN101113163A; ATE466084T1; CN1675362A; CN101113163B; EP1536009B1; WO2003106682A1; JP4365784B2

Abstract

생체내에서 CTL 을 유도하는 활성을 가진 WTI 기원의 HLA-A-24-구속성 펩티드; 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 생체내 또는 시험관내 상기 펩티드를 이용한 암 백신; 등을 제공하는 것을 의도로 한다. 상기 암 백신은 암을 앓는 다수의 환자 치료에 유용하다.

HLA-A24-구속성 펩티드

Description

ＨＬＡ-Ａ24-구속성 암 항원 펩티드{HLA-A24-RESTRICTED CANCER ANTIGEN PEPTIDES}

본 발명은 암백신 치료법 분야에 속한다. 본 발명은, HLA-A24 구속성 암 항원 펩티드, 더욱 특히는, WT1 에서 유래된 HLA-A24 구속성 암 항원 펩티드로서 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 지닌 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 물질을 포함하는 암백신, 상기 물질의 암백신으로의 용도 및 이를 기초로 하여 암을 치료 및 예방하는 방법에 관한 것이다.

세포성 면역, 특히 세포독성 T 세포 (하기에서 CTL 로 지칭함) 는 생명체로부터 암 세포 또는 바이러스 감염 세포를 제거하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. CTL 은 암 세포 상의 암 항원 단백질에서 유래된 항원 펩티드 (암 항원 펩티드) 및 MHC (Major Histocompatibility Complex) 클래스 I 항원 (인간의 경우, HLA 항원으로 지칭함) 사이에 형성된 복합체를 인지함으로써 암 세포를 공격 및 파괴한다.

암 항원 단백질의 대표적 예가 문헌 [Immunity, vol. 10: 281, 1999] 의 표 1 에 기재되어 있다. 특정한 예로는, 흑색종 항원, 예컨대 멜라닌 세포성 조직 특이 단백질, gp 100(J. Exp. Med., 179:1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994), 및 타이로시나제 (J. Exp. Med., 178:489, 1993); 및 HER2-neu (J. Exp. Med., 181:2109, 1995) 및 흑색종에서 유래된 것을 제외한 암 항원 단백질로서 암 표지, 예컨대 CEA (J. Natl. Cancer Inst., 87:982, 1995) 및 PSA (J. Natl. Cancer Inst., 89:293, 1997) 가 포함된다. 암 항원 펩티드는 약 8-11 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드로서, 암 항원 단백질을 세포내 프로테아제로 처리함으로써 생성된다 (Cur. Opin, Immunol., 5:709, 1993; Cur. Opin, Immunol., 5: 719, 1993; Cell, 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995). 이렇게 생성된 암 항원 펩티드는 MHC 클래스 I 항원 (HLA 항원)과 결합하여 복합체를 이룬 후, 상기 복합체는 세포 표면에 제시되어 상기한 CTL 에 의해 인식된다. 따라서, CTL 에 의한 암 세포 파괴를 기초로 한 암 면역 치료(암백신)용 약제의 개발에 있어서, CTL 을 효과적으로 유도할 수 있는, 암 항원 단백질에서 생성된 암 항원 펩티드를 확인해내는 것이 매우 중요하다.

MHC 클래스 I 에는 다수의 하위 유형이 존재하고, 각각의 하위 유형에 결합하는 항원 펩티드의 아미노산 서열은 특정한 규칙성 (결합 모티프) 을 지닌다. HLA-A2 의 결합 모티프에 있어서, 예를 들어, 2 번 위치의 아미노산은 류신, 메티오닌 또는 이소류신 이고, 9 번 위치의 아미노산은 발린, 류신 또는 이소류신 이다. HLA-A24 의 결합 모티프에 있어서, 2 번 위치의 아미노산은 타이로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, 9 번 위치의 아미노산은 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판 또는 메티오닌이다. 최근, 상기 모티프를 함유한 HLA 항원에 결합 가능한 것으로 예상되는 임의의 펩티드 서열을 데이타베이스에서 검색할 수 있다. (예를 들어, BIMAS 소프트웨어; http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). 따라서, 암 항원 단백질로부터 CTL 을 유도할 수 있는 암 항원 펩티드를 확인하기 위해서, 결합 모티프 또는 목적하는 HLA 유형으로 예상되는 펩티드와 일치하는, 길이가 약 8-11 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 영역을 우선 암 항원 단백질의 아미노산 서열로부터 식별한다.

그러나 결합 모티프 또는 예상 펩티드 서열을 기초로 확인한 펩티드가 반드시 면역원성인 것은 아니다. 항원 펩티드는 암 항원 단백질의 세포내 처리 과정을 거쳐 생성되므로, 상기 과정을 거쳐서 생성되지 않은 펩티드는 항원 펩티드가 될 수 없다. 또한, 많은 암 항원 단백질이 원래 생명체에 존재하므로, 결합 모티프 또는 예상 펩티드 서열을 갖는 펩티드가 암 항원 펩티드로서 세포 내에서 생성되더라도, CTL 이 그러한 암 항원에 대하여 내성을 지닐 수 있다. 이는, CTL 을 유도하는 활성을 지닌 암 항원 펩티드를 식별하기 위해서는, 단순히 결합 모티프 또는 목적하는 HLA 유형으로 예상되는 펩티드 서열을 기초로 한 추정만으로는 불충분하고, 생체 내에서의 면역원성 (CTL 을 유도하는 활성) 에 대한 측정이 중요하다는 것을 보여준다.

빌름스 (Wilms) 암, 홍채결여증 (aniridia), 비뇨생식기 이상 (urogenital anomaly), 정신 지체 등이 복합된 WAGR 증후군의 분석에 기초하여 (Nature, 343:774, 1990) 빌름스 암의 원인 유전자 중 하나로서의 염색체 11p13 으로부터 억제 유전자 WT1 (WT1 유전자) 를 분리하였다. WT1 의 유전체 DNA 는 약 50 Kb 이고, 10 개의 엑손 (exon) 으로 이루어져 있으며, 상기 엑손의 cDNA 는 약 3 kb 이다. 상기 cDNA 로부터 추론된 아미노산 서열은 서열번호: 1 (Cell., 60:509, 1990) 에 나타난 바와 같다. 상기 WT1 유전자는, 그것이 인간 백혈병에서 고도로 발현되며 WT1 안티센스 올리고머로 처리시 백혈병 세포의 세포 성장이 억제된다는 사실에 의거하여 백혈병 세포의 성장을 촉진시키는 것으로 제안되어 왔다 (Japanese Patent Publication (Kokai) No. 104627/1997). 그 후, WT1 유전자가 또한 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암 (embryonal cancer), 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암 및 난소암 등의 고형암에서도 고도로 발현된다는 사실 (Japanese Patent Publication (Kokai) No. 104627/1997, Japanese Patent Publication (Kokai) No. 35484/1999) 에 의거하여 상기 WT1 유전자가 백혈병 및 고형암의 새로운 암 항원 단백질인 것으로 증명되었다(J. Immunol., 164: 1873-80, 2000,、J. Clin. Immunol., 20, 195-202, 2000). 암 면역요법에 대한 약제 (암백신) 를 바람직하게는 가능한 한 많은 암환자들에 적용할 수 있으며, 따라서 많은 종류의 암에서 고도로 발현되는 WT1 으로부터의 암 항원 펩티드를 동정하고 이들 암 항원 펩티드를 기초로 암백신을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 맥락에서, WO00/06602 및 WO00/18795 은 상기 WT1 단백질 일부로 구성된 천연 발생적 암 항원 펩티드를 기술한다.

암백신의 개발 과정에서, 백신의 생체내 효능 평가는 실험동물로서 흔히 사용되는 순계 (pure-line) 마우스를 이용하여는 수행할 수 없고, HLA 를 발현하는 인간 대체 동물 모델이 필요하다. 구체적으로, 암백신으로서 사용가능한 인간 항원 펩티드는, 인간 특이적 MHC 클래스 I 분자인 HLA 에 제시될 때, 특이적 면역반응을 유도한다. 인간이 아닌 실험동물에는 HLA 가 결핍되어 있으며, 따라서, 인 간의 치료를 목적으로 한 암백신의 생체내 평가에 대하여 이용가능하지 않다. 따라서, 상기 기술한 바와 같은 암백신의 효능 평가에는 HLA 를 발현하는 인간 대체 동물 모델이 필수적이다.

본 발명의 목적은 생체내에서 면역원성 (CTL 유도 활성) 을 가지는 WT1 으로부터 유래한 암 항원 펩티드 및 이들 펩티드를 포함하는 암백신, 이들의 암백신으로서의 용도, 및 이들에 기초하여 암을 치료하고 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

최근, 생체내 효능을 평가하기 위하여 사용될 수 있는 HLA-A24 항원을 발현하는 인간 대체 동물 모델이 준비되었고, 이 발명을 청구하는 특허출원이 제출되었다(WO 02/47474, 국제출원일: 2002년 6월 20일, 출원인: Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd.).

상기 모델은 HLA-A24 한정 암 항원 단백질 및 암 항원 펩티드, 뿐만 아니라 이들의 유전자의 생체내 효능을 평가하는 것을 가능하게 하였다.

본 발명자들은 이들 인간 대체 동물 모델을 사용하여 WT1 로부터 유래하고 HLA-A24 구속성인 천연 펩티드 및 변경 펩티드를 평가하였다. 즉, BIMAS 소프트웨어 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) 를 사용하여 WT1 서열로부터 도출되는 HLA-A24 항원인 것으로 예상되는 펩티드 서열 (결합 모티프) 을 가지는 펩티드에 대하여 평가한 결과, 하기 천연 펩티드 중에서 펩티드 B (서열번호: 7) 만이 생체내 면역원성 (CTL 유도 활성) 을 가지는 것으로 드러났다:

펩티드 A: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열번호: 8)

펩티드 B: Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호: 7)

펩티드 C: Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호: 9)

펩티드 D: Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe (서열번호: 10) 및

펩티드 E: Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe (서열번호: 11)

나아가, 본 발명자들은 하기 변경 펩티드를 제조하였는데:

펩티드 F: Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열번호: 2)

펩티드 G: Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호: 3) 및

펩티드 H: Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호: 4),

이들 모두는 상기 기술한 펩티드 A 내지 C 에서 2 위치의 아미노산을 타이로신 (Tyr) 으로 변경한 변경를 가지며, 유사한 방식으로 이들의 면역원성을 평가하였다. 그 결과, 본 발명자들은 변경 형태의 펩티드 G 가 이의 기원인 천연 형태의 펩티드 B 보다 더 높은 면역원성을 가진다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 천연 형태인 펩티드 A 및 C 가 면역원성이 없음에도 불구하고, 이들의 변경 형태인 펩티드 F 및 H 는 높은 면역원성 (CTL 유도 활성) 을 가진다는 것을 발견하였다.

나아가, 본 발명자들은 또한, 유사한 방식으로, BIMAS 소프트웨어 검색에서 HLA-A24 항원인 것으로 예상되는 펩티드 서열을 가지는 것으로 나타난, 인간 WT1 으로부터 유래하는 하기 천연 펩티드 (펩티드 K 및 L) 및 2 위치에서의 아미노산이 타이로신으로 변경된 하기 이들의 변경 펩티드 (펩티드 I 및 J) 의 면역원성을 평 가하였다:

펩티드 K: Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열번호: 51)

펩티드 L: Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열번호: 52)

펩티드 I: Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열번호: 5) 및

펩티드 J: Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열번호: 6).

그 결과, 본 발명자들은, 천연 형태인 펩티드 K 및 L 이 면역원성 (CTL 유도 활성) 을 가지지 않음에도 불구하고, 이들의 변경 형태인 펩티드 I 및 J 는 생체내에서 고도의 면역원성 (CTL 유도 활성) 을 가지는 것을 발견하였다.

이들 발견에 기초하여, 본 발명자들은 다양한 개질이 존재하거나 존재하지 않는 서열번호: 2 내지 6 으로 나타낸 바와 같은 변경 펩티드 및 서열번호: 7로 나타낸 바와 같은 천연 펩티드가 암백신으로서 이용가능하다는 확신을 얻었다. 본 발명은 상기 기술한 바의 발견을 기초로 완성되었다.

따라서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:

(I) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 펩티드:

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열번호: 2),

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호: 3),

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호: 4),

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열번호: 5), 및

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열번호: 6); 또는 서열번호: 2, 3, 4, 5 및 6 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 펩티드; 또는

아미노산 잔기의 변경이 서열번호: 2, 3, 4, 5 및 6 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 어느 하나에 포함되는 변경된 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호: 7 의 아미노산을 포함하는 펩티드를 제외하고는 HLA-A24 구속성 방식으로 CTL을 유도하는 활성을 가지는 펩티드; 바람직하게는, 서열번호: 2, 3, 5 및 6 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 어느 하나에서 9 위치의 류신이 페닐알라닌, 트립토판, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환된 변경 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 따르는 펩티드; 서열번호: 4 의 아미노산에서 9 위치의 페닐알라닌이 트립토판, 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환된 변경 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 따르는 펩티드; 또는 서열번호: 4 의 아미노산에서 5 위치의 시스테인이 알라닌, 세린 또는 α-아미노부티르산 (서열번호: 66, 67 또는 68) 으로 치환되는 변경 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 따르는 펩티드; 또는 아미노산 잔기의 변경이 서열번호: 2, 3, 4, 5 및 6 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 어느 하나에 포함되는 변경 아미노산으로 이루어지는 본 발명에 따르는 펩티드;

(Ⅱ) 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열번호 2 내지 6, 및 66 내지 68 로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드; 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터; 또는 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 형질전환 세포; 또는 본 발명의 세포를, 펩티드의 발현이 가능한 조건 하에서 배양시키는 것을 포함하는 본 발명에 따른 펩티드의 제조 방법;

(Ⅲ) 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체;

(Ⅳ) 본 발명의 펩티드로부터 유래한 암항원 펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포, 바람직하게는 서열번호 2 내지 6, 및 66 내지 68 로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 아미노산 서열로 이루어진 암항원 펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체가 제시되는 본 발명의 항원-제시 세포;

(Ⅴ) 본 발명의 펩티드로부터 유래한 암항원 펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체를 인식하는 CTL, 바람직하게는 서열번호 2 내지 6, 및 66 내지 68 로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 아미노산 서열로 이루어진 암항원 펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체를 인식하는 본 발명에 따른 CTL; 및

(Ⅵ) 본 발명의 펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 형질전환 세포, 본 발명의 항원-제시 세포, 또는 본 발명의 CTL 을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 함유하는 약제학적 조성물, 구체적으로는 암백신; 및 암백신 제조에 있어서 본 발명에 따른 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질전환 세포, 항원-제시 세포, 또는 CTL 의 용도, 및 암의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 이를 필요로 하는 HLA-A24 및 WT1 에 대해 양성인 환자에게 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질전환 세포, 항원-제시 세포, 또는 CTL 의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법.

또한, 본 발명은 하기를 제공한다:

(Ⅶ) 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 한 물질을 포함하는 약제학적 조성물:

a) Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호 7)의 서열을 포함하는 펩티드,

b) 상기 a)의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

c) 상기 b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터,

d) 상기 c)의 발현 벡터를 포함하는 세포,

e) 상기 a)의 펩티드로부터 유래된 암항원 펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포, 및

f) 상기 a)의 펩티드로부터 유래된 암항원 펩티드와 HLA-A24 항원과의 복합체를 인식하는 CTL 을 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 함유하는 약제학적 조성물, 구체적으로는 암백신; 암백신 제조에 있어서 상기 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질전환 세포, 항원-제시 세포, 또는 CTL 의 용도, 및 암의 치료 또는 예방 방법에 있어서, 이를 필요로 하는 HLA-A24 및 WT1 에 대해 양성인 환자에게 상기 기술된 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질전환 세포, 항원-제시 세포, 또는 CTL 의 치료적 유효량 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법.

도 1 은 본 발명의 키메라 유전자 (HLA-A2402/K^b 유전자)의 구축에 사용되는 H-2K^b 유전체 DNA 의 제조 방법을 보여주는 모식도이다.

도 2 는 본 발명의 키메라 유전자인, HLA-A2402/K^b 유전자의 제조 방법을 보여주는 모식도이다.

도 3 은 서열번호 33 에 기재된 HLA-A2402/K^b유전체 서열의 제 1 내지 1300 위치 서열과 서열번호 34 에 기재된 HLA-A2402/K^bcDNA 서열의 제 1 내지 407 위치 서열과의 위치 관계를 나타낸 것이다.

도 4 는 서열번호 33 에 기재된 HLA-A2402/K^b유전체 서열의 제 1301 내지 2600 위치 서열과 서열번호 34 에 기재된 HLA-A2402/K^bcDNA 서열의 제 408 내지 1015 위치 서열과의 위치 관계를 나타낸 것이다.

도 5 는 서열번호 33 에 기재된 HLA-A2402/K^b유전체 서열의 제 2601 내지 3857 위치 서열과 서열번호 34 에 기재된 HLA-A2402/K^bcDNA 서열의 제 1016 내지 1119 위치 서열과의 위치 관계를 나타낸 것이다.

도 6 은 HER-2/neu 유래 항원 펩티드 (HER-2/neu_780-788) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 세로축은 세포 유해성 활성 (% Specific Lysis; % 특이적 세포파괴) 을, 가로축은 형질전환 마우스의 이름을 각각 나타낸다. 그래프에서, "pep+" 은 펩티드 펄스된 표적 세포를 이용하여 수득된 결과를, "pep-" 은 임의의 펩티드 펄스되지 않은 표적 세포를 이용하여 수득된 결과를 나타낸다.

도 7 은 MAGE-3 유래 항원 펩티드 (MAGE-3_195-203) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 8 은 CEA 유래 항원 펩티드 (CEA_652-660) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 9 는 CEA 유래 항원 펩티드 (CEA_268-277) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 10 은 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 A, WT1_126-134) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되지 않음을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 11 은 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 B, WT1_302-310) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 12 는 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 C, WT1_417-425) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되지 않음을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 13 은 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 D, WT1_285-294) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되지 않음을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 14 는 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 E, WT1_326-335) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되지 않음을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 15 는 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 A, WT1_126-134)의 제 2 위치에서의 아미노산 잔기가 타이로신으로 바뀐 변경 펩티드(펩티드 F)에 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 16 은 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 B, WT1_302-310)의 제 2 위치에서의 아미노산 잔기가 타이로신으로 바뀐 변경 펩티드(펩티드 G) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 17 은 인간 WT1 유래 항원 펩티드 (펩티드 C, WT1_417-425)의 제 2 위치에서의 아미노산 잔기가 타이로신으로 바뀐 변경 펩티드(펩티드 H) 를 사용해 본 발명의 HLA-A24 발현 형질전환 마우스를 면역시, 특이적 CTL 이 유도되는 것을 보여주는 그래프이다. 그래프에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대는 도 6 에 기술된 의미와 동일하다.

도 18 은, HLA-A24 가 발현된 본 발명의 트랜스제닉 마우스를, 인간 WT1에서 유래된 항원 펩티드 (펩티드 K, WT1_10-18) 내 2번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신으로 변형된 변경 펩티드 (펩티드 Ⅰ) 로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대의 의미는 도 6 에서 기재한 바와 동일하다.

도 19 는, HLA-A24 가 발현된 본 발명의 트랜스제닉 마우스를, 인간 WT1에서 유래된 항원 펩티드 (펩티드 L, WT1 239-247) 내 2번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신으로 변형된 변경 펩티드 (펩티드 J) 로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대의 의미는 도 6에서 기재한 바와 동일하다.

도 20 은, 변경 펩티드 (펩티드 H에서 천연 펩티드로) 에 의해 유도된 이펙터 세포의 교차 반응성 시험 결과를 보여준다. 상기 도에서, 세로축은 CTL-유도 활성 (% Specific Lysis) 을 나타내고, 가로축은 각각의 트랜스제닉 마우스의 이름을 나타낸다. 또한, 상기 도에서, 백색 막대는 변경 펩티드 (펩티드 H) 로 펄스된 표적 세포를 사용하여 수득한 결과를 보여주고, 점선 막대는 천연 펩티드 (펩티드 C) 로 펄스된 표적 세포를 사용하여 수득한 결과를 보여주며, 흑색 막대는 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 사용하여 수득한 결과를 보여준다.

도 21 은, HLA-A24 가 발현된 본 발명의 트랜스제닉 마우스를, 인간 WT1에서 유래된 항원 펩티드 (펩티드 K, WT1_10-18) 로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되지 않았음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대의 의미는 도 6에서 기재한 바와 동일하다.

도 22 는, HLA-A24 가 발현된 본 발명의 트랜스제닉 마우스를, 인간 WT1에서 유래된 항원 펩티드 (펩티드 L, WT1_239-247) 로 면역화하였을 경우, 특정 CTL이 유도되지 않았음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 백색 막대, 및 흑색 막대의 의미는 도 6에서 기재한 바와 동일하다.

도 23 은, HLA-A2402 양성인 건강한 공여자로부터 얻은 말초혈의 단핵구 세포를, 시험관 내에서, 인간 WT1에서 유래된 항원 펩티드 (펩티드 B, WT1_302-310) 또는 펩티드 B 내 2번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신으로 변형된 이것의 변경 펩티드 (펩티드 G) 로 자극하였을 경우, CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축은 세포독성 활성을 나타내고, 가로축은 이펙터 세포 (E) 및 표적 세포 (T) 의 비, 즉 E/T를 나타낸다. 흑색 원 및 흑색 삼각형은 각각 다중 변형된 펩티드 및 천연 펩티드로 자극된 이펙터 세포의 세포독성 활성을 나타낸다.

도 24 는, HLA-A2402 양성인 건강한 공여자로부터 얻은 말초혈의 단핵구 세포를, 생체 내에서, 인간 WT1에서 유래된 항원 펩티드 (펩티드 B, WT1_302-310) 또는 펩티드 B 내 2번 위치의 아미노산 잔기가 타이로신으로 변형된 이것의 변경 펩티드 (펩티드 G) 로 자극하였을 경우, CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축은 세포독성 활성을 나타내고, 가로축은 이펙터 세포 (E) 및 표적 세포 (T) 의 비, 즉 E/T를 나타낸다. 흑색 원 및 흑색 삼각형은 각각 RERF-LC-AI 세포 및 LK87 세포의 다중 변형된 펩티드로 자극된 이펙터 세포의 세포독성 활성을 나타낸다. 백색 원, 백색 삼각형 및 백색 사각형은 각각 RERF-LC-AI 세포, LK87 세포 및 11-18 세포의 천연 펩티드로 자극된 이펙터 세포의 세포독성 활성을 나타낸다.

도 25 는, HLA-A24 가 발현된 트랜스제닉 마우스를 펩티드 H 로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축은 세포독성 활성 (% Specific Lysis)을 나타내고, 가로축은 E/T 비를 나타낸다. 흑색 원 및 백색 원은 각각 펩티드 H (면역원성 펩티드) 로 펄스된 표적 세포를 사용하여 수득한 결과 및 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포로 수득한 결과를 나타낸다.

도 26 은, HLA-A24 가 발현된 트랜스제닉 마우스를 펩티드 M 으로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 흑색 원 및 백색 원의 의미는 도 25에서 기재한 바와 동일하다.

도 27 은, HLA-A24 가 발현된 트랜스제닉 마우스를 펩티드 N 으로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 흑색 원 및 백색 원의 의미는 도 25에서 기재한 바와 동일하다.

도 28 은, HLA-A24 가 발현된 트랜스제닉 마우스를 펩티드 O 로 면역화 하였을 경우, 특정 CTL이 유도되었음을 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 흑색 원 및 백색 원의 의미는 도 25에서 기재한 바와 동일하다.

도 29 는, 치환된 펩티드 (치환된 펩티드인 펩티드 M 대 비치환 펩티드인 펩티드 H) 에 의해 유도된 이펙터 세포의 교차 반응 시험 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축은 CTL-유도 활성 (% Specific Lysis) 을 나타내고, 가로축은 E/T 비를 나타낸다. 또한, 상기 도에서, 흑색 원, 흑색 사각형 및 백색 원은, 펩티드 M (면역원성 펩티드), 펩티드 H 로 펄스된 표적 세포 및 어떠한 펩티드로도 펄스되지 않은 세포를 이용하여 수득한 결과를 나타낸다.

도 30 은, 치환된 펩티드 (치환된 펩티드 N 대 비치환 펩티드인 펩티드 H) 에 의해 유도된 이펙터 세포의 교차 반응 시험 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 도에서, 세로축, 가로축, 흑색 원, 흑색 사각형 및 백색 원의 의미는 도 29에서 기재한 바와 동일하다.

본 발명을 수행하기 위한 최적의 방법

(Ⅰ) 본 발명에 따른 펩티드

본 발명의 펩티드는 인간 WT1 (Cell, 60:509, 1990, NCBI database 접근 번호 XP_034418, 서열 번호 1)에서 유래되었고, HLA-A24 구속성 방식으로 생체 내에서 CTL (면역원성)을 유도하는 활성을 가진다.

본 발명의 펩티드는 항원 제시 세포에 제시되어, HLA-A24 항원 구속성 방식으로 생체 내에서 CTL 을 유도하는 특성을 가진다. 그러한 특성을, 하기 참조 문헌에 자세히 기재된 HLA-A24 의 동물 모델을 이용하여 측정할 수 있다.

서열 번호 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 본 발명의 펩티드는, 그 펩티드가 펩티드에서 유도된 암 항원 펩티드가 항원 제시 세포에 제시되어 CTL을 유도하는 특성을 가지고 있는 한 전혀 제한되지 않는다. 상기 펩티드의 아미노산 잔기의 통상적 길이는 보통 9-100, 바람직하게는 9-50, 더욱 바람직하게는 9-30, 더 더욱 바람직하게는 9-20, 보다 더 바람직하게는 9-11 이다. 여기서, 암 항원 펩티드는, 항원 제시 세포에 제시 될 경우, CTL 유도 활성을 일으키는 펩티드로서 정의 내린다.

본 발명의 펩티드는 펩티드 화학계에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 그러한 제조 방법의 예로는 하기의 문헌에 기재된 방법들이 있다:

"Peptide Synthesis" Interscience, New York, 1966; "The Proteins" vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Pepuchido-Gosei", Maruzen Co. Ltd., 1975; "Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn", Maruzen Co. Ltd., 1985; 및 "Iyakuhin-no-Kaihatu, Zoku, vol. 14, Peputido-Gosei", Hirokawa Shoten, 1991.

본 발명의 펩티드는, 또한 종래의 DNA 합성 및 유전 공학 방법에 따라 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 정보를 기초로 하여 제조할 수도 있다. DNA 합성, 다양한 플라스미드의 구축, 상기 플라스미드의 숙주 세포로의 트랜스펙션, 형질전환주의 배양 및 상기 배양으로부터 단백질의 회수와 같은 방법은, 당업자에 공지된 방법, 문헌 (Molecular Coling, T. Maniatis 등, CSH Laboratory(1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS(1985)) 에 기재된 방법 또는 하기의 (Ⅱ) 에 기재된 방법에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드의 특정한 예를 하기에 제공한다.

(1) 서열 번호 2-6 으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 펩티드

상기하였듯이, 본 발명은 서열 번호 2-6 에 나타낸 바와 같은 WT1 에서 유도된 변경된 펩티드가 생체 내에서 CTL을 유도하는 활성을 갖고 있다는 사실의 새로운 발견에 기초하고 있다. 서열 번호 2-6 에 나타낸 새로운 펩티드가 생체 내에서 CTL을 유도하는 활성을 확실히 가진다는 사실은 이전에는 공지된 바 없다. 상기 변형된 펩티드 중 임의의 하나를 포함하는 펩티드는, 암 치료를 위한 면역 요법에서 사용하는 CTL 유도용 조성물 또는 암 백신에 포함되는 활성 성분으로서 유용 하다.

구체적으로, 본 발명의 펩티드는 하기의 펩티드 중 임의의 하나를 포함한다:

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호 2),

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 3),

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 4),

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 5), 및

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 6).

이들 중에서, Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 4) 서열을 포함하는 펩티드 및 Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 5) 서열을 포함하는 펩티드가 바람직하다.

본 발명에 따른 더욱 특정한 펩티드의 예는 하기의 (1-1) 내지 (1-4) 에 나타낸 펩티드를 포함한다.

(1-1) 서열 번호 2-6 으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 중 임의의 하나로 이루어진 펩티드

서열 번호 2-6 의 아미노산 서열 중 임의의 하나로 이루어진 펩티드의 특정한 예는 하기의 암 항원 펩티드를 포함한다:

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호 2) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드,

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 3) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드,

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 4) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드,

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 5) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드 및

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 6) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드.

이들 중에서, Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 4) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드 및 Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 5) 서열로 이루어진 암 항원 펩티드가 바람직하다. 상기 펩티드는 상기한 바와 같은 통상적인 펩티드 합성 방법에 따라 제조할 수 있다. 생체 내에서 CTL을 유도하는 상기 펩티드의 활성은 하기의 참조 문헌에 기재된 인간을 위한 동물 모델로 측정할 수 있다.

(1-2) 서열 번호 2-6 의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하며, 모티프 구조를 포함하는 펩티드

HLA 분자 내에는 다수의 하위 유형이 존재하며, 각각의 하위 유형에 결합하는 항원 펩티드의 아미노산 서열이 특정한 규칙성 (결합 모티프)을 지닌다는 사실이 공지되어 있다. 또한, HLA-A24 에 대한 결합 모티프에 관하여, 8-11 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 있어서, 2 번 위치의 아미노산은 타이로신 (Tyr), 페닐알라닌 (Phe), 메티오닌 (Met) 또는 트립토판 (Trp) 이고, C-말단의 아미노산은 페닐알라닌 (Phe), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile), 트립토판 (Trp) 또는 메 티오닌(Met)이다 (J. Immunol, 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol, 155, p4307, 1994).

상기의 규칙성을 기초로 하여, 본 발명에 따른 펩티드의 예로는, 하기의 9 개 아미노산 잔기로 이루어진 암 항원 펩티드 중 임의의 하나의 C-말단에 Phe, Leu, Ile, Trp 또는 Met 이 첨가된 10 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드:

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호 2),

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 3),

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 4),

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 5), 또는

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 6),

및 10 개의 아미노산 잔기로 이루어진 상기 펩티드 중 임의의 하나의 C-말단에 Phe, Leu, Ile, Trp 또는 Met 이 추가로 첨가된 11 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드가 포함되며, 이들 모두는 생체 내에서 CTL을 유도하는 활성을 가진다. 상기 펩티드는 상기에 기재한 통상적인 펩티드 합성 방법에 따라 제조할 수 있다. 생체 내에서 CTL을 유도하는 상기 펩티드의 활성은, 하기의 참조 문헌에 기재된 인간을 위한 동물 모델로 측정할 수 있다.

(1-3) 서열 번호 2-6 의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 에피토프 펩티드

최근에, 다수의 CTL 에피토프 (항원 펩티드) 가 서로 결합된 펩티드 (에피토프 펩티드) 는 생체 내에서 CTL을 효과적으로 유도하는 활성을 지닌다는 사실이 증 명되었다. 예를 들어, 논문 [Journal of Immunology 1998,161: 3186-3194] 은 HLA-A2, -A3, -A11, 암 항원 단백질에서 유래된 B53-구속성 CTL 에피토프, PSA 가 서로 결합된 약 30-머 펩티드가, 생체 내에서 관련된 CTL 에피토프에 특이적인 CTL을 유도한다는 사실을 기재하고 있다.

또한, CTL, 에피토프 및 헬퍼 (helper) 에피토프가 서로 결합된 펩티드 (에피토프 펩티드) 는 효과적으로 CTL을 유도한다는 사실이 증명되었다. 헬퍼 에피토프란 CD4-양성 T 세포를 활성화시키는 펩티드를 말하는 것으로 (Immunology, 1:751, 1994), B형 간염 바이러스에서 유래된 HBVc 128-140 및 파상풍 독소에서 유래된 TT 947-967을 포함하는 것으로 알려져 있다. 헬퍼 에피토프에 의해 활성화된 CD4-양성 T 세포는, 암을 파괴하기 위한 면역 반응에 있어서 중요하다고 생각되는데, 이는 이들이 CTL 분화의 유도 및 CTL의 유지 및 대식세포를 포함하는 이펙터의 활성화와 같은 작용을 하기 때문이다. 헬퍼 에피토프 및 CTL 에피토프가 서로 결합된 펩티드의 예로서, 예컨대 논문 [Journal of Immunology 1999, 162: 3915-3925] 은, 6 개의 HLA-A2 구속성 항원 펩티드, HBV에서 유래된 3 개의 HLA-A11 구속성 항원 펩티드 및 헬퍼 에피토프 (미니 유전자) 와 결합된 펩티드를 암호화하는 DNA 가 생체 내에서 관련된 에피토프에 응답하여 효과적으로 CTL을 유도한다고 기재하고 있다. 또한, CTL 에피토프 (흑색종 항원의 280 내지 288 번 위치로 이루어진 암 항원 펩티드, gp 100) 및 헬퍼 에피토프 (파상풍 독소에서 유래된 T 헬퍼 에피토프) 가 서로 결합된 펩티드를 임상 시험에서 테스트하였다 (Clinical Cancer Res, 2001, 7: 3012-3024).

상기 발견을 기초로 하여, 암 항원 펩티드 또는 상기 (1-1) 또는 (1-2) 에 나타낸 펩티드가 다양한 에피토프와 결합된 펩티드 (에피토프 펩티드) 로서, 생체 내에서 CTL을 유도하는 활성을 지닌 펩티드 또한 본 발명에 따른 펩티드의 예가 된다.

본 발명의 암 항원 펩티드와 결합되는 에피토프가 CTL 에피토프인 경우, 사용 가능한 CTL 에피토프에는 HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -A11, -A24, -A31, -A6801, -B7, -B8, -B2705, -B37, -Cw0401, -Cw0602 등에 구속성인 WT1에서 유도된 에피토프가 있다. 2 가지 이상의 에피토프가 결합될 수 있는데, 다양한 HLA 분자에 결합된 항원 펩티드 분석을 기초로, 하나의 CTL 에피토프는 길이가 8-14 아미노산 잔기일 수 있다 (Immunogenetics, 41: 178, 1995).

본 발명의 암 항원 펩티드와 결합되는 에피토프가 헬퍼 에피토프인 경우, 상기에 언급한 B형 간염 바이러스에서 유래된 HBVc 128-140 및 파상풍 독소에서 유래한 TT 947-967를 예로 들 수 있다. 헬퍼 에피토프의 길이는 약 13 - 약 30 개, 바람직하게는 약 13 - 약 17 개의 아미노산 잔기일 수 있다.

본 발명에 따른 에피토프 펩티드의 구체적인 예로는, 서열 번호 2-6 중 임의의 하나의 아미노산 서열 하나 이상이 헬퍼 에피토프와 결합된 펩티드를 포함한다. 더욱 구체적으로는, 서열 번호 2-6 중 임의의 하나의 아미노산 서열 하나 이상이 파상풍 독소에서 유래된 헬퍼 에피토프 (예를 들어, Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu; 서열 번호 32)와 결합된 펩티드 및 서열 번호 2-6 중 임의의 하나의 아미노산 서열 하나 이상이 Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu (서열 번호 50, Clinical Cancer Res, 2001, 7: 3012-3024) 의 서열과 결합된 펩티드를 예로 들 수 있다.

다양한 에피토프가 서로 결합되어 있는 상기 펩티드 (에피토프 펩티드) 는 상기 언급한 통상적인 펩티드 합성 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 상기 펩티드는, 다양한 에피토프가 서로 결합된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 정보를 기초로 하여, 종래의 DNA 합성 및 유전 공학적 방법에 따라 제조할 수도 있다. 즉, 폴리뉴클레오티드를 공지된 발현 벡터 (expression vector) 에 삽입하고, 숙주 세포를 재조합 발현 벡터로 형질 변환시킨 후, 형질변환주를 배양한 다음, 다양한 계획된 에피토프가 서로 결합된 에피토프 펩티드를 배양 세포에서 회수함으로써 펩티드를 제조할 수 있다. 상기 방법은 문헌 (Molecular Cloning, T. Maniatis 등, CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) 에 기재된 방법 또는 하기의 (Ⅱ)에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

이렇게 제조되어 생체 내에서 CTL을 유도하는 에피토프 펩티드 (다양한 에피토프가 서로 결합됨)의 활성은, 하기의 참조 문헌에 기재된 인간을 위한 동물 모델로 측정할 수 있다.

(1-4) N-말단 아미노산의 아미노기 또는 C-말단 아미노산의 카르복실기가 변형된, 서열 번호 2-6 의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하는 펩티드

상기 (1-1) 내지 (1-3)에 기재된 본 발명의 펩티드 내 N-말단 아미노산의 아미노기 또는 C-말단 아미노산의 카르복실기는 개질될 수 있다.

여기서, N-말단 아미노산의 아미노기의 변형 기에는, 탄소수 1-6의 알킬기, 페닐기, 시클로알킬기, 아실기 등이 포함되며, 이 중 1 내지 3 개를 선택할 수 있다. 아실기의 예로는, 탄소수 1-6의 알카노일기, 페닐기로 치환된 탄소수 1-6의 알카노일기, 탄소수 5-7의 시클로알킬기로 치환된 카르보닐기, 탄소수 1-6의 알킬술포닐기, 페닐술포닐기, 탄소수 2-6의 알콕시카르보닐기, 페닐기로 치환된 알콕시카르보닐기, 탄소수 5-7의 시클로알콕시로 치환된 카르보닐기, 페녹시카르보닐기 등이 있다.

C-말단 아미노산의 카르복실기가 개질된 펩티드에는 에스테르 및 아미드가 포함된다. 구체적인 에스테르에는 C1-C6 알킬 에스테르, 페닐기로 치환된 C0-C6 알킬 에스테르, C5-C7 시클로알킬 에스테르 등이 포함되며, 구체적인 아미드에는 아미드, 하나 또는 두 개의 C1-C6 알킬기로 치환된 아미드, 페닐기로 치환된 하나 또는 두 개의 C0-C6 알킬기로 치환된 아미드, 아미드의 질소 원자를 함유한 5 내지 7 원 아즈아시클로알칸(azacycloalkane)을 형성하는 아미드가 포함된다.

(2) 아미노산 잔기의 변경이 서열 번호 2-6로 이루어진 군에서 선택된 임의의 아미노산 서열에 포함된 변경 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 (다중 변경 펩티드)

본 발명은, 서열 번호 2-6로 나타낸 바와 같은 WT1에서 유래한 변형된 펩티드가 생체 내에서 CTL을 유도하는 상기 활성을 가진다는 사실의 새로운 발견에 기초한다. 생체 내에서 CTL을 유도하는 활성을 가진 상기 펩티드의 아미노산을 추가로 변경하여, CTL을 유도하는 동등한 또는 더욱 효과적인 활성을 갖는 다중 변경 펩티드를 이끌어 낼 수 있다. 이러한 개념을 토대로, 본 발명은 임의의 서열 번호 2-6 펩티드의 아미노산 서열에 대하여 변경된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다 (이러한 펩티드를 하기에서 다중 변경 펩티드로 일컬을 수 있다).

구체적으로, 본 발명은, 아미노산 잔기의 변경이 서열 번호 2, 3, 4, 5 및 6 으로 이루어진 군에서 선택된 임의의 아미노산 서열 중 하나에 포함되는 펩티드를 제공하며, 상기 펩티드는, 서열 번호 7 의 아미노산을 포함하는 펩티드가 본 발명에 따른 펩티드의 범위에서 제외되어 있다면, CTL 을 유도하는 활성을 가진다.

본 명세서에서, 아미노산 잔기의 "변경" 은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 및/또는 부가를 의미하며, 여기서 아미노산 잔기의 치환이 바람직하다. 아미노산 잔기의 치환에 관한 변경에 있어서, 치환될 아미노산 잔기의 수 및 위치는, 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성이 유지되는 한 임의적으로 결정할 수 있다. 변경된 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드의 예로는 하기의 펩티드가 포함된다.

상기 하였듯이, HLA-A24 의 결합 모티프와 관련하여, 8-11 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드에 있어서, 2 번 위치의 아미노산은 타이로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌 (Met) 또는 트립토판 (Trp) 이고, C-말단의 아미노산은 페닐알라닌 (Phe), 류신 (Leu), 이소류신 (Ile), 트립토판 (Trp) 또는 메티오닌 (Met) 이다 (J. Immunol, 152, p3913, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995, J. Immunol, 155, p4307, 1994). 규칙성을 토대로, 본 발명에 따른 다중 변경 펩티드는, 임의의 서열 번호 2-6 중 하나의 아미노산 서열 내 2 번 및/또는 9 번 위치의 아미노산 잔기를 상기한 모티프로 사용 가능한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다.

2 번 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 다중 변경 펩티드의 구체적 예로는, 하기의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하며, 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 지닌 펩티드가 포함된다:

Arg Phe Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호 53),

Arg Trp Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호 54),

Arg Phe Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 55),

Arg Met Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 56),

Arg Trp Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 57),

Arg Phe Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 58),

Arg Met Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 59),

Ala Phe Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 60),

Ala Met Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 61),

Ala Trp Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 62),

Asn Phe Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 63),

Asn Met Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 64), 및

Asn Trp Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 65).

그러한 펩티드에는, 상기 서열 번호 53-65 의 아미노산 서열 중 임의의 하나로 이루어지며, 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 지닌 펩티드가 포함된다.

서열 번호 2-6 에 따른 본 발명의 모든 펩티드는, 인간 WT1 에서 유래한 천연 펩티드의 2 번 위치의 아미노산 잔기를 변경하여, CTL 을 효과적으로 유도하는 활성을 지닌 변경된 펩티드를 제공하도록 함으로써 완성되었다. 여기서, 본 발명의 다중 변경 펩티드 내 2 번 위치의 아미노산 잔기는 바람직하게는 타이로신이다. 반면에, 다중 변경 펩티드 내 C-말단의 아미노산 잔기는 상기의 모티프로 사용 가능한 아미노산 잔기로 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 다중 변경 펩티드의 구체적인 예에는, 하기의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함하며 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 가진 펩티드를 포함한다:

상기 펩티드에는 상기 나타낸 서열번호: 12 내지 31 의 아미노산 서열 중 임의 하나로 이루어지고, 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 갖는 펩티드가 포함된다.

본 발명의 추가예에는 위치 2 에서 아미노산 잔기의 변경을 포함하는 다중-변경 펩티드에서 위치 2 의 아미노산 잔기의 변경 및 상술된 C-말단에서 아미노산 잔기의 변경을 둘 다 포함하는 암 항원 펩티드가 포함된다.

서열번호: 4 의 아미노산 서열에는 용액 중 산화되어 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기가 포함된다. 이를 피하기 위해, 시스테인 잔기를 화학 구조가 시스테인 잔기와 유사한 또다른 아미노산 잔기, 예컨대 α-아미노부티르산 또는 알라닌 잔기, 세린 잔기 등으로 치환시켜, 다중-변경 펩티드를 제공할 수 있다.

본 구현예에 따른 다중-변경 펩티드의 구체예에는 하기 아미노산 서열 중 임의 하나를 포함하고, 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 갖는 펩티드가 포함된다:

(여기서, Abu 는 α-아미노부티르산이다).

펩티드에는 상기 나타낸 서열번호: 66 내지 68 의 아미노산 서열 중 임의 하나로 이루어지고, 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성을 갖는 암 항원 펩티드가 포 함된다.

상기 펩티드는 상술된 바와 같은 펩티드 합성용 통상 방법에 따라 제조될 수 있다. 생체 내에서 CTL 을 유도하는 펩티드의 상기 활성은 이후 참고문헌에 기재된 인간에 대한 동물 모델에서 결정될 수 있다.

상술된 바와 같은 본 발명의 다중-변경 펩티드는 또한 상기 (1-2) 에 나타낸 바와 같은 모티브 구조를 얻어, 상기 (1-3) 에 나타낸 바와 같은 여러 에피토프와 연결하거나 상기 (1-4) 에 나타낸 바와 같은 아미노 또는 카르복실기로 개질함으로써 또한 개질할 수 있다.

본 발명의 펩티드는, 예를 들어 이후 기재되는 항원-제시 세포의 제조에서, 또는 CTL 유도용 조성물 또는 암 백신에 함유하는 활성 성분으로서 유용하다.

(II) 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 및 형질전환체

본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 중 어느 한 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열 및 상기물을 코딩하는 DNA 의 정보에 근거하여 쉽게 제조될 수 있다. 구체적으로, 이들은 DNA 합성 또는 PCR 증폭을 위한 통상 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 예에는 하기가 포함된다:

하기 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드:

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열번호: 2)

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열번호: 3)

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열번호 4)

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열번호 5)

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열번호 6)

Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe (서열번호 66)

Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe (서열번호 67)

Arg Tyr Pro Ser Abu Gln Lys Lys Phe (서열번호 68)(여기서, Abu 는 α-아미노부티르산이다).

폴리뉴클레오티드의 구체예에는 상기 (1-3) 에 기재된 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의의 한 아미노산 서열을 포함하는 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 보다 구체적으로, 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의 하나 이상의 아미노산 서열이 테타누스 독소 유래의 헬퍼 에피토프 (예를 들어,

; 서열번호: 32) 에 연결된 펩티드, 및 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의 하나 이상의 아미노산 서열이

서열 (서열번호: 50, Clinical cancer Res., 2001, 7:3012-3024) 에 연결된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의 하나 이상의 아미노산 서열이 헬퍼 에피토프에 연결된 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 예시된다.

이렇게 제조된 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 삽입되어, 본 발명의 펩티드 발현용 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다.

본원에서 사용되는 발현 벡터는 사용 목적 및 숙주에 따라 적절히 선택될 수 있고, 플라스미드, 파지 벡터 및 바이러스 벡터가 포함된다.

대장균 숙주용으로 사용되는 벡터의 예에는 플라스미드 벡터, 예컨대 pUC118, pUC119, pBR322 및 pCR3, 및 파지 벡터, 예컨대 λZAPII 및 λgt11 이 포함된다. 효모 숙주용으로 사용되는 벡터의 예에는 pYES2 및 pYEUra3 이 포함된다. 곤충 세포 숙주용으로 사용되는 벡터의 예에는 pAcSGHisNT-A 가 포함된다. 동물 세포 숙주용으로 사용되는 벡터의 예에는 플라스미드 벡터, 예컨대 pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, 및 pRc/CMV 및 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노관련 바이러스 벡터가 포함된다.

상기 벡터에는 필요한 경우 발현 유도용 프로모터, 시그날 서열을 코딩하는 유전자, 선택 표지 유전자, 터미네이터 등과 같은 인자가 포함될 수 있다.

또한, 벡터는 융합 단백질을 제공하는, 용이한 단리 및 정제를 위한 티오레독신, His-태그 또는 GST (글루타티온 S-트랜스퍼라아제) 용 부가 서열을 포함할 수 있다. 상기 경우, 숙주 세포 내에서 적합하게 작동하는 프로모터 (lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 초기 프로모터 등) 를 포함하는 GST-융합 단백질 발현용 벡터 (즉, pGEX4T), Myc, His 등과 같은 태그-서열을 포함하는 벡터 (즉, pcDNA3.1/Myc-His) 및 티오레독신 또는 His-태그를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 벡터 (pET32a) 를 사용할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 상기물을 포함하는 발현 벡터가 생체 내에서 CTL 을 유도하는 활성은 이후 참고문헌에 기재되는 인간에 대한 동물 모델에서 결정될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상기물을 포함하는 발현 벡터는, 예를 들어 본 발명의 펩티드 제조, 이후 기재되는 바와 같은 유전자 치료법 또는 이후 기재되는 바와 같은 항원-제시 세포의 제조에 유용하다.

이렇게 제조된 본 발명의 발현 벡터는 숙주 내로 형질전환되어 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제조할 수 있다.

본원에서 사용되는 숙주에는 대장균, 효모, 곤충 세포 및 동물 세포가 포함된다. 대장균에는 대장균 K-12 주, 예컨대 HB101 주, C600 주, JM109 주, DH5α주 및 AD494(DE3) 주가 포함된다. 효모에는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 가 포함된다. 동물 세포에는 L929 세포, BALB/c3T3 세포, C127 세포, CHO 세포, COS 세포, Vero 세포 및 Hela 세포가 포함된다. 곤충 세포에는 sf9 가 포함된다.

각각의 숙주 세포에 적합한 형질전환용 통상 방법을 이용하여, 숙주 세포를 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 구체적 방법에는 인산칼슘 방법, DEAE-덱스트란 방법, 전기천공, 및 유전자 전달용 지질 (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL) 이 사용되는 방법이 포함된다. 형질전환 후, 형질전환체를 선택 표지를 포함하는 종래 배지에서 인큐베이션하여, 상술된 바와 같은 발현 벡터가 숙주 세포 내로 형질전환된 형질전환체를 선택할 수 있다.

이렇게 제조된 형질전환체를 적절한 조건 하에 인큐베이션하여, 본 발명의 펩티드를 제조할 수 있다. 폴리펩티드는 생화학 정제용의 통상 절차에 따라 추가로 단리 및 정제될 수 있다. 정제용 절차의 예에는 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 및 겔 여과 크로마토그래피가 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드가 티오레독신, His-태그, GST 등을 포함하는 융합 단백질로 발현되는 경우, 폴리펩티드는 상기 융합 단백질 또는 태그의 특성에 근거한 정제 방법에 의해 단리 및 정제될 수 있다.

(III) 본 발명의 항체

본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 특정 항체에 제한되지 않고, 면역 항원으로 본 발명의 펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다.

상술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 이들이 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합하는 한, 특정 항체에 제한되지 않고, 구체예에는 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 로부터 선택되는 아미노산 서열의 임의 하나로 이루어진 암 항원 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 포함된다.

항체 제조는 널리 공지되어 있으며, 본 발명의 항체는 당 분야에 널리 공지된 통상 방법에 따라 제조될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel 등 (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12~11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. 등 편저, Cold Spring Harber Laboratory Press Publisher, New York 1989).

구체적으로, 항체는 토끼와 같은 비인간 동물을 면역화시키기 위한 면역원으로서, 본 발명의 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 로부터 선택되는 아미노산 서열 중 임의 하나로 이루어진 암 항원 펩티드) 를 이용한 후, 종래 방법으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 항체를 수득하여 제조될 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 본 발명의 펩티드 (예를 들어, 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 로부터 선택되는 아미노산 서열 중 임의 하나로 이루어진 암 항원 펩티드) 로 마우스와 같은 비인간 동물을 면역화시켜, 세포 융합에 의해 수득된 비장세포 및 골수종 세포로부터 하이브리도마를 제조한 후, 하이브리도마로부터 항체를 수득하여 제조될 수 있다 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel 등 (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4~11.11).

본 발명의 펩티드에 대해 생성된 항체는 숙주에 적합한 다양한 아쥬번트를 사용하여 면역학적 반응을 증강시키는 방식으로 제조될 수 있다. 아쥬번트의 예에는 프로인트 (Freund's) 아쥬번트, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성제, 예컨대 리소레시틴 및 Pluronic 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, Keyhole limpet Hemocyanin, 디니트로페놀 및 인간 아쥬번트, 예컨대 BCG (Bacille Calmette Guerin) 및 Corynebacterium-parvum 이 포함된다.

상술된 바와 같이, 펩티드를 인지하는 항체 뿐만 아니라 펩티드 활성을 중화시키는 항체도 종래 방식으로 동물을 본 발명의 펩티드로 적절히 면역화시켜 쉽게 제조될 수 있다. 상기 항체는 친화도 크로마토그래피, 면역학적 진단 등에서 사용될 수 있다. 면역학적 진단은 면역블롯팅, 방사면역분석 (RIA), 효소 연관 면역흡착 분석 (ELISA), 형광 또는 발광 분석 등으로부터 적절히 선택될 수 있다. 면역학적 진단은 WT1 유전자가 발현되는 암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암 및 난소암을 진단하는데 유용하다.

(IV) 본 발명의 항원 제시 세포

본 발명은 본 발명의 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체가 제시되는 항원 제시 세포를 제공한다.

이후 기재되는 예는 본 발명의 펩티드 투여가 CTL 을 유도하여, 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체가 제시되는 항원 제시 세포가 말초 혈액 단핵구에 존재함을 나타내며, 이어서 상기 복합체가 제시되는 암 세포를 특이적으로 손상시키는 CTL 을 유도함을 나타낸다. 본 발명에 따른 펩 티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체가 제시되는 상기 항원 제시 세포는 이후 기재되는 바와 같은 세포 치료법 (DC 치료법) 에 유용하다.

본 발명의 항원 제시 세포는 이들이 그 표면 상에 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 제시하는 한 특정 세포에 제한되지 않으며, 바람직하게는 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의 하나의 아미노산 서열로 이루어진 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체가 제시되는 수지상 세포의 항원 제시 세포가 포함된다.

세포 치료법에 사용되는 항원 제시 세포를 제조하기 위해, 항원 제시력을 갖는 세포를 암 환자로부터 단리하여, 본 발명의 펩티드로 생체 외에서 펄스를 주거나 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상기물을 함유하는 발현 벡터로 형질전환시켜서 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 제시시킨다. 이와 관련하여, "항원 제시력을 갖는 세포" 는 이것이 세포 표면에 본 발명의 펩티드가 제시될 수 있게 하는 HLA-A24 항원을 발현하는 세포인 한 특정 세포에 제한되지 않으며, 특히 높은 항원 제시력을 갖는 것으로 여겨지는 수지상 세포가 바람직하게 예시된다.

항원 제시력을 갖는 세포에 펄스를 줄 물질은 본 발명의 펩티드 뿐만 아니라 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기물을 함유하는 발현 벡터일 수 있다.

본 발명의 항원 제시 세포는, 예를 들어 암 환자로부터 항원 제시력을 갖는 세포를 단리하여, 세포를 본 발명의 펩티드 (서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의 하나의 아미노산 서열로 이루어진 암 항원 펩티드) 로 생체 외에서 펄스를 주고, 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 제작하여 제조할 수 있다 (Cancer Immunol. Immunother., 46: 82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59: p1184, 1999). 수지상 세포가 사용되는 경우, 본 발명의 항원 제시 세포는, 예를 들어 Ficoll 방법을 이용하여 암 환자의 말초 혈액으로부터 임파구를 단리하고, 비부착 세포를 제거하고, 부착 세포를 GM-CSF 및 IL-4 의 존재 하에 인큐베이션하여 수지상 세포를 유도하고, 상기 수지상 세포를 본 발명의 펩티드 등과 인큐베이션 및 펄스를 주어 제조할 수 있다.

본 발명의 항원 제시 세포가 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의 하나의 서열을 포함하는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 로, 또는 상기물을 포함하는 발현 벡터로 항원 제시력을 갖는 상기 언급된 세포를 형질전환하여 제조되는 경우, DNA 형태의 상기 폴리뉴클레오티드의 제조는, 예를 들어 [Cancer Res., 56: p5672, 1996, 또는 J. Immunol., 161: p5607, 1998] 를 참고로 수행될 수 있다. 유사하게, RNA 형태의 상기 폴리뉴클레오티드의 제조로 항원 제시 세포를 제조할 수 있으며, 예를 들어 [J. Exp. Med., 184: p465, 1996] 을 참고할 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 항원 제시 세포는 CTL 유도용 조성물 또는 암 백신 중 활성 성분으로, 또는 이후 기재되는 세포 치료법 (DC 치료법) 에 유용하다.

(V) 본 발명의 CTL

본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 인지하는 CTL 을 제공한다.

이후 기재되는 예는, 본 발명의 펩티드 투여가 CTL 을 유도하며, 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체가 제시되는 항원 제시 세포가 말초 혈액 단핵구 중에 존재하고, 이어서 상기 복합체가 제시되는 암 세포를 특이적으로 손상시키는 CTL 을 유도함을 나타낸다. 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 특이적으로 인지하는 상기 CTL 은 이후 기재되는 입양 면역치료법에 유용하다.

본 발명의 CTL 은 이들이 본 발명에 따른 펩티드 유래 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 특이적으로 인지하는 한 특정 CTL 에 제한되지 않으며, 특히 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의의 한 아미노산 서열로 이루어진 암 항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 간 복합체를 특이적으로 인지하는 CTL 이 포함된다.

입양 면역치료법에 사용되는 CTL 을 제조하기 위해, 예를 들어 말초 임파구를 환자로부터 단리하여 본 발명의 펩티드 (예컨대 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의의 한 아미노산 서열로 이루어진 암 항원 펩티드) 또는 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대 서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의의 한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드) 또는 상기물을 포함하는 발현 벡터로 시험관 내 자극한다 (Journal of Experimental Medicine 1999, 190: 1669).

이렇게 제조된 본 발명의 CTL 은 암 백신에 포함된 활성 성분으로서, 또는 입양 면역치료법에 유용하다.

(VI) 암 백신으로서의 약제학적 조성물, 용도 및 방법

상기 기재된 바와 같은 본 발명의 펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 항원 제시 세포 및 본 발명의 CTL 은 하기 예시되는 각각의 물질의 적절한 형태로 제형화되는 경우, CTL 유도용 조성물 또는 암 백신에 포함되는 활성 성분으로서 사용될 수 있다.

(6-1) 활성 성분으로서 본 발명의 펩티드를 포함하는 암 백신

CTL 유도 활성을 갖는 본 발명의 펩티드로 유도되는 CTL 은 이들의 세포독성 활성 및 림포카인 생성을 통해 암을 파괴할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 암 치료 또는 예방용 암 백신에서 활성 성분으로 사용될 수 있다. 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는 암 백신 (암 백신으로 사용가능한 약제학적 조성물) 을 제공한다. 본 발명의 암 백신이 HLA-A24 에 양성이고, WT1 에 양성인 암 환자에게 투여되는 경우, 펩티드 (서열번호: 2 내지 6 및 66 내지 68 중 임의의 한 아미노산 서열로 이루어진 암 항원 펩티드) 는 항원 제시 세포의 HLA-A24 항원 상에 제시되며, 이어서 HLA-A24 항원을 포함하는 복합체에 특이적인 CTL 이 효율적으로 증식하여 암 세포를 파괴한다. 상기 방식으로, 암의 치료 또는 예방이 달성된다. 본 발명의 암 백신은 혈액암, 예컨대 백혈병, 골수형성이상 증후군, 다발성 골수종 및 악성 임파종, 및 고형암, 예컨대 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암을 포함하는, WT1 유전자의 발현 수준이 상승된 암의 치료 또 는 예방에 사용될 수 있다.

이와 관련하여, 다른 구현예로서, 본 발명은 암 백신의 제조에 있어서 본 발명에 따른 펩티드의 용도, 및 본 발명에 따른 펩티드의 유효량을, 이를 필요로 하는 HLA-A24 에 양성이고, WT1 에 양성인 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

활성 성분으로 본 발명의 펩티드를 포함하는 암 백신은 활성 성분으로 단일 CTL 에피토프를 포함할 수 있고, 또는 활성 성분으로 또다른 펩티드 (CTL 에피토프 또는 헬퍼 에피토프) 에 연결된 에피토프 펩티드를 포함할 수 있다. 최근에, 여러 CTL 에피토프 (항원 펩티드) 가 서로 연결된 에피토프 펩티드는 생체 내에서 효율적으로 CTL 을 유도하는 활성을 갖는 것이 알려졌다. 예를 들어, [Journal of Immunology 1998, 161: 3186-3194] 에는 암 항원 단백질 유래의 HLA-A2, -A3, -A11, B53-구속성 CTL 에피토프, PSA (항원 펩티드) 가 서로 연결된 약 30-머 에피토프 펩티드가 생체 내에서 관련된 CTL 에피토프에 특이적인 CTL 을 유도함이 기재되어 있다. 또한, CTL 에피토프 및 헬퍼 에피토프가 서로 연결된 에피토프 펩티드가 효율적으로 CTL 을 유도하는 것으로 나타나 있다. 본 발명의 펩티드가 상기 에피토프 펩티드 형태로 투여되는 경우, 펩티드는 항원 제시 세포 내로 도입된 후 세포내 분해를 거쳐, HLA 항원에 결합하여 복합체를 형성하는 각각의 항원 펩티드를 만든다. 복합체는 항원 제시 세포의 세포 표면에 콤팩트하게 제시된 후, 복합체에 특이적인 CTL 이 효율적으로 증식하여 암 세포를 파괴한다. 이러한 방식으로, 암의 치료 또는 예방이 달성된다.

활성 성분으로 본 발명의 펩티드를 포함하는 암 백신은 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 적합한 아쥬번트와 함께 또는 특정 투여형으로 투여되어, 세포성 면역을 효과적으로 구축할 수 있다. 상기 목적을 위해, 문헌 (Clin. Microbiol. Rev., 7:277-289, 1994) 에 기재된 아쥬번트를 사용할 수 있고, 구체적으로 박테리아 유래 성분, 시토카인, 식물 유래 성분, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성제, 예컨대 리소레시틴 및 Pluronic 폴리올, 폴리음이온, 펩티드 및 오일 에멀젼 (에멀젼 제형) 이 포함된다. 또한 리포좀 제형, 성분이 수 ㎛ 직경을 갖는 비드에 결합된 입상 제형 또는 성분이 지질에 부착된 제형도 또한 가능하다.

투여는, 예를 들어 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사로 달성될 수 있다. 제형 중 본 발명의 펩티드 용량은 치료될 질환, 환자의 연령 및 체중 등에 따라 변할 수 있지만, 전형적으로 매 수일 내지 매 수달 동안 본 발명의 펩티드를 0.0001 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 0.001 mg 내지 1000 mg, 보다 바람직하게는 0.1 mg 내지 10 mg 투여한다.

(6-2) 활성 성분으로 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 DNA 백신

상기 기재된 본 발명의 펩티드 뿐만 아니라, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 암 치료 또는 예방용 DNA 백신에서 활성 성분으로 사용될 수 있다. 구현예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 활성 성분으로 포함하는 암 백신 (암 백신으로 사용가능한 약제학적 조 성물) 을 제공한다. 또다른 구현예에 있어서, 본 발명은 HLA-A24 에 양성이고 WT1 에 양성인 환자에게 본 발명에 따른 DNA 백신의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

최근에, 많은 CTL 에피토프(항원 펩티드)가 서로 연결되어 있는 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 CTL 에피토프 및 헬퍼 에피토프가 서로 연결되어 있는 에피토프 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 생체내에서 CTL을 효과적으로 유도하는 활성을 갖는다는 것이 증명되었다. 문헌 [Journal of Immunology 1999, 162:3915-3925] 는, 예를 들면 6개의 HLA-A2-구속성 항원 펩티드 및 HBV 유래의 세개의 HLA-A11-구속성 항원 펩티드가 연결된 에피토프 펩티드를 코딩하는 DNA, 및 헬퍼 에피토프 (미니진)가 생체내에서 관련된 에피토프에 반응하여 CTL을 효과적으로 유도하는 것을 기술한다.

따라서, 본 발명의 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 서로 연결하거나, 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 다른 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 연결하여 제조되는 폴리뉴클레오티드가 편입된 적절한 발현 벡터는 암백신에서 유효성분으로서 사용될 수 있다.

다음의 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 암백신(DNA 백신)에서 유효성분으로서 작용하도록 하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입은 바이러스 벡터, 또는 임의의 기타 방법 (Nikkei-Science, April, 1994, pp.20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48(1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(5), 1994, 및 본원에 언급된 문헌들)에 따라서 달성될 수 있다.

바이러스 벡터를 사용한 방법의 예는 본 발명의 DNA를 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스바이러스, 우두 바이러스, 마마바이러스, 폴리오바이러스, 또는 신드비스 바이러스와 같은 DNA 또는 RNA 바이러스로의 도입 및 세포로의 도입 방법을 포함한다. 이러한 방법 중에서, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 또는 우두 바이러스를 사용한 것들이 특히 바람직하다.

다른 방법은 발현 플라스미드를 직접 근육에 주사(DNA 예방접종)하는 방법, 리포좀 방법, Lipofectin 방법, 마이크로주입, 인산칼슘 방법, 및 전기천공을 포함하며, DNA 예방접종 및 리포좀 방법이 특히 바람직하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 실상에 있어 약으로 작용하게 하기 위해, 폴리뉴클레오티드를 몸에 직접 주입하는 생체내 방법, 특정 세포를 인간에서 제거하여, 몸밖에서 상기 세포에 DNA를 도입하고, 이 세포를 다시 몸으로 도입 (Nikkei-Science, April, 1994, pp.20-45; Gekkan-Yakuji, 36(1), 23-48(1994); Jikken-Igaku-Zokan, 12(5), 1994, 및 본원에 언급된 문헌들)하는 생체외 방법이 있다.

생체내 방법의 경우, 폴리뉴클레오티드는 치료될 증상 및 질병 및 다른 요인에 따라 임의의 적절한 경로로 투입될 수 있다. 예를 들면, 정맥내, 동맥내, 피하, 피부내, 근육내 경로, 등으로 투여될 수 있다. 생체내 방법이 경우, 조성물은 예컨대 용액과 같은 다양한 투여 형태로 투여될 수 있으며, 전형적으로는, 예를 들면, 필요하다면 통상적 담체가 첨가될 수 있는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 주사의 형태로 제형화된다. 만약 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 리포좀 또는 막융합 리포좀(예컨대 센다이 바이러스 (HVJ)-리포좀)에 포함된다면, 조성물은 예컨대 현탁액, 냉동 약물, 원심분리-농축된 냉동 약물, 등과 같은 리포좀 제형의 형태일 수 있다.

상기 제형에 함유된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 투여량은 치료될 질병, 환자의 연령 및 체중, 등에 따라 변할 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 0.0001mg 내지 100mg, 바람직하게는 0.001mg 내지 10mg으로 수일 내지 수개월마다 투여하는 것이 전형적이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 암환자에게 투여하는 경우, 폴리뉴클레오티드에 상응하는 폴리펩티드는 항원제시 세포에서 매우 높게 발현된다. 이어서, 세포내 분해로 생성된 각 암항원 펩티드는 HLA 항원에 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체는 항원제시 세포의 세포 표면에 촘촘히 제시된다. 이어서, 상기 복합체에 대해 특이적인 CTL들이 효율적으로 증식하고, 암세포를 파괴한다. 이러한 방식으로, 암의 치료 또는 예방이 달성된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 유효성분으로 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 본 발명의 암백신은 예컨대 백혈병, 골수이형성증후군, 다발성 골수종 및 악성 림프종과 같은 혈액암, 및 예컨대 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암과 같은 고형암을 포함하는 WT1 유전자 발현 수준이 상승된 경우에 암의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.

(6-3) 본 발명의 항원제시 세포를 유효성분으로 함유하는 암백신

본 발명은 본 발명의 항원제시 세포를 유효성분으로 함유하는 암백신을 제공한다.

최근에, 백혈구를 암환자의 말초혈액에서 분리하여, 상기 백혈구로부터 유도된 가지세포를 시험관 내에서 펩티드, 등으로 펄스하여 항원제시세포를 제조하고, 이를 이어서 피하 주사 등을 통해 환자에게 되돌려 주는 세포 치료(DC 치료)가 보고되었다 (Cancer Innunol, Immunother., 46:82, 1998, J. Immunol., 158: p1796, 1997, Cancer Res., 59:p1184, 1999, Cancer Res., 56:p5672, 1996, J.Immunol., 161:p5607, 1998, J. Exp. Med., 184:p465, 1996). 따라서, 본 발명의 항원제시 세포를 유효성분으로 포함하는 암백신은 세포 치료에 사용된 것처럼 암백신에서 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 항원제시 세포를 유효성분으로 포함하는 암백신은 항원제시 세포를 안정적으로 유지하기 위해 바람직하게는 생리적 식염수, 인산완충 식염수(PBS), 배지, 등을 포함한다. 이는 예를 들면 정맥, 피하, 근육으로 투여될 수 있다. 투여량을 앞서 언급한 문헌에 기술된 것들로 예시된다.

환자의 몸으로의 암백신의 도입에 의해, 특이적 CTL이 HLA-A24 양성, 및 WT1 양성인 환자에서 효과적으로 유도되어 암의 치료 및 예방이 달성된다. 본 발명의 항원제시 세포를 유효성분으로 포함하는 암백신은 예컨대 백혈병, 골수이형성증후군, 다발성 골수종 및 악성 림프종과 같은 혈액암, 및 예컨대 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암과 같은 고형암을 포함하는 WT1 유전자 발현 수준이 상승된 암의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.

(6-4) 본 발명의 CTL을 유효성분으로 함유하는 암백신

본 발명은 본 발명의 CTL을 유효성분으로 함유하는 암백신(암백신으로 사용할 수 있는 약학조성물)을 제공한다. 본 발명의 CTL은 이하에서 입양 면역요법에서 유용하다.

흑색종의 경우, 입양면역요법은, 환자 자신으로부터 취한 종양-침투성 T 세포를 몸밖에서 다량으로 배양하고, 이어서 환자에게 다시 되돌려주는 경우에 치료효과를 달성한다 (J. Natl. Cancer. Inst., 86:1159, 1994). 마찬가지로, 마우스 흑색종에서, 스플레노사이트를 암 항원 펩티드 TRP-2로 자극하여, 이에 의해 암항원 펩티드에 특이적인 CTL을 증식시키고, 상기 CTL를 흑색종 이식된 마우스에 투여하여 전이의 억제를 관찰하였다 (J. Exp. Med., 185:453, 1997). 이는 항원제시 세포 상의 암항원 펩티드 및 HLA 항원 사이의 복합체를 특이적으로 인식하는 CTL의 시험관내 증식에 기인한다. 따라서, 환자에서 유래된 말초 혈액 백혈구를 본 발명에 따른 펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 발현벡터를 사용하여 시험관 내에서 자극하여, 종양-특이적 CTL을 증식시키고, 후속적으로 상기 CTL을 다시 환자에게 돌려주는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법이 유용한 것으로 판단된다. 따라서, 본 발명의 상기 CTL은 입양 면역요법에 사용되는 암백신에 유효성분으로서 포함되어 사용될 수 있다.

본 발명의 CTL을 유효성분으로서 함유하는 암백신은 CTL을 안정적으로 유지하기 위해 바람직하게는 생리적 식염수, 인산완충 식염수(PBS), 배지, 등을 포함한 다. 이는, 예를 들면 정맥, 피하, 또는 근육으로 투여될 수 있다. 투여량을 앞서 언급한 문헌에 기술된 것들로 예시된다.

환자의 몸으로의 암백신의 도입에 의해, 암세포 상의 CTL의 세포독성 효과가 HLA-A24, 양성, 및 WT1 양성인 환자에서 증강되어, 암세포를 파괴하여, 암의 치료가 달성된다. 본 발명의 CTL을 유효성분으로 포함하는 암백신은 예컨대 백혈병, 골수이형성증후군, 다발성 골수종 및 악성 림프종과 같은 혈액암, 및 예컨대 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배아암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 및 난소암과 같은 고형암을 포함하는 WT1 유전자 발현 수준이 상승된 암의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.

(VII) 서열 번호 7의 아미노산 서열에 기재한 펩티드를 함유하는 암백신

본 발명에서, Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 7)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 생체내에서 CTL을 유도하는 활성을 갖는다. 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 암항원 펩티드는 WO00/18795에서 HLA-A24 항원에 결합할 것으로 기대되는 서열을 갖는 펩티드로 기술되었다. 그러나, 본 발명에서 최초로 상기 펩티드가 생체내에서 CTL을 유도하는 활성이 있으며, 암백신으로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 임의의 물질을 함유하는 암백신 또는 약학 조성물을 제공한다:

a) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드,

b) 상기 a)에 나타난 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

c) 상기 b)에 나타난 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.

d) 상기 c)에 나타난 발현벡터를 함유하는 세포,

e) 상기 a)에 나타난 펩티드 유래의 암항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 사이의 복합체를 제시하는 항원 제시 세포, 및

f) 상기 a)에 나타난 펩티드 유래의 암항원 펩티드 및 HLA-A24 항원 사이의 복합체를 인식하는 CTL.

나아가, 본 발명은 또한 상기 기술된 임의의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현벡터, 형질전환제, 항원제시세포, 및 CTL의 암백신의 제조에의 용도, 및 치료적 및 예방적으로 유효한 양의 임의의 상기 물질을 HLA-A24 양성, 및 WT1 양성인, 도움이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

상기 a) 내지 f)에서 기술한 물질의 제조 및 이들의 암백신으로서의 용도는 본 발명에 따른 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 발현벡터, 항원제시세포, 및 CTL에 대한 각각의 부분에서 기술된 것과 동일하다.

본 발명은 나아가 하기의 실시예로 예시되나, 어떤 관점으로든 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다.

본원에서 이하 기술되는 참조는 HLA-A24를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 제조를 기술하며, 자세한 것은 WO 02/47474 (국제공개일: 2002년 6월20일, PCT/JP01/10885 (국제출원일: 2001년 12월12일 (우선일: 2000년 12월13일))에 기술 된다.

참조예 1

HLA-A2402 유전체 DNA 절편의 클로닝

(1) HLA-A2402 유전체 DNA 절편의 클로닝

인간 HLA-A2402 유전체 DNA 절편을 PCR로 클로닝하기 위해, 인간 종양세포주, RERF-LC-AI 세포(Riken Cell Bank RCB0444)를 배양하고 Genomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham)을 사용하여 첨부된 프로토콜대로 인간 유전체 DNA를 정제하였다. 이어서 GenBank 데이터베이스를 키메라 HLA 유전자의 구축에 필요한 HLA-A2402 유전체 DNA에 대하여 검색하여, 접근번호 제Z72422로 등록된 것이 연관성이 있는 것으로 밝혔으나, 270bp의 프로모터 영역은 등록되지 않았다. 목적하는 트랜스제닉 마우스의 구축은 프로모터, 엑손 1 내지 3 및 인트론 1 내지 3을 필요로 한다. 프로모터를 포함하는 HLA-A2402 유전체 DNA를 클로닝하기위해, 하기의 상류 프라이머 HLA26-1F 및 하류 프라이머 A24-BglII 30을 사용하여 PCR을 수행하였다:

HLA26-1F: 5' CCC AAG CTT ACT CTC TGG CAC CAA ACT CCA TGG GAT-3' (36mer, 서열 번호 36), 상기 프라이머는 일본인에게서 흔히 발견되는 HLA-A2601(접근번호 AB005048)의 프로모터를 참조로 고안되었다;

A24-BglII 30: 5' CGG GAG ATC TAC AGG CGA TCA GGT AGG CGC-3'(30mer, 서열 번호 37), 상기 프라이머는 인트론 3에 있는 뉴클레오티드 서열, 구체적으로 접근번호 Z72422의 5' 말단에서부터 1282 위치의 뉴클레오티드의 G 에서 A로의 변형을 포함한다.

상기 뉴클레오티드 변형은 하기의 이유로 필요하다. 본 참조는 HLA-A2402의 엑손 1-3 및 H-2K^b의 엑손 4-8로 이루어지는 키메라 HLA를 발현하는 트렌스제닉 마우스를 수득하는 것이 목적이며, 이 키메라 HLA는 HLA-A2402 유전체 DNA의 인트론 3에 있는 BamHI 제한효소 부위의 상류 영역 및 H-2K^b유전체 DNA의 인트론 3의 하류 영역을 라이게이션하여 구축될 수 있으며, 이를 위해 HLA-A2402의 인트론 3에 인위적 BglII 제한효소부위를 구축할 필요가 있었다.

이어서, HLA-A2402 유전체 DNA 절편의 PCR 클로닝을 높은 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 Native Pfu DNA 중합효소 (Stratagene) 및 상기의 프라이머 쌍을 사용하여 첨부된 프로토콜대로 수행하였다. 상기 PCR은 95℃에서 45초 동안의 열처리, 35주기의 95℃에서 45초, 66℃에서 1분 및 72℃에서 4분의 반응, 및 72℃에서 10분 동안의 반응 및 후속적인 4℃로의 냉각을 포함한다. 상기 증폭된 유전자 절편을 파아지미드 벡터, pBluscript의 HindIII 및 BamHI 제한효소부위로 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 수득하였다. 상기 재조합 플라스미드를 42℃에서 열쇼크 방법으로 E.coli JM109 (Toyobo)로 도입하고, 재조합 플라스미드가 도입된 흰색의 E.coli 콜로니를 X-Gal 및 IPTG로 코팅된 암피실린(50㎍/ml)-함유 LB 아가 배지(1% 박토-트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, 2% 아가) 상에서 선택하여 형질전환체를 수득하였다.

(2) HLA-A2402 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열 결정

상기에서 수득한 4개의 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 배지(3ml)에서 하룻밤 배양하고, 이어 각각의 형질전환체에 포함된 플라스미드 클론을 알칼린 라이시스 방법 (CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F.M. Ausubel 등 편저, John Wiley & Sons, Inc.)으로 정제하였다. 이어서 ABI PRISM^TM377 DNA 염기서열분석 시스템(PE Biosystems)을 이용하여 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 염기서열 시료에 ABI PRISM^TMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems)을 사용하여 첨부된 프로토콜대로 각각의 클론의 서열을 결정하였다. 각 클론의 프로모터를 비교하여, 이들의 전적으로 동일함을 밝혔다. 따라서, GenBank 데이터베이스에는 등록되지 않았던 HLA-A2402 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다. 상기 접근 번호 Z72422로 등록된 뉴클레오티드 서열을 각 클론의 서열과 비교하여, PCR 돌연변이가 없는 하나의 정상 클론이 있음을 밝혔다.

참조예 2

H-2K^b유전체 DNA 절편의 클로닝

(1) H-2K^b유전체 DNA 절편의 클로닝

마우스 종양 세포주 EL4(ATCC T1B-39)를 배양하고, 마우스 유전체 DNA를 정제하여 PCR 클로닝에 사용하였다. DNA 정제(증폭)는 긴 DNA 사슬의 증폭에 적합한 TaKaRa LA Taq^TM(Takara Shuzo)을 사용하여 첨부된 프로토콜대로 수행하였다. 이어서 GenBank 데이터베이스를 키메라 HLA 유전자의 구축에 필요한 H-2K^b유전자에 대하여 검색하여, 상기 유전자가 접근번호 v00746 및 v00747로 등록된 두 부분으로 나누어진 것을 밝혔다. H-2K^b의 상류 1594 bp 영역에서 인트론 3의 중간부분까지가 v00746으로 등록되었고, H-2K^b의 하류 1837 bp 영역에서 인트론 7의 중간부분까지가 v00747로 등록되었다. v00746 및 v00747로 등록되고 나누어진, 인트론 3에 BamHI 제한효소부위가 없었기 때문에, 데이터베이스에 등록된 H-2K^b유전자는 불완전한 길이인 것으로 생각되었다.

H-2K^b유전자와 상동인 슈도유전자 또는 매우 상동인 유전자(Cell, 25:683, 1981)가 있다. 하기의 상류 및 하류 프라이머 및 상기와 같이 정제된 마우스 유전체 DNA를 템플레이트로 사용하여 TaKaRa LA Taq^TM(Takara Shuzo) 을 사용해 첨부된 프로토콜대로 PCR을 수행하였다:

상류프라이머 H-2KB F3:

5'-CGC AGG CTC TCA CAC TAT TCA GGT GAT CTC-3'(30mer, 서열 번호 38), 이는 상기 상보적 유전자와 상동성이 적으며 v00746의 엑손3에 의해 코딩된다; 및

하류프라이머 H-2KB 3R:

5'-CGG AAT TCC GAG TCT CTG ATC TTT AGC CCT GGG GGC TC-3' (38mer, 서열 번호 39), 이는 말단에 첨가된 EcoRI 제한효소부위를 갖는 v00747에 해당한다.

상기 PCR은 25주기의 98℃에서 10초, 66℃에서 4분의 반응, 및 68℃에서 10분의 반응 및 후속적인 4℃로의 냉각을 포함한다.

상기 증폭된 유전자 절편을 파아지미드 벡터, pBluscript의 KpnI 및 EcoRI 제한효소부위로 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 수득하였다. 상기 재조합 플라스미드를 42℃에서 열쇼크 방법으로 E.coli JM109 (Toyobo)로 도입하고, 재조합 플라스미드가 도입된 흰색의 E.coli 콜로니를 X-Gal 및 IPTG로 코팅된 암피실린-함유 LB 아가 배지 상에서 선택하여 형질전환체를 수득하였다. 3개의 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 배지 (3 ml) 에서 하룻밤 배양하였다. 각각의 형질전환체에 포함된 플라스미드 클론을 정제하고 상기와 유사한 방법으로 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 세개의 각 클론의 뉴클레오티드 서열을 v00747의 서열과 비교하여, 두개의 클론에서는 독립적으로 하나의 PCR 돌연변이가 있었고, 하나의 클론에는 세개의 PCR 돌연변이가 있음을 발견하였다. 이들 세개의 클론에서는 v00747의 것과는 다른 5개의 공통적으로 발견되는 뉴클레오티드가 있었다. 이들 뉴클레오티드는 인트론 6 및 3' 비코딩 영역에 해당하는 영역에서 발견되었다. 나아가, 비등록된 인트론 3 영역은 3개의 클론과는 상이한 PCR 돌연변이로 인한 뉴클레오티드를 포함하였다. 비등록된 영역을 고려하면 뉴클레오티드 서열의 결정은 따라서 부분적으로는 불가능하였고, 이는 높은 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소를 사용하여 비등록된 인트론 3 영역을 다시 클로닝한 후 달성될 수 있다.

(2) H-2K^b인트론 3의 뉴클레오티드 서열결정

비등록 영역의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해, 템플레이트로 상기 정제된 마우스 유전체 DNA를 사용하여 첨부된 프로토콜대로 Native Pfu 중합효소 (Stratagene)로 PCR을 하여 비등록 인트론 3 영역을 포함하는 영역을 클로닝하였다. 상기 PCR은 하기의 상류 및 하류 프라이머를 사용하여 수행되었다:

상류 프라이머 H-2kb F5:

5'-AGG ACT TGG ACT CTG AGA GGC AGG GTC TT-3'(29mer, 서열 번호 40), 이는 v00746으로 등록되었다;

하류 프라이머 H-2kb 5R:

5'-CAT AGT CCC CTC CTT TTC CAC CTG TGA GAA-3'(30mer, 서열 번호 41), 이는 v00747로 등록되었다. 상기 PCR은 95℃에서 45초 동안의 열처리, 25주기의 95℃에서 45초, 68℃에서 1분 및 72℃에서 4분의 반응, 및 72℃에서 10분의 반응 및 후속적인 4℃로의 냉각을 포함한다. 상기 증폭된 유전자 절편을 파아지미드 벡터, pBluscript의 BamHI 및 BglII 제한효소부위로 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 수득하였다. 상기 재조합 플라스미드를 42℃에서 열쇼크 방법으로 E.coli JM109 (Toyobo)로 도입하고, 재조합 플라스미드가 도입된 흰색의 E.coli 콜로니를 X-Gal 및 IPTG로 코팅된 암피실린(50㎍/ml)-함유 LB 아가 배지(1% bacto-trypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 2% 아가) 상에서 선택하여 형질전환체를 수득하였다. 5개의 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 배지(3ml)에서 하룻밤 배양하고, 이어 각각의 형질전환체에 포함된 플라스미드 클론을 정제하고, 상기와 유사한 방법으로 뉴클레오티드 서열 분석을 하였다. 분석된 각 클론의 인트론 3 영역을 비교하여, 서열이 완전히 일치함을 밝혔다. 그리하여 인트론 3의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다. 추가로, 비등록된 영역의 BamHI 부위로부터 v00747까지에 걸치는 영역이 463bp라는 것을 밝혔다.

(3) H-2K^b유전체 DNA의 구축

상기 (2)에서의 비등록 영역의 서열 결정의 결과로, 목적하는 키메라 HLA 유전자의 구축에 필요한 H-2K^b유전체 DNA의 전체 뉴클레오티드 서열이 결정되었다. 목적하는 H-2K^b유전체 DNA는 상기에서 수득한 두개의 클론, 즉, 5'- 및 3'-영역 각각에서 PCR 돌연변이가 없는 H-2K^b#20 및 PCR 돌연변이가 없는 H-2K^b#26을 조합하여 구축될 수 있다는 것이 명백해졌다. 따라서, 이러한 클론을 제한효소로 절단하여 PCR 돌연변이가 없는 각 영역을 조합하여 PCR 돌연변이가 없는 H-2K^b유전체 DNA를 구축하였다. 구축의 도식적 그림이 도 1에 있다.

상기 양 클론을 모두 BamHI 및 EcoRI 제한효소부위에서 절단하고 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 수득하였다. 상기 재조합 플라스미드를 42℃에서 열쇼크 방법으로 E.coli JM109 (Toyobo)로 도입하고, 재조합 플라스미드가 도입된 흰색의 E.coli 콜로니를 X-Gal 및 IPTG로 코팅된 암피실린-함유 LB 아가 배지 상에서 선택하여 형질전환체를 수득하였다. 3개의 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 배지(3ml)에서 하룻밤 배양하였다. 각각의 형질전환체에 포함된 플라스미드 클론을 알칼린 라이시스 방법으로 정제하고, 상기와 유사한 방법으로 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 그 결과, 모든 형질전환체가 PCR 돌연변이가 없는 H-2K^b유전체 DNA를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 것으로 밝혀졌다.

본원의 수득된 H-2K^b유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33의 1551 위치의 뉴클레오티드를 포함하여, 이로부터의 하류 서열에 해당되며 다음에 기술된다.

참조예 3

키메라 유전체 DNA (HLA-A2402/K^bDNA)의 구축

참조 1에서 수득한 HLA-A2402 유전체 DNA를 포함하는 HLA-A2402#1 플라스미드를 BglII 제한효소 부위에서 절단하고, 상기 참조 2에서 수득한 H-2K^b유전체 DNA를 포함하는 H-2K^b#20/26 플라스미드를 BamHI 제한효소 부위에서 절단하고, 수득한 절편을 라이게이션하여 재조합 플라스미드를 생성하였다. 도식적 구축은 도 2에 있다. 재조합 플라스미드를 42℃에서 열쇼크 방법으로 E.coli JM109 (Toyobo)로 도입하고, 재조합 플라스미드가 도입된 흰색의 E.coli 콜로니를 X-Gal 및 IPTG로 코팅된 암피실린-함유 LB 아가 배지 상에서 선택하여 형질전환체를 수득하였다. 10개의 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 배지(3ml)에서 하룻밤 배양하였다. 각각의 형질전환체에 포함된 플라스미드 클론을 정제하고, 상기와 유사한 방법으로 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 그 결과, 3개의 형질전환체가 의도하는 키메라 유전자 HLA-A2402/K^bDNA를 갖는 플라스미드를 포함하였고, 이를 간단히 "A2402/K^bDNA"로 언급할 수 있다. 구축된 HLA-A2402/K^b의 유전체 서열은 서열 번호 33으로 나타낸다.

참조예 4

키메라 유전체 DNA의 스플라이싱 분석

마우스 종양 세포주 EL4를 상기 구축된 키메라 HLA 유전자(HLA-A2402/K^b유전자)로 Electro Gene Transfer GTE-10(Shimadzu)을 사용하여 부착된 프로토콜대로 트랜스펙션하였다. 이틀 후에, 전체 RNA 를 트랜스펙션된 EL4 세포 및 트랜스펙션되지 않은 EL4 세포(대조군)로부터 ISOGEN(Nippon Gene)을 사용하여 부착된 프로토콜대로 정제하였다. Oligo(dT)_12-18 및 상기 RNA 일부를 템플레이트로 사용하여 부착된 프로토콜대로 역전사를 수행하여 cDNA를 합성하였다. 추가로, Native Pfu DNA 중합효소 및 상기 cDNA를 템플레이트로 사용하여 PCR로 키메라 유전자를 특이적으로 합성하였다.

95℃에서 45초간 열처리하고, 95℃에서 45초간, 53℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간의 40주기의 반응, 및 72℃에서 10분간의 반응 후, 4℃로 냉각하는 조건 하에서, HLA-A2402 유전자의 엑손 1에서 코딩되고 H-2K^b유전자와 상동성이 적은, 업스 트림 프라이머 키메라-F2:

(23머, 서열 번호:42) 및, H-2K^b유전자의 엑손 8에서 코딩되고 HLA-A2402 유전자와 상동성이 적은, 다운스트림 프라이머 키메라-R2:

(23머, 서열 번호:43)을 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, 약 1.1 kbp 유전자 절편은 오로지 트랜스펙션된 EL4 세포에서만 특이적으로 증폭되었다. 이 결과에 기초하여, 전이된 키메라 유전체 DNA는 마우스 세포에서 전사되었고, 즉, HLA 프로모터가 작동되었고, 예상된 위치에서 스플라이싱된 mRNA가 발현되었다고 판단되었다. 상기 PCR에 의해 증폭된 절편이 서열분석되었고, 여기서 HLA-A2402/K^b를 코딩하는 cDNA의 염기 서열이 예상된 바와 같이 결정되었다. 상기 HLA-A2402/K^b를 코딩하는 cDNA의 염기 서열은 서열 번호:34 에서 보여지고, 이의 아미노산 서열은 서열 번호:35 에서 보여진다. 또한, 도 3 내지 5는 평행하게 배열된 HLA-A2402/K^b(서열 번호:33)의 유전체 서열과 cDNA 서열(서열 번호:34)의 관계를 보여준다.

참조예 5

미세주입용 DNA 용액의 제조

구축된 키메라 HLA 유전자를 코딩하는 플라스미드(11 ㎍)를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI, 및 또한 오로지 벡터를 절단하는 제한 효소 DraI으로 분해하였 다. 겔 전기영동(1% SeaKem GTG, Nippon Gene) 후, 키메라 DNA를 포함하는 겔 절편을 회수하였다. 트랜스진을 첨부된 프로토콜에 따라 Prep-A-Gene 정제 키트(BioRad)로 정제하고 1/10 TE 완충액(10 mM Tris(pH 8), 0.1 mM EDTA(pH 8))에 용해함에 의해, 미세주입용 DNA 용액을 제조하였다.

참조예 6

마우스 수정란으로의 도입 및 트랜스제닉 마우스의 식별

C57BL/6 마우스 품종 유래의 수정란을 사용하여, 키메라 유전자 구축물의 주입을 수행하였다.

C57BL/6 마우스는, HLA-A2402에 대한 동일한 결합 모티프를 가지는 H-2K^d가 아닌 클래스 I 분자 H-2b로서 발현하므로, C57BL/6 마우스 품종의 수정란을 사용하였다. 따라서, HLA-A24-구속성 항원 펩티드가 투여되는 경우, 엔도제너스 마우스 클래스 I은 세포 표면 상에 상기 펩티드를 제공하지 않으므로, 상기 C57BL/6 라인의 트랜스제닉 마우스는 유리하게 상기 교차 반응을 피할 수 있다.

첫번째 주입시, 키메라 구축물을 81 개의 수정란에 주입하였고, 이 수정란들을 4 마리의 수용자 마우스에 전달하였으며, 이는 자손으로 이어지지 않았다. 두번째 주입시, 키메라 구축물을 50 개의 수정란에 주입하였고, 이 수정란들을 2 마리의 수용자 마우스에 전달하였으며, 이는 4마리의 자손으로 이어졌으나, 이들은 모두 이유(離乳) 이전에 사망하였다. 세번째 주입시, 키메라 구축물을 101 개의 수정란에 주입하였고, 이 수정란들을 4 마리의 수용자 마우스에 전달하였으며, 이 는 11 마리의 자손으로 이어졌으나, 이들 모두는 이유(離乳) 이전에 사망하였다.

네번째 주입시, 키메라 구축물을 168 개의 수정란에 주입하였고, 이 수정란들을 6 마리의 수용자 마우스에 전달하였고, 이는 22 마리의 자손으로 이어졌으며, 이들 중 19 마리는 이유(離乳)하였다. 이들 중 4 마리, 즉, 01-4 04-2, 05-1 및 05-6은 트랜스제닉 마우스로 식별되었고; 그러나, 01-4 마우스는 기형으로 인하여 교배할 수 없었고, 05-6 마우스는 이유(離乳) 직후 사망하였다. 다섯번째 주입시, 키메라 구축물을 221 개의 수정란으로 주입하였고, 이 수정란들을 8마리의 수용자 마우스로 전달하였으며, 이는 14 마리의 자손으로 이어졌고, 이들 중 6마리는 이유(離乳)하였다. 이들 중 3 마리, 즉 04-1, 04-5 및 04-6은 트랜스제닉 마우스로 식별되었다. 여섯번째 주입시, 키메라 구축물을 225 개의 수정란에 주입하였고, 이 수정란들을 8 마리의 수용자 마우스에 전달하였으며, 이는 13 마리의 자손으로 이어졌고, 이들 중 9 마리는 이유(離乳)하였다. 이들 중 3 마리, 즉 10-5, 14-1 및 15-2는 트랜스제닉 마우스로 식별되었다.

HLA-A2402 유전자(HLA26-1F, 서열 번호:36; 및 A24-Bg1II30, 서열 번호:37)의 클로닝에 사용되는 것과 동일한 프라이머 및 템플레이트로서 테일 DNA 제제를 사용하여 첨부되는 프로토콜에 따라 TaKaRa LA Taq^TM(Takara Shuzo)로 PCR을 수행하고, 1% 아가로스 겔 전기영동에 적용하고, 1.5 kbp DNA 밴드의 존재에 기초하여 마우스를 선택함으로써, 트랜스제닉 마우스를 식별하였다.

참조예 7

트랜스제닉 마우스에서 트랜스진 산물의 발현

문헌 [CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, J. E. Coliganl 등 편저, John Wiley & Sons, Inc]에 따라, 참조예 6에서 구축된 8 마리의 트랜스제닉 라인 04-2, 05-1, 04-1, 04-5, 04-6, 10-5, 14-1 및 15-2의 마우스로부터 분리된 비장으로부터 스플레노사이트를 회수하였다. 트랜스제닉 마우스 스플레노사이트의 표면 세포 상에서, 트랜스진으로부터 발생한 단백질인, HLA-A2402/K^b의 발현을, 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 분석하였다. 대조군으로서, C57BL/6 품종으로부터 제조된 스플레노사이트를 사용하였다. 구체적으로, 5 x 10⁶ 스플레노사이트를 FITC-표지된 항-HLA 항체 B9.12.1 (Immunotech) 에 의해 염색하였다. 엔도제너스 마우스 클래스 I을, FITC-표지된 항-H-2K^b 단일클론 항체 AF6-88.5 (Pharmingen) 에 의해 염색하였다.

그 결과, 5 라인, 즉, 04-1, 04-5, 10-5, 14-1 및 15-2가, HLA 클래스 I에 대한 특이적 발현을 보여주었다. 이들 중, 오로지 04-1 라인이 재생산 능력을 가지는 것으로 나타났다. 반면, 나머지 3 라인, 즉, 04-6, 04-2 및 05-1은 HLA 클래스 I에 대한 특이적 발현을 보여주지 않았다. 따라서, 8 마리의 트랜스제닉 마우스 라인을 구축하였으나, 이들 중, 오로지 04-1 라인이 클래스 I 발현 방식을 나타내었고, 동형접합성을 달성하였다.

참조예 8

HLA-A2402을 발현하는 형질전환된세포의 확립

상기에서 제조한 트랜스제닉 마우스의 CTL-유도 능력을 평가하기 위하여, HLA-A2402/K^b를 안정적으로 발현하는, 형질전환된세포 Jurkat-A2402/K^b를 확립하였다.

(1) 발현 벡터의 구축

Tg 마우스로부터 비장을 제거하였고, 스플레노사이트를 제조하였다. 첨부되는 프로토콜에 따라, ISOGEN(Nippon Gene)으로 전체 DNA를 제조하였다. cDNA를 합성하기 위하여, Oligo(dT)_12-18 및, 템플레이트로서 상기 RNA의 일부를 사용하여, 첨부되는 프로토콜에 따라, SuperScript Choice System(GIBCO BRL)으로 역전사를 수행하였다. 그 후, 원형으로서 상기 cDNA의 일부, 및 업스트림 프라이머 chi.PF1:

(서열 번호:44); 및 다운스트림 프라이머 chi.PR1:

(서열 번호:45)을 사용하여, 첨부되는 프로토콜에 따라, LA-PCR 키트(Takara Shuzo)에 의해 PCR을 수행하였다. PCR은, 95℃에서 45초간 열처리, 95℃에서 45초간, 60℃에서 1분간 및 68℃에서 2분간의 25 주기의 반응, 및 72℃에서 10분간 반응, 그 후 4℃로 냉각시키는 것을 포함한다. PCR 증폭된 유전자를, 발현 벡터 pcDNA3.1(+)(Invitrogen)으로 도입하여, HLA-A2402/K^b를 코딩하는 발현 벡터를 구축하였다.

(2) Jurkat 세포로의 도입

PvuI 제한 효소로 분해함에 의해 상기 벡터(10 ㎍)을 선형화하였다. 첨부되는 프로토콜에 따라, 유전자-전달 장치(GIBCO BRL)에 의해, Jurkat 세포(ATCC T1B-152) 5 x 10⁶을 구축된 키메라 HLA 유전자로 트랜스펙션하였다. 0.5 세포/웰으로, 96-웰 플레이트 내로 세포를 시딩하였고, Geneticin (0.6 ㎎/㎖) 함유 배지 내에서 배양하였다. 그 결과, 6 개의 웰 (6 클론, A-2, A-4, A-6, A-9, A-10 및 A-11)에서 세포 증식이 관찰되었다. 이들 중, A-10이 가장 높은 트랜스진 발현을 보여주었고, 상기 클론을 Jurkat-A2402/K^b 세포로서 확립하였다.

참조예 9

트랜스제닉 마우스의 CTL-유도 능력에 대한 시험

인간 종양 항원 HER-2/neu는 유방암, 난소암 및 폐암에서 과잉 발현되는 것으로 공지되어 있고, 시험관 내 실험에 의해, 이로부터 유도된 펩티드는, HLA-A24 양성의 건강한 대상자의 말초 혈액에서 특이적 CTL을 유도하는 활성을 가지는 것으로 나타났다(Int. J. Cancer., 87:553, 2000).

상기 인간 종양 항원 유래의 HLA-A24-구속성 펩티드 HER-2/neu_780-788(서열 번호:46) 및 파상풍독 유래 MHC 클래스 II I/A^b-구속성 헬퍼 펩티드(Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu; 서열 번호:32)로 트랜스제닉 마우스를 면역화하고, 특이적 CTL이 인간의 경우에서와 마찬 가지로 유도되었는지 시험하였다. 구체적으로, HER-2/neu_780-788및 보조 펩티드를 DMSO 중, 40 ㎎/㎖ 및 20 ㎎/㎖로 각각 조절하였고, 생리 식염수 중에서 2 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖로 각각 희석하였다. 유리 주사기를 사용하여, 이들을 동량의 프로인트 불완전 면역보강제(Freund's incomplete adjuvant)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)와 혼합하여, 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 제조하였다. 면역화를 위하여, 생성되는 제제(200 ㎕)를 트랜스제닉 마우스(04-1 라인)의 꼬리 시작점에 피하 주사하였다. 시험의 개시 후 7일 째, 비장을 제거하여 유리 슬라이드의 광택 부분 상에 놓았고, 스플레노사이트를 회수 및 제조하였다. ACK 완충액(0.15 M NH₄Cl, 10mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.2-7.4)로 용혈 처리된 스플레노사이트의 부분을 X 선 방사(2,000 rad)에 노출시켰고, 상기 언급된 펩티드(100 ㎍/㎖)로 1 시간 동안 펄스화하고, 0.7 x 10⁶/웰로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 비-조사된, 비-펩티드-펄스화 스플레노사이트(7 x 10⁶/웰)를 함께 첨가하였고, 37℃에서 다시 자극하였다(펩티드의 최종 농도, 1 ㎍/㎖). RPMI1640 배지 중, 10% FCS, 10 mM HEPES, 20 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 mM MEM 비필수 아미노산, 1% MEM 비타민 및 55 μM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 배양액(CTM 배양액)의 10 ㎖ 중에서 6일 동안 시험관 내 자극을 수행하였다.

반면, 참조예 8에서 제조된, Jurkat-A2402/K^b 세포를 ⁵¹Cr(3.7 MBq/10⁶세포)로 표지하였고, 100 ㎍/㎖에서 1 시간 동안 상기 펩티드로 펄스화하였다. 표지를 2 시간 초과 동안 수행하였고, 표지 개시 이후 1시간 째에, 펩티드를 첨가하여 최종 농도 100 ㎍/㎖를 제조하였다. 펩티드로 펄스화되지 않은 세포를 대조군 표적 세포로서 제조하였다.

CTL-유도 활성을 ⁵¹Cr 방출 분석법(J. Immunol, 159:4753, 1997)에 의해 결정하였고, 여기서 미리 제조한 트랜스제닉 마우스 스플레노사이트 제제를, 표적 세포로서 상기 Jurkat-A2402/K^b세포에 첨가하였다. 결과는 도 6에서 보여진다. 그 결과, HER-2/neu_780-788로 자극함에 의한 특이적 CTL의 유도를 관찰하였다.

또한, HER-2/neu_780-788과 같이 HLA-A24-구속성 암 항원 펩티드로 또한 공지된, MAGE-3_195-203(서열 번호:47), CEA_653-660(서열 번호:48) 및 CEA_268-277(서열 번호:49)를 사용하여, 동일한 방식으로 CTL 유도 능력을 시험하였다. 그 결과는 도 7 내지 9에서 보여진다. 그 결과, 이들 공지된 HLA-A24-구속성 암 항원 펩티드로 자극함에 의한 특이적 CTL의 유도가 관찰되었다.

상기 결과로부터, 본 발명의 HLA-A24 트랜스제닉 마우스는, 생체 내 HLA-A24-구속성 암 항원 단백질 또는 암 항원 펩티드에 대해 사용될 수 있는, 인간을 위한 동물 모델인 것으로 보여졌다.

실시예 1

인간 WT1 유래 천연 펩티드 및 변경 펩티드의 CTL-유도 활성

HLA 항원에 결합할 수 있는 서열을 검색하는 BIMAS 소프트웨어 (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)를 사용하여, HLA-A24 항원에 결합할 것으로 예상되는 서열에 대해, 인간 WT1의 아미노산 서열을 검색하였다. 검색 결과 하기의 펩티드가 확인되었다:

펩티드 A, B, C, D 및 E는 각각 인간 WT1의 아미노산 서열의 126 내지 134, 302 내지 310, 417 내지 425, 285 내지 294, 326 내지 335 위치의 서열에 상응한다. Fmoc 방법을 사용하여 상기 펩티드를 합성하였다.

천연 형태:펩티드 A 내지 C에서 위치 2의 아미노산이 타이로신으로 변경된, 변경 펩티드가 또한 Fmoc 방법을 사용하여 합성되었다:

각 항원 펩티드의 면역원성을, 전술한 참조예에서 구축된 HLA-A2402/K^b 트랜스제닉 마우스를 사용하여 평가하였다. 각 펩티드의 면역원성 평가를 위해, 3 마리의 트랜스제닉 마우스를 하나의 펩티드로 면역화하였다.

파상풍독-유래 마우스 MHC 클래스 II I-A^b-구속성 보조 펩티드(Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;서열 번호:32)와 함께 각 합성 펩티드로 트랜스제닉 마우스를 면역화하였다. 구체적으로, 각 항원 펩티드 및 보조 펩티드를 DMSO 내에서, 각각 40 ㎎/㎖ 및 20 ㎎/㎖로 조절하였고, 생리 식염수로 각각 2 ㎎/㎖ 및 1 ㎎/㎖로 희석하였다. 유리 주사기를 사용하여, 이들을 동량의 프로인트 불완전 면역증강제(IFA)와 혼합하여 유중수 에멀젼을 제조하였다. 면역화를 위하여, 생성되는 에멀젼(200 ㎕)을 HLA-A2402/K^b트랜스제닉 마우스(04-1 라인)의 꼬리 시작점에 피하 주사하였다. 시험의 개시 후 7일 째, 비장을 제거하여 유리 슬라이드의 광택 부분 상에 놓았고, 스플레노사이트를 회수 및 제조하였다. ACK 완충액(0.15 M NH₄Cl, 10mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.2-7.4)로 용혈 처리된 스플레노사이트의 일부를 X 선 방사(2,000 rad) 에 노출시켰고, 상기 언급된 펩티드(100 ㎍/㎖)로 1 시간 동안 펄스화하고, 7 x 10⁶/웰로 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 동시에, 비-조사된, 비-펩티드-펄스화 스플레노사이트(7 x 10⁵/웰)을 함께 첨가하였고, 37℃에서 6일 동안 시험관 내 자극하였다. 10% FCS, 10 mM HEPES, 20 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 mM MEM 비필수 아미노산, 1% MEM 비타민 및 55 μM 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI1640 배지 내에서, 시험관 내 자극을 수행하였다.

그 후, 종래의 방법에 따라 세포독성에 대한 시험을 수행하였다. Jurkat-A2402/K^b 세포 (참조예 8), 및 펩티드로 펄스화된 Jurkat-A2402/K^b 세포를 표적 세 포(T)로서 사용하였다. 상기 세포를 ⁵¹Cr(3.7 MBq/10⁶ 세포)로 표지하였고, 1시간 동안 100 ㎍/㎖에서 펩티드로 펄스화하였다(표지를 2시간 초과 동안 수행하였고, 표지의 개시 1시간 째, 펩티드를 첨가하였다). 시험관 내 자극되고 인큐베이션된 스플레노사이트를 이펙터 세포로(E)서 사용하였다. 이들을 결합하고, 80의 E/T 비율로 반응시켰으며,⁵¹Cr 방출 분석법(J. Immunol., 159:4753, 1997)에 의해 세포독성을 결정하였다. 이 결과는 도 10 내지 17에서 보여진다. Y축은 세포독성을 보여주고, X축에서 숫자: 1, 2 및 3은 세 마우스의 숫자를 보여준다.

이들 도면은, 상기 보여지는 바와 같이 시험된 WT1으로부터의 5개의 천연 펩티드 중, 오로지 펩티드 B가 면역원성을 가진다는 것을 보여준다. 천연 형태:펩티드 B에서 위치 2의 아미노산이 타이로신으로 변경된, 변경된 형태:펩티드 G는 펩티드 B보다 더 높은 면역원성을 가지는 것으로 보여진다. 또한, 비록 천연 형태:펩티드 A 및 C가 면역원성을 가지지 않지만; 천연 형태: 펩티드 A 및 C에서 위치 2의 아미노산이 타이로신으로 변경된, 변경된 형태:펩티드 F 및 H는 높은 면역원성을 가지는 것으로 보여졌다.

상기 결과로부터, 천연 형태:펩티드 B 및 변경된 형태:펩티드 F, G 및 H 는, 생체 내 CTL을 유도하는 활성을 가지는 항원 펩티드으로서 작용하는 것으로 증명되었다.

실시예 2

인간 WT1 유래의 변경 펩티드의 CTL-유도 활성 (II)

실시예 1과 동일한 방식으로, BIMAS 소프트웨어를 사용하여 HLA-A24 항원에 결합할 것으로 예상되는 서열을 가지는 것으로 검색되고 식별된 하기의 천연 펩티드(펩티드 K 및 L), 및 천연 형태에서 위치 2의 아미노산이 타이로신으로 변경된, 이의 변경 펩티드(펩티드 I 및 J)를, Fmoc 방법을 사용하여 합성하였다.

펩티드 K 및 L은, 각각 인간 WT1의 아미노산 서열의 10 내지 18, 및 239 내지 247 위치의 서열에 상응한다. 펩티드 I 및 J는, 펩티드 K 및 L에서 위치 2의 아미노산이 타이로신으로 각각 전환된, 변경 펩티드이다. 상기 천연 및 변경 펩티드 각각의 면역원성을 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 그 결과는 도 18, 19, 21, 및 22에서 보여진다. Y축은 세포독성을 보여주고, X축에서 숫자: 1, 2 및 3은 세 마우스의 숫자를 보여준다.

이들 도면은, 비록 천연 형태:펩티드 K 및 L은 면역원성을 가지지 않지만, 변경된 형태:펩티드 I 및 J 모두는 높은 면역원성을 가진다는 것을 보여준다.

상기 결과로부터, WT1 변경된 형태:펩티드 I 및 J는 생체 내 세포독성 T 세포를 유도하는 항원 펩티드로서 작용하는 것으로 증명되었다.

실시예 3

인간 WT1 유래의 변경 펩티드의 세포독성

변경 펩티드에 의해 유도된 이펙터 세포의 천연 펩티드에 대한 교차-반응성을 시험하였다. 마우스를 변경된 형태:펩티드 H(E)로 면역화함에 의해 유도된 이펙터 세포 및, 천연 형태:펩티드 C(T)로 펄스화된 Jurkat-A2402/K^b의 표적 세포를 결합하였고, 80의 E/T 비율로 반응시켰으며, ⁵¹Cr 방출 분석법에 의해 세포독성을 결정하였다. 그 결과는 도 20에서 보여진다. 이 도면은, WT1 변경 펩티드에 의해 유도된 이펙터 세포가 변경된 형태 및 천연 형태로 펄스화된 세포 모두에 대해 세포독성을 나타낸다는 것을 보여준다.

실시예 4

인간 WT1 유래 변경 펩티드에 의한 인간 말초 혈액의 단핵 세포로부터 CTL 유도

말초 혈액의 단핵 세포를, HLA-A2402에 대해 양성인 건강한 기증자로부터 분리하였고, 4 x 10⁶ 세포/웰로 24-웰 플레이트의 웰에 위치시켰다. 웰에, 서열 번호:7의 천연 펩티드 또는 서열 번호:3의 변경 펩티드를 10 μM의 농도로 첨가하였고, 45% RPMI1640, 45% AIV, 10% 불활성화된 인간 AB 세럼, IX 비필수 아미노산, 25 ng/㎖ 2-메르캅토에탄올, 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신, 및 50 U/㎖ 페니실린을 함유하는 배양 배지 내에 혼합물을 1주 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 2 x 10⁶세포/웰로 조절하였고, 이를 이후 응답자 세포로서 사용하였다. 반면, 동일한 건강한 기증자로부터 분리된, 말초 혈액의 단핵 세포를, 상기 펩티드들 중 하나의 10 μM과 함께 4시간 동안 인큐베이션하여, 펩티드와의 펄스화를 달성하였고, 그 후 30 Gy로 조사하였다. 세포를 4 x 10⁶ 세포/웰로 조절하였고, 이를 이후 자극기 세포로서 사용하였다.

이에 따라 제조된 응답자 세포 및 자극기 세포를 함께 혼합하였고, 혼합물에 30U/㎖로 IL-2를 첨가하였다. 자극기 세포와 함께 응답자 세포의 동일한 자극을 일주일의 간격으로 3번 수행하였다. 이에 따라 수득된 이들 세포의 세포독성을, 표적 세포(T)로서 서열 번호:7의 천연 펩티드로 펄스화된, ⁵¹Cr로 표지된, HLA-A24에 대해 양성인 C1R-A^*2402 세포(Int. J. Cancer, 81, p387, 1999)와, 서열 번호:7의 천연 펩티드로 자극된 세포 또는 상기 기술된 바와 같이 서열 번호:3의 변경된 세포(이펙터 세포)(E)를 10, 20 또는 40의 E/T 비율로 반응시킴에 의해 세포독성을 결정하는⁵¹Cr 방출 분석법에 의해 결정하였다. 그 결과는 도 23에서 보여진다. 이 도면은, 변경 펩티드가 천연 펩티드를 인식하는 CTL을 유도할 수 있고, 천연 펩티드에 비해 우수한 CTL-유도 활성을 나타낸다는 것을 보여준다. 또한, WT1에 대해 양성이고, HLA-A24, RERF-LC-AI 세포에 대해 양성인 폐암 세포주; WT1에 대해 양성이고, HLA-A2402, 11-18 세포에 대해 음성인 폐암 세포주; 또는 WT1에 대해 음성이고, HLA-A24, 11-18 세포에 대해 양성인 폐암 세포주를 표적 세포로서 사용하여, ⁵¹Cr 방출 분석법에 의해 동일한 방식으로 상기 기술된 이펙터 세포의 세포독성을 결정하였다. 이 결과는 도 24에서 보여진다. 이 도면은, 변경 펩티드 및 천 연 펩티드로 자극된 이펙터 세포는, WT1 및 HLA-A2402 모두에 대해서 양성인, RERF-LC-AI 세포를 오로지 특이적으로 손상시켰다는 것을 보여주고, 이는, WT1에 대해 특이적이고, HLA-A2402-구속성인 CTL이, 펩티드로 자극함에 의해 유도되었다는 것을 보여준다. 이는 또한, 변경 펩티드는, 천연 펩티드에 비해 우수한 CTL-유도 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.

실시예 5

시스테인 잔기가 치환된 펩티드의 CTL-유도 활성

펩티드 H(Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe; 서열 번호:4)는 위치 5에 시스테인 잔기를 포함한다. 시스테인 잔기는 용액에서 산화되어 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 이를 피하기 위하여, 위치 5의 시스테인 잔기가 세린 잔기, 알라닌 잔기, 또는 α-아미노부티르산로 치환된, 치환된 형태:펩티드 M, N 및 O를 합성하였고, 각 펩티드의 면역원성을 생체내에서 평가하였다:

상기 치환된 형태:펩티드 M, N 및 O를 Fmoc 방법을 사용하여 합성하였고, 이들의 면역원성을 실시예 1과 동일한 방식으로 평가하였다. 세포독성에 대한 시험에서, 시험관 내에서 자극 및 인큐베이션된 스플레노사이트를 이펙터 세포(E)로서 사용하였고, 표적 세포와 각종 비율로 혼합하여, ⁵¹Cr 방출 분석법(J. Immunol, 1997; 159:4753)에 의해 이펙터 세포의 세포독성을 결정하였다. 이 결과는 도 25 내지 28에서 보여진다. 이 도면에서, 수직축은 세포독성을 나타내고, 수평축은 E/T 비율을 나타낸다.

상기 도면은, 펩티드 H에서 위치 5의 시스테인 잔기가 세린 잔기, 알라닌 잔기, 또는 α-아미노부티르산으로 치환된, 펩티드 M, N 및 O는, 비-치환된 펩티드인 펩티드 H와 동일한 면역원성을 가진다는 것을 보여준다.

실시예 6

시스테인 잔기가 치환된 펩티드의 세포독성

치환된 펩티드에 의해 유도된 이펙터 세포의 비-치환된 펩티드에 대한 교차-반응성을 시험하였다. 펩티드 M 또는 N로 면역화함에 의해 유도된 이펙터 세포(E)로, 펩티드 M 또는 N으로, 펩티드 H로 펄스화되거나 어떠한 펩티드로도 펄스화되지 않은 Jurkat-A2402/K^b 세포의 표적 세포(T)를 반응시켰고, 이펙터 세포의 세포독성을 ⁵¹Cr 방출 분석법으로 결정하였다. 이 결과는 도 29 및 30에서 보여진다.

상기 도면은, 치환된 펩티드에 의해 유도된 이펙터 세포는, 치환된 펩티드(펩티드 M 및 N; 도면에서 면역화 펩티드), 및 비-치환된 펩티드(펩티드 H)로 펄스화된 모든 세포에 대해 세포독성을 나타낸다는 것을 보여준다.

본 발명에 따라, 생체 내에서 CTL을 유도하는 활성을 가지는, WT1 유래의 HLA-A24-구속성 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 백신이 제공된다. 본 발명의 암 백신 은 다수의 암 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다.

<110> Haruo Sugiyama Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited <120> HLA-A24-RESTRICTED CANCER ANTIGEN PEPTIDES <130> Y04PCT7039 <150> JP 2002-171518 <151> 2002-06-12 <150> JP 2002-275572 <151> 2002-09-20 <160> 68 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro 290 295 300 Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 435 440 445 Leu <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 2 Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 3 Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 4 Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial 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aagcttactc tctggcacca aactccatgg gatgattttt cttctagaag agtccaggtg 60 gacaggtaag gagtgggagt cagggagtcc agttcaggga cagagattac gggatgaaaa 120 gtgaaaggag agggacgggg cccatgccga gggtttctcc cttgtttctc agacagctct 180 tgggccaaga ttcagggaga cattgagaca gagcgcttgg cacagaagca gaggggtcag 240 ggcgaagtcc cagggcccca ggcgtggctc tcagggtctc aggccccgaa ggcggtgtat 300 ggattgggga gtcccagcct tggggattcc ccaactccgc agtttctttt ctccctctcc 360 caacctatgt agggtccttc ttcctggata ctcacgacgc ggacccagtt ctcactccca 420 ttgggtgtcg ggtttccaga gaagccaatc agtgtcgtcg cggtcgctgt tctaaagtcc 480 gcacgcaccc accgggactc agattctccc cagacgccga ggatggccgt catggcgccc 540 cgaaccctcg tcctgctact ctcgggggcc ctggccctga cccagacctg ggcaggtgag 600 tgcggggtcg ggagggaaac ggcctctgcg gggagaagca aggggcccgc ctggcggggg 660 cgcaagaccc gggaagccgc gccgggagga gggtcgggcg ggtctcagcc actcctcgtc 720 cccaggctcc cactccatga ggtatttctc cacatccgtg tcccggcccg gccgcgggga 780 gccccgcttc atcgccgtgg gctacgtgga cgacacgcag ttcgtgcggt tcgacagcga 840 cgccgcgagc cagaggatgg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg ggccggagta 900 ttgggacgag gagacaggga aagtgaaggc ccactcacag actgaccgag agaacctgcg 960 gatcgcgctc cgctactaca accagagcga ggccggtgag tgaccccggc ccggggcgca 1020 ggtcacgacc cctcatcccc cacggacggg ccgggtcgcc cacagtctcc gggtccgaga 1080 tccaccccga agccgcggga ccccgagacc cttgccccgg gagaggccca ggcgccttaa 1140 cccggtttca ttttcagttt aggccaaaaa tccccccggg ttggtcgggg ccgggcgggg 1200 ctcgggggac tgggctgacc gcggggtcgg ggccaggttc tcacaccctc cagatgatgt 1260 ttggctgcga cgtggggtcg gacgggcgct tcctccgcgg gtaccaccag tacgcctacg 1320 acggcaagga ttacatcgcc ctgaaagagg acctgcgctc ttggaccgcg gcggacatgg 1380 cggctcagat caccaagcgc aagtgggagg cggcccatgt ggcggagcag cagagagcct 1440 acctggaggg cacgtgcgtg gacgggctcc gcagatacct ggagaacggg aaggagacgc 1500 tgcagcgcac gggtaccagg ggccacgggg cgcctacctg atcgcctgta gatcctgtgt 1560 gacacacctg taccttgtcc cccagagtca ggggctggga gtcattttct ctggctacac 1620 acttagtgat ggctgttcac ttggactgac agttaatgtt ggtcagcaag gtgactacaa 1680 tggttgagtc tcaatggtgt 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tggcttttgt gatgaagatg agaaggagaa acacaggtag 2580 gaaagggcag agtctgagtt ttctctcagc ctcctttaga gtgtgctctg ctcatcaatg 2640 gggaacacag gcacacccca cattgctact gtctctaact gggtctgctg tcagttctgg 2700 gaacttccta gtgtcaagat cttcctggaa ctctcacagc ttttcttctc acaggtggaa 2760 aaggagggga ctatgctctg gctccaggtt agtgtgggga cagagttgtc ctggggacat 2820 tggagtgaag ttggagatga tgggagctct gggaatccat aatagctcct ccagagaaat 2880 cttctaggtg cctgagttgt gccatgaaat gaatatgtac atgtacatat gcatatacat 2940 ttgttttgtt ttaccctagg ctcccagacc tctgatctgt ctctcccaga ttgtaaaggt 3000 gacactctag ggtctgattg gggaggggca atgtggacat gattgggttt caggaactcc 3060 cagaatcccc tgtgagtgag tgatgggttg ttcgaatgtt gtcttcacag tgatggttca 3120 tgaccctcat tctctagcgt gaagacagct gcctggagtg gacttggtga cagacaatgt 3180 cttctcatat ctcctgtgac atccagagcc ctcagttctc tttagtcaag tgtctgatgt 3240 tccctgtgag cctatggact caatgtgaag aactgtggag cccagtccac ccctctacac 3300 caggaccctg tccctgcact gctctgtctt cccttccaca gccaaccttg ctggttcagc 3360 caaacactga gggacatctg tagcctgtca gctccatgct accctgacct gcaactcctc 3420 acttccacac tgagaataat aatttgaatg taaccttgat tgttatcatc ttgacctagg 3480 gctgatttct tgttaatttc atggattgag aatgcttaga ggttttgttt gtttgtttga 3540 ttgatttgtt tttttgaaga aataaatgat agatgaataa acttccagaa tctgggtcac 3600 tatgctgtgt gtatctgttg ggacaggatg agactgtagc agctgagtgt gaacagggct 3660 gtgccgaggt gggctcagtt tgctttgatc tgtgatgggg ccacacctcc actgtgtcac 3720 ctctgggctc tgttccctct atcactatga ggcacatgct gagagtttgt ggtcacaaag 3780 acacagggaa ggcctgagcc ttgccctgtc cccaggatta tgagccccca gggctaaaga 3840 tcagagactc ggaattc 3857 <210> 34 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: The DNA region from position 1 to position 618 is derived from human, and the DNA region from position 619 to position 1119 is derived from mouse. <400> 34 atggccgtca tggcgccccg aaccctcgtc ctgctactct cgggggccct ggccctgacc 60 cagacctggg caggctccca ctccatgagg tatttctcca catccgtgtc ccggcccggc 120 cgcggggagc cccgcttcat cgccgtgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180 gacagcgacg ccgcgagcca gaggatggag ccgcgggcgc cgtggataga gcaggagggg 240 ccggagtatt gggacgagga gacagggaaa gtgaaggccc actcacagac tgaccgagag 300 aacctgcgga tcgcgctccg ctactacaac cagagcgagg ccggttctca caccctccag 360 atgatgtttg gctgcgacgt ggggtcggac gggcgcttcc tccgcgggta ccaccagtac 420 gcctacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 480 gacatggcgg ctcagatcac caagcgcaag tgggaggcgg cccatgtggc ggagcagcag 540 agagcctacc tggagggcac gtgcgtggac gggctccgca gatacctgga gaacgggaag 600 gagacgctgc agcgcacgga ttccccaaag gcccatgtga cccatcacag cagacctgaa 660 gataaagtca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgctgacat caccctgacc 720 tggcagttga atggggagga gctgatccag gacatggagc ttgtggagac caggcctgca 780 ggggatggaa ccttccagaa gtgggcatct gtggtggtgc ctcttgggaa ggagcagtat 840 tacacatgcc atgtgtacca tcaggggctg cctgagcccc tcaccctgag atgggagcct 900 cctccatcca ctgtctccaa catggcgacc gttgctgttc tggttgtcct tggagctgca 960 atagtcactg gagctgtggt ggcttttgtg atgaagatga gaaggagaaa cacaggtgga 1020 aaaggagggg actatgctct ggctccaggc tcccagacct ctgatctgtc tctcccagat 1080 tgtaaagtga tggttcatga ccctcattct ctagcgtga 1119 <210> 35 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: The polypeptide region from position 1 to position 206 is derived from human, and the polypeptide region from position 207 to position 372 is derived from mouse. <400> 35 Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala 5 9 14 19 Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 24 29 34 Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 39 44 49 Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala 54 59 64 Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly 69 74 79 84 Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Gly Lys Val Lys Ala His Ser Gln 89 94 99 Thr Asp Arg Glu Asn Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser 104 109 114 Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Met Met Phe Gly Cys Asp Val Gly 119 124 129 Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 134 139 144 Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 149 154 159 164 Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg Lys Trp Glu Ala Ala His Val 169 174 179 Ala Glu Gln Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu 184 189 194 Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ser 199 204 209 Pro Lys Ala His Val Thr His His Ser Arg Pro Glu Asp Lys Val Thr 214 219 224 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr 229 234 239 244 Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu Ile Gln Asp Met Glu Leu Val Glu 249 254 259 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val 264 269 274 Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr Tyr Thr Cys His Val Tyr His Gln 279 284 289 Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Pro Pro Ser Thr 294 299 304 Val Ser Asn Met Ala Thr Val Ala Val Leu Val Val Leu Gly Ala Ala 309 314 319 324 Ile Val Thr Gly Ala Val Val Ala Phe Val Met Lys Met Arg Arg Arg 329 334 339 Asn Thr Gly Gly Lys Gly Gly Asp Tyr Ala Leu Ala Pro Gly Ser Gln 344 349 354 Thr Ser Asp Leu Ser Leu Pro Asp Cys Lys Val Met Val His Asp Pro 359 364 369 His Ser Leu Ala 374 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 36 cccaagctta ctctctggca ccaaactcca tgggat 36 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 37 cgggagatct acaggcgatc aggtaggcgc 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 38 cgcaggctct cacactattc aggtgatctc 30 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 39 cggaattccg agtctctgat ctttagccct gggggctc 38 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 40 aggacttgga ctctgagagg cagggtctt 29 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 41 catagtcccc tccttttcca cctgtgagaa 30 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 42 cgaaccctcg tcctgctact ctc 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 43 agcatagtcc cctccttttc cac 23 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 44 cccaagcttc gccgaggatg gccgtcatgg cgccccgaa 39 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer <400> 45 ccggaattct gtcttcacgc tagagaatga gggtcatgaa c 41 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 46 Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile 5 9 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 47 Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile 5 9 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 48 Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu 5 9 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 49 Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe 5 9 14 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 50 Ala Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 51 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 52 Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 53 Arg Phe Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 54 Arg Trp Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 55 Arg Phe Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 56 Arg Met Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 57 Arg Trp Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 58 Arg Phe Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 59 Arg Met Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 60 Ala Phe Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 61 Ala Met Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 62 Ala Trp Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 63 Asn Phe Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 64 Asn Met Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 65 Asn Trp Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 66 Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 67 Arg Tyr Pro Ser Ala Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide Xaa at position 5 stands for Abu. <400> 68 Arg Tyr Pro Ser Xaa Gln Lys Lys Phe 1 5

Claims

하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드:

Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (서열 번호 2),

Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu (서열 번호 3),

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (서열 번호 4),

Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu (서열 번호 5) 및

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu (서열 번호 6).
제 1 항에 있어서, 서열 번호 2, 3, 4, 5 및 6 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
서열 번호 2, 3, 5 및 6 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 한 아미노산 서열의 위치 9 에서의 류신이 페닐알라닌, 트립토판, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환된 변경된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드.
서열 번호 4 의 아미노산 서열의 위치 9 에서의 페닐알라닌이 트립토판, 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환된 변경된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드.
서열 번호 4 의 아미노산 서열의 위치 5 에서의 시스테인이 알라닌, 세린 또는 α-아미노부티르산으로 치환된 변경된 아미노산 (서열 번호 66, 67 또는 68) 을 함유하는 펩티드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 6 항에 있어서, 서열 번호 2 내지 6 및 66 내지 68 로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 한 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제 8 항의 발현 벡터를 포함하는 세포.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드를 제조하는 방법으로서, 펩티드의 발현에 대해 조작가능한 조건 하에 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA-A24-항원의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포.
제 12 항에 있어서, 서열 번호 2 내지 6 및 66 내지 68 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드와 HLA-A24 항원의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA-A24 항원의 복합체를 인식하는 CTL.
제 14 항에 있어서, 서열 번호 2 내지 6 및 66 내지 68 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드와 HLA-A24 항원의 복합체를 인식하는 CTL.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 세포, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA-A24-항원의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포 또는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA-A24 항원의 복합체를 인식하는 CTL 을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
유효성분으로서의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드, 상기 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 세포, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA-A24-항원의 복합체가 제시되는 항원-제시 세포 또는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩티드와 HLA-A24 항원의 복합체를 인식하는 CTL 을 포함하는 암 백신.
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