ES2298353T3

ES2298353T3 - Peptido wt1 modificado.

Info

Publication number: ES2298353T3
Application number: ES02708646T
Authority: ES
Inventors: Haruo Sugiyama
Original assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Current assignee: International Institute of Cancer Immunology Inc
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: CN1281625C; TWI318630B; US20090325886A1; BRPI0208183B1; JP2006034296A; EP1371664A4; DE60224508D1; US20040097703A1; CA2440303C; EP1371664B1; JPWO2002079253A1; KR100863853B1; EP1371664A1; JP3728439B2; CN1531553A; WO2002079253A1; KR20030084970A; BR0208183A; HK1070078A1; US8105604B2

Abstract

Un péptido antigénico de cáncer que tiene como su ingrediente activo un péptido que consiste en 9-30 aminoácidos y que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEC ID Nº 3).

Description

Péptido WT1 modificado.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un antígeno de cáncer basado en el producto del gen supresor del tumor de Wilms WT1. Este antígeno de cáncer es útil como una vacuna anticáncer contra cánceres de la sangre tales como leucemia, síndrome mielodisplástico, mieloma múltiple y linfoma maligno, cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, carcinoma cervical y cáncer ovárico, así como cualquier cáncer que exprese WT1.

Descripción de la técnica antecedente

El mecanismo inmune para eliminar objetos extraños del cuerpo consiste generalmente en inmunidad humoral, en la que están implicados macrófagos que actúan como células presentadoras de antígenos que reconocen un antígeno, células T auxiliares que activan otras células T reconociendo antígenos presentados por dichos macrófagos y produciendo diversas linfocinas, y linfocitos B que se diferencian en células productoras de anticuerpos debido a la acción de dichas linfocinas; e inmunidad celular, mediante la cual las células T asesinas (células T citotóxicas (CTL)), que se han diferenciado como resultado de presentarse con un antígeno, atacan y destruyen las células diana.

Actualmente, se piensa que la inmunidad contra cáncer es principalmente resultado de inmunidad celular que implica células T asesinas. En inmunidad contra cáncer concerniente a células T asesinas, las células T precursoras, que han reconocido antígeno de cáncer presentado en la forma de un complejo de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I (antígeno de MHC clase I, también denominado antígeno HLA en el caso de seres humanos) y antígeno de cáncer, se diferencian y proliferan, y las células T asesinas resultantes que se han formado atacan y destruyen las células cancerosas. En este momento, las células cancerosas presentan un complejo de antígeno de MHC de clase I y el antígeno canceroso en su superficie celular, y son objetivo de las células T asesinas (Cur. Opin. Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev., 146, 167, 1995).

Se piensa que el antígeno de cáncer que se ha mencionado anteriormente presentado por el antígeno de MHC de clase I sobre las células cancerosas que sirven como las células diana es un péptido compuesto de aproximadamente 8-12 aminoácidos formado como resultado de una proteína antigénica sintetizada en el interior de células cancerosas procesadas por proteasa intracelular (Cur. Opin. Immunol., 5, 709, 1993; Cur. Opin. Immunol., 5, 719, 1993; Cell, 82, 13, 1995; Immunol. Rev., 146, 167, 1995).

Actualmente, aunque se han realizado búsquedas de proteínas antigénicas para diversos cánceres, se han verificado pocas como antígenos específicos de cáncer.

El gen supresor de tumor WT1 del tumor de Wilms (gen WT1) se ha aislado del cromosoma 11p13 como uno de los genes causantes del tumor de Wilms basándose en el análisis del síndrome WAGR que sucede como una complicación del tumor de Wilms, aniridia, anormalidades urogenitales, retraso metal, etcétera (Gessler, M., et al., Nature, Vol. 343, pág. 774-778 (1990)). Su ADN genómico tiene aproximadamente 50 Kb y está compuesto de 10 exones, mientras que su ADNc tiene aproximadamente 3 kb. La secuencia de aminoácidos estimada a partir del ADNc es como se muestra en la secuencia ID Nº: 1 (Mol. Cell. Biol., 11, 1707, 1991).

El gen WT1 se expresa con alta frecuencia en leucemia humana, y cuando las células de leucemia se tratan con un oligómero antisentido WT1 se inhibe el crecimiento de las células (Publicación de Patente Japonesa No Examinada Nº 9-104627). Por tanto, se piensa que el gen WT1 actúa promoviendo el crecimiento de células de leucemia. Además, el WT1 también se expresa altamente en cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mamá, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, carcinoma cervical y cáncer ovárico (Solicitud de Patente Japonesa Nº 9-191635), y se ha demostrado que el gen WT1 es un nuevo marcador tumoral en leucemia de cánceres sólidos.

En el documento WO 00/06602 se describen varios partidos antigénicos específicos de cáncer que consisten en un parte del producto de expresión del gen WT1, un péptido particularmente prometedor se denomina D^{b}, y la siguiente secuencia de aminoácidos: Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Secuencia ID Nº 2) (denominado "péptido WT1 silvestre" en la presente invención) se describe en ese documento, que también se identifica en el documento WO 00/26249. Se describen péptidos WT1 adicionales en el documento WO 00/18795 y el documento WO 00/26249).

Descripción de la invención

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un péptido que sea prometedor como una vacuna contra cáncer y que tenga una actividad mayor que péptidos antigénicos específicos de cáncer conocidos anteriormente.

Como un resultado de la realización en serio de diversos estudios para resolver los anteriores problemas, los inventores de la presente invención observaron que un péptido (denominado "péptido WT1 modificado") que tiene una secuencia de aminoácidos en la que el segundo aminoácido Met de la secuencia de aminoácidos que se ha mencionado anteriormente (Secuencia ID Nº 2) cambia a Tyr, de hecho, Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Secuencia ID
Nº: 3), tiene mayor actividad, conduciendo de este modo a completar la presente invención.

Por tanto, la presente invención proporciona un péptido (péptido WT1 modificado) que consiste en 9-30 aminoácidos y que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (Secuencia ID Nº 3). Este péptido es preferiblemente un polipéptido que consiste en 9-12 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la Secuencia ID Nº 3, y más preferiblemente, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la Secuencia ID Nº 3.

Además, la presente invención proporciona una vacuna contra cáncer que tiene como su ingrediente activo el péptido WT1 modificado que se ha mencionado anteriormente.

Además, la presente invención, también proporciona una vacuna de ADN contra cáncer que tiene como su ingrediente activo ADN que codifica el péptido que se ha mencionado anteriormente.

Además, la presente invención proporciona células presentadoras de antígeno en las que se presenta un complejo de antígeno HLA (antígeno de MHC de clase I) y el péptido que se ha mencionado anteriormente.

Además, la presente invención también proporciona células T citotóxicas que se obtienen por la estimulación de linfocitos de sangre periférica in vitro usando el péptido que se ha mencionado anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra los efectos de inactivación de células (actividad citolítica específica) en células diana C1R2402 (T), pulsadas o no pulsadas con péptido, por células efectoras (E) estimuladas con péptido WT1 silvestre (Secuencia ID Nº 2) o el péptido WT1 modificado de la presente invención (Secuencia ID Nº 3). En el gráfico, los círculos negros indican el efecto citolítico en las células diana C1R2402 pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con péptido WT1 modificado, los cuadrados negros indican el efecto citolítico sobre células diana C1R2404 pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre, los círculos blancos indican el efecto citolítico sobre células diana C1R2402 no pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con péptido WT1 modificado, y los cuadrados blancos indican el efecto citolítico sobre células diana C1R2402 no pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre.

La Fig. 2 es un gráfico que muestra la actividad citolítica en células de leucemia mielocítica aguda que expresan endógenamente el antígeno WT1 o en células de leucemia mielocítica aguda que no expresan el antígeno WT1 por células efectoras estimuladas con el péptido WT1 silvestre o el péptido WT1 modificado de la presente invención.

La Fig. 3 es un gráfico que muestra los efectos de inactivación de células (actividad citolítica específica) en células diana C1R2402 pulsadas o no pulsadas con el péptido por células efectoras estimuladas con el péptido WT1 silvestre o el péptido WT1 modificado de la presente invención. En el gráfico, los círculos negros indican el efecto citolítico sobre células C1R2402 pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con péptido WT1 modificado, los cuadrados negros indican el efecto citolítico sobre células diana C1R2402 pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con el péptido WT1 silvestre, los círculos blancos indican en el efecto citolítico sobre células diana C1R2402 no pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con el péptido WT1 modificado, y los cuadrados blancos indican el efecto citolítico sobre células diana CR12402 no pulsadas con péptido silvestre por células estimuladas con péptido WT1 silvestre.

La Fig. 4 es un gráfico que muestra la actividad citolítica sobre líneas celulares de cáncer de pulmón que expresan endógenamente WT1 o que no expresan WT1 por células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre o el péptido WT1 modificado de la presente invención.

La Fig. 5 es un gráfico que muestra los efectos inhibidores de anticuerpo anti-HLA de clase I, anticuerpo anti-HLA de clase II y anticuerpo anti-CD8 sobre los efectos de inactivación celular (actividad citolítica específica) sobre células diana C1R2402 pulsadas con péptido silvestre por células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre o el péptido WT1 modificado de la presente invención.

Descripción de las realizaciones preferidas

El péptido de la presente invención es un péptido que consiste en 9-30 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los 9 aminoácidos mostrados en la Secuencia ID Nº 3. Además, desde el punto de vista de que se presentan por unión al antígeno HLA, el péptido es preferiblemente un péptido que consiste en 9-12 aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia ID Nº 3, y más preferiblemente, es un péptido que tiene normas (motivos) en la secuencia del péptido antigénico presentado por la unión al antígeno HLA en ese momento (J. Immunol. 152, pág. 3913, 1994; Immunogenetics, 41, pág. 178, 1995; J. Immunol, 155, pág. 4307, 1994; J. Immunol., 155, pág. 4749, 1995). Además, el péptido es mucho más preferiblemente un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de los 9 aminoácidos mostrada en la Secuencia ID Nº 3).

Además, el "péptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia ID Nº 3" que se ha mencionado anteriormente es específicamente, por ejemplo, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia ID Nº 3 y que se extiende en la dirección N-terminal y/o la dirección C-terminal desde la posición pertinente en WT1 (Secuencia ID Nº 1) (números de posición 235-243) o desde la posición correspondiente en WT1 humano (Número de Depósito en Base de Datos NCBI XP012009) que tiene una actividad como un péptido antigénico de cáncer.

Un ejemplo de un método para medir la actividad del péptido antigénico de cáncer de la presente invención es el método descrito en J. Immunol., 154, pág. 2257, 1995. Lo siguiente proporciona una explicación de un resumen de este método usando el caso de que los HLA son HLA-A24 como un ejemplo. En primer lugar se aíslan linfocitos de sangre periférica de una persona positiva al antígeno HLA-A24. A continuación, estimulando los linfocitos de sangre periférica añadiendo el péptido de la presente invención in vitro, se inducen CTL (células T citotóxicas) que reconocen específicamente el complejo del péptido de la presente invención y HLA-A24 presentados por las células presentadoras de antígeno.

Esta inducción de CTL se puede investigar, por ejemplo, midiendo las cantidades de diversas citocinas (por ejemplo, IFN-\gamma) producidas por las CTL reaccionando con el complejo del péptido antigénico y HLA-A24. Además, la inducción de CTL también se puede investigar mediante un método en el que el las citotoxicidad de las CTL se mide con respecto a las células presentadoras de péptido antigénico marcadas con ^{51}Cr o Europio (51Cr Release Assay, Int. J. Cancer, 58, pág. 317, 1994; Europium Release Assay, J. Immunol., 154, pág. 3991, 1995). Además, la inducción de CTL también se puede investigar con referencia a los ejemplos descritos a continuación.

La presente invención también se refiere a una vacuna contra cáncer que tiene el antígeno que se ha mencionado anteriormente como su ingrediente activo. Esta vacuna se puede usar para la prevención o el tratamiento de cánceres de la sangre tales como leucemia, síndrome mielodisplástico, mieloma múltiple y linfoma maligno, así como cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de células germinales, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, carcinoma cervical y cáncer ovárico. En particular, esta vacuna se puede aplicar a pacientes positivos a HLA-A24. Esta vacuna se puede administrar por vía oral o por vía parenteral por ejemplo, por administración intraperitoneal, subcutánea, intracutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal.

Además, la administración de la vacuna de la presente invención también se puede realizar mediante un método en el que se recogen monocitos de la sangre periférica de un paciente, se extraen células dendríticas de los monocitos, las células dendríticas se pulsan con el péptido de la presente invención y después se devuelven al paciente por administración subcutánea etcétera.

Este método se denomina citoterapia o terapia de células dendríticas (DC), y se hará referencia a la sección titulada "Células Presentadoras de Antígenos" descrita a continuación para detalles adicionales.

La vacuna, además del péptido administrado como el ingrediente activo que se ha mencionado anteriormente, también puede contener vehículos farmacéuticamente admisibles tales como un adyuvante adecuado (Clin-Microbiol. Rev., 7, 277-289, 1994), cuyos ejemplos incluyen un gel mineral como hidróxido de aluminio, un tensioactivo como la lecitina de fósforo y un poliol de Pluronic, un polianión, un péptido y una emulsión oleosa. Alternativamente, la vacuna puede contener otros agregados mezclados en liposomas o mezclados en polisacáridos o la vacuna. La dosificación es típicamente de 0,1 \mug/kg a 1 mg/kg por día.

En la presente invención, el ADN que codifica la vacuna del polipéptido que se ha mencionado anteriormente también se puede usar como una vacuna (vacuna de ADN). De hecho, después de insertar ácidos nucleicos y preferiblemente ADN, que contiene ácidos nucleicos que codifican el péptido WT1 modificado de la presente invención en un vector adecuado, y preferiblemente un vector de expresión, se puede impartir la inmunidad contra cáncer administrando el vector a un animal. Se hará referencia al documento WO 00/6602 o J. Immunol., 160, pág. 1717, 1998 etcétera para la técnica específica usada para esta vacuna de ADN.

Además, la presente invención se refiere a células presentadoras de antígeno sobre las que se presenta un complejo de antígeno HLA y el péptido que se ha mencionado anteriormente. En este ejemplo, aunque se observa una potente actividad de inactivación celular debido a la estimulación con el péptido de la presente invención, esto es el resultado de la presencia de células presentadoras de antígeno sobre las que se presenta un complejo del péptido de la presente invención y antígeno HLA (antígeno HLA-A24), en monocitos de sangre periférica, y de la inducción de CTL (células T citotóxicas) que reconocen específicamente estas células presentadoras de antígeno. Estas células presentadoras de antígeno sobre las que se presenta un complejo de antígeno HLA y el péptido de la presente invención se usan de forma eficaz en citoterapia (terapia DC) como se describe a continuación.

Las células presentadoras de antígeno usadas en citoterapia se producen aislando células que tienen la capacidad de presentar antígenos de pacientes con tumor, pulsar estas células con el péptido de la presente invención en el exterior del cuerpo, y provocar que un complejo de antígeno HLA y el péptido de la presente invención se presenten sobre la superficie de las células. En este documento, aunque no hay restricciones particulares sobre las "células que tienen la capacidad de presentar antígenos" suponiendo que sean células que expresan el antígeno HLA capaces de presentar el péptido de la presente invención sobre la superficie de las células, se prefieren células dendríticas ya que se considera que tienen una gran capacidad de presentación de antígenos.

Además, el péptido de la presente invención que se usa para pulsar las células que se han mencionado anteriormente que tienen la capacidad de presentar antígeno puede no estar solamente en la forma de un péptido, sino que también puede estar en forma de ADN o ARN que codifica dicho péptido.

Se puede hacer referencia a un método específico para preparar las células presentadoras de antígeno de la presente invención en, por ejemplo, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82, 1998, J. Immunol., 158, pág. 1796, 1997 y Cancer Res., 59, pág. 1184, 1999. En el caso de usar células dendríticas se aíslan linfocitos de la sangre periférica de un paciente con tumor que usa el método Fycoll, y después de retirar posteriormente las células no adheridas, las células dendríticas se obtienen de las células adheridas cultivándolas en presencia de GM-CSF e IL-4, después de lo cual las células presentadoras de antígeno de la presente invención se pueden preparar pulsando las células dendríticas cultivándolas con el péptido de la presente invención.

Además, en el caso de preparar las células presentadoras de antígeno de la presente invención insertando ADN o ARN que codifica el péptido de la presente invención en las células que se han mencionado anteriormente que tienen la capacidad de presentar antígeno, la inserción se puede realizar con referencia a, por ejemplo, Cancer Res., 56, pág. 5672, 1996 o J. Immunol., 161, pág. 5607, 1998 en el caso de ADN, o con referencia a J. Exp. Med., 184, pág. 465, 1996 en el caso de ARN.

Estas células presentadoras de antígeno se pueden usar como el ingrediente activo de un agente terapéutico tumoral. En este momento, para mantener la estabilidad de las células presentadoras de antígeno, el agente de tratamiento comprende preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o medio etcétera. Los ejemplos de métodos de administración incluyen administración intravenosa, la administración subcutánea y administración intracutánea.

Además, la presente invención también se refiere a células T citotóxicas (CTL) que se obtienen estimulando linfocitos de sangre periférica in vitro usando el péptido que se ha mencionado anteriormente. Las CTL de la presente invención se pueden usar de forma eficaz en la inmunoterapia adoptiva descrita a continuación.

De hecho, en el caso de melanoma, se ha reconocido que la inmunoterapia adoptiva es terapéuticamente eficaz cultivando in vitro un gran número de las células T del paciente que han invadido el tumor, y devolviéndolas después al paciente (J. Natl. Cancer Inst., 86, 1159, 1994). Además, en el caso del melanoma de ratón, se ha observado inhibición de metástasis estimulando células del bazo in vitro con el péptido antigénico del tumor TRP-2, permitiendo que las CTL específicas proliferen en el péptido antigénico de tumor, y administrando después dichas CTL a los ratones con transplante de melanoma (J. Exp. Med., 185, 453, 1997). Esto se basa en el resultado de permitir proliferar in vitro a las CTL que reconocen específicamente un complejo del antígeno HLA de células presentadoras de antígeno y péptido de antígeno tumoral. Por tanto, se piensa que es útil un método de tratamiento en el cual los linfocitos de sangre periférica del paciente se estimulan in vitro usando el péptido de la presente invención para aumentar las CTL específicas de tumor seguido por la devolución de estas células al paciente.

De este modo, las CTL de la presente invención se pueden usar como el ingrediente activo de un agente terapéutico tumoral. En este momento, para mantener la estabilidad de las CTL, el agente terapéutico comprende preferiblemente solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o medio, etcétera. Los ejemplos de métodos de administración incluyen administración intravenosa, administración subcutánea y administración intracutánea.

Los siguientes ejemplos sirven para clarificar la utilidad del péptido de la presente invención como un antígeno de cáncer y una vacuna contra cáncer.

Ejemplo 1

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de donantes positivos a HLA-A*2402 y se distribuyeron entre los pocillos de una placa de 24 pocillos a 2 x 10^{6} células/pocillo seguido por la adición de péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado a una concentración de 20 \muM y cultivándolas durante 1 semana. El medio usado en este momento consistió en RPMI al 45%, AIV al 45%, FCS al 10% 1x aminoácidos no esenciales y SM/PCG. Después del cultivo que se ha mencionado anteriormente se ajustaron las células a 2 x 10^{6} células/pocillo y se usaron como células de respuesta.

Por el otro lado se aislaron de forma similar otras células mononucleares de sangre periférica de los mismos donantes positivos a HLA-A*2402 y después se pulsaron con péptidos por el cultivo durante 4 días con uno de los péptidos que se han mencionado anteriormente a 20 \muM. Después de la irradiación a 30 Gy se ajustaron las células hasta 4 x 10^{6} células/pocillo y se usaron como células estimuladoras.

Las células de respuesta y las células estimuladoras preparadas de la manera que se ha descrito anteriormente después se mezclaron y después se cultivaron durante 1 semana después de la adición de IL-2 a 50 U/ml. Como resultado, el estado de las células resultantes fue como se muestra en la siguiente tabla.

TABLA 1

1

A continuación se realiza un ensayo de inactivación de acuerdo con el método de liberación de ^{51}Cr (J. Immunol., 164, 1873, 2000). Para las células diana se usaron células C1R2402 y células C1R2402 pulsadas con los péptidos que se han mencionado anteriormente. Después se permitió que las células estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado, como se ha descrito previamente (células efectoras (E)) actuaran sobre cada una de estas células diana (T) a una proporción E:T de 1,5 de 20, seguido por la medición de la lisis celular. Estos resultados se muestran en la Fig. 1. Como es evidente a partir de este gráfico, las células estimuladas con péptido WT1 modificado mostraron una actividad de inactivación celular más potente que las células estimuladas con el péptido WT1 silvestre.

Ejemplo 2

La actividad de inactivación celular de células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado sobre células de leucemia que expresan endógenamente antígeno WT1 se ensayó de acuerdo con el método de liberación de ^{51}Cr. Para las células diana se usaron células WT1+/A*2402+ (células de leucemia del paciente # 1 de AML), células WT1-/A*2402+ (células de leucemia del paciente # 2 de AML), células WT1+/A*2402- (células de leucemia del paciente # 3 de AML) y células WT1-/A*2402- (células de leucemia del paciente # 4 de AML).

Las células efectoras (E) preparadas en el Ejemplo 1 y la célula diana que se han mencionado anteriormente (T) se mezclaron a una proporción de E:T de 20:1 y se cultivaron durante 4 horas seguido por la medición del grado de lisis celular. Estos resultados se muestran en la Fig. 2.

Como es evidente a partir de este gráfico, aunque ambas células estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado demostraron actividad citotóxica en las células WT1+/A*2402, el nivel de esta actividad fue mayor para el péptido WT1 modificado.

Ejemplo 3

Se realizó el mismo experimento que en el Ejemplo 1 usando células efectoras preparadas a partir de células mononucleares de sangre periférica de diferentes donantes sanos positivos para HLA-A*2402. Estos resultados se muestran en la Fig. 3.

Como es evidente a partir de este gráfico, de forma similar al Ejemplo 1, las células estimuladas con péptido WT1 modificado mostraron una actividad citotóxica más potente que las células estimuladas con péptido WT1 silvestre.

Ejemplo 4

La actividad citotóxica de células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado se ensayó en una línea celular de cáncer asociada a cáncer de pulmón que expresa endógenamente antígeno WT1 (células diana) usando el método de liberación de ^{51}Cr. Para las células diana se usaron células RERF-LCAI (WT1+/A*2402+), LC1sq (WT1+/A*2402+), 11-18 (WT1-/A*2402+) y LK87 (WT1+/A*2402-).

Se cultivaron células efectoras (E) preparadas del mismo modo que en el Ejemplo 1 y las células diana que se han mencionado anteriormente (T) marcadas con ^{51}Cr durante 4 horas a una proporción de E:T de 20:1 del mismo modo que en el Ejemplo 2 seguido por la medición del grado de lisis celular. Estos resultados se muestran en la Fig. 4.

Como es evidente a partir de este gráfico, aunque ambas células estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado demostraron actividad citotóxica solamente en las células WT1+/A*2402+, el nivel de esta actividad fue mayor para el péptido WT1 modificado.

Ejemplo 5

Se confirmó que células efectoras estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado eran células asesinas CD8-positivas que se unían a HLA de clase I mediante un ensayo de bloqueo usando anticuerpos. Los anticuerpos usados consistieron en anticuerpo anti-HLA de clase I, anticuerpo anti-HLA de clase II y anticuerpo anti-CD8. Se mezclaron células efectoras (E) preparadas del mismo modo que en el Ejemplo 1 y células diana (T) en la forma de células C1R2402 o células C1R2402 pulsadas con péptido WT1 silvestre, ambas marcadas con ^{51}Cr, con anticuerpo a una proporción de E:T de 20:1, y después se cultivaron durante 4 horas seguido por la medición del grado de lisis celular de acuerdo con el método de liberación de ^{51}Cr. Estos resultados se muestran en la Fig. 5.

Es evidente a partir de este gráfico que la actividad citotóxica se bloqueó por el anticuerpo anti-HLA de clase I y el anticuerpo anti-CD8 para ambas células estimuladas con péptido WT1 silvestre o péptido WT1 modificado, indicando que las células que muestran actividad citotóxica son células asesinas positivas a CD8 que se unen a HLA de clase I.

Ejemplo 6

Se investigó la afinidad de unión del péptido WT1 modificado y del péptido WT1 silvestre por HLA-A*2402. Después de tratar células C1R2402 durante 1 minuto con una solución tampón (ácido cítrico 131 mM, fosfato sódico 66 mM, 290 m osmol, pH 3,3), se neutralizaron las células añadiendo medio DMEM que comprendía albúmina sérica bovina al 0,5%. Después de lavar las células con el medio, se suspendieron a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml en medio DMEM que contenía microglobulina \beta2 200 nM (Sigma) y albúmina sérica bovina al 0,5%. Se mezclaron 15 \mul de la suspensión celular con 50 \mul del medio que comprendía diversas concentraciones de péptido WT1 seguido por la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de lavar las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal para HLA-A24 marcado con FITC (nombre del clon: 7A12), y la cantidad de HLA-A24 expresada se analizó con un sistema de citómetro de flujo FACS. Se realizó un procedimiento similar en el péptido antigénico de melanoma pmel 15, que se ha informado que se une a HLA-A*2402 (Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu) (Secuencia ID Nº 4) (J. Immunol., 154, 5994, 1995), y usando esto como un patrón, se calcularon las constantes de disociación (kd) de los péptidos WT1 de acuerdo con el método descrito en la bibliografía (Immunogenetics, 51, 816, 2000). Estos resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2

2

Como es evidente a partir de esta tabla, el péptido WT1 modificado demostró una afinidad de unión por HLA-A*2402 más fuerte que el péptido WT1 silvestre.

Basándose en los resultados que se han mencionado anteriormente, se probó que el péptido de la presente invención funciona de forma incuestionable como un antígeno de cáncer y provoca la inducción y proliferación de células T asesinas (células T citotóxicas de células de cáncer) contra células cancerosas. Por tanto, el péptido antigénico de cáncer de la presente invención es útil como una vacuna contra cáncer contra leucemia y cánceres sólidos que acompañan una expresión aumentada del gen WT1.

<110> Haruo Sugiyama

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<120> Péptido WT1 modificado

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<130> JP39

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<150> JP 2001-83250

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<151> 22-03-2001

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<160> 4

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<210> 1

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<211> 449

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<212> PRT

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<213> Ratón

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<400> 1

3

4

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<210> 2

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido Sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\sa{Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu}

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<210> 3

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido Sintético

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<400> 3

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\sa{Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu}

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<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221>

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<222>

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<223> Péptido Sintético

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<400> 4

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\sa{Ala Tyr Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Leu}

Claims

1. Un péptido antigénico de cáncer que tiene como su ingrediente activo un péptido que consiste en 9-30 aminoácidos y que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEC ID
Nº 3).

2. Un péptido antigénico de cáncer de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en 9-12 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 3.

3. Un péptido antigénico de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 3.

4. Una vacuna contra cáncer que tiene como su ingrediente activo un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una vacuna de ADN contra cáncer que tiene como su ingrediente activo ADN que codifica para un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Células presentadoras de antígeno sobre las que se presenta un complejo de antígeno HLA y péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Células T citotóxicas que se obtienen estimulando linfocitos de sangre periférica in vitro usando un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

8. Uso de células T citotóxicas obtenidas por estimulación in vitro de linfocitos de sangre periférica con un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cáncer.