JP2002284797A - サバイビン由来癌抗原ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導
しうるペプチドを提供する。 【解決手段】 以下のアミノ酸配列： Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu で示されるペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、癌細胞を標的とする細
胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）を誘導すること
ができるペプチドに関する。また本発明は、前記ペプチ
ドを含む癌ワクチン及び抗癌剤に関する。更に本発明
は、癌細胞を標的とするＣＴＬを誘導するための前記ペ
プチドの使用、得られたＣＴＬ及び前記ＣＴＬを含む抗
癌剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年における免疫学と分子生物学の進歩
は、腫瘍免疫の進歩に多大の影響を与えている。ヒトで
インフルエンザウイルス感染が起きた場合に、その感染
に対して免疫が成立して感染症から離脱するという事象
は以下の細胞性免疫により説明することができる。イン
フルエンザウイルスに感染した上皮細胞は、その細胞表
面にある主要組織適合抗原複合体ＨＬＡ分子上にウィル
スゲノム由来の９〜１０のポリペプチドを提示する。こ
のＨＬＡ−ウイルスペプチド複合体を提示する感染細胞
は強烈なアロジェニック反応を惹起し、感染細胞は末梢
血中に存在するＣＤ８陽性ＣＴＬにより特異的に認識さ
れ、積極的に排除される。この細胞性免疫のメカニズム
は自己の細胞が腫瘍化して生じた癌細胞に対しても同様
に働くと理解される。このことは、ベルギーのThierry
Boonらによる悪性黒色腫からの腫瘍抗原ＭＡＧＥ遺伝子
の単離により証明された（Van der Bruggenら, Scienc
e, 254, 1643-1647(1991)）。Ｔ細胞が認識する癌抗原
の同定方法としては、Ｔ細胞を用いてヒト癌由来のｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングする方法が既に開発
されており、この方法を用いて前記のＭＡＧＥ遺伝子が
単離された。それ以後、悪性黒色腫を初めとした癌細胞
表面上のクラスＩ分子に提示されてＴ細胞に認識される
癌由来癌抗原ペプチドが複数同定され、これらのいくつ
かを用いた臨床治験が開始されており、既に一定の成果
が得られている。例えば、癌患者の血清中に存在する抗
体により認識される分子として食道癌より同定されたＮ
Ｙ−ＥＳＯ−１分子は、その合成ペプチドがＣＴＬの誘
導能を有することが確認されている（Chen, YT.ら, Pro
c.Natl. Acad. USA, 94, 1914-1918(1997)及びJager,
E.ら, J. Exp. Med., 187,265-270(1998)）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、臨床的に癌の
大部分を占めるリンパ腫、肺癌、膀胱癌等の上皮癌では
癌抗原がほとんど同定されておらず、これらを用いた免
疫療法は確立されていない。そこで本発明は、癌の免疫
療法に使用しうる癌ワクチン及び抗癌剤を提供すること
を解決すべき課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、免疫学的
なヒト癌拒絶が主にＣＴＬ、特にＣＤ８（＋）ＣＴＬに
より担われていることに着目した。ＣＤ８（＋）ＣＴＬ
は癌細胞上の主要組織適合抗原複合体（ヒトではＨＬ
Ａ）と当該ＨＬＡ上に提示された癌抗原ペプチドとから
なる複合体を認識して活性化する。そして、活性化され
たＣＴＬはその細胞表面上のＴ細胞抗原レセプターを介
して癌細胞を認識し、これを攻撃する。したがって、癌
抗原ペプチドが同定されれば、これを癌ワクチン及び抗
癌剤として使用し、ＣＴＬを効率的に誘導して、癌を予
防及び治療することができる。サバイビン（Survivin）
はアポトーシスインヒビター（ＩＡＰｓ）ファミリーに
属するタンパク質であり、強い抗アポトーシス能を有す
る。サバイビンは当初、単一の遺伝子に由来する産物と
して報告されたが、この遺伝子には、スプライスバリア
ントが複数あることが報告されている（Mahotka, C.ら,
Cancer Res.,59, 6097-6102(1999)）。サバイビンは肺
癌、膀胱癌等の多くの癌で発現するが、正常組織での発
現は胎児組織と成人胸腺、精巣等に限られていることが
報告されている（Ambrosini, G.ら, Nat. Med., 3, 917
-921(1997)）。しかしながら、サバイビンが実際にＣＴ
Ｌを誘導しうるか否かは明らかにされていなかった。そ
こで本発明者等は、種々のサバイビン由来のペプチドに
ついて癌抗原性、すなわちＣＴＬ誘導能について鋭意検
討を重ねたところ、サバイビンエクソン２Ｂ遺伝子によ
りコードされる２３個からなるアミノ酸配列内にＨＬＡ
−Ａ２４結合モチーフがあり、このなかの特定のペプチ
ドがＣＴＬを誘導することができることを見いだした。
本発明はこの知見に基づいてなされたものである。すな
わち、本発明は、 （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、癌
細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうるペプチ
ド； （２）前記（１）のペプチドを含む癌ワクチン； （３）前記（１）のペプチドを含む抗癌剤； （４）癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する
ための前記（１）のペプチドの使用； （５）前記（１）のペプチドにより誘導された細胞傷害
性Ｔ細胞及び、 （６）前記（５）の細胞傷害性Ｔ細胞を含む抗癌剤；で
ある。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し
うるペプチドは、以下の配列： Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu （配列番号
１） で示されるペプチドをいう。

【０００６】本発明のペプチドの同定は、以下の工程： （１）ヒト主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ
であるＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに対応する配列を
有するサバイビン由来ペプチドを提供する工程、（２）
前記のペプチドを、ＨＬＡ−Ａ２４を発現する抗原提示
細胞に添加し、ＨＬＡ−Ａ２４により前記ペプチドを提
示している抗原提示細胞を得る工程、（３）前記抗原提
示細胞でＴ細胞を刺激してＣＴＬを誘導する工程、及
び、（４）誘導されたＣＴＬの癌細胞傷害能を測定する
工程、を含む方法により行うことができる。

【０００７】本発明のペプチドはアミノ酸数が９と小さ
いので、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏ
ｃ法により合成することができる。市販のアミノ酸合成
装置を使用して合成することもできる。また、本発明の
ペプチドはサバイビンに由来するので、癌患者の癌細胞
から文献（Suzuki, K.ら, J. Immunol., 163, 2783-279
1(1999)）に記載の方法にしたがいサバイビンを単離し
て、該当するペプチドを得ることもできる。

【０００８】本発明のペプチドを使用して癌細胞を標的
とするＣＴＬを誘導することができる。誘導されたＣＴ
Ｌは癌細胞を認識して、これを攻撃する。したがって、
本発明のペプチドは癌ワクチン及び抗癌剤として使用す
ることができる。本発明の癌ワクチン及び抗癌剤を適用
しうる癌は、本発明のペプチドをＨＬＡ−Ａ２４により
提示している癌細胞からなる癌、例えば上皮癌である。
上皮癌としては、肺癌、大腸癌、膀胱癌、膵癌、前立腺
癌、乳癌等が挙げられる。本発明のペプチドを癌ワクチ
ン及び抗癌剤として使用する場合、本発明のペプチド
は、それ自身で又は補助剤と共に使用することができ、
更に医薬的に許容しうる担体を適宜含有させることがで
きる。補助剤としては、免疫応答の強化を目的とするア
ジュバント、例えばフロイドの不完全（完全）アジュバ
ント、アルミニウムアジュバント等が挙げられる。医薬
的に許容しうる担体としては、例えばＰＢＳ、蒸留水等
の希釈剤、生理食塩水等が挙げられる。本発明の癌ワク
チン及び抗癌剤は、当該技術分野において周知の方法に
より、液剤、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、
ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤等の形態にす
ることができる。本発明の癌ワクチン及び抗癌剤は、そ
の使用形態に応じて経口、非経口又は経皮投与すること
ができる。例えば、静注投与、筋射投与が挙げられる。
投与量は、通常、患者の体重、疾患の性質及び状態に依
存して変化するが、成人に使用する場合、１日あたり最
大で５〜１０ｍｇである。例えば、成人の癌患者に皮下
注射により使用する場合、１週間あたり１００〜１００
０μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇである。

【０００９】また、本発明のペプチドを、癌細胞を標的
とするＣＴＬを誘導するために使用することができる。
誘導は、例えば文献（Nabeta, Y.ら, Jpn. J. Cancer R
es.91, 616-621(2000)）に記載の方法にしたがい行うこ
とができる。 具体的には以下の工程：ＨＬＡ−Ａ２４を発現している
細胞を提供する工程、前記細胞に本発明のペプチドを添
加して、ＨＬＡ−Ａ２４上に提示させる工程、前記ペプ
チドをＨＬＡ−Ａ２４により提示している細胞でＴ細胞
を刺激し、前記Ｔ細胞を癌細胞標的ＣＴＬへ誘導する工
程、を含む方法を使用することができる。ＨＬＡ−Ａ２
４を発現する細胞は癌患者から採取したものでもよい
が、非ＨＬＡ−Ａ２４発現細胞に、ＨＬＡ−Ａ２４をコ
ードする遺伝子を導入して作成してもよい。

【００１０】得られたＣＴＬは癌細胞を標的とするの
で、これを抗癌剤に使用することができる。この場合、
前記の本発明のペプチドを含む抗癌剤と同様に、適宜医
薬的に許容しうる担体を含み、かつ種々の形態をとるこ
とができる。本発明のＣＴＬを含む抗癌剤は、本発明の
ペプチドを含む癌ワクチン及び抗癌剤と同様に非経口投
与することができる。投与量は、通常、患者の体重、疾
患の性質及び状態に依存して変化するが、成人の癌患者
に皮下注射により使用する場合、１週間あたり１００〜
１０００μｇであり、好ましくは１００〜２００μｇで
ある。

【実施例】次に、実施例により本発明の効果を具体的に
説明するが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。

【００１１】参考例１ サバイビンｍＲＮＡの細胞株に
おける発現 以下の細胞株：ＬＨＫ−２（肺腺癌細胞）、ＫＭＧ−Ａ
（胆のう癌細胞）、Ｆｓ−１（上顎癌細胞）、ＯＳＣ４
０（口腔扁平上皮癌細胞）、ＨＣ−ＭＡ（下咽頭扁平上
皮癌細胞）、ＫＥ−４（食道癌細胞）、ＬＢ３３ｍｅｌ
（悪性黒色腫細胞）、８８８ｍｅｌ（悪性黒色腫細
胞）、１１０２ｍｅｌ（悪性黒色腫細胞）、ＢＢ６４Ｒ
ＣＣ（腎癌細胞）、ＬＢ９０５ＢＬＣ（前立腺癌細
胞）、ＹＭ−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、Ｌ
Ｇ２−ＥＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＫＫ−Ｅ
ＢＶ（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、Ｎａｂｅ−ＥＢＶ
（健常人由来ＥＢＶ−Ｂ細胞）、ＰＨＡ−ｂｌａｓｔ
（ＰＨＡ刺激Ｔ細胞）及びＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）
並びに成人の胃、小腸、大腸、脾臓、肺、腎臓、前立
腺、膵臓及び心臓から採取した正常組織に由来するｍＲ
ＮＡ ２μｇを、サバイビン遺伝子特異的プライマーを
用いてＲＴ−ＰＣＲし、得られたＰＣＲ産物を電気泳動
した後、エチジウムブロマイドで染色した。内部標準と
してＧ３ＰＤＨを用いた。図１に示されるように、構成
的タンパク質であるＧ３ＰＤＨはいずれの細胞において
も発現が見られた。一方サバイビンは、癌細胞であるＬ
ＨＫ−２、ＫＭＧ−Ａ、Ｆｓ−１、ＯＳＣ４０、ＨＣ−
ＭＡ、ＫＥ−４、ＬＢ３３ｍｅｌ、８８８ｍｅｌ、１１
０２ｍｅｌ、ＢＢ６４ＲＣＣ、ＬＢ９０５ＢＬＣ、ＹＭ
−ＥＢＶ、ＬＧ２−ＥＢＶ、ＫＫ−ＥＢＶ、Ｎａｂｅ−
ＥＢＶ及びＰＨＡ−ｂｌａｓｔでサバイビンの発現が見
られたが、正常細胞では発現が見られなかった。この結
果より、サバイビンは多くの癌細胞に特異的に発現する
ことが理解される。

【００１２】実施例１ 本発明のサバイビン由来癌抗原
ペプチドの製造 以下のアミノ酸配列： Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu （配列番号
１） を有するペプチドを合成した。ペプチドは、９−フルオ
レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）戦略に基づ
いて固相同時多重ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８（島津製
作所）を使用して合成し、次いでＣ１８逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Millipore）により精
製した。ペプチドの純度及び同一性は、それぞれ分析用
ＨＰＬＣ及び質量分析により測定した。ペプチドを、ジ
メチルスルホキシド中に濃度１．５ｍｇ／ｍｌで溶解
し、−８０℃で保存した。

【００１３】実施例２ 本発明のサバイビン由来癌抗原
ペプチドを用いたＣＴＬのin vitro誘導 ヒトの末梢血をフィコール・コンレイ密度勾配中で遠心
分離して末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を集め、次いで接着
細胞と非接着細胞とに分離した。接着細胞をＡＩＭ−Ｖ
（Gibco Co.）中、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（N
ovartis Pharmaceuticals）及び１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ
−４（Gibco-BRL）と共にインキュベートした。この細
胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。非接着細
胞をＡＩＭ−Ｖ中、３０〜１００ＩＵ／ｍｌの組換えＩ
Ｌ−４（味の素）と共にインキュベートした。７〜１０
日目に、本発明のペプチド（終濃度３０μｇ／ｍｌ）を
ＡＰＣに添加し、１日後、組換えＴＮＦ−α及びＩＦＮ
−α（住友製薬）を添加してＡＰＣを成熟させた。次い
でＡＰＣに放射線を照射した後、ＡＰＣと自家非接着細
胞から分離したＣＤ８陽性細胞とを、ＩＬ−２を含まな
いＡＩＭ−Ｖ中で混合した。インキュベート２日後、Ｉ
Ｌ−２（武田薬品工業）を終濃度１００ＩＵ／ｍｌで培
養へ添加した。７日毎に、Ｔ細胞マイトジェンであるＰ
ＨＡで刺激した自家ＰＨＡブラスト（ＰＨＡ刺激Ｔ細
胞）をＡＰＣとして、ＣＤ８陽性細胞を刺激した。刺激
毎に、培養に１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮培
地を追加した。２８日目のＣＴＬを以下の活性試験に使
用した。

【００１４】実施例３ 本発明のＣＴＬの細胞傷害性 （１）試験方法 ＣＴＬの細胞傷害能を⁵¹Ｃｒ細胞傷害試験により評価し
た。ＣＴＬの標的細胞を１００μＣｉのクロム酸ナトリ
ウム（⁵¹Ｃｒ）を用いて３７℃で２時間標識し、洗浄
し、再懸濁した。試験ペプチドが提示された標識標的細
胞は、前記の標的細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）を⁵¹Ｃ
ｒで標識し、３０μｇ／ｍｌの試験ペプチドと室温で２
時間インキュベートすることにより得た。エフェクター
細胞（ＣＴＬ）をＶ字底マイクロタイタープレートＣｏ
ｓｔａｒ３８９４（Corning Incorporated）の各ウェル
に入れ、ここに前記標識標的細胞を濃度５×１０³細胞
／ウェルで添加し、容量０．２ｍｌとした。６時間のイ
ンキュベート後、０．１ｍｌの上清を集め、自動化ガン
マカウンター（LKB Wallac）により⁵¹Ｃｒの放出を測定
した。測定は３重に行い標準偏差を計算した。特異的細
胞傷害能の百分率は、特異的⁵¹Ｃｒ放出の百分率を下記
の式：［（実験値）−（自発的放出値）／（最大放出
値）−（自発的放出値）］×１００を用いて計算するこ
とにより決定した。自発的放出値は、標的細胞をエフェ
クター細胞の非存在下で単独でインキュベートしたとき
の放出値より得た。最大放出値は界面活性剤である１０
％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ナカライケミカルＣｏ．）
と共にインキュベートしたときの最大放出量により得
た。

【００１５】（２）本発明のＣＴＬの細胞傷害性 文献（Ambrosiniら、前出及びMahotkaら、前出）に記載
のサバイビンのアミノ酸一次配列： Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp 16 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala 32 Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr 48 Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 64 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val Ala 80 Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr 96 Arg Glu Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val 112 Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp 128 Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys 144 Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln 160 Leu Ala Ala Met Asp （配列番号４） の中から、表１に示すＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフに
対応する３種のペプチドを、実施例１に記載の方法にし
たがい製造した。

【００１６】表１．試験ペプチド

【００１７】２名のＨＬＡ−Ａ２４陽性の健常人Ａ及び
Ｂの末梢血を用いて、実施例２と同様の方法により各群
のペプチドを用いてＣＴＬを誘導した。ＣＴＬの標的細
胞として、サバイビンを発現する（以降、サバイビン陽
性という）Ｃ１Ｒ細胞株（ATCCより入手）に、ＨＬＡ−
Ａ２４＊２４０２遺伝子を、ベクターｐＩＲＥＳ（Clon
etech, Inc.）を用いて、文献（Suzukiら、前出）にし
たがい導入し、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面に発現さ
せた（以降、ＨＬＡ−Ａ２４陽性という）Ｃ１Ｒ−Ａ＊
２４０２細胞を用いた。前記（１）の試験法にしたが
い、各標的細胞に試験ペプチドを添加して、標的細胞上
にペプチドを提示させ、これを試験に使用した。各ペプ
チドを用いて誘導したＣＴＬについての⁵¹Ｃｒ細胞傷害
試験の結果をそれぞれ図２に示す。縦軸は標的細胞の融
解の百分率を、横軸はＥ／Ｔ比（エフェクター細胞（Ｃ
ＴＬ）／標的細胞）を示す。健常人Ａ及びＢの両方にお
いて、本発明のペプチド（サバイビン２Ｂ８０）により
誘導されたＣＴＬはＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２細胞に対して
高い細胞融解を示したが、その他のペプチドにより誘導
されたＣＴＬはいずれの細胞に対しても低い細胞融解性
を示した（図２）。これらの結果より、本発明のペプチ
ドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつ
サバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞
傷害性を有していることが理解される。（３）本発明のＣＴＬの細胞傷害性 前記の健常人Ｂ由来の本発明のＣＴＬについて、下記表
２に示す細胞を標的として、本発明のペプチドを添加し
た場合と未添加の場合の細胞傷害性を試験した。 表２．標的細胞 ＋：陽性 −：陰性⁵¹ Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図３に示す。試験
は１種の標的細胞につき、３つのＥ／Ｔ比（２０、６及
び２）を用いて行った。図３に示す各標的細胞における
結果において、左側の棒はＥ／Ｔ＝２０での結果、真ん
中の棒はＥ／Ｔ＝６での結果及び右側の棒はＥ／Ｔ＝２
における結果を示している。本発明のＣＴＬは、本発明
のペプチドを未添加のＣ１Ｒ−Ａ＊２４０２、８８８ｍ
ｅｌ、ＬＧ２−ｍｅｌ、ＯＳＣ４０、ＫＥ−４、ＬＨＫ
−２、ＰＣ−９に対しても細胞傷害性を示した。これは
前記細胞が元々ＨＬＡ−Ａ２４及びサバイビンを発現し
ているためであると考えられる。一方、本発明のサバイ
ビン由来ペプチドを添加した場合、本発明のＣＴＬはよ
り高い細胞傷害性を示した。一方、ＨＬＡ−Ａ２４を発
現していないＫ５６２に対しては、たとえ本発明のペプ
チドを添加した場合であっても細胞傷害性を示さなかっ
た。これらの結果より、本発明のペプチドにより誘導さ
れたＣＴＬが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつサバイビン陽性
の細胞、すなわち癌細胞に対し高い細胞傷害性を有して
いること、及び、細胞外からサバイビン由来癌抗原ペプ
チドを添加した細胞だけでなく細胞内でサバイビンを発
現している癌細胞に対しても高い細胞傷害性を有してい
ることが理解される。

【００１８】実施例４ 本発明のＣＴＬクローンの作成
及び反応性の解析 （１）ＣＴＬのクローンの作成 本発明のＣＴＬの反応性を検討するために、単一のＣＴ
Ｌクローンを、Riddellら（Walter, EA.ら, N. Engl.
J. Med., 333, 1038-1044(1995)）の方法にしたがい作
成した。９６穴Ｕ字型プレートにて１ウェルあたり０．
３、３又は１０細胞／ウェルとなるようにＣＴＬを調整
し、ここに放射線を照射して不活化した。次いで、健常
人由来ＰＢＭＣ細胞（１×１０⁴）とＬＧ２−ＥＢＶ細
胞（５×１０⁴）と共に培養した。培養液として、１０
％ ヒトＡＢ血清、４０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（BD P
harmingn, San Diego）、５０μＭ ２−ＭＥ、１０ｍ
ＭＨｅｐｅｓ、１５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を含むＡＩＭ
−Ｖ溶液を１ウェルあたり全量２００μｌで用いた。培
養７日目に１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を用いたことを除
いて前記と同様の新鮮培養液と交換した。培養１０日目
ないし１４日目に、４８穴プレートに移し、実験２８日
目に３種類のクローン：７Ｆ６、７Ｈ２及び４Ｆ９を得
た。この中からクローン７Ｈ２についてＦＡＣＳにより
細胞表現型を解析した。（２）ＣＴＬクローン７Ｈ２のＦＡＣＳ解析 １次抗体として、マウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ
８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ分子
標識抗体（Becton-Dickinson）を使用した。ＣＴＬクロ
ーン７Ｈ２を１次抗体で４℃、３０分処理した後、ＰＢ
Ｓで２回洗浄した。次いでＦＩＴＣで標識した抗マウス
２次抗体で４℃、３０分処理し、ＰＢＳで２回洗浄した
後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Be
cton-Dickinson）により蛍光強度を測定した。結果を図
４に示す。縦軸は細胞数（カウント数）、横軸はＦＩＴ
Ｃ蛍光強度を示す。各図の下には使用した１次抗体が認
識する細胞表面抗原を記載した。図中の常に右側に位置
する線は１次抗体及び２次抗体で処理したときの結果を
示し、図中の常に左側に位置する線は１次抗体なしで２
次抗体のみで処理した陰性対照を示す。陰性対照を示す
線に対して１次抗体で処理したときの線がどれだけ右に
移動したかを検討することにより、陽性率を判断した。
ＣＴＬクローン７Ｈ２はＣＤ３、ＣＤ８及びＴＣＲαβ
については陽性であったが、ＣＤ４、ＣＤ１６及びＴＣ
Ｒγδについては陰性であった。以上の結果より、ＣＴ
Ｌクローン７Ｈ２はＣＤ３、ＣＤ８及びＴＣＲαβ陽性
の典型的なＣＴＬであることが理解される。（３）ＣＴＬクローンの細胞傷害性 （１）で得た３種類のクローン７Ｆ６、７Ｈ２及び４Ｆ
９について、肺癌細胞ＬＨＫ−２細胞（ＨＬＡ−Ａ２４
陽性かつサバイビン陽性）を標的として、本発明のペプ
チドを添加した場合と未添加の場合の細胞傷害性を試験
した。⁵¹Ｃｒ細胞傷害試験の結果をそれぞれ図５に示
す。図５に示す各ＣＴＬクローンの結果において、左側
の棒は標的細胞ＬＨＫ−２、本発明のペプチド添加の場
合の結果、真ん中の棒は標的細胞ＬＨＫ−２、本発明の
ペプチド未添加の場合の結果及び右側の棒は標的細胞Ｋ
５６２の場合の結果を示している。本発明のＣＴＬは、
本発明のペプチドを未添加のＬＨＫ−２に対しても細胞
傷害性を示した。これはＬＨＫ−２細胞が元々ＨＬＡ−
Ａ２４及びサバイビンを発現しているためであると考え
られる。一方、本発明のサバイビン由来ペプチドを添加
した場合、本発明のＣＴＬはより高い細胞傷害性を示し
た。一方、ＨＬＡ−Ａ２４を発現していないＫ５６２に
対しては、たとえ本発明のペプチドを添加した場合であ
っても細胞傷害性を示さなかった。これらの結果より、
本発明のペプチドにより誘導されたＣＴＬが、ＨＬＡ−
Ａ２４陽性かつサバイビン陽性の細胞、すなわち癌細胞
に対し特異的な細胞傷害性を有していること、及び、細
胞外からサバイビン由来癌抗原ペプチドを添加した細胞
だけでなく細胞内でサバイビンを発現している癌細胞に
対しても高い細胞傷害性を有していることが理解され
る。

【００１９】

【発明の効果】本発明のペプチドは、本発明のペプチド
を提示したＨＬＡ−Ａ２４を有する癌細胞を標的とする
ＣＴＬを誘導することができる。ＨＬＡ−Ａ２４の発現
率は高く、欧米人では２０〜３０％であり、特に日本人
では５０％以上が発現している。したがって、本発明の
癌抗原ペプチドは有用な癌ワクチン及び抗癌剤として使
用することができる。

【００２０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hokkaido Technology Licensing Office Co. Ltd. <120> A cancer antigen peptide derived from survivin <130> y1i-0018 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp 1 5 10 15 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala 20 25 30 Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr 35 40 45 Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 50 55 60 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Gly Pro Gly Thr Val Ala 65 70 75 80 Tyr Ala Cys Asn Thr Ser Thr Leu Gly Gly Arg Gly Gly Arg Ile Thr 85 90 95 Arg Glu Glu His Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val 100 105 110 Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp 115 120 125 Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys 130 135 140 Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln 145 150 155 160 Leu Ala Ala Met Asp 165

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、種々の癌細胞及び正常細胞におけるサ
バイビンの発現を示す図である。

【図２】図２は、種々のサバイビン由来ペプチドを用い
て誘導したＣＴＬについての⁵¹Ｃｒ細胞傷害試験の結果
を示すグラフである。

【図３】図３は、本発明のＣＴＬの種々の標的細胞に対
する⁵¹Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラフである。

【図４】図４は、本発明のＣＴＬクローン７Ｈ２の細胞
表面抗原についてのＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフで
ある。

【図５】図５は、本発明のＣＴＬクローンの肺癌細胞Ｌ
ＨＫ−２に対する⁵¹Ｃｒ細胞傷害試験の結果を示すグラ
フである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 鳥越 俊彦 北海道札幌市南区澄川５条11丁目９−13 Ｆターム(参考） 4B065 AA94X BB19 BB34 CA44 CA45 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA17 CA56 NA14 ZB262 4C085 AA02 BB01 BB11 CC32 EE01 GG04 4H045 AA10 AA11 AA30 BA15 CA41 DA86 EA28 EA31

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列から
   なり、癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しう
   るペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のペプチドを含む癌ワク
   チン。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のペプチドを含む抗癌
   剤。
4. 【請求項４】 癌細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を
   誘導するための請求項１に記載のペプチドの使用。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のペプチドにより誘導さ
   れた細胞傷害性Ｔ細胞。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を含
   む抗癌剤。