WO2005005631A1

WO2005005631A1 - リビン由来のｈｌａ-ａ２４結合性癌抗原ペプチド

Info

Publication number: WO2005005631A1
Application number: PCT/JP2004/010008
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Sato; Toshihiko Torigoe; Hiroyuki Hariu; Yoshihiko Hirohashi
Original assignee: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2003-07-11
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2005-01-20
Also published as: JP4516916B2; CN1849395A; US7601801B2; JPWO2005005631A1; CN1849395B; US20070036812A1

Abstract

　配列番号：１に記載のリビンのアミノ酸配列における連続する８～１１アミノ酸からなる部分ペプチドであって、かつＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識されるペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ペプチドやポリヌクレオチドを含む癌ワクチン等を提供する。

Description

リビン由来の H L A— A 2 4結合性癌抗原べプチド技術分野

本発明は、リビン由来の H L A— A 2 4結合性癌抗原べプチドに関する。背景技術

生体による癌（腫瘍）の排除には、免疫系、特に T細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの癌局所には癌細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Arch. Surg. , 126 :p200 (1990) ) 、メラノーマからは自己の癌細胞を認識する細胞傷害性 T細胞（以下 CTL) が比較的容易に分離されている（Immunol. Today, 8： p385 (1987)、 J. Immunol. , 138： 989 (1987)、 Int. J. Cancer, 52 :p52 (1992) ) 。また、該 CTLの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、癌排除における T細胞の重要性が示唆されている（J. Natl. Cancer. Inst.， 86 : pi 159 (1 994) ) 。

自己の癌細胞を攻撃する CTLが標的とする分子については長い間不明であつたが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになつてきた。すなわち CTLは、 T細胞受容体（TCR) を用いて、癌抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラス I抗原（MHCクラス I抗原、 HLA抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の癌細胞を攻撃していることが明らかとなつた。

癌抗原ペプチドは、癌に特有のタンパク質、すなわち癌抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された癌抗原ペプチドは、小胞体内で MHCクラス I抗原（HLA抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を抗原特異的な CTLが認識し、細胞傷害作用ゃリンフォ力インの産生を介して抗癌作用を示す。このような一連の作用の解明に伴い、癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、癌患者の体内の癌特異的 CTLを増強させる治療法が可能となつた。癌抗原タンパク質としては、 1991年に T. Boonらが初めて MAGEと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（Science ， 254:_P1643 (1991) ) 。その後、いくつかの癌抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノ一マ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質である gpl00、 MART - 1、チロシナーゼなどのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種癌細胞と正常精巣細胞に発現する MAGE関連タンパク質群、癌特異的なアミノ酸変異を持つ一カテニン、 CDK4などが同定されている。また、メラノーマ以外の癌抗原タンパク質としては、 HER2/neu、 p53 (変異型）などの癌遺伝子産物、 CEA、 PSAなどの癌マーカ一、 HPV、 EBVなどのウィルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説 (Immunol. Today, 18 :p267 (1997) J. Exp. Med. , 183 :p725 (1996)、 Curr. Opin . Immunol. , 8 :p628 (1996) ) の記述に詳しい。

リビンはアポトーシス阻害タンパク（Inhibitor of apoptosis protein： IAP) のフアミリーに属する分子として同定された (J. Biol. Chem. 276 : p3238 (2001) ) 。リビンは 280ァミノ酸よりなり、バキュロウィルス IAPリピート (BIR) と呼ばれる IAPに特徴的な約 7 0ァミノ酸からなるユニークな繰り返し配列を 1個持っている。同時期にメラノーマに高発現する IAPとして同定された ML- IAP (melanoma in hibitor of apotosis protein) もリビンと同一のアミノ酸配列の分子である (Cur r. Biol. 10 :pl359 (2000) ) 。

HLA- 0201陽性のメラノ一マ患者の転移巣から回収した T細胞は ML-IAP由来のぺプチドを認識して細胞傷害活性を示した報告があり、リビンが癌抗原タンパク質として細胞傷害性 T細胞（CTL)の標的になっていると考えられる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:p3398 (2003) )。しかしながら当該リビンが、多数存在する HLA抗原のうち HLA- A24抗原に結合性の癌抗原べプチド部分を有しているか否かは明らかにされていない。発明の開示

本発明の目的は、リピン由来の HLA-A24結合性癌抗原べプチド、および当該ぺプチドの癌ワクチンとしての使用などを提供することにある。

本努明者らは、癌免疫療法において癌ワクチンとして使用できるリビン由来の抗原ペプチドにっき鋭意検討を行った。その結果、リピンには、多数存在する HLA抗原サブクラスのうち、 HLA - A24抗原に結合して CTLにより認識される癌抗原ぺプチド部分が存在していることを初めて見出した。そしてこの知見により、 HLA- A24陽性の癌患者に対してリビン特異的 CTLを誘導することのできる新たな癌ワクチン療法が可能となった。

とりわけ配列番号： 8に記載の癌抗原ペプチドは、陽性コントロールに比して格段に高い HLA- A24抗原結合性を示し、また良好な CTL誘導活性を有し、臨床適応可能な癌抗原ぺプチドとして本発明者により見出されたものである。

本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。

すなわち本発明は、

( 1 ) 配列番号： 1に記載のリビンのァミノ酸配列における連続する 8〜 1 1ァミノ酸からなるぺプチドであって、かつ H L A— A 2 4抗原と結合して C T Lにより認識されるぺプチド、

( 2 ) 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のレ、ずれかに記載のァミノ酸配列を含有する、前記（1 ) 記載のペプチド、

( 3 ) 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列からなる、前記（2 ) 記載のペプチド、

( 4 ) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有する、前記（2 ) 記載のペプチド、

( 5 ) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記（4 ) 記載のペプチド、

( 6 ) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を含有する、前記 ( 4 ) 記載のぺプチド、、

( 7 ) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなる、前記（ 6 ) 記載のぺプチド

( 8 ) 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位および/または C末端のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する 9〜1 1アミノ酸からなるペプチドであって、かつ H L A— A 2 4抗原と結合して C T Lにより認識されるペプチド、 ( 9 ) 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および /または C末端のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列からなる、前記（8 ) 記載のペプチド、

( 1 0 ) 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2 位および/または C末端のァミノ酸残基が、

第 2位：チロシン、フエ二ルァラニン、メチォニン、トリプトファン、

C末端：フエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含有する、前記（8 ) 記載のペプチド、

( 1 1 ) 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2 位および Zまたは C末端のァミノ酸残基が、

の中から選択されるレ、ずれかのァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列からなる、前記（1 0 ) 記載のペプチド、

( 1 2 ) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは c末端のアミノ酸残基が、

第 2位：チロシン、フエエノレアラニン、メチォニン、トリプトファン、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、前記（1 0 ) 記載のペプチド、

( 1 3 ) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位およびまたは C末端のァミノ酸残基が、

第 2位：チロシン、フエニノレアラニン、メチォニン、トリプトファン、

C末端：フエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列からなる、前記（12) 記載のペプチド、

(14) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは C末端のァミノ酸残基が、

C末端：フエニノレアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、

の中から選択されるいずれかのァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列（配列番号 : 63、ただし配列番号： 8に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含有する、前記（1 2) 記載のペプチド、

(15) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列の第 2位および/または C末端のァミノ酸残基が、

C末端：フエ二ルァラニン、ロイシン、ィソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号 : 63、ただし配列番号： 8に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）力、らなる、前記（14) 記載のペプチド、

(16) 前記（1) 〜（1 5) いずれ力記載のペプチドを含有するェピトープぺプチド、

(17) 前記（1) 〜（16) いずれ力記載のペプチドのうちシスティン残基を含有するペプチドの単量体がジスルフィド結合により結合してなる、二量化ぺプチド、、

(18) 配列番号： 7〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、前記（17) 記載の二量化べプチド、

(19) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を含有するぺプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、前記（18) 記載の二量化ペプチド、

(20) 前記 (1) 〜（16) いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレォチド、

(21) 前記（20) 記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、 (22) 前記（21) 記載の発現ベクターを含有する細胞、

(23) 前記（22) 記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、前記 (1) 〜（1 9) いずれか記載のペプチドの製造方法、

(24) 前記（1) 〜（1 9) いずれ力、記載のペプチドに特異的に結合する抗体

(25) 前記（1) 〜（1 9) いずれ力、記載のペプチドと HLA— A 24抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、

(26) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記载のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A 24抗原との複合体が提示されている、前記（25) 記載の抗原提示細胞、

(27) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A2 4抗原との複合体が提示されている、前記（26) 記載の抗原提示細胞、

(28) 前記（ 1 ) 〜（1 9) いずれか記載のペプチドと HLA— A 24抗原との複合体を認識する C T L、

(29) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A 24抗原との複合体を認識する、前記（28) 記載の CT し、

(30) 配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A2

4抗原との複合体を認識する、前記（29) 記載の CTL、

(31) 前記（1) 〜（1 9) いずれ力記載のペプチド、前記（21) 記載の発現ベクター、前記（_{2 2)} 記載の細胞、前記（25) 〜（27) いずれか記載の抗原提示細胞、あるいは前記（28) 〜（30) いずれか記載の CTLと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、

(32) CTLの誘導剤として使用される、前記（31) 記載の医薬組成物、 (33) 癌ワクチンとして使用される、前記 (31) 記載の医薬組成物、 (34) 前記（24) 記載の抗体を含有する癌の診断薬、

(35) 前記（1) 〜（19) いずれ力記載のペプチドと HL A— A 24抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 H L Aテトラマーまたは HL Aペンタマ一、

(36) 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A 24抗原とを含有する、前記（35) 記載の HL Aモノマ一、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは H L Aペンタマ一、

(37) 配列番号： 8に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドと HL A— A 2 4抗原とを含有する、前記（36) 記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HL Aテトラマーまたは HL Aペンタマ一、

(38) 前記（35) 〜（37) いずれか記載の HL Aモノマー、 HLAダイマ一、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を成分として含有する、リビン由来の H L A— A 24抗原結合性癌抗原べプチド特異的な C T Lの検出用試薬、ならび

(39) 癌ワクチンの効果の診断のために用いられる、前記（38) 記載の試薬、に関する。図面の簡単な説明

図 1は、リビン由来の 8種類のぺプチドおよび陽性コントロールである EBウィルス由来ぺプチド（EBV) ( HLA-A* 2402への結合親和性を示したグラフである。図中、縦軸は平均蛍光強度（結合親和性）を示す（害施例 1) 。

図 2は、リピン由来ペプチド（ペプチド 7) によるヒト末梢血単核球（PBMC) 力、らの CTL誘導活性を、 ⁵¹Crリリースアツセィにより測定した結果を示したグラフである。 HLA- A24陽性の肺癌患者より得た PBMCを用いた。図中、縦軸は CTLによる細胞傷害活性を示す。また、図中の標的細胞で、 LNY-1は、リピン陽性および HLA- A*2⁴0 2陰性、 LNY-1A24はリビン陽性および HLA- A*2402陽性、 K562はリビン陰性および HL A-A* 2402陰性である（実施例 2) 。

図 3は、図 2と同じ実験を HLA-A24陽性の別の肺癌患者の PBMCを用いて行った結果を示したグラフである。発明を実施するための最良の形態本発明は、配列番号： 1に記載のリピンのアミノ酸配列における連続する 8~11 アミノ酸からなるぺプチドであって、かつ HLA-A24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドを提供する。 '

本発明のぺプチドは、前記のように配列番号： 1に記載のァミノ酸配列の一部よりなるぺプチドであるが、その N末端ァミノ酸残基及び/又は C末端のァミノ酸残基が修飾されていても良い。またシスティン残基を含有するペプチドに関しては、その単量体がジスルフィド結合により結合してなる二量化ぺプチドの形態であっても良い。

ここで配列番号： 1に記載のヒト · リピンのアミノ酸配列は、 J. Biol. Chem. 27 6：3238, 2001、 NCBIデータベース Accession No. AAG33622 に記載された公知の配列である。

本発明のペプチドは、配列番号： 1に記載のヒト■ リビンのアミノ酸配列における連続する 8〜11アミノ酸からなるペプチドである。ここで「8〜11アミノ酸」との定義は、 HLA-A24抗原に結合性を有するぺプチドが、一般的に 8〜11ァミノ酸からなることに基づくものである（Iramunogenetics, 41 : 178-²28 (1995)、 J. Immunol. , 155： 4307-4312 (1995)、 J. Immunol. , 152 : 3913—3924 (1994)、 J. Immunol.， 152 : 3904-3912 (1994)、：)。好ましくは、配列番号： 1に記載のヒト · リビンのアミノ酸配列における連続する 9〜11アミノ酸からなるぺプチドが挙げられ、さらに好ましくは 9〜10ァミノ酸からなるぺプチドが挙げられる。

前記本発明のぺプチドは、配列番号： 1に記載のァミノ酸配列における連続する

8〜11アミノ酸からなる部分ペプチド (候補ペプチド）を合成し、該ペプチドが HLA- A24抗原に結合して CTLにより認識されるか否かをァッセィすることにより、同定することができる。

ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該合成方法としては、文献（ぺプタイド · シンセシス (Peptide Synthesis ) ， Interscience, New York, 1966；ザ-プロテインズ ( The Proteins) , Vol 2 , Academic Press Inc. , New York, 1976；ぺプチド合成，丸善（株）， 1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）， 1985 ;医薬品の開発続第 14巻'ペプチド合成，広川書店， 1991) などに記載されている方法が挙げられる。

前記において「HLA- A24抗原に結合して CTLにより認識される」とは癌抗原べプチドとしての活性を有することを意味するものであり、「HLA - A24抗原に結合して CTL を誘導する（CTL誘導活性を有する）」こと、「HLA- A24抗原に結合して CTLを活性化する（CTL活性化活性を有する）」ことと同義語である。よって本発明においては「HLA-A24抗原に結合して CTLにより認識される」ことを、「癌抗原べプチドとしての活性を有する」若しくは「CTL誘導活性を有する」と称することもある。

候補ぺプチドが HLA-A24抗原に結合して CTLにより認識されることは、例えば J. Im munol. , 169， 1611, 2002 に記載の方法により調べることができる。

すなわちまず、 HLA - Α24抗原陽性のヒトから末梢血単核球（PBMC) を分離'培養する。培養後、非接着性の細胞を回収して培養し、 CTLを含む Τ細胞集団（CD8陽性 Τ 細胞）を抗 CD8抗体結合マグネチックビーズなどで分離する。また別途、抗原提示用細胞調製のために接着性の細胞を培養し、候補ペプチドを添加（パルス）してさらに培養する。

次に、前記ぺプチドパルスした抗原提示細胞と CTLを含む Τ細胞集団とを混合培養する。このぺプチドパルスした抗原提示細胞による刺激を数回繰り返してぺプチド特異的な CTLを増やした後、当該 CTLによる細胞傷害活性を、例えば^{5 1} Crリリースァッセィ (Int. J. Cancer, 58 : p317， 1994) などにより測定する。アツセィにおいて使用する標的細胞としては、 ⁵ でラベルしたリビン陽性かつ HLA-A24陽性の細胞が挙げられる。具体的には、例えばリビン陽性おょぴ HLA-A24陰性であるメラノーマ由来細胞株や肺癌由来細胞株に HLA- A24の一種である HLA-A* 2402遺伝子（Cancer Re s.， 55： 4248-4252 (1995)、 Genbank Accession No. M64740) を導入した^{5 1} Crラベ /レ化細胞などが挙げられる。

以上のようなアツセィにより、 CTLが標的細胞を傷害した場合は、候補ペプチド力 S 「HLA_A24抗原と結合して CTLにより認識される」という本発明の活性を有すると判断する。

さらに、 TO02/47474号公報および Int J. Cancer: 100， 565- 570 (2002) に記述された HLA- A24モデルマウスを用いることにより、候補ペプチドが in vivoで「HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識される」という本発明の活性を有することを確認することができる。

HLA分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。 HLA - A24の結合モチーフとしては、 8〜11アミノ酸からなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン（Tyr) 、フエ二ルァラニン（Phe)、メチォニン（Met ) またはトリプトフアン (Trp) であり、 C末端のァミノ酸がフェニルァラニン（Phe )、ロイシン（Leu)、イソロイシン（lie)、トリプトファン（Trp)またはメチォニン（M et)となることが知られている (Iramunogenetics, 41 -. 178-228 (1995) , J. Immunol. , 1 55：4307-4312 (1995)、 J. Immunol. , 152: 3913-3924 (1994)、 J. Immunol. , 152： 3904-3 912 (1994)、；)。また、これら規則性に係わるアミノ酸残基に類似するアミノ酸残基も許容され得る。

さらに近年、これらの規則性に基づき、 H L Α抗原に結合可能と予想されるぺプチド配列を、インターネット上、 NIHの BIMASのソフトを使用することにより検索すること 3、できる (http: //bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla一 bind/ ) 。

本発明は、リビン（配列番号： 1) 1 HLA - Α24抗原に結合して CTLにより認識される抗原ぺプチド部分を有していることを初めて見出したものであるが、当該リビンのアミノ酸配列のうち、前記 BIMASソフトを用いた検索により同定される 9ァミノ酸若しくは 10ァミノ酸からなる推定上の HLA - A24結合配列としては、配列番号： 2〜配列番号： 59 に記載のリピンの部分アミノ酸配列が挙げられる。

すなわち本発明のぺプチドの具体的な態様として、本発明は、配列番号： 2〜59 のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有し、かつ HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識されるべプチドを提供する。

当該べプチドは、配列番号： 2〜配列番号: 59のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するリビンの部分ぺプチドであり、かつ HLA- A24抗原に結合して CTLにより認識される活性を有する限り、その長さは特に限定されない。しかしながら HLA - A24抗原に結合性を有するぺプチドは、一般的に 8〜11ァミノ酸からなることが知られている (Immunogenetics, 41： 178-228 (1995) , J. Immunol. , 155 : 4307-4312 (1995)、 J. Immunol. , 152 : 3913- 3924 (1994)、 J. Immunol. , 152 : 3904 - 3912 (1994)。従って前記配列番号に係る本発明のぺプチドは、 9〜11ァミノ酸からなるぺプチドであることが好ましく、 9~10アミノ酸からなるぺプチドであることがより好ましい。

すなわち本発明のぺプチドのより好ましい形態として、本発明は、配列番号： 2 〜59のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する 9〜11アミノ酸（好ましくは 9〜10 アミノ酸）からなるぺプチドであって、かつ HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドを提供する。

また、さらに好ましい形態として、本発明は、配列番号： 2〜59のいずれかに記載のァミノ酸からなり、かつ HLA - A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドを提供する。

前記配列番号で示される本発明のぺプチドのうち好ましいのは配列番号： 6〜9に記載のァミノ酸配列を含有するぺプチドであり、特に好ましいのは配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を含有するぺプチドである。当該配列番号.： 8に記載の癌抗原ぺプチドは、陽性コントロ一ルに比して格段に高い HLA- A24抗原結合性を示し、また良好な CTL誘導活性を有するペプチドとして本発明者により見出されたものである。

ペプチドの長さとしては 9〜11アミノ酸が好ましく、 9〜10アミノ酸がさらに好ましい。また配列番号： 6〜9に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドがより好ましく、配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドが特に好ましい。

前記本発明のペプチドは、活性を保持する範囲内で、適宜改変されていても良い。ここでアミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び Z又は付加 (ペプチドの N末端、 C末端へのァミノ酸の付加も含む) を意味し、好ましくはアミノ酸残基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸残基の数および位置は、癌抗原べプチドとしての活性を有する限り任意であるが、前記したように通常、 HLA-A24抗原に結合するペプチドの長さが 8〜11 アミノ酸程度であることから、 1個から数個の範囲が好ましい。

当該置換に係るアミノ酸残基の改変においては、 HLA- A24抗原に対する結合モチーフ構造を有するぺプチドにおける第 2位及び/又は C末端のァミノ酸残基の置換が好ましい。

このような本発明の置換に係るぺプチドの具体的な態様としては、配列番号： 2 〜配列番号： 59のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位および/または C末端のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含有する 9~11ァミノ酸（好ましくは 9〜10アミノ酸）からなるペプチドであって、かつ HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドが挙げられる。

このうち配列番号： 2〜配列番号： 59のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは C末端のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列からなるぺプチドであって、かつ HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識されるぺプチドが好ましい。

前記置換においては、 HLA- A24抗原の結合モチーフ構造を保持するァミノ酸残基への置換が好ましい。すなわち本発明の置換に係るぺプチドの好ましい態様としては、配列番号： 2〜配列番号： 59のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位おょぴ / または C末端のァミノ酸残基が、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する 9〜11アミノ酸 (好ましくは 9〜 10アミノ酸) からなるぺプチドであって、かつ HLA- A24抗原と結合して CTLにより認識されるぺプチドが挙げられる。

このうち、配列番号： 2〜配列番号： 59のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および/または C末端のァミノ酸残基が、

C末端：フエ-ノレァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、

の中から選択される!/、ずれかのァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列からなるぺプチドであって、かつ HLA-A24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドがより好ましい。

前記置換に係る本発明のぺプチドのうち、より好ましいのは、配列番号： 6〜9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは C末端のァミノ酸残基が、第 2位：チロシン、フエ-ルァラニン、メチォニン、トリプトファン、

の中から選択されるレ、ずれかのァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含有する 9〜11アミノ酸（好ましくは 9〜10アミノ酸）からなるペプチドであって、かつ HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識されるぺプチドである。

このうち、配列番号： 6〜9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは C末端のァミノ酸残基が、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるぺプチドであって、かつ HLA- A24抗原と結合して CTLにより認識されるぺプチドがより好ましい。

前記置換に係る本発明のぺプチドのうち、特に好ましいのは、配列番号： 8に記載のァミノ酸配列の第 2位およひゾまたは C末端のァミノ酸残基が、

C末端：フエ-ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、

の中から選択されるいずれかのァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列（配列番号 : 6 3、ただし配列番号： 8に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）を含有する 9〜11アミノ酸（好ましくは 9〜10アミノ酸）からなるペプチドであって、かつ HLA - A24抗原と結合して CTLにより認識されるぺプチドである。

このうち、配列番号： 8に記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは C末端のァミノ酸残基が、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列（配列番号： 6 3、ただし配列番号： 8に記載のアミノ酸配列に該当する配列は除く）力^なるぺプチドであって、かつ HLA- A24抗原と結合して CTLにより認識されるぺプチドがより好ましい。

前記第 2位及び Z又は C末端のァミノ酸残基の改変（好ましくは置換）は、例えば前記に示したリピンの部分配列からなる本発明の天然型の癌抗原ペプチドにおいて、その HLA- A24抗原への結合性を高める、若しくは活性を増強する目的で行うことができる。置換を施した第 2位おょぴ Zまたは C末端アミノ酸以外の部分は、天然型の配列のまま（すなわちリビンのァミノ酸配列のまま）であっても良く、また活性を保持する限りさらなる改変を施しても良い。当該改変とは、具体的には、システイン残基の他のアミノ酸残基（例えばセリン、ァラニン、 α -ァミノ酪酸）への置換が挙げられる。より具体的には、例えば配列番号： 7に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのペプチドの第 2位及び/又は C末端アミノ酸の置換型ぺプチドにおいて、その第 6位のシスティンが他のアミノ酸残基（例えばセリン、ァラニン、 α -ァミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。また、例えば配列番号： 8に記載のアミノ酸配列からなるぺプチド、またはこのべプチドの第 2位及び/ 又は C末端ァミノ酸の置換型ぺプチド（例えば配列番号： 63に記載のァミノ酸配列よりなるペプチド) において、その第 6位のシスティンが他のアミノ酸残基 (例えばセリン、了ラニン、 -アミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。また、例えば配列番号： 9に記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、またはこのぺプチドの第 2位及び/又は C末端ァミノ酸の置換型ぺプチドにおいて、その第 7位のシステインが他のアミノ酸残基（例えばセリン、ァラニン、 -ァミノ酪酸）に置換されたペプチドが例示される。

本発明はまた、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチド）とヘルパーペプチド若しくは他の癌抗原ペプチドとを含有するペプチド（いわゆる「ェピトープペプチド」）を提供する。

近年、複数の CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（ェピトープペプチド）、効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1998, 161： 3186- には、癌抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A², - A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープを連結した約 30merのペプチドが、イン ' ビボでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載されている。また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたぺプチド（ェピトープペプチド）により、効率的に CTLが誘導されることも示されている。ここでへルパーェピトープとは C D 4陽性 T細胞を活性化させる作用を有するぺプチドを指すものであり（Immunity. , 1 : 751, 1994) 、例えば B型肝炎ウィルス由来の H B V c 1 2 8— 1 4 0や破傷風毒素由来の T T 9 4 7 - 9 6 7などが知られている。当該へルパーェピトープにより活性化された C D 4陽性 T細胞は、 C T Lの分化の誘導や維持、およびマク口ファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーェピトープと CTLェピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えば Journal of Immuno logy 1999, 162： 3915- 3925には、 HBV由来 HLA- A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA - Al l拘束性抗原ペプチド 3種類、およびヘルパーェピトープより構成されるぺプチドをコードする DNA (ミニジーン) が、イン■ビポでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、 CTLェピトープ（メラノ一マ抗原 gplOOの第 280位〜 288位からなる癌抗原べプチド）とヘルパーェピトープ（破傷風毒素由来 Tヘルパーェピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res.， 2001, 7： 3012-3024) 。

従って、前記本発明のぺプチド (天然型ぺプチド、改変ペプチド）を含む複数のェピトープを連結させた CTL誘導活性を有するェピトープぺプチドも、本発明のぺプチドの具体例として例示することができる。

ここで、本発明の癌抗原ペプチドに連結させるェピトープが CTLェピトープ（癌抗原ペプチド）の場合、用いる CTLェピトープとしては、リビン由来の HLA- A0201, -A0204, -A0205, - A0206, -A0207 に拘束性の CTLェピトープが挙げられる。これら CTLェピトープは複数個連結することが可能であり、 1つの CTLェピトープの長さとしては、各種 HLA分子に結合している抗原べプチドの解析により（Immunogenetic s, 41 : 178， 1995) 、 8〜14アミノ酸程度を挙げることができる。

また本発明の癌抗原ぺプチドに連結させるェピトープがヘルパーェピトープの場合、用いるヘルパーェピトープとしては、前述のような B型肝炎ウィルス由来の H B V c l 2 8 - 1 4 0や破傷風毒素由来の T T 9 4 7 - 9 6 7などが挙げられる。また当該へパーェピトープの長さとしては、 13〜30アミノ酸程度、好ましくは 13 〜17ァミノ酸程度を挙げることができる。本発明のェピトープぺプチドとして、具体的には、例えば配列番号： 2〜59のいずれかに記載のァミノ酸配列からなり、かつ HLA- A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドの 1種または 2種以上とヘルパーェピトープとを連結させたェピトープぺプチドを挙げることができる。

より具体的には、例えば配列番号： 8に記載のアミノ酸配列よりなるぺプチドと破傷風毒素由来のヘルパーぺプチド（例えば Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Tr p Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;配列番号： 61) とを連結させたェピトープぺプチドゃ、配列番号： 8に記载のァミノ酸配列よりなるぺプチドと Ala Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Leu (酉己列番号： 62、 Clinical Cancer Res.， 2001, 7 : 3012-3024) とを連結させたェピトープぺプチドなどが挙げられる。

このような複数のェピトープを連結させたペプチド（ェピトープペプチド）は、前述のように一般的なぺプチド合成法によつて製造することができる。またこれら複数のェピトープを連結させたェピトープぺプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常の DNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに揷入し、得られた組換え発現べクタ一で宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法（Molecular Cloning, T. Maniatis et al. , CSH Laboratory (1983) , DNA Clonin g, DM. Glover, IRL PRESS (1985) )や後述の方法などに準じて行うことができる。以上のようにして製造された複数のェピトープを連結させたェピトープぺプチドを前述の^{5 1} Crリリースアツセィゃ TO 02/47474号公報おょぴ Int J. Cancer: 100, 565-570 (2002)に記述のヒトモデル動物に供すること等により、 CTL誘導活性を測定することができる。

以上に示した本発明のぺプチド（天然型ぺプチド、改変べプチドおよびェピトープペプチド）の N末端アミノ酸のアミノ基、または C末端アミノ酸の力ルポキシル基は、修飾されていても良い。すなわち、当該 N末端のアミノ酸残基及び/又は C末端のァミノ酸残基が修飾されたぺプチドも、本発明のぺプチドの範疇に含まれる。ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、例えば 1〜 3個の炭素数 1 から 6のアルキル基、フエニル基、シクロアルキル基、ァシル基が挙げられ、ァシル基の具体例としては炭素数 1から 6のアルカノィル基、フエニル基で置換された炭素数 1から 6のアルカノィル基、炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換されたカルボエル基、炭素数 1から 6のアルキルスルホニル基、フエニルスルホニル基、炭素数 2から 6のアルコキシカルボニル基、フエニル基で置換されたアルコキシカルボ-ル基、炭素数 5から 7のシクロアルコキシで置換されたカルボ二ル基、フエノキシカルボエル基等が挙げられる。

C末端ァミノ酸のカルボキシル基を修飾したぺプチドとしては、例えばエステル体およびァミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数 1から 6のァルキルエステル、フエニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル、炭素数 5から 7のシクロアルキルエステル等が挙げられ、ァミド体の具体例としては、アミド、炭素数 1から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで 5から 7員環のァザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。

また、以上に示した本発明のぺプチド (天然型ぺプチド、改変ペプチドおよびェピトープペプチド）のうちシスティン残基を含有するペプチドに関しては、そのぺプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる二量化ぺプチドの形態であつても良い。当該二量化は、ペプチド単量体を合成後、酸化状態に置くことにより作製することができる。

具体的には、例えば配列番号： 7に記載のアミノ酸配列からなるペプチド、またはこのぺプチドの第 2位及び/又は C末端ァミノ酸の置換型ぺプチドのニ量化ぺプチドが例示される。また、例えば配列番号： 8に記載のアミノ酸配列からなるぺプチド、またはこのペプチドの第 2位及び/又は C末端アミノ酸の置換型ペプチド（例えば配列番号： 63に記載のァミノ酸配列よりなるぺプチド）の二量化ぺプチドが例示される。また、例えば配列番号： 9に記載のァミノ酸配列からなるペプチド、またはこのぺプチドの第 2位及び/又は C末端ァミノ酸の置換型ぺプチドのニ量化ぺプチドが例示される。本発明はまた、前記本発明のペプチド（天然型ペプチド、改変ペプチドまたはェピトープぺプチド）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 DNAの形態であっても RNAの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のぺプチドのァミノ酸配列情報およぴそれによりコードされる DNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常の DNA合成や PCRによる増幅などによって、製造することができる具体的には、例えば配列番号： 2~59のいずれかに記載のァミノ酸配列からなり、かつ HLA- A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドの 1種または 2種以上とヘルパーェピトープとを連結させたェピトープぺプチドをコードするポリヌクレォチドが挙げられる。

好ましくは、例えば配列番号： 8に記載のァミノ酸配列よりなるぺプチドと破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えば Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Le u Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu;配列番号： 61) とを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。また配列番号： 8に記載のアミノ酸配列よりなるぺプチドと Ala Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Ly s Phe lie Gly lie Thr Glu Leu (配列番号： 62、 Clinical Cancer Res. , 2001, 7： 3012-3024) とを連結させたェピトープぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを挙げることができる。

前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のぺプチドを発現するための組換え発現べクターを作製することができる。

ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスべクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 _PBR322、 pC

R3等のプラスミドベクター、；i ZAPII、 L gtllなどのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3. 1、 pRc/RSVヽ pRc/CMVなどのプラスミドベクタや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスべクタ一などのウィルスベクターが挙げられる。

前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST ( ダルタチオン S -トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（la c、 tac、 trc、 trp、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクべクタ一 (pGEX4Tなど）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3. 1/M yc - Hisなど) 、さらにはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a) などを用いることができる。

前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。

ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、 E. coli K-12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 a株、 AD494 (DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス 'セルビジェなどが挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 C H0細胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては sf9などが挙げられる。

宿主細胞への発現べクタ一の導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、エレクト口ポレーンヨン法、遺伝子導入用ジピッド (Lipofectamine Lipofecti n; Gibco- BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。

以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な（ペプチドの発現可能な）条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離 ·精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、ゲノレろ過クロマトグラフィ一等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離'精製することができる。

本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。

本発明の抗体は前記のように本発明のぺプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号： 2〜配列番号： 59のいずれかに記载のアミノ酸配列からなり、かつ HLA- A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。好ましくは、配列番号： 6〜9のいずれかに記載のァミノ酸配列よりなるぺプチドに特異的に結合する抗体が挙げられ、より好ましくは、配列番号： 8に記載のァミノ酸配列よりなるぺプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。

これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製gすること »できる (Current protocols in Molecular Biology edit. A usubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 12〜11. 13、 A ntibodies ; A Laboratory Manual, Lane, H， D.ら編, Cold Spring Harber Labora tory Press 出版 New York 1989) 。

具体的には、本発明のペプチドを免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクロ一ナル抗体の場合には、本発明のペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドーマ細胞の中から待ること力 Sでさる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11. 4〜11. 11) 。

本発明のぺプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並ぴにリゾレシチン、プル口ニックポリオル、ポリア二オン、ペプチド、油乳剤、キ一ホールリンぺットへモシァニンおょぴジニトロフエノールのような表面活性物質、 B C G (カルメットーゲラン桿菌) やコリネバクテリウム-パノレヴムなどのヒトアジュバントなどがある。

以上のように本発明のぺプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アブイ二ティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、ィムノブロット法、放射免疫測定法（R I A) 、酵素免疫測定法（E L I S A) 、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、リピン遺伝子が発現している癌、すなわち肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の診断において有効である。

本発明は、本発明のぺプチドと HLA-A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。

後述の実施例において、本発明のぺプチド刺激により CTL誘導活性が認められた iK これは、本発明のペプチドと HLA-A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識する CTLが誘導されたことを示すものである。このような、 HLA - A24抗原と本発明のぺプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（DC療法）において有効に用いられる。

本発明の抗原提示細胞は、本発明のぺプチドと HLA- A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良く、具体的には、例えば配列番号： 2〜配列番号： 59 のいずれかに記載のァミノ酸配列からなり、かつ HLA - A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドと HLA - A24抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。好ましくは、配列番号： 6〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるぺプチドと HLA-A24抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞が挙げられ、より好ましくは、配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと HLA-A24抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。

細胞療法（DC療法）において用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスする力または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現べクターを細胞内に導入して、 HLA - A24抗原と本発明のぺプチド由来の癌抗原べプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能な HLA-A24抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。

また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のぺプチドであっても良いし、また本発明のぺプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。

本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のぺプチド（例えば配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなる癌抗原べプチド）を体外でパルスし、 HLA-A24抗原と本発明のぺプチドとの複合体を作製することにより得られる（Cancer Immunol. Immunother.， 46： 82, 1998、 J. Immuno 1.， 158 :pl796， 1997、 Cancer Res.， 59 : pi 184， 1999)。樹状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞を GM-CSFおよび IL- 4存在下で培養して榭状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のぺプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。

また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のぺプチドをコ一ドするポリヌクレォチド（例えば配列番号： 8に記載のァミノ酸配列を有するェピトープぺプチドをコードするポリヌクレオチド) あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドが DNAの場合は Cancer Res.， 56 :p5672, 1996や J. Immunol.， 161 : ρ5607, 1998などを参考にして行うことができる。また、 DNAのみならず RNAの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、 J. Exp. Med. , 184： p465， 1996などを参考できる。

本発明はまた、本発明のぺプチドと HLA - A24抗原との複合体を認識する CTLを提供する。

後述の実施例において、本発明のぺプチド刺激により CTL誘導活性が認められた。これは、本発明のぺプチドと HLA - A24抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、この抗原提示細胞を特異的に認識する CTLが誘導されたことを示すものである。このような、 HLA-A24抗原と本発明のペプチドとの複合体を特異的に認識する CTLは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。

本発明の CTLは、本発明のぺプチドと HLA-A24抗原との複合体を特異的に認識するものであれば良いが、具体的には、例えば配列番号： 2〜配列番号： 59のいずれかに記载のァミノ酸配列からなり、かつ HLA - A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドと HLA-A24抗原との複合体を特異的に認識する CTLを挙げることができる。好ましくは、配列番号： 6〜9のいずれかに記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと HLA - A24抗原との複合体を特異的に認識する CTLが挙げられ、より好ましくは、配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと HLA - A24抗原との複合体を特異的に認、識する CTLを挙げることができる。

養子免疫療法において用いられる CTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のぺプチド（例えば配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなる癌抗原ぺプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号： 8に記載のアミノ酸配列を有するェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでィン · ビトロで刺激する等により作製れる (Journal of Experimental Medicine 1999， 190 : 1669) 。

以上に記載した本発明のペプチド、本発明の発現ベクター、本発明の細胞、本発明の抗原提示細胞、および本発明の CTLは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、 CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。

(1) 本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン

本発明のペプチドは、 CTLの誘導能を有するものであり、誘導された CTLは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従つて本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンを HL A-A24陽性かつリピン陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞の HLA- A24抗原にぺプチド（例えば配列番号： 8に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）が提示され、提示された HLA - A24抗原複合体を特異的に認識する CTLが増殖して癌細胞を破壌することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の癌ヮクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。

よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量を HLA-A24陽性かつリビン陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。

本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一の CTLェピトープ (例えば配列番号： 8に記載のアミノ酸配列からなる癌抗原べプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLェピトープゃヘルパーェピトープ）と連結したェピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数の CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結したェピトープペプチドが、イン - ビボで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of I匪 nology 1998， 161 : 3186 - 3194には、癌抗原タンパク質 PSA由来の HLA- A2, _A3， -A1 1， B53拘束性 CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結した約 30merのェピトープぺプチドが、ィン ·ビポでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載されている。また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたェピトープペプチドにより、効率的に CTLが誘導されることも示されている。このようなェピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原べプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的な CTL が体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壌する。このようにして癌の治療または予防が達成される。

また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol. Rev. , 7 : 277-289, 1994) に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性剤、ポリア二オン、ペプチド、または油乳濁液（ェマルジヨン製剤）などを挙げることができる。また、リボソーム製剤、直径数/ x mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。

投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常 0. 0001mg〜1000mg、好ましくは 0. 001 mg〜1000mg、より好ましくは O. lmg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与するのが好ましい。

(2) 本発明のぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする DNAワクチン

前記本発明のぺプチドのみならず、本発明のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有する発現べクターもまた、癌の治療または予防のための DNAワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン ( 癌ワクチンとしての医薬組成物) を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明の DNAワクチンの有効量を HLA- A24陽性かつリビン陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。

近年、複数の CTLェピトープ（抗原ぺプチド）を連結したェピトープぺプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、 in vivoで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 199 9, 162： 3915- 3925には、 HBV由来 HLA- A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA- All拘束性抗原ぺプチド 3種類、およびヘルパーェピトープを連結したェピトープぺプチドをコードする DNA (ミニジーン）力イン .ビボでそれぞれのェピトープに対する C TLを効果的に誘導したことが記載されている。

従って、本発明のェピトープぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを適当な発現べクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチド含有努現ベクターを癌ワクチン（DNAワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。

すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウィルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45 頁、月刊薬事， 36 (1) , 23 - 48 (1994)、実験医学増刊， 12 (15) , (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。

ウィルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアゥイノレス、ボックスウイノレス、ポリオウイルス、シンビスウィルス等の D N Aウィルスまたは R N Aウィルスに本発明の D N Aを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好ましい。

その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 (D NAヮクチン法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーション法等が挙げられ、特に D NAワクチン法、リポソーム法が好ましい。

本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレォチドを直接体内に導入する in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で D NAを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す ex vivo法がある（曰経サイエンス， 1994年 4月号, 20 - 45頁、月刊薬事， 36 (1)， 23 - 48 (1994)、実験医学増刊， 12 (15)，（1994)、およびこれらの引用文献等）。 in vivo法がより好ましい。

in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウィルス（HVJ) -リボソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤の形態とすることができる。

製剤中の本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、 0. 0001mg~100ra g、好ましくは 0. 001mg〜10mgの本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターを、数日ないし数月に 1回投与するのが好ましい。

以上のような本発明のポリヌクレオチド含有発現ベクターの癌患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリべプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原べプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体を特異的に認識する CTLが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現べクタ一を有効成分とする癌ワクチンは、 V ビン遗伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。

(3) 本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン

本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。

近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、ィン - ビトロでぺプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（DC療法）が報告されている（Cancer Immunol. I匪 unother.， 4 6 : 82, 1998、 J. Immunol.， 158 :pl796， 1997、 Cancer Res. , 59 :pll84, 1999、 Cancer Re s.， 56 :p5672， 1996、 J. Immunol.， 161： p5607, 1998、 J. Exp. Med. , 184： p465, 1996) 。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。

本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。

前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、 HLA- A24陽性かつリピン陽性の患者の体内で効率良く特異的な CTLが誘導され、癌を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。 (4) 本努明の CTLを有効成分とする癌ワクチン

本発明は、本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の CTLは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。

メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（J. Natl. Cancer. Inst. , 86： 1159， 1994) 。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン 'ビトロで癌抗原ぺプチド T R Ρ _ 2で刺激し、癌抗原ぺプチドに特異的な CTLを増殖させ、該 CTL をメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J. Ex p. Med.， 185 : 453, 1997 ) 。これは、抗原提示細胞の HLA抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識する CTLをイン 'ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のぺプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドゃ発現ベクターを用いて、イン .ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的 CTLを增ゃした後、この CTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明の C TLを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチンは、 CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。

前記癌ヮクチンを患者の体内に戻すことにより、 HLA- A24陽性かつリビン陽性の患者の体内で CTLによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、癌を治療することができる。本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチンは、リビン遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば肺癌、大腸癌、前立腺癌、腎癌、胃癌、黒色腫（特に悪性黒色腫）、明細胞肉腫等の予防または治療のために使用することができる。

本発明は、本発明の抗体を含有する癌の診断薬を提供する。

本発明の抗体を含有する癌の診断薬を用いることにより、癌の免疫学的診断を行うことができる。当該免疫学的診断を行うには、まず本発明の抗体を必要に応じて適宜標識し、これを用いて癌が疑われる患者から得た試料（例えば血液、癌組織など）中の抗原（リビン)若しくは抗原ペプチド（リビン由来抗原ペプチド）の存在を検出することにより、癌の有無を診断することができる。具体的にはィムノブ口ット法、放射免疫測定法（RIA) 、酵素免疫測定法 (ELISA) 、蛍光あるいは発光測定法等により行うことができる。

本発明はまた、本発明のペプチドと HLA— A24抗原とを含有する HLAモノマー、 HLA ダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を提供する。

癌免疫療法において、治療前に癌抗原（癌抗原ペプチド）に対する CTL前駆細胞の頻度や量を予め調べることや、癌抗原（癌抗原ペプチド）による治療実施中の患者における CTLの頻度や量を調べることは、当該癌抗原（癌抗原ペプチド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定などにおいて重要な指標となる。癌抗原ぺプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、抗原（抗原ペプチド）特異的 CTLの検出、すなわち当該 CTLの頻度や量を測定するための試薬として有用である ₀

ここで HLAテトラマーとは、 HLA抗原の α鎖と 2ミクログロブリンをぺプチド ( 抗原ペプチド）と会合させた複合体 (HLAモノマー) をビォチン化し、アビジンに結合させることにより 4量体化したものを指す (Science 279： 2103-2106 (1998)、 Science 274： 94-96 (1996))。

HLAモノマーとは前記 HLAテトラマーの製造において用いられる、 HLA抗原 α鎖、 2ミクログロブリン、抗原ぺプチドの会合体をビォチン化したもの（単量体）を指す。

HLAダイマーとは HLA抗原鎖と Ig (ィムノグロブリン、例えば IgGl)とを融合させ、これに ]3 2ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す（Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA 90： 6671-6675 (1993) ) ₀ HLAダイマーに結合した抗原ペプチド特異的 CTLは、例えば標識抗 IgGl抗体を IgGlに結合させることなどにより、検出することができる。

HLAペンタマーとは近年開発された技術であり、 HLA抗原と抗原ぺプチドとの複合体 5分子が Coiled-Coilドメインを介して重合した 5量体を指す。 HLA抗原一抗原ぺプチドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、 HLAテトラマー法と同様にフローサイトメータ一等で解析することができる（http：〃 www. proiramune. co. uk/参照）。

以上に述べた HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一はいずれも受託合成可能であり、例えば Prolmmune社や BD Biosciences社などに委託することにより合成することができる。また現在では種々の抗原ぺプチドを含有する HLAテトラマーなども市販されている（(株)医学生物学研究所等）。

本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一として具体的には、例えば配列番号： 2〜配列番号： 59のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、かつ HLA-A24抗原に結合して CTLにより認識されるぺプチドと HLA - A24抗原とを含有する HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおょぴペンタマ一が挙げられる。このうち HLAテトラマーまたは HLAぺンタマーを用いることが好ましく、 HLAテトラマーを用いることがより好ましい。中でも配列番号： 6〜9のいずれかに記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと HLA - A24抗原とを含有する HLAテトラマーまたは HLAペンタマーが好ましく、特に配列番号： 8に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと HLA - A 24抗原とを含有する HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一が好ましい。このうち HLA テトラマーがより好ましい。

当該 HLAモノマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、フローサイトメトリ一、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により結合した CTLを容易に選別または検出することが出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン (PE) 、フノレオレセインイソチオシァネート (FITC) 、ベリジニンクロロフィルプロテイン（PerCP) 、ァロフィコシァニン（APC)などにより標識された HLAモノマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一が挙げられる。

本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である HL A- A24抗原（HLA- A24抗原の α鎖）は、 Cancer Res.， 55 : 4248-4252 (1995)および Genbank Accession No. M64740に開示されている HLA- A2402の公知の塩基配列の情報に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。

本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である ]3 2 ミクログロブリンは、ヒト由来の j3 2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒト i3 2 ミクログロブリンは GenBank Acc. No. AB021288 に開示されているヒト j3 2ミクログロブリンの公知の塩基配列情報に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローニングすることができる。

HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一作製法については、前記各文献により周知であるが、具体的に HLAテトラマーの作製法につき簡単に述べると以下のようになる。

まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、 HLA- A24 a鎖発現べクタ一および 2ミクログロプリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌 (例えば BL21) を用いることが好ましい。得られた単量体 HLA - A24複合体と本発明ペプチドとを混合し、可溶性の HLA-ぺプチド複合体を形成させる。次に HLA-ぺプチド複合体における HLA_A24 _a鎖の C末端部位の配列を BirA酵素によりピオチン化する。このビォチン化された HLA -ぺプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを 4： 1のモル比で混合することにより、 HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。前記本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一は、リビン由来の HLA - A24結合性癌抗原べプチド特異的な CTLの検出用試薬として有効に用いられる。

本発明の CTL検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：

1)本発明の癌抗原ぺプチドによる治療開始前に、本発明の癌抗原べプチドに対する CTL前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該癌抗原ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。

2)本発明の癌抗原ペプチド（癌ワクチン）による治療実施中の患者における CTLの頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。

CTLの検出法としては、具体的には、被験患者より CTLを含む生体試料（例えば PB

MC)を単離し、本発明の HLAテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、 HLAテトラマー等に結合した本発明ぺプチド特異的な CTLの存在頻度または量を、フローサイトメータ一等で測定する。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

実施例 1

ぺプチドの HLA-A* 2402への結合親和性の検討

リビンのアミノ酸配列 (NCBIのデータべ一ス Entrezの MG33622) より HLA - A* 2402 (HLA-A24の 1種）に結合する可能性のあるべプチドを 8種類合成した。それぞれぺプチドの配列は、リビンの第 47位から 55位に相当するペプチド 1 (Ala Trp Asp His V al Asp Gly Gin lie；配列番号： 2) 、第 47位から 56位に相当するペプチド 2 (Ala T rp Asp His Val Asp Gly Gin lie Leu；配列番号： 3) 、第 80位から 89位に相当するぺプチド 3 (Ala Phe Pro Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu；配列番号： 4) 、第 83位から第 91位に相当するペプチド 4 (Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu；配列番号 : 5) 、第 140位から第 148位に相当するペプチド 5 (Pro Trp Thr Glu His Ala Lys T rp Phe；配列番号： 6) 、第 146位から 154位に相当するペプチド 6 (Lys- Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe Leu；配列番号： 7) 、第 146位から 155位に相当するペプチド 7 (L ys Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe Leu Leu；配列番号： 8) および第 145位から 154位に相当するペプチド 8 (Ala Lys Trp Phe Pro Ser Cys Gin Phe Leu；配列番号： 9) である。リビン由来の前述のペプチドおよび EBウィルス由来のペプチド（Thr Tyr G ly Pro Val Phe Met Ser Leu；配列番号： 60)はアミノ酸合成機を用いて F-moc法で合成した。

これらのペプチドの HLA-A* 2402への結合親和性の測定は、文献（J. Immunol. 16 4: 2565， 2000) に記載の方法と同様に実施した。 MHCクラス I分子を発現していないマウスリンパ腫由来の細胞株 RMA- Sに HLA- A* 2402と H- 2K^bのキメラ MHCの遺伝子を安定的に導入した細胞株 RMA- S- A* 2402細胞 (J. Immunol. , 164, 2565-2574 (2000) ) を 26°Cで 18時間培養した。 RMA- S-A* 2402細胞を PBS溶液で洗浄後、 3 μ L/tnLのヒト ₂ - ミクログロブリンと 100 L/mLの各種べプチドを含有する培養液 0ΡΊΊ- MEM (Invitro gen社）に懸濁して 26°Cで 3時間、 37°Cで 3時間培養した。この細胞を PBS溶液で洗浄後、抗 HLA-A24抗体により 4°Cで 30分間処理した。さらに細胞を PBS溶液で洗浄後、 P E標識した抗マウス IgG抗体により 4°Cで 30分間処理した。細胞を洗浄後、 1%ホルマリンを含む PBS溶液 lmLに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置 FACS can (BDバイオサイエンス社）で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。上記の 8種類のぺプチドの結合親和性を測定した結果を図 1に示す。文献（J. Immunol. 158 : 3325, 1997)で HLA- A* 2402に結合することが報告されている EBウィルス由来のペプチドは強い結合能を示した。試験した 8種類のペプチドの中で、ペプチド 5、 6、 7および 8は HLA - A* 2402に良好に結合することが示された。特にぺプチド 7は陽性コント口ール（EBV)より高い結合性を示した。

実施例 2

リビン由来ぺプチドによるヒト末梢血単核球からの CTL誘導

実施例 1で HLA-A* 2402への強い結合能が認められたペプチド 7 (配列番号: 8) について、文献（J. Immunol. 169 : 1611, 2002)と同様の方法により、末梢血単核球からの CTL誘導を行った。 HLA-A24陽性の肺癌患者からインフォームドコンセントを得て末梢血を採血し、比重遠心法により単核球を分離し、 AIM-V培養液（Invitrogen社）を用いて培養した。 24時間後、非接着性の細胞を回収して、 100U/niLの IL- 2を含んだ AIM- Vを用いて培養した。抗原提示用細胞調製のため、接着性の細胞は、 1000U/m Lの IL-4と lOOOU/mLの GM- CSFを含む AIM- V培養液で 5日間培養した後、 10 μ Μのぺプチド 7を添カ卩して 1日間培養し、さらに 10ng/mLの TNFと 1000U/mLの IFN - aを加えて培養した。非接着性の細胞から CD8陽性 T細胞を抗 CD 8抗体結合マグネチックビーズで分離し、上記のぺプチドをパルスした抗原提示用細胞ととも培養した。

CD8陽性 T細胞を分離した残りの非接着性細胞は、 1 g /m Lの PHAと 100U/mL の IL - 2を含む AIM-V培地で 3日間培養した後、 PHAを除いた培地で 4日間培養し、 2 回目、 3回目のぺプチド刺激用の抗原提示細胞としてストックした。ぺプチド刺激をした CD8陽性 T細胞に対しては、 1回目のぺプチド刺激から 7日後と 14日後に、ストックの抗原提示細胞にぺプチド 7を 2時間パルスし、 5000radで X線照射した細胞を添加して 2回目、 3回目のペプチド刺激を行った。 3回目の刺激から 1週間後の T細胞の細胞傷害活性を^{5 1} Crリリースアツセィにより測定した。標的細胞としてリビン陽性および HLA- A* 2402陰性である LNY- 1細胞（肺癌由来細胞株）、 LNY-1細胞に HLA- A* 2402遺伝子を安定的に導入した LNY- 1A24細胞、細胞に対して感受性を示すリビン陰性およぴ HLA-A* 2402陰性の慢性骨髄性白血病由来細胞株 K562 (ATCC株番号 CCL-243) を用いた。標的細胞は、 100 /z Ciの^{5 1} Crで 1時間ラベルした。 5 X 10³個の標的細胞に対して、 10倍のエフェクター細胞（ペプチド刺激した T細胞）を添カロし、 4時間培養して細胞傷害活性を測定した。癌患者検体 2例の結果を図 2および図 3に示す。

ぺプチド 7で刺激した T細胞は、リビン陽性および HLA-A* 2402陽性の LNY-1A24細胞を傷害したが、リビン陽性ではあるが HLA- A* 2402陰性の LNY- 1細胞ゃリビン陰性おょぴ HLA- A* 2402陰性の K562は傷害しなかった。リビン由来のぺプチド 7により誘導された CTLは、 HLA- A* 2402拘束性にリビン発現細胞を特異的に傷害したことから、ぺプチド 7は HLA - A24結合性の癌抗原ぺプチドであることが示された。産業上の利用可能性

本発明により、リビン由来の HLA- A24結合性癌抗原ぺプチド、当該ぺプチドをコードするポリヌクレオチド、これらべプチドゃポリヌクレオチドを含む CTLの誘導剤などが提供される。本発明の CTLの誘導剤は癌ワクチンとして有用である。本発明の癌ワクチンは、 HLA- A24陽性の多くの癌患者に適用可能である。配列表フリーテキスト

配列番号 2に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。

配列番号 3に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。

配列番号 4に記載のァミノ酸配列は合成ぺプチドである。

配列番号 5に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。

配列番号 6に記载のァミノ酸配列は合成べプチドである。

配列番号 7に記載のァミノ酸配列は合成ぺプチドである。

配列番号 8に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。

配列番号 9に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。

配列番号 1 0に記載のァミノ酸配列は合成ぺプチドである ₍

配列番号 1 1に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである _t

配列番号 1 2に記載のァミノ酸配列は合成ぺプチドである _t

配列番号 1 3に記載のァミノ酸配列は合成ぺプチドである _t 配列番号： 1 4に記載のァミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 1 5に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 1 6に記載のアミノ酸配列は合成ぺプチドである。配列番号： 1 7に記載のアミノ酸 d歹 [Jは合成- \,ナ卜である。配列番号： 1 8に記載のアミノ酸酉己歹 (1は合成、ブチ卜 Cめな。配列番号： 1 9に記載のアミノ酸配歹 !Jは合成、ブチ卜で fc 。配列番号： 2 0に記載のァミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 2 1に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 2 2に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 2 3に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 2 4に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

ペプチドである。配列番号： 2 5に記載のアミノ酸配列は合成

配列番号： 2 6に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 2 7に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。配列番号： 2 8に記載のアミノ酸配列は合成ぺプチドである。配列番号： 2 9に記載のアミノ酸配列は合成 <プチドである。配列番号： 3 0に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 3 1に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 3 2に記載のアミノ酸配列は合成 ^ペプチドである。配列番号： 3 3に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 3 4に記載のァミノ酸配列は合成べプチドである。配列番号： 3 5に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 3 6に記載のアミノ酸配列は合成プチドである。配列番号： 3 7に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 3 8に記載のァミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 3 9に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 4 0に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配列番号： 4 1に記載のアミノ酸配列は合成ぺプチドである。配列番号： 4 2に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。配歹 1.1番号 : 43に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 t 1番号 : 44に記載のアミノ酸配列は合成プチドである。

配歹 i— 1番号 : 45に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1. 1番号 : 46に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 t (番号 : 47に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 I— 1番号 : 48に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹'— 1番号 : 49に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 50に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 51に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹『― 1番号 : 52に記載のアミノ酸配列は合成^ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 53に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹【- 1番号 : 54に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 |- 1番号 : 55に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 56に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配^ 1番号 : 57に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 58に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 59に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1- 1番号 : 60に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 61に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

配歹 1 1番号 : 62に記載のアミノ酸配列は合成べプチドである。

配歹 1 1番号 : 63に記載のアミノ酸配列の第 2番目の Xaaァミノ酸残基はフエニルァラニン残基（Phe) 、チロシン残基（Tyr)、メチォニン残基（Met)またはトリプトファン残基（Trp) であり、第 10番目の Xaaァミノ酸残基はフェニルァラ二ン残基（Phe)、ロイシン残基（Leu) 、イソロイシン残基（Ile)、トリブトファン残基 (Trp) またはメチォニン残基（Met)である。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 1に記載のリビンのァミノ酸配列における連続する 8〜： L 1ァミノ酸からなるペプチドであって、かつ H L A— A 2 4抗原と結合して細胞傷害性 T細胞（C T L ) により認識されるペプチド。

2 . 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有する、請求項 1記載のペプチド。

3 . 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有する、請求項 2記載のペプチド。

4. 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および/または C末端のァミノ酸残基が他のァミノ酸残基に置換されたァミノ酸配列を含有する 9〜1 1ァミノ酸からなるぺプチドであって、かつ H L A— A 2 4抗原と結合して C T Lにより認識されるぺプチド。

5 . 配列番号： 2〜配列番号： 5 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および/または C末端のァミノ酸残基が、

第 2位：チロシン、フエニノレアラニン、メチォユン、トリプトファン、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項 4記載のペプチド。

6 . 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列の第 2位および Zまたは c末端のァミノ酸残基が、

C末端：フエニルァラエン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチォ二ン、

の中から選択されるいずれかのアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含有する、請求項 5記載のペプチド。

7 . 請求項 1 ~ 6いずれか記載のぺプチドを含有するェピトープぺプチド。

8 . 請求項 1〜 7いずれか記載のぺプチドのうちシスティン残基を含有するぺプチドの単量体がジスルフィド結合により結合してなる、二量化ぺプチド。

9 · 配列番号： 7〜配列番号： 9のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有するペプチド単量体がジスルフィド結合により結合してなる、請求項 8記載の二量化ぺプチド。

1 0. 請求項 1〜 7いずれ力記載のぺプチドをコードするポリヌクレオチド。

1 1. 請求項 1 0記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。

1 2. 請求項 1 1記載の発現ベクターを含有する細胞。

1 3. 請求項 1 2記載の細胞を、ぺプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項 1〜 9いずれか記載のぺプチドの製造方法。

14. 請求項 1〜 9いずれ力、記載のぺプチドに特異的に結合する抗体。

1 5. 請求項 1〜 9レ、ずれか記載のぺプチドと HLA— A24抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。

1 6. 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A24抗原との複合体が提示されている、請求項 1 5記蛾の抗原提示細胞。

1 7. 請求項 1〜9レ、ずれか記載のぺプチドと HLA— A24抗原との複合体を認識する CTL。

1 8. 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A 24抗原との複合体を認識する、請求項 1 7記載の CTL 。

1 9. 請求項 1〜 9いずれか記載のぺプチド、請求項 1 1記載の発現べクタ一、請求項 1 2記載の細胞、請求項 1 5または 1 6記載の抗原提示細胞、あるいは請求項 1 7または 1 8記載の CTLと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。

20. CTLの誘導剤として使用される、請求項 1 9記載の医薬組成物。

21. 癌ワクチンとして使用される、請求項 1 9記載の医薬組成物。

22. 請求項 14記載の抗体を含有する癌の診断薬。

23. 請求項 1〜 9いずれか記載のペプチドと HL A— A 24抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一。

24. 配列番号： 6〜配列番号： 9のいずれかに記載のァミノ酸配列を含有するペプチドと HLA— A 24抗原とを含有する、請求項 23記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HL Aペンタマ一。

25. 請求項 23または 24記載の HL Aモノマー、 HLAダイマ一、 HLA テトラマーまたは HLAペンタマ一を成分として含有する、リビン由来の HLA— A 24抗原結合性癌抗原べプチド特異的な C T Lの検出用試薬。

26. 癌ワクチンの効果の診断のために用いられる、請求項 25記載の試薬。